PL202679B1 - Sposób identyfikacji biologicznie aktywnych substancji chemicznych - Google Patents
Sposób identyfikacji biologicznie aktywnych substancji chemicznychInfo
- Publication number
- PL202679B1 PL202679B1 PL357350A PL35735000A PL202679B1 PL 202679 B1 PL202679 B1 PL 202679B1 PL 357350 A PL357350 A PL 357350A PL 35735000 A PL35735000 A PL 35735000A PL 202679 B1 PL202679 B1 PL 202679B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- mixture
- chemicals
- complex
- substances
- target biological
- Prior art date
Links
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 188
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 85
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 80
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title description 4
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 title description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 39
- 239000005445 natural material Substances 0.000 claims description 22
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 20
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 12
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 12
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 10
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 9
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 8
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 238000011209 electrochromatography Methods 0.000 claims description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 7
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 6
- 102000016966 beta-2 Adrenergic Receptors Human genes 0.000 claims description 6
- 108010014499 beta-2 Adrenergic Receptors Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 5
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 claims description 5
- 238000005319 nano flow HPLC Methods 0.000 claims description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 claims description 5
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 claims description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000004850 capillary HPLC Methods 0.000 claims description 3
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims description 3
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 claims description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 3
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 abstract description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 10
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 8
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 7
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000245665 Taraxacum Species 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 108010067463 CRC 220 Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- ZNIFSRGNXRYGHF-UHFFFAOYSA-N Clonidine hydrochloride Chemical compound Cl.ClC1=CC=CC(Cl)=C1NC1=NCCN1 ZNIFSRGNXRYGHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 229960002925 clonidine hydrochloride Drugs 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- AKUVRZKNLXYTJX-UHFFFAOYSA-N 3-benzylazetidine Chemical compound C=1C=CC=CC=1CC1CNC1 AKUVRZKNLXYTJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFYRPLNVJVHZGT-UHFFFAOYSA-N Amitriptyline hydrochloride Chemical compound Cl.C1CC2=CC=CC=C2C(=CCCN(C)C)C2=CC=CC=C21 KFYRPLNVJVHZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000005187 Taraxacum officinale ssp. officinale Nutrition 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 229960005119 amitriptyline hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 229960002335 bromhexine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 229960001657 chlorpromazine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- YRSGDLIATOURQO-UHFFFAOYSA-N ethyl 4-acetyl-5-oxohexanoate Chemical compound CCOC(=O)CCC(C(C)=O)C(C)=O YRSGDLIATOURQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000003176 neuroleptic agent Substances 0.000 description 2
- 230000000701 neuroleptic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000011885 synergistic combination Substances 0.000 description 2
- 150000003505 terpenes Chemical group 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N (-)-Nicotine Chemical compound CN1CCC[C@H]1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- MVTHUEOHHHQQKY-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-(diaminomethylideneamino)-3-phenylpropanoic acid Chemical compound NC(N)=N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MVTHUEOHHHQQKY-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- XPRCPVGCTGELMN-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-amino-3-(4-carbamimidoylphenyl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(C(N)=N)C=C1 XPRCPVGCTGELMN-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- GUJAGMICFDYKNR-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzodiazepine Chemical class N1C=CN=CC2=CC=CC=C12 GUJAGMICFDYKNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- KUVIULQEHSCUHY-XYWKZLDCSA-N Beclometasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(Cl)[C@@H]1[C@@H]1C[C@H](C)[C@@](C(=O)COC(=O)CC)(OC(=O)CC)[C@@]1(C)C[C@@H]2O KUVIULQEHSCUHY-XYWKZLDCSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 244000258539 Epigaea repens Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 208000024777 Prion disease Diseases 0.000 description 1
- 240000001949 Taraxacum officinale Species 0.000 description 1
- 235000006754 Taraxacum officinale Nutrition 0.000 description 1
- 229940123445 Tricyclic antidepressant Drugs 0.000 description 1
- 101710119641 Trypsin-6 Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N acetylcholine Chemical compound CC(=O)OCC[N+](C)(C)C OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004373 acetylcholine Drugs 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000384 adrenergic alpha-2 receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical group 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical group 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 1
- 229960000836 amitriptyline Drugs 0.000 description 1
- KRMDCWKBEZIMAB-UHFFFAOYSA-N amitriptyline Chemical compound C1CC2=CC=CC=C2C(=CCCN(C)C)C2=CC=CC=C21 KRMDCWKBEZIMAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 1
- 229960003870 bromhexine Drugs 0.000 description 1
- OJGDCBLYJGHCIH-UHFFFAOYSA-N bromhexine Chemical compound C1CCCCC1N(C)CC1=CC(Br)=CC(Br)=C1N OJGDCBLYJGHCIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 229960001076 chlorpromazine Drugs 0.000 description 1
- ZPEIMTDSQAKGNT-UHFFFAOYSA-N chlorpromazine Chemical compound C1=C(Cl)C=C2N(CCCN(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 ZPEIMTDSQAKGNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011960 computer-aided design Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940067866 dandelion extract Drugs 0.000 description 1
- 235000020691 dandelion extract Nutrition 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical group 0.000 description 1
- 239000003172 expectorant agent Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 150000002391 heterocyclic compounds Chemical group 0.000 description 1
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229910001867 inorganic solvent Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003049 inorganic solvent Substances 0.000 description 1
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002596 lactones Chemical group 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 229940066491 mucolytics Drugs 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 229960002715 nicotine Drugs 0.000 description 1
- SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N nicotine Natural products CN1CCCC1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 238000002638 palliative care Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000197 pyrolysis Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- QEVHRUUCFGRFIF-MDEJGZGSSA-N reserpine Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@H]2C[C@@H]3C4=C(C5=CC=C(OC)C=C5N4)CCN3C[C@H]2C1)C(=O)OC)OC)C(=O)C1=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 QEVHRUUCFGRFIF-MDEJGZGSSA-N 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000007127 saponification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 101150008563 spir gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001256 steam distillation Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical group 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 229920001864 tannin Polymers 0.000 description 1
- 239000001648 tannin Substances 0.000 description 1
- 235000018553 tannin Nutrition 0.000 description 1
- 239000001845 taraxacum officinale leaf extract Substances 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- 235000007586 terpenes Nutrition 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003029 tricyclic antidepressant agent Substances 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
- G01N30/38—Flow patterns
- G01N30/46—Flow patterns using more than one column
- G01N30/466—Flow patterns using more than one column with separation columns in parallel
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
- G01N2030/027—Liquid chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
- G01N2030/067—Preparation by reaction, e.g. derivatising the sample
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N2030/621—Detectors specially adapted therefor signal-to-noise ratio
- G01N2030/625—Detectors specially adapted therefor signal-to-noise ratio by measuring reference material, e.g. carrier without sample
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
- G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
- G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
- G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
- G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
- G01N2030/8831—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving peptides or proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
- Electrostatic Separation (AREA)
- Centrifugal Separators (AREA)
- Physical Or Chemical Processes And Apparatus (AREA)
- Hydrogenated Pyridines (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Extraction Or Liquid Replacement (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikacji biologicznie aktywnych substancji w mieszaninie substancji chemicznych.
Badania leków, w tym substancji aktywnych wytwarzanych drogą syntezy chemicznej z wykorzystaniem wyłącznie naturalnych źródeł oraz ich sprawdzanie na zwierzętach, doprowadziły do celowego, wspomaganego komputerowo projektowania struktury substancji aktywnych, z zastosowaniem metod doświadczalnych i teoretycznych.
Wraz z coraz głębszą znajomością różnych przyczyn chorób (np. wad lub genetycznie uwarunkowanych zmian białka) badania leków i terapia lekowa stały się znacznie bardziej skomplikowane. Tak więc w minionych dziesięciu latach metodami biologii molekularnej (projekt ludzkiego genomu) można było wyjaśnić przyczyny kilku głównie neurodegeneracyjnych chorób, takich jak choroba Alzheimera, choroba Parkinsona, choroba Huntingtona, stwardnienie zanikowe boczne, choroby prionowe i różne zespoły ataktyczne. Rozpoznanie zmian biologicznych leżących u podstaw chorób stanowi podstawę przestawienia się z leczenia objawowego, paliatywnego na leczenie przyczynowe.
Spośród 30000 opisanych w medycynie chorób 100 - 150 jest tak ważnych, że stanowią przedmiot projektów badawczych w przemyśle farmaceutycznym. Leki obecnie będące do dyspozycji nadają się do terapeutycznego oddziaływania na około 400 receptorów, enzymów i innych cząsteczek biologicznych. Należy jednak wziąć pod uwagę, że przedmiotem badań może być około 10000 genów i ich produktów jako substancji aktywnych. Udowodnienie ich patologicznej roli wymaga między innymi silnie reagującego układu molekularnego i komórkowego. Oprócz racjonalnego projektowania, uwzględniającego optymalizację właściwości substancji na podstawie wartości doświadczalnych lub na bazie znanych struktur molekularnych, w badaniach leków wielką rolę odgrywa obecnie chemia kombinatoryjna i rozwijająca się obecnie biosynteza kombinatoryjna.
Bardzo słabym punktem tych metod jest ograniczone zróżnicowanie substancji syntetycznych, w porównaniu ze strukturalną zło żonoś cią roś linnych i drobnoustrojowych wtórnych produktów metabolizmu.
W celu udostępnienia tej naturalnej różnorodności, niezbędne jest ścisłe powiązanie klasycznych badań substancji naturalnych z medycyną molekularną i chemią organiczną. W poszukiwaniu nowych struktur podstawowych organizmy roślinne i zwierzęce oraz grzyby i drobnoustroje dobiera się na zasadzie losowej, z punktu widzenia chemotaksonomii, na podstawie obserwacji ekologicznych i na podstawie wiedzy etnomedycznej.
Wykrywanie jednego lub większej liczby składników aktywnych w mieszaninie substancji, z wykorzystaniem np. biblioteki substancji otrzymanej metodą chemii kombinatoryjnej lub ekstraktów substancji naturalnych, jest jednak bardzo kosztowne.
Ekstrakty substancji naturalnych składają się ogólnie biorąc np. z dużej liczby (do 2000) różnorodnych substancji o polarności w całym zakresie, w zależności od różnego rodzaju struktur podstawowych i grup funkcyjnych. Zazwyczaj tylko stosunkowo niewiele związków stanowi około 80% masy ekstraktu, podczas gdy większość pozostałych związków występuje w niewielkim stężeniu w zakresie ppm, a więc w ilościach nierównoważnych molowo. Jednakże często w takim ekstrakcie tylko niewiele substancji lub nawet tylko jedna pojedyncza substancja wykazuje charakterystyczną aktywność biologiczną, przy czym aktywność tę można przypisać jednej substancji, występującej w ekstrakcie w ilości śladowej.
Dotychczas obróbkę i analizę składników naturalnych ekstraktów, najczęściej chromatograficznie rozdzielonych, lub obszernej biblioteki substancji, wytworzonej metodami chemii kombinatoryjnej, zwykle prowadzono z użyciem automatycznych wysokosprawnych układów do selekcjonowania (Highthroughput Screening; HTS). Ten sposób jest jednak bardzo kosztowny. Z tego względu wymagane jest najpierw wytworzenie selektywnych ekstraktów ze źródeł substancji naturalnych (np. roślin, zwierząt, grzybów, drobnoustrojów) z użyciem rozpuszczalników o wzrastającej polarności, a następnie badanie tych ekstraktów pod względem aktywności biologicznej. Dalsze badania prowadzi się po uzyskaniu podfrakcji z aktywnych wyselekcjonowanych ekstraktów.
Wreszcie końcowe badania muszą wykazać, która czysta substancja lub które czyste substancje po wyodrębnieniu z aktywnej frakcji wykazują aktywność biologiczną i stanowią „przebój”. Dla chromatograficznego rozdzielenia podbibliotek i ich zbadania potrzeba kilku tygodni. W celu otrzymania wystarczających ilości czystej (czystych) substancji trzeba stosować duże ilości ekstraktu wyjściowego.
PL 202 679 B1
Także taki proces jest kosztowny, co jest związane z wysoką ceną preparatywnych kolumn HPLC i dużym zużyciem rozpuszczalników (zarówno zakup, jak i usuwanie odpadów).
Już wskutek rozdzielenia na podfrakcje, a jeszcze tym bardziej wyodrębnienia czystej substancji naturalnej w wysokosprawnych sposobach selekcjonowania, traci się ewentualnie istniejące synergiczne lub antagonizujące działanie pojedynczych składników ekstraktu. Tak więc ekstrakt aktywny w pierwszym teście może stracić swoją skuteczność biologiczną, gdyż rozdzielenie na poszczególne substancje uniemożliwia tworzenie wiązania ze składnikiem stanowiącym cel, które możliwe jest tylko przy współdziałaniu różnych składników.
Sposób wykrywania aktywnych składników w syntetycznej, wytworzonej metodą chemii kombinatoryjnej bibliotece peptydów, składającej się z maksymalnie 19 chemicznie bardzo podobnych peptydów powstałych tylko przez wymianę aminokwasów i występujących w równomolowych ilościach, opisali Zuckermann i inni, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89, 4505-4509 (1992). Do tej biblioteki substancji peptydowych dodano w niedomiarze przeciwciało i drogą szybkiej filtracji żelowej oddzielono kompleks struktura docelowa (= przeciwciało)-peptyd. Peptyd uwolniono z kompleksu działaniem 1% kwasu trifluorooctowego i ustalono jego budowę metodą spektroskopii masowej i analizy aminokwasów. Ten sposób postępowania nie nadaje się jednak do wyodrębniania kompleksów: struktura docelowa-cząsteczka w przypadku mniejszych cząsteczek (masa cząsteczkowa co najwyżej 1500), gdyż filtracja żelowa sprawdza się tylko przy większych różnicach mas cząsteczkowych. Według autorów proces ten wymaga również mieszanin o jednakowych stężeniach molowych. Poza tym otrzymanie synergicznie działających kombinacji ligandów jest niemożliwe lub pozostawione przypadkowi.
Również doświadczenia opisane przez Wieboldta i innych w Anal. Chem., 69, 1683-1691 (1997) dotyczyły równomolowych mieszanin 20 - 30 ściśle spokrewnionych cząsteczek (syntetycznie wytwarzanych pochodnych o ogólnej strukturze 1,4-benzodiazepiny). Zawężone zróżnicowanie substancji syntetycznych ułatwia wprawdzie obróbkę doświadczalną, jednak równocześnie stanowi to czynnik ograniczający stosowalność.
Ultrafiltracja pulsacyjna ze spektroskopią masową, opisana przez R.B. van Breemena i innych w Anal. Chem., 69, 2159-2164 (1997), również wymaga równomolowej biblioteki substancji, zawierającej 20 substancji. Kowalencyjnie związane substancje nie mogą być wykryte, ponieważ uwalniają je tylko rozpuszczalniki organiczne.
Istniała zatem potrzeba opracowania szybko realizowanego, skutecznego sposobu wykrywania i wyodrębniania biologicznie, np. farmakologicznie aktywnych substancji chemicznych i kombinacji tych substancji, zwłaszcza w nierównomolowych mieszaninach, takich jak ekstrakty substancji naturalnych (np. z roślin, zwierząt, grzybów i drobnoustrojów).
Wynalazek dotyczy sposobu identyfikacji biologicznie aktywnych substancji chemicznych o masie cząsteczkowej w zakresie 150 - 300000 w mieszaninie substancji chemicznych, charakteryzującego się tym, że w następujących etapach:
a) do tej mieszaniny dodaje się docelową strukturę biologiczną i tworzy się kompleks docelowej struktury biologicznej i co najmniej jednej biologicznie aktywnej substancji chemicznej zawartej w mieszaninie, przy czym kompleks wytwarza się przez wiązanie co najmniej jednej substancji chemicznej z docelową strukturą biologiczną ,
b) wydziela się kompleks z mieszaniny, oraz
c) uwalnia się, wyodrębnia i identyfikuje co najmniej jedną biologicznie aktywną substancję chemiczną z wydzielonego kompleksu, albo
d) identyfikuje się co najmniej jedną biologicznie aktywną substancję chemiczną zawartą w mieszaninie na podstawie róż nicy pomiędzy chromatogramem mieszaniny substancji chemicznych przed dodaniem docelowej struktury biologicznej a chromatogramem mieszaniny substancji chemicznych otrzymanym po wydzieleniu kompleksu.
Korzystnie do mieszaniny substancji chemicznych dodaje się docelową strukturę biologiczną w postaci roztworu, zawiesiny lub dyspersji.
Korzystnie docelową strukturę biologiczną dodaje się w postaci roztworu wodnego.
Korzystnie wartość pH roztworu wodnego stabilizuje się odpowiednim buforem.
Korzystnie powstałe wiązanie ma charakter kowalencyjny lub niekowalencyjny.
W szczególności wią zania niekowalencyne stanowią mostki wodorowe, oddział ywania elektrostatyczne, wiązania kompleksowe z metalami, oddziaływania lipofilowych grup biologicznie aktywnej substancji chemicznej z docelową strukturą biologiczną, oddziaływania dipol-dipol lub oddziaływania kation-π.
PL 202 679 B1
Korzystnie kompleks wydziela się z mieszaniny substancji chemicznych metodą ultrafiltracji, ultrawirowania lub innymi odpowiednimi metodami.
Korzystnie wyodrębnia się i/lub identyfikuje co najmniej jedną biologicznie aktywną substancję chemiczną oddzielonego kompleksu takimi metodami jak HPLC, elektrochromatografia, elektroforeza, metody sprzężone, takie jak LC-MS lub MS-MS, korzystnie metodą mikrokapilarnej HPLC lub nano-HPLC.
Korzystnie co najmniej jedną biologicznie aktywną substancję chemiczną zawartą w mieszaninie identyfikuje się takimi metodami jak HPLC, elektrochromatografia, elektroforeza, metody sprzężone, takie jak LC-MS lub MS-MS, korzystnie metodą kapilarnej HPLC lub nano-HPLC.
Korzystnie co najmniej jedną biologicznie aktywną substancję chemiczną wydziela się z mieszaniny metodą preparatywnej HPLC, elektrochromatografii lub elektroforezy.
Korzystnie jako mieszaninę substancji chemicznych stosuje się bibliotekę substancji otrzymanych drogą syntezy lub metodami chemii kombinatoryjnej, albo ekstrakt substancji naturalnych.
Korzystnie jako mieszaninę substancji chemicznych stosuje się chemicznie modyfikowany ekstrakt substancji naturalnych.
Korzystnie również jako mieszaninę substancji chemicznych stosuje się mieszaninę różnych ekstraktów substancji naturalnych.
W pewnych przypadkach stosuje się mieszaninę substancji chemicznych zawierają c ą co najmniej 50 różnych substancji chemicznych.
W szczególności jako docelową strukturę biologiczną stosuje się białko.
Korzystnie jako docelową strukturę biologiczną stosuje się enzym, receptor, przeciwciało, błonę biologiczną lub komórkę.
W szczególnoś ci jako docelową strukturę biologiczną stosuje się enzym trombinę , enzym trypsynę, a także receptor adrenergiczny β2.
Dodatkowe lub w wyższym stężeniu występujące substancje, otrzymane w oddzielnym doświadczeniu przeprowadzonym bez struktury docelowej (ślepa próba), stanowią łącznie wszystkie substancje związane ze strukturą docelową. Substancje te wyodrębnia się i wyjaśnia ich budowę.
Możliwe są dalsze etapy obróbki kompleksu, w których:
d) uwalnia się co najmniej jedną aktywną substancję chemiczną związaną ze strukturą docelową w kompleksie, z rozerwaniem wiązania pomiędzy aktywną substancją chemiczną i strukturą docelową w kompleksie,
e) oddziela się co najmniej jedną uwolnioną aktywną substancję chemiczną, oraz
f) identyfikuje się co najmniej jedną oddzieloną aktywną substancję chemiczną i ewentualnie porównuje się z substancją (substancjami) zidentyfikowaną(ymi) w etapie c).
Pojęcie „docelowa struktura biologiczna” oznacza białko (np. receptor, enzym, przeciwciało), błonę biologiczną lub całą (zdrową lub rakowatą) komórkę. Przy zetknięciu się, zwłaszcza przy powstaniu wiązania pomiędzy dopasowaną aktywną substancją chemiczną i strukturą docelową, może zajść reakcja charakterystyczna dla struktury docelowej, najczęściej powiązana z procesem biochemicznym. Innymi słowy, aktywna substancja chemiczna odznacza się silnym powinowactwem do odpowiednich struktur docelowych. Przykładami takich struktur docelowych są białka trombina, trypsyna i receptor adrenergiczny β2.
„Substancje chemiczne” stanowią praktycznie wszystkie jednorodne substancje znane z chemii organicznej i chemii substancji naturalnych. Pojęcie to obejmuje substancje chemiczne o małej i dużej masie cząsteczkowej, nie obejmuje jednak polimerów o nieznanej liczbie merów. Fachowcy znają takie chemicznie jednorodne substancje organiczne. Należą do nich alifatyczne, aromatyczne i cykliczne węglowodory oraz związki zawierające grupy funkcyjne, takie jak kwasy karboksylowe, alkohole, estry, aldehydy, laktony, amidy, związki heterocykliczne, izoprenoidy, terpeny, węglowodany, steroidy itd. Jako odpowiednie substancje chemiczne w rachubę mogą wchodzić również glikozydy, peptydy, białka i enzymy.
Masa cząsteczkowa odpowiednich jednorodnych substancji chemicznych ogólnie wynosi powyżej Mr = 150. Przykładowo masa cząsteczkowa znanych neuromediatorów acetylocholiny [H3CCO-O-CH2-CH2-N(CH3)3]OH i nikotyny wynosi odpowiednio Mr = 163 i Mr = 162 i to praktycznie określa dolną granicę masy cząsteczkowej odpowiednich substancji chemicznych. Górna granica masy cząsteczkowej jest zasadniczo nieograniczona. Ze względu na specyficzne reakcje ze specjalnymi docelowymi strukturami biologicznymi, białka o wysokiej masie cząsteczkowej (Mr do około 300 000) są
PL 202 679 B1 bardzo interesującymi aktywnymi jednorodnymi substancjami chemicznymi, które można wydzielić z mieszaniny różnorodnych substancji chemicznych sposobem według wynalazku.
Niejednorodne biopolimery, takie np. jak glikogen, celuloza itp. nie są analizowane sposobem według wynalazku, gdyż ze względu na nieokreśloną liczbę merów nie stanowią jednorodnych substancji chemicznych określonych w wynalazku.
Substancje chemiczne dzieli się poza tym na substancje aktywne i nieaktywne. Przez aktywną substancję chemiczną rozumie się taką substancję, która przy związaniu się ze specjalną strukturą docelową zdolna jest do wywołania charakterystycznej dla niego reakcji. Aktywna substancja chemiczna charakteryzuje się powinowactwem do struktury docelowej. Nieaktywna substancja chemiczna nie musi wykazywać powinowactwa do struktury docelowej.
Rzeczywista górna granica masy cząsteczkowej stosowanej substancji chemicznej nie może być zatem określona. Łatwość obróbki zależy zasadniczo od stosunku masy cząsteczkowej aktywnej substancji chemicznej do masy cząsteczkowej struktury docelowej. Masa cząsteczkowa struktury docelowej jest ogólnie bardzo duża i może wynosić np. powyżej 1 miliona. Jak wspomniano, strukturą docelową może być również cała komórka. Substancje chemiczne o mniejszej masie cząsteczkowej (około 150 - 30000) dają się od takich struktur docelowych łatwo oddzielić znanymi sposobami, takimi jak ultrawirowanie, ze względu na dużą różnicę mas cząsteczkowych. Jeśli jednak masa cząsteczkowa aktywnej substancji chemicznej i masa cząsteczkowa struktury docelowej mają porównywalną wartość, to ultrawirowanie przynosi niezadowalające wyniki i trzeba stosować wysokosprawne lub dodatkowe sposoby rozdzielania.
Pod pojęciem „mieszanina substancji chemicznych” rozumie się mieszaninę różnych substancji chemicznych, zawierającą co najmniej jedną substancję aktywną, która spełnia wyżej podane kryterium, czyli może wywołać reakcję przy zetknięciu ze specjalną strukturą docelową. Mieszanina może również zawierać kilka takich aktywnych substancji chemicznych. Poza tym mieszanina może również zawierać substancje chemiczne, które nie wywołują żadnej reakcji wobec docelowej struktury biologicznej. Zazwyczaj nieaktywne substancje chemiczne mają główny odział w mieszaninie różnych substancji chemicznych. W szczególności nieaktywne substancje chemiczne zawarte w mieszaninie substancji chemicznych są nieaktywne tylko względem specjalnie wybranej struktury docelowej, są jednak w stanie wyzwalać taką reakcję wobec innej struktury docelowej.
W praktyce mieszaninę substancji chemicznych stanowi korzystnie biblioteka substancji, wytwarzana syntetycznie lub metodami chemii kombinatoryjnej, albo ekstrakt substancji naturalnych. W tym znaczeniu ekstrakt substancji naturalnych oznacza złożone mieszaniny jednorodnych substancji chemicznych, pochodzące z biologicznego źródła i otrzymywane korzystnie z roślin, części roślin, takich jak liście, kwiaty, drewno, korzenie, kora itp., grzybów, zwierząt, gruczołów, jaj i ekskrementów zwierząt, z drobnoustrojów itp. Otrzymuje się je znanymi sposobami, takimi jak destylacja z parą wodną, sucha destylacja, ekstrakcja wodą, rozpuszczalnikami organicznymi, nieorganicznymi i rozpuszczalnikami w stanie nadkrytycznym. Często towarzyszą temu, ewentualnie zaraz po tym, następują dalsze przemiany chemiczne, takie jak estryfikacja, zmydlanie, tworzenie soli, uwodornienie, odwadnianie, izomeryzacja, alkilowanie, fermentacja, rozkład enzymatyczny itd. Skład tak otrzymanych ekstraktów substancji naturalnych niekiedy nie odpowiada składowi w źródle biologicznym. Na ogół występuje jednak duża liczba, czyli co najmniej 50 różnorodnych substancji chemicznych, w tym, jak już wspomniano, liczne tylko w ilościach śladowych, czyli w stężeniu tylko kilku ppm. W takim ekstrakcie często tylko niewiele lub nawet tylko jedna substancja wykazuje charakterystyczną aktywność biologiczną, przy czym aktywność tę może powodować substancja znajdująca się w ekstrakcie tylko w ilości śladowej. Mieszaninę substancji chemicznych może również stanowić mieszanina różnych ekstraktów substancji naturalnych. W konkretnym przypadku wybrano ekstrakt mniszka lekarskiego (Taraxacum officinale). Szczególnie ważnymi źródłami biologicznymi są naturalne rośliny lecznicze, których ekstrakty mają działanie fizjologiczne i/lub farmakologiczne i częściowo są wymienione w DAB (Deutsches Arzneibuch) i HAB (Homoopatisches Arzneibuch).
„Dodawanie” struktury docelowej do mieszaniny substancji chemicznych następuje korzystnie w postaci roztworu, zawiesiny lub dyspersji. W wielu przypadkach strukturę docelową można dodawać w roztworze wodnym, zwłaszcza w takim, w którym pH stabilizuje się za pomocą odpowiedniego buforu. Szczególną zaletą opisywanego sposobu jest to, że nie rozdziela się mieszaniny substancji chemicznych na kilka różnych frakcji, aż do czystych substancji chemicznych, przed dodaniem struktury docelowej.
PL 202 679 B1
Określenie „kompleks” oznacza nadające się do wyodrębniania cząstki, składające się ze struktury docelowej, z którą związana jest co najmniej jedna aktywna substancja chemiczna. Ze strukturą docelową mogą być związane również dwie lub większa liczba aktywnych substancji chemicznych. Dwie lub większa liczba aktywnych substancji chemicznych związanych w takim kompleksie ze strukturą docelową mogą istnieć względem siebie w określonym, charakterystycznym stosunku, który ze względu na specyficzne reakcje struktury docelowej odpowiada za działanie synergiczne. Ze względu na często spotykane układy jako strukturę docelową wybiera się białko, także w kompleksach białko-ligand.
Kompleks zawiera co najmniej jedną aktywną substancję chemiczną „związaną” ze strukturą docelową. Rodzaj wiązania pomiędzy strukturą docelową i aktywną substancją chemiczną lub aktywnymi substancjami chemicznymi zasadniczo nie odgrywa żadnej roli. Najczęściej występują wiązania kowalencyjne lub niekowalencyjne. Do tych ostatnich należą mostki wodorowe, oddziaływania elektrostatyczne, np. pomiędzy przeciwnie naładowanymi grupami, połączenia kompleksowe z metalami, oddziaływania lipofilowych grup aktywnej substancji chemicznej z hydrofobowymi obszarami (tzw.
kieszenie) struktury docelowej, oddziaływania dipol-dipol i oddziaływania kation-π. Powinowactwo aktywnej substancji chemicznej do struktury docelowej jest często związane z połączonymi oddziaływaniami różnego typu.
„Oddzielanie” co najmniej jednego kompleksu od niezwiązanych, czyli „wolnych” nieaktywnych substancji chemicznych w mieszaninie prowadzi się zasadniczo zwykłymi sposobami, przy czym szczególnie korzystnie wybiera się procesy nie związane z narażaniem kompleksów na działanie ciepła. Do takich procesów należą: filtracja, ultrafiltracja, wirowanie, ultrawirowanie, dializa równowagowa, filtracja żelowa lub wytrącanie kompleksu. Identyfikacji co najmniej jednej „aktywnej” substancji chemicznej związanej ze strukturą docelową można niekiedy dokonać przed uwolnieniem tej substancji z kompleksu, np. metodą spektroskopii masowej z analizą czasu przelotu (MALDI-TOF).
Szczególnie szybką, prostą i skuteczną metodą oddzielania jest filtracja. Można ją prowadzić jako ultrafiltrację (np. przy użyciu jednostek filtracyjnych Microcon firmy Amicon) lub za pomocą specjalnych urządzeń filtracyjnych (np. Brandel-Zellsammler).
„Uwalnianie” z kompleksu co najmniej jednej aktywnej substancji chemicznej ułatwia jej wykrywanie, wyodrębnianie, a w szczególności jej określenie chemiczne. Uwalnianie łączy się z etapem rozdzielania, po dwóch lub kilku przemywaniach, dokonywanych w celu usunięcia niespecyficznie zaadsorbowanych substancji. Dzięki temu osiąga się uwalnianie z kompleksu związanych aktywnych substancji chemicznych. Następuje przy tym rozerwanie istniejącego w kompleksie wiązania pomiędzy strukturą docelową i co najmniej jedną aktywną substancją chemiczną. Stosuje się przy tym, w zależności od natury wiązania, metody fizyczne lub chemiczne. Można tego dokonać np. z użyciem kwaśnego roztworu wodnego zawierającego niższy alkanol, korzystnie mieszaniną kwas trifluorooctowy/metanol/woda, np. o składzie 1/49,5/49,5 (% objętościowych).
Można zrezygnować z etapu uwalniania, jeśli nie jest wymagana identyfikacja aktywnej substancji chemicznej, względnie gdy jest zidentyfikowany sam kompleks. Należy zrezygnować z uwalniania, jeśli w warunkach uwalniania aktywna substancja podlegałaby zmianom lub nie można byłoby jej oddzielić wskutek obecności roztworu uwalniającego. Występuje to przede wszystkim w przypadku kilku wiązań kowalencyjnych. W takich przypadkach identyfikacji aktywnej substancji chemicznej dokonuje się na podstawie różnicy przesączu zawierającego strukturę docelową (doświadczenie właściwe) i bez struktury docelowej (ślepa próba). Ten sposób umożliwia jednoczesne wykrycie wszystkich substancji chemicznych związanych ze strukturą docelową, podczas gdy uwalnianie zazwyczaj umożliwia identyfikację tylko niewielu (np. jednej do trzech) aktywnych substancji chemicznych, przy czym nie ma pewności, że są one w stanie niezmienionym.
Substancje występujące w ślepej próbie dodatkowo lub w wyższym stężeniu są potencjalnie aktywnymi substancjami. Można je wyodrębniać z mieszaniny substancji chemicznych (np. ekstraktu substancji naturalnych) dowolnym sposobem rozdzielania (np. chromatograficznie).
„Oddzielanie” co najmniej jednej aktywnej substancji chemicznej, uwolnionej od struktury docelowej, po rozerwaniu wiązania występującego w kompleksie, można prowadzić takimi samymi, już wymienionymi, znanymi sposobami. Również w tym przypadku korzystnie stosuje się najprostsze i najodpowiedniejsze sposoby, czyli filtrację i odwirowanie. Oddzielanie aktywnej substancji chemicznej lub aktywnych substancji chemicznych można prowadzić metodą preparatywnej HPLC.
„Identyfikację” substancji występujących w ślepej próbie dodatkowo lub w wyższym stężeniu i co najmniej jednej oddzielonej aktywnej substancji chemicznej prowadzi się znanymi sposobami, takimi jak HPLC, np. tradycyjna analityczna HPLC, mikro HPLC, kapilarna HPLC, lub nano HPLC,
PL 202 679 B1 albo metodą elektrochromatografii, elektroforezy lub metodami sprzężonej LC-MS Lub MS-MS. Identyfikację aktywnych substancji chemicznych wymienionymi sposobami można jednak prowadzić również przed ich uwolnieniem z kompleksu.
Sposób według wynalazku różni się zasadniczo od znanych wysokosprawnych sposobów selekcjonowania, a zwłaszcza tym, że przez celowe utworzenie kompleksu struktury docelowej i co najmniej jednej aktywnej substancji chemicznej, a następnie oddzielenie niezwiązanych nieaktywnych substancji chemicznych (doświadczenie właściwe) i przez porównanie ze ślepą próbą, za pomocą tej odpowiedniej, specjalnej struktury docelowej można wyodrębnić i zidentyfikować z biblioteki substancji lub ze złożonej mieszaniny substancji naturalnych jedną lub kilka aktywnych substancji chemicznych (tzw. „ligandów”), związanych z odpowiednim białkiem.
Zamiast wyodrębniania każdej potencjalnie interesującej substancji chemicznej i doprowadzania do jej zetknięcia ze strukturą docelową, stosuje się w tym celu mieszaninę substancji. Kompleksy tworzące się zgodnie z zasadą Emila Fischera „klucz-zamek” zostają oddzielane od niezwiązanych substancji chemicznych o niskiej masie cząsteczkowej np. przez ultrafiltrację i identyfikowane metodą chromatografii porównawczej (mieszanina bez struktury docelowej [ślepa próba] w porównaniu z mieszaniną zawierającą strukturę docelową [doświadczenie właściwe]). Dla potwierdzenia wyników, z kompleksów następnie uwalnia się ligandy (aktywne substancje chemiczne), o ile są one trwałe i podatne na uwalnianie, identyfikuje się je zwykłymi metodami, wyodrębnia i ustala ich budowę typowymi metodami analitycznymi.
Sposób według wynalazku nie wymaga ani dużych ilości białka, ani ekstraktu, potrzebuje tylko niewielkich objętości rozpuszczalników przez zmniejszenie skali do metod mikroanalitycznych, nie wymaga pracochłonnego wydzielania podfrakcji oraz umożliwia wykrywanie połączeń substancji działających synergicznie. Można zrezygnować ze znakowania radioaktywnego i fluorescencyjnego. Sposób według wynalazku umożliwia przerabianie większych ilości ekstraktu, przy czym aktywne substancje chemiczne mogą być „wyłowione”, jeśli ich właściwości są niepożądane dla dalszego zastosowania ekstraktu.
Sposób ten szczególnie korzystnie można stosować wtedy, gdy z większych ilości takiego ekstraktu powinny być „wyłowione” tylko aktywne substancje chemiczne, wykazujące oddziaływanie ze stosowaną strukturą docelową. Co najmniej jedną oddzieloną aktywną substancję chemiczną można następnie stosować jako aktywny składnik leku, zamiast mieszaniny substancji naturalnych. Ma to znaczenie również wtedy, gdy więcej niż jedna aktywna substancja chemiczna w ekstrakcie substancji naturalnych tworzy kompleks ze strukturą docelową i wzajemny stosunek między kilkoma aktywnymi substancjami chemicznymi odgrywa dominującą rolę w biologicznym działaniu ekstraktu substancji naturalnych (efekt synergiczny).
Zaletą tego sposobu jest zatem również możliwość identyfikacji skutecznej (synergicznej) kombinacji substancji, co w przypadku wysokosprawnego selekcjonowania pojedynczych substancji nie jest możliwe.
Dzięki sposobowi według wynalazku można przesunąć granice wykrywalności (wykrywalność) aktywnych substancji chemicznych w obszar mikromolowych wartości Ki; a mianowicie wykrywalne są kompleksy struktury docelowej i aktywnej substancji chemicznej o wartości K 1,7 μΜ.
Sposób według wynalazku ilustrują następujące przykłady.
P r z y k ł a d 1. Wyodrębnianie substancji hamujących trombinę typu 4-amidynofenyloalaniny z arbitralnie wybranej biblioteki substancji
Jako strukturę docelową wybrano proteazę serynową trombiny. Jako składniki biblioteki substancji (mieszaninę „nieaktywnych” substancji chemicznych, w znaczeniu podanej uprzednio definicji) wybrano następujących pięć substancji leczniczych, uwzględniając ich rozpuszczalność w wodzie, maksima absorpcji i ich podatność na rozdzielanie chromatograficzne:
1. działający na ośrodkowy układ nerwowy agonista receptora adrenergicznego α2, chlorowodorek klonidyny
2. środek mukolityczny, chlorowodorek bromheksyny
3. tricykliczny środek antydepresyjny, chlorowodorek amitryptyliny
4. neuroleptyk typu fenotiazyny, chlorowodorek chloropromazyny
5. neuroleptyk typu fenotiazyny, chlorowodorek chloroprotyksenu
PL 202 679 B1
Jako substancję hamującą trombinę (aktywną substancję chemiczną) stosowano CRC 220 z Behringwerke (Marburg, Ki = 2,5 nM) o następującym wzorze strukturalnym:
Skład badanych próbek podano poniżej.
T a b e l a 1
| Próbka | Ślepa próba bez trombiny | Doświadczenie właściwe z trombiną |
| Trombina, 2000 E/mg | 0 | 1 nmol 5 pmoli/l |
| Chlorowodorek klonidyny | 2 nmole 10 pmoli/l | 2 nmole 10 pmoli/l |
| Chlorowodorek bromheksyny | 2 nmole 10 pmoli/l | 2 nmole 10 pmoli/l |
| Chlorowodorek amitryptyliny | 2 nmole 10 pmoli/l | 2 nmole 10 pmoli/l |
| Chlorowodorek chloropromazyny | 2 nmole 10 pmoli/l | 2 nmole 10 pmoli/l |
| Chlorowodorek chloroprotykseny | 2 nmole 10 pmoli/l | 2 nmole 10 pmoli/l |
| CRC 220 | 2 nmole 10 pmoli/l | |
| 0,9% NaCl w wodzie (czystej) | do 200 pl | do 200 pl |
Inkubację biblioteki substancji i inhibitora z trombiną prowadzono w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej; jako rozpuszczalnik stosowano 0,9% NaCl w H2O. Powstały kompleks białko-ligand oddzielano drogą ultrafiltracji (odśrodkowej). Wszystkie procesy filtracji lub przemywania prowadzono do osiągnięcia suchości filtra.
Filtr: Microcon 10 (Amicon)
Warunki odwirowywania: 9981 x g, temperatura pokojowa
Etapy przemywania: 2 x 150 μΐ 0,9% NaCl w H2O, 4°C
Po ultrafiltracji i analizie przesączu przeprowadzono etapy przemywania i uwalniania ligandu (aktywnej substancji chemicznej) z pozostałego na filtrze kompleksu białko-ligand, przez działanie w temperaturze pokojowej 200 μl mieszaniny woda/metanol/TFA (49,5/49,5/1).
Ślepą próbę (bez trombiny) we wszystkich etapach prowadzono w sposób analogiczny, tak że możliwe było porównanie przesączów. Przesącze otrzymywane we wszystkich etapach suszono z użyciem koncentratora Speed-VAC, a następnie rozpuszczano w odpowiednio określonej ilości rozpuszczalnika dla HPLC, z użyciem ultradźwięków i wytrząsania.
PL 202 679 B1
Identyfikację ligandów prowadzono metodą analitycznej HPLC: fazę stacjonarną stanowił Hypersil C 18BDS, 3 pm, 150*0,3 mm Fusica (LC Packings); fazę ruchomą stanowiła mieszanina acetonitryl/woda/TFA (35/65/0,01), elucja izokratyczna, 5 pl/min, λ = 230 mm. Wyniki przedstawiono na fig. 2.
Różnicę pomiędzy doświadczeniem właściwym i ślepą próbą stanowi CRC 220 jako aktywny związek chemiczny. Z uwagi na to, że chlorowodorek klonidyny (4,6 min) nie występuje ani w doświadczeniu właściwym, ani w ślepej próbie, jest on wiązany nie przez strukturę docelową, ale przez filtr. Nie jest on inhibitorem.
P r z y k ł a d 2. Tworzenie wiązań o różnej sile w nierównomolowej mieszaninie amidynofenyloalaniny z trypsyną.
Poniżej jako substancje chemiczne stosowano substancje hamujące trypsynę typu 3-amidynofenyloalaniny o wzorach strukturalnych przedstawionych w tabeli, a jako strukturę docelową stosowano proteazę serynową trypsynę.
T a b e l a 2
| Nr | Struktura Na/P2/Ca | Wzór | Ki [pmol/l] Trombina | Ki [pmol/l] Trypsyna |
| 6 (120) *HCl | eNas/-/Pzd-N-SMe | NH O -HCl ęH2 /-\ —SO—NH-C-CO-N^_^N—SOj-CH, | ||
| 7 (105-95) *HCl | eNas/-/Ppd | NH •HCl U ęH2 /—< NH-C-CO-N ) Γ T J H | ||
| 10 (110-79) *HCl | eNas/-/iNip-Oet | NH ^x^x^SO-NH-C-CO-N W Γ I jj H '-' cA |
T a b e l a 3. Skł ad próbek
| Próbka | Trypsyna 10600 E/mg | 6 (Ki = 67 nM) | 7 (Ki = 330 nM) | 10 (Ki = 20 nM) | 0,9% NaCl w wodzie (czystej) |
| 261 ;300 | 0 | 1,68 nmola 8,4 pmola/l | 8.25 nmola 41.25 pmola/ | 0,5 nmola 2,5 pmola/l | do 200 pl |
| 262;301;302 | 10 nmoli 50 pmoli/l | 1,68 nmola 8,4 pmola/l | 8,25 nmola 41,25 pmola/l | 0,5 nmola 2,5 pmola/l | do 200 pl |
Doświadczenia przeprowadzono w sposób opisany w przykładzie 1.
PL 202 679 B1
T a b e l a 4. Wyniki
| Próbka | Substancja | Przesącz [pmole/l] | 1. Przemywanie [pmole/l] | 2. Przemywanie [pmole/l] | Uwalnianie [pmole/l] |
| 261 | 6 | 7,44 | 0,71 | 0,05 | 0,01 |
| 7 | 31,57 | 3,13 | 0,26 | 0,13 | |
| 10 | 0,05 | 0,02 | 0,0013 | 0,0011 | |
| 262 | 6 | 0,67 | 0,23 | 0,15 | 6,09 |
| 7 | 22,22 | 3,68 | 1,29 | 8,49 | |
| 10 | 0,02 | 0,0058 | 0,0012 | 0,53 |
P r z y k ł a d 3. Wyodrę bnianie i identyfikacja substancji naturalnych w ekstrakcie Taraxacum (mniszka)
Substancje stosowane w próbach
Ekstrakt Taraxaci spir. Sicc. (substancja naturalna - ekstrakt suchy firmy Caelo)
Wytwarzanie roztworu wodnego
- wytwarzanie zawiesiny suchego ekstraktu w wodzie (0,2 g w 20 ml)
- 5 minutowa obróbka w kąpieli ultradźwię kowej, pozostawienie na 30 min z okresowym wstrzą saniem
- filtracja przez filtr membranowy (0,7 μ m), a nastę pnie przez filtr Anotop 25 (0,02 μ m)
- sprawdzanie obecnoś ci garbników z uż yciem FeCl3, Pb(CH3COO)4 i ż elatyny; uzyskano wynik negatywny
b) Receptor adrenergiczny β2 (= struktura docelowa)
- preparat błon z owadzich komórek Sf9 zakażano przez 3 dni rekombinowanym receptorem adrenergicznym β2 bakulowirusa (komórki i wirusy, konstrukt plazmidowy, wyodrębnianie rekombinowanych bakulowirusów i preparowanie błon: MPI far Biophysik, Abt. Fϋr Molekulare Membranbiologie, Frankfurt nad Menem, dr Helmut Reilander) [H. Reilander, Febs letters, 282, 441-444 (1991)].
W próbach łączono w różnych stosunkach stechiometrycznych ekstrakt Taraxacum i preparat z błon i otrzymaną mieszaninę rozpuszczano w 200 μl buforu wiązania (150 mM NaCl, 50 nM Tris, pH 8,2 w wodzie).
Wiązanie receptor-ligand następowało w czasie 30 minutowej inkubacji mieszaniny w temperaturze 30-34°C. Następnie roztwór podawano na 10 pm filtr odśrodkowy i odwirowywano przy 9981 x g przez 15 minut lub do osiągnięcia suchości filtra. Porównanie chromatogramów próbek z receptorem (doświadczenie właściwe) i bez receptora (ślepa próba) umożliwiało identyfikację związanych substancji chemicznych. Po dwóch etapach przemywania rozdzielono znajdujący się na filtrze kompleks przez potraktowanie 200 μl TFA (1/49,5/49,5).
T a b e l a 5. Skł ad badanych próbek
| Próbka | Receptor adrenergiczny β2 (Preparat z błon 10/98; 6,5 pmola receptora/mg białka) | Ekstrakt Taraxaci (10 mg/ml wodnego ekstraktu, przefiltrowany przez filtr Anotop 25 (Merck)) | Bufor wiązania (150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 8,2) |
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| 351 | 0 | 1.5 mg 7.5 g/l | do 200 pl |
| 355 | 1,04 pmola 5,2 nmola/l | 1.5 mg 7.5 g/l | do 200 pl |
| 356 | 1,04 pmola 5,2 nmola/l | 1.5 mg 7.5 g/l | do 200 pl |
| 360 | 0 | 0,3 mg 1,5 g/l | do 200 pl |
| 361 | 1,04 pmola 5,2 nmola/l | 0,3 mg 1,5 g/l | do 200 pl |
PL 202 679 B1 cd. tabeli 5
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| 362 | 0 | 0,6 mg 3 g/l | do 200 ul |
| 363 | 1,04 pmola 5,2 nmola/l | 0,6 mg 3 g/l | do 200 pi |
| 364 | 0 | 1,0 mg 5,0 g/l | do 200 pl |
| 365 | 1,04 pmola 5,2 nmola/l | 1,0 mg 5,0 g/l | do 200 pl |
| 366 | 1,04 pmola 5,2 nmola/l | 1.5 mg 7.5 g/l | do 200 pl |
| 367 | 1,04 pmola 5,2 nmola/l | 1.5 mg 7.5 g/l | do 200 pl |
| 369 | 1,04 pmola 5,2 nmola/l | 1.5 mg 7.5 g/l | do 200 pl |
| 373 | 1,04 pmola 5,2 nmola/l | 1.5 mg 7.5 g/l | do 200 pl |
| 374 | 0,52 pmola 2,6 nmola/l | 1.5 mg 7.5 g/l | do 200 pl |
| 375 | 0,26 pmola 1,3 nmola/l | 1.5 mg 7.5 g/l | do 200 pl |
Eluaty z kolejnych czterech etapów filtracji odwirowywano w próżni do sucha i tuż przed analizą metodą LC otrzymane substancje rozpuszczano ze wspomaganiem ultradźwiękowym w 10 μΐ ruchomej fazy HPLC (porównaj przykład 1).
T a b e l a 6. Wyniki
| Próbka | Substancja | Przesącz [pmol/l] | 1. Przemywanie [pmol/l] | 2. Przemywanie [pmol/l] | Uwalnianie [pmol/l] |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 351 | L3 | 740,3 | 51,0 | 8,0 | 11,9 |
| L6 | 5970,7 | 15045 | 750,8 | 195,0 | |
| L7 | 3802,1 | 748,2 | 145,5 | 22,7 | |
| 355 | L3 | 353,5 | 88,8 | 12,9 | 15,8 |
| L6 | 1482,0 | 451,4 | 100,4 | 707,0 | |
| L7 | 1539,6 | 909,9 | 180,4 | 214,5 | |
| 356 | L3 | 961,9 | 79,0 | 9,9 | 26,3 |
| L6 | 1848,6 | 600,1 | 202,1 | 2199,1 | |
| L7 | 2183,1 | 1117,4 | 295,9 | 510,7 | |
| 360 | L3 | 411,5 | 22,7 | 0 | 8,1 |
| L6 | 2935,2 | 468,9 | 140,3 | 34,7 | |
| L7 | 1268,8 | 129,6 | 6,6 | 8,6 | |
| 361 | L3 | 537,0 | 16,5 | 29,6 | 11,2 |
| L6 | 1588,2 | 146,5 | 124,3 | 138,1 | |
| L7 | 1268,8 | 129,6 | 6,6 | 8,6 |
PL 202 679 B1 cd. tabeli 6
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 362 | L3 | 650,1 | 20,5 | 5,6 | 3,2 |
| L6 | 3446,6 | 958,0 | 351,4 | 85,4 | |
| L7 | 1423,2 | 176,5 | 33,7 | 7,5 | |
| 363 | L3 | 736,9 | 54,4 | 0 | 8,7 |
| L6 | 1180,6 | 248,3 | 142,0 | 257,0 | |
| L7 | 1740,7 | 76,4 | 104,2 | 16,9 | |
| 364 | L3 | 1034,4 | 36,9 | 3,0 | 5,3 |
| L6 | 3752,4 | 1377,0 | 627,8 | 151,3 | |
| L7 | 1829,6 | 92,7 | 30,1 | 89,6 | |
| 365 | L3 | 1221,4 | 51,7 | 8,6 | 9,8 |
| L6 | 2291,6 | 626,7 | 141,6 | 436,9 | |
| L7 | 2746,8 | 74,0 | 11,2 | 111,9 | |
| 366 | L3 | 2088,5 | 102,8 | 2,3 | 7,6 |
| L6 | 5581,8 | 620,0 | 181,5 | 504,8 | |
| L7 | 4261,6 | 1425,3 | 213,1 | 168,2 | |
| 367 | L3 | 2310,8 | 46,2 | 15,6 | 6,3 |
| L6 | 5159,0 | 832,5 | 274,6 | 616,8 | |
| L7 | 6243,7 | 1509,0 | 199,2 | 232,9 | |
| 369 | L3 | 2381,4 | 90,8 | 41,8 | 7,0 |
| L6 | 7449,7 | 478,1 | 341,9 | 674,0 | |
| L7 | 3505,8 | 986,8 | 221,7 | 378,7 | |
| 373 | L3 | 2450,0 | 91,7 | 26,6 | 36,2 |
| L6 | 5562,6 | 182,7 | 277,1 | 2096,1 | |
| L7 | 4900,2 | 1176,5 | 285,4 | 847,8 | |
| 374 | L3 | 2593,2 | 44,0 | 7,4 | 25,3 |
| L6 | 8589,0 | 1062,4 | 476,6 | 1015,4 | |
| L7 | 5661,6 | 627,7 | 200,9 | 538,8 | |
| 375 | L3 | 2252,1 | 39,7 | 19,6 | 19,0 |
| L6 | 10838,5 | 921,1 | 433,9 | 279,9 | |
| L7 | 4921,4 | 631,3 | 112,3 | 154,4 |
Trzy ligandy „wyłowione”, czyli otrzymane przez kompleksowanie, a następnie uwalnianie z kompleksu (L3 = kwas trans-kaftarynowy, L6 = kwas trans-chikorynowy i L7 = winian trans-diferoilu) zidentyfikowano metodami UV, R1H-NMR i MS.
PL 202 679 B1
Figura 1 symbolicznie przedstawia tworzenie się co najmniej jednego kompleksu. Do nierównomolowej mieszaniny 1000 różnych, jednorodnych substancji chemicznych (cztery z nich stanowiły substancje aktywne) dodaje się strukturę docelową. Powstają cztery różne kompleksy, z których każdy zawiera związaną substancję chemiczną. Nieaktywne substancje w liczbie 996 można oddzielić od kompleksów przez ultrafiltrację.
Objaśnienie oznaczeń:
= struktura docelowa = różne aktywne substancje chemiczne = róż ne nieaktywne substancje chemiczne (punkty) = różne kompleksy z co najmniej jedną aktywną substancją chemiczną.
Figura 2 przedstawia:
A) Mieszaninę substancji chemicznych z inhibitorem CRC 220: chlorowodorek klonidyny (4,6 min), CRC 220 (6,9 min), bromoheksyny (12,3 min), amitryptyliny (17,6 min), chloropromazyny-HCl (26,9 min), chlorowodorek chloroprotyksenu (26,9 min)
B) Przesącz bez struktury docelowej [ślepa próba]
C) Przesącz ze strukturą docelową trombiną [doświadczenie właściwe]
Figura 3 przedstawia chromatogramy:
A) Taraxacum (ślepa próba)
B) Taraxacum (doświadczenie właściwe)
C) Uwalnianie Taraxacum.
Różnica pomiędzy ślepą próbą i doświadczeniem właściwym wskazuje, że związane jest około 12 substancji, podczas gdy metodą uwalniania można było otrzymać tylko 3 substancje.
Claims (19)
1. Sposób identyfikacji biologicznie aktywnych substancji chemicznych o masie cząsteczkowej w zakresie 150 - 300000 w mieszaninie substancji chemicznych, znamienny tym, ż e w następujących etapach:
a) do tej mieszaniny dodaje się docelową strukturę biologiczną i tworzy się kompleks docelowej struktury biologicznej i co najmniej jednej biologicznie aktywnej substancji chemicznej zawartej w mieszaninie, przy czym kompleks wytwarza się przez wiązanie co najmniej jednej substancji chemicznej z docelową strukturą biologiczną ,
b) wydziela się kompleks z mieszaniny, oraz
c) uwalnia się, wyodrębnia i identyfikuje co najmniej jedną biologicznie aktywną substancję chemiczną z wydzielonego kompleksu, albo
d) identyfikuje się co najmniej jedną biologicznie aktywną substancję chemiczną zawartą w mieszaninie na podstawie róż nicy pomiędzy chromatogramem mieszaniny substancji chemicznych przed dodaniem docelowej struktury biologicznej a chromatogramem mieszaniny substancji chemicznych otrzymanym do wydzieleniu kompleksu.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do mieszaniny substancji chemicznych dodaje się docelową strukturę biologiczną w postaci roztworu, zawiesiny lub dyspersji.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że docelową strukturę biologiczną dodaje się w postaci roztworu wodnego.
PL 202 679 B1
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że wartość pH roztworu wodnego stabilizuje się odpowiednim buforem.
5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że powstałe wiązanie ma charakter kowalencyjny lub niekowalencyjny.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że wiązania niekowalencyjne stanowią mostki wodorowe, oddziaływania elektrostatyczne, wiązania kompleksowe z metalami, oddziaływania lipofilowych grup biologicznie aktywnej substancji chemicznej z docelową strukturą biologiczną, oddziaływania dipol-dipol lub oddziaływania kation-π.
7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że kompleks wydziela się z mieszaniny substancji chemicznych metodą ultrafiltracji, ultrawirowania lub innymi odpowiednimi metodami.
8. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że wyodrębnia się i/lub identyfikuje co najmniej jedną biologicznie aktywną substancję chemiczną oddzielonego kompleksu takimi metodami jak HPLC, elektrochromatografia, elektroforeza, metody sprzężone, takie jak LC-MS lub MS-MS, korzystnie metodą mikrokapilarnej HPLC lub nano-HPLC.
9. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że co najmniej jedną biologicznie aktywną substancję chemiczną zawartą w mieszaninie identyfikuje się takimi metodami jak HPLC, elektrochromatografia, elektroforeza, metody sprzężone, takie jak LC-MS lub MS-MS, korzystnie metodą kapilarnej HPLC Lub nano-HPLC.
10. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że co najmniej jedną biologicznie aktywną substancję chemiczną wydziela się z mieszaniny metodą preparatywnej HPLC, elektrochromatografii lub elektroforezy.
11. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako mieszaninę substancji chemicznych stosuje się bibliotekę substancji otrzymanych drogą syntezy lub metodami chemii kombinatoryjnej, albo ekstrakt substancji naturalnych.
12. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako mieszaninę substancji chemicznych stosuje się chemicznie modyfikowany ekstrakt substancji naturalnych.
13. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako mieszaninę substancji chemicznych stosuje się mieszaninę różnych ekstraktów substancji naturalnych.
14. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się mieszaninę substancji chemicznych zawierającą co najmniej 50 różnych substancji chemicznych.
15. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako docelową strukturę biologiczną stosuje się białko.
16. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako docelową strukturę biologiczną stosuje się enzym, receptor, przeciwciało, błonę biologiczną lub komórkę.
17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że jako docelową strukturę biologiczną stosuje się enzym trombinę.
18. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że jako docelową strukturę biologiczną stosuje się enzym trypsynę.
19. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że jako docelową strukturę biologiczną stosuje się receptor adrenergiczny β2.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19945351A DE19945351C2 (de) | 1999-09-22 | 1999-09-22 | Verfahren zum Auffinden und zur Isolierung pharmakologisch wirksamer Verbindungen aus Substanzgemischen |
| PCT/EP2000/008919 WO2001022078A1 (de) | 1999-09-22 | 2000-09-13 | Verfahren und vorrichtung zum auffinden und zur isolierung pharmakologisher verbindungen aus substanzgemischen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL357350A1 PL357350A1 (pl) | 2004-07-26 |
| PL202679B1 true PL202679B1 (pl) | 2009-07-31 |
Family
ID=7922864
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL357350A PL202679B1 (pl) | 1999-09-22 | 2000-09-13 | Sposób identyfikacji biologicznie aktywnych substancji chemicznych |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7232690B1 (pl) |
| EP (1) | EP1214589B1 (pl) |
| JP (1) | JP4842477B2 (pl) |
| KR (1) | KR100676154B1 (pl) |
| CN (1) | CN100420945C (pl) |
| AR (1) | AR025740A1 (pl) |
| AT (1) | ATE268474T1 (pl) |
| AU (1) | AU777927B2 (pl) |
| BR (1) | BR0014633A (pl) |
| CA (1) | CA2387999C (pl) |
| CZ (1) | CZ2002990A3 (pl) |
| DE (2) | DE19945351C2 (pl) |
| DK (1) | DK1214589T3 (pl) |
| ES (1) | ES2222230T3 (pl) |
| HU (1) | HU227662B1 (pl) |
| IL (1) | IL148823A0 (pl) |
| MX (1) | MXPA02002992A (pl) |
| PL (1) | PL202679B1 (pl) |
| PT (1) | PT1214589E (pl) |
| TR (1) | TR200200779T2 (pl) |
| TW (1) | TWI245121B (pl) |
| WO (1) | WO2001022078A1 (pl) |
| ZA (1) | ZA200202396B (pl) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10125258A1 (de) * | 2001-05-23 | 2003-01-09 | November Ag Molekulare Medizin | Verfahren zur Bestimmung des Bindeverhaltens von an Ziel-Molekülen spezifisch bindenden Liganden |
| WO2006015797A2 (en) * | 2004-08-09 | 2006-02-16 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Method for high-throughput screening of test molecules binding to target molecules |
| WO2008079407A1 (en) * | 2006-12-26 | 2008-07-03 | Brigham Young University | Serum proteomics system and associated methods |
| KR102589887B1 (ko) | 2022-08-11 | 2023-10-17 | 인포보스 주식회사 | 미지 물질 내 함유물질의 예측방법, 장치 및 프로그램 |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4948726A (en) * | 1986-06-02 | 1990-08-14 | Longoria Claude C | Enzyme immunoassay based on membrane separation of antigen-antibody complexes |
| US5202421A (en) * | 1988-12-27 | 1993-04-13 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | Anticoagulant substance obtained from urine and process for the preparation thereof |
| JPH05506774A (ja) * | 1990-02-14 | 1993-10-07 | リセプター ラボラトリーズ インコーポレーテッド | 有益ペプチドの産生法およびスクリーニング法 |
| WO1992002815A2 (en) * | 1990-08-10 | 1992-02-20 | Perseptive Biosystems, Inc. | Quantitative analysis and monitoring of protein structure by subtractive chromatography |
| WO1992002818A1 (en) | 1990-08-10 | 1992-02-20 | Purdue Research Foundation | Matrix sequential addition immunoassay |
| JP3175941B2 (ja) * | 1991-03-28 | 2001-06-11 | パーセプティブ バイオシステムズ インコーポレイテッド | クロマトグラフ溶出液の減法に依るオンライン生成物確認方法及び装置 |
| EP0632895B1 (en) | 1992-03-27 | 1998-07-08 | Perseptive Biosystems, Inc. | Rapid hypersensitive flowthrough immunodetection system |
| JPH08510325A (ja) * | 1993-05-28 | 1996-10-29 | カイロン コーポレイション | 生物学的に活性なペプチド配列の選択方法 |
| US5491096A (en) * | 1993-12-27 | 1996-02-13 | Eli Lilly And Company | Antigen detection with affinity chromatography and parallel processing a control |
| US6030804A (en) * | 1995-06-06 | 2000-02-29 | Human Genome Sciences, Inc. | Polynucleotides encoding G-protein parathyroid hormone receptor HLTDG74 polypeptides |
| JP3737516B2 (ja) * | 1995-06-26 | 2006-01-18 | パーセプティブ バイオシステムズ，インコーポレーテッド | 高速自動化連続流、多次元分子選別および分析 |
| EP0759470B1 (en) * | 1995-06-29 | 2006-10-25 | Takara Bio Inc. | Gene encoding endoglycoceramidase activator |
| HUP9900459A3 (en) * | 1996-01-23 | 1999-11-29 | Rapigene Inc Bothell | Methods and compositions for detecting binding of ligand pair using non-fluorescent label |
| DE19629141A1 (de) * | 1996-07-19 | 1998-04-16 | Bayer Ag | Verfahren und Vorrichtung zum Screening von Molekülen bezüglich ihres individuellen Bindungsverhaltens zu mindestens einem vorgegebenen Ligand |
| JPH1150724A (ja) * | 1997-08-05 | 1999-02-23 | Shinkansai Bearing Co Ltd | 窓用ヒンジ |
| DE19757574A1 (de) * | 1997-12-23 | 1999-06-24 | Bayer Ag | Verbesserte Doppelmetallcyanid-Katalysatoren für die Herstellung von Polyetherpolyolen |
| AUPP103497A0 (en) * | 1997-12-19 | 1998-01-15 | Panbio Pty Ltd | Assay apparatus |
| US6077940A (en) | 1997-12-24 | 2000-06-20 | Genentech, Inc. | Free solution ligand interaction molecular separation method |
-
1999
- 1999-09-22 DE DE19945351A patent/DE19945351C2/de not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-09-13 MX MXPA02002992A patent/MXPA02002992A/es active IP Right Grant
- 2000-09-13 TR TR2002/00779T patent/TR200200779T2/xx unknown
- 2000-09-13 DE DE50006696T patent/DE50006696D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-13 WO PCT/EP2000/008919 patent/WO2001022078A1/de active IP Right Grant
- 2000-09-13 CA CA002387999A patent/CA2387999C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-09-13 PT PT00960653T patent/PT1214589E/pt unknown
- 2000-09-13 ES ES00960653T patent/ES2222230T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-13 IL IL14882300A patent/IL148823A0/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-09-13 AT AT00960653T patent/ATE268474T1/de active
- 2000-09-13 US US10/088,868 patent/US7232690B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-09-13 AU AU72867/00A patent/AU777927B2/en not_active Ceased
- 2000-09-13 CZ CZ2002990A patent/CZ2002990A3/cs unknown
- 2000-09-13 DK DK00960653T patent/DK1214589T3/da active
- 2000-09-13 EP EP00960653A patent/EP1214589B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-13 PL PL357350A patent/PL202679B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2000-09-13 HU HU0203686A patent/HU227662B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2000-09-13 KR KR1020027003696A patent/KR100676154B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-09-13 JP JP2001525199A patent/JP4842477B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-09-13 CN CNB008131104A patent/CN100420945C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-09-13 BR BR0014633-1A patent/BR0014633A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-09-20 TW TW089119307A patent/TWI245121B/zh not_active IP Right Cessation
- 2000-09-22 AR ARP000104964A patent/AR025740A1/es active IP Right Grant
-
2002
- 2002-03-26 ZA ZA200202396A patent/ZA200202396B/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HU227662B1 (en) | 2011-10-28 |
| WO2001022078A1 (de) | 2001-03-29 |
| ES2222230T3 (es) | 2005-02-01 |
| BR0014633A (pt) | 2002-08-20 |
| KR20020048413A (ko) | 2002-06-22 |
| HUP0203686A2 (hu) | 2003-03-28 |
| DE19945351C2 (de) | 2002-04-18 |
| DK1214589T3 (da) | 2004-10-11 |
| JP4842477B2 (ja) | 2011-12-21 |
| TR200200779T2 (tr) | 2002-09-23 |
| DE19945351A1 (de) | 2001-07-12 |
| CA2387999C (en) | 2008-09-02 |
| CZ2002990A3 (cs) | 2002-07-17 |
| ATE268474T1 (de) | 2004-06-15 |
| CA2387999A1 (en) | 2001-03-29 |
| MXPA02002992A (es) | 2002-09-30 |
| TWI245121B (en) | 2005-12-11 |
| AR025740A1 (es) | 2002-12-11 |
| DE50006696D1 (de) | 2004-07-08 |
| CN100420945C (zh) | 2008-09-24 |
| ZA200202396B (en) | 2003-03-28 |
| KR100676154B1 (ko) | 2007-01-31 |
| EP1214589A1 (de) | 2002-06-19 |
| IL148823A0 (en) | 2002-09-12 |
| PT1214589E (pt) | 2004-09-30 |
| US7232690B1 (en) | 2007-06-19 |
| CN1375058A (zh) | 2002-10-16 |
| HUP0203686A3 (en) | 2010-01-28 |
| JP2003510569A (ja) | 2003-03-18 |
| EP1214589B1 (de) | 2004-06-02 |
| PL357350A1 (pl) | 2004-07-26 |
| AU777927B2 (en) | 2004-11-04 |
| AU7286700A (en) | 2001-04-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Fu et al. | Screening techniques for the identification of bioactive compounds in natural products | |
| Lankatillake et al. | Understanding glycaemic control and current approaches for screening antidiabetic natural products from evidence-based medicinal plants | |
| Cieśla et al. | Comparison of analytical techniques for the identification of bioactive compounds from natural products | |
| Potterat et al. | Natural products in drug discovery-concepts and approaches for tracking bioactivity | |
| López et al. | Acetylcholinesterase inhibitory activity of some Amaryllidaceae alkaloids and Narcissus extracts | |
| US7179592B2 (en) | Size-exclusion-based extraction of affinity ligands and active compounds from natural samples | |
| Camp et al. | Front‐Loading Natural‐Product‐Screening Libraries for log P: Background, Development, and Implementation | |
| CN109632978B (zh) | 一种茯苓对照提取物及其制备方法和应用 | |
| Shi et al. | Establishment of thrombin affinity column (TAC)-HPLC-MS/MS method for screening direct thrombin inhibitors from Radix Salviae Miltiorrhiae | |
| Akram et al. | Methods for the analysis of galanthamine and its extraction from laboratory to industrial scale | |
| Tian et al. | Characterization of small-molecule–biomacromolecule interactions: From simple to complex | |
| Xin et al. | Mass spectrometry-based strategies for screening of bioactive natural products | |
| PL202679B1 (pl) | Sposób identyfikacji biologicznie aktywnych substancji chemicznych | |
| DE102009024720B4 (de) | Massenspektrometrischer Endopeptidasen-Assay | |
| NZ518083A (en) | Method and device for detecting and isolating pharmacological compounds being contained in substance mixtures | |
| Mladic et al. | Analytics for bioactivity profiling of complex mixtures with a focus on venoms | |
| Jude et al. | Bioanalytical screening/purification techniques | |
| Uges et al. | Antidepressants and antipsychotics | |
| Polak et al. | Wysoki nski, A.; Dzido, TH Preparation of Antihypertensive Drugs in Biological Matrix with Solvent Front Position Extraction for LC–MS/MS Analysis | |
| EP1205754B1 (en) | Method for screening plant extracts for active ingredients | |
| WO2023015237A1 (en) | High-throughput engineering of molecular glues | |
| Mamina et al. | determination of quifenadine by HPLC method in blood | |
| Joseph et al. | Applying Charged Aerosol Detection to Aminoglycosides: Development and Validation of an RP‐HPLC Method for Gentamicin and Netilmicin | |
| Patel | Development of Immobilised Biopolymer Stationary Phases based on the Efflux Transporters | |
| Azab | The Diagnostic Use of Measurements of Membrane Binding Sites in Death by Poisoning |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20120913 |