ES2222230T3

ES2222230T3 - Procedimiento y dispositivo para detectar y aislar compuestos farmacologicos contenidos en mezclas de sustancias.

Info

Publication number: ES2222230T3
Application number: ES00960653T
Authority: ES
Inventors: Jana Institut Fur Pharmazeutische Chemie Lenz; Rudolf Inst. Fur Pharmazeutische Chemie Matusch; Hans Rainer Hoffmann
Original assignee: LTS Lohmann Therapie Systeme AG
Current assignee: LTS Lohmann Therapie Systeme AG
Priority date: 1999-09-22
Filing date: 2000-09-13
Publication date: 2005-02-01
Anticipated expiration: 2020-09-13
Also published as: TR200200779T2; JP2003510569A; HU227662B1; EP1214589A1; US7232690B1; DE19945351A1; MXPA02002992A; TWI245121B; IL148823A0; CZ2002990A3; PL202679B1; CA2387999C; AU777927B2; ATE268474T1; KR100676154B1; CN100420945C; DE19945351C2; AU7286700A; EP1214589B1; DK1214589T3

Abstract

Procedimiento para la identificación de al menos una sustancia química activa en una mezcla de sustancias químicas activas e inactivas con masas molares de 150 a 30000, caracterizado por los pasos: a) adición de una sustancia diana a esta mezcla y formación de un complejo de sustancia diana y al menos una sustancia química activa de la mezcla, efectuándose la adición de la sustancia diana a la mezcla de sustancias químicas en una solución, en una suspensión o en una dispersión, b) separación del complejo de las sustancias químicas inactivas de la mezcla, mediante filtración, ultrafiltración, centrifugación, ultracentrifugación, diálisis de equilibrio, filtración por gel o precipitación, y o bien, c) liberación, aislamiento e identificación de al menos una sustancia química activa del complejo separado o bien d) identificación de al menos una sustancia activa de la mezcla, mediante el establecimiento de la diferencia entre un cromatograma de la mezcla de sustancias químicas activas e inactivas y un cromatograma de la mezcla de sustancias químicas inactivas, obtenida después de la separación del complejo.

Description

Procedimiento y dispositivo para detectar y aislar compuestos farmacológicos contenidos en mezclas de sustancias.

La investigación de los medicamentos se ha desarrollado, partiendo del aprovechamiento exclusivo de fuentes naturales, pasando por la síntesis química de principios activos y su examen mediante ensayos con animales, hasta el diseño estructural selectivo de principios activos, apoyado por ordenadores, con la ayuda del uso de procedimientos experimentales y teóricos.

Por el conocimiento creciente de las diversas causas de enfermedades (por ejemplo, la falta o la alteración genética de una proteína), la investigación en el campo de los medicamentos y la terapia con medicamentos se han vuelto considerablemente más complejas. Así, en los últimos diez años, mediante procedimientos de biología molecular (Proyecto de genoma humano) pudieron esclarecerse las causas genéticas de algunas enfermedades neurodegenerativas primarias, como del Mal de Alzheimer, del Mal de Parkinson, del Mal de Huntington, de la esclerosis lateral amiotrófica, de las enfermedades causadas por priones y diversos síndromes atáxicos. Este reconocimiento de las alteraciones biológicas en las que se basan las enfermedades representa el fundamento para un cambio de una terapia sintomática, paliativa, por una terapia causal.

De 100 a 150 de las aproximadamente 30000 enfermedades descritas en la medicina son tan relevantes que son apropiadas para ser proyectos de investigación para la industria farmacéutica. Los medicamentos que están a disposición hoy en día apuntan hacia una influencia terapéutica de aproximadamente 400 receptores, enzimas y otras bio-moléculas. Sin embargo, se parte del hecho de que se tienen en cuenta hasta 10000 genes y sus productos como sustancia diana en la investigación de principios activos. La comprobación de su relevancia patológica, entre otras cosas, requiere sistemas moleculares y celulares de gran valor informativo.

Además del diseño racional, que incluye la optimización de propiedades de sustancias basada en valores experimentales o en estructuras moleculares conocidas, hoy en día la química combinatoria y la biosíntesis combinatoria, que se encuentra en desarrollo, desempeñan un papel importante en la investigación de los medicamentos.

Un punto débil importante de estos procedimientos es la diversidad limitada de sustancias sintéticas, en comparación con la complejidad estructural de metabolitos secundarios vegetales y microbianos.

Para poder esclarecer esta multiplicidad natural, es indispensable una unión íntima de la investigación clásica de las sustancias naturales con la medicina molecular y la química orgánica. En la búsqueda de nuevas estructuras guías, se realiza la selección de organismos animales y vegetales, así como de los hongos y microorganismos mediante el principio del azar, desde puntos de vista quimio-taxonómicos, basados en observaciones ecológicas y basados en conocimientos previos de etnomedicina.

Sin embargo, la detección de uno o varios componente(s) activo(s) entre mezclas de sustancias como, por ejemplo, a partir de bibliotecas de sustancias, obtenidas mediante química combinatoria, o a partir de extractos de sustancias naturales, es muy costosa.

Los extractos de sustancias naturales, por ejemplo, generalmente están compuestos por un gran número (hasta 2000) de las sustancias más diversas, que comprenden todo el ámbito de polaridades, lo que está condicionado por las más diferentes estructuras básicas y grupos funcionales. Normalmente, aquí sólo relativamente pocos compuestos ya suman aproximadamente el 80% del peso del extracto, mientras que la mayoría de los compuestos restantes, sin embargo, están en concentración baja, hasta el intervalo de las ppm, es decir, se encuentran en proporción no equimolar. Con frecuencia, en tal extracto sólo pocos o incluso sólo una única sustancia presenta la actividad biológica característica, pudiendo deberse esta actividad a una sustancia que se encuentra en el extracto sólo en forma de traza.

Hasta ahora, el tratamiento y el análisis de las sustancias componentes de un extracto natural, separadas la mayoría de las veces mediante cromatografía, o de una biblioteca voluminosa de sustancias, obtenida mediante química combinatoria, normalmente se realiza mediante el uso de sistemas automáticos de análisis con rendimiento de muestras extremadamente alto [HTS por sus siglas en inglés "high-throughput screening" (examen de alto rendimiento);]. Sin embargo, este procedimiento es muy complicado y costoso. Así, es necesario preparar en primer lugar extractos selectivos con disolventes de polaridad creciente, a partir de la fuente de sustancias naturales (por ejemplo, plantas, animales, hongos, microorganismos), y ensayarlos de manera biológica. Otros ensayos se realizan después de la formación de sub-fracciones del respectivo extracto activo selectivo.

Finalmente, un último ensayo debe mostrar, cuál(es) sustancia(s) pura(s), después del aislamiento desde la fracción activa, manifiestan actividad biológica y de esta manera representen un acierto. Para la división cromatográfica en sub-bibliotecas y su análisis, respectivamente se necesitan varias semanas. Para poder obtener cantidades suficientes de sustancia(s) pura(s), por ello debe comenzarse con grandes cantidades de extractos. También esto conlleva altos costos, de columnas de HPLC preparativa y gran consumo de disolventes (costos tanto de adquisición como de desecho).

Ya por la división en sub-fracciones, pero con mayor razón mediante el aislamiento de las sustancias naturales puras, mediante el examen de alto rendimiento se pierden efectos sinérgicos o antagónicos, eventualmente presentes, de los componentes individuales del extracto. Así, un extracto que manifiesta actividad en el primer ensayo puede perder su actividad biológica, porque la división inhibe la formación de un enlace de algunas sustancias individuales a una sustancia diana, que sólo era posible por la acción conjunta de diversos componentes.

Un procedimiento para hallar componentes activos entre una biblioteca sintética de péptidos, obtenida mediante química combinatoria, que está compuesta por 19 péptidos químicamente muy similares, presentes en cantidades equimolares, que resultan sólo mediante el intercambio de aminoácidos, es descrito por Zuckermann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4505-4509 (1992). Para ello, se adicionó un anticuerpo en defecto a una de tales bibliotecas de sustancias de péptidos y se separó el complejo sustancia diana (=anticuerpo)- péptido mediante filtración rápida por gel. Se libera el péptido del complejo mediante ácido trifluoroacético al 1% y se esclarece la estructura mediante espectroscopia de masas y análisis de aminoácidos. Pero este procedimiento no es apto para el aislamiento de complejos de moléculas diana más pequeñas (de peso molecular menor o igual que 1500), porque la filtración por gel sólo funciona técnicamente con diferencias mayores de pesos moleculares. Según dicen los autores, también requiere mezclas equimolares. Además, la determinación de combinaciones de ligandos de efecto sinérgico es imposible, o está librado al azar.

También los experimentos descritos por Wieboldt et al. en Anal. Chem., 69, 1683-1691 (1997) están dirigidos a mezclas equimolares de 20 a 30 moléculas estrechamente emparentadas (derivados preparados sintéticamente, con una estructura general de 1,4-benzodiazepina). Aunque la diversidad limitada de las sustancias sintéticas facilita el tratamiento experimental, al mismo tiempo representa un factor limitante para su aplicabilidad.

La espectrometría de masas de ultrafiltración impulsada, descrita por R. B. van Bremen et al. en Anal. Chem., 69, 2159-2164 (1997), también necesita una biblioteca de sustancias equimolar con 20 sustancias. Como sólo se libera con disolventes orgánicos, no pueden detectarse sustancias de enlace covalente.

Por ello, el objetivo de la presente invención es el desarrollo de un procedimiento fácilmente realizable y eficiente para la detección y el aislamiento de sustancias y combinaciones de sustancias químicas biológicamente, por ejemplo, farmacológicamente activas, en particular, a partir de mezclas no equimolares como extractos de sustancias naturales (por ejemplo, de plantas, animales, hongos, microorganismos).

Se alcanza el objetivo mediante un procedimiento que está caracterizado por los siguientes pasos:

a): adición de una sustancia diana a una mezcla de sustancias químicas, por ejemplo, un extracto de sustancias naturales,

b): formación de al menos un complejo de la sustancia diana y al menos una sustancia química activa, enlazándose esta sustancia química a la sustancia diana,

c): separación de las sustancias químicas no enlazadas de la mezcla, del al menos un complejo y, dado el caso, su determinación analítica (por ejemplo, por cromatografía) (=ensayo principal).

Las sustancias que se presentan adicionalmente o en concentraciones mayores, que se pueden detectar en un ensayo separado sin sustancia diana (ensayo en blanco), representan la suma de todas las sustancias enlazadas por la sustancia diana. Éstas son aisladas y se esclarece su estructura.

Pero como pasos siguientes para el tratamiento del complejo también pueden tenerse en cuenta:

d): la liberación de la al menos una sustancia química activa enlazada en el complejo a la sustancia diana, destruyendo el enlace entre la sustancia química activa y la sustancia diana en el complejo, la

e): separación de la al menos una sustancia química activa liberada y la

f): identificación de la al menos una sustancia química activa separada y, dado el caso, la comparación con la(s) sustancia(s) identificada(s) en el paso c).

Por sustancia diana biológica se entiende una proteína (por ejemplo, un receptor, una enzima, un anticuerpo), una membrana biológica o una célula entera (sana o cancerosa). Por el contacto, en particular, por el enlace entre una sustancia química activa adecuada con esta sustancia diana, puede producirse el desencadenamiento de una reacción que es característica para la sustancia diana y en la mayoría de las veces está conectada con un proceso bioquímico. En otras palabras: la sustancia química activa posee una fuerte afinidad por la sustancia diana especial. Ejemplos de tales sustancias diana son las proteínas trombina, tripsina y el adreno-receptor \beta_{2}.

Como "sustancia química" se tienen en cuenta prácticamente todas las sustancias uniformes conocidas de la química orgánica y la química de las sustancias naturales. A éstas pertenecen sustancias químicas de bajo peso molecular y de alto peso molecular, pero no polímeros de un número desconocido de unidades monoméricas. El experto conoce tales sustancias químicas uniformes de la química orgánica. A éstas pertenecen hidrocarburos alifáticos, aromáticos y cíclicos y compuestos con grupos funcionales, como ácidos carboxílicos, alcoholes, ésteres, aldehídos, lactonas, amidas, heterociclos, isoprenoides, terpenos, hidratos de carbono, esteroides, etc. También pueden tenerse en cuenta glucósidos, péptidos, proteínas y enzimas como sustancia química apropiada.

Las masas moleculares de sustancias químicas uniformes apropiadas en general se encuentran por encima de
M_{r} = 150. Así, por ejemplo, los neurotransmisores conocidos acetilcolina [H_{3}CCO-O-CH_{2}-CH_{2}-N(CH_{3})_{3}]OH y nicotina poseen masas moleculares M_{r} = 163 o M_{r} = 162 y así describen prácticamente el límite inferior de la masa molecular de las sustancias químicas apropiadas. En principio, el límite superior de la masa molecular no está fijado. Así, proteínas de alto peso molecular (M_{r} de hasta aproximadamente 300000), debido a su reacción específica con sustancias diana biológicas muy especiales, verdaderamente son sustancias químicas activas uniformes interesantes, que mediante el procedimiento conforme a la invención pueden ser separadas de una mezcla de diversas sustancias químicas.

Biopolímeros no uniformes como, por ejemplo, glucógeno, celulosa, etc. no se tienen en cuenta para el procedimiento conforme a la invención porque no representan sustancias químicamente uniformes en el sentido de la presente invención, debido a que presentan un número indefinido de unidades monoméricas.

En el caso de las sustancias químicas, además se debe distinguir entre sustancias químicas activas e inactivas. Por sustancia química activa debe entenderse aquélla que es capaz de enlazarse a una sustancia diana especial y de desencadenar una reacción característica para ésta. Una sustancia química activa se caracteriza porque posee una afinidad hacia la sustancia diana. Una sustancia química inactiva no necesita poseer afinidad hacia la sustancia diana.

Por ello, no puede fijarse un límite superior preciso de la masa molar de la sustancia química que se tiene en cuenta. Más bien, esencialmente sólo se establece la facilidad del tratamiento por la relación de la masa molar de la sustancia química reactiva respecto a la masa molar de la sustancia diana. La masa molar de esta sustancia diana en general es muy alta y puede encontrarse, por ejemplo, por encima de 1 millón. Como hemos dicho, la sustancia diana también puede ser una célula entera. Sustancias químicas con masa molar baja (aproximadamente 150 a 30000) pueden separarse fácilmente de tales sustancias diana, mediante procedimientos convencionales como ultra-centrifugación, debido a la gran diferencia entre las masas. Pero si la masa molar de la sustancia química activa y la masa molar de la sustancia diana se encuentran en órdenes de tamaño comparables, la ultra-centrifugación también sólo da resultados de separación no satisfactorios y deben usarse procedimientos de separación más exigentes, o procedimientos
adicionales.

Por "mezcla de sustancias químicas" debe entenderse una mezcla de diversas sustancias químicas que al menos contienen una sustancia química que cumpla con el criterio enunciado anteriormente, es decir, que sea capaz de desencadenar una reacción al entrar en contacto con una sustancia diana particular. La mezcla también puede contener varias de tales sustancias químicas activas. Además, la mezcla también puede contener sustancias químicas que no pueden desencadenar ninguna reacción en la sustancia diana biológica. Normalmente, las sustancias químicas inactivas representan la parte principal en la mezcla de diversas sustancias químicas. En particular, las sustancias químicas inactivas contenidas en una mezcla de sustancias químicas sólo son inactivas respecto a una sustancia diana especialmente seleccionado, pero realmente son capaces de desencadenar una tal reacción con otra sustancia diana.

En la práctica, en el caso de una mezcla de sustancias químicas, preferentemente se trata de bibliotecas de sustancias que se preparan en forma sintética o con la ayuda de la química combinatoria, o de un extracto de sustancias naturales. Por extracto de sustancias naturales, en el sentido de esta definición por tanto deben entenderse mezclas complejas de sustancias químicamente uniformes que proceden de una fuente biológica y preferentemente, se obtienen a partir de plantas, partes de plantas, como hojas, flores, madera, raíces, corteza, etc., hongos, animales, glándulas, huevos y excrementos de animales, microorganismos, etc. Esto se realiza mediante procedimientos conocidos, por ejemplo, destilación por vapor de agua, destilación seca, extracción con agua, disolventes orgánicos, inorgánicos o hipercríticos; frecuentemente también con un procesamiento químico posterior simultáneo o subsiguiente, como esterificación, saponificación, formación de sales, hidrogenación, deshidratación, isomerizaciones, alquilaciones, fermentación, degradación enzimática, etc. Los extractos de sustancias naturales así obtenidos, en cuanto a sus componentes, a veces ya no corresponden entonces a la composición que existía en la fuente biológica. Pero en general, están presentes una gran cantidad, es decir, al menos 50 sustancias químicas diferentes, entre ellas, como ya se ha dicho, numerosas están sólo en forma de trazas, es decir, en una concentración de sólo algunas ppm. Con frecuencia, en tal extracto sólo pocas, o incluso sólo una única sustancia manifiesta la actividad biológica característica, pudiéndose deber esta actividad a una sustancia que se encuentra en el extracto sólo en forma de traza. La mezcla de sustancias químicas también puede ser una mezcla de diferentes extractos de sustancias naturales; como ejemplo concreto se eligió un extracto de diente de león (Taraxacum officinale). Naturalmente, las plantas medicinales representan fuentes biológicas especialmente importantes, cuyos extractos poseen efectos fisiológicos y/o farmacológicos y en parte están nombradas en DAB y en HAB.

La "adición" de una sustancia diana a la mezcla de sustancias químicas se efectúa preferentemente en solución, suspensión o dispersión. En muchos casos puede efectuarse la adición en una solución acuosa, especialmente en una solución cuyo valor de pH se estabilice con la ayuda de un tampón apropiado. Es una ventaja especial del procedimiento aquí descrito, que antes de adicionar la sustancia diana no se efectúe una división previa de la mezcla de sustancias químicas en varias fracciones diferentes, hasta llegar a sustancias químicas puras.

Con un "complejo" se quiere decir una partícula aislable que está compuesta por la sustancia diana, a la que está enlazada al menos una sustancia química activa. Una sustancia diana también puede enlazarse con dos o varias sustancias químicas activas. Las dos o más sustancias químicas activas enlazadas a la sustancia diana en tal complejo pueden estar presentes en una relación determinada, característica entre sí, lo que en cuanto a la reacción específica de la sustancia diana especial corresponde a un efecto sinérgico. El experto, por el hecho frecuente de que como sustancia diana se usa una proteína, también se refiere a complejos de proteína-ligando.

En el complejo, la al menos una sustancia química activa está "enlazada" a la sustancia diana. Aquí la forma del enlace entre la sustancia diana y la o las sustancia(s) química(s) activa(s) en principio no tiene importancia. En forma más frecuente se presentan enlaces covalentes o no covalentes. A estos últimos pertenecen, por ejemplo, puentes de hidrógeno, interacciones electrostáticas, por ejemplo, entre grupos de cargas opuestas, formación de complejos metálicos, interacciones entre grupos lipófilos de la sustancia química activa y ámbitos hidrófobos (llamados bolsillos) de la sustancia diana, interacciones dipolo-dipolo e interacciones \Pi catiónicas. Frecuentemente, también es la combinación de diferentes interacciones la que origina la afinidad de una sustancia química activa por la sustancia diana.

La "separación" del al menos un complejo de las sustancias químicas inactivas no enlazadas, es decir, "libres" de la mezcla, fundamentalmente se efectúa mediante procedimientos usuales, seleccionándose en forma especialmente ventajosa procedimientos sin carga térmica para el complejo. A éstos pertenecen la filtración, ultrafiltración, centrifugación, ultracentrifugación, diálisis de equilibrio, filtración por gel o precipitación del complejo. La identificación de la al menos una sustancia química "activa" enlazada a la sustancia diana a veces puede efectuarse antes de la liberación de esta sustancia química del complejo, por ejemplo, mediante espectroscopia de masas de tiempo de vuelo (MALDI-TOF).

La filtración representa un procedimiento de separación especialmente rápido, sencillo y eficiente. Puede llevarse a cabo como ultrafiltración (por ejemplo, usando unidades de filtración Microcon de la empresa Amicon) o con aparatos especiales de filtración (por ejemplo, recolectores de células Brandel).

Pero la "liberación" de la al menos una sustancia química activa del complejo facilita su detección, su aislamiento y, en particular, su caracterización química. Se realiza, a continuación, del paso de separación, después de dos o más pasos de lavado para eliminar sustancias adsorbidas inespecíficamente. De esta manera, se logra la liberación de las sustancias químicas activas enlazadas del complejo. Aquí se disuelve nuevamente el enlace que existe en el complejo entre la sustancia diana y la al menos una sustancia química activa. Para ello, se usan procedimientos físicos o químicos, dependiendo de la naturaleza del enlace. Esto puede efectuarse, por ejemplo, mediante una solución ácida acuosa de alcanol inferior, preferentemente, con una mezcla de ácido trifluoroacético/ metanol/ agua, por ejemplo, de la composición 1/ 49,5/ 49,5 (% en volumen).

Puede prescindirse del paso de liberación cuando no sea necesaria una identificación de la sustancia química activa o cuando se identifica el complejo como tal. Se debe prescindir de la liberación cuando la sustancia activa se alteraría en las condiciones de la liberación o no se dejara separar mediante la solución de liberación. Esto principalmente es el caso de algunos enlaces covalentes. En estos casos se efectúa la identificación de la sustancia química activa por la diferencia de los filtrados con sustancia diana (=ensayo principal) y sin sustancia diana (ensayo en blanco). Este procedimiento permite abarcar simultáneamente todas las sustancias químicas activas enlazadas a la sustancia diana, mientras que de la liberación normalmente sólo resultan pocas (por ejemplo, una a tres) sustancias químicas activas y además no se puede estar seguro si están inalteradas.

Las sustancias adicionales o las sustancias en concentración más alta, que aparecen en el ensayo en blanco, representan las sustancias químicas potencialmente activas. Pueden aislarse de la mezcla de sustancias químicas (por ejemplo, del extracto de sustancias naturales) mediante cualquier procedimiento de separación (por ejemplo, cromatografía), también en cantidades mayores.

La "separación" de la al menos una sustancia química activa liberada de la sustancia diana, después de destruir el enlace existente en el complejo, puede efectuarse mediante los mismos procedimientos fundamentalmente conocidos que ya fueron nombrados. También aquí preferentemente se usan los procedimientos más sencillos y convenientes, es decir, filtración, y centrifugación. La separación de la(s) sustancia(s) química(s) activa(s) también puede efectuarse mediante HPLC preparativa.

La "identificación" de las sustancias que aparecen adicionalmente o en concentración más alta en el ensayo en blanco y de la al menos una sustancia química activa separada se efectúa mediante procedimientos usuales como HPLC, por ejemplo, HPLC analítica convencional, micro-HPLC, HPLC capilar o nano-HPLC, o por electrocromatografía, electroforesis o técnicas de acoplamiento de CL (cromatografía líquida)-EM o EM-EM. Pero la identificación de la(s) sustancia(s) química(s) activa(s) mediante los procedimientos nombrados también puede efectuarse ya antes de su liberación del complejo.

El procedimiento conforme a la invención se diferencia fundamentalmente del examen conocido de alto rendimiento y, a saber, esencialmente porque por la formación selectiva de un complejo a partir de una sustancia diana y al menos una sustancia química activa y la subsiguiente separación de las sustancias químicas inactivas no enlazadas (ensayo principal) y la diferencia con el ensayo en blanco, mediante esta sustancia diana especial apropiada pueden aislarse e identificarse una única o algunas pocas sustancias químicas activas que se enlazan a la correspondiente proteína (llamadas "ligando"), entre una biblioteca de sustancias o entre una mezcla compleja de sustancias naturales.

En lugar de aislar individualmente cada sustancia química potencialmente interesante y conducirlas hacia la sustancia diana, se presenta ésta a la mezcla de sustancias. Los complejos que se forman después del reconocimiento, correspondiendo al principio de Emil Fischer de "llave-cerradura" son separados, por ejemplo, mediante ultrafiltración, de las sustancias químicas de peso molecular bajo, no enlazadas y se identifican mediante cromatografía comparativa (muestra sin sustancia diana [ensayo en blanco] versus muestra con sustancia diana [=ensayo principal]). Para la confirmación de los resultados entonces se liberan adicionalmente los ligandos (las sustancias químicas activas) de los complejos, mientras sean estables y liberables, se identifican mediante procedimientos usuales, se aíslan y se esclarecen sus estructuras mediante los procedimientos habituales de análisis.

El procedimiento conforme a la invención no requiere grandes cantidades de proteína ni de extracto, porque se reducen las escalas por usar micro-métodos en el análisis, bajos volúmenes de disolvente, no requiere sub-fraccionamientos que insumen mucho tiempo, y posibilita el descubrimiento de combinaciones de sustancias de efecto sinérgico. Puede prescindirse de marcaciones radioactivas y fluorescentes. Desde luego, el procedimiento conforme a la invención también posibilita el tratamiento de cantidades mayores de extracto, pudiéndose "pescar" sustancias químicas activas cuyas propiedades sean indeseables para el uso subsiguiente de este extracto.

El procedimiento puede usarse ventajosamente si a partir de cantidades mayores de tales extractos deben "pescarse" sólo las sustancias químicas activas que manifiesten una interacción con la respectiva sustancia diana. La al menos una sustancia química activa separada entonces puede ser usada posteriormente, en lugar de la mezcla de sustancias naturales, como principio activo de un medicamento. Esto también es importante cuando más de una sustancia química activa del extracto de sustancias naturales forma un complejo con la sustancia diana y la relación de las cantidades de las más de una sustancias químicas activas entre sí desempeñe un papel relevante para el efecto biológico del extracto de sustancias naturales (efecto sinérgico).

Por ello, una ventaja de este procedimiento también consiste en la posibilidad de identificar combinaciones activas de sustancias (sinérgicas) que no son accesibles en el examen de alto rendimiento de sustancias individuales.

Finalmente, en forma inesperada, con la ayuda de este procedimiento también pudo desplazarse el límite de detectabilidad para sustancias químicas activas al intervalo de valor de K_{i} micromolar, es decir, se pudieron detectar complejos de una sustancia diana y una sustancia química activa con un valor de K_{i} de 1,7 \muM.

Los siguientes ejemplos sirven para la representación concreta del procedimiento conforme a la invención.

Ejemplo 1 Aislamiento de una sustancia inhibidora de trombina del tipo de 4-amidino-fenilalanina, a partir de una biblioteca de sustancias seleccionada a propósito

Como sustancia diana se usó la serina proteasa trombina. Como sustancias de la biblioteca de sustancias (de la mezcla de sustancias químicas "inactivas" en el sentido de la definición anterior) se seleccionaron las siguientes cinco sustancias medicamentosas y, a saber, teniendo en cuenta su hidrosolubilidad, sus máximos de absorción y su separabilidad por cromatografía.

1.: El agonista del adreno-receptor \alpha_{2} de acción central, clorhidrato de clonidina

2.: el mucolítico clorhidrato de bromhexina

3.: el antidepresivo tricíclico clorhidrato de amitriptilina

4.: el neuroléptico del tipo de fenotiazina, clorhidrato de clorpromazina

5.: el neuroléptico del tipo de fenotiazina, clorhidrato de clorprotixeno.

Como sustancia inhibidora de trombina (la sustancia química activa) se usó el compuesto CRC 220 de la empresa Behring (Marburg, K_{i} = 2,5 nM) con la siguiente fórmula estructural

1

Las preparaciones de ensayo examinadas tenían la siguiente composición

TABLA 1

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Se realizó la incubación de la biblioteca de sustancias y del inhibidor con trombina en el transcurso de 1 hora a temperatura ambiente; disolvente: NaCl al 0,9% en H_{2}O. Mediante ultrafiltración (centrífuga) se realizó la separación de los complejos formados de proteína-ligando. Todos los procesos de filtración y/o lavados fueron realizados hasta la sequedad de los filtros.

Filtro: Microcon 10 (Amicon)

Condiciones de centrifugación: 9981 x g, temperatura ambiente

Pasos de lavado: 2 veces con sendos 150 \mul de NaCl al 0,9% en H_{2}O, 4ºC.

Después de la ultrafiltración y del análisis del filtrado siguieron pasos de lavado y la liberación del ligando (de la sustancia química activa) del complejo proteína-ligando remanente en el filtro, por tratamiento con 200 \mul de agua/ metanol/ TFA (49,5/ 49,5/ 1), a temperatura ambiente.

El ensayo en blanco (sin trombina) fue tratado de manera análoga en todos los pasos, de manera que fuera posible una comparación de los filtrados. Los filtrados obtenidos en todos los pasos fueron secados mediante Speed-VAC Concentrator y luego fueron disueltos en el eluyente correspondiente de HPLC en cantidad definida, usando ultrasonido y sacudimiento.

Se efectuó la identificación de los ligandos mediante HPLC analítica: fase estacionaria: Hypersil C 18 BDS; 3 \mum, 150* 0,3 mm; Fusica (LC Packings)- fase móvil: acetonitrilo/ agua/ TFA (35/ 65/, 01), isocrático, 5 \mul/ min, \lambda = 230 mm. Los resultados están representados en la figura 2.

La diferencia entre el ensayo principal y el ensayo en blanco es CRC 220 como compuesto químico activo. Como el clorhidrato de clonidina (4,6 min) no se presenta ni en el ensayo principal ni en el ensayo en blanco, no es ligado por la sustancia diana, sino por el filtro. No es inhibidor.

Ejemplo 2 Enlace de mezclas no equimolares de amidino-fenilalaninas de fuerzas diferentes de enlace a tripsina

Como sustancias químicas se usaron las sustancias inhibidoras de tripsina del tipo de 3-amidino-fenilalanina, reproducidas a continuación mediante sus fórmulas estructurales, y se usó la serina proteasa tripsina como sustancia diana.

TABLA 3

3

TABLA 4

4

Se efectuaron los ensayos como está descrito en el ejemplo 1.

TABLA 5

5

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Ejemplo 3 Aislamiento e identificación de sustancias naturales a partir de extracto de Taraxacum

Sustancias usadas para los ensayos:

a): Extracto de Taraxacum spir. sicc. (extracto seco de sustancias naturales de la empresa Caelo). Preparación de soluciones acuosas:

-: suspensión de los extractos secos en agua (0,2 g en 20 ml)

-: tratamiento durante 5 min en baño de ultrasonido, dejar en reposo durante 30 min sacudiendo ocasionalmente

-: filtración a través de un filtro de membrana (0,7 \mum), a continuación, a través de un filtro Anotop 25 (0,02 \mum)

-: detección de taninos, mediante FeCl_{3}, Pb(CH_{3}COO)_{4} y gelatina: negativo

b): Adreno-receptor \beta_{2} (= sustancia diana)

-: Preparación de membrana a partir de células de insectos Sf9, que habían estado infectadas durante 3 días con un Baculovirus de receptor adrenérgico \beta_{2} recombinante (células y virus, construcción de plásmidos, aislamiento del Baculovirus recombinante y preparación de las membranas: MPI für Biophysik, Abt. für Molekulare Membranbiologie, Frankfurt/Main, Dr. Helmut Reiländer) [H. Reiländer, Febs letters, 282, 441-444 (1991)].

En los ensayos se combinaron el extracto de Taraxacum y la preparación de membrana en diferentes relaciones estequiométricas, disueltas en 200 \mul de tampón de enlace (150 mM de NaCl, 50 mM de tris, pH 8,2 en agua).

El enlace de receptor-ligando fue completado mediante una incubación de la mezcla durante 30 minutos, a 30-34ºC. Luego se colocaron las soluciones sobre un filtro centrífugo Microcon 10 y se centrifugó a 9981 x g durante 15 min o, en su caso, hasta la sequedad del filtro. La comparación de los cromatogramas de las muestras con (= ensayo principal) y sin receptor (= ensayo en blanco) condujo a la identificación de las sustancias químicas enlazadas. Después de dos pasos de lavado con tampón de enlace, fueron separados los complejos que se hallaban en el filtro, mediante el tratamiento con 200 \mul de TFA (1/ 49,5/ 49,5).

TABLA 6

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Los eluatos de los siguientes cuatro pasos de filtración fueron centrifugados al vacío hasta sequedad y se disolvieron mediante ultrasonido las sustancias obtenidas en 10 \mul de la fase móvil de la HPLC (véase el ejemplo 1) poco antes del análisis por CL.

TABLA 7

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Se pudieron identificar los tres ligandos "pescados", es decir, los ligandos obtenidos por formación de un complejo y subsiguiente liberación del complejo (L3 = ácido trans-caftárico, L6 = ácido trans-chicórico y L7 = éster trans-diferoílico de ácido tartárico), mediante UV, RMN ^{1}H y EM.

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Descripción de las figuras

La figura 1 muestra una representación simbólica de la formación del al menos un complejo. A una mezcla de 1000 sustancias diferentes químicamente uniformes en forma no equimolar (entre ellas cuatro activas) se adiciona una sustancia diana. Se forman cuatro complejos diferentes que respectivamente contienen enlazada una de las sustancias químicas activas. Las 996 sustancias inactivas pueden separarse entonces de los complejos mediante ultrafiltración.

Significados:

1 = sustancia diana

2 = diversas sustancias químicas activas

3 = diversas sustancias químicas inactivas (puntos)

4 = diversos complejos con al menos una sustancia química activa

La figura 2 muestra:

A) una mezcla de sustancias químicas con el inhibidor CRC 220. Clorhidrato de clonidina (4,6 min), CRC 220 (6,9 min), bromhexina (12,3 min), amitriptilina (17,6 min), clorhidrato de clorpromazina (23,9 min), clorhidrato de clorprotixeno (26,9 min)

B) Filtrado sin sustancia diana (ensayo en blanco)

C) Filtrado con sustancia diana (ensayo principal)

Los cromatogramas contenidos en la figura 3 muestran:

A) Taraxacum (ensayo en blanco)

B) Taraxacum (ensayo principal)

C) Liberación de Taraxacum

La diferencia entre el ensayo en blanco y el ensayo principal muestra que están enlazadas aproximadamente 12 sustancias, mientras que por el procedimiento de la liberación sólo se pudieron detectar 3 sustancias.

Claims

1. Procedimiento para la identificación de al menos una sustancia química activa en una mezcla de sustancias químicas activas e inactivas con masas molares de 150 a 30000, caracterizado por los pasos:

a): adición de una sustancia diana a esta mezcla y formación de un complejo de sustancia diana y al menos una sustancia química activa de la mezcla, efectuándose la adición de la sustancia diana a la mezcla de sustancias químicas en una solución, en una suspensión o en una dispersión,

b): separación del complejo de las sustancias químicas inactivas de la mezcla, mediante filtración, ultrafiltración, centrifugación, ultracentrifugación, diálisis de equilibrio, filtración por gel o precipitación, y

o: bien,

c): liberación, aislamiento e identificación de al menos una sustancia química activa del complejo separado

o: bien

d): identificación de al menos una sustancia activa de la mezcla, mediante el establecimiento de la diferencia entre un cromatograma de la mezcla de sustancias químicas activas e inactivas y un cromatograma de la mezcla de sustancias químicas inactivas, obtenida después de la separación del complejo.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se efectúa la adición en una solución acuosa.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se estabiliza el valor de pH de la solución acuosa con la ayuda de un tampón apropiado.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el complejo se forma mediante un enlace entre la al menos una sustancia química activa y la sustancia diana.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque en el caso del enlace se trata de un enlace covalente o no covalente.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque en el caso del enlace no covalente se trata de puentes de hidrógeno, interacciones electrostáticas, formación de complejos metálicos, interacciones de grupos lipófilos de la sustancia química activa con la sustancia diana, interacciones dipolo-dipolo o de interacciones \Pi catiónicas.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el aislamiento y/ o la identificación de la al menos una sustancia química activa del complejo separado se efectúa mediante procedimientos como HPLC, electro-cromatografía, electroforesis, técnicas de acoplamiento como CL-EM o EM-EM, preferentemente, mediante HPLC microcapilar o nano-HPLC.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la identificación de la al menos una sustancia química activa de la mezcla se efectúa mediante procedimientos como HPLC, electro-cromatografía, electroforesis, técnicas de acoplamiento como CL-EM o EM-EM, preferentemente, mediante HPLC microcapilar o nano-HPLC.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la separación de la al menos una sustancia química activa de la mezcla se efectúa mediante HPLC preparativa, electro-cromatografía o electroforesis.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la mezcla de sustancias químicas activas e inactivas es una biblioteca de sustancias, obtenida mediante química sintética o combinatoria, o es un extracto de sustancias naturales.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la mezcla de sustancias químicas es un extracto de sustancias naturales químicamente modificado.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la mezcla de sustancias químicas es una mezcla de diferentes extractos de sustancias naturales.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la mezcla de sustancias químicas activas e inactivas contiene al menos 50 sustancias químicas diferentes.

14. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la sustancia diana es una proteína.

15. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la sustancia diana es una enzima, un receptor, un anticuerpo, una membrana biológica o una célula.

16. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la sustancia diana es la enzima trombina.

17. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la sustancia diana es la enzima tripsina.

18. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la sustancia diana es el adreno-receptor \beta_{2}.