CN1290301A - 单链双功能的糖蛋白激素 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了糖蛋白激素的单链促效剂和/或拮抗剂。这些蛋白质具有式:(1)β1－(接头1)m－α－(接头2)n－β2;或(2)β1－(接头1)m－β2－(接头2)n－α;或(3)α－(接头1)m－β1－(接头2)n－β2,式中,各β1和β2具有脊椎动物糖蛋白激素β亚基的氨基酸序列,或是该氨基酸序列的变异体;“α”指脊椎动物糖蛋白激素α亚基或其变异体;“接头”指共价相连的成分,它将β1和β2亚基与α亚基,以及将β1和β2亚基相互间隔开,从而有效地保留了所述活性;以及各m和n独立地为0或1。

Description

单链双功能的糖蛋白激素
对政府资助的确认
本发明是部分根据国立卫生研究院的NIH合同No．No1-HD-9-2922，在政府资助下完成的。政府对本发明具有一定权利。
技术领域
本发明涉及蛋白质工程领域，具体地，涉及通常为异二聚体的某些糖蛋白激素的修饰形式。本发明涉及绒毛膜促性腺激素(CG)、促甲状腺激素(TSH)、黄体生成素(LH)和促卵泡成熟激素(FSH)的经修饰的单链形式，它们能够提供两种效果或功能，或者一般能够作为天然激素的促效剂和／或拮抗剂而起作用。
背景技术
在人体中，四种重要的糖蛋白激素异(源)二聚体(LH、FSH、TSH和CG)具有相同的a亚基和不同的β亚基。这些激素中的三种也几乎存在于所有其它的脊椎动物中；而目前仅在灵长类以及怀孕母马的胎盘和尿中发现CG。
PCT申请WO90／09800(1990年9月7日出版，在此引用作为参考)描述了这些激素的许多修饰形式。一种重要的修饰是用人绒毛膜促性腺激素或其变异体的羧基端肽(carboxy terminal peptide，CTP)对β亚基进行C端延伸。也描述了这些激素的其他突变蛋白。CTP是从人绒毛膜促性腺激素β亚基的112-118位中任一位置延伸至145位的氨基酸序列。该PCT申请描述了通过保守性氨基酸置换而获得CTP延伸变异体，而不破坏CTP的改变清除特性的能力。此外，PCT专利申请WO 94／24148(1994年10月27日公布，在此引用作为参考)描述了通过在C末端以外的位置延伸或插入CTP而修饰这些激素，而且CTP片段比从112-118位延伸至145位的序列更短。
FSH的CTP-延伸型β亚基还在申请人的两篇文章中有描述：LaPolt，P．S．等人；Endocrinoloy(1992)131：2514-2520和Fares，F．A．等人，Proc Natl Acad SciUSA(1992)89：4304-4308。这两篇文章在此引用作为参考。
人绒毛膜促性腺激素异源二聚体形式的晶体结构已发表在几乎同时出版的两篇文章中。一篇是Lapthorn，A．J．等人，Nature(1994)369：455-461，另一篇是Wu，H．等人，Structure(1994)2：545-558。这些文章的结果总结于Patel，D．J．Nature(1994)369：438-439中。
PCT申请WO91／16922(1991年11月14日公布)描述了异源二聚体糖蛋白激素的多种嵌合的及其他修饰形式。一般而言，该文献针对分别涉及各种α或β链的α亚基或β亚基的嵌合物。简单地列在该申请中而没有给出其他说明的一个构建物将基本上整个人绒毛膜促性腺激素的β链与α亚基前体蛋白(即含有该亚基的分泌信号序列)融合在一起。
另外两个公布的PCT申请描述了这些激素的单链形式，其中α和β亚基被共价相连，形成如下通式的融合肽∶
β(接头)nα或
α(接头)nβ
式中n为0或1，而α和β为这些激素的各亚基。Moyle，W．RPCT申请WO95／22340(1995年8月24日公布)；以及本发明人的申请WO96／05224(1996年2月22日公布)。这些文献的公开内容也在此引用作为参考。
上述单链糖蛋白激素的一类形式，即胱氨酸桥连(bridge)的数目被减少的形式，公开于美国申请No．08／933，693(1997年9月19日申请)。该申请在此引用作为参考。
目前已发现，通过将两个β亚基包含在一个单链内使其共用一个共同的α亚基，可以构建出一种单链形式的糖蛋白激素，它们有更强的促效剂和／或拮抗剂活性，和／或它们是双功能的。这些形式可以含有如上述文献中描述的各种CTP延伸片段和插入片段以及α和β亚基的天然形式的变异体和CTP的变异体。
本发明公开的内容
本发明提供了糖蛋白激素的单链形式，它含有两个相同或不同的β亚基。本发明的单链形式可以是糖基化、部分糖基化或非糖基化的，而且存在于天然糖蛋白激素或其变异体中的α和β链可以任选地通过接头成分(linker moiety)而连接。特别优选的接头成分包括羧基端肽(CTP)单元，它或者是完整的单元或者是其一部分所构成的变异体。产生的单链激素或者保留或增强了未修饰的异源二聚体形式激素的活性，或者是该活性的拮抗剂。如果两个β亚基不同，那么它们作为促效剂和／或拮抗剂而呈现双功能。
因此，一方面，本发明涉及一种糖基化或非糖基化的下式蛋白质：
β1-(接头1)m-α-(接头2)n-β2(1)；或
β1-(接头1)m-β2-(接头2)n-α(2)；或
α-(接头1)m-β1-(接头2)n-β2(3)
式中，各β1和β2具有脊椎动物糖蛋白激素β亚基的氨基酸序列，或是所述氨基酸序列的变异体(其中所述变异体在本文中已有定义)。“α”指脊椎动物糖蛋白激素α亚基或其变异体；“接头”指共价相连的成分，它以合适的距离将β1和β2亚基与α亚基，以及将β1和β2亚基相互间隔开。各m和n独立地为0或1。
在所有上述例子中，单链形式保留了构象，因此在单链形式中包含整个亚基是不必要的。因此，本发明包括上式(1)、(2)和(3)的化合物，它含有α和／或β亚基的片段，其中这些形式保留了含完整亚基的对应形式所表现的生物活性。
另一方面，本发明涉及产生本发明的蛋白的重组材料和方法，涉及含有本发明蛋白的药物组合物，涉及对本发明蛋白特异的抗体，以及涉及其应用的方法。
附图简述
图1显示了在与hCG的竞争下，化合物CGβ-α-CTP-FSHβ与LH受体的结合情况。
图2显示了在与FSH的竞争下，图1中化合物与FSH受体的结合情况。
发明的实施方式
在人体中有四种“糖蛋白”激素构成一个包括人绒毛膜促性腺激素(hCG)、促卵泡成熟激素(FSH)、黄体生成素(LH)和促甲状腺激素(TSH)在内的家族。如此处所用，“糖蛋白激素”指该家族的所有成员。所有这些激素都是由α亚基和β亚基构成的异二聚体，其中对于某一物种而言在该组中的α亚基氨基酸序列是相同的，而β亚基因视家族成员的不同而不同。因此，一般情况下这些糖蛋白激素是由相互结合但非共价相连的α和β亚基构成的异二聚体。大多数脊椎动物产生FSH、TSH和LH；绒毛膜促性腺激素只在包括人在内的灵长类和怀孕母马中发现。
在动物中，各激素的α和β亚基由不同的基因编码，而且分别合成，然后被装配成非共价相连的异二聚体复合物。在本发明的化合物中，β亚基被直接连于α亚基成为一个一级结构必然为线性的单链分子。由二级和三级结构因素和构象所赋予的三维结构，在外观上与异二聚体形式十分相似，从而使β亚基所代表的异二聚体的功能得以表现。然而，通过亚基结构的适当变化，本发明的化合物可以具有促效剂或拮抗剂活性；例如，如果β亚基是不同的，化合物可表现出针对某一糖蛋白激素受体的拮抗剂活性，但是又表现出对另一受体的促效剂活性，或者可以对两种受体都有促效剂活性或拮抗剂活性。本发明化合物所表现出的活性谱，取决于选择的各α和β亚基、连接成分的性质、以及α和β亚基的取向。
在本发明的最佳实施例中，式(1)、(2)或(3)化合物是融合蛋白，其中α和β亚基直接地或通过肽接头而头对尾地相连。在只有基因编码的氨基酸构成序列时，该化合物可重组合成。然而，并不需要将本发明化合物局限于这种方式；α和β亚基以及接头可包括非基因编码的氨基酸。此外，接头可以是肽之外的物质，例如二羧酸或酸酐、二胺、或双功能接头(例如Pierce Chemical CoRockford，IL出售的)等。此外，这些亚基可以按融合蛋白所需要的头对头或尾对尾构型、以及头对尾构型直接地或通过接头而相连。在这些情况下，用标准活化技术，对于头对头构型而言，两个氨基可以通过酸酐或通过任何二羧酸衍生物而连接；两个羧基可以通过二胺或二醇连接。
但是，为了方便起见，最优选的形式是头对尾构型，其中形成标准的肽键，而且化合物可以通过重组技术或肽合成技术制备成融合蛋白，它或者是诸反应成分的单链，或者较佳地，连接了整个序列的各部分。
不论各实例如何，α和β亚基在靠近其N端和C端的位置处与该分子的其余部分连接。优选的是，这些亚基直接在其末端相连，然而这种连接也许是单纯的“靠近”型。一般地，“靠近”表示在末端的10个氨基酸之内，较佳地在5个氨基酸之内，更佳地在2个氨基酸之内的一个位置，最佳地为末端本身。
亚基组份
如此处所用，α亚基，和FSH、LH、TSH和CG的β亚基以及异二聚体形式一般与其常规定义相同，指具有本领域中已知氨基酸序列的蛋白质或其等位变异体，而不论其所表现的糖基化方式或氨基酸侧链的其他衍生变化。
这些肽的“天然”形式是指具有从相关脊椎动物组织中分离出的氨基酸序列、而且具有本领域中已知氨基酸序列的肽或其等位变异体。
这些蛋白质和CTP单元(见下文)的“变异体”形式，指通过例如定点突变或其他重组操作而产生的或者人工合成的、在天然蛋白质氨基酸序列中具有故意改变(包括截短)的蛋白质。
这些改变由1-10、较佳地1-8、更佳地1-5个氨基酸变化构成，包括缺失、插入和取代，其中最佳的是保守性氨基酸取代。得到的变异体必须保留活性以影响天然激素的相应活性，即或者它们必须保留天然激素的生物学活性从而能起促效剂作用，或者它们必须起拮抗剂的作用，通常是能够与天然激素的受体结合但不能实现信号转导。
按常规含义，“保守性类似物”指这样的类似物，其中被取代的残基与进行取代的残基属于同一氨基酸种类。如本领域中熟知的那样，氨基酸已分类成几组，例如参见Dayhoff，M．等人，Atlas of Protein Sequences andStructure(1972)5∶89-99。通常，酸性氨基酸被归在一组；碱性氨基酸被归在一组；中性亲水氨基酸被归在一组；等等。更具体的分类情况列于WO 96／05224，该文献在此引用作为参考。
一组优选变异体是其中α或β亚基或两者的糖基化位点被改变的变异体。本文所述的激素四成员家族(quartet)的部分有用变异体在美国专利5，177，193中有描述(1993年1月5日出版，在此引用作为参考)。如其所述，可以通过破坏相关位点，或者通过选择产生蛋白质的宿主细胞而改变糖基化方式。
氨基酸序列的改变也包括插入和缺失。因此，激素的截短形式被包括在变异体中，例如缺失C末端85-92位中部分或全部氨基酸的α亚基突变型。此外还包括缺失N末端的1-10个氨基酸的α亚基。
突变蛋白还包括非关键区域被改变或被去除的突变蛋白。这种缺失和改变可包括整个环，从而缺失或改变远大于10个氨基酸的序列。但是变异体必须至少保留受体结合域和／或涉及信号转导的区域。
有相当多的文献涉及此处所述的激素四成员家族的变异体，而且从这些文献中明显地知道，可以制备大量可能具有促效剂和拮抗剂活性的变异体。公开的这些变异体参见Chen，F．等人，Molec Endocrinol(1992)6：914-919；Yoo，J．等人，JBiol Chem (1993)268：13034-13042；Yoo，J等人，J BiolChem(1991)266：17741-17743；Puett，D．等人，Glycoprotein Hormones，Lusbader，J．W．等人，EDS，Springer Verlag New York(1994)122-134；Kuetmann，H．T．et al(ibid)P103-117；Erickson，L．D．等人，End ocrinology(1990)126：2555-2560；和Bielinska，M．等人，J Cell Biol(1990)111：330a(Abstract 1844)。
其他的变异体包括其中有一个或多个胱氨酸连接被缺失的种类，这典型地是通过用中性氨基酸置换一个或两个参与连接的半胱氨酸而实现。特别优选的可被缺失的胱氨酸连接是位于26位和110位之间以及23位和72位之间的胱氨酸连接。
此外，已表明，激素四成员家族的β亚基可以以嵌合形式构建从而提供嵌合体两种组份的生物学功能，或者通常提供生物学功能改变的激素。因此，可以按Moyle，Proc Natl Acad Sci(1991)88：760-764；Moyle，Nature(1994)368：251-255描述的方法构建具有FSH和LH／CG活性的嵌合分子。如这些文章中所述，用FSH-β的101-109位氨基酸置换CG-β亚基中的相应残基可得到具有hCG和FSH二者活性的类似物。
如本文所用，“肽”和“蛋白质”可互换使用，因为它们之间的长度区别是不确定的。
如上所述，在构成本发明的具有或不具有连接成分的化合物时，被用作α和β亚基的“变异体”可以是该亚基的完整氨基酸序列或仅是其一部分。
“变异体”还包括含插入在非关键区域的CTP(或变异的CTP)的α和／或β链。
α和β亚基的“非关键”区域是生物学活性(包括促效剂和拮抗剂活性)非必需的分子区域。通常可将这些区域从结合位点、前体剪切位点和催化区域中去除。对引导合适折叠、与受体结合和催化活性等至关重要的区域，应加以评估。应注意，在二聚体情况下是关键的某些区域在单链形式下会变成非关键的，因为由分子所赋予的构象限制可能会消除这些区域的关键性。非关键区域的确定可以方便地通过缺失或修饰候选区域然后对所需活性进行适当的测试即可实现。因修饰而导致活性损失的区域是关键的；而改变后导致相同或相似活性(包括拮抗剂活性)的区域被认为是非关键的。
应再次强调，“生物学活性”指对天然激素的活性起促效的或拮抗的活性。因此，某些区域对变异体作为拮抗剂起作用至关重要，尽管拮抗剂不能直接提供激素的生理效应。
例如，对于α亚基，33-59位被认为是信号转导所必需的，而羧基端20个氨基酸的延伸段是信号转导／受体结合所必需的。与β亚基进行装配中的关键残基至少包括残基33-58，尤其是37-40。
当非关键区域“靠近”N末端或C末端时，插入可以位于该末端10个氨基酸中的任何位置，更佳地在5个氨基酸中，最佳地为末端本身。
如本文所用，“CTP单元”指在人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基端发现的、在C末端从氨基酸112-118延伸至残基145的氨基酸序列，或指其一部份。因此，每个“完整”CTP单元含有28-34个氨基酸，其长度取决于CTP的N末端。
“部分”CTP单元指这样的氨基酸序列，它位于位置112-118至145(含145本身)，但是从最短的“完整”CTP单元(即从118-145位)中缺失至少一个氨基酸。这些“部分”序列包括在“变异体”的定义内。“部分”CTP单元宜含有至少一个O-糖基化位点。激素的某些非糖基化形式是拮抗剂，因此可以作为拮抗剂使用。CTP单元在丝氨酸残基处含有4个糖基化位点，分别位于121(位点1)、127(位点2)、132(位点3)和138(位点4)位。用于促效剂的CTP部分形式可含有一个或多个按在天然CTP序列中的次序排列的这些位点，尽管介于中间的位点可以删略。
在某些情况下，可以插入或使用串联式的CTP单元作为接头。“串联式”插入或延伸表示插入子或延伸段含有至少两个“CTP单元”。每个CTP单元可以是完整的或是片段，可以是天然的或变异的。在串联式延伸或插入中的所有CTP单元可以是相同的，也可以互不相同。
“接头成分”是将α和β序列连接在一起而又不干扰其活性的组成部分，这些活性由作为异二聚体成员的同一α和β所表现，或者它发生了改变使其活性从促效剂转变成拮抗剂活性。活性水平可以在合理的范围内变动，但是接头的存在不能使单链形式基本上丧失其促效剂和拮抗剂活性。单链形式并不是前肽而是成熟的蛋白质，而且必须表现出与该异二聚体(异二聚体的元件形成其组成)的激素活性有关的活性。
双功能激素的优选例
本发明的双功能激素可用重组技术进行最有效和最经济地生产。因此，优选的是那些仅含有基因编码的氨基酸的α和β链、CTP单元和其他接头成分形式的融合蛋白。然而，如上所述，有可能用肽合成技术或其他有机合成技术来构建至少某单链激素的部分，因此含有非基因编码的氨基酸和非肽型接头的变异体也在本发明范围之内。
在最佳实施例中，β1亚基的C-末端是共价地(可任选地通过接头)连于成熟α亚基的N-末端，该α亚基又共价地(可任选地通过接头)连于β2亚基。连接可以是直接肽连接，其中一个亚基的C末端氨基酸与另一亚基的N末端直接通过肽键而相连；但是，在许多情况下，最好在两个末端之间含有接头成分。在大多数情况下，接头成分在两个链之间至少提供一个β转角。因此，在接头中存在脯氨酸残基也许是有利的。
(应理解，在所讨论的构成单链形式的亚基末端之间的连接中，一个或多个末端也可以通过如上所述的取代和／或缺失而改变。)
在一组特别优选的实施例中，连接是头对尾型，接头成分含有一个或多个CTP单元和／或其变异体或截短形式。用于这种接头成分的CTP单元的优选形式在下面描述。
此外，接头成分可含有共价地(最好可以释放)连于接头成分的药物。将药物偶联于接头成分的方法以及使其释放的方法是常规方法。
如上所述，CTP和其变异体除了位于接头成分中之外，还可以包括在构成单链激素的各亚基的任何非关键区域中。
尽管CTP单元宜包含在接头成分中，应理解该接头可以是能提供α和β亚基适当空间关系的任何合适的共价结合材料。因此，对于头对尾构型，接头一般是二价成分，例如含有任意数目的、但通常小于100个、更佳地小于50个的氨基酸的肽，它具有适当的亲水性／疏水性比率以便在溶液中能提供适当的间隔和构象，或者是可赋予这些特性的非肽型接头。通常，接头应有均衡的亲水性，从而位于周围溶液中并且不干扰α和β亚基或者两个β亚基之间的相互作用。较佳地，接头含有通常由肽接头中脯氨酸提供的β转角，或者含有丝氨酸和／或甘氨酸残基。可以使用具有上述正确特性的任何合适的聚合物，其中包括肽接头。
特别优选的本发明的双功能激素例子包括头对尾构型的：βFSH-α-βFSH；α-βFSH-βLH；βFSH-α-βLH；βLH-α-βLH；α-βLH-βFSH；βLH-α-βFSH；βTSH-α-βTSH；βTSH-βFSH-α；βTSH-α-βFSH；βCG-α-βCG；α-βCG-βFSH；α-βCG-βTSH；βCG-βFSH-α；βCG-α-βTSH；βFSH-CTP-αβFSH；α-βFSH-CTP-βLH；βFSH-CTP-α-βLH；βLH-CTP-αβLH；α-βLH-CTP-βFSH；βLH-α-CTP-βFSH；βLH(δ115-123)-α-βFSH；βLH(δ115-123)-CTP-α-βFSH；βCG-CTP-αCTP-βFSH-CTP-CTP；βTSH-CTP-CTP-αβFSH-CTP-CTP；βFSH-CTP-CTP-α-βLH；βLH-CTP-CTP-βLH-α；βCG-CTP-CTP-α-βTSH；βCG-CTP-CTP-βLH-α；βFSH-CTP-βLH(δ115-123)-CTP-α；等。
人类的亚基形式也是特别优选的。在上述构建物中，“CTP”指CTP或其变异体(包括截短片段)，如No．96／05224中所述。
对于应用于人体，人类形式的α和β亚基是理想的。应理解，在其他脊椎动物中的对应形式可用于兽医用途。因此，牛、羊、马、猪、猫、犬和其他动物特有的FSH、TSH和LH亚基，适用于影响这些物种自身的各病症。
可以包含在接头成分中的合适药物包括肽或蛋白质，例如类胰岛素生长因子；表皮生长因子；酸性和碱性成纤维细胞生长因子；血小板衍生的生长因子；各种集落刺激因子(CFS)，例如粒细胞CFS、巨噬细胞CFS等；以及各种细胞因子如IL-2、IL-3和多种其他白细胞介素蛋白质；各种干扰素；肿瘤坏死因子等。可以包含用于释放这些药物的合适的切割位点如蛋白酶的靶序列，而该蛋白酶的靶位点并不存在于α和β亚基中。肽类或蛋白质类药物的优点是整个构建物可以方便地通过单基因的重组表达而生产。另外，也可以使用小分子药物如抗生素、消炎药、毒素等。
一般地，包含在接头成分中的药物可以是需要在激素通常结合的受体附近发挥作用的药物。还可提供将药物从接头的包含形式中释放出来的合适方法，例如通过在下面的“制备方法”一节中所述的引入酶催化裂解位点的方法。
其他修饰
本发明的单链蛋白质还可以用公知的方法进行偶联或衍生从而对氨基酸序列进行衍生变化，例如磷酸化、糖基化、对通常的糖基化形式进行去糖基化、酰化、对氨基酸侧链进行修饰(如将脯氨酸转变成羟基脯氨酸)，以及与那些翻译后修饰(已发现普遍存在)类似的修饰形式。
本发明的激素的糖基化状态尤为重要。激素可以以非糖基化形式制备，这可通过在原核宿主中生产，或通过突变亚基和／或CTP单元中一般存在的糖基化位点。非糖基化和部分糖基化的激素可以通过对糖基化位点的操作来制备。当然，糖基化形式也包括在本发明范围之内。
正如本领域中熟知的那样，本发明的单链蛋白质也可偶连于标记物、载体、固相载体等，这取决于所需的用途。可以使用其标记形式来跟踪其代谢结果；用于该目的的合适标记物包括(尤其是)放射性同位素标记物如碘131、锝99、铟111等。这些标记物也可用于介导在测试系统中对单链蛋白质进行检测；在该例子中，可以使用放射性同位素以及酶标记物、荧光标记物、生色标记物等。使用这类标记物可对有关受体进行定位，因为它们可用作这些受体的导向式(targ eting)试剂。
本发明的蛋白质还可偶联于载体以便在制备与这些新的修饰形式发生特异性免疫反应的抗体的过程中增加其免疫原性。用于该目的的合适载体包括匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白、白喉类毒素等。可以采用标准偶联技术将本发明的修饰肽与载体相连，包括使用双功能接头。
可以使用类似的连接技术及其他技术，将本发明的蛋白质偶联于固相载体。偶联后，可以将这些蛋白质用作亲和试剂，分离所需的、与其有特异反应的组份。因此，它们可用于纯化和分离与适当β亚基发生作用的受体。
制备方法
构建本发明的蛋白质的方法是本领域中众所周知的。如上所述，如果仅含有基因编码的氨基酸，而且单链是处于头对尾构型，那么目前最实际的方法是通过表达编码所需蛋白质的DNA而重组合成这些材料。含有编码单链形式(包括变异形式)的核酸序列的DNA可以由天然序列制备，或者从头人工合成，或者组合使用这些技术。定点诱变、连入额外序列、扩增反应(如PCR)和构建合适表达系统的技术目前都是本领域中众所周知的。编码所需蛋白质的部分或全部DNA可以用标准的固相合成技术合成，最好引入限制性酶切位点以方便连接。可将用于转录和翻译包含的编码序列的合适控制元件提供给DNA编码序列。众所周知，目前已有可以与大量不同宿主相容的表达系统，这些宿主包括原核宿主如大肠杆菌或枯草杆菌和真核宿主如酵母、其他真菌(如曲霉和链孢霉属)、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞(如CHO细胞)、鸟类细胞等。
宿主的选择尤其应涉及翻译后加工，特别是包括糖基化。糖基化的位置主要由分子内的糖基化位点的性质所控制；但是，占据该位点的糖的性质主要由宿主的性质所决定。因此，本发明激素性质的微调可以通过适当地选择宿主而实现。
α亚基部分(其中α亚基是修饰的或非修饰的)的一种特别优选的基因形式是“小基因”(minigene)构建物。如本文所用，α亚基“小基因”指在Matzuk，M．Met al，Mol Endocrinol(1988)2：95-100中描述pM2／CG α或pM2／I构建物中所公开的基因构建物。
对于重组生产，可使用已用表达系统修饰的宿主细胞，进行培养从而产生所需的蛋白质。此处使用的术语如下：
“修饰的”重组宿主细胞，即“经修饰从而含有”本发明的重组表达系统的细胞，指这样的宿主细胞，它已经用方便的引入方法(包括转染、病毒感染等)处理从而含有此表达系统。“修饰的细胞”是指细胞含有该表达系统而不论该表达系统是整合入染色体还是位于染色体之外。“修饰的”细胞对于包含表达系统可以是稳定的，或者编码序列可被瞬时表达。简而言之，带有本发明的表达系统的“修饰的”重组宿主细胞是指，当天然不含有该表达系统时，通过引入操作而含有该表达系统的细胞，而不论用何种方式实现这种引入。
“表达系统”指含有待表达的编码核苷酸序列及其相伴的、实现编码序列表达所必需的控制序列的DNA分子。典型地，这些控制序列包括：启动子、终止调控序列以及(在某些情况下)操纵子或其他调控表达的序列。控制序列是那些设计用于在特定重组宿主靶细胞中发挥作用的序列，因此必须选择宿主细胞使之与构建的表达系统中的控制序列相容。
如果需要分泌产生的蛋白质，那么还要包含编码信号肽的其他核苷酸序列，从而产生操作性连于(operably linked)所需单链激素的信号肽，进而产生前体蛋白。一旦分泌，信号肽被切除，释放出成熟的单链激素。
如本文所用，“细胞”、“细胞培养物”和“细胞系”可互换使用而不必在意其细微区别。在需要区分它们的地方，会在上下文中清楚地表明。对于都可以表示的场合，所有含义的都包括在内。
产生的蛋白质可以从细胞裂解液中获得(如果产生于细胞内)，或者从培养基中获得(如果是分泌的)。从细胞培养物中回收重组蛋白质的技术是本领域中众所周知的，而且可以用已知技术如色谱法、凝胶电泳、选择性沉淀等纯化这些蛋白质。
本发明的全部或部分激素可以用本领域已知的肽合成技术直接合成。合成的部分可以连接起来，而在接头成分中所含药物的释放位点可以用标准化学方法引入。当然，对于那些含有非基因编码的氨基酸的例子以及采用头对头或尾对尾构型的例子，合成工作至少部分是处于蛋白质水平的。在天然N端或靠近天然N端的位置的头对头连接，可以通过含有与氨基起反应的功能基团的接头如二羧酸衍生物而实现。在C端或靠近C端的位置的尾对尾连接，可以通过二胺、二醇或其组合的接头而实现。
抗体
本发明的蛋白质可以用于产生与这些新化合物起特异性免疫反应的抗体。这些抗体可以用于各种诊断和治疗用途。
抗体一般是用标准免疫方案在哺乳动物如兔、小鼠、羊或大鼠中制备，并且抗体作为多克隆抗血清进行效价测定以保证免疫充分。然后收获多克隆抗血清以用于例如免疫测定。来自宿主的分泌抗体的细胞，如脾细胞或外周血白细胞，可以用已知的技术进行永生化处理并筛选，以产生对本发明的蛋白质呈免疫特异性的单克隆抗体。“抗体”包括其保留所需免疫特异性的任何片段，例如Fab，Fab′，F(ab)2，Fv等。因此，抗体也可以用重组技术制备，通常是分离出至少编码单克隆抗体可变区(具有合适特异性)的核苷酸序列并构建合适的表达系统。这种方法允许进行任何所需的修饰，例如产生Fv形式、嵌合形式、“人源化”形式等。
“对本发明蛋白质有免疫特异性的”指在确定亲和性或非亲和性所考虑的普通参数内，抗体能特异性地结合于本发明的化合物，但不结合于异二聚体或其亚基本身或仅包括一个β亚基的任何单链形式。应理解，特异性是一个相对概念，可以选择任意的限度，例如特异性结合可相差100倍或更多。因此，本发明范围内的免疫特异性抗体与其针对的单链蛋白质的反应比与相应异二聚体、现有技术的单链形式或各亚基的反应至少大100倍。这些抗体的获得，可以通过例如选择与本发明化合物结合的抗体并且舍去也结合异二聚体、亚基或现有技术单链形式(描述于WO95／22340和WO96／05224)的那些抗体。
配方和用法
可用已知的、与单链形式相应的异二聚体类似的方法，来配制和施用本发明的蛋白质。因此，配制和施用方法会随所用的具体激素或激素组合而有所不同。然而，与异二聚体相比，施用的剂量水平和频率也可以改变，尤其考虑到如果存在CTP单元，那么生物学半衰期会因其存在而延长。
本发明的蛋白质的配方是典型的用于蛋白质或肽药物的配方，如在Remington′s Pharmac eutical Sciences(最新版)，Mack Publishing Company，Easton，PA中所述的配方。蛋白质的给药一般是通过注射，例如静脉注射、肌内注射、皮下注射、或腹膜内注射，或者使用透粘膜或透皮给药的配方。这些配方一般含有表面活性剂或渗透剂如胆盐、梭链孢酸等。这些配方还可以以气雾剂或栓剂形式，或者在透皮给药中以皮肤膏药(patch)形式给药。口服给药也是可行的，只要配方能防止本发明的肽在消化道中被降解。
剂量规定和配方的优化可按常规方法并如本领域中通常进行的那样进行。这些配方也可修改以包含适合兽医应用的那些成分。
本发明的化合物可以用于许多方面，最明显地是作为激素异二聚体形式的替代物。因此，与异二聚体相同，本发明的促效剂形式的单链激素可用于治疗不育症(作为体外受精技术的辅助剂)以及其他与天然激素相关的治疗方法。这些技术适用于人和其他动物。当然，在其品种衍化方面对单链蛋白的选择取决于采用何种方法。应意识到，赋予那些含两种不同β亚基的化合物的双重功能，为以前不能得到的治疗提供了机会。
本发明化合物还可以以类似于异二聚体的方式用作试剂。
此外，本发明化合物可用作诊断工具，以检测生物样品中抗体的存在与否，该抗体结合于天然蛋白质的程度达到了结合单链化合物相关部分的程度。它们还可以作为评估各种样品中这些激素水平的试剂盒中的对照试剂。评估激素本身的水平或针对它们的抗体的水平的方法是本领域中公知的标准免疫分析方法。可以使用各种涉及放射性同位素标记、荧光标记、酶标记等标记技术的竞争性和直接分析试验。
本发明化合物还可用于检测和纯化与天然激素结合的受体。因此，本发明化合物可以偶联于固相载体，用于受体或抗激素抗体的亲和色谱层析制备。得到的受体本身可用于在筛选治疗和候选试剂的试验中评估激素作为候选药物的活性。当然，当β亚基不同时，必须考虑这些化合物中β亚基的双重特异性。然而，当两个β亚基相同时，它们提供了一种针对相关受体的强有力的亲和纯化工具。
最后，唯一地与本发明的单链激素反应的抗体可用作纯化工具，用于分离随后制备物中的这些材料。它们还可用于监测这些化合物作为药物给药后的水平。
下列实施例用于阐述本发明，而不是限制本发明。
实施例1
带备CGβ-α-CTP-FSHβ
用现有的编码各亚基相关部分的核苷酸序列来制备编码标题化合物的核苷酸序列。CGβ区域编码人CGβ的145个氨基酸；编码α亚基的核苷酸序列编码人α的92个氨基酸(作为小基因)；编码CTP的序列编码人绒毛膜促性腺激素118-145位的28个氨基酸；而FSHβ的编码区域编码人FSHβ亚基的111个氨基酸。
按Sachais，βBiol．Chem(1993)268：2319所述的方式，将含有CGβ外显子3、α小基因、CTP和βFSH的扩增片段插入pM2HA-CGβexonl，2(一种衍生自pM2且含CGβ外显子1，2的表达载体)的SalI位点。含CGβ外显子1，2的pM2在Matzuk，M．M．等人，Proc Natl Acad Sic USA(1987)84：6354-6358和Matzuk，M．M．等人，JCell Biol(1988)106：1049-1059中有描述。首先，将在CGβ外显子3下游含有α小基因的片段插入该载体，从而获得pM2-HACGβα。然后pM2-HACGβα用ScaI进行酶切，再与ScaI限制性消化过的pBIIKS(+)α-CTP-FSH连接。形成的表达载体pM2-HACGβ-α-CTP-FSH，当插入合适宿主时，产生标题化合物。
实施例2
CGβ-α-CTP-FSHβ的产生和活性
将实施例1中构建的表达载体转染入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，通过放射性标记的蛋白质在SDS凝胶上的免疫沉淀而评估该蛋白质的产生情况。
收集培养基，浓缩，然后测试其与人LH受体(预计会结合于βCG-α部分)的结合情况。对于该试验，LH受体的制备是通过将编码完整人LH受体的cDNA插入表达载体pCMX(Oikawa，J．X-C等人，Mol Endocrinol(1991)5：759-768)。将处于指数生长期的293细胞用该载体并用Chen，C．等人，Mol Cell Biol(1987)7：2745-2752中的方法进行转染，导致LH受体在表面上表达。
在该试验中，将表达人LH受体的细胞(2×105／管)与lng标记的hCG一起温育，并与浓度逐渐增加的未标记hCG或数量逐渐增加的待测样品在22℃竞争18小时。在样品存在时，标记的下降便表明样品的结合能力。在该试验中，对于293细胞中的人LH受体，异二聚体型hCG具有野生型的活性(这与以前的测定相同)，而含CGβ-α-CTP-FSHβ的培养基也表现出活性。这些结果示于图1。如图所示，异二聚体的hCG(实心方块)和本发明的双功能单链蛋白(实心圆圈)都成功地与标记的hCG竞争LH受体。双功能化合物的效力稍低，因为α亚基羧基末端被修饰。
同样，图1还显示了另一试验的结果，其中测试了来自被修饰从而含有两个表达系统的细胞的不同数量的培养上清。一种表达系统产生单链FSHβ-α；另一系统产生hCG的β亚基。形成的非共价相连的单链FSHα-β／CGβ复合物(实心三角形)也成功地竞争结合。
类似地，还测试了来自含CGβ-α-CTP-FSHβ的培养基上清与293细胞中表达的FSH受体的结合情况。该试验按上述方式进行，不同点在于：用表达人FSH受体的细胞替换表达人LH受体的细胞，并且将标记的FSH用作竞争剂。该试验的结果示于图2。
如图所示，单链的标题化合物(实心圆圈)成功地与FSH(实心方块)竞争结合。在另一无关的试验中，同样如图2所示，不同类型复合物(即非共价地连于CGβ的单链FSHβ-α)的混合物(与非复合的且过量的单链FSHβ-α(实心三角形)混合而成)，是一种出色的竞争剂。
实施例4
构建其他的表达载体
按与实施例1类似的方式，制备产生单链双功能FSHβ-CTP-α-CGβ、α-FSHβ-CTP-CGβ、CGβ-βFSH-CTP-α和β LH-CTP-βFSH-CTP-α的表达载体，然后转染入CHO细胞。收获培养上清液，并如上所述针对LH受体和FSH受体进行测试。这些化合物也表现出结合于两种受体的能力。

Claims (16)

1．一种糖基化或非糖基化的、具有促效剂和／或拮抗剂活性的蛋白质，其特征在于，该蛋白质具有下式：
β1-(接头1)m-α-(接头2)n-β2(1)；或
β1-(接头1)m-β2-(接头2)n-α(2)；或
α-(接头1)m-β1-(接头2)n-β2(3)
式中，各β1和β2具有脊椎动物糖蛋白激素β亚基的氨基酸序列，或是该氨基酸序列的变异体；
“α”指脊椎动物糖蛋白激素α亚基或其变异体；
“接头”指共价相连的成分，它将β1和β2亚基与α亚基，以及将β1和β2亚基相互间隔开，从而有效地保留了所述活性；以及
各m和n独立地为0或1。
2．如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，该m和n是1。
3．如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，至少一个该接头成分包含一针对糖蛋白激素受体的药物，或者其中至少一个接头是CTP或其变异体。
4．如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，β1是FSH、LH、或TSH的β亚基，并通过全长或部分CTP单元或其变异体而延伸至靠近其C末端的一个位置。
5．如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，α亚基或者一个或多个β亚基，或两者都通过将CTP单元或其变异体插入非关键区域而被修饰，和／或其中的所述接头成分包括CTP或其变异体。
6．如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，该变异体相对于所述序列的天然形式而言含有1-5个保守的氨基酸替换，和／或所述变异体是所述序列的截短形式。
7．一种药物组合物，其特征在于，它含有与适当的药物赋形剂相混合的权利要求1所述的蛋白质。
8．一种被偶连于固相载体的权利要求1所述的蛋白质。
9．一种对权利要求1所述的蛋白质有免疫特异性的抗体。
10．一种DNA或RNA分子，其特征在于，它含有编码权利要求1所述的蛋白质的核苷酸序列。
11．一种表达系统，它用于产生糖蛋白激素的促效剂和／或拮抗剂，其特征在于，该表达系统含有编码权利要求1所述的蛋白质的第一核苷酸序列，该序列操作性地连于能够实现所述第一核苷酸序列表达的控制序列。
12．如权利要求11所述的表达系统，其特征在于，它还含有编码信号肽的第二核苷酸序列，该信号肽操作性地连于所述第一核苷酸序列所编码的蛋白质。
13．一种宿主细胞，其特征在于，它经修饰以含有权利要求11所述的表达系统。
14．一种宿主细胞，其特征在于，它经修饰以含有权利要求12所述的表达系统。
15．一种产生单链蛋白质的方法，该单链蛋白质是糖蛋白激素的促效剂和／或拮抗剂，其特征在于，该方法包括：
在产生所述蛋白质的条件下，培养权利要求14所述的细胞；和
从培养物中回收所述蛋白质。
16．一种产生单链蛋白质的方法，该单链蛋白质是糖蛋白激素的促效剂和／或拮抗剂，其特征在于，该方法包括：
在产生该糖所述蛋白质的条件下，培养权利要求14所述的细胞；和
从培养物中回收所述蛋白质。
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