CN1320355C - 一种苹果酒中香气物质的分析方法 - Google Patents

Abstract

一种苹果酒中香气物质的分析方法，属果味酒类分析技术领域。本发明采用顶空固相微萃取法与气相色谱质谱联用法确立了苹果酒中香气物质的分析方法，采用一种灵敏度更高的双极性75μmCarboxen-PDMS萃取头用于苹果酒中香气物质检测是一项开创性工作，本发明优化了HS-SPMS萃取参数建立了样品的处理方法和与GC-MS联用的分析方法，并在检测苹果酒香气物质数量上与传统的液液萃取法比较要多许多，是一种快速、简单、样品量少、精确灵敏、经济高效的方法，可以准确的用于苹果酒中香气物质的定量分析。

Description

一种苹果酒中香气物质的分析方法

技术领域

一种苹果酒中香气物质的分析方法，属于果味酒类分析技术领域。

背景技术

香气是苹果酒风味的重要组成部分。国外科研人员采用GC-MS和嗅闻GC流出物定性办法，已鉴定出200多种对苹果酒风味有作用的物质，其中主要是高级醇和酯类，另外有一些羰基化合物、低级脂肪酸、缩醛，内酯和萜烯等以微量存在于苹果酒中。苹果酒各组成中，α-苯乙醇及其酯类和低级脂肪酸构成苹果酒香气的基本骨架，而脂肪酸酯特别是2-甲基丁酸乙酯赋予苹果酒的苹果香。虽然苹果酒中香气物质种类繁多，但对香气起重要作用的组分比较少。一般来说，人们认为影响苹果酒香气的关键香气成分(Key flavour compounds)有：乙酸乙酯、乙酸正丁酯、乙酸异戊酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、苯甲酸乙酯、乳酸乙酯、琥珀酸乙酯、乙酸苯乙酯、异戊醇、正己醇、庚醇、α-苯乙醇等醇类、酯类2大类物质共16种香气成分。

建立苹果酒中香气成分的分析方法对于了解、调控苹果酒中香气成分的形成具有重要意义。由于苹果酒中关键香气物质种类多，浓度相差比较大，要求采用的分析方法对这些香气物质均有较好的检测能力，在常见浓度范围内有较好的线性关系，较高的灵敏度和回收率。

饮料酒中香味物质的分析通常要对香气成分进行抽提浓缩预处理。传统处理方法有液液萃取法(Liquid-Liquid Extraction)，顶空法(Head SpaceSampling)，吹扫捕集法(Purge and Trap)，同时蒸馏萃取法(Simultaneous Distillation/Extraction)和固相萃取法(Solid PhaseExtraction)。这些方法都不同程度地存在某些缺点，或花费太高，或样品量过多、耗时过多，或使用的是对人体有害的昂贵的有机溶剂，对操作者造成潜在的危害，并可能在浓缩过程中丢失香气物质。

固相微萃取(Solid Phase Microextraction，简称SPME)是二十世纪九十年代以来出现的一项新的样品处理方法。它克服了前述传统预处理方法的几乎所有的缺点，无需有机溶剂、分析样品量少、操作简单、快速、费用低，集采样、萃取、浓缩、进样于一体，能够尽可能减少被分析的香气物质的损失，并能与气相色谱、液相色谱联用。

SPME装置的关键部件是一根熔融石英纤维丝或涂有一层具有选择性固相或液相聚合薄膜的石英纤维丝，该纤维丝称为纤维头。萃取样品时，首先用纤维头从待分析基质中萃取被分析物，然后可以将固相微萃取针管插入气相色谱仪的进样器内经热解吸后分析检测，也可以将固相微萃取针插入与液相色谱相连的SPME/HPLC的接口解吸池，开启流动相洗脱样品进样分析。SPME纤维头上的薄膜根据极性分类，通常有两大类：即极性的聚丙烯酸酯(Polyacrylate，简称PA)或聚乙二醇(Polyethylene glycol，简称PEG)，非极性的聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，简称PDMS)。目前，一种灵敏度更高的双极性纤维头Carboxen-PDMS正越来越受到人们的关注。固相微萃取可用来检测气相或液相样品甚至固态样品。酒类的香气物质检测多采用顶空固相微萃取法(Head Space Solid Phase Microextraction，简称HS-SPME)。利用该法分析苹果酒中的香气物质尚未见报道。

发明内容

(1)本发明要解决的技术问题

本发明针对苹果酒中风味物质的检测，利用顶空固相微萃取法(HS-SPME)快速、简单地抽提浓缩苹果酒中挥发性成分，优化了HS-SPME萃取参数，验证了HS-SPME在苹果酒中香气物质抽提浓缩的可行性，建立了HS-SPME与GC-MS联用快速测定苹果酒中香气物质的分析方法，具有快速、简单、样品量少精确、灵敏、有效等特点。对苹果酒中多种关键香气物质均有较好的检测能力，在常见浓度范围内有较好的线性关系，较高的灵敏度和回收率。

(2)技术方案

一种苹果酒中香气物质的分析方法，采用顶空同相微萃取法与气相色谱质谱联用法，HS-SPME/GC-MS法。选定的固相微萃取条件是：萃取头75μmCarboxen PDMS；样品量，10ml苹果酒加入1ml内标2-辛醇0.18mg/10ml，NaCl 25％(w/v)，加入磁力搅拌子搅拌；吸附时间40min；吸附温度45℃；测定溶液的酒精度范围0-12％(v/v)；选定的色谱拄PEG 2M 30m。

主要试剂：

果胶酶(Pectinex 5XL)：Novo Nordisk公司；2-辛醇(2-Octanol)：Sigma公司；其他试剂均为国产色谱纯或分析纯；

主要仪器：

HS--SPME取样装置如附图所示，SPME手动进样手柄及85μmPA、100μmPDMS、75μmCarboxen PDMS萃取头(纤维头)购于上海安谱科学仪器有限公司(美国Supelco.Co制造)；气相色谱质谱联用仪：Trace MS美国Finigon质谱公司；苹果酒的酿造按徐岩等(2001年等)专利工艺酿造全汁干型苹果酒，酒精度为12％(v/v)；

香气物质的SPME萃取

萃取头的选定：

通过75μm Carboxen-PDMS、85μm PA、100μm PDMS三种纤维头对模拟苹果酒中关键香气物质组分的响应值比较，选定75μmCarboxen PDMS萃取头。

萃取头的老化：

75μmCarboxen PDMS萃取头第一次使用时在气相色谱进样口275℃老化5h，。第二次以后使用时在上述温度下老化1h。

萃取头萃取：

在15mL装有磁力搅拌器的顶空瓶中加入2.5gNaCl，10mL苹果酒，1mL内标(2-辛醇，约0.18mg/10mL)，45℃平衡10min，插入75μmCarboxenPDMS萃取纤维头，45℃吸附40min，GC解吸2min，用于GC-MS分析。

气相色谱(GC)条件：

进样量：1μL。分流方式：分流。色谱柱：PEG 2M，30m。程序升温：45℃，保持1min，以5℃/min的升温速度，至190℃，保持25min。载气：He，流速：1ml/min。检测器温度：250℃。入口温度：250℃。

质谱(MS)条件：

EI电离源，电子能量：70eV。灯丝电流：0.25mA。电子倍增器电压：1500V。扫描范围：33～450amu。离子源温度：200℃。

实验数据处理：由Xcalibur软件系统完成。

定性：未知化合物经计算机检索同时与NIST library(107kompounds)和Wiley library(320k compounds，version6.0)相匹配。

定量：选择2-辛醇为内标，它在苹果酒中的最终精确浓度18mg/10ml，以苹果酒中常见的几种代表性酸类、醇类和酯类物质测定它们对2-辛醇的相对响应因子。苹果酒中鉴定的酸类、醇类和酯类物质的浓度以相应的真实物质或结构相近的物质的相对响应因子计算。苹果酒中可能存在的缩醛类、萜烯类等其他物质以与2-辛醇质量浓度之比计算。由于苹果汁中的香气物质可能对苹果酒中的香气物质产生影响，需要研究苹果酒中香气物质在发酵过程中的变化，所以香气物质的测定要同时兼顾苹果汁中关键香气物质，己烯醛是苹果汁中特征香气物质之一。以后苹果汁中鉴定的己烯醛以结构类似物己酮对2-辛醇的相对响应因子计算。

为了减少杂质对香气成分的干扰，将苹果酒中关键香气配制在模拟苹果酒中，以含混标的模拟苹果酒为研究对象，优化了萃取条件。模拟苹果酒是含苹果酸4g/L、柠檬酸2g/L，酒精度为12％(v/v)的高纯水溶液。减少被分析物(有机物)在水溶液的可溶性，能使更多的挥发性分析物挥发至溶液的顶空，吸附到纤维头上，从而降低该方法的检测限，提高香气物质的响应值。在溶液相中加入盐(如NaCl)可达到该目的。本发明模拟苹果酒中的固相微萃取的液体样品中NaCl加入量一般为25％(w/v)。

吸附温度的决定

温度对萃取效率也有影响，以75μm Carboxen-PDMS在25、40、50℃下比较了混标中香气物质的响应值：醇类物质随温度增加，响应值增加；酯类物质中除乳酸乙酯随温度上升，响应值增加外，其他物质在40℃时响应值最高，25、50℃时均比40℃时低；温度对己酮的响应值影响不大。以含量较低的乳酸乙酯、琥珀酸二乙酯为主要依据，选择45℃为吸附温度。

吸附时间的决定

顶空固相微萃取法是一种在平衡状态测定被分析物的方法，分析物的平衡状态由分析物在系统的三相中的物质分配决定。这三相包括聚合物薄膜、顶空和水溶液。一旦被分析物在三相中达到平衡，它们在每相中的浓度为一常数。所以，要准确测定分析物在聚合物薄膜中的浓度，首先要使系统达到平衡状态。该状态可通过测定被分析物的萃取时间与响应值(峰面积)图测定。峰面积为常数时的时间为平衡时间。

在45℃下，15、25、40min比较了混标香气物质的响应值。除乳酸乙酯外，大多数香气物质在25min即达到平衡状态。但乳酸乙酯40min时的响应值是25min时的1.73倍，说明吸附时间对这种物质的影响较大，需要较长时间才能达到平衡状态，选择40min作为吸附时间。

酒精度的影响

研究苹果酒发酵过程中香气物质的变化有利于研究香气物质形成的规律，为从工艺上控制苹果酒中香气物质的形成提供理论依据。苹果酒和苹果汁中组分的主要区别是两者酒精度不同，苹果汁中不含酒精成分，苹果酒中的酒精度为12％(v/v)，酒精度的变化可能会影响纤维头对苹果汁和苹果酒中的主要香气成分的吸附。为此，在45℃，吸附40min条件下，在模拟苹果汁和苹果酒中比较了相同浓度的主要醇类、酯类、脂肪酸的响应值，对于苹果汁中的主要香气物质己烯醛，根据其结构类似物己酮在苹果汁或苹果酒中的响应值测定。模拟苹果汁是苹果酸含量为4g/L的高纯水溶液。酒精度对各类香气物质的响应值有一定影响，但影响不大，对于酯类、酸类和醛类物质，酒精度增加，相对响应值减少，减少倍数分别为1.1-1.15、1.15、1.20-1.25。对于醇类物质，相对响应值增加，增加倍数为1.05-1.25。所以该方法也可用于苹果汁中香气物质的测定。

方法有效性验证

确定了SPME萃取参数，本研究考察了在该条件下的测定方法分析苹果酒中香气物质的可行性。包括测定该方法的线性范围和回收率。线性范围是以苹果酒苹果汁中常见的香气物质，配成稍宽于苹果酒中常见浓度范围内的五个梯度，测定它们在模拟苹果酒中的线性情况。回收率的测定是在本实验室发酵完全的苹果酒中加入这几种物质，对加入和不加入香气物质的苹果酒进行测定，按照加标回收率的方法进行计算，结果可以看出，该分析方法在苹果汁、苹果酒主要香气物质常见浓度范围内有较好的线性关系，回归系数大于0.9112，回收率大于80％，是一种较快速、准确的分析方法。

(3)有益效果

本发明建立了一种快速、简单、样品量少的测定苹果酒中挥发性成分的分析方法，即顶空固相微萃取法与气相质谱联用法，具有快速，用样量少，精确，灵敏，有效等优点。该法能萃取苹果酒中的醇类、酯类、低级脂肪酸类、酮类等4类物质，表明该分析方法可较完全地萃取苹果酒中的香气物质。在苹果酒中的低级脂肪酸类、醇类和酯类等常见香气物质的浓度范围内，该分析方法呈线性关系，回归系数大于0.91，回收率大于801％说明该法可以较准确地用于苹果酒中的香气物质的定量分析。

测定溶液的酒精度在0-12％(v/v)范围内变化时，酒精度对苹果酒、苹果汁中香气物质的响应值影响不大，该方法可以用于苹果汁中香气物质的测定。

与传统的苹果酒香气萃取方法相比，固相微萃取法能萃取出其中的所有关键香气物质。而液液萃取法不能萃取其中的2-甲基丁酸乙酯、乙酸丁酯、反式乙酸己烯酯、正庚醇。固相微萃取法更适合用于苹果酒中的香气分析。

传统的苹果酒香气成分分析方法有静态顶空法、直接进样法、固相萃取法、液液萃取法。这些方法中，静态顶空法对苹果酒中的香气成分没有浓缩，所以能检测的香气物质种类少；苹果酒中含有糖类、有机酸类和多酚类等不挥发性物质，采用直接进样法会污染色谱柱；固相萃取法丢失乙酸乙酯等低沸点的苹果酒中的香气物质；液液萃取法能萃取苹果酒中的主要香气物质，是一种比较理想的香气成分预处理方法。

固相微萃取法和以戊烷∶二氯甲烷(2∶1，v/v)为溶剂的液液萃取法噶啦苹果酒中的香气成分分析结果比较表明：液液萃取法和固相微萃取法分别在苹果酒中萃取出45、33种香气物质，液液萃取法比固相微萃取多12种。虽然液液萃取法萃取的香气物质较多，但该方法多萃取的挥发性组分主要集中在挥发性较差的酯类物质(肉豆蔻酸乙酯、棕榈酸乙酯和丁二烯酸单乙酯)和脂肪酸类物质(丁酸、2-甲基己酸、十二酸、苯甲酸、9-癸烯酸)上，对于苹果酒、苹果汁香气有重要影响的关键酯类、醇类物质，液液萃取法不能萃取其中的2-甲基丁酸乙酯、乙酸丁酯、反式乙酸己烯酯、正庚醇，而固相微萃取法能萃取出其中的所有关键香气物质。要使液液萃取法萃取出其中的所有香气物质，必须加大样品量，从而增加萃取溶剂的用量，由于液液萃取溶剂之一正戊烷是一种昂贵的溶剂，增加样品量会使分析成本大量增加。所以，固相微萃取法更适合用于苹果酒中的香气分析。

附图说明

附图为HS-SPME固相微萃取装置示意图。

1.SPME手柄，2、萃取头，3、实验样品，4、搅拌子，5、恒温水浴，6、电磁搅拌器。

Claims (3)

1、一种苹果酒中香气物质的分析方法，其特征是采用顶空固相微萃取法与气相色谱质谱联用法，即HS-SPME/GC-MS法；选定的固相微萃取条件是：萃取头75μm Carboxen-PDMS；样品量，10ml苹果酒加入1ml内标2-辛醇0.18mg/10ml，NaCl重量/体积比为25％，加入磁力搅拌子搅拌；吸附时间40min；吸附温度45℃；测定溶液的酒精度体积比范围0-12％；选定的色谱柱PEG 2M 30m；

气相色谱质谱条件：色谱条件：进样量：1μl；分流方式：分流；色谱柱：PEG 2M 30m；程序升温：45℃保持1min，以5℃/min的升温速度至190℃，保持25min；载气：He，流速1ml/min；检测器温度：250℃，入口温度：250℃；质谱条件：EI电离源，电子能量为70eV，灯丝电流为0.25mA，电子倍增器电压为1500V，扫描范围为33-450amu，离子源温度为200℃。

2、根据权利要求1所述的分析方法，其特征是：75μm Carboxen-PDMS萃取头购于上海安谱科学仪器有限公司，美国Supelco.Co制造，萃取头的老化：萃取头第一次使用时在气相色谱进样口275℃老化5h，第二次以后使用时在气相色谱进样口275℃老化1h。

3、根据权利要求1所述的分析方法，其特征是75μm Carboxen-PDMS萃取头萃取：在15ml装有磁力搅拌子的顶空瓶中加入2.5g NaCl，10ml苹果酒，1ml内标0.18mg/10ml 2-辛醇，45℃平衡10min，插入75μm Carboxen-PDMS萃取头，45℃吸附40min，GC解吸2min，用于GC-MS分析。