JP2003510569A - 混合物質に含まれる薬理学的活性化合物を検出および単離するための方法および装置 - Google Patents

混合物質に含まれる薬理学的活性化合物を検出および単離するための方法および装置

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、活性および不活性化学物質の混合物中に含まれる少なくとも１種類の活性化学物質を単離および／または同定するための方法に関する。本発明の方法は、工程：ａ）前記混合物に標的を加え、標的と、混合物の少なくとも１種類の活性化学物質との複合体を生成し、ｂ）この複合体を混合物の不活性化学物質から分離し、および、ｃ）少なくとも１種類の活性化学物質を、分離した複合体から遊離および単離し、および／または、前記物質を同定し、または、ｄ）混合物の少なくとも１種類の活性化学物質を、活性および不活性化学物質からなる混合物に関するクロマトグラムを、不活性化学物質からなる混合物のクロマトグラムから差し引くことにより同定し、前記の最後の混合物が複合体を分離した後に得られたものであり、また、所望により、分離した複合体から少なくとも１種類の活性物質を遊離および単離する、を特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 薬理学的研究は、天然源のみの使用から始まり、活性物質の化学合成およびそ
れらの動物実験による試験を経て、実験的および理論的方法を用いて、標的を絞
った、コンピューターによる活性物質の構造設計へと発展した。 疾病の様々な原因（例えば、タンパク質の欠損または遺伝的に起きる変性）に
関する知識の増加により、薬理学的研究および医薬による治療は著しく複雑化し
た。こうして、過去１０年以上、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチン
トン病、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病および様々な運動失調症候群などのい
くつかの原発性神経変性疾病の遺伝的原因が、分子生物学的方法（ヒトゲノム計
画）により明らかにできた。疾病の根底にある生物学的変化のこのような認識は
、対症療法や姑息的療法から、原因療法への移行の基礎を形成している。
【０００２】 医学上記述のある約３０，０００種の疾病のうち１００〜１５０種が、製薬業
の研究計画として十分適しているとされる。現在使用可能な医薬は、治療に影響
する約４００種のレセプター、酵素およびその他の生体分子に向けられている。
しかし、最大約１０，０００種の遺伝子およびその産物が、活性剤研究の標的と
して適していると考えられている。これらの病理学的な関連性の証明には、中で
も、有益な情報を提供する分子系および細胞系が要求される。 経験的な値または既知の分子構造に基づく物質特性の最適化を含む合理的な設
計に加えて、最近コンビナトリアルケミストリーおよび開発段階にあるコンビナ
トリアル生合成が、薬剤研究において重要な役割を果たしている。
【０００３】 これらの方法の重大な弱点は、植物および微生物学的な二次代謝物の構造的複
雑さに比べ、合成物質の多様性が限定されていることである。 この天然の多様性を活用できるためには、古典的な天然物研究、分子医学およ
び有機化学の間に緊密なつながりを創出することが不可欠である。新しい先進的
な構造の探索においては、植物体および動物体だけでなく菌類や微生物の選択が
、生態学的観察および古来の民俗医学的知識に基づき、化学分類的視点から、無
作為原則（random principle）により行われている。 しかし、コンビナトリアルケミストリーにより創出した物質ライブラリーから
または天然物の抽出物からなど、物質混合物から、１つまたは２つ以上の活性成
分を決定することは、極めて労働集約的である。
【０００４】 例えば、一般的に天然物の抽出物は、基本構造および官能基が異なることによ
り、全極性域にわたるこの上なく異なった多数（最大２，０００）の物質からな
る。通例として、比較的少数の化合物だけで、すでに抽出物重量の約８０％を占
めるが、残りの化合物の殆どの部分が、ｐｐｍ領域より低い低濃度で、つまり、
等モルではなく存在している。しかし、少数の物質だけが、または、ただ１つの
単一物質だけが、特徴的な生物学的活性を示し、この活性は、抽出物中に痕跡程
度にしか存在しない物質に起因し得る。
【０００５】 現在まで、天然抽出物またはコンビナトリアルケミストリーにより生成した膨
大な物質ライブラリーの、主としてクロマトグラフィーにより分離した成分の処
理や分析は、一般的に超高速大量処理の自動試験システム（高速大量処理スクリ
ーニング；ＨＴＳ）を使用して行っていた。しかし、この方法は極めて労働およ
び費用集約的である。これには、例えば、最初に天然物源（例えば植物、動物、
菌類、微生物など）から、極性の増大する溶媒により選択的な抽出物を調整し、
それらを生物学的試験に供する必要がある。それぞれの有効な選択的抽出物から
サブフラクションを形成した後、さらなる試験が行われる。
【０００６】 最後に、有効な分画から単離した後、どの純物質（単数または複数）が生物学
的活性を発揮し、従って、「ヒット」したかを示すために最終試験が行われる。
クロマトグラフィーによるサブライブラリーへの分離およびその試験には、それ
ぞれ数週間を要する。純物質（単数または複数）を十分な量回収できるためには
、従って、大量の抽出物から出発する必要がある。これもまた、予備ＨＰＬＣカ
ラムに高い費用と、多量の溶媒の要求（入手および処理の両方）を伴う。 サブフラクションの分離によりすでに、そして、天然純物質の単離によりなお
さら、抽出物の個別成分の可能な相乗作用または拮抗作用が、高速大量処理スク
リーニングの中で失われてしまう。こうして、最初の試験で有効だった抽出物が
、個別の物質に分離されたために、様々な成分の相互作用によってのみ可能だっ
た標的への結合が阻止され、生物学的作用を失ってしまうのである。
【０００７】 コンビナトリアルケミストリーにより創出された合成ペプチドライブラリーか
らの、アミノ酸の置換だけで生成し、等モル量存在する最大１９種類の化学的に
極めて類似のペプチドからなる有効成分の決定方法が、Zuckermann et al., Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4505-4509(1992)に記載されている。この目的の
ために、このようなペプチド物質ライブラリーに不十分量の抗体を加え、標的（
＝抗体）−ペプチド複合体を高速ゲル濾過により分離した。このペプチドを１％
トリフルオロ酢酸で複合体から遊離し、構造を質量分析およびアミノ酸分析で明
らかにした。しかし、この方法は、ゲル濾過が、技術的に分子量の大きな差で作
用するため、より小さな分子（分子量１５００以下）の標的−分子複合体には適
していない。また、筆者によれば、この方法には、等モル混合物が必要である。
さらに、リガンドの相乗活性のある組み合わせの決定が不可能か、または、不確
実である。
【０００８】 Wieboldt et al.によるAnal. Chem., 69, 1683-1691 (1997)に記載の実験は、
同様に、２０〜３０の近縁分子（一般的な１，４−ベンゾジアゼピン構造を有す
る合成により生成された誘導体）の等モル混合物に対するものである。合成物質
の限定された多様性によって、実験処理を簡単にすることは事実だが、同時に、
その使用に対する限定因子となる。 同様に、R. B. van Breemen et alによるAnal. Chem., 69, 2159-2164 (1997)
に記載のパルス限外濾過質量分析は、２０種類の物質の等モル物質ライブラリー
を必要とする。遊離は有機溶媒でしかできないので、共有結合物質は検出するこ
とができない。
【０００９】 従って、本発明の目的は、特に天然物抽出物などの等モルでない混合物から（
例えば植物、動物、菌類、微生物から）、生物学的な、例えば、薬理学的な活性
を持つ化学物質および物質の組み合わせを検出および単離するための、短時間で
行うことがでる、効率的な方法を開発することにある。 この目的は、以下の： ａ）化学物質の混合物、例えば、天然物の抽出物に標的を加える工程、 ｂ）標的と少なくとも１種類の活性化学物質とによる少なくとも１種類の複合
体で、この化学物質が標的に結合しているものを形成する工程、 ｃ）混合物中の非結合化学物質を少なくとも１種類の複合体から分離し、可能
であればこの複合体を分析（例えばクロマトグラフィー）により検出する（＝主
実験）工程、 を特徴とする方法で達成される。
【００１０】 標的を含まない別の実験（ブラインド試験）で決定され、追加的に、または、
より高い濃度で存在する物質は、標的に結合したすべての物質の合計である。こ
れらを、単離し、その構造を明らかにする。 しかし、複合体を処理するさらなる工程としては、以下の： ｄ）複合体中の活性化学物質と標的との間の結合を壊すことで、複合体中の標
的に結合した少なくとも１種類の活性化学物質を遊離する工程、 ｅ）遊離した少なくとも１種類の活性化学物質を分離する工程、および ｆ）分離した少なくとも１種類の活性化学物質を同定し、可能であれば工程ｃ
で同定した物質と比較する工程 が好適と思われる。
【００１１】 「生物学的な標的」なる語は、タンパク質（例えば、レセプター、酵素、抗体
）、生体膜または（正常または癌）細胞全体を意味する。接触により、特にこの
標的に適合する活性化学物質が結合すると、その標的に特徴的で、主に生化学的
な過程に関連した反応が惹起されることがある。換言すれば：活性化学物質は、
特異的標的に対し強い親和性を有する。このような標的の例としては、タンパク
質のトロンビン、トリプシン、および、β２−アドレナリンレセプターがある。 「化学物質」としては、事実上、有機および天然物化学で知られているすべて
のものが好適である。中でも低分子および高分子化学物質であるが、未知数のモ
ノマー単位を有するポリマーではない。このような、化学的に均一な有機化学物
質は、当業者に知られている。中でも、脂肪族、芳香族および環式の炭化水素、
およびカルボン酸、アルコール、エステル、アルデヒド、ラクトン、アミド、ヘ
テロ環、イソプレノイド、テルペン、炭化水素、ステロイドなどの官能基を有す
る化合物である。また、グリコシド、ペプチド、タンパク質および酵素も好適な
物質として考慮することができる。
【００１２】 化学的に均一で好適な物質の分子量は、一般的にＭｒ＝１５０より大きい。し
たがって、既知の神経伝達物質であるアセチルコリン［Ｈ３ＣＣＯ−Ｏ−ＣＨ２ −ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）３］ＯＨおよびニコチンは、分子量がそれぞれＭｒ＝１
６３およびＭｒ＝１６２であり、実質的に好適な化学物質の分子量の下限となっ
ている。分子量の上限は主に限定されていない。したがって、高分子タンパク質
（Ｍｒが約３００,０００以下）は、確かに、本発明の方法によって様々な化学
物質の混合物から分離され得る、化学的に均一な所定の活性物質である。 グリコーゲン、セルロースなどの不均一なバイオポリマーは、モノマー単位数
が確定できないため、本発明における化学的に均一な物質とはならず、本発明の
目的には不適である。
【００１３】 さらに、化学物質について、活性化学物質と不活性化学物質を区別しなければ
ならない。活性化学物質とは、特異的な標的に結合することで、それに特徴的な
反応を惹起することができる物質であると理解されている。活性化学物質は、標
的に対し親和性を有することを特徴とする。不活性化学物質は、標的に対し全く
親和性を有する必要がない。 したがって、適した化学物質の相対分子量の真の上限を示すことはできない。
むしろ、それは単に、標的の相対分子量に対する活性化学物質の相対分子量の比
によって実質的に決まる処理の単純さである。この標的の相対分子量は一般に非
常に大きく、例えば、１００万以上であることができる。言及したように、標的
は細胞全体であってもよい。相対分子量が小さい（約１５０〜約３０,０００）
化学物質は、質量差が大きいため、このような標的から、超遠心分離法などの従
来の方法で簡単に分離することができる。しかし、活性化学物質の相対分子量と
標的の相対分子量が同レベルの大きさの場合、超遠心分離法でも満足できる分離
結果が得られず、さらに高度な、あるいは、追加的な分離方法を用いなければな
らない。
【００１４】 「化学物質混合物」なる語は、上述の基準を満たす、すなわち、接触により特
異的標的での反応を惹起することができる活性化学物質を少なくとも１種類含む
、異なる化学物質の混合物を意味する。混合物は、このような活性化学物質を２
種類以上含んでもよい。さらに、この混合物は、生物学的標的に反応を惹起する
ことができない化学物質を含んでもよい。一般的に、不活性化学物質は、異なる
化学物質の混合物中で主要な部分を占めている。特に、化学物質混合物中に含ま
れる不活性化学物質は、選択した特定の標的に対してのみ不活性なだけで、別の
標的にこのような反応を惹起することは全く可能である。
【００１５】 実際には、化学物質の混合物は、合成的に生成した、またはコンビナトリアル
ケミストリーを用いる物質ライブラリー、または天然物の抽出物であることが好
ましい。「天然物の抽出物」なる語は、この意味では、したがって、生物源から
生成した、および好ましくは、植物、葉、花、木部、根、樹皮などの植物の一部
、菌類、動物、動物の腺、卵および排泄物、微生物などから回収した化学的に均
一な物質の複合混合物を意味すると理解される。これは、蒸気蒸留、乾式蒸留、
水、有機、無機または超臨界溶剤による抽出などの既知の方法；また、しばしば
、エステル化、サポニン化、塩形成、水素化、脱水、異性化、アルキル化、発酵
、酵素分解などのさらなる化学処理を同時または遂時的に行うことで得られる。
これらの成分の構成に関して、こうして得られた天然物の抽出物は、もはや天然
源に存在する化合物と一致しないこともある。しかし、一般的に、非常に異なっ
た化学物質が多数、すなわち、少なくとも５０種類存在し、なかでも、すでに述
べたように、多数の物質が、痕跡程度、つまり、数ｐｐｍの濃度でだけ存在して
いる。しかし、しばしば、このような抽出物中で、少数種の、または、たった１
種類の物質が、特徴的な生物学的活性を示し、この活性が抽出物中に痕跡程度に
しか存在しない物質によるものである可能性がある。化学物質の混合物は、異な
る天然物の抽出物の混合物であることもできる。特別な例として、タンポポ（ta
raxacum officinale）の抽出物を選んだ。特別に重要な生物源は、もちろん薬草
であり、その抽出物は生理学的および／または薬理学的効果があり、その一部は
ドイツ薬局方およびホメオパシー薬局方に特定されている。
【００１６】 化学物質混合物への標的の「添加」は、溶液、懸濁液または分散液中で行うこ
とが好ましい。多くの場合、添加は、水溶液、特に、好適なバッファーによりｐ
Ｈが安定している溶液中で行う。ここに記載した方法の特に有利な点は、標的を
添加する前に、事前に化学物質混合物を、純粋な化学物質に至る複数の異なる分
画に分離しないことである。 「複合体」なる語は、単離できる粒子で、少なくとも１つの活性化学物質が結
合している標的からなるものを意味する。標的には、２つまたは３つ以上の活性
化学物質が結合していてもよい。このような複合体において、標的に結合した２
つまたは３つ以上の活性化学物質は、互いにある特徴的な比率で存在し、その比
率は、特定の標的の特異的反応に関する相乗効果に一致する。当業者はまた、標
的としてタンパク質集団を選択することが多いことから、タンパク質−リガンド
複合体にも言及している。
【００１７】 複合体中では、少なくとも１つの活性化学物質が標的に「結合」している。こ
こで、標的と活性化学物質（単数または複数）の結合の種類は、本質的に重要で
はない。共有または非共有結合が最も頻繁に生じる。後者は、例えば、水素結合
、例えば逆に荷電した基の間などの静電相互作用、金属錯化、活性化学物質の脂
肪親和基と標的の疎水領域（いわゆるポケット）間の相互作用、双極子間相互作
用、および、カチオン−π相互作用を含む。また、様々な相互作用が組み合わさ
って活性化学物質と標的の親和性の原因になっていることが多い。
【００１８】 少なくとも１種類の複合体を、混合物の非結合、つまり「遊離」不活性化学物
質から「分離」する場合は、基本的に公知の方法を利用して行い、特に複合体に
熱負荷を与えない方法を選択することが有益である。これは、例えば、複合体の
濾過、限外濾過、遠心分離、超遠心分離、平衡分析、ゲル濾過または沈殿である
。標的に結合した少なくとも１種類の「活性」化学物質の同定は、この化学物質
を複合体から遊離する前に、例えば飛行時間質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）
で行うことができることもある。
【００１９】 濾過は、特に、早く、簡単で、効率的な分離方法である。これを、限外濾過（
例えばアミコン社製のＭｉｃｒｏｃｏｎフィルターユニットを使用して）、また
は、特殊な濾過装置（例えばＢｒａｎｄｅｌ 細胞収集器）で行ってもよい。 しかし、複合体から少なくとも１種類の活性化学物質を「遊離」することで、
その検出、単離および特にその化学的特性化が容易になる。これは、分離工程に
引続き、非特異吸着物質を除くため、２回または３回以上の洗浄処理後に行う。
これにより、結合した活性化学物質の複合体からの遊離が達成される。この過程
で、複合体に存在する標的と、少なくとも１つの活性化学物質との間の結合は再
び絶たれる。このために、結合の種類によって、物理的または化学的方法を使用
する。これは例えば、酸、低アルカノリック（alkanolic）水溶液、好ましくは
、トリフルオロ酢酸／メタノール／水の混合物、例えば１／４９．５／４９．５
（容量％）の組成のものを用いることによって行うことができる。
【００２０】 活性化学物質の同定が要求されない場合、複合体自体を同定できるのであれば
、遊離工程を省略することができる。遊離は、活性化学物質が遊離条件で変性し
てしまう場合、または、遊離液で分離できない場合に省略できる。これは、主に
いくつかの共益結合に当てはまる。これらのケースでは、活性化学物質の同定は
、標的を使用した場合の濾液（主実験）と標的を使用しない濾液（ブランクサン
プル）との差により行う。この処理により、標的に結合したすべての化学物質を
同時に検出することができるが、遊離では、習慣的に、少数（例えば１〜３種類
）の活性化学物質が得られるだけである；さらに、遊離を行った場合、物質が変
性していないかどうかは不確実である。
【００２１】 ブラインドサンプル中に追加的またはより高濃度で出現した物質は、潜在的な
活性化学物質である。これらは、化学物質混合物（例えば天然物抽出物）から、
何らかの分離法で（例えばクロマトグラフィー法により）、大量に単離すること
ができる。 複合体中の結合を破壊した後に、標的から遊離活性化学物質を「分離」する場
合は、基本的にすでに述べた既知の方法で行うことができる。ここでも、最も簡
単で、最も有用な方法、つまり、濾過と遠心分離が好みにより使用される。活性
化学物質（単数または複数）の分離は、また、予備ＨＰＬＣでも行うことができ
る。
【００２２】 ブランクサンプル中に追加的またはより高濃度で出現した物質、および、少な
くとも１種類の分離活性化学物質の「同定」は、ＨＰＬＣ、例えば通常の分析Ｈ
ＰＬＣ、マイクロＨＰＬＣ、キャピラリ−ＨＰＬＣまたはナノＨＰＬＣ、または
、電気クロマトグラフィー、電気泳動法、または、ＬＣ−ＭＳまたはＭＳ−ＭＳ
の複合技術などの公知の方法で行う。しかし、前記の方法による活性化学物質（
単数または複数）の同定は、複合体からの遊離以前にすでに行っていてもよい。 本発明の方法は、主として、標的と少なくとも１種類の活性化学物質との狙っ
た複合体の形成と、それに引続く非結合不活性化学物質の分離（主試験）、およ
び、ブランクトライアルとの違いにより、対応するタンパク質（いわゆる「リガ
ンド」）に結合した１種類または少数の活性化学物質を、物質ライブラリーまた
は複合天然物混合物から単離、同定することが可能であることにより、既知の高
速大量処理スクリーニングとは根本的に異なっている。
【００２３】 潜在的に重要な各化学物質を個別に単離し、標的に供するのではなく、後者を
物質混合物に提示するのである。Emil-fischerの「鍵と鍵穴の法則」による認識
で形成された複合体は、例えば限外濾過により、非結合低分子化学物質から分離
され、比較クロマトグラフィー（comparative chromatography）（標的非含有［
＝ブラインドサンプル］対標的含有［＝主試験］サンプル）により同定する。結
果を確認するため、次にリガンド（活性化学物質）を−これらが安定して、遊離
可能な限り−複合体から追加的に遊離し、公知の方法により同定、単離し、公知
の方法で構造を明らかにする。
【００２４】 本発明による方法は、大量のタンパク質も抽出物も要求せず、マイクロメソッ
ド分析への小型化により少量の溶剤しか要求せず、時間を要するサブフラクショ
ン化も要求せず、相乗的な活性物質の組み合わせが発見できる。放射性標識およ
び蛍光標識も省略できる。本発明の方法は、その性質上、より大量の抽出物の処
理をも可能にし、その特性上さらなる抽出物の使用を所望しない活性化学物質を
「取り尽す」ことが可能である。
【００２５】 この方法は、大量のこのような抽出物から、対象とする標的と相互作用を示す
これらの活性化学物質のみを「取り尽く」そうとする場合は、特に有効に使うこ
とができる。この少なくとも１つの分離活性化学物質は、天然物混合物の代わり
に医薬の有効成分としてさらに使用してもよい。また、天然物抽出物の２つ以上
の活性化学物質が標的と複合体を形成し、この２つ以上の活性化学物質の互いの
相対比が、天然物抽出物の生物学的効力に関して支配的な役割を果たしている場
合（相乗効果）、これは重要である。
【００２６】 また、したがって、この方法の利点は、個別の物質の高速大量処理スクリーニ
ングでは検出されない、（相乗的）活性物質の組み合わせを同定することができ
るところにある。 最後に、この方法を用いることにより、予想に反して、活性化学物質の認識限
界（検出限界）を、Ｋｉ値がマイクロモルのレベルに移行することも可能であり
、つまり、Ｋｉ値が１．７μＭの標的と活性化学物質の複合体が検出できる。 以下の例により、本発明の方法を説明する。
【００２７】 例１：ランダムに選択した物質ライブラリーからの４−アミジノフェニルアラニ
ン型のトロンビン阻害物質の単離 標的として、セリンプロテアーゼであるトロンビンを選んだ。物質ライブラリ
ー（上記の「不活性」化学物質の混合物）の物質として、水への溶解性、吸収極
大およびクロマトグラフィーによる分離性を考慮して、以下の５種の薬剤： 1.中央攻撃型（centrally attacking）α２-アドレナリンレセプターアゴニスト
である塩酸クロニジン 2.粘液溶解剤である塩酸ブロムヘキシン 3.三環系抗うつ薬である塩酸アミトリプチリン 4.フェノチアジン系神経弛緩薬である塩酸クロルプロマジン 5.フェノチアジン系神経弛緩薬である塩酸クロルプロチキセン を選んだ。
【００２８】 トロンビン阻害剤（活性化学物質）として、以下の構造式を有するＢｅｈｒｉ
ｎｇｗｅｒｋｅ製の化合物ＣＲＣ２２０（Marburg；Ｋｉ＝２．５ｎＭ）を用い
た：
【化１】
【００２９】 試験したアッセイは以下の内容だった：
【表１】
【００３０】 物質ライブラリーおよび阻害剤とトロンビンのインキュベーションは、室温で
１時間以内で行った；溶媒：０．９％ＮａＣｌ水。形成されたタンパク質−リガ
ンド複合体の分離は、限外濾過（遠心分離式）で行った。すべての濾過処理およ
び洗浄は、フィルターが乾燥するまで実行した。 フィルター：Ｍｉｃｒｏｃｏｎ１０（アミコン社製） 遠心分離条件：９９８１×ｇ、室温 洗浄工程：２回、それぞれ０．９％ＮａＣｌ水１５０μｌで、４℃で行う。
【００３１】 限外濾過および濾液の分析の次に、洗浄工程を行い、室温で、水／メタノール
／ＴＦＡ（４９．５／４９．５／１）２００μｌで処理することにより、フィル
ターに残ったタンパク質−リガンド複合体からリガンド（活性化学物質）を遊離
した。 濾液の比較が可能なように、ブラインドサンプル（トロンビン非含有）は、す
べての工程に関して同様の処理を行った。すべての工程で得られた濾液は、高速
真空濃縮機（speed-VAC concentrator）で乾燥した後、対応する定量のＨＰＬＣ
フロー剤（flow agent）に、超音波および振とうにより溶解した。
【００３２】 リガンドの同定は、分析ＨＰＬＣ：固定相は、Hypersil C 18BDS、３μｍ、１
５０＊０．３ｍｍ、Fusica（LC Pakings）−移動相は：アセトニトリル／水／Ｔ
ＦＡ（３５／６５／．０１）、アイソクラティック、５μｌ／分、λ＝２３０ｍ
ｍ、で行った。結果を図２に示す。 主実験とブラインドサンプルとの差は、活性化学物質であるＣＲＣ２２０であ
る。塩酸クロニジン（４．６分）は主試験にもブラインドサンプルにも出現して
いないので、ターゲットではなく、フィルターに捕捉されていた。これは阻害剤
ではない。
【００３３】 例２：異なる結合力のアミジノフェニルアラニンの非等モル混合物のトリプシン
への結合。 化学物質として、以下に構造式を示すトリプシン阻害剤である３−アミジノフ
ェニルアラニンを、そして、標的としてセリンプロテアーゼであるトリプシンを
用いた：
【表２】
【００３４】
【表３】 実験は例１に記載したとおりに行った。
【００３５】
【表４】
【００３６】 例３：タンポポ属の抽出物による天然物の単離と同定。 アッセイに使用した物質： ａ）ｅｘｔｒ．ｔａｒａｘａｃｉ ｓｐｉｒ．ｓｉｃｃ．（Ｃａｅｌｏ社の乾
燥天然物抽出物） 水溶液の調整： −乾燥抽出物を水に懸濁する（２０ｍｌに０．２ｇ） −超音波槽で５分間処理し、随時振とうしながら３０分間静置する −薄膜フィルター（０．７μｍ）で濾過し、ついで、Ａｎｏｔｏｐ２５フィルタ
ー（０．０２μｍ）で濾過する −ＦｅＣｌ３、Ｐｂ（ＣＨ３ＣＯＯ）４およびゼラチンでタンニン試験を行い、
結果は陰性。 ｂ）β２−アドレナリンレセプター（＝標的） −リコンビナントβ２-アドレナリンレセプターバキュロウイルスを３日間感染
させたＳｆ９昆虫細胞からの膜標本（細胞およびウイルス、プラスミドの作成、
リコンビナントバキュロウイルスの単離および膜の調整： MPI fur Biophysik,
Molecular Membrane Biology Department, Frankfurt/Main, Dr. Helmut Reila
nder) [H. Reilander, Febs letters, 282, 441-444 (1991)]
【００３７】 アッセイでは、タンポポ属抽出物と膜標本は、異なった化学量論的比率で混合
し、２００μｌの結合バッファー（ＮａＣｌ１５０ｍＭ、トリス５０ｍＭ、ｐＨ
８．２水溶液）に溶解した。 レセプターとリガンドの結合は、混合物を３０〜３４℃で３０分間インキュベ
ートして行った。次に溶液を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ１０遠心分離フィルターに設置
し、９９８１×ｇで１５分間、または、フィルターが乾燥するまで遠心分離した
。レセプター含有サンプル（＝主実験）とレセプター非含有サンプル（＝ブライ
ンドサンプル）のクロマトグラムを比較することで、結合した化学物質を同定し
た。結合バッファーで洗浄処理を２回行った後、フィルター上に存在する複合体
は、ＴＦＡ（１／４９．５／４９．５）２００μｌの処理により分離した。
【００３８】
【表５】
【００３９】 濾過工程を４回行った後の溶出液は、乾燥するまで真空下で遠心分離し、得ら
れた物質を超音波でＨＰＬＣ移動相（例１参照）１０μｌに、ＬＣ分析の直前に
溶解した。
【表６】
【００４０】
【表７】
【００４１】 ３種類の「取り尽された」、すなわち、複合体化とその後の複合体からの遊離
により得られた、リガンド（Ｌ３＝トランス−カフタリン酸（trans-caftarinic
acid）、Ｌ６＝トランス−チコリン酸（trans-chicorinic acid）およびＬ７＝
トランス−ジフェロイル−酒石酸エステル）をＵＶ、１Ｈ−ＮＭＲおよびＭＳに
より同定できた。
【化２】
【図面の簡単な説明】
【図１】 少なくとも１種類の複合体の形成を模式的に示した図である。異なる１０００
種類の化学的に均一な物質（そのうち４種が活性を持っている）の非等モル混合
物に標的を加えた。複合体に結合したいずれかの活性化学物質をそれぞれ含む、
４種類の異なる複合体が形成される。９９６種類の不活性物質は、次に、限外濾
過により複合体から分離できる。番号は： １＝標的 ２＝様々な活性化学物質 ３＝様々な不活性化学物質（点） ４＝活性化学物質を少なくとも１つ含む様々な複合体 を意味する。
【図２】 Ａ）阻害剤ＣＲＣ２２０と化学物質の混合物 塩酸クロニジン（４．６分）、ＣＲＣ２２０（６．９分）、ブロムヘキシン（１
２．３分）、アミトリプチリン（１７．６分）、塩酸クロルプロマジン（２３．
９分）、塩酸クロルプロチキセン（２６．９分） Ｂ）標的を含まない濾液［ブラインドサンプル］ Ｃ）標的のトロビンを含む濾液［主実験］ を示した図である。
【図３】 Ａ）タンポポ属（ブラインドサンプル） Ｂ）タンポポ属（主実験） Ｃ）タンポポ属遊離物 を示したクロマトグラムである。 ブラインドサンプルと主実験との違いにより、約１２種類の物質が結合している
が、遊離法によって検出できたのは３種類だけであったことが示された。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年１０月４日（２００１．１０．４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｂ０１Ｄ 57/02 Ｂ０１Ｄ 57/02 ４Ｇ０７５ 61/14 ５００ 61/14 ５００ ４Ｈ００６ Ｂ０１Ｊ 19/00 ＺＣＣ Ｂ０１Ｊ 19/00 ＺＣＣＺ ４Ｈ０４５ Ｂ０３Ｃ 5/00 Ｂ０３Ｃ 5/00 Ｚ Ｂ０４Ｂ 3/00 Ｂ０４Ｂ 3/00 Ｚ Ｃ０７Ｃ 69/732 Ｃ０７Ｃ 69/732 Ｃ０７Ｋ 1/22 Ｃ０７Ｋ 1/22 Ｇ０１Ｎ 30/72 Ｇ０１Ｎ 30/72 Ｃ 30/88 30/88 Ｚ // Ｃ０７Ｄ 211/62 Ｃ０７Ｄ 211/62 295/18 295/18 Ａ Ｚ (72)発明者 マトゥッシュ，ルドルフ ドイツ連邦共和国 35032 マールブルク、 マールバッヒャー ヴェーク ６、インス ティテュート フュア ファーマツォイテ ィッシェ ヒェミー (72)発明者 ホフマン，ハンス ライナー ドイツ連邦共和国 56566 ノイヴィート、 ブルクホフシュトラーセ 123 Ｆターム(参考） 4C054 AA02 CC09 DD01 EE01 FF33 4C086 AA02 BC21 BC50 ZC02 ZC20 4D006 GA06 HA85 PA04 PB52 PB53 PC38 PC41 4D054 FA06 4D057 AA03 AB01 AB03 AC02 4G075 AA39 BB05 BB07 DA02 4H006 AB20 AB21 AB24 BJ50 BN30 BP10 4H045 AA20 BA42 CA30 GA01 GA05 GA10 GA26

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 活性および不活性化学物質の混合物から少なくとも１種類の
    活性化学物質を単離および／または同定する方法であって： ａ）混合物に標的を添加し、標的と、混合物の少なくとも１種類の活性化学物質
    との複合体を形成する工程、 ｂ）混合物の不活性化学物質から複合体を分離する工程、および ｃ）分離した複合体から少なくとも１種類の活性化学物質を遊離および単離およ
    び／または同定する工程か、 または ｄ）混合物の少なくとも１種類の活性化学物質を、活性および不活性化学物質の
    混合物のクロマトグラムから、複合体の分離後に得た不活性化学物質の混合物の
    クロマトグラムを差し引くことにより同定し、可能ならば、分離した複合体から
    少なくとも１種類の活性物質を遊離および単離する工程の一方、 を特徴とする、前記方法。
  2. 【請求項２】 化学物質の混合物への標的の添加を、溶液、懸濁液または分
    散液中で行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 添加を水溶液中で行うことを特徴とする、請求項１または２
    に記載の方法。
  4. 【請求項４】 水溶液のｐＨ値が、適当なバッファーにより安定化している
    ことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. 【請求項５】 複合体が、少なくとも１つの活性化学物質と標的との結合に
    より形成されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
  6. 【請求項６】 結合が、共有結合または非共有結合であることを特徴とする
    、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 【請求項７】 非共有結合が、水素結合、静電的相互作用、金属錯化、活性
    化学物質の脂肪親和基と標的との相互作用、双極子間相互作用、または、カチオ
    ン−π相互作用により形成されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに
    記載の方法。
  8. 【請求項８】 複合体の不活性化学物質からの分離が、限外濾過、超遠心分
    離またはその他の好適な方法によって行われることを特徴とする、請求項１〜７
    のいずれかに記載の方法。
  9. 【請求項９】 分離した複合体の少なくとも１種類の活性化学物質の単離お
    よび／または同定を、ＨＰＬＣ、電気クロマトグラフィー、電気泳動、ＬＣ−Ｍ
    ＳまたはＭＳ−ＭＳなどの複合技術などの方法で、好ましくはマイクロキャピラ
    リーまたはナノＨＰＬＣにより行うことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか
    に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 混合物の少なくとも１種類の活性化学物質の同定を、ＨＰ
    ＬＣ、電気クロマトグラフィー、電気泳動、ＬＣ−ＭＳまたはＭＳ−ＭＳなどの
    複合技術などの方法で、好ましくはマイクロキャピラリーまたはナノＨＰＬＣに
    より行うことを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
  11. 【請求項１１】 少なくとも１種類の活性化学物質の混合物からの分離を、
    予備ＨＰＬＣ、電気クロマトグラフィーまたは電気泳動により行うことを特徴と
    する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
  12. 【請求項１２】 活性および不活性化学物質の混合物が、合成化学またはコ
    ンビナトリアルケミストリーにより得られた物質ライブラリー、または、天然物
    の抽出物であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
  13. 【請求項１３】 化学物質の混合物が、天然物の抽出物を化学的に変化させ
    たものであることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
  14. 【請求項１４】 化学物質の混合物が、様々な天然物抽出物の混合物である
    ことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
  15. 【請求項１５】 活性および不活性化学物質の混合物が少なくとも５０種類
    の異なる化学物質を含むことを特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載の
    方法。
  16. 【請求項１６】 標的がタンパク質であることを特徴とする、請求項１〜１
    ５のいずれかに記載の方法。
  17. 【請求項１７】 標的が酵素、レセプター、抗体、生体膜または細胞である
    ことを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
  18. 【請求項１８】 標的が酵素のトロンビンであることを特徴とする、請求項
    １〜１７のいずれかに記載の方法。
  19. 【請求項１９】 標的がトリプシンであることを特徴とする、請求項１〜１
    ８のいずれかに記載の方法。
  20. 【請求項２０】 標的がβ２−アドレナリンレセプターであることを特徴と
    する、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
  21. 【請求項２１】 請求項１に記載の方法を組み込んだ実行のための装置。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10125258A1 (de) * 2001-05-23 2003-01-09 November Ag Molekulare Medizin Verfahren zur Bestimmung des Bindeverhaltens von an Ziel-Molekülen spezifisch bindenden Liganden
WO2006015797A2 (en) * 2004-08-09 2006-02-16 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Method for high-throughput screening of test molecules binding to target molecules
KR20090115930A (ko) 2006-12-26 2009-11-10 브라이엄 영 유니버시티 혈청 단백질체학 시스템 및 관련 방법
KR102589887B1 (ko) 2022-08-11 2023-10-17 인포보스 주식회사 미지 물질 내 함유물질의 예측방법, 장치 및 프로그램

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997027327A2 (en) * 1996-01-23 1997-07-31 Rapigene, Inc. Methods and compositions for detecting binding of ligand pair using non-fluorescent label
JPH1150724A (ja) * 1997-08-05 1999-02-23 Shinkansai Bearing Co Ltd 窓用ヒンジ
WO1999033862A1 (en) * 1997-12-24 1999-07-08 Genentech, Inc. Free solution ligand interaction molecular separation method

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4948726A (en) * 1986-06-02 1990-08-14 Longoria Claude C Enzyme immunoassay based on membrane separation of antigen-antibody complexes
US5202421A (en) * 1988-12-27 1993-04-13 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Anticoagulant substance obtained from urine and process for the preparation thereof
EP0515554B1 (en) * 1990-02-14 1997-05-07 Receptor Laboratories, Inc. Method for generating and screening useful peptides
CA2088360A1 (en) * 1990-08-10 1992-02-11 Noubar B. Afeyan Quantitative analysis and monitoring of protein structure by substractive chromatography
AU8654891A (en) * 1990-08-10 1992-03-02 Purdue Research Foundation Matrix sequential addition immunoassay
ATE147281T1 (de) * 1991-03-28 1997-01-15 Perseptive Biosystems Inc Produktinformation in chromatographischem effluenten durch differenzbildung
DE69319593T2 (de) * 1992-03-27 1998-12-17 Perseptive Biosystems Inc Schnelles hochempfindliches immunanalytisches durchfluss-nachweissystem
JPH08510325A (ja) * 1993-05-28 1996-10-29 カイロン コーポレイション 生物学的に活性なペプチド配列の選択方法
US5491096A (en) * 1993-12-27 1996-02-13 Eli Lilly And Company Antigen detection with affinity chromatography and parallel processing a control
US6030804A (en) * 1995-06-06 2000-02-29 Human Genome Sciences, Inc. Polynucleotides encoding G-protein parathyroid hormone receptor HLTDG74 polypeptides
JP3737516B2 (ja) 1995-06-26 2006-01-18 パーセプティブ バイオシステムズ，インコーポレーテッド 高速自動化連続流、多次元分子選別および分析
DE69636649T2 (de) * 1995-06-29 2007-10-04 Takara Bio Inc., Otsu Für einen Endoglycoceramidase-Aktivator kodierendes Gen
DE19629141A1 (de) * 1996-07-19 1998-04-16 Bayer Ag Verfahren und Vorrichtung zum Screening von Molekülen bezüglich ihres individuellen Bindungsverhaltens zu mindestens einem vorgegebenen Ligand
DE19757574A1 (de) * 1997-12-23 1999-06-24 Bayer Ag Verbesserte Doppelmetallcyanid-Katalysatoren für die Herstellung von Polyetherpolyolen
AUPP103497A0 (en) * 1997-12-19 1998-01-15 Panbio Pty Ltd Assay apparatus

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997027327A2 (en) * 1996-01-23 1997-07-31 Rapigene, Inc. Methods and compositions for detecting binding of ligand pair using non-fluorescent label
JPH1150724A (ja) * 1997-08-05 1999-02-23 Shinkansai Bearing Co Ltd 窓用ヒンジ
WO1999033862A1 (en) * 1997-12-24 1999-07-08 Genentech, Inc. Free solution ligand interaction molecular separation method

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Publication number Publication date
DE19945351A1 (de) 2001-07-12
DK1214589T3 (da) 2004-10-11
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IL148823A0 (en) 2002-09-12
PL202679B1 (pl) 2009-07-31
CN100420945C (zh) 2008-09-24
ATE268474T1 (de) 2004-06-15
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