MXPA02002992A - Procedimiento para el descubrimiento y aislamiento de compuestos farmacologicos activos a partir de mezclas de sustancias, asi como dispositivo para la realizacion del procedimiento. - Google Patents

Abstract

1. Un procedimiento para el aislamiento y/o identificacion de al menos una sustancia quimica activa a partir de una mezcla de sustancias activas e inactivas, caracterizado por los pasos siguientes: a) Adicion de una diana a dicha mezcla y formacion de un complejo de la diana y al menos una sustancia quimica activa de la mezcla. b) Separacion del complejo de las sustancias quimicas inactivas de la mezcla y, o bien c) Liberacion y aislamiento y/o identificacion de al menos una sustancia quimica activa del complejo separado o d) identificacion de al menos una sustancia quimica activa de la mezcla por comparacion de un cromatograma de la mezcla de sustancias quimicas activas e inactivas y un cromatograma de la mezcla de sustancias quimicas inactivas obtenida despues de la separacion del complejo y, en su caso, liberacion y aislamiento de al menos una sustancia activa del complejo separado.

Description

PROCEDIMIENTO PARA EL DESCUBRIMIENTO Y AISLAMIENTO DE 0 Í OESTOS FARMACOLÓGICOS ACTIVOS A PARTIR DE MEZCLAS DE SUSTANCIAS, ASÍ COMO DISPOSITIVO PARA LA REALIZACIÓN DEL PROCEDIMIENTO.

Descripción La investigación farmacéutica ha evolucionado desde el aprovechamiento exclusivamente de fuentes naturales, pasando por la síntesis química de principios activos y su ensayo en animales, hasta el diseño estructural informatizado de principios activos con empleo de métodos teóricos y experimentales .

Al aumentar nuestro conocimiento de las diversas causas de las patologías (p. ej . , la falta de una proteína o su modificación genética) , la investigación farmacéutica y el tratamiento farmacológico han ido adquiriendo mayor complejidad. Así, en los últimos 10 años se han podido esclarecer mediante métodos de biología molecular (proyecto "genoma humano") las causas genéticas de algunas dolencias básicamente neurodegenerativas, como las enfermedades de Alzheimer, Parkinson o Huntington, la esclerosis lateral amiotrófica, las enfermedades causadas por priones y diversos síndromes atáxicos. Este reconocimiento de las modificaciones biológicas en las que se basan las enfermedades sienta las bases de un cambio del tratamiento sintomático y paliativo a un tratamiento causal .

De 100 a 150 de las casi 30.000 enfermedades descritas por la medicina son de tal importancia que se prestan como proyectos de investigación para la industria farmacéutica. Los medicamentos actualmente disponibles tienen por objeto influir de forma terapéutica sobre unos 400 receptores, enzimas y otras moléculas biológicas. No obstante, se parte de la base de que unos 10.000 genes y sus productos constituyen el objetivo de la investigación de principios activos. La comprobación de su importancia patológica exige, entre otras cosas, sistemas moleculares y celulares definitorios .

Además del diseño racional, que comprende la optimización de propiedades de sustancias sobre la base de valores empíricos o de estructuras moleculares conocidas, tanto la química combinatoria como la biosíntesis combinatoria, esta última en fase de desarrollo, desempeñan actualmente un importante papel en la investigación farmacéutica.

Un notable punto débil de estos métodos reside en la limitada diversidad de sustancias sintéticas, en comparación con la complejidad estructural de los metabolitos secundarios vegetales y microbianos .

Para poder abarcar semejante variedad natural es inevitable establecer una estrecha conexión entre la investigación clásica de sustancias naturales, la medicina molecular y la química orgánica. En la búsqueda de nuevas estructuras guía, la elección de organismos vegetales y animales, así como de hongos y microorganismos, se hace iguiendo el principio aleatorio, aplicando criterios y taxonómicos, sobre la base de observaciones ecológicas y de conocimientos etnomédicos.

Sin embargo, el descubrimiento de uno o más componentes activos a partir de mezclas de sustancias, por ejemplo a partir de bibliotecas de mezclas de sustancias creadas mediante química combinatoria o de extractos naturales, resulta muy costoso.

Los extractos de sustancias naturales están constituidos en general por una multiplicidad (hasta 2.000) de las más diversas sustancias, que abarcan todo el ámbito de polaridades, lo cual está condicionado por diferentes estructuras básica y grupos funcionales. Por lo general, los compuestos que comprenden aproximadamente el 80 % del peso del extracto son unos pocos, mientras que la mayoría del resto de compuestos están presentes en pequeñas concentraciones, que llegan a ser de ppm, es decir que no son equimolares. A menudo son pocas las sustancias, a veces sólo una, que muestran tener la característica actividad biológica en dichos extractos, pudiendo atribuirse dicha actividad, en ocasiones, a la presencia de vestigios de sustancia en el extracto.

Hasta ahora, la preparación- y el análisis de la mayoría de ingredientes, separados por cromatografía, de un extracto natural o de una extensa biblioteca de sustancias creada mediante química combinatoria suelen hacerse utilizando sistemas de ensayo automatizados de alto rendimiento (High-throughput Screening, HTS) . Sin embargo, este proceso resulta muy costoso y poco rentable. Por tanto, es preciso partir de las sustancias naturales (p. ej . , plantas, animales, hongos, microorganismos) y primero fabricar extractos selectivos con disolventes de polaridad cada vez más elevada y luego ensayarlos desde el punto de vista biológico. Tras la formación de subfracciones a partir del extracto activo selectivo correspondiente se realizan otros ensayos .

Un último ensayo deberá demostrar cuáles son las sustancias puras que tienen actividad biológica una vez aisladas de la fracción activa y que, por tanto, representan un "Hit" . La separación cromatográfica en subbibliotecas y su ensayo requiere siempre varias semanas. Para obtener cantidades suficientes de sustancias puras hay que partir de la extracción de grandes cantidades. También esto implica costes elevados en columnas preparatorias de HPLC y en disolventes (tanto para el suministro como para la eliminación del disolvente residual) .

La operación de separación para obtener fracciones secundarias y, más aún, la de aislamiento de las sustancias naturales puras produce la pérdida de los posibles efectos sinérgicos o antagónicos de los componentes individuales del extracto durante el proceso de HTS. Así, un extracto que es activo en el primer ensayo puede perder su actividad biológica, porque la separación en sustancias individuales impida la unión a una diana que sólo era posible en conjunción con diversos componentes.

Zuckermann y cois., Proc. Natl . Acad. Sci . USA, 89, 4505-4509 (1992) describen un procedimiento para el descubrimiento de componentes activos a partir de una biblioteca sintética de péptidos obtenida por química combinatoria, que consta como máximo de 19 péptidos químicamente muy similares, originados únicamente por intercambio de aminoácidos y presentes en cantidades equimolares. En este proceso se añadió un anticuerpo deficitario a una biblioteca de sustancia peptídica como la mencionada y el complejo péptido-diana (=anticuerpo) se separó por filtración rápida en estado de gel. El péptido se libera del complejo añadiendo un 1 % de ácido trifluoroacético, y la estructura se resuelve mediante espectroscopia de masas y análisis de aminoácidos. Sin embargo, este proceso no es adecuado para el aislamiento de complejos moléculas-diana constituidos 'por moléculas pequeñas (peso molecular inferior o igual a 1500) , ya que la filtración en estado de gel sólo funciona técnicamente con mayores diferencias de peso molecular. Según los autores, también se necesitan mezclas equimolares. Por otra parte, el cálculo de las combinaciones de .ligandos que actúan sinérgicamente es imposible de realizar y se deja en manos del azar.

En los experimentos de ieboldt y cois, descritos en Anal . Chem . , 69 , 1683-1691 (1997) también se trabaja con mezclas equimolares de 20 a 30 moléculas estrechamente emparentadas (derivados de producción sintética con una estructura genérica 1, 4-benzodiazepina) . Si bien la limitada diversidad de las sustancias sintéticas facilita el trabajo experimental, representa al mismo tiempo un factor limitador de su capacidad de aplicación.

La espectrometría de masa por ultrafiltración pulsada de R. B. van Breemen y cois, descrita en Anal . Chem. , 69, 2159-2164 (1997) también precisa una biblioteca de sustancias equimolar con 20 sustancias. Dado que sólo se realiza la liberación con disolventes orgánicos, las sustancias unidas mediante enlaces covalentes no pueden detectarse.

El objetivo de la presente invención consiste, por tanto, en el desarrollo de un método eficaz y de rápida realización para el descubrimiento y aislamiento, por ejemplo, de sustancias y combinaciones de sustancias biológicas fármaco-lógicamente activas-, sobre todo a partir de mezclas no equimolares como los extractos de sustancias naturales (p. ej . , de plantas, animales, hongos, microorganismos) .

El objetivo se consigue mediante un procedimiento que se caracteriza por: a) La adición de una diana a una mezcla de sustancias químicas, por ejemplo un extracto de sustancias naturales . b) La formación de al menos un complejo a partir de la diana y al menos una sustancia química activa, estando dicha sustancia química unida a la diana. c) La separación de al menos un complejo de las sustancias químicas no unidas de la mezcla y, en su caso, su registro analítico (= ensayo principal) (por ejemplo, por cromatografía) .

Las sustancias que aparecen adicionalmente o en concentraciones superiores, las cuales se calculan en un ensayo por separado sin diana (ensayo en blanco) , representan la suma de todas las sustancias unidas por la diana. Dichas sustancias se aislan y se determina su estructura.

Otros pasos que también pueden plantearse para la preparación del complejo son: d) La liberación de al menos una sustancia química activa unida a la diana, en el complejo por destrucción del enlace entre la sustancia química activa y la diana en el complejo, e) la separación de al menos una sustancia química activa liberada y f) la identificación de al menos una sustancia química activa separada y, en su caso, la comparación con las sustancias identificadas en el paso c) .

Se entiende por diana biológica una proteína (p. ej . , receptor, enzima, anticuerpo) , una membrana biológica o una célula completa (sana o cancerosa) . Por contacto, particular-mente en caso de unión entre una sustancia química activa adecuada con dicha diana, puede desencadenarse una reacción, que es característica de la diana y que está casi siempre en combinación con un proceso bioquímico. En otras palabras: la sustancia química activa posee una fuerte afinidad por la diana en particular. Son ejemplos de estas dianas las proteínas trombina, tripsina y el ß2- adrenorreceptor .

La "sustancia química" puede ser prácticamente cualquier sustancia homogénea procedente de la química orgánica y la química de las sustancias naturales. Entre ellas se cuentan las sustancias químicas de bajo y alto peso molecular, pero no los polímeros de número desconocido de unidades monoméricas. Estas sustancias químicas homogéneas son conocidas por el especialista a través de la química orgánica. Entre ellas se encuentran los hidrocarburos alifáticos, aromáticos y cíclicos y los compuestos con grupos funcionales como los ácidos carboxílicos, alcoholes, esteres, aldehidos, lactonas, amidas, heterociclos, isoprenoides, terpenos, hidratos de carbono, esteroides, etc. Los glicósidos, péptidos, proteínas y enzimas también pueden ser sustancias químicas apropiadas.

Los pesos moleculares de las sustancias químicas homogéneas adecuadas son en general superiores a Mr = 150. Así, por ejemplo, los conocidos neurotransmisores acetilcolina [H3 CCO-0-CH2-CH2-N(CH3) 3]OH y nicotina tienen pesos moleculares de Mr = 163 y Mr = 162 respectivamente y constituyen práctica-mente el límite inferior del peso molecular de las sustancias químicas apropiadas. El límite ?tmn-nn?--*~A-*--~j-**-'- «a«*. i,?«lMri>mat?'--"-'"'fa-"* ---•&"- ánL-Jjti-ÉA-éU-tl superior del peso molecular es en principio cualquiera. Así, debido a su reacción específica con dianas biológicas muy especiales, las proteínas de elevado peso molecular (Mr hasta aproximadamente 300.000) son sustancias químicas activas 3 '•X homogéneas interesantes, que pueden separarse de una mezcla de diversas sustancias químicas por el procedimiento según la invención.

Los polímeros biológicos no homogéneos, como el glicógeno, la celulosa, etc., no son adecuados para el procedimiento según la invención, porque no representan sustancias químicamente homogéneas en el sentido de la presente invención, debido a que tienen un número indefinido de unidades monoméricas.

Por otra parte, hay que distinguir entre sustancias químicas activas e inactivas. Se entiende por sustancia química activa la que es capaz de desencadenar una reacción característica al unirse a una diana especial. Una sustancia química activa se caracteriza por tener afinidad por la diana. Una sustancia química inactiva no tiene necesariamente afinidad por la diana.

Por todo ello, no es posible cuantificar el límite superior del peso molecular de la sustancia química en cuestión. La facilidad de preparación se establece básicamente a través del cociente del' peso molecular de la sustancia química activa respecto al peso molecular de la diana. El peso molecular de la diana es generalmente muy elevado, pudiendo ser superior a 1 millón. Como se ha indicado, la diana puede ser una célula completa. Las sustancias químicas de bajo peso molecular (entre aprox. 150 y aprox. 30.000) se separan fácilmente de dichas dianas por procesos convencionales como la ultracentrifugación, debido a la gran diferencia de pesos moleculares. Sin embargo, cuando el peso molecular de la sustancia química activa y el peso molecular de la diana son de un orden de magnitud comparable, la separación por ultracentrifugación resulta insuficiente y hay que utilizar métodos de separación más exigentes o combinar la ultracentpfugación con otros métodos.

Se entiende por "mezcla de sustancias químicas" una mezcla de distintas sustancias químicas, entre las cuales se encuentra al menos una sustancia química activa, que satisface el criterio arriba mencionado, es decir que es capaz de desencadenar una reacción por contacto en una diana especial . La mezcla también puede contener sustancias químicas que no sean capaces de desencadenar ninguna reacción en una diana biológica. Por regla general, las sustancias químicas inactivas representan la proporción principal de la mezcla de diversas sustancias químicas. Las sustancias químicas inactivas de la mezcla sólo son inactivas en relación con una diana especialmente seleccionada, pero pueden desencadenar una reacción como la mencionada en otra diana distinta.

La mezcla de sustancias químicas es en la práctica preferentemente una biblioteca de sustancias fabricadas sintéticamente o con ayuda de la química combinatoria, o un extracto de sustancias naturales. En el sentido de esta -.. -i. zíx rMx. ,.,--.... . - ? - - ? JX.XAA. - .. definición, se entiende por extracto de sustancias naturales la mezcla compleja de sustancias químicamente homogéneas de origen biológico obtenidas preferentemente de plantas, partes de plantas como las hojas, las flores, la madera, las raíces, la corteza, etc., hongos, animales, glándulas, huevos y excrementos de animales, microorganismos, etc. Esta obtención se realiza por procesos conocidos, como destilación en corriente de vapor, destilación seca, extracción con agua, disolventes orgánicos, inorgánicos o sobrecríticos; a menudo va acompañada simultáneamente de transformaciones químicas como esterificaciones, saponificaciones, formación de sales, hidrogenaciones, deshidrataciones, isomerizaciones, alquilaciones, fermentaciones, descomposiciones enzimáticas, etc. Por tanto, la composición de los ingredientes de los extractos de sustancias naturales así obtenidos ya no equivale a la composición de la sustancia en su estado natural. Con todo, en general están presentes al menos 50 sustancias químicas de lo más diverso, entre ellas, como ya se ha mencionado, muchas sólo en forma de vestigios, es decir en una concentración de unas pocas ppm. A menudo sólo son unas pocas sustancias, o solamente una de ellas, las que muestran la actividad biológica característica en un extracto de este tipo, siendo dicha actividad únicamente atribuible a una sustancia que sólo se encuentra en el extracto como vestigio. La mezcla de sustancias químicas también puede ser una mezcla de diferentes extractos de sustancias naturales. En el ejemplo concreto se eligió un extracto de diente de león (Taraxacum officinale) . Naturalmente, las plantas medicinales representan fuentes biológicas particularmente importantes y sus extractos poseen propiedades fisiológicas y o farmacológicas, recogiéndose en parte en la DAB y la HAB.

La "incorporación" de la diana a la mezcla de sustancias químicas se realiza preferentemente en solución, suspensión o dispersión. En muchos casos puede hacerse la adición en una solución acuosa, en particular en una solución cuyo pH se estabilice con ayuda de un tampón adecuado. Una ventaja especial del procedimiento aquí descrito reside en que no tiene lugar una separación previa de la mezcla de sustancias químicas en fracciones distintas para obtener sustancias químicas puras antes de la adición de la diana.

Por "complejo" se entiende una partícula aislable, que está constituida por la diana unida al menos a una sustancia química activa. Una diana p'uede unirse también a dos o más sustancias químicas activas. Las dos o más sustancias químicas activas unidas a la diana en un complejo de este tipo pueden estar en una relación característica determinada, la cual equivale a una acción sinérgica en relación con la reacción específica de la diana especial. Debido a que se elige con frecuencia como diana una proteína, el especialista también se refiere a menudo a complejos ligando-proteína .

En el complejo debe haber al menos una sustancia activa "unida" a la diana. El tipo de enlace entre la diana y la sustancia o sustancias químicas activas no tiene básicamente ninguna influencia. Los enlaces más frecuentes son covalentes o no covalentes. Entre estos últimos se encuentran, por ejemplo, los puentes de hidrógeno, las nteracc ones electrost t cas, por ejemplo entre grupos con cargas opuestas, los complejos metálicos, las interacciones de grupos lipófilos de la sustancia química activa con zonas hidrófobas (denominadas bolsillos) de la diana, las interacciones dipolo-dipolo y catión-p. Con frecuencia es la combinación de distintas interacciones la que origina la afinidad de una sustancia química activa por la diana.

La "separación" de al menos un complejo de las sustancias químicas inactivas no unidas, es decir "libres", de la mezcla se realiza básicamente por los métodos habituales, eligiendo procesos especialmente ventajosos sin necesidad de someter el complejo a una carga térmica. Entre ellos están la filtración, ultrafiltración, centrifugación, ultracentri-fugación, diálisis de equilibrio, filtración en estado de gel o precipitación del complejo. La identificación de al menos una de las sustancias químicas "activas" unidas a la diana puede realizarse a veces antes de la liberación de la sustancia química del complejo, por ejemplo mediante espectroscopia de trayectoria de masas (MALDI-TOF) .

La filtración constituye un método de separación particularmente rápido, eficiente y sencillo. Puede realizarse como ultrafiltración (p. ej . , utilizando unidades de filtración Microcon de la empresa Amicon) o mediante aparatos de filtración especiales (p. ei . , colectores de células B. Brandel) .

La "liberación" de al menos una sustancia química activa del complejo facilita, en todo caso, su descubrimiento, aislamiento y sobre todo su caracterización química. Se realiza tras el paso de separación, después de dos o más operaciones de lavado para eliminar sustancias adsorbidas no especificadas. De este modo se consigue la liberación de las sustancias químicas activas unidas del complejo. En el proceso se vuelve a soltar el enlace existente en el complejo entre la diana y al menos una sustancia química activa. Para ello se emplean, según sea la naturaleza del enlace, métodos físicos o químicos. Puede utilizarse, por ejemplo, una solución acida de alcohol de bajo peso molecular en agua, preferentemente con una mezcla de ácido trifluoroacético/metanol/agua, por ejemplo de composición 1/49,5/49,5 (% en vol.).

Se puede prescindir del paso de liberación cuando no es preciso identificar la sustancia química activa, o bien cuando se identifica el complejo como tal. Hay que prescindir de la liberación cuando la sustancia activa puede resultar modificada debido a las condiciones de liberación o cuando la solución de liberación no es capaz de separar la sustancia activa. Esto es básicamente lo que ocurre con algunos enlaces covalentes. En estos casos, la identificación de la sustancia química activa se realiza midiendo la diferencia de filtrados con diana (= ensayo principal) y sin diana (ensayo en blanco) . Este proceso permite registrar simultáneamente todas las sustancias químicas unidas a la diana, mientras que la liberación únicamente proporciona, por regla general, pocas sustancias químicas activas (p. ej . , una a tres), no pudiendo además estar seguro de que éstas no hayan resultado modificadas. trf,«i. A* -i?- ¡iji--^—-*-a--- .¿I ^.^.^lHt A tJtkáAj Las sustancias que aparecen adicionalmente o en concentración más alta en el ensayo en blanco representan las sustancias químicas potencialmente activas. Estas pueden también aislarse de la mezcla de sustancias químicas (p. ej . del ex-tracto de sustancias naturales) en grandes cantidades con cualquier método de separación (p. ej . por cromatografía) .

La "separación" de al menos una sustancia química activa liberada de la diana tras la destrucción del enlace con el complejo puede hacerse con los mismos métodos, básicamente conocidos, ya mencionados. En este caso también se utilizan con preferencia los métodos más sencillos y prácticos, es decir, filtración y centrifugación. La separación de las sustancias químicas activas también puede realizarse mediante HPLC preparativa.

La "identificación" de las sustancias que aparecen adicionalmente o en concentración más alta en el ensayo en blanco y de al menos una sustancia química activa separada se realiza por los métodos habituales, como HPLC, por ejemplo HPLC analítica convencional, micro HPLC, HPLC capilar o nano HPLC, o por electrocromatografía, electroforesis o técnicas de acoplamiento de LC-MS o MS-MS. No obstante, la identificación de las sustancias químicas activas mediante los métodos mencionados también puede realizarse antes de su liberación del complejo.

El procedimiento según la invención se diferencia básicamente del conocido proceso de HTS en que, mediante la ormac n espec fica de un complejo a base de una diana y al menos una sustancia química activa y la subsiguiente separación de las sustancias químicas inactivas no unidas (ensayo principal) y la diferencia respecto al ensayo en blanco por medio de esta diana especial idónea, es posible, a partir de una biblioteca de sustancias o de una mezcla compleja de sustancias naturales, aislar e identificar una o unas pocas sustancias químicas activas, que se unen a la correspondiente proteína (los denominados "ligandos").

En lugar de aislar individualmente cada sustancia química potencialmente interesante y añadirla a la diana, se pone a ésta en contacto con la mezcla de sustancias. Los complejos formados, tras el reconocimiento según el "principio de llave-cerradura" de Emil Fischers, se separan de las sustancias químicas de bajo peso molecular no unidas, por ejemplo por ultrafiltración, y se identifican por cromatografía comparada (muestra sin diana [= ensayo en blanco] frente a muestra con diana [= ensayo principal] ) . A continuación, para confirmar los resultados, se liberan adicionalmente los ligandos (las sustancias químicas activas) de los complejos - siempre que dichos ligandos sean estables y susceptibles de ser liberados -, se identifican por los métodos habituales, se aislan y se determina su estructura medíante los métodos analíticos corrientes.

El procedimiento según la invención no requiere grandes cantidades de proteína ni de extracto, utiliza pequeños volúmenes de disolvente en la analítica debido a la reducción de escala a métodos microanalíticos, no precisa n subfraccionamiento prolongado y permite descubrir combinaciones de sustancias de actividad sinérgica. No se requiere el marcado radiactivo ni con fluorescencia. Desde luego, el procedimiento según la invención también permite el tratamiento de grandes cantidades de extracto, de modo que pueden "pescarse" sustancias químicas activas cuyas propiedades no resulten deseables para la ulterior utilización de este extracto.

El procedimiento puede utilizarse de un modo particularmente ventajoso cuando, de grandes cantidades de dichos extractos, sólo se deben "pescar" las sustancias químicas activas, que muestran una interacción con la correspondiente diana. La sustancia química activa separada puede seguir utilizándose como principio activo de un medicamento en lugar de la mezcla de sustancias naturales. Esto también es importante cuando hay más de una sustancia del extracto de sustancias naturales que forma un complejo con la diana y el cociente respectivo de más de una sustancia química activa desempeña un papel dominante en la actividad biológica del extracto de sustancias naturales (efecto sinérgico) .

Una ventaja de este procedimiento reside también en la posibilidad de identificación de combinaciones de sustancias activas (sinérgicas) que no son asequibles en el proceso de HTS de sustancias individuales.

Por último, con ayuda de este procedimiento el límite de reconocimiento (límite de detección) de sustancias químicas activas se ha podido incluir contra lo esperado, en el intervalo de valor micromolar de K- ; es decir, que pueden detectarse complejos de una diana y una sustancia químicamente activa con un valor Ki de 1,7 µM.

Los siguientes ejemplos son ilustrativos del procedimiento según la invención.

Ejemplo 1: Aislamiento de un inhibidor de la trombina del tipo 4 -amidinofenilalanina a partir de una biblioteca de sustancias elegida arbitrariamente.

Como diana se eligió la serinproteasa trombina. Como sustancias de la biblioteca de sustancias (de la mezcla de sustancias químicas "inactivas" según la definición anterior) se eligieron los siguientes cinco medicamentos, teniendo en cuenta su solubilidad en agua, sus máximos de absorción y su capacidad de separación por cromatografía: 1. El agonista de los a2-adrenoreceptores clonidina HCl 2. El mucolítico bromhexina HCl 3. El antidepresivo tricíclico amitriptilina HCl 4. El neuroléptico de tipo fenotiazina cloropromazina HCl 5. El neuroléptico de tipo fenotiazina cloroprotixen HCl Como inhibidor de la trombina (la sustancia química activa) se utilizó el compuesto CRC 220 de Behringwerke (Marburg, K- = 2,5 nM) de la siguiente fórmula estructural: Los ensayos analizados tenían la composición siguiente : Tabla 1 La incubación de la biblioteca de sustancias y del inhibidor con trombina se realizó en una hora a temperatura ambiente; disolvente: 0,9 % de NaCl en. H20. La separación de los complejos proteína-ligando formados se realizó por ultrafiltración (centrífuga) . Todos los procesos de filtración y los lavados se efectuaron hasta sequedad de los filtros.

Filtro: Microcon 10 (Amicon) Condiciones de centrifugación: 9981xg, temperatura ambiente Operaciones de lavado: 2 con 150 µl de NaCl al 0,9 % en H20 cada vez, 4 °C Tras la ultrafiltración y el análisis del filtrado se realizaron operaciones de lavado y la liberación del ligando (la sustancia química activa) del complejo proteína- ligando retenido en el filtro por tratamiento con 200 µl de agua/metanol/ATF (49,5/49,5/1) a temperatura ambiente.

El ensayo en blanco (sin trombina) se realizó de modo análogo en todos los pasos, lo cual permite la comparación de los filtrados. Los filtrados obtenidos en todos los pasos se secaron mediante un concentrador Speed-VAC y después se disolvieron en una cantidad definida de la correspondiente fase móvil de la HPLC utilizando ultrasonido y agitación.

La identificación de los ligandos se llevó a cabo mediante HPLC analítica: fase estacionaria Hypersil C 18 BDS, 3 µm, 150 * 0,3mm, Fusica (LC Packings) - fase móvil: Acetonitrilo/agua/ TFA (35/65/0,1), isocrático, 5 µl/min., ? = 230mm. Los resultados se representan en la fig. 2.

La diferencia entre el ensayo principal y el ensayo en blanco es el compuesto químico activo CRC 220. Puesto que la clonidina-HCl (4,6 min.) no aparece en el ensayo principal ni en el ensayo en blanco, no está unida a la diana, sino que ha sido retenida por el filtro. No se trata de un inhibidor.

Ejemplo 2: Unión de mezclas no equimolares de amídinofenilalaninas de distinta fuerza de enlace a la tripsina.

Se utilizaron como sustancias químicas los inhibidores de la tripsina de tipo 3 -amidinofenilalanina representados a continuación por sus fórmulas estructurales, y como diana la serinproteasa tripsina:- T«tóa 3 Tabla 4: Composición de los análisis Los ensayos se realizaron como se ha descrito en el ejemplo 1 Tabla 5 : Resultados Ejemplo 3: Aislamiento e identificación de sustancias naturales a partir de extracto de Taraxacum.

Sustancias utilizadas para los análisis: (extracto seco de sustancia natural de la empresa Cáelo) Preparación de soluciones acuosas: _ Suspensión del extracto seco en agua (0,2 g en 20 ml) . _ Tratamiento durante 5 min. en baño ultrasónico, reposo de 30 min. agitando de vez en cuando. _ Filtración a través de filtro de membrana (0,7 µm)y después a través de filtro Anotop 25 (0,02 µm) . _ Control de taninos mediante FeCl3, Pb(CH3COO)4 y gelatina: negativo b) ß2-adrenoreceptor (= diana) _ Preparación de membrana a partir de células de insectos Sf9 infectadas durante 3 días con un baculovirus recombinante contra receptor ß2-adrenérgico (células y virus, construcción de plásmidos, aislamiento del baculovirus recombinante y preparación de las membranas: MPI de Biofísica, Depart . de Membranobiología Molecular, Frankfurt/Main, Dr. Helmut Reilánder) [H. Reilánder, Febs letters, 282, 441-444 (1991)].

En los análisis se combinaron el extracto de Taraxacum y la preparación de membrana en varias proporciones estequiométricas disueltos en 200 µl de tampón de enlace (150 mM NaCl, 50 mM tris, pH 8,2 en agua) .

El enlace receptor-ligando se consolidó por incubación de la mezcla durante 30 minutos a 30-34 °C. A continuación se añadieron las soluciones a un filtro |U .3-...Lift ¡fl1?Í¡í til i ijjiflff r ¡í centrífugo Microcon 10 y se centrifugó a 998lxg durante 15 min., o hasta que el filtro quedó seco.' La comparación de los cromatogramas de los ensayos con receptor (= ensayo principal) y sin receptor (= ensayo en blanco) condujo a la identificación de las sustancias químicas unidas. Tras dos operaciones de lavado con tampón de enlace se separaron los complejos retenidos en el filtro por tratamiento con 200 µl de TFA (1/49,5/49,5) .

Tabla 6: Composición de los análisis: ... Jhjii Los eluidos de los siguientes 4 pasos de filtración se centrifugaron al vacío hasta sequedad y las sustancias obtenidas se disolvieron en 10 µl de la fase móvil de la HPLC (ver el ejemplo 1) mediante ultrasonido poco antes del análisis LC. a a 1 -. Resu ta os i -i.--..,-- -- é ... ,.--.-_ ..i.-. - _----,-,.-. ...ih--... . . .. , .- -.--...-_ -t-J .-..Í-J Los tres ligandos "pescados" (L3 = ácido trans- caftarínico, L6 = ácido trans-chicorínico y L7 = ácido trans- diferoil-tartárico) , es decir obtenidos por formación de un complejo y subsiguiente liberación, de éste, pudieron identificarse por medio de UV, ^-NMR y MS .

U ¿7 fe AÉ¿^ -¿ ... ^.£^¿- . ¿ AiÍ LAS FIGURAS La fig. 1 muestra una representación simbólica de la formación de al menos un complejo. A una mezcla de 1000 distintas sustancias no equimolares, químicamente homogéneas (cuatro de las cuales son activas) , se añade una diana. Se forman cuatro complejos distintos, cada uno de los cuales contiene una de las sustancias químicamente activas. A continuación, las 996 sustancias inactivas pueden separarse de los complejos mediante ultrafiltración. La numeración significa: 1 = diana 2 = diversas sustancias químicas activas 3 = diversas sustancias químicas inactivas (puntos) 4 = diversos complejos con al menos una sustancia química activa La fig. 2 ilustra: A) Mezcla de sustancias químicas con el inhibidor CRC 220 clonidina HCl (4,6 min.), CRC 220 (6,9 min.), bromhexina (12,3 min.), amitriptilina (17,6 mi?.), cloropromazina HCl (23,9 min.), cloroprotixen HCl (26,9 min.).

B) Filtrado sin diana (ensayo en blanco) C) Filtrado con diana de trombina (ensayo principal) Los cromatogramas de la fig. 3 ilustran: A) Taraxacum (ensayo en blanco) B) Taraxacum (ensayo principal) C) Liberación de Taraxacum La diferencia entre ensayo en blanco y ensayo principal muestra casi 12 sustancias unidas, mientras que mediante el método de la liberación sólo pudieron detectarse 3 sustancias.

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES DE PATENTE 1 . Procedimiento para la identificación de al menos una sustancia química activa a partir de una mezcla de sustancias activas e inactivas, caracterizado por los pasos siguientes: a) Adición de una diana a dicha mezcla y formación de un complejo formado por la diana y al menos una sustancia química activa de la mezcla, b) Aislamiento del complejo respecto a las sustancias químicas inactivas de la mezcla y, o bien c) Liberación, aislamiento e identificación de al menos una sustancia química activa del complejo aislado d) Identificación de al menos una sustancia química activa de la mezcla por comparación de un cromatograma de la mezcla de sustancias • químicas activas e inactivas con un cromatograma de la mezcla de sustancias químicas inactivas obtenida después del aislamiento del complejo.
2. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por realizarse la adición de la diana a la mezcla de sustancias químicas en una solución, una suspensión o una dispersión.
3. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por realizarse la adición en una solución acuosa.
4. Procedimiento según una de 'las reivindicaciones precedentes, caracterizado por estabilizarse el valor del pH de la solución acuosa con ayuda de un tampón adecuado.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por formarse el complejo mediante un enlace entre al menos una sustancia química activa y la diana.
6. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por ser el enlace covalente o no covalente.
7. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por ser el enlace no covalente un puente de hidrógeno, interacciones electrostáticas, formación de complejos metálicos, interacciones de grupos lipófilos de la sustancia química activa con la diana, interacciones dipolo-dipolo o interacciones de catión-p.
8. 8. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por realizarse la separación del complejo de la sustancia química inactiva mediante ultrafiltración, ultracentrifugación u otros métodos al efecto.
9. 9. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por realizarse el aislamiento y/o la identificación de al menos una sustancia química activa del complejo separado por métodos como HPLC, electrocromatografía, electroforesis, técnicas de acoplamiento como LC-MS o MS-MS, preferentemente por HPLC microcapilar o HPLC nanométrica.
10. 10. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por realizarse la identificación de al menos una sustancia . química activa de la mezcla por métodos como HPLC, electrocromatografía, electroforesis, técnicas de acoplamiento como LC-MS o MS- MS, preferentemente por HPLC microcapilar o HPLC nanométrica.
11. 11. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por realizarse la separación de al menos una sustancia química activa de la mezcla por medio de HPLC preparativa, electrocromatografía o electroforesis .
12. 12. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por ser la mezcla de sustancias químicas activas e inactivas una biblioteca de sustancias obtenida de la química sintética o de la química combinatoria, o un extracto de sustancias naturales.
13. 13. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por ser la mezcla de sustanc as qu m cas un extracto de sustancias naturales químicamente modificado.
14. 14. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por ser la mezcla de sustancias químicas activas e inactivas un extracto de diversas sustancias naturales.
15. 15. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por contener la mezcla de sustancias químicas activas e inactivas al menos 50 sustancias químicas diferentes.
16. 16. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por ser la diana una proteína.
17. 17. Procedimiento según una de .las reivindicaciones precedentes, caracterizado por ser la diana una enzima, un receptor, un anticuerpo, una membrana biológica o una célula.
18. 18. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por ser la diana la enzima trombina.
19. 19. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por ser la diana el receptor tripsina.
20. 20 . Procedimiento según una de las reivindicaciones fyz.ixMziax?¿íA x-Ü- *: - -.¿a-«¿7 precedentes, caracterizado por ser la diana el ß2- adrenorreceptor. Dispositivo para la ejecución combinada del procedimiento según la reivindicación 1.