CN101386664A - 异丙酚分子印迹聚合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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李魏嶙
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Abstract

本发明涉及药物分析中的样品前处理技术领域，是一种异丙酚分子印迹聚合物和异丙酚分子印迹固相萃取柱及其制备方法和用途。该分子印迹聚合物的功能单体为甲基丙烯酸，交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯，印迹分子为异丙酚。用该异丙酚分子印迹聚合物制备异丙酚分子印迹固相萃取柱。利用该异丙酚分子印迹固相萃取柱分离富集异丙酚的生物样品。本发明异丙酚分子印迹聚合物可用作固相萃取柱和色谱柱的填料来高选择性地分离富集复杂生物样品中的异丙酚。本发明异丙酚分子印迹固相萃取柱较普通溶剂萃取法、C18固相萃取法更为简单、快速、高效。

Description

异丙酚分子印迹聚合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及药物分析中的样品前处理技术领域，是一种异丙酚分子印迹聚合物及其制备方法和用途。
背景技术
异丙酚(Propofol)即2，6-二异丙基苯酚，是一种静脉麻醉药，因起效快、作用时间短、苏醒迅速、无积蓄，且副作用小等特性，被人称为“跨世纪”的新型静脉麻醉药。目前，被国内外广泛应用于临床麻醉及ICU镇静。
异丙酚的生物样品检测目前多采用HPLC法，气相—质谱法，荧光光谱法等检测其浓度。无论采用何种方法，生物样品前处理是分析成败的关键，它决定样品的分析速度，准确度及精密度，且是误差的重要来源。目前异丙酚生物样品前处理多采用蛋白沉淀法、液液萃取法和固相萃取法。沉淀法会使异丙酚随蛋白共沉淀造成回收率低，结果误差大。液液萃取法用于提取血浆中异丙酚时，提取量与异丙酚浓度之间的线性关系不理想，在溶剂挥发过程中，存在异丙酚随氮气流挥发的可能性。此方法比较复杂耗时，有机溶剂耗量大，在提取过程中常发生乳化现象及被测组分丢失。目前，固相萃取柱的填充剂主要有氧化铝、硅藻土、活性炭、C18、离子交换树脂等，这些填充剂的选择性不够高，在富集待测物的同时大量基体和干扰物质也被富集，干扰最后的分析。
尽管固相萃取(solid-phaseextraction.SPE)由于其简单、便宜、有机溶剂用量少、易实现自动化等优点，正在日益取代传统的液液萃取，但是，普通的固相萃取填料选择性不够高，导致测定时基体干扰严重，使固相萃取广泛应用受到很大的限制。
发明内容
本发明提供了一种异丙酚分子印迹聚合物和异丙酚分子印迹固相萃取柱及其制备方法和用途，其克服了上述现有技术之不足，该异丙酚分子印迹固相萃取柱能方便、高选择性地分离与富集复杂生物样品中的异丙酚。
本发明的技术方案之一是通过以下方式得到的：一种异丙酚分子印迹聚合物，其特征在于该分子印迹聚合物的功能单体为甲基丙烯酸，交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯，印迹分子为异丙酚。
下面是对上述技术方案之一的进一步优化和/或选择：
上述印迹分子、功能单体、交联剂三者之间的摩尔配比为1：4至6：16至30。
上述异丙酚印迹分子与引发剂之间的配比量为30至100mg的引发剂/mmol的异丙酚印迹分子。
上述引发剂采用偶氮二异丁腈即AIBN。
本发明的技术方案之二是通过以下方式得到的：一种上述异丙酚分子印迹聚合物的制备方法，其按下述步骤进行：先在容器中加入所需要量的印迹分子异丙酚，其次加入所需要量的体积比为9:1的己烷/甲苯溶剂和功能单体甲基丙烯酸，然后置于超声波发生器上超声1小时，使异丙酚和功能单体甲基丙烯酸充分作用形成复合物，再加入所需要量的二甲基丙烯酸乙二醇酯交联剂和偶氮异丁腈引发剂，在充分混合后超声30分钟，真空条件下除去气体，用氮气鼓泡5分钟至8分钟之后，在真空状态下密封并在60℃恒温水浴锅中聚合24小时或置于冰水浴中进行光聚合8小时，制得块状聚合物；将该块状聚合物碾碎并过200至400目筛后，反复漂洗，洗去极细颗粒，干燥后将其均匀装入色谱柱，以甲醇为流动相洗去印迹分子、未聚合的单体及交联剂，再通过正己烷，用HPLC分析检测至目标分子洗脱干净后，干燥，贮存于真空干燥器中，即得到所需的异丙酚分子印迹聚合物。
本发明的技术方案之三是通过以下方式得到的：上述异丙酚分子印迹聚合物制备异丙酚分子印迹固相萃取柱。
本发明的技术方案之四是通过以下方式得到的：上述异丙酚分子印迹固相萃取柱的制备方法是将上述分子印迹聚合物填充在聚丙烯外壳的小柱内得异丙酚分子印迹固相萃取柱。
本发明的技术方案之五是通过以下方式得到的：上述异丙酚分子印迹固相萃取柱的用途在于利用该异丙酚分子印迹固相萃取柱分离富集异丙酚的生物样品。
下面是对上述技术方案之五的进一步优化和/或选择：
用上述异丙酚分子印迹固相萃取柱在前处理异丙酚的血浆样品和全血样品，以正己烷为活化剂，摩尔比为9：1的正己烷与甲苯为淋洗剂，甲醇为洗脱剂。
本发明以异丙酚作分子模板制备异丙酚分子印迹聚合物，它是一种有固定孔穴大小和形状及有确定排列功能基团的交联聚合物，它对异丙酚模板分子的立体结构具有“记忆”功能，此材料可用作固相萃取柱和色谱柱的填料来高选择性地分离富集复杂生物样品中的异丙酚。本发明异丙酚分子印迹固相萃取柱较普通溶剂萃取法、C18固相萃取法更为简单、快速、高效。
附图说明
附图1为分子印迹聚合物的制备过程示意图。附图2为本发明异丙酚分子印迹聚合物的制备示意图。
附图3为P(PRO)和P(B)的结合等温线。
附图4为评价P(PRO)和P(B)结合性质的Scatchard图。附图5为底物结构示意图。
附图6为不同溶剂活化下印迹聚合物对异丙酚的吸附率。
附图7为不同装载液对MI-SPE吸附率的影响。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制，可根据上述本发明的技术方案和实际情况来确定具体的实施方式。
下面结合实施例对本发明作进一步论述：
实施例1，该分子印迹聚合物的功能单体为甲基丙烯酸，交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯，印迹分子为异丙酚。
实施例2，与实施例1的不同之处在于：实施例2的印迹分子、功能单体、交联剂三之间的摩尔配比为1：4至6：16至30。
实施例3，与实施例2的不同之处在于：实施例3的异丙酚印迹分子与引发剂之间的配比量为30至100mg的引发剂/mmol的异丙酚印迹分子。
实施例4，与实施例3的不同之处在于：实施例4的引发剂采用偶氮二异丁腈即AIBN。
实施例5，上述异丙酚分子印迹聚合物的制备方法是按下述步骤进行：
分子印迹聚合物的制备包括：(1)在适当介质中，印迹分子(Template Molecule)与具有适当功能基团的功能单体(Functional Monomer)形成某种可逆的主客体配合物(Host-guest Complex)；(2)加入交联剂(cross-linker)，引发剂在热或光引发下，在印迹分子—功能单体配合物周围发生聚合反应，在此过程中，聚合物链将模板分子—功能单体的配合物“捕获”到聚合物的立体结构中；(3)通过一定的物理或化学方法将聚合物中的印迹分子洗脱(extraction)或解离(dissociation)出来，这样在聚合物的骨架上就留下了与印迹分子具有“预定”选择性的空间和结合位点(binding sites)，如附图1所示。
由于分子印迹聚合物以其对模板分子高度的特异选择性和亲和性，使分子印迹技术在分离技术领域有了一定的发展空间，为生物样品前处理提供了有效的解决方法。
所需药品、试剂及仪器
异丙酚(Propofol，2，6-二异丙基-苯酚，99.9％(w/w)，LGC Promochem，)；甲基丙烯酸(MAA，天津博迪化工有限公司)；二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA，广州双键贸易有限公司)；偶氮二异丁腈(AIBN，常州市傲华化工有限公司)；甲苯；正己烷；甲醇；甲醇；麝香草酚(Thymol，5-甲基-2-异丙基苯酚，天津市天新精细化工开发中心)。
微量移液器(上海求精生化试剂仪器有限公司，WKY型)；离心机(LD4-2，北京医用离心机长)；电热恒温水浴锅(DK-S22，上海精宏实验设备有限公司)；电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9053A，上海精宏实验设备有限公司)；氮气(工业氮)；HPLC(Agilent 1100；5μm，46×250mm)；扫描电镜(JEOL，JSM-6390LV)；电子光学透射电镜(JEOL，JEM-1230)；超声仪(SK2510HP，上海科导)；紫外灯(ZF-20C，12W，上海宝山顾村电光仪器厂)；红外光谱扫描仪(IR Prestige-21，日本岛津)；分析天平(AB104-N，梅特勒托利多)；电热恒温振荡水槽(DKZ-1，上海精宏实验设备有限公司)。
实验步骤
1 印迹聚合物的合成路线如附图2所示。
2 制备方法
2.1 印迹聚合物(P(PRO))的制备
在三颈鸡心瓶中加入模板分子异丙酚(简称为PRO)0.1783g(1mmol)，己烷/甲苯(v/v，9:1)溶剂10ml和MAA0.5100g(6mmol)，置于超声波发生器上超声1小时，使异丙酚和MAA充分作用形成复合物，再加入DEMA5.9466g(30mmol)，AIBN20mg。充分混合后超声30分钟，真空条件下除去气体，用氮气鼓泡5—8分钟之后，在真空状态下密封并在60℃恒温水浴锅中聚合24小时或置于冰水浴中进行光聚合8小时，制得块状聚合物。
大量的聚合物在研钵中碾碎，过200-400目筛后，反复漂洗，洗去极细颗粒，干燥。
将印迹聚合物均匀装入色谱柱，以甲醇为流动相洗去印迹分子、未聚合的单体及交联剂，再通过正己烷，用HPLC分析检测至目标分子洗脱干净后，干燥，贮存于真空干燥器中。即得到所需的分子印迹聚合物。
2.2 非印迹聚合物(P(B))的制备
非印迹聚合物的制备除不加模板分子外，其余操作步骤同上。
3 制备的影响因素考察
在MIP的合成中，功能单体和交联剂的用量会影响聚合物的性质。
本文以硬度和疏松程度为指标，通过实验考察了模板分子、功能单体和交联剂三者的比例分别为1:4:16、1:4:20、1:6:30(摩尔比)时合成的聚合物。实验优化了模板分子、功能单体和交联剂三者的比例，并用于后续实验。
4 聚合物性质考察
4.1 结合实验
称取20.0mg异丙酚分子印迹聚合物(P(PRO))10份，置于10ml磨口锥形瓶中，分别加入3.0ml不同浓度的异丙酚溶液，放入恒温(25℃)水浴振荡器中，振荡18小时，离心后取上层清液，用荧光分光光度法测定其荧光强度，平行测定三次取平均值。同时用非印迹聚合物(P(B))作对照。计算模板分子的游离浓度、印迹聚合物对模板分子的单位结合量，做结合等温线、Scatchard图，评价印迹聚合物的结合性质。
选用与异丙酚(PRO)结构相似的麝香草酚(Thymol，简称为THY)为对照分子，研究P(PRO)对底物的选择结合特性。
称取20.0mg异丙酚分子印迹聚合物(P(PRO))10份，置于10ml磨口锥形瓶中，分别加入底物初始浓度为28.0μmol/L，体积为3.0ml的异丙酚溶液和麝香草酚溶液，放入恒温(25℃)水浴振荡器中，振荡18小时，离心后取上层清液，用荧光分光光度法测定其荧光强度，平行测定三次取平均值。同时用非印迹聚合物(P(B))作对照。
5 结果与讨论
5.1 功能单体和交联剂的用量
在MIP的合成中，功能单体的用量对MIP的识别性能有影响。在聚合过程中如有过量的功能单体未能与模板分子聚合，并以游离单体的形式存在，则会与待测物进行非选择性作用，影响MIP的特异性。
交联剂的合适用量对保持MIP中识别空穴的三维空间结构非常重要。交联剂用量少，则交联度较低，不利于稳定识别空穴的三维空间结构；交联度太高，则传质阻力太大，不利于模板的抽提和识别。
本发明通过大量实验考察，当模板分子、功能单体和交联剂三者的比例为1:4:16和1:4:20时，聚合24小时后聚合物上层有淤积液，当三者比例为1:6:30时合成的聚合物干燥且无淤积液，硬度适当，表面无皲裂，有疏松空隙。后将此比例用于异丙酚分子印迹聚合物的合成。
5.2 聚合物性质
5.2.1 聚合物的结合特性
为研究聚合物的结合特性，用平衡吸附实验法测定了异丙酚分子印迹聚合物和空白聚合物的结合量Q对不同浓度异丙酚吸附液的结合等温线，用实验所得数据绘附图3所示。
在分子印迹中常用Scatchard模型评价分子印迹聚合物的结合特性。Scatchard方程如下：
Q/C＝[Qmax-Q]/Kd
其中：Kd代表结合位点的平衡离解常数；Qmax代表结合位点的最大表观结合量；C代表异丙酚在吸附液中的平衡浓度。将所得数据用于Scatchard分析，用Q/C对Q作图，得Scatchard图，附图4所示。
在Scatchard图中Q/C对Q明显是非线性关系，这说明异丙酚分子印迹聚合物中的识别位点具有不同的作用性质。在图的两端有两个明显的部分分别具有良好的线性关系，这证明在所研究的异丙酚浓度范围内，印迹聚合物主要存在两类不同的结合位点，由它们的斜率和截距可分别求出高亲和力和低亲和力结合位点的离解常数和最大表观结合量，结果见表1。
5.2.2 P(PRO)对底物的选择性(本发明的底物为与异丙酚化学结构相似的一类化合物，下述底物都为本发明的底物)
选用与异丙酚(PRO)结构相似的麝香草酚(THY)为对照分子(结构如附图5)，研究了P(PRO)对底物的选择结合特性，用平衡结合法分别测定了P(PRO)和P(B)对模板分子PRO和对照分子THY的结合量，结果见表2。
由表2可看出，P(PRO)对异丙酚的结合量高于P(B)对异丙酚的结合量，并且高于对有相似结构的麝香草酚的结合量。这是因为在印迹聚合物中，不但具有与异丙酚的官能团作用的功能基团，而且具有与异丙酚的立体结构相互补的特定形状的孔穴；而在非印迹聚合物中起作用的功能基团的分布是任意的，且不存在形状和大小相匹配的结合位点；对麝香草酚来说，只有酚羟基一个官能团，而没有适合印迹孔穴的立体结构。因此，印迹聚合物P(PRO)对PRO展现的特异选择性正是功能基团和孔穴立体形状同时作用的结果。
本发明与现有技术即旧技术差别对比：
 
本发明 现有技术即旧技术
引发剂 偶氮二异丁腈(AIBN) 1，1_-azobis(cyclohexanecarbonitrile)(ABCHC，不易购买，价格贵成本高)    
功能单体∶交联剂 1∶5 1∶1
测定方法 荧光分光光度法 比色法(根据液体颜色深浅)
应用 作为系统中的固相萃取材料                     识别材料
实施例6，该异丙酚分子印迹固相萃取柱用上述异丙酚分子印迹聚合物制备而成，并用分子印迹固相萃取-荧光法来分析异丙酚的血药浓度，并与传统的C18固相萃取-荧光法进行了比较，用分子印迹固相萃取柱直接前处理异丙酚的血浆样品和全血样品(生物样品之一)，
具体过程如下：
1 试剂和仪器
甲基丙烯酸(MAA，天津市博迪化工有限公司，分析纯)，偶氮二异丁腈(AIBN，北京化工厂，化学纯)，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA，广州双键贸易有限公司，分析纯)，异丙酚标准品(propofol，2，6-二异丙基苯酚，99.9(w/w)，LGC Promochem)，正己烷(上海山浦化工有限公司，分析纯)，甲苯，甲醇，乙腈(天津市北方天医化学试剂厂，分析纯)，氮气(99.9％的工业氮)，所用水为二次蒸馏水。
荧光分光光度仪(RF-540，日本岛津)；快速混匀器(SK-1，金坛市医疗仪器厂)；离心机(SIGMA 2-16，德国赛多利斯)；分析天平(AB104-N，梅特勒托利多)；超声仪(SK2510HP，上海科导)；C18固相萃取柱(河北津杨滤材厂)；固相萃取装置(SUPELCO，美国)。
2 实验方法
2.1 制备分子印迹固相萃取柱
将新购置的C18固相萃取柱内容物取出，用甲醇作载体，将0.50克制备的异丙酚分子印迹聚合物颗粒装到萃取柱中。这样就得到了具有再吸附目标分子的分子印迹固相萃取柱。
2.2 固相萃取操作
每次上样之前，固相萃取柱都先用活化剂活化，再用2ml溶剂平衡后，将分析物溶液过柱，然后用淋洗液(正己烷：甲苯＝9：1)冲洗，最后用洗脱液洗柱子，待测液经氮气吹干后，用3ml甲醇溶解并用RF-540测定其浓度。
2.3 标准曲线的制备
2.3.1 异丙酚正己烷溶液标准曲线的制备
精密吸取17.8μl的异丙酚标准品，用正已烷稀释到100ml得1mM的储备液。分别吸取上述储备液2、4、6、8和10ml，用正几烷稀释到100ml，得0.02mM、0.04mM、0.06mM、0.08mM和0.1mM的异丙酚正已烷溶液。
以浓度为纵坐标，荧光强度为横坐标进行线性回归，得上述系列溶液的回归方程为C＝0.0022F-0.0353(r＝0.9991)。
2.3.2 异丙酚甲醇溶液标准曲线的制备
精密吸取5μl的异丙酚标准品，用甲醇稀释到50ml得100μg/ml的储备液。分别吸取上述储备液0.25、0.5、1.25、2.5和3.75ml，用甲醇稀释到25ml，得1、2、5、10和15μg/ml的异丙酚甲醇溶液。
以浓度为纵坐标，荧光强度为横坐标进行线性回归，得上述系列溶液的回归方程为C＝1.3249F-0.2936(r＝0.9997)。
2.3.3 异丙酚乙腈溶液标准曲线的制备
精密吸取5μl的异丙酚标准品，用乙腈稀释到50ml得100μg/ml的储备液。分别吸取上述储备液0.25、0.50、1.25、2.50和3.75ml，用乙腈稀释到25ml，得1、2、5、10和15μg/ml的异丙酚甲醇溶液。
以浓度为纵坐标，荧光强度为横坐标进行线性回归，得上述系列溶液的回归方程为C＝0.3840F-0.4650(r＝0.9997)。
2.4 分子印迹固相萃取条件的选择
2.4.1 活化剂的选择
取3根分子印迹固相萃取柱，上样之前，分别用4ml正己烷、甲醇和乙腈中的一种活化，再用2ml正己烷平衡后，抽干，用0.1mM的异丙酚正己烷溶液1ml上样，接收液用正己烷稀释到5ml，测在RF-540上测它们的荧光强度，由异丙酚正己烷溶液的标准曲线分别算出它们的吸附率。
2.4.2 装载液对吸附率的影响
分别配制5μg/ml的异丙酚甲醇、乙腈和正己烷溶液中的一种，4ml正己烷活化柱子后，2ml相应溶剂平衡柱子，抽干，在0.5ml/min流速下，装载1ml上述溶液，过分子印迹固相萃取柱，接收液用相应溶剂稀释到5ml，在荧光分光光度计(RF-540)上测定它们的荧光强度，代入相应的标准曲线分别算出它们的吸附率。
2.4.3 洗脱剂的选择
配置不同的洗脱剂:甲醇、乙腈和甲醇-乙酸(V/V，7:3)(混合)中的一种。用5μg/ml异丙酚正己烷溶液1ml过柱，之后每次用3ml的洗脱剂洗脱，每次的洗脱流出液经氮气吹干后用3ml的甲醇定溶，用荧光分光光度计RF-540测定其中底物浓度。
2.5 分子印迹固相萃取柱与C18柱的萃取效果比较(固相萃取及荧光法测定人血浆中异丙酚的浓度)
2.5.1 系列浓度异丙酚甲醇溶液的配制
将含1.00g的异丙酚(纯度为99.9％)转移至100ml量瓶中，用甲醇定容，精密吸取此液lml，置于100ml量瓶中，加甲醇稀释定容为100μg/ml异丙酚标准溶液，于4℃冰箱内储存。
取上述贮备液适量，配成浓度为1、2、4、10、15和20μg/ml的甲醇溶液。
2.5.2 样品的处理
取空白血浆1ml，置具塞离心管中，精密加入上述不同浓度的异丙酚甲醇溶液1ml，离心取上清液，依次用4ml正己烷活化C18固相萃取小柱和分子印迹固相萃取小柱后，2ml水平衡柱子，抽干，加入混合液，负压抽滤，用4ml正己烷：甲苯液(9：1)洗涤固相萃取小柱，再用6ml甲醇3次提取，在室温下氮气流吹干，残渣用3ml甲醇溶解，测定该液荧光强度F。
2.5.3 回收率的测定
配制浓度为0.5、3.0、5.0μg.ml-1的血浆样品各12份，按“2.5.2”项方法进行测定。
2.6 直接上样实验
用4ml正己烷活化柱子后，2ml水平衡，抽干，在0.5ml/min流速下，分别装载1、2、3、6、10μg.ml-1的异丙酚血浆样品1ml过分子印迹固相萃取柱，然后先后用2ml水和2ml正己烷：甲苯(9：1)淋洗，之后用6ml的甲醇(3次)洗脱，洗脱接收液在室温下氮气流吹干，残渣用3ml甲醇溶解，RF-540测定其荧光强度。
3 结果和讨论
3.1 活化剂的选择
极性较小的正己烷作为活化剂时印迹聚合物对异丙酚的吸附率较高。因为印迹聚合物是在极性较低正己烷：甲苯(9：1)条件下合成的，用极性较高的甲醇和乙腈活化柱子对聚合物的孔穴有一定损伤，从而导致吸附率下降，如附图6所示。
3.2 装载液对吸附率的影响
极性较高的甲醇作为装载液时印迹聚合物对异丙酚的吸附率较低，只有66.70％。说明溶剂的极性会影响固相萃取对模板的的吸附。高极性的有机溶剂甲醇减弱了印迹聚合物和异丙酚之间的氢键作用，同时，甲醇和印迹聚合物竞争性的夺取异丙酚，这导致异丙酚的泄漏量增多，印迹聚合物对异丙酚的吸附量减少，如附图7所示。
3.3 洗脱剂的选择
洗脱剂一般选择甲醇、乙腈、乙酸和乙醇等极性溶剂以破坏底物与识别位点所形成的氢键作用。异丙酚为脂溶性药物，有酚羟基，不溶于水，本发明优选甲醇、乙腈和甲醇-乙酸(V/V，7:3)作为洗脱剂，并研究洗脱次数对回收率的影响。单次洗脱体积为3ml，正己烷为样品溶剂，测定每次洗脱对异丙酚的回收率。实验结果表明，在相同条件下，甲醇的单次洗脱回收率为96.34％，乙腈为87.79％，甲醇-乙酸(V/V，7:3)为82.56％，将异丙酚洗脱完全，甲醇需要2次洗脱，而乙腈需要1次，甲醇-乙酸(V/V，7:3)需要2次，经过3次洗脱后，使用甲醇为洗脱溶剂累计回收率为99.94％，使用乙腈累计回收率为87.79％，使用甲醇-乙酸(V/V，7:3)为洗脱溶剂累计回收率为83.86％。综合考虑三种洗脱溶剂的洗脱效果，选择甲醇为最佳的洗脱溶剂。如表3所示。
3.4 异丙酚分子印迹固相萃取柱(即MISPE)与C18柱的固相萃取效果比较(固相萃取及荧光法测定人血浆中异丙酚的浓度)。
3.4.1 标准曲线的制备 分别精密吸取上述系列浓度的异丙酚甲醇溶液1ml，加入1ml新鲜空白血浆中，制成浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、7.5、和10.0μg/ml的溶液，按2.5.2操作，测定该液荧光强度F。以浓度为纵坐标，荧光强度为横坐标进行线性回归，得C18固相萃取小柱处理后样品的回归方程为C＝0.3578F-0.0953(r＝0.9941)，分子印迹固相萃取小柱处理后样品的回归方程为C＝0.2772F+0.0082(r＝0.9995)。
3.4.2 回收率的测定于新鲜空白血浆中加入一定量的异丙酚，按回收率方法操作并计算。结果表明异丙酚浓度在0.5-10.0μg/ml范围内，C18固相萃取小柱处理后的平均回收率为73.50％±3.23％，RSD＝4.39％，分子印迹固相萃取小柱处理后的平均回收率为82.62％±2.96％，RSD＝3.42％。
通过上述标准曲线的线性和和回收率的比较可以看出，相比于C18固相萃取柱来说，MIP作为SPE的萃取材料在线性和准确度上都表现出了明显的优势。
3.5 异丙酚血浆样品的直接上样实验
用RF-540荧光分光光度计反复扫描系列浓度异丙酚血浆溶液上样后洗脱液的荧光光谱，确定λex＝280nm，λem＝300nm，以浓度为纵坐标，荧光强度为横坐标进行线性回归，得样品的回归方程为C＝1.6028F-5.5375(r＝0.9788)。从回归方程可以看出，直接上样后洗脱液的荧光强度随样品浓度的增大而增强。
从表4说明，以上说明异丙酚的血浆样品可以直接用MI-SPE(分子印迹固相萃取柱)萃取。
本发明与现有技术即旧技术差别对比：
 
本发明 现有技术即旧技术
固相萃取填料 异丙酚分子印迹聚合物 C18
活化剂 正己烷 甲醇和水
淋洗剂 正己烷：甲苯(9：1) 蒸馏水
富集选择性 对待测物有较好的富集选择性 无
前处理生物样品的效果                 标准曲线有较好的线性，且回收率较高                           标准曲线线性和回收率都一般
表1 Scatchard曲线分析结果
 
                               高亲和力结合位点   低亲和力结合位点  
离解常数Kd(mol/L)             4.88×10-3       5.71×10-2      
最大表观结合量Qmax(μ mol/g)   4.69              30.69            
表2 不同底物在P(PRO)和P(B)上的结合量(μ mol/g)
 
底物     异丙酚(Propofol)   麝香草酚(Thymol)  
P(PRO)   10.4              5.5              
P(B)     3.6               2.8              
表3 洗脱溶剂及洗脱次数对MISPE回收率的影响
Figure A200810305314D00141
表4 系列浓度异丙酚血浆溶液上样后洗脱液的荧光强度
 
样品               1            2            3            4            5           
浓度(μ g/ml) 1.00        2.00        3.00        6.00        10.00      
荧光强度(F)Mean±SD           3.60±0.1 4.80±0.1 5.80±0.2 7.60±0.2 9.20±0.2

Claims (10)

  1. 【权利要求1】1、一种异丙酚分子印迹聚合物，其特征在于该分子印迹聚合物的功能单体为甲基丙烯酸，交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯，印迹分子为异丙酚。
  2. 【权利要求2】2、根据权利要求1所述的异丙酚分子印迹聚合物，其特征在于印迹分子、功能单体、交联剂三者之间的摩尔配比为1：4至6：16至30。
  3. 【权利要求3】3、根据权利要求2所述的异丙酚分子印迹聚合物，其特征在于异丙酚印迹分子与引发剂之间的配比量为30至100mg的引发剂/mmol的异丙酚印迹分子。
  4. 【权利要求4】4、根据权利要求3所述的异丙酚分子印迹聚合物，其特征在于引发剂采用偶氮二异丁腈即AIBN。
  5. 【权利要求5】5、根据权利要求4所述的异丙酚分子印迹聚合物，其特征在于该异丙酚分子印迹聚合物按下述步骤得到：先在容器中加入所需要量的印迹分子异丙酚，其次加入所需要量的体积比为9:1的己烷/甲苯溶剂和功能单体甲基丙烯酸，然后置于超声波发生器上超声1小时，使异丙酚和功能单体甲基丙烯酸充分作用形成复合物，再加入所需要量的二甲基丙烯酸乙二醇酯交联剂和偶氮异丁腈引发剂，在充分混合后超声30分钟，真空条件下除去气体，用氮气鼓泡5分钟至8分钟之后，在真空状态下密封并在60℃恒温水浴锅中聚合24小时或置于冰水浴中进行光聚合8小时，制得块状聚合物；将该块状聚合物碾碎并过200至400目筛后，反复漂洗，洗去极细颗粒，干燥后将其均匀装入色谱柱，以甲醇为流动相洗去印迹分子、未聚合的单体及交联剂，再通过正己烷，用HPLC分析检测至目标分子洗脱干净后，干燥，贮存于真空干燥器中，即得到所需的异丙酚分子印迹聚合物。
  6. 【权利要求6】6、一种根据权利要求1或2或3或4所述的异丙酚分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于按下述步骤进行：先在容器中加入所需要量的印迹分子异丙酚，其次加入所需要量的体积比为9:1的己烷/甲苯溶剂和功能单体甲基丙烯酸，然后置于超声波发生器上超声1小时，使异丙酚和功能单体甲基丙烯酸充分作用形成复合物，再加入所需要量的二甲基丙烯酸乙二醇酯交联剂和偶氮异丁腈引发剂，在充分混合后超声30分钟，真空条件下除去气体，用氮气鼓泡5分钟至8分钟之后，在真空状态下密封并在60℃恒温水浴锅中聚合24小时或置于冰水浴中进行光聚合8小时，制得块状聚合物；将该块状聚合物碾碎并过200至400目筛后，反复漂洗，洗去极细颗粒，干燥后将其均匀装入色谱柱，以甲醇为流动相洗去印迹分子、未聚合的单体及交联剂，再通过正己烷，用HPLC分析检测至目标分子洗脱干净后，干燥，贮存于真空干燥器中，即得到所需的异丙酚分子印迹聚合物。
  7. 【权利要求7】7、一种根据权利要求1或2或3或4或5所述的异丙酚分子印迹聚合物的异丙酚分子印迹固相萃取柱，其特征在于用该异丙酚分子印迹聚合物制备异丙酚分子印迹固相萃取柱。
  8. 【权利要求8】8、一种根据权利要求7所述的异丙酚分子印迹固相萃取柱的制备方法，其特征在于将上述分子印迹聚合物填充在聚丙烯外壳的小柱内得异丙酚分子印迹固相萃取柱。
  9. 【权利要求9】9、一种根据权利要求7所述的异丙酚分子印迹固相萃取柱的用途，其特征在于利用该异丙酚分子印迹固相萃取柱分离富集异丙酚的生物样品。
  10. 【权利要求10】10、根据权利要求9所述的异丙酚分子印迹固相萃取柱的用途，其特征在于用该异丙酚分子印迹固相萃取柱在前处理异丙酚的血浆样品和全血样品，以正己烷为活化剂，摩尔比为9：1的正己烷与甲苯为淋洗剂，甲醇为洗脱剂。
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