JPH05506774A - 有益ペプチドの産生法およびスクリーニング法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 有益ペプチドの産生法およびスクリーニング法、発明の背景 １、発明の分野 本発明は様々に応用できるペプチドの新規な産生法およびスクリーニング法に関 する。５Ｅｌａ１１ペプチド（２−１５アミノ酸）には、それらを特定のタンパ ク質に特異的に結合する特異な空間的、熱力学的特性を持たせることができる。

これらペプチドがそれらタンパク質に結合すれば、そうしたタンパク質の機能を 一時的または永久的に除去したり活性化したりすることができる。

したがって結合してウィルスのコートタンパク質の機能を除去するペプチドは、 そのウィルスに対する有効な薬剤たり得る。

同様に結合して味覚または嗅覚の受容体を活性化するペプチドは、風味剤または 芳香剤として有益な即効剤たり得る。このような有益なペプチドの開発には薬品 工業において少なからず関心が高い。主たる問題は、個々のペプチドの産生なら びにスクリーニングが不十分で労働集約的であるということである。ペプチドは 個々に産生され、そして目的のタンパク質に対する結合能につきテストされなけ ればならない。個々のペプチドを産生しスクリーニングすることは困難であるか ら、多数のペプチドをスクリーニングすることは不可能である。このように多数 のペプチドを迅速かつ効果的にスクリーニングする方法に対すしたペプチドを合 成しスクリーニングすることが同時にできることである。

２、従来の技術 種々のタンパク質分解酵素、例えば、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、 パパイン、プロメライン、サーモリシン、およびＳ、　ｇｒｉｓｅｕｓブロティ ナーゼなどは、ペプチド結合を加水分解する。加水分解率は酵素に何を選択する かによって左右され、またそのペプチド結合に隣接する残基によっても左右され る。Ｓ、　ｇｒｉｓｅｕｓブロティナーゼ、パパイン、およびズブチリシン酵素 は、広い基質特異性を持つことが知られているが、全体的な酵素による加水分解 のためには、酵素混合物を使用することが好ましい。Ｂ１１１．　“Ｈｙｄｒｏ ｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”、　ｉｎ　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｐ ｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０：　３７．　８９−９０　（Ａｏｆｉ ｓｅｎ、Ｊｒ、ら、ｅｄＳ４．１９６５） １９３７年に、タンパク質加水分解反応は可逆的であることが示された。それか ら間もなく、両過程にプロテアーゼが所定配列のペプチドのフラグメント縮合合 成が用いられた。どのペプチド結合か形成されるかで酵素は異なるので、オリゴ ペプチドを作るにはいくつかの異なる酵素が連続して使用されねばならなかった 。不幸にして酵素の鎖延長は、既存の結合を危う（するおそれがあった。５ａｋ ｉｎａら、Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、。

ペプチドの酵素合成における一つの問題は、通常条件下では加水分解が熱力学的 に有利にされるということである。したがって平衡［ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ］ はシフトされなければならない。ｔＴｏｍａｎｄｂｅｒｇら、Ｂｉｏｃｈｅ［ｌ １ｓｔｒｙ、　２１＋　３３８５−８９　（１９８２）は、このようなペプチド の合成を有利にするよう平衡をシフトするよう、「分子トラップ」、つまり既知 のアミノ酸配列を持つ特定のペプチドに対する親和性を有する分子のことである が、を使うことができると教示している。

多様なペプチド群を産生ずる目的で種々のアプローチが行われてきている。

［半合成ｊ　［ｓｅｍｉｓｙｎｔｂｅｔｉｃ］ペプチドおよびタンパク質が、（ １）使うことのてきるフラグメントのセットを産生ずるため天然ポリペプチドの 制限的なタンパク質加水分解、（２）付加的オリゴペプチドの化学的合成、およ び（３）合成的および自然発生的パートナ−の再構築、によって調整されている 。その技術は自然発生ポリペプチドの類似体を調整するため普通に使われている 。

Ｃｈａｉｋｅｎ、　ＣＲＣＣｒ１ｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２５５　（１９８１年９月）。Ｒｕｇｇｅｒｉら、Ｐ、Ｎ 、Ａ、Ｓ、（Ｕ、Ｓ、Ａ、）、８３：　５７０８−１２　（１９８６年８月）は 、種々の血小板結合ペプチドをモデルにして長さが１６残基まての一連の合成ペ プチドを調整した。用いられた技術は、化学的手段による固体合成の一種であっ たが、所望の種類を分は与えるため個々の個室化されたペプチド樹脂を使った。

Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、Ｐ、　Ｎ、＾、Ｓ、　（Ｕ、Ｓ、Ａ、）、　８２：　５１ ３１−３５　（１９８５）参照。

さらに種々のペプチドを産生ずる別のアプローチは、混合オリゴヌクレオチドの 発現で行うものである。Ｇａｆｆら、ＤＮＡ、　ｆｉ：　ａｓ１−８８　（１９ ８７）　参照。しかしこれらアプローチのどれもペプチドの大集団内でランダム 合成とランダム分解との間のバランスのとれた平衡を持つものはない。必要とさ れるのは、かかる平衡系であって、それによって未知のアミノ酸配列の特定生成 物を選択的に除去することが、大量の有り得る各生成物の正味の合成なしに、そ の生成物の正味の選択的合成をもたらすことになるのである。

ペプチド合成の触媒としてのタンパク質分解酵素の第１次的用途は、単一の既知 のペプチド種の合成に従来向けられてきている。このような非ランダムペプチド の酵素合成に関していくつかの特許が存在し、この目的のためにその他のペプチ ドの形成を阻止する保護基を用いることを開示し特許請求している。

ｌ５ＯＷａ、米国特許３．９７７、７７３　（１９７６）は、３またはそれ以上 のアミノ酸を有するペプチドの酵素生成におけるペプシンの使用に関する。ある 種の強制がペプチド配列に課される。Ｎ末端およびＣ末端の保護基が広く引用さ れている。Ｉｓｏｗａ、米国特許４，０８６．１３６　（１９７８）は、２つま たはそれ以上のアミノ酸を有するペプチドの酵素合成においてチオールプロテイ ナーゼ（例、パパイン）あるいはセリンプロテイナーゼ（例、ズブチリシン）を 使用することを特許請求している。その特許請求は、１つのアミノ酸またはペプ チドが、アミノ保護基をもち、他方はカルボキシル保護基をもつこと、そして後 者は次のうちのどれかであることを要件としている。すなわち、第三アルコキシ 、ベンジルオキシ、ヘンシルアミノ、ベンジルヒドリルアミノである。

Ｉｓｏｗａ、米国特許４．１１６．７６８　（１９７８）は、メタロプロテイナ ーゼ酵素の作用下にペプチドの産生を行う。Ｎ末端およびＣ末端保護基か広く引 用されている。Ｉｓｏｗａ、米国特許４．１１９．４９３（１９７８）参照。Ｉ ｓｏｗａ、米国特許４，１６５．３１１　（１９７９）は、ａ−Ｌ−アスパルチ ル−し−フェニルアラニンアルカリエステル（すなわちアスパルテーム様化合物 ）の産生のため付加的化合物を使用することを本旨とする。Ｉｓｏｗａの米国特 許４．２５６．８３６（１９８１）は、プロテアーゼを使ってこれら化合物を産 生ずる過程に係るものである。

米国特許４５２１５１４　（１９８５）も参照。

Ｊｏｈａｎｓｅｎ、米国特許４，３３９，５３４　（１９８２；　Ｄｅ　Ｆｏｒ ｅｎｅｄ　Ｂｒｙｇｇｅｒｉｅｒ　Ａ／Ｓ）は、ペプチドの酵素合成のためＬ− 特異性セリンまたは酵母カルボキシペプチダーゼのようなチオールカルボキシペ プチダーゼを使用することに広く関連するものである。Ｊｏｈａｎｓｅｎ、米国 特許４．８０６．４７３参照。Ｏｙａｍａ、米国特許４．５２１．５１４（１９ ８５；　Ｔｏｙｏ　５ｏｄａ）はプロテアーゼの回収工程に関する。ＳｎｅｌＩ ｍａｎ、米国特許３，５４４，４２６　（１９６５）はカルボン酸エステル、ア ミン（ペプチドを含む）、ヌクレオシドのリン酸誘導体およびエンザイムの反応 によるペプチド鎖の合成に関する。Ｍｏｒｉｈａｒａ。

米国特許４．３２０．１９７及び４．３２０．１９６はヒトインシュリンの半合 成に関する。

勿論、排他的に以前から存在するアミノ酸配列のペプチドを現存のタンパク質の 簡単な分解で産生ずるためタンパク質分解酵素を用いることは周知である。例え ばＭａｔｓｕｋａｗａ、米国特許３、８５５．１９６　（発明者らに、１９７４ 年１２月１７日発行）は、ｃｅｒｖｏｉｄａｅ（トナカイ、カリブーを含む分類 群）の骨格筋を分子量１．０００以下の低分子量ペプチド中にプロテアーゼで分 解している。これらのペプチドはゲルタイプ分子ふるいを使ってクルードダイジ ェストから分離された。

Ｍａｑｂｏｉｓ、米国特許３．９９３．６３６　（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｎａｔ ｉｏｎａｌ　ｄｅ　１ａＲｅｃｂｅｒｃｈｅ　Ａｇｒｏｎｏｍｉｑｕｅに、１９ ７６年１１月２３日発行）は、野菜タンパク質を分子量カットオフが２．０００ と低い薄膜で限外濾過している（第４ｇ４、第３８〜４４頁）。

Ｆｕｊｉｍａｋｉ、米国特許３，８１３，３２７　（１９７４年４月９日発行、 現在期限切れ）は、例えばズブチリシンでタンパク質を加水分解することによっ てＭＷＩ、　２００〜２．０００のオリゴペプチドを得ることにつき特許請求し ている。

Ｐｉｅｃｚｅｎｉｋ、　ＷＯ３７１０１３７４は、抗体の認識部位を同定するた め現存タンパク質の簡単な分解から均一サイズの可変配列ペプチドを使っている 。あるいは、可変ペプチドはアミノ酸からの化学合成、または断片ＤＮＡを発現 ベクター中に挿入し、その後それを発現させるという方法で生成する。

半透膜の存在下または不存在下で高分子によりペプチドを結合させることは種々 の目的のため行われることについて既に記述した。受容体結合分析はその技術に 周知の方法で、受容体への結合能のためペプチドをスクリーニングすることはよ く行われている。例えば上記Ｒｕｇｇｅｔｉ参照。ｌＦｅ５　ｔｓ＋ａｏ米国特 許３．６４９゜４５７　（Ｍｏｎｓａｎｔｏ　Ｃｏ、に、１９７２年３月１４日 発行）は、可溶性の酵素−ポリマー抱合体を、酵素反応物を通過させるが酵素試 薬は通過させない半透性壁の酵素反応室に入れる技術を開示している。その列中 て、薄膜は１．０００までもの低い排除限界をもっている（第３欄、第１５〜１ ８行）。パパインがこの系中で使用される酵素として示唆されている（第９欄、 第４８行）。反応産生物は酵素−ポリマー抱合体より低い分子量のものでなけれ ばならないが、「共に酵素反応して高い分子量産生物を産生ずる複数の反応物を 基質がなすときは、出発基質より高い分子量のものでもよい」（第１３欄、第６ ０〜６３行）。Ｌｉｋｈｉｔｅ、米国特許３．８４３．４４４　（１９７４年１ ０月２３日発行）は、１つの培地中のリガンドが第２の培地中の受容体にバリヤ フィルムを介して引き付けられる薄膜分離工程につき開示している。Ｌｉｋｂｉ ｔｅの系においては、受容体もリガンドも実際にはそのバリヤを通過することが なく、受容体やりカントはその反対側に選択的に集められるのであるという点に 注目されなければならない（第２欄、第２０〜２１行、２５〜２８行、および６ ７〜７０行）。

本発明は、特定サイズ範囲の大きな、ランダムのペプチド集団産生の必要性を満 足させ、かかる集団から潜在的に有益なペプチドを随伴選択［ｃｏｎｃｏｍｉｔ ａｎｔ　５ｅｌｅｃｔｉｏｎ］　Ｌ、、大量の外来ランダムペプチドの純産生な しに、上記のようなペプチドの分析可能な量を合成することに関する。本発明は スクランブル反応、すなわちタンパク質分解酵素によって触媒されたペプチドの 合成・分解間に安定、好ましくは全体的平衡状態にある系、を使用することによ って、また、特に高分子によるペプチド結合によって平衡状態に動揺を与えて潜 在的に有益なペプチドを選択し純合成する手段に上記スクランブル反応を結び付 け、こうして系からかかるペプチドを除去しかかる結合ペプチドの形成に資する ため平衡状態をシフトすることによって、この必要性を満たしている。酵素活性 を有する遺伝子工学的に操作されたタンパク質もスクランブル反応を促進しペプ チドのランダム分配を提供するのに有益である。

図面の簡単な説明 図１：　本発明のペプチド合成／トラップ装置および工程の概念図。この装置は 、例えばタンパク質分解酵素と開始ペプチドが置かれスクランブル反応が開始さ れる系である撹拌され温度調整される反応室１を有している。反応室の無菌状態 を維持するため、三股バルブを介してマイクロ濾過装置２で予め殺菌した反応室 １に全試薬が加えられ、またそこから−分別量が取り除かれる。加圧は第２マイ クロ濾過バルブ３により大気中に放出される。Ｇｉｌｍａｎの細菌エアベントが 適当である。細菌の生育を抑制するために反応混合物中に妥当な抗細菌剤を添加 するのもよい。反応室１の内容物は、１実施例において、ポンプ４により結合室 ５中を循環させられる。本装置は多重の高分子シンク［ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕ ｌｅ　５ｉｎｋ］を同時分析し、構造的に関連する高分子系に対し相対的に特定 するため平行な結合室５と共に組み立てられる。

第２実施例では、反応室１の内容物はポンプ６により、抽出室７を介して直列な 結合室８でポンプされる。リガンドの抽出室７と結合室８の列は、高分子シンク に結合室８内に関心のあるリガントを示す前に、関心のないリガンドを抽出室７ 隣の反応室混合物から取り除くことを可能にする。このことは、密接に関連する 高分子シンクに対する特殊な親和性をもつ結合ペプチドを同定する敏感で直接的 な方法を提供する。ポンプ６と抽出室７は十分に遅い流速を提供するものであっ て、かつ、該抽出室７内の高分子に高い親和性をもつペプチドの反応室１内容物 を枯渇するに十分に大きい表面積でなければならない。

図２　図１の結合室５．８の詳細図。反応室１からの反応混合物はライン１０経 由で結合室１１に流れ込み、ライン１２経由で戻る。

高分子はポンプ１４により中空ファイバ１３を介して循環する。

これらのファイバはその半透性のため、スクランブル反応によって産生されたペ プチドと接触している高分子を、この混合物の触媒環境にさらすことなく反応室 １内に置く。バルブとマイクロ濾過装置１５は、高分子シンクをロードし、ペプ チド高分子複合物をサンプルするため、高分子シンク側で使われた。

抽出室７は上記の結合室と同一のものだが、ただ結合室８へ出ていく前に抽出リ ガンドに対する親和性をもつペプチドの枯渇を確実にするため反応室内容物との 接触時間を最大にするように小室が設けられている点が異なる。小室７内のそれ に比較し結合室８内の高分子に特殊な親和性をもつペプチドを同定するため、完 成系か平衡状態に到達する前に抽出室７内の高分子がサンプルされる。異なる条 件（温度、緩衝液、アミノ酸の相対速度、ペプチダーゼなど）が好ましいこれら の場合には、異なる反応室／結合室の組合せが用いられる。すへての結合室と抽 出室は洗浄後に再使用される。

図３．　簡単な半透膜タイプのペプチド産生・スクリーニング装置の概略図。１ はキャップ、２はスクランブル混合物、３は透析袋、４は高分子シンク、５は撹 拌棒、６は貯留槽、そして７は磁力撹拌器である。プロテアーゼタンパク質とペ プチドの混合物が貯留槽（実際的容量の）中に入れられる。高分子シンク（受容 体）が透析袋（貯留槽の約１／１０の容量で、好ましくは１０００〜３５００ダ ルトンの分子カットオフをもつ）中に入れられる。透析袋は、酵素、タンパク質 、ペプチドの混合物中に沈められると、この混合物中で産生された低い分子量の ペプチドが透析膜を通して放散し、高分子シンクと相互反応する。適切な時間経 過後、透析袋の内容物を除去し、その高分子に結合しているペプチドを評価する 。結合室は系の無菌状態を確保するためキャップで蓋をし、酵素、タンパク質、 ペプチドの溶液の適切な混合を確実にするため貯留槽の内容物を撹拌する。

図４・　プロテアーゼ分子と高分子シンク分子の両者を固定化［ｉｍｍｏｂｉｌ ｉｚｅ］することによって選択的な液受流を達成するペプチド産生・スクリーニ ング装置の概略図。１はキャップ、２はタンパク質及び／又はペプチド、３は固 定化酵素、４は固定化した高分子シンク、５は撹拌棒、６は貯留槽、７は磁力撹 拌器。

この技術ではタンパク質又はタンパク質／ペプチド混合物が貯留槽（実際的容量 の）中に入れられる。高分子シンク（受容体）がしっかりとした基質上に固定化 されたガラスまたはセファロースビーズに付着する。同様に、酵素も別のしっか りした基質上に固定化されているガラスまたはセファロースビーズに付着する。

高分子マトリックスと酵素マトリックスはタンパク質、ペプチド混合物中に沈浸 され互いに空間的に分離される。固定化された酵素とタンパク質、ペプチド混合 物間の相互作用の結果産生される低分子量のペプチドは、固定化された高分子シ ンクと相互に反応する。妥当な時間経過とともに、しっかりした高分子シンクの 基質を除去し、その高分子に結合したペプチドを評価する。結合室は系の無菌状 態を確保するためキャップで蓋をし、貯留槽の内容物をタンパク質、ペプチド溶 液の適切な混合を確保するため撹拌する。

発明の概要 アミノ酸の数に従い特定サイズ範囲内の論理的に可能なほぼ全てのペプチドまで 大量で種々のペプチド集団を廉価かつ迅速に産生じ、この種々のペプチド集団を 高分子または高分子複合物に結合するペプチドの存在ゆえにスクリーニングする 方法を提供するもので、したがって潜在的に薬学的その他の目的に適合するもの である。本発明の方法はまた、外来のランダムペプチドの分析可能な量を付随す る純合成なしに上記ペプチドの分析可能な（ピコモル〜ミＩＪモル）量の産生法 を提供するものである。ペプチドの大きなランダム集団から単離される単一ペプ チドの薬学的用途を全部示すには次のステップがある。（１）そのペプチドの産 生、（２）一定の生理学的機能に関係する高分子に特異的に結合する特定のペプ チドの実証、（３）その特異的結合ペプチドの単離、（４）その特異的結合ペプ チドの構造（アミノ酸配列）の決定、（５）その特異的結合ペプチドの大規模合 成、（６）ペプチドの生物学的活性の実証、そして（７）予備臨床的ならびに臨 床的な試験、である。上記ステップ（３）〜（７）については現在既に満足でき る方法が存在する。そこで必要とされているのは、ペプチドの大量なランダム集 団の産生法であり、特定のタンパク質または高分子と特異的に結合するペプチド の存在のためその集団をスクリーニングする方法であり、またががるペプチドの 分析可能量の合成法である。本発明はこうした要請に応えるもので、次の手段を 採用する。（１）一定サイズで種々の配列未決定の大量のペプチドを平衡なペプ チドの合成と分解によりランダムに産生ずるため１または２以上のプロテアーゼ を利用する「スクランブル」系と、（２）合成反応をたった一つの結合ペプチド についてのみ完成させるようにするとともに、その関心ある特定のペプチドをス クリーニングするようにする分子トラップ出、（３）半透性バリヤ、共有原子価 の固定化またはマトリックスの固定化、その他上記スクランブル系を分子トラッ プから物理的に分離する類似の手段である。本発明の１目的は、ペプチドの巨大 なランダム集団を廉価かつ迅速に合成する手段を提供することである。別の目的 は、特定の生物学的に重要な高分子を結合するペプチド（特異的結合ペプチド） の存在のためそうした集団をスクリーニングする方法を提供することて、これに よりかかるペプチドをアミノ酸配列で同定するこ吉ができる。さらに他の目的は 、ペプチドが単離されたとき同一分子のものとは異なる分子複合体中にある別の 生物学的に重要な高分子に結合するペプチド（特異的結合ペプチド）の存在のた めペプチドの大量のランダム集団を付随的にスクリーニングする手段を提供する ことである。

本発明のさらに別の目的は、本発明の方法によって同定されアミノ酸配列をもち 、したがって標準的合成手段で容易に産生ずることができる特異的結合ペプチド を提供することである。

実施例の説明 一定すイズ節囲内にある変えられた配列の多数ペプチドを有するペプチド集団の 合成法、および特定の高分子に特異的に結合する１または２以上のペプチド（特 異的結合ペプチド）の存在のために上記集団をスクリーニングする方法が示され ている。

本方法は、出発物質として１または２以上の非特異性プロテアーゼと、カゼイン などの廉価な天然タンパク質、または天然タンパク質の混合物、の消化物をゲル 浸透クロマトグラフィで単離したサイズ選定されたペプチドの混合物を利用して 「スクランブル」反応させる技術を含む。この「スクランブル」反応は、酵素か 触媒であっていずれの方向にでも反応を促進することができるという事実を利用 するものである。タンパク質分解酵素にとって、タンパク質の加水分解（ペプチ ドをより小さいペプチドおよびアミノ酸に分解すること）と、ペプチド合成（ペ プチド形成のためペプチド及び／又はアミノ酸を結び付けること）とは同一酵素 により促進され得るということを意味する。

平衡点（合成と分解との）は、主としてアミノ酸およびその他のペプチド産生物 の濃度によって決定される。合成と分解が平衡する平衡点のためには、ペプチド は常にランダムに合成され、その後ランダムに分解され、このように実際にスク ランブルしており、アミノ酸の極めて変化した組合物を含む多重なペプチドの分 解が生している。かかるペプチドの多重性はペプチド内またはペプチド間のアミ ノ酸を再調整［ｒｅａｒｒａｎｇｅ］することによって、及び／又はペプチドを 産生ずるタンパク質を消化しそのペプチドにアミノ酸を追加することによって産 生ずることができる。そのような再調整または消化および追加工程を行うのにタ ンパク質分解酵素を採用することができる。こうした工程は、いかなるザイズで も所望のペプチドを産生ずるための特殊ペプチドの論理的に最大数の巨大数をも たらすことができる。

例えば８つのアミノ酸の平均的ペプチドサイズにとって産生できる個別ペプチド の論理的最大数は約２０８または約２．５６　Ｘ１０１０まてである。これらペ プチド各々は、固有の空間的、熱力学的結合特性をもつもの古考えられ、したが って特定の標的高分子に結合するための固有の特殊能をもっている。これに対し 結合多様性の頂点をなすと長い間考えられてきたヒト抗体の全種は、最大約１０ ９の特殊な熱力学的結合状態を産生ずる。

しかし個別のペプチド数はこの最大の論理的数字より小さいことに注目されなけ ればならない。これは真実の平衡点が発生することを妨害する安定状態条件がそ の周囲に発展すると考えられる局所的エネルギ最小値の存在か想像できることに よるものである。しかしそのような系にも相当なバリエーションが想像される。

かかるバリエーションは有益な特異的結合ペプチドの産生をもたらし得る最大論 理数に近づくものとは限らない。

本方法はさらに、特定高分子に特異的に結合する１または２以上のペプチド（特 異的結合ペプチド）の分析可能量を産生じ選定する方法にも関する。これはこの ようなペプチドをスクランブル系から抜き取ることによってそうしたペプチドを 純合成し、こうして平衡点をシフトすることによって行われる。プロテアーゼを 含む高分子を通過させることのない特定サイズまでのペプチドの通過を許す半透 性バリヤによってスクランブル混合物から物理的に分離される特定高分子「トラ ップ」に特異的に結合させることによって、これらペプチドは系から抜き取られ る。平衡状態にあるこのスクランブル反応から特定のペプチド産生物を選択的に 抜き取ることによって、またこのようにしてその分解を阻止することによって、 そうしたペプチドを純合成することは、その他の２５０億（またはそれ以上）の ペプチドの各々につき同量を純合成するという非実際的なことをしなくても達成 することができる。

このように本発明は特定高分子に特異的に結合するペプチドの存在をめてペプチ ド集団を産生しスクリーニングするもので、さらにこうしたペプチドを分析可能 な量好都合に純合成することを可能にするものでもある。例えば古典生物学的受 容体、特異的免疫グロブリン、構造タンパク質などのような、そのペプチドの結 合が期待される高分子を「トラップ」として利用することによって、有益なペプ チドを選定することができる。

こうした特異的に結合したペプチドは次に、標準工程によって互いにそれら高分 子から分離され、アミノ酸配列により同定される。

ひとたび同定されれば、当業者をして標準の合成法によりこの特異的結合ペプチ ドを無限に産生させることが完全に可能である。したがって本発明方法によれば 、本発明方法による特異的結合ペプチドの産生と、本発明方法により産生された 特異的結合ペプチドに同一のアミノ酸配列を有するペプチドの大量産生との両者 を可能にする。

本発明方法は、特定高分子に結合するペプチドの純合成と組合せて特殊な空間的 、熱力学的特性の大量の多様なペプチドを生成するためのプロテアーゼで触媒さ れたペプチド「スクランブル」と、当該ペプチドのアミノ酸配列による同定とに 関する。

出発ペプチドは約２　ａ、　ａ、　（ａ、　ａ、はアミノ酸の略号）から約１５ 　ａ、　ａの平均サイズである。本技術分野に通じる者はこうした出発ペプチド が種々の源から出るものであることを認めるであろう。好ましくはそれらペプチ ドは、２０の天然アミノ酸の全部もしくはほぼ全部を含むのがよい。かかるペプ チド源としては、天然タンパク質のタンパク質分解消化物［ｐｒｏｔｅｏｌｙｔ ｉｃ　ｄｉｇｅ５ｔ３］のほか化学的に合成されたペプチドも含む。最も好まし くは、例えばカゼインのような廉価なタンパク質のタンパク質分解消化によって 産生じたペプチドを使用することである。出発ペプチドとして最も好ましいサイ ズ範囲は、約７　ａ、　ａ、から約１０ａ、ａ、である。

出発ペプチドは平衡的合成によってスクランブルされ、タンパク質分解酵素によ って分解触媒される。スクランブルが進行するにつれて１または２以上のタンパ ク質分解酵素が出発ペプチドの溶液に加えられる。それら出発ペプチドは約１０ −’Ｍ〜約１０−’Ｍの濃度で、より普通には約１０−’Ｍ〜約１０−’Ｍの濃 度で存在する。最も好ましい出発ペプチドの濃度は約１０−３Ｍ〜約１０−’Ｍ である。本発明に有効な試薬の全部がいがなる条件下でも全面的に可溶性である 必要は必ずしもないことに留意されたい。したがって本発明の目的上モル濃度は 、溶液１リツトル当たりに加えられる物質のモル数を意味するに過ぎず、溶液１ リツトルに実際溶解しているモル数ではないと理解されたい。スクランブル反応 にとって考え得る最良の状態ははっきりとした比較的非特異的なプロテアーゼの 組合せを用いることである。最も好ましくは、パパイン、ペプシン、ブロメライ ン、サーモリシンを単独または組合せて使うことである。各プロテアーゼは、分 子量および各々の可溶性の程度に応じて、基質濃度の約０．０１重量％〜約２０ 重量％の濃度で存在しなければならない。最も好ましくは、各酵素が基質濃度の 約０．５重量％て存在することである。

あるいはスクランブルは、こうした酵素的手段ではなく化学的手段で行うことも できる。

特定高分子に対し高い結合親和性をもつペプチドの選択的な純合成は、例えばペ プチドの自由な通過は許すが高分子やタンパク質分解酵素の通過は許さない半透 膜によってスクランブル反応から分離させた特定高分子「トラップ」にペプチド を結合させることにより「スクランブル」サイクルから間ペプチドを抜き取るこ とによって達成される。トラップとして使用可能な高分子または高分子複合物の タイプについては論理的な制限が少しもない。

生物学的、生化学的技術の利用は無数の生体分子の同定を可能にし、それら生体 分子の変調が病的状態を変え得ることを明らかにした。これらの生体分子や生体 分子複合体としては、受容体、特異性抗体クラス、構造タンパク貫ＲＮＡ、ＤＮ Ａ、ポリサッカライドあるいは酵素などがある。

同定されクローニングされた古典的受容体の例としては、ドーパミン受容体（Ｄ ｉとＤ２）、アヘン剤受容体、ベンゾシアセビン受容体、アドレナリン受容体（ α−１，２およびβ−１，２）コリン（ムスカリン）受容体、カルシウム、ナト リウムまたはカリウムチャネル受容体、グルココルチコイド受容体、フィブリノ −ケン受容体、およびフィブロネクチン受容体がある。

さらにインシュリン、エストロゲン、ＬＤＨ，プロゲステロン、イノシトール三 リン酸、およびセラトニンの各受容体などがある。

特異性抗体クラスとしては、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、クルーヴスのオ フサルモファシー、乾紺、インシュリン依存性糖尿病、および全身性エリテマト ーデスのような臓器移植拒絶症ならびに自己免疫疾患に関係するものを含む。

構造タンパク質と酵素としては、かぜ［ｃｏｉＩｍｏｎ　ｃｏｌｄ］（ライノウ ィルス）、Ａ型肝炎、インフルエンザ、ＲＳウィルス、ＨＩＶおよびガン誘発性 ウィルス（例、ＨＰＶ）のような病理学的ウィルスまたは細菌と関連するものが ある。特定例としてはライフウィルスキャプシドタンパク質、レオウィルス赤血 球凝集素受容体、およびＨＩ　Ｖ　ｇｐ１２０タンパク質がある。さらに挙げれ ば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ペニシリナーゼなどがある。

非ウィルス系の構造タンパク質と酵素としては、鎌状赤血球ヘモグロビンとか、 新生物［ｎｅｏｐｌａｓｉａ］と関連する特異性タンパク質キナーゼがある。さ らに例を挙げれば、コラゲナーゼインヒビター、ＨＭＧ−ＣｏＡ、リダクターゼ インヒビター、アンギオテンンン変換酵素インヒビター、レニンインヒビター、 およびチミジル酸シンテターゼインヒビターがある。

原則として各高分子、高分子複合体、または受容体は、空間的ならびに熱力学的 な特性の明確なセットで認識可能な特殊な表面を示し、したがってどんな受容体 または高分子も論理的にトラップとして作用することが可能である。トラップと して利用可能な高分子の濃度は、約１０−１０Ｍ〜約１０−’Ｍである。

好ましい実施例では、高分子濃度は約１０−”Ｍ〜約１０−５Ｍである。結合ペ プチドのサイズは約２　ａ、　ａ、〜約１５　ａ、　ａ、の範囲である。最も好 ましいのは結合ペプチドのサイズが約２　ａ、　ａ、〜約１０ａ、ａ、の間であ る。ペプチドによる高分子の特異的結合は、会合定数がモル当たり約１０４〜約 １０１３であるときの結合として定義される。この範囲内の親和性を有するペプ チドは特異的結合タンパク質として知られる。最も好ましくは、モル当たり少な くとも約１０５の結合親和性を有するペプチドであって、結合タンパク質の活性 をモジュレーションすることができるものである。

本技術に通じている者なら、例えば半透性バリヤのような手段を使って、高分子 ［トラップ」を「スクランブル」反応から分離するために採用されるべき多くの 配置［ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ］を認めることができるであろう。唯一の制 約は、その配置が結合ペプチドの自由な通過を許すものであると同時に、高分子 「トラップ」またはいかなるプロテアーゼの移転［ｔｒａｎｓｎｉｇｒａｔｉｏ ｎ］をも阻止するものでなければならないということである。別言すれば、バリ ヤは特異的結合高分子または高分子複合体と流動交通にペプチドを置くと共に、 それ以外の高分子または高分子複合体（例えばプロテアーゼ）をそうした交通状 態に置かないものであることが必要である。そこでバリヤは、高分子透析、脱塩 、濃縮または単離に通常使われるもので、約１５ｋｄまたはそれ以下の分子量を カットオフする選択的透過性のものである。

好ましいバリヤ材としては、硝酸セルロース、酢酸セルロース、再生セルロース 、ポリアミド、およびシーツとかチューブ、中空ファイバの形に作られるポリカ ーボネートポリマーで、約０゜２ｋｄ〜約２０ｋｄの透過性カットオフをもつも のがよい。最も好ましくは、約１〜３．５ｋｄの透過性カットオフをもつ半透膜 である。半透性のバリヤ、「スクランブル」反応、および高分子「トラップ」間 の空間的関係は、さまざまであるが、いずれの配置においても半透性バリヤは、 タンパク質分解酵素を高分子「トラップ」から完全に分離する。実施例によって は、このバリヤは「スクランブル」または「トラップ」要素のいずれかを有する 「袋」であるか、または系中にあって「スクランブル」または「トラップ」要素 を有する２個または３個以上の小室間に設けられた「窓」として機能するもので もよい。

以下、例は図面と共に説明するが、その具体例に権利を制限する趣旨ではない。

本発明に関連する技術に通じる者なら、ここに挙げたものと異なるタンパク質分 解酵素またはタンパク質分解酵素の組合せを採用することもでき、また反応時間 および試薬の濃度がある程度まで変更可能であること、異なるサイズの有効なペ プチドが産生できること、および「スクランブル」や「選択的」系を分離するそ の他の手段も採用可能であることを認めるであろう。本例において濃度値はモル 濃度で与えられているが、当業者なら試薬の全部が全条件下で常に完全に溶解し ていなければならないものでもないことを認めるであろう。

したかってここに記載のモル濃度値は、溶液のリットル当たり実際に溶解してい る物質のグラム数を表すものではなく、溶液の各々リットル当たりに加えられる 物質のモル数を表すもにに過ぎないことを理解されたい。次の略号が以下使用さ れる・ａ、ａ、”アミノ酸、Ｗ＝ニトリブトファンＥ＝グルタマート、Ｆ＝フェ ニルアラニン、Ｙ＝ニトリブトシンＬ＝ロイシン、Ｓ＝セリン、Ｇ＝ニブリシン 【＝イソロイシン、Ｋ＝リシン、Ｖ−バリン、Ａ−アラニン、Ｍ＝モル、ｇ−グ ラム、ｍｇ＝ミリグラム、ｋｄ＝キロダルトン、２−Ｄ　５ＤＳ−ＰＡＧＥ＝２ 次ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、以上。

例１ 出発ペプチドの調整 カゼイン、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、ラクトアルブミン、ウシ腎臓 アセトン粉末、腸アセトン粉末、ヘモグロビン、エデスチン、ニワトリ卵白、ヒ ョウタン種子グロブリン、等の廉価なタンパク質、またはそれらタンパク質の混 合物が、パパイン、プロナーゼ、またはズブチリシンのような非特異性プロテア ーゼまたはそれらの混合物の約１０−’Ｍの濃度、約０゜５％含水重量で、消化 される。外界温度（２５℃）で、この消化には約２時間を必要とする。消化物は ゲル浸透クロマトグラフィでポリサッカライドマトリックス（例、Ｂｉｏ−Ｒａ ｄ、　Ｂｉｏ−Ｇｅ１Ｍ）上に小片化する。約７〜１２ａ、ａ、のアミノ酸を有 する小片を集め、スクランブル反応に使うため、凍結乾燥し、約１０−２Ｍの濃 度に再構築する。あるいは、図１の反応室１中で直接に消化することによっても 同様な適切な出発ペプチド分布を得ることかできる。このようにして同様に廉価 なタンノくり質またはタンパク質混合物の１０−”Ｍ溶液約３Ｌが、非特異性プ ロテアーゼまたはその混合物約０．５％含水重量で消化される。７〜１２ａ。

ａ、をもつｓｍａｌｌペプチドの好ましい分子量分布は、平均ペプチド長さを増 加することになるより多くのタンノ（り質を加えるか（すなわちアミノ酸をより 濃縮し合成を増進させる）、あるＬ’はペプチド鎖長を短くするようペプチド混 合物を希釈する（すなわち現存ペプチドの加水分解を増進する）ことによって調 節される。実際のペプチドのサイズ分布は、例１の図１における弁２から反応混 合物の１分別量を抜き取り、ポリサ・ツカライドゲルを使ったゲル浸透クロマト グラフィにそれをかけることによってモニターされる。出発ペプチドを調製する 両方法【こお−）で、所与の結合ペプチド中におけるアミノ酸及び／又はｓｍａ ｌｌペプチドの含有が特に好ましいと考えられるか、あるし）はスクランブル反 応における反応速度が特に遅いときは、平衡混合物は、アミノ酸及び／又は５Ｉ Ｉａ１１ペプチドを加えられてもよし）。

例２ スクランブル反応の開始 図１の反応室に、７〜１２ａ、ａ、サイズの１０−２Ｍペプチド断片溶液約３Ｌ Ｃ例１）が、反応室の無菌状態を維持するためマイクロ濾過装置を介して加えら れる。次にペプチド基質１００ｇ当たり約０．５ｇのＳ、　ｇｒｉｓｅｕｓプロ テアーゼ、ツク／フィン、ズブチリシンの混合物が加えられる。スクランブル反 応は約２５℃で撹拌することで具体化される。あるいはこれと同じことＣよ例１ に示した廉価な出発タンパク質の直接的消化（こよっても到達できる。所望の全 体的平衡状態、またスクランブル量を査定するため、例３に示したいくつかの技 術が行われる。０ずれの場合もペプチド長さは、反応室から反応混合物の分別量 を抜き取り、それをポリサッカライドゲルを使ったゲル浸透クロマトグラフィに かけることで、定期的にモニターされる。ペプチド長さの所望の平均範囲、すな わち７〜１２ａ、ａ、は、より長い長さが望まれるときにはさらにアミノ酸か、 ペプチドかあるいはタンパク質を加えることにより、逆に短いペプチド長さが望 まれるときは、緩衝液で希釈することによって、維持される。

例３ クロマトグラフィ測定した化学的異種混交性によるペプチドにおけるアミノ酸ス クランブルの定性分析スクランブル反応において真の全体的平衡状態に到達した かどうかを保証する実際的方法はない。これは全ての可能な１０ｊ３（１０残基 の場合）ペプチドが等量だけ存在することの立証を要求する。スクランブルの最 も実際的な定義は、例１の出発タンパク質のアミノ酸配列中に見られないアミノ 酸配列を有する高親和性ペプチドを同定することで足りる。そのようなペプチド にアミノ酸スクランブルを起こすことは、例２の反応混合物中にある現存ペプチ ド中に遊離アミノ酸を組入れたり、それとペプチドを組合せたりするなどの種々 の方法で示される。例えば次の定性的で、かつ半定量的な分析が、スクランブル の論理的限界に近づいたその程度を決定するのに有効であり、したがってトラッ プとして利用することかできるペプチドの数を見積もることも可能である。ペプ チドにおけるアミノ酸スクランブルの最初の評価は、スクランブルが生ずると、 化学的異種混交性および潜在生物学的な異種混交性が増進するという事実に依存 している。したがってスクランブルのない断片へのタンパク質の最初の非削［ｃ ｌｅａｖａｇｅ］は、限定的数量の化学物質、すなわち例１て使用される５ＩＩ ａｌｌタンパク質用の数千である。かかる消化混合物のクロマトグラフィ　（ゲ ル濾過、逆相、等電点電気泳動、イオン交換、順相、分配、など）は、構造、す なわちピークを、限定的数量の化学物質の相対的に高い濃度によって示すことに なる。スクランブルが進行するにつれ、化学的異種混交性は１０アミノ酸長さの ペプチドにつき数千という分離化学物質から最大的１０１３まで化学物質を増加 する。化学的異種混交性が増加するにつれ、化学物質数が増加し、いずれかの特 異的出発化学物質が減少するので、クロマトグラフィ的構造はそれに応じて消失 する。限界の１０１３ペプチドは、殆どのものがクロマトグラフィ挙動において 少し異なるもので、各々は出発アミノ酸内容物の非常に小さな等断片でしかない 、はっきりとした限界ピークをもたない広がったこぶのクロマトグラムを示す。

スクランブルの中期的段階は、クロマトグラフィ構造の部分的消失で特徴付けら れる。出発ペプチド混合物のそれと比較したクロマトグラフィ測定における化学 的異種混交性の増加は、アミノ酸スクランブルが生じていることを定性的に意味 する。

同位体標識法によるペプチドの アミノ酸スクランブルに関する半定量分析ペプチドにおけるアミノ酸のスクラン ブル量は、全アミノ酸含有のジペプチド混合物で標識付したスクランブル反応パ ルスて時間とともに標識分布を測定することによって評価することかできる。こ うした分析も真の全体的平衡状態においては、溶液中に遊離している各アミノ酸 、および混合物中の各ペプチド中の各部位にある各アミノ酸は、そのパルス標識 に等しいアクセス蓋然性をもつという事実に依存するものである。各ペプチドを 単離し、全ての可能なペプチドに標識が平均的に分布されていることを判定する ことは最初の概算として非現実的だが、ペプチドの異種混交性的混合物のバルク 特性としてなら行うことができる。この工程においては２０全部の３Ｈ標識アミ ノ酸（ペプチド反応混合物のアミノ酸分布にマツチするよう調整された５　ｍｃ ｉ、　１０−７Ｍ　トータルの）が例２の反応混合物に加えられ、その反応物は 一定期間インキユベートされる。反応物の１分別量を抜き取り種々のクロマトグ ラフィにかける。すなわち、ゲル濾過、逆相、等電点電気泳動、イオン交換、順 相、分配、などである。クロマトグラフィマトリックスからの排液を２１４１Ｍ 紫外線（全ペプチド）および３Ｈ（合成されたもの）検出の両者で分析する。標 識付していない出発ペプチド混合物からの新１７いペプチド中へ３Ｈを組込むこ とにより測定した化学的異種混交性の増加は、アミノ酸スクランブルが発生して いることを定性的に意味している。ペプチド混合物中におけるアミノ酸スクラン ブルが大きければ大きいほど、同位体および２１４ｏＭ紫外線クロマトグラフィ のプロフィルが近くなる。真の全体的平衡状態（１００％スクランブルされた状 態）では、上記２つのプロフィルは全紫外線スペクトル範囲を通して均一でなけ ればならない。

反応混合物におけるアミノ酸スクランブル量のより正確な把握は、様々なりロマ トグラフィ工程から溶離した新しいペプチドオリゴマーの各部位における標識ア ミノ酸の分布を決定することによって得ることができる。真の全体的平衡状態、 すなわちペプチド中で完全にアミノ酸スクランブルが発生しているときは、標識 付けられたものは全部の有り得るアミノ酸小室に均等に分布される。小室はペプ チドの異種混交性混合体中における同一の相対的部位にあるもの（すなわちカル ボキシ末端から第３番目の残基）として定義される。真に論理的スクランブルが 発生している真の全体的平衡状態では、標識付アミノ酸の非標識付アミノ酸に対 する割合は、これら小室の各々の出発ペプチド混合体の全アミノ酸内容物に加え られた標識の出発速度に等しいものとなる。もしこの状態にまだ到達していない のなら、そのペプチドの様々な部位にある標識アミノ酸は、この論理的量とは違 うものとなる。こうした違いが、その系が真の全体的平衡状態に近づいたその程 度を評価するのに利用することができる。出発混合物中のアミノ酸の全モル濃度 は、出発ペプチドと所定の平均ペプチド長さを維持するため加えられるペプチド との合計量である（Ｍ全アミノ酸の濃度を１０−２とすれば、次の計算において ジペプチドとして加えられる標識アミノ酸量は無意味となる）。ペプチダーゼ加 水分解を使い酵素的に種々のクロマトグラフィ断片にあるペプチドを配列的に分 解することにより、あるいはＥｄｉ＋ａｎ分解を使って化学的に分解し、その後 ペプチドから各アミノ酸残基が放出されたときその放出された標識量を測定する ことにより行う。スクランブル量、つまり真の全体的平衡状態に到達した到達程 度は、その論理的に可能な値（１０−５）を超える観察値の割合として規定され る。スクランブル発生の発生程度を反映するものとして、ゼロから１０−５まで の値が考え得る。

例４ 結合するペプチドの選択的な純合成と同定反応室ａ（図１参照）は例１〜例３に 述べたようにして平衡状態をもたらされる。３Ｈ標識された全２０のアミノ酸、 またはこれらアミノ酸を含む５ｆｌａｌｌペプチド（５ｎｃｉ、　ＩＯＭ　トー タル）の混合物を反応室に導入し、系をしてペプチド混合物に対し標識付ペプチ ドを分布させる。図１の合成／トラップ装置中の並列結合室の一つの中空ファイ バに、ヒト血小板フィブリノーゲン受容体の緩衝１０−５Ｍ溶液約１０ＩＩＬ（ ｌｉａｒｇｕｅｒｉｅ　Ｌ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌ］、１９７９．２５４（１ ２）、　５３５７）を加える。系全体は、新たな平衡状態（安定状態）になるに 十分な時間、すなわち目的の特異的結合ペプチドを産生ずるに必要な時間を与え られる。所定時間後、血小板フィブリノーゲン受容体および結合ペプチドを含有 する中空ファイバから得た溶液の１分別量を抜き取り、該溶液中に存在する非特 異的ペプチドから受容体ペプチド複合体を分離するため（前者は反応室に戻され る）限外濾過にかける。非特異的ペプチドからの結合ペプチドの分離は、濾過液 を通常の限外濾過装置を使いホスファート緩衝液で３回洗浄して行う。これは親 和性が約Ｋａ＝１０６以上のペプチドに複合する血小板フィブリノーゲン受容体 を残す。このようにして単離された血小板フィブリノーゲン受容体複合体は、結 合ペプチドを放出するように熱変性される（１００℃、１時間）。フィブリノー ゲン受容体に特異的なこれらペプチドは、次に限外濾過により変性受容体から分 離される。フィブリノーゲン受容体に特殊なペプチドの溶液は、標準的なりロマ トグラフイ方法単独を使って、または、逆相ＨＰＬＣ，等電点電気泳動、吸着ク ロマトグラフィ、分配クロマトグラフィ、イオン交換などと組合せて使って、小 片化する。ペプチドの検出は、シンチレーションカウンタを使って行う。個々の ペプチドは次にスタンダードペプチド配列法により配列し、合成し、標準的工程 によって抗血小板活性につき評価する。抗血小板活性を発現するこれらペプチド またはその合成変形体は、様々な心臓脈管疾患の臨床的処置に有力な薬剤である 。

例５ レニンに結合するペプチドの選択的純合成と同定市販されているレニンの緩衝液 （１０ｍＬ、１０−’Ｍ）を、図１の合成／トラップ装置にある第２番目の並列 結合室の中空ファイバに加え、系を目的の高親和性ペプチド産生に必要な時間イ ンキュベートした。この分析は、２つの高分子シンク間の特定ペプチド（または 特定ペプチドの合成に使われるペプチド断片）のどんな競合［ｃｏｍｐｅｔｉｔ ｉｏｎ］も、その最終的状態ではなく、新らたな全体的平衡状態、に到達する時 間を長引かせるに過ぎないものなので、例４の分析と同時に行うことができる。

例４につき記載したものと同一の工程が、レニンに対し高親和性を有するペプチ ドを同時に同定する。レニンに対する結合特異性を有するこれらペプチド、また はその合成変形体は、レニン機能を抑制する有力な候補であり、したがって高血 圧症の処置に有望である。

例６ コラゲナーゼ■に結合するペプチドの選択的純合成と同定その酵素活性が腫瘍転 移に意義深いとみられるコラゲナーゼ■の緩衝液（１０！ＩＬ、１０−’Ｍ）（ Ｓａｌｏ　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　１９８３．２５８、２０５８）を、図 １の合成／トラップ装置にある第３の並列結合室の中空ファイバに加え、系をコ ラゲナーゼ■の特異的結合ペプチド産生に必要な時間インキュベートする。例４ で記載のものと同一の工程が、コラゲナーゼ■に対する高親和性を有するペプチ ドを同時に同定する。この特性を有するペプチドが、この酵素のため標準分析法 でコラゲナーゼ酵素活性抑制能をもつものをめてスクリーニングする。コラゲナ ーゼ■抑制能を発現するペプチド、またはその合成変形体は、腫瘍転移のおそれ を減殺する注射液［ｉｎ　ｊｅｃｔａｂｌｅｓ］として有力候補である。

例７ 鐘状ヘモグロビンに結合するが正常ヘモグロビンには結合しないペプチドの選択 的純合成と同定スクランブル／トラップ装置の総体は、密接に関連する高分子系 に対する高親和性を有するペプチドの比較同定を行う。例えば、１個のアミノ酸 が異なるヘモグロビンと鐘状ヘモグロビンは、高親和性ペプチドの同定を同時に 評価され得る。新しく調製したヘモグロビンの緩衝溶液（１０＋ｏＬ　１０−３ Ｍ）と、鐘状ヘモグロビンとを同濃度で、図１に示した合成／トラップ装置の２ つの追加的並列結合室の中空ファイバ中に別々にロードし、系を目標の高親和性 ペプチドを産生ずるのに必要な時間だけインキュベートさせる。ヘモグロビンと 鐘状ヘモグロビンとを含むこれら２つの中空ファイバから高親和性ペプチドのク ロマトグラフィプロフィルの比較は、鐘状ヘモグロビンに結合するが正常ヘモグ ロビンには結合しないペプチドを、その差によって区別する。鐘状ヘモグロビン に対する特殊な親和性を有するペプチド、またはそれらペプチドの合成誘導体は 、鐘状化過程の抑制に有力な候補であり、したがって鎌状赤血球貧血の処置に有 望である。こうした結果はまた、ヘモグロビンが抽出室７中にロードされ、鐘状 ヘモグロビンが分析室８中にロードされる図１のリガンド抽出室／結合室７のシ リーズを使うことによっても達成することができる。

例８ ペプチド生成のためのタンパク質の ペプシン触媒消化と、それへのアミノ酸の付加カセイン（０，５１］Ｍ）とペプ シン（０，２５１１Ｍ）とを５０１１１１のリン酸カリウム緩衝液（ｐ［１５， ０）中で２２℃で、トリチウム標識したＷＥジペプチドと共にインキュベートし た。サンプルを逆相ＨＰＬＣにかけ、ペプチドを分離し、それらのトリチウム濃 度につき分析した。反応時間１日、５日および７日後に、トリチウムを多数の新 たなペプチドに組み込んだ。これはペプシンがペプチドを生成するようカゼイン を消化できると共に、その後これらペプチドにジペプチドからアミノ酸を付加す ることができることを示している。

例９ ペプシンまたはパパインの触媒による ジペプチドからの多重ペプチドの合成 ペプシン（０，２５ＩＩＭ）またはパパイン（０，２５＋Ｍ）で５０１のリン酸 カリウム（ｐｆｌ　５．０）中で２２°Ｃで、トリチウム標識したＷＥトリペプ チド５０ｆｆｉＭ、　０．９ｕＣｉ）をインキュベートした。パパインを使った ときは、まづそれを５０℃ＭのＫＣＮ、１５ｍ１ｌのＥＤＴＡ、６０ＩＩＩＭの 酢酸塩中で２時間２２℃で活性化した。例８におけると同様にしてペプチドを分 離し、分析した。反応の１日後または５日後に多重な新しいペプチドの形成が観 察されたが、これはパパインもペプシンも新たなペプチドを合成することができ ることを示している。

例１０ プロテアーゼ混合物による多重ペプチドの産生例９の条件と同一条件下てペプシ ンとパパインでＥＷ、　ＷＥおよびＦＹをインキュベートした。１日後に多重の 新しいペプチド産生物が、個々のジペプチドから産生されるペプチド総量を超え る数産生された。

例１１ ペプチド内およびペプチド間におけるアミノ酸のプロテアーゼ触媒による転位［ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ］例８の条件と同一条件下でペプシンでトリペプチ ドＹＹＦをインキュベートした。あるいはトリペプチドＹＹＦ（０，２５ａｌｌ ）とテトラペプチドＶＡＡＦ（０，２５ｍＭ）をペンタ：／（０，２５ｍＭ）で 共にインキュベートした。サンプルを１時間〜２４時間の間、１時間間隔でペプ チド産生物につき分析した。様々なアミノ酸配列をもつ種のモノペプチド、ジペ プチド、トリペプチド、テトラペプチドおよびペンタペプチドが全サンプル中に 存在していた。ペプチド間およびペプチド内のアミノ酸交換が観察された。この １時間〜２４時間の間に、産生物のプロフィルは激しく変化した。このことはペ プシンがペプチドのスクランブルを触媒する、つまりペプチド結合の加水分解と 形成との間の動的平衡状態におけるペプチド内およびペプチド間のアミノ酸の転 位があることを示している。

例１２ 反応物の多様性に対し不均衡な増加を示す産生された多重ペプチドの多様性 ＬＹとＬＳＦ、ＷＥとＬＳＦ、ＷＥとＧＧＩ、またはＷＥとＧＬＹのジペプチド またはトリペプチド（各々、５０および２５Ｉ［１Ｍ）をサーモリシン（０，１ ａｌｌＭ）と共に２２℃、５０ｉ＋Ｍのリン酸カリウム（ｐＨ８，０）中でイン キュベートした。あるいは、ＬＷ（５０ｏＭ）とＫＹＫ（２５ａ＋Ｍ）またはＷ Ｆ（５０ｉＭ）のジペプチドとトリペプチドと０．１ｍＭのプロメラインで５０ ｍＭのリン酸カリウム（９口０．８）、５ＩｎＭの２−メルカプトエタノールで インキュベートした。２４時間後、ジペプチドまたはトリペプチドだけがサーモ リシンとインキュベートされたときにはなかった多重な新しいペプチドが形成さ れた。このことは反応ペプチドのより複雑な混合物は不均衡により複雑なペプチ ド産生物を産生ずるこ高分子シンクによる平衡状態のシフト ５０ＩＩＩＭのリン酸カリウム（ｐｆｌ６．３）、５ｍＭＭのＥＧＴＡ、２ｍＭ ＭのＭｇＣ］、、中で、２２℃で、１０００ダルトンカツトオフで、フィブリノ ーゲン（０，０３ｍＭ）含有または非含有の等浸透圧緩衝液を入れた透析袋で、 カゼイン（０，５ｍＭＭ）をペプシン（０，２５１１ＩＭ）でインキュベートし た。１時間〜９３時間後、いずれの場合も透析袋中には低分子量の産生物が検出 できた。透析袋中の産生物はフィブリノーゲンの有無により異なり、フィブリノ ーゲンの存在下では少な（とも１つの産生物が時間の関数として増加した。

このことは（１）カゼインのタンパク質消化から出る低い分子量の産生物は半透 性バリヤを通過して分散することができ、（２）スクランブル反応から出た半透 性バリヤを通過する高分子シンクの存在は特定の産生物を合成するのに都合よく スクランブル反応の平衡状態をシフトすることができる、ということを示してい る。

例１４ 様々な反応ペプチド、プロテアーゼ、および高分子シンクを使った結合複合物の 形成と特異的結合ペプチドの同定 ジペプチドＦＹ（５０ｍＭ）をペプシン（０，２５１１１Ｍ）と共に２２°Ｃて ２４時間、５０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ５，０）中でインキュへ−１−した 。反応混合物を１０００ダルトンの分子量カットオフの透析袋の外側に出した。

透析袋には等浸透圧緩衝液中に５０［Ｍのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のＩＥ ＩＬを入れである。５日後、透析袋内からの複数分別量を１０．０００ダルトン カツトオフ薄膜を介して濾過（−１次いで等浸透圧緩衝液で洗浄した。薄膜のり テンテート［ｒｅｔｅｎｔａｔｅｌを等浸透圧緩衝液で再懸濁し、１００℃で１ ５分間変性し特異的結合ペプチドを結合複合物から分離し、次いて１０００ダル トンカツトオフフイルタで濾過した。ペプチドスタンダードを使ってペプチドの 分離および分析のため濾過物を逆相ＨＰＬＣにかけた。フィブリノーゲンまたは カゼインを高分子シンクとしてＢＳＡの代わりに使ったとき、別の特異的結合ペ プチドが得られた。

例１５ スクランブルされたペプチド中への タンパク質からのアミノ酸輸送［ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｔｉｏｎ］ジペプチドＷ Ｅ（５０ｍｉｌ）とトリペプチド（２５ｄ）とを例１２に記載の条件下でサーモ リシン（０，１ｄ）で共にインキュベートした。５日後に、様々な配列の多重性 の新しいよりｌａｒｇｅなペプチドが得られた。それらペプチドの１つはイソロ イシンを含んでいたが、おそらくサーモリシンからのものと思われる。

このように、より５Ｉｌａｌｌなペプチドおよびタンパク質が、より１ａｒｇｅ なスクランブルされたペプチド中に組み込まれ得るアミノ酸を供出することがで きる。

要約器 特定の高分子または高分子複合物に高親相性をもって結合するペプチドの存在を めてペプチドの大集団を産生じ、がっ、スクリーニングし、さらに、ペプチドの 結合かめられている高分子または高分子複合物を「トラップ−］として使うこと により、そうしたペプチドの分析可能な量を容易に純合成する。

国際調査報告 ＩＰＩｅｍ＊ａ−−＋ｈ−−＋＝−＝−ｂ−ＰＩＴＴ／Ｉｆ’；Ｑｌ／Ｉ’１ｌ ＴＱＱＩ国際調査報告 ｐＣＴ／ｕｓ　９１１００８９１

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）予め決定されているアミノ酸配列でペプチドが特徴付けられないペプ チド多重性を産生するスクランブル系を使い、（ｂ）上記ペプチドを特異的高分 子または特異的高分子複合物と流動交通状態に置き、それによってペプチドを特 異的高分子または特異的高分子複合物に接触できるようにするが、それら以外の 高分子または高分子複合物には接触できないようにし、 （ｃ）上記ペプチドを結合複合物を形成するように特異的高分子または特異的高 分子複合物に競合的に結合させ、（ｄ）上記ペプチドを上記結合複合物から分離 し、そして（ｅ）上記ペプチドを上記結合複合物から同定するというステップを 特徴とする特異的結合ペプチドを同定する方法。
2. ２．ペプチドの多重性がペプチド内またはペプチド間のアミノ酸を再調整するこ とによって産生されるものである請求項１の方法。
3. ３．再調整が１または２以上のタンパク質分解酵素の活性によりもたらされるも のである請求項２の方法。
4. ４．ペプチドの多重性がペプチドを生成する消化タンパク質により産生され、次 にこれらペプチドにアミノ酸を加えることによるものである請求項１の方法。
5. ５．再調整が１または２以上のタンパク質分解酵素の活性によりもたらされるも のである請求項４の方法。
6. ６．流動交通が半透膜により提供されるものである請求項１、２、３、４または ５の方法。
7. ７．ペプチドの多重性がペプチドのランダム集団である請求項１、２または３の 方法。
8. ８．ペプチドの多重性がペプチドのランダム集団である請求項６の方法。
9. ９．特異的結合高分子または特異的結合高分子複合物が生理学的過程に関与する 受容体である請求項１、２、３、４、５、６、７または８の方法。
10. １０．特異的結合高分子または特異的結合高分子複合物がフィブリノーゲンであ る請求項１、２、３、４、５、６、７または８の方法。
11. １１．特異的結合高分子または特異的結合高分子複合物が鎌状赤血球ヘモグロビ ンである請求項１、２、３、４、５、６、７または８の方法。
12. １２．特異的結合高分子または特異的結合高分子複合物がコラゲナーゼＩＶであ る請求項１、２、３、４、５、６、７または８の方法。
13. １３．特異的結合高分子または特異的結合高分子複合物がレニンである請求項１ 、２、３、４、５、６、７または８の方法。
14. １４．請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１ ３の方法で同定されるペプチド。
15. １５．請求項１、２、３、４、５、６、７、８または１０の方法で同定されるフ ィブリノーゲンに結合するペプチド。
16. １６．請求項１、２、３、４、５、６、７、８または１１の方法で同定される鎌 状赤血球ヘモグロビンに結合するペプチド。
17. １７．請求項１、２、３、４、５、６、７、８または１２の方法で同定されるコ ラゲナーゼＩＶに結合するペプチド。
18. １８．請求項１、２、３、４、５、６、７、８または１３の方法で同定されるレ ニンに結合するペプチド。
19. １９．スクランブルが特異的高分子または特異的高分子複合物の存在下に行われ 、特異的結合ペプチドの選択的な純合成をもたらすものである請求項１の方法。