TWI245121B - Process for detecting and isolating pharmacologically active compounds from substance mixtures - Google Patents

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A7 B7 1245121 五、發明說明（1 ) 藥理硏究已發展-自使用獨特天然來源開始，經過活性 物質的化學合成和藉由動物實驗進行其試驗-到使用實驗和 理論上的方法進行活性物質之尋標、電腦輔助結構圖。 隨著不同的疾病原因（例如，缺乏或是遺傳上所導致之 蛋白質的改變）之知識的增加，對於藥劑的藥學硏究和治療 已變得越趨於更加複雜化，因此，過去十年來，一些初級 的神經變性的疾病，例如：阿爾滋海默氏症，帕金森氏症 、亨丁頓氏症、肌肉萎縮性側索式硬化、普裏歐尼克氏症 和不同的共濟失調症狀的遺傳性原因可藉由分子生物方法 加以闡明（人類基因組計劃）。此種在疾病下之生物改變的 識別形成自症狀的緩和轉移到病因療法的基礎。 在醫學上所描述之約30,000種疾病的100到150種疾 病係足以適合作爲藥學工業的硏究計劃。目前可獲得的藥 劑意欲治療性地影響約400個接受器、酵素和其他的生物 分子。然而，茲假設有將近達10000個基因及其產物係適 合作爲活性劑硏究的標的物。證實它們的病理相關性需要 有資訊價値的分子系統及細胞系統。 除了合理的設計之外，其包含基於經驗値或基於習知 分子結構對物質性質之最佳化，目前的組合化學和組合生 物合成，該後者於發展階段，於藥物硏究上扮演一個很重 要的部分。 這些方法中一個重要的弱點是相較於植物和微生物二 級代謝產物之結構的複雜性，合成物質的多樣性是有限的— 〇 4 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) %
-------訂---------線U 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1245121 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 --------------- 五、發明說明（> ) 爲能利用這天然的多樣性，茲絕對必要在正統天然產 物硏究、分子醫樂及有機化學間產生一緊密的連結。在探 索新的主題結構中，植物和動物有機體以及黴菌和微生物 之選擇係根據隨機的原則，在化學分類觀點下，基於生態 觀察和基於先前的人類治療學的知識的基礎進行。 然而’測定來自物質混合物如來自經由組合化學所產 生之物資庫或來自天然產物卒取物的一或多個活性成分是 非常的費力。 天然物質萃取物，例如，一般由許多(達2,〇〇〇)橫跨整 個極性範圍之大多數不同的物質所組成，其是由於不同的 基本結構和官能基團所導致。通常地，只有相當少數的化 合物近似萃取物重量的約80%，然而殘餘化合物的主要部 分係以低至ppm範圍的濃度存在，即，非等莫耳。然而經 常地只有少數的物質，或甚至只有單一物質會表現出生物 活性特性’且該活性可能起因於微量存在於萃取物中的物 質。 直到目前’天然萃取物之大部分的色層分離法的成分 ’或是藉由組合化學產生的廣泛物質庫，的方法及分析一 般已使用非常高的產量(高生產量的篩選，HTS)的自動化測 試系統來進行。然而，這種方法是非常的費力的和價格非 常昂貴的。例如，茲需要起始製備自天然產物來源(例如， 植物、動物、黴菌、微生物），以逐漸增加之極性的溶液選-擇性萃取，且接著進行生物測試。在從個別的有效的選擇 性萃取物中形成細餾份後，進行另外的測試。 5 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1245121 A7 -—~ B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（j ) 最後，一個最後測試係爲顯示純物質，從有效部分分 離後，表現生物活性且因此表示’’成功(hit)”。在次資料庫 中之色層分離及其測試每次需花上數週的時間。爲能夠回 收足夠量的純物質，茲因此需要以大量的萃取物起始。此 同樣地，需要高成本用於準備用HPLC管柱和高溶劑需求（ 在購買和處理二者）。 已藉由分離細餾份，但格外地藉由分離純天然物質， 該萃取物之個別成份的可能協乘或對抗作用係於高生產量 篩選中會損失。所以，在第一次測試時有效的萃取物可能 會損失其生物作用，因爲，分離成個別物質會防止標的物 的鍵結，該標的物鍵結只有藉由各種不同成分之交互作用 才有可能。 一種測定來自經由組合化學產生且由最高地19個化學 上非常類似的胜肽(其僅從胺基酸置換而產生且以等莫耳量 存在）所組成之合成胜肽庫的有效成份之方法係描述於 Zuckermann 等人 ’ Proc· Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4505〜4509(1992)。爲達此目的’加入一不足量的抗體到此 種胜肽物質庫中，且標的物卜抗體)胜肽複合物藉由快速凝 膠過濾加以分離。該胜肽以1%三氟醋酸自複合物中釋放， 且該結構藉由質譜和胺基酸分析說明。然而’此種方法是 不適用於較小的分子量之標的物一分子複合物(分子量低於 或是等於丨500)，因爲凝膠過濾技術的運作僅僅適用於分' 子量具有較大差異時。同樣的’根據作者指出，該方法需 要等莫耳混合物。此外，配合基之協乘活性組合物之測試 6 -n «I ϋ H ϋ ϋ I^OJ« ϋ ϋ ϋ H ϋ ϋ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) # 線
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 Χ 297公釐） 1245121 A7 B7 五、發明說明（t) 是不可能的或聽憑機會。 由 Wieboldt 等人在 J如/. 1683-1691(1997) 中所描述之實驗同樣地關於20至30個緊密相關的分子之 等旲耳混合物(具有一般1，4-苯並二氮雜肇結構之協乘生產 衍生物）。該合成物質之有限的多樣性確實幫助實驗的進行 ’這是確實的，但同時表示其用途之限制因子。 问樣的’由R. B. van Breemen等人在如a/· C/^m·，处， 2159_2164(1997)中描述的脈衝超過濾質譜需要具有20個 物質之等莫耳物質庫。因爲釋放係僅以有機溶劑完成，共 價鍵結物質無法被偵測到。 因此’本發明的目的是發展一種可以快速地實行和有 效的方法，用以偵測和分離生物地，例如，藥理地，活性 化學物質和物質組合物，尤其是來自非等莫耳混合物，如 天然物質萃取物（例如，來自植物、動物、黴菌和微生物) 〇 此目的可藉由一種方法達成，其特徵在於下列步驟： a) 加入一標的物至化學物質，例如，天然產物之萃取 物，的混合物中， b) 從標的物和至少一種活性化學物質形成至少一複合 物’此化學物質係鍵結至標的物； c) 自該至少一複合物中分離混合物之未鍵結的化學物 質’及其可能地分析(例如，色層層析)偵測(=主要實驗）。 該欲於一不含標的物（盲檢）之分離實驗中測定且額外 或以較高濃度存在之物質表示所有由標的物鍵結之物質的 7 本紙張尺度適用中國國家標準（CNs)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) %
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1245121 A7 Β7 五、發明說明（< ) 總數。該等物質被分離且其結構被說明。 然而，處理複合物之另外的步驟，下列亦可適合： d) 游離至少一種鍵結到於複合物中之標的物之活性化 學物質，其係藉由破壞活性化學物質與於複合物中之標的 物間的鍵結， e) 分離至少一種經游離的活性化學物質，及 f) 鑑別至少一種經分離的活性化學物質，且可能地與 步驟c之所鑑別的物質進行比較。 名詞’’生物標的物”一詞係指一種蛋百質(例如，受體， 酵素，抗體），一種生物膜或是一完整的細胞（健康的或是 癌化的）。藉由接觸之後，尤其是當結合一相配活性化學物 質到該標的物時，一反應可被促使，其爲標的物的特徵且 幾乎是與一生化方法相關聯。換句話說，該活性化學物質 對特定的標的物具有一高的親合力，此種標的物的實例爲 一種蛋白質，凝血酶、胰蛋白酶、和β2_腎上腺素受體。 實際上所有那些從有機和天然產物化學習知者都是適 合作爲’’化學物質”。在那些物質中，彼等爲低分子和高分 子化學物質，但並非是一些未知數的單體單元之聚合物。 此種有機化學之化學均一物質爲熟習該項技術者所知。在 這些之中爲脂肪族的、芳香族的和環狀的碳氫化合物和含 有一官能基團，如羧酸類、醇類、酯類、醛類、內酯類、 醯胺類、雜環類、類異戊二烯類、松烯油類、碳氫化合物二 、類固醇類、等等之化合物。同樣地，配醣類、胜肽類、 蛋白質和酵素可被考慮作爲合適的物質。 --------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) #
8 1 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1245121 A7 五、發明說明（l ) 適當的化學均一物質之分子質量一般是高於M^150。 因此’習知神經遞質乙醯膽鹼[h3cco-o-ch2-ch2-N(CH3)3]〇H和菸鹼具有分子質量分別地爲Mfi63和 Mr=162 ’且因此實際上描述適合的化學物質之分子質量之 下限。原則上來說該分子質量的上限並未受限制。所以， 高分子蛋白質(Mr達約300,000)確是所意欲者之明確活性化 學均一物質’其可藉由本發明方法自不同的化學物質之混 合物中分離出來。 非均一性的生物聚合物如肝糖、纖維素等等，是不適 用於本發明方法，因爲，由於其不確定的單體單元數目， 他們無法代表作爲本發明目的之化學均一物質。 此外’對於化學物質，必須在活性的和不活性的化學 物質間進行區別。一活性化學物質係被了解爲可以鍵結到 一能夠快速的進行反應爲其特徵之特異性標的物之物質。 一活性化學物質其特徵在於具有對標的物之親和力。一不 活性化學物質則不需要具有對標的物之親合力。 因此，適當的化學物質之相對分子質量的真實上限可 能無法指出。更確切地說，其僅是測試的過程單純，其係 藉由活性化學物質之相對分子質量比上標的物之相對分子 質量之比値加以實質測定。該標的物之相對分子質量一般 是非常大的，且例如，可能超過一百萬以上。如所提及， 該標的物也可是一個完整的細胞。具有小相對分子質量之二 化學物質(大約150到約爲30,000)，因與前述的標的物分 子質量上有較大的差異性，可藉由習知方法，例如，超離 9 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
1245121 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ----- -B7________ 五、發明說明（\ ) 心’而容易地從標的物中分離出來。然而，當活性化學物 質之相對分子質量與標的物之相對分子質量在可比較的大 小等級內時，超離心也只能提供不甚滿意的分離結果，且 必須使用更多複雜的或是額外的分離方法。 名詞’’化學物質之混合物"一詞指的是不同化學物質之 混合物，其包含至少一活性化學物質，且可以滿足前述的 標準’即，與一特異性的標的物接觸後可以引起反應。混 合物也可包含超過一種以上此種活性化學物質。此外，該 混合物也可包含一不能在生物標的物上引起反應之化學物 質。通常地，該不活性化學物質爲在不同化學物質之混合 物中佔了主要的部分。特別地，該於化學物質混合物中所 包含之不活性化學物質僅是針對某一特定選擇之標的物不 具活性，但是卻可以在另一種標的物上引起此種反應。 實務上，化學物質之混合物較佳是一種物質庫，該物 質庫可由合成產生的或是使用組合化學，或天然產物之萃 取物。名詞Π天然產物之萃取物”一詞是根據此定義欲被了 解的意指化學均一物質之複合混合物，該等物質源自於生 物來源且較佳地爲回收自植物、植物的部份如葉、花、木 材、根、樹皮等，黴菌、動物、腺體、卵和動物的排泄物 、微生物等。此可使用習知方法進行，例如，蒸氣蒸餾、 乾燥蒸餾、以水、有機、無機或超臨界溶劑萃取，經常的 也同時進行或是之後的化學物質進一步進行例如，酯化作= 用、皂化作用、鹽形成作用、氫化作用、脫水作用、異構 化作用、烷化作用、發酵作用、酵素分解作用等等。關於 10 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) % 訂---------線4
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） A7 1245121 B7 _ 五、發明說明（名） 他們成分的組成物，如此獲得之天然產物萃取物有時不與 存在於生物來源的組成物相對應。然而，一般而言，在這 之中，存在大量，即，至少50種最多不同的化學物質，如 所提及，多數的物質僅僅只有微量存在。即，只存在一些 ppm的濃度。然而，經常的，在此種萃取物中僅僅只存在 於少數或是恰好只含有單一物質顯示生物活性特性，這種 活性可能是由於僅僅只有微量存在於萃取物中之物質。化 學物質的混合物也可是一個不同天然產物萃取物之混合物 。在一特殊的實例中，選擇蒲公英(taraxacum officinale)之 萃取物。特別重要的生物來源，當然是醫藥植物，其萃取 物具有生理及/或藥理作用，且其部分已經詳加記載在德國 藥典和類似醫療法的藥典中。 標的物’’添加”到化學物質混合物較佳地於溶液、懸浮 液或分散液中進行。在很多例子中，添加通常是於一水性 溶液中進行，尤其是在一以適當的緩衝液促進溶液的穩定 性的pH値溶液中。此處所描述方法之特別的優點爲在添 加標的物前，並未事先將化學物質混合物分離成複數個不 同的餾分甚至是純化學物質。 名詞’’複合物’’一詞指的是可以被分離的一種顆粒，且 其由至少有鍵結一個活性化學物質之標的物所組成。該標 的物也可鍵結2個或是更多個活性化學物質。該鍵結至此 複合物中之標的物的2個或是更多個活性化學物質可以相 對於彼此之特定、特殊比例存在，關於該特殊的標的物之 特異性的反應比例相對應一協乘作用。熟習該項技術者也 11 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1245121 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（' ) 稱之爲蛋白質-配位基複合物，因爲該被選擇作爲標的物之 蛋白質的構象爲經常性的選擇。 在複合物中，至少有一個活性化學物質”鍵結”到標的 物上。在此’標的物和活性化學物質之間鍵結的型態基本 上並不具有重要性。共價鍵或非共價鍵最常發生。後者包 括，例如，氫橋、靜電相互作用，例如，相反的電荷基團 間、金屬複合、標的物之具有疏水性的區域（所謂的口袋 (pocket))活性化學物質之親油性基團之間的相互作用、偶 極-偶極相互作用和7Γ陽離子相互作用。所以，其常是造成 活性化學物質對於標的物之親和力之不同的相互作用的組 合。 從至少一個來自未鍵結，即，”游離”的混合物之不活 性化學物質之複合物中”分離”，係基本上使用一般的方法 進行；選擇具有特別優點的方法，該等方法不含複合物之 熱負荷。這些方法爲，例如，過濾、超過濾、離心、超離 心、平衡分析'複合物之凝膠過濾或沈澱。鑑別至少一種 鍵結到標的物之’’活性’’化學物質有時可於複合體中游離化 學物質前進行，例如，飛行時間質譜儀(MALDI-TOF)。 過濾、表不一特別快速、簡單及有效的分離方法。其可 以超過濾、（例如，使用Amicon公司之Microcon filter units) 或用特殊的過濾裝置(例如，Brandel細胞採集器)進行。 然而，來自複合物之至少一種活性化學物質的”游離” ' ，有助於其偵測、分離和尤其的是其化學定性。在二次或 是多次將非特異性吸附的物質移去的洗滌流程後，接著分 12 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) # 訂---------線
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1245121 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 __ B7 _ 五、發明說明（) 離步驟。因此，可達到從複合物中鍵結的活性化學物質之 游離。在此方法中，該存在於複合物中之標的物和至少一 種活性化學物質間的鍵係再被打斷一次。爲此目的，視鍵 的本質而定，使用物理或化學方法。此可藉由，例如，藉 由使用一種酸、弱鹼的水性溶液’較佳地與三氟醋酸/甲醇 /水之混合物，例如1/49.5/49.5(體積，百分比）之組成物來 進行。 假如活性化學物質之鑑別不需要，也就是說，假如複 合物欲被鑑別，則游離的步驟可以免除。假使’藉由游離 條件改變活性物質，或是藉由游離溶液並無法分離活性物 質時，則游離步驟必須免除。這些主要是在一些共價鍵的 例子中。在這些例子中，可以藉由濾液中含有標的物(=主 要實驗）和不含標的物(=空白樣本）之差異完成活性化學物 質之鑑別。此方法允許所有被標的物鍵結的化學物質同時 進行偵測，然而，游離通常僅產生少數(例如’一個到三個 )的活性化學物質；除此之外，在這些游離的例子中，並無 法確定物質爲未改變。 在盲目樣本中額外地或以高濃度發生的物質表示潛在 的活性化學物質。他們可以自化學物質(例如’天然產物萃 取物）之混合物中藉由任何分離方法(例如’色層分離)而被 分離。 在藉由破壞存在於複合物中之鍵後’可使用已被提及 之相同、基本習知的方法完成自標的物中’’分離’’至少一種 游離的活性化學物質。此處，使用較佳的最簡單和最有效 13 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) % -------訂---------線
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1245121 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（“） 的方法，即，過濾和離心。活性化學物質之分離也可藉由 準備的HPLC完成。 發生於另外或較高濃度之空白樣本中之物質或至少一 種經分離之活性化學物質之’’鑑別’’可藉一般方法’如HPLC ，例如，傳統分析HPLC、微-HPLC、毛細管HPLC或奈-HPLC進行，或是藉由電子色層分析、電泳或是LC-MS或 MS-MS之偶合技術進行。然而，藉由所提及方法鑑別活性 化學物質，也可在他們從複合物中游離之前就已進行。 本發明方法係基本地不同於已知高產量篩選，主要的 事實是標的物和至少一種活性化學物質之複合物之尋標形 成，且隨後分離^未鍵結的不活性化學物質（主要試驗），和 與空白試驗之差異，茲可能藉由這種適當的特異性的標的 物，來分離和鑑別單一或一些活性化學物質，該等物質會 結合到相對應蛋白質上(所謂之"配位基’’），該蛋白質來自於 一物質庫或來自於一複合物天然產物混合物。 代替分離每一個個別的有潛力有興趣的化學物質，和 提供這些物質給標的物，後者係表現在物質混合物中。在 根據 Emil Fisher’s f’Lock-and_key principle(鎖與鍮匙的原理 Γ辨識後形成之複合物係藉由，例如，超過瀘，自未鍵結 之低分子化學物質中分離，且藉由比較色層層析（標的物-游離[=空白樣本])對含標的物[=主要試驗]之樣本)進行鑑別 。爲確認結果，該配位基（活性化學物質）然後自複合物中 被另外地游離-盡可能的他們爲穩定且可游離，再藉由一般 方法鑑別、分離，和藉由一般分析方法說明其結構。 14 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) % -------訂---------線
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1245121 A/ Γ—___ B7 五、發明說明（d 根據本發明之方法可不需要大量的蛋白質或是萃取物 ，其藉由縮小規模至微量分析法分析時只需要少量的溶劑 體積，需要不會耗費太多的時間的次分餾，和能夠發現協 乘的活性物質組合物。可以免除使用放射性標記和螢光標 記。本發明方法自然地也能夠運用在較大量的萃取物上， 茲可能π取出（fish out)n活性化學物質，其性質並不欲用於 萃取物之另外用途。 當來自此種較大量的萃取物時本方法可以有特別優點 的使用，且意欲只π取出’’與有關標的物有相互作用的那些 活性化學物質。然後，至少一種經分離的活性化學物質可 被進一步使用作爲一醫藥之活性的本質以取代天然產物混 合物。這也是相當重要的，假使天然產物之萃取物之超過 一種以上的活性化學物質和標的物形成一複合物，且超過 一種以上的活性化學物質對其彼此之相關比例扮演一個與 天然產物萃取物之生物功效有關之一主要部分（協乘作用） 〇 因此本方法的一優點也在於鑑別一活性（協乘）物質組 合物之可行性，其無法於個別物質高生產篩選中偵測。 最後，茲亦可能以此方法幫助轉移活性化學物質對所 有預期的辨識的限制(偵測限制)至微莫耳ΚΓ値的區域，即 ，具有&値爲1·7微莫耳之標的物和活性化學物質之複合 物是可偵測的。 下列實施例將提供列舉說明本發明方法。 15 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------^----
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1245121 A7 B7 五、發明說明（θ) 實施例1 :從一隨機的選擇性的物質庫中分離4-甲脒 基苯基丙氨酸型態之凝血酶-抑制質。 作爲標的物，選擇絲氨酸蛋白酶凝血酶。作爲物質庫 中的物質(如前所定義之”不活性”化學物質之混合物），選擇 以下的5種藥物，考慮其水溶解度’其最大之吸收和其色 層分析分離性： 1、 中樞侵襲α2-腎上腺受體激動劑克氯尼淀(clonidin)-HCL。 2、 溶黏液劑溴克辛(bromhexine)-HCL。 3、 三環抗抑鬱的 amitryptiline-HCL。 4、 致類神經病病狀的吩噻嗪型酚噻嗪 (chlorpromazine)-HCL °
5、 致類神經病病狀的吩噻曉型chlorprothixene-HCL 〇 作爲凝血酶抑制劑（活性化學物質），使用具有下列結 構式之 Behringwerke(Marburg ; Ki=2.5nM)的 CRC220 化合 物： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) % 訂---------線
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 η2ν
e Μ 〇 Η 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1245121 五、發明說明（） 檢測分析下列的組成物 表1 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 樣本 不含凝血酶之盲目樣本 含有凝血酶之主要實驗 凝血酶 0 1 nmol 2000E/mg 5 μιηοΐ/ΐ 克氯尼錠(Clonidin)-HCL 2 nmol 2 nmol 10 μηιοΐ/ΐ 10 μιηοΐ/l 溴克辛(Bromhexine)-HCL 2 nmol 2 nmol 10 μιηοΐ/l 10 μιηοΐ/l Amitryptiline-HCL 2 nmol 2 nmol 10 μιηοΐ/l 10 μιηοΐ/l 酉&0¾1 秦(Chlorpromazine)-HCL 2 nmol 2 nmol 10 μηιο1/1 10 μιηοΐ/l Chlorprothixene-HCL 2 nmol 2 nmol 10 μπιοΐ/l 10 μιηοΐ/l CRC220 2 nmol 10 μιηοΐ/l 水中含有0.9%的氯化鈉(最純 的） ad 200 μΐ ad 200 μΐ 請 先 閱 k 背 面 $ 事 m 再 滇 寫 衣 頁
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將物質庫和含有凝血酶之抑制劑之培養於室溫下；溶 劑：水中含有0.9%的氯化鈉進行1小時。藉由超過濾(離 心）完成所形成蛋白質-配位基複合物之分離。進行所有的 過濾程序和洗滌的步驟直到過濾器乾燥爲止。 17 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1245121 B7_ ___ 五、發明說明) 過濾器：Microcon 10 (Amicon) 離心條件：9981xg，室溫 洗滌步驟：2x，每次在4°C下使用含有〇.9%氯化納水 溶液1 5 0微升。 超過濾和分析濾液接著進行洗滌步驟’和藉由在室溫 下以200微升之水/甲醇/TFA(49.5/49.5/l)溶液處理而自保 留在過濾器之蛋白質-配位基複合物中游離配位基(活性化1 學物質）。 該盲目樣本（不含凝血酶)係以於所有步驟中類似的方 法加以處理，因此，濾液是可以進行比較的。於所有步驟 中所得的濾液藉由快速-VAC濃縮器進行乾燥，和隨後溶 解在已定義量之相對應HPLC流動試劑中應用超音波和攪 動。 藉由分析HPLC完成配位基之鑑別，其中靜止相爲：
Hypersil C 18 BDS，3μπι，150* 0.3mm，Fusica (LC
Packings)。流動相爲：乙腈/水/TFA(35/65/，01)，isocratic ’ 5微升/分鐘，=230mm。該結果顯不在圖2中。 主要試驗和盲目樣本之間的差異是在於以CRC200當 成一活性化學化合物。因爲克氯尼錠(cl〇nidin)-HCL(4.6分 鐘)不存在主要試驗中，也不存在於盲目樣本中，故藉由測 試標的物無法發現到，但藉由過濾也無法發現到。其並非 是一種抑制劑。 18 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
1245121 λ： _Β7_ 五、發明說明（A ) 實施例2 :對胰蛋白酶之不同的結合強度之甲脒基苯 基丙氨酸之非等莫耳混合物之結合。 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項 再 .藉由其結構式表示於下列之3-甲脒基苯基丙氨酸之胰 蛋白酶抑制劑被使用作爲化學物質，且絲胺酸蛋白酶胰蛋 白酶作爲標的物： 表 編號 結構 N/alpha/P2/C alpha 分子式 Κί[μηιο1/1] 凝血酶 Κί[μηιο1/1] 胰蛋白膽 6 (120)*HC1 pNas/-/Pzd-N-SMe NH #HC， ^ r^\ ^Y^wS〇2-nh-o-C(>-n^一^^一 S〇2-CH3 0.0021 0.067 7 (105-95)* HC1 PNas/-/Ppd NH HjnA〇 •HC 丨 丫 ch2 S〇2-N H 卞 CO — 〉 0.065 0.33 10 (110-79)* HC1 pNas/-/iNip-Oet NH H2N"V^ /~\ 々〇 0.36 0.02
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經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1245121 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、 發明說明（\\ ) 表 4 :分析糸 &成物 樣本 胰蛋白酶 6 7 10 0.9氯化鈉 10.600 E/mg [Κ,=67ηΜ] [Κ,=330ηΜ] [Ki=20nM] 在水中 [最純的] 261 ； 300 0 1.68 nmol 8.25 nmol 0.5 nmol ad 200 μΐ 8.4 μιηοΐ/l 41_25 μιηοΐ/ΐ 2.5 μπιοΐ/l 262 ； 301 ； 10 nmol 1.68 nmol 8.25 nmol 0.5 nmol ad 200 1 302 50 μηιοΐ/l 8.4μιηο1/1 41.25 μιηοΐ/l 2.5 μιηοΐ/l 進行如實施例1中所述之實驗。 表5 : 結果 樣本 物質 濾液 第一次洗滌 第二次洗滌 游離 [μιηοΐ/l] Γμιηο1/1] [μιηοΐ/ΐ] [μπιοΐ/ll 261 6 7.44 0.71 0.05 0.01 7 31.57 3.13 0.26 0.13 10 0.05 0.02 0.0013 0.0011 262 6 0.67 0.23 0.15 6.09 7 22.22 3.68 1.29 8.49 10 0.02 0.0058 0.0012 0.53 實施例3 :蒲公英之萃取物之天然產物之分離和鑑別 _ 使用於分析的物質 a)extr. taraxaci spir. sicc(Caelo公司之天然產物乾燥萃 取物） 20 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 請 先 閱 讀 背
S 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 頁 訂
1245121 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 B7___ 五、發明說明（0 ) 水性溶液的製備： -乾燥的萃取物懸浮在水中（0.2克溶解在20毫升） -在超音波浴中處理5分鐘，且不斷的搖動直到持續 30分鐘-通過〇.7μπι之薄膜過濾器過濾，接著通過〇.〇2μηι之 Anotop 25過濾器 -藉由FeCl3、Pb(CH3COO)4和凝膠進行單寧試驗：負 反應。 b)p2-腎上腺受體(=標的物） -使用一重組的β2-腎上腺受體-竿狀病毒感染Sf9昆蟲 細胞3天，製備薄膜(細胞和病毒，質體構築，重組竿狀病 毒的分離和製備薄膜：MP1 fiir Biophsik，Molecular Membrance Biology Department，Frankfurt/Main，Dr· Helmut Heilander，182, 441-444(1991)]。 在這分析方法中，蒲公英的萃取物和薄膜製備以不同 的化學計算比加以組合，溶解在200微升之結合緩衝溶液 中（150mM氯化鈉，50mM tri，在水中之pH値爲8.2)。 藉由混合物在30〜34°C之30分鐘長時間的培養以完成 受體-配合基結合。之後’將溶液放置在一 Microconi0之 離心過濾器中及在9981xg離心15分鐘或是直到過濾器乾 燥爲止。比較樣本中含有(=主要實驗)和不含有(=盲目樣本） 21 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) f --訂-------
線V 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1245121 A7 B7 五、發明說明（ 受體之色層分析之比較引導鍵結化學物質之鑑別。經二次 以結合緩衝溶液洗滌步驟後，該出現在過濾器上的複合物 經由200微升的TFA(l/49.5/49.5)處理而分離。表6 :組成物之分析 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 樣本 β2-腎上腺受體 萃取物蒲公英(10毫 結合緩衝液 (薄膜製備10/98 ;每 毫克的蛋白質含有 6.5 pmol的受體） 克/毫升之水性萃取物 ，藉由Anotop 25過 濾器(Merck)過濾） (150mM氯化鈉； 50mM 的 tris ; pH8.2) 351 0 1.5 mg ad 200 μΐ 7.5 g/1 355 1.04 pmol 1.5 pmol ad 200 μΐ 5.2 nmol/1 7.5 nmol/1 356 1.04 pmol 1.5 pmol ad 200 μΐ 5.2 nmol/1 7.5 nmol/1 360 0 0.3 mg ad 200 μΐ 1.5 g/1 361 1.04 pmol 0.3 mg ad 200 μΐ 5.2 nmol/1 1.5 g/1 362 0 0.6 mg ad 200 μΐ 3 g/1 363 1.04 pmol 0.6 mg ad 200 μΐ ~ 5.2 nmol/1 3 g/1 364 0 1.0 mg ad 200 μΐ I 1 訂 22 Φ 線
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1245121 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、 發明說明（/) —>—-— 5.0 g/1 365 1.04 pmol 1.0 mg ad 200 μΐ 5.2 nmol/1 5.0 g/1 366 1.04 pmol 1.5 mg ad 200 μΐ 5.2 nmol/1 7.5 g/1 367 1.04 pmol 1.5 mg ad 200 μΐ 5.2 nmol/1 7.5 g/1 369 1.04 pmol 1.5 mg ad 200 μΐ 5.2 nmol/1 7.5 g/1 373 1.04 pmol 1.5 mg ad 200 μΐ 5.2 nmol/1 7.5 g/1 374 0.52 pmol 1.5 mg ad 200 μΐ 2.6 nmol/1 7.5 g/1 375 0.26 pmol 1.5 mg ad 200 μΐ 1.3 nmol/1 7.5 g/1 從下列4個過濾步驟中之洗出物在真空下離心直到乾 燥爲止，且該獲得之物質藉由含有10微升的HPLC(如實二 施例1)之移動相的超音波溶解，這是在LC分析不久之前 進行。 23 «i-------- ·111111 線丨# (請先閱讀背面之注意1»頃再滇寫本Js) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1245121 A7 B7 五、發明說明（y\ ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 表7 :結果 樣本 物質 濾液 第一次洗滌 第二次洗滌 遊離 [nmol/11 [nmol/11 [nmol/11 [nmol/1] 351 L3 740.3 51.0 8.0 11.9 L6 5970.7 15045 750.8 195.0 L7 3802.1 748.2 145.5 22.7 355 L3 353.5 88.8 12.9 15.8 L6 1482.0 451.4 100.4 707.0 L7 1539.6 909.9 180.4 214.5 356 L3 961.9 79.0 9.9 26.3 L6 1848.6 600.1 202.1 2199.1 L7 2183.1 1117.4 295.9 510.7 360 L3 411.5 22.7 0 8.1 L6 2935.2 468.9 140.3 34.7 L7 1268.8 129.6 6.6 8.6 361 L3 537.0 16.5 29.6 11.2 L6 1588.2 146.5 124.3 138.1 L7 1268.8 129.6 6.6 8.6 362 L3 650.1 20.5 5.6 3.2 L6 3446.6 958.0 351.4 85.4 L7 1423.2 176.5 33.7 7.5 — 363 L3 736.9 54.4 0 8.7 L6 1180.6 248.3 142.0 257.0 24 本紙張尺度適用申國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) f 丨訂---------線
1245121 A7 B7 五、發明說明（〆） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 L7 1740.7 76.4 104.2 16.9 364 L3 1034.4 36.9 3.0 5.3 L6 3752.4 1377.0 627.8 151.3 L7 1829.6 92.7 30.1 89.6 365 L3 1221.4 51.7 8.6 9.8 L6 2291.6 626.7 141.6 439.6 L7 2746.8 74.0 11.2 111.9 366 L3 2088.5 102.8 2.3 7.6 L6 5581.8 620.0 181.5 504.8 L7 4261.6 1425.3 213.1 168.2 367 L3 2310.8 46.2 15.6 6.3 L6 5159.0 832.5 274.6 616.8 L7 6243.7 1509.0 199.2 232.9 369 L3 2381.4 90.8 41.8 7.0 L6 7449.7 478.1 341.9 674.0 L7 3505.8 986.8 221.7 378.7 373 L3 2450.0 91.7 26.6 36.2 L6 5562.6 182.7 277.1 2096.1 L7 4900.2 1176.5 285.4 847.8 374 L3 2593.2 44.0 7.4 25.3 L6 8589.0 1062.4 476.6 1015.4 - L7 5661.6 627.7 200.9 538.8 375 L3 2252.1 39.7 19.6 19.0 25 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ΐ 訂---------線

Claims (1)

1245121 v - C8 -D8 六、申請專利範圍 1、 一種自包含複數個活性及不活性化學物質之混合物 中分離及鑑別至少一種活性化學物質的方法，該混合物係 爲天然產物之萃取物或獲自合成或組合化學之物質庫，該 方法特徵在於下列步驟： a) 添加一標的物至該混合物中且形成一標的物及該混 合物中至少一種活性化學物質之複合物，其中該化學物質 之相對分子質量係小於該標的物之分子質量， b) 藉由過濾、超過濾、離心、超離心、平衡滲析、凝 膠過濾或沈澱自該混合物之不活性化學物質中分離該複合 物，及任選一種 c) 自該經分離的複合物中游離、分離及鑑別至少一種 活性化學物質，或 d) 藉由自活性及不活性化學物質之混合物的色譜扣除 不活性化學物質之混合物的色譜以鑑別該混合物中至少一 種活性化學物質，該活性化學物質係在分離複合物、及自 該經分離的複合物中可能地游離及分離至少一種活性物質 後而獲得。 2、 如申請專利範圍第1項之方法，其特徵在於該添加 標的物至該化學物質之混合物係於一溶液、一懸浮液或一 分散液中進行。 3、 如申請專利範圍第2項之方法，其特徵在於該添加 係於一水性溶液中進行。 4、 如申請專利範圍第3項之方法，其特徵在於該水性 溶液之pH値係以一適當的緩衝溶液幫助其穩定。 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格(210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
C8 D8 六、申請專利範圍 5 '如申請專利範圍第1至4項中任一項之方法，其特 徵在於該複合物係藉由在至少一種活性化學物質和標的物 間之一'鍵所產生。 6、 如申請專利範圍第5項之方法，其特徵在於該鍵是 一非共價鍵。 7、 如申請專利範圍第6項之方法，其特徵在於該非共 價鍵係藉由氫橋、靜電相互作用、金屬複合作用、活性化 學物質之親油性基團與標的物之相互作用、偶極-偶極相互 作用、或陽離子7Γ相互作用所形成。 8、 如申請專利範圍第1至4項中任一項之方法，其特 徵在於該經分離之複合物之至少一種活性化學物質之分離 及/或鑑別係藉由方法如HPLC、電子色層分析、電泳，偶 合技術如LC-MS或MS-MS完成，較佳的是藉由微毛細管 (micro-capillary)或奈-HPLC(nano-HPLC)完成。 9、 如申請專利範圍第1至4項中任一項之方法，其特 徵在於該混合物之至少一種活性化學物質之鑑別係藉由方 法，例如，HPLC、電子色層分析、電泳，偶合技術如LC-MS或MS-MS完成，較佳的是藉由微毛細管（micro_ capillary)或奈-HPLC(nano-HPLC)完成。 10、 如申請專利範圍第1至4項中任一項之方法，其 特徵在於該自混合物分離至少一種活性化學物質係藉由準 備的HPLC，電子色層分析或電泳進行。 11、 如申請專利範圍第1至4項中任一項之方法，其 特徵在於該化學物質之混合物係爲天然產物之化學修飾萃 2 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297 ;釐) (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁)
2 11 45 2 A8B8C8D8 六、申請專利範圍 取物。 12、 如申請專利範圍第1至4項中任一項之方法，其 特徵在於該化學物質之混合物係爲不同天然產物萃取物之 混合物。 13、 如申請專利範圍第1至4項中任一項之方法，其 特徵在於該活性及不活性化學物質之混合物包含至少50種 不同的化學物質。 14、 如申請專利範圍第1至4項中任一項之方法，其 特徵在於該標的物是一種蛋白質。 15、 如申請專利範圍第1至4項中任一項之方法，其 特徵在於該標的物是一種酵素、一種受體、一種抗體、一 種生物薄膜或一種細胞。 16、 如申請專利範圍第15項之方法，其特徵在於該 標的物是一種酵素凝血酶。 17、 如申請專利範圍第15項之方法，其特徵在於該 標的物是胰蛋白酶。 18、 如申請專利範圍第15項之方法，其特徵在於該 標的物是β2-腎上腺素受體。 3 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
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