CZ299742B6 - Jednoretezcové bifunkcní glykoproteinové hormony - Google Patents
Jednoretezcové bifunkcní glykoproteinové hormony Download PDFInfo
- Publication number
- CZ299742B6 CZ299742B6 CZ20001774A CZ20001774A CZ299742B6 CZ 299742 B6 CZ299742 B6 CZ 299742B6 CZ 20001774 A CZ20001774 A CZ 20001774A CZ 20001774 A CZ20001774 A CZ 20001774A CZ 299742 B6 CZ299742 B6 CZ 299742B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- protein
- subunits
- subunit
- beta
- amino acid
- Prior art date
Links
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 title claims abstract description 65
- 239000005556 hormone Substances 0.000 title claims abstract description 65
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 title claims abstract description 23
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 title claims abstract description 23
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 title description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 62
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 58
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 43
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 36
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims abstract description 24
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims abstract description 24
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 22
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 claims abstract description 21
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 claims abstract description 16
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 12
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 claims abstract description 10
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 claims description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 27
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 20
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 16
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 8
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 4
- 102000017357 Glycoprotein hormone receptor Human genes 0.000 claims description 2
- 108050005395 Glycoprotein hormone receptor Proteins 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- 230000003175 thyreotropic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 230000006918 subunit interaction Effects 0.000 claims 1
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 abstract description 15
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 abstract description 15
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 abstract description 11
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 abstract description 11
- 229940015047 chorionic gonadotropin Drugs 0.000 abstract description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract description 3
- 230000004075 alteration Effects 0.000 abstract 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 38
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 37
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 28
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 28
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 14
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 11
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 11
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 10
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 10
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 9
- 102000023108 LH Receptors Human genes 0.000 description 8
- 108010011942 LH Receptors Proteins 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 102000008175 FSH Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010060374 FSH Receptors Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 3
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 2
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 150000001990 dicarboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 150000002009 diols Chemical class 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 2
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 2
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- PNDPGZBMCMUPRI-HVTJNCQCSA-N 10043-66-0 Chemical compound [131I][131I] PNDPGZBMCMUPRI-HVTJNCQCSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101710116299 Choriogonadotropin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 102100031196 Choriogonadotropin subunit beta 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710166590 Choriogonadotropin subunit beta 3 Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000018386 EGF Family of Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010066486 EGF Family of Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- IECPWNUMDGFDKC-UHFFFAOYSA-N Fusicsaeure Natural products C12C(O)CC3C(=C(CCC=C(C)C)C(O)=O)C(OC(C)=O)CC3(C)C1(C)CCC1C2(C)CCC(O)C1C IECPWNUMDGFDKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000893054 Homo sapiens Follitropin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 102000003864 Human Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010082302 Human Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- GKLVYJBZJHMRIY-OUBTZVSYSA-N Technetium-99 Chemical compound [99Tc] GKLVYJBZJHMRIY-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003388 anti-hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 102000035824 beta Subunit Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010081485 beta Subunit Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 1
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 150000001991 dicarboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000003269 fluorescent indicator Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- IECPWNUMDGFDKC-MZJAQBGESA-N fusidic acid Chemical compound O[C@@H]([C@@H]12)C[C@H]3\C(=C(/CCC=C(C)C)C(O)=O)[C@@H](OC(C)=O)C[C@]3(C)[C@@]2(C)CC[C@@H]2[C@]1(C)CC[C@@H](O)[C@H]2C IECPWNUMDGFDKC-MZJAQBGESA-N 0.000 description 1
- 229960004675 fusidic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 description 1
- APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N indium atom Chemical compound [In] APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Glykosylovaný nebo neglykosylovaný agonistický nebo antagonistický protein vzorce .beta..sup.1.n.-(spojovník.sup.1.n.).sub.m.n.-.alfa.-(spojovník.sup.2.n.).sub.n.n.-.beta..sup.2.n. (1), nebo .beta..sup.1.n.-(spojovník.sup.1.n.).sub.m.n.-.beta..sup.2.n.-(spojovník.sup.2.n.).sub.n.n.-.alfa. (2), nebo .alfa.-(spojovník.sup.1.n.).sub.m.n.-.beta..sup.1.n.-(spojovník.sup.2.n.).sub.n.n.-.beta..sup.2.n. (3), kde každé .beta..sup.1 .n.a .beta..sup.2.n. má aminokyselinovou sekvenci .beta. podjednotky glykoproteinového hormonu obratlovcu vybraného z choriongonadotropinu (CG), folikul stimulujícího hormonu (FSH), luteinizacního hormonu (LH) a thyreotropního hormonu (TSH) nebo varianty kterékoli z techto .beta. podjednotek mající 1 až 10 zmen aminokyselin, kterými jsou delece nebo konzervativní substituce aminokyselin, ".alfa." oznacuje .alfa. podjednotku spolecnou uvedeným glykoproteinovým hormonum obratlovcu nebo variantu této .alfa. podjednotky mající 1 až 10 zmen aminokyselin, kterými jsou delece nebo konzervativní substituce aminokyselin, pricemž uvedené varianty .beta. podjednotek a .alfa. podjednotky si podržují aktivitu jako agonista nebo antagonista, "spojovník" se vztahuje na kovalentne vázanou skupinu, jež oddeluje podjednotky .beta..sup.1.n. a .beta..sup.2.n. do takové vzdálenosti od podjednotky .alfa. a od sebe navzájem, aby se zachovala aktivita jako agonista nebo antagonista, kde spojovník je hydrofilní, aby se udržel v roztoku a nebránil interakci mezi podjednotkami, a každé m a n je nezávisle 0 nebo 1.
Description
Jednořetězcové bifunkční glykoproteinové hormony
Oblast techniky
Tento vynález se týká oblasti proteinového inženýrství, zvláště modifikovaných forem určitých glykoproteinových hormonů, normálně se vyskytujících jako heterodimery. Vynález se týká modifikovaných jednořetězco vých forem choriogonadotropinu (CG), hormonu stimulujícího štítnou žlázu (TSH), luteinizačního hormonu (LH) a hormonu stimulujícího folikuly (FSH), jež vykazují dvojí účinky nebo funkce nebo se zpravidla mohou chovat jako agonisty a/nebo antagonisty přírodních hormonů.
U lidí mají čtyři důležité glykoproteinové heterodimery hormonů (LH, FSH, TSH a CG) identické a podjednotky a rozdílné β podjednotky. Tři z nich se rovněž vyskytují prakticky ve všech druzích obratlovců; CG byl dosud nalezen jen v primátech a v placentě a moči březích klisen.
Dosavadní stav techniky
Přihláška PCT WO 90/09800, publikovaná 7. září 1990, popisuje množství modifikovaných forem těchto hormonů. Jedna důležitá modifikace je extenze C-konce polypeptidu β podjednotky peptidem zakončeným karboxylem (CTP) lidského choriongonadotropinu nebo jeho variantou. Jsou rovněž popsány další muteiny těchto hormonů. CTP je sekvence aminokyselin sahající od kterékoliv z poloh 112-118 do polohy 145 β podjednotky choriongonadotropinu. Přihláška PCT popisuje varianty extenze CTP dosažené konzervativními aminokyselinovými substitucemi tak, aby se nezničila schopnost CTP měnit charakteristiky clearance. Kromě toho přihláška PCT WO 94/24148, publikovaná 27. října 1994, popisuje úpravu těchto hormonů extenzí nebo inzercí CTP v jiných místech než je C-konec polypeptidu, a fragmenty CTP kratší než je sekvence sahající od poloh 112-118 do 145.
β Podjednotka FSH rozšířená o CTP se též popisuje ve dvou článcích přihlašovatelů tohoto patentu; LaPolt, P.S., a další; Endokrinology (1992) sv. 131: 2514-2520, a Fares, F. A. a další; Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1992), sv. 89, 4304-4308.
Krystalová struktura heterodimemí formy lidského choriongonadotropinu byla nyní publikována ve více nebo méně současných článcích; jedním byl Lapthom, A. J. a další: Nátuře (1994), sv. 369, 455-461 a jiný článek: Wu, H a další: Structure (1994), sv. 2, 545-558. Závěry těchto článků sumarizoval Patel, D. J., Nátuře (1994), sv. 369,438^139.
Přihláška PCT WO 91/16922 publikovaná 14. listopadu 1991 popisuje větší počet chimérických ajinak modifikovaných forem heterodimemích glykoproteinových hormonů. Popis se všeobecně zaměřuje na chiméry podjednotek a a β včetně částí různých řetězců a a β. Jeden konstrukt pouze uvedený v této přihlášce, ale blíže nepopsaný, fúzuje v podstatě celý β řetězec lidského choriongonadotropinu k preproteinu a podjednotky, to znamená včetně vylučovací signální sekvence pro tuto podjednotku.
Dvě další publikované přihlášky PCT popisují jednořetězcové formy těchto hormonů, v nichž jsou a a β jednotky kovalentně vázány za vzniku fúzního peptidu obecného vzorce:
β (spojovník^ a, nebo a (spojovník),, β přičemž n je od 0 do 1 a a a β představují podjednotky těchto hormonů: Moyle, W. R., přihláška PCT WO 95/22340, publikovaná 24. srpna 1995 a přihláška téhož vynálezce WO 96/05224, publikovaná 22. února 1996.
1CZ 299742 B6
Formy výše popsaných jednořetězcových glykoproteinových hormonů, v nichž se redukoval počet cystinových můstků, se popisují v patentové přihlášce USA č. 08//933,693, podané 19. 9. 1997, zveřejněné jako patent US 6 693 074.
Nyní bylo zjištěno, zeje možné konstruovat jednořetězcové formy glykoproteinových hormonů se zvýšenou agonistickou a/nebo antagonistickou aktivitou a/nebo bifunkčních, které obsahují dvě β podjednotky v jednom řetězci, takže mají společnou a podjednotku. Tyto formy mohou obsahovat různé extenze a inzerce CTP stejně jako varianty přírodních forem podjednotek a a β a io CTP, jak se popisuje ve výše uvedených dokumentech.
Podstata vynálezu is Vynález poskytuje jednořetězcovou formu glykoproteinových hormonů obsahujících dvě β podjednotky, jež mohou být buď tytéž nebo rozdílné. Jednořetězcové formy podle vynálezu mohou být buď glykosylované, částečně glykosylované nebo neglykosylované a a a β řetězce vyskytující se v přírodních glykoproteinových hormonech nebo jejich variantách mohou být podle přání spojeny skupinou spojovníku. Zvláště výhodné skupiny ve funkci spojovníku zahrnují peptido20 vou jednotku ukončenou karboxylem (CTP), buď jako kompletní jednotku nebo jako variantu obsahující varianty představující jen její část. Výsledné jednořetězcové hormony buď zachovávají aktivitu nemodifikovaných heterodimemích forem, nebojsou vůči této aktivitě antagonisty, Jsou-li dvě β podjednotky odlišné, jsou jako agonisty a/nebo antagonisty bifunkční.
Proto je v jednom ohledu tento vynález zaměřen na glykosylovaný nebo neglykosylovaný protein vzorce β^spojovník1)m--α-(spojovník2)n-β2 (1), nebo
P'4spojovník\n-34spojovník2)ira (2), nebo a^spojovniťjm-p^spojovník2)^2 (3) kde každé β1 a β2 má aminokyselinovou sekvenci β podjednotky glykoproteinového hormonu obratlovců vybraného z choriongonadotropinu (CG), folikul. stimulujícího hormonu (FSH), luteinizačního hormonu (LH) a thyreotropního hormonu (TSH) nebo varianty kterékoli z těchto β podjednotek mající 1 až 10 změn aminokyselin, kterými jsou delece nebo konzervativní substituce aminokyselin, „a“ označuje a podjednotku společnou uvedeným glykoproteinovým hormonům obratlovců nebo variantu této a podjednotky mající 1 až 10 změn aminokyselin, kterými jsou delece nebo konzervativní substituce aminokyselin, přičemž uvedené varianty β podjednotek a a podjednotky si podržují aktivitu jako agonista nebo antagonista, „spojovník“ se vztahuje na kovalentně vázanou skupinu, jež odděluje podjednotky β' a β2 do takové vzdálenosti od podjednotky a a od sebe navzájem, aby se zachovala aktivita jako agonista nebo antagonista, kde spojovník je hydrofilní, aby se udržel v roztoku a nebránil interakci mezi podjednotkami.
Každé n a m je nezávisle 0 nebo 1.
Ve všech předchozích případech zachovává jednořetězcová forma konformaci, takže je v jednořetčzcových formách nutná inkluze celých podjednotek. Vynález proto zahrnuje sloučeniny vzorců (1), (2) a (3) obsahující fragmenty a a/nebo β podjednotek, přičemž tyto formy zachovávají biologickou aktivitu, jakou vykazují odpovídající formy, jež obsahují kompletní podjednotky.
-2CZ 299742 B6
V dalších ohledech je vynález zaměřen na rekombinantní materiály a způsoby produkce proteinů podle vynálezu a na farmaceutické kompozice, jež je obsahují; dále na specifické protilátky pro tyto proteiny a způsoby jejích užití.
Stručný popis obrázků
Obrázek 1 ukazuje vazbu sloučeniny CGP-a-CTP-FSHp na receptor RH v konkurenci hCG. Obrázek 2 ukazuje vazbu sloučeniny z obrázku 1 na receptor FSH v konkurenci FSH.
Realizace vynálezu
Čtyři lidské „glykooproteinové“ hormony tvoří rodinu složenou z lidského choriongonadotropinu (hCG), hormonu stimulujícího folikuly (FSH), luteinizačního hormonu (LH) a hormonu stimulujícího štítnou žlázu (TSH). Zde používaný termín „glykoproteinové hormony“ se vztahuje ke všem členům této rodiny. Všechny tyto hormony jsou heterodimery složené z a podjednotek, které jsou ve skupině identické co do sekvence aminokyselin, a z β podjednotek, které se u různých . členů rodiny liší. Proto se tyto glykoproteinové hormony vyskytují jako heterodimery složené z a a β podjednotek, jež jsou spojeny, ale ne kovalentní vazbou. FSH, TSH a LH vytváří většina obratlovců; choriongonadotropin byl nalezen jen v primátech včetně lidí a březích klisnách.
Ve zvířatech jsou ct a β podjednotky všech hormonů kódovány v různých genech, syntetizují se odděleně a potom jsou složeny do nekovalentního heterodimemího komplexu. Ve sloučeninách podle vynálezu se β podjednotky přímo váží na a podjednotku do jednořetězcové molekuly, jež je v primární struktuře v podstatě lineární. Trojrozměrná struktura vyplývající ze sekundárních a terciárních strukturálních skutečností a zkonformace je zřejmě dostatečně podobná heterodimerní formě, aby umožnila uplatnění funkčnosti heterodimeru představované β podjednotkami. Při vhodné proměně struktury podjednotek může však mít sloučenina podle vynálezu aktivitu agonisty nebo antagonisty; když jsou kupříkladu β podjednotky rozdílné, sloučeniny mohou mít aktivitu antagonisty ve vztahu k receptoru jednoho glykoproteinového hormonu, ale aktivitu agonisty pro receptor jiného hormonu, nebo může mít aktivitu agonisty nebo antagonisty pro oba. Spektrum aktivit jež vykazují sloučeniny podle vynálezu bude stejně záviset na volbě jednotlivých a a β podjednotek, na povaze skupin spojovníku i na orientaci a a β podjednotek.
V nej výhodnějším provedení vynálezu jsou sloučeniny vzorců (l), (2) nebo (3) fúzní proteiny (fusion proteins), v nichž jsou a a β podjednotky spojeny N-konec-C-konec (head-to-tail) buď přímo nebo přes peptidové spojovníky. Když sekvenci tvoří jen genově kódované aminokyseliny, lze sloučeninu syntetizovat rekombinantně. U takových sloučenin podle vynálezu je však nutno provést restrikci; a a β podjednotky stejně jako spojovníky mohou obsahovat aminokyseliny, jež nejsou kódovány genově. Kromě toho spojovníky nemusí být nutně peptidy, nýbrž například dikarboxylové kyseliny nebo anhydridy, diaminy nebo bifunkční spojovníky od firmy Pierce Chemical Co., Rockford, II. a podobně. Kromě toho se mohou podjednotky spojovat buď přímo nebo přes spojovník v konfiguraci N-konec - N-konec (head-to-head) nebo C-konc - C-konc (tail-to-tail) stejně jako v konfiguraci N-konec - C-konec, jak se vyžaduje u fúzních proteinů.
V těchto případech se v konfiguraci N-konec - N-konec mohou dvě aminoskupiny spojit prostřednictvím anhydridu nebo derivátu dikarboxylové kyseliny; dvě karboxylové skupiny se mohou spojit přes diaminy nebo dioly za použití standardních aktivačních technik.
Z praktických důvodů je však nejvýhodnější formou konfigurace N-konec - C-konec, při kterých postačují standardní peptidové vazby a sloučenina se může připravit rekombinantně jako fúzní protein nebo za použití způsobu pro přípravu syntetického peptidu buď v jediném sledu reakcí nebo výhodněji ligací jednotlivých částí celé sekvence.
- 3 CZ 299742 B6
Ve všech provedeních jsou však a a β podjednotky připojeny ke zbytku molekuly v polohách blízkých jejich N a C koncům. Dává se přednost, aby se tyto podjednotky vázaly přímo přes svá zakončení, avšak toto spojení může být jednoduše „proximální“, Obecně platí, že „proximální“ znamená polohu, jež je v rozsahu méně než 10 aminokyselin, raději do 5 aminokyselin, ještě výhodněji pod dvě aminokyseliny a nejraději na samotném zakončení.
Podjednotky jako strukturní složky
Zde uváděné společné a podjednotky a β podjednotky FSH, LH, TSH a CG, stejně jako heterodimemí formy, mají své konvenční definice a vztahují se k proteinům se sekvencemi známými v oboru, nebo k jejich alelickým variantám, bez ohledu na to zda jsou aminokyseliny postranních řetězců glykosy lovány nebo jinak derivatizovány.
„Přírodní“ formy těchto peptidů jsou ty, které mají sekvence aminokyselin, jež byly izolovány z odpovídajících tkání obratlovců, a mají tyto známé sekvence buď jako takové nebo v podobě jejich alelických variant.
„Variantní“ formy těchto proteinů a jednotek CTP (viz dole) jsou takové, které vykazují záměrné změny včetně vyštípnutí sekvencí aminokyselin přírodního proteinu, vzniklé například místně specifickou mutagenezí nebo jinou rekombinantní technikou, nebo připravené synteticky.
Tyto změny spočívají ve změnách 1-10, raději 1-8 a nejraději 1-5 aminokyselin, kteréžto změny zahrnují delece, inzerce a substituce, nejraději konzervativní substituce aminokyselin. Výsledné varianty musí zachovávat aktivitu ovlivňující odpovídající aktivitu přírodního hormonu, to znamená že musí zachovat biologickou aktivitu přírodního hormonu aby se choval jako agonista, nebo se musí chovat jako antagonisty zpravidla v důsledku schopnosti vázat receptory pro přírodní hormony a neschopnosti provést transdukci signálu.
„Konzervativní analog“ v konvenčním smyslu znamená analog, v němž nahrazený zbytek patří do téže obecné kategorie aminokyselin jako zbytek, jímž se nahrazuje. Aminokyseliny byly zařazeny do skupin jež popisuje odborná literatura, například Dayhoff, M. a další, Atlas of Protein Sequences and Structure (1972), sv. 5, 89-99. Obecně platí, že jednu skupinu tvoří kyselé aminokyseliny, bazické druhou, neutrální hydrofilní tvoří třetí a tak dále. Podrobnější klasifikaci uvádí patentová přihláška WO 96/05224.
Jednou ze souborů výhodných variant je varianta, v níž jsou pozměněna místa glykosylace buď a nebo β podjednotky nebo obou. Některé z užitečných zde popsaných variant kvarteta hormonů jsou uvedeny v patentu US 5 177 193 ž 5. ledna 1993, Jakje v nich zřejmé, schémata glykosylace se mohou změnit zničením odpovídajících míst nebo alternativně volbou hostitelských buněk, v nichž protein vzniká.
Změny sekvence aminokyseliny též zahrnují inzerce a delece. Proto jsou mezi variantami vyštípnuté formy hormonů, například mutanty a podjednotky, kterým chybějí některé nebo všechny aminokyseliny na pozicích 85-92 při C-konci. Kromě toho jsou zde a podjednotky s deletovanými aminokyselinami 1-10 odN-konce.
Varianty též zahrnují takové, jejichž nekritické regiony byly změněny nebo odstraněny. Takové delece nebo změny mohou zahrnovat celé smyčky, takže de letovány nebo změněny mohou být sekvence obsahující o mnoho více než 10 aminokyselin. Výsledné varianty si však musí podržet alespoň domény s vazbou na receptory a/nebo oblasti, jichž se týká transdukce signálu.
Existuje obsáhlá literatura týkající se variant glykoproteinových hormonů a je jasné, že lze připravit velký počet možných variant, jež vykazují aktivitu agonistů a antagonistú. Takové varianty popisuje například Chen, F. a další, Molec. Endocrinol. (1992), sv. 6,914—919; Yoo, J. a
-4CZ 299742 B6 další, J. Biol. Chem. (1993), sv. 268, 13034-13042; Yoo, J. a další, J. Biol. Chem. (1991), sv. 266, 17741-17743; Puett, D. a další, Glycoprotein Hormones, Lusbader, J. W. a další, EDS, Springer Verlag New York (1994), 122-134; Kuetmann, Η. T. a další (tamtéž), s. 103-117; Erickson, L. D. a další, Endocrinology (1990), sv. 126, 2555-2560; a Bielinska, M. a další, J. Cell. Biol. (1990), sv. 111, 330a (Abstract 1844).
Mezi jinými variantami jsou i takové, v nichž je deletována jedna nebo více cystinových vazeb, typicky náhradou jednoho nebo obou cysteinů, které se zúčastňují na vazbě, neutrální aminokyselinou. Zvláště výhodnými cystinovými vazbami, jež lze deletovat, jsou vazby mezi polohami 26 a 110 a mezi polohami 23 a 72.
Navíc bylo ukázáno, že β podjednotky hormonového kvarteta se mohou konstruovat v chimérických formách s cílem získat biologické funkce obou složek chiméry, nebo obecně hormony se změněnou biologickou funkcí. Takto se mohou chimérické molekuly s aktivitami jak FSH tak LH/CG připravit podle popisu Moyle, Proč. Nati. Acad, Sci. (1991), sv. 88, 760-764; Moyle, Nátuře (1994), sv. 368, 251-255. Jak se v těchto článcích popisuje, náhrada zbytků vCG-β podjednotkách odpovídajícími aminokyselinami 101-109 FSH-β poskytuje analog s oběma aktivitami hCG t FSH.
Zde používané termíny „peptid“ a „protein“ jsou vzájemně zaměnitelné, protože rozdíl v jejich délce je věcí názoru.
Jak je výše uvedeno, „varianty“ použité jako a a β podjednotky při vytváření sloučeniny podle vynálezu se spojovacími skupinami nebo bez nich mohou představovat úplné sekvence aminokyselin v podjednotkách nebo jen jejich částech.
„Varianty“ také zahrnují a a/nebo β řetězce obsahující CTP (nebo variantu CTP) vložené do nekritické oblasti.
„Nekritické“ oblasti a a β podjednotek jsou takové oblasti molekul, jichž není třeba pro biologickou aktivitu (včetně aktivity agonisty a antagonisty). Zpravidla se tyto oblasti odstraňují z vazebných míst, míst pro odštěpení prekurzoru a z katalytických regionů. Je třeba zjistit oblasti kritické pro zajištění správného skládání, vazby na receptory, katalytické aktivity a podobně. Zmiňme se, že některé oblasti, které jsou kritické u dimerů, se v případě jednořetězcových forem stávají nekritickými, protože konformační restrikce způsobená molekulou může zrušit nezbytnost těchto oblastí. Určení nekritických oblastí se snadno zajistí delecí nebo modifikováním dotyčných oblastí a uskutečněním vhodného testu pro hledanou aktivitu. Oblasti, v nichž.modifikace mají za následek ztrátu aktivity, jsou kritické; oblasti, v nichž se po změně Zachová tatáž nebo podobná aktivita (včetně aktivity agonisty), jsou považovány za nekritické.
Opět je třeba zdůraznit, že „biologickou aktivitou“ se míní aktivita, jež je buď agonistická nebo antagonistická k aktivitě přírodních hormonů. Proto jsou určité oblasti kritické pro chování varianty jako antagonisty, i když tento antagonista není schopen přímo zajistit fyziologický účinek hormonu.
Například polohy 33-59 jsou v případě a podjednotky považovány za nezbytné pro transdukci signálu a rozšíření aminokyseliny 20 na karboxylovém konci je nutné pro vazbu transdukce signálu na receptor. Zbytky kritické pro spojení s β podjednotkou jsou minimálně zbytky 33-58 a zvláště 37-40.
Kde je nekritický region proximální k N- nebo C-konci, dochází k inzerci v kterékoliv poloze do 10 aminokyselin od konce, výhodně do 5 aminokyselin a nejvýhodněji na konci samotném.
Zde používaný termín Jednotka CTP“ se týká aminokyselinové sekvence nalézající se na karboxylovém konci β jednotky lidského choriongonadotropinu sahající od aminokyseliny
-5CZ 299742 Bó
112-118 ke zbytku 145 na C-zakončení, nebo její části. Proto každá „úplná“ jednotka CTP obsahuje 28-34 aminokyselin v závislosti na N-konci CTP.
„Částečnou“ jednotkou CTP se míní aminokyselinová sekvence mezi polohami 112-118 až 145 včetně, která však má nejméně jednu aminokyselinu deletovanou vzhledem k nejkratší možné „úplné“ jednotce CTP (to znamená od polohy 118-145). Tyto „částečné“ jednotky CTP jsou zahrnuty v definici „varianty“. „Částečná“ jednotka CTP výhodně obsahuje nejméně jedno místo O-glykosylace. Některé neglykosyl ováné formy hormonů jsou antagonisté a jako takové jsou užitečné. Jednotka CTP obsahuje čtyři glykosylační místa na serinových zbytcích v polohách 121 ío (místo 1), 127 (místo 2), 132 (místo 3) a 138 (místo 4). Částečné formy CTP použitelné jako agonisty obsahují jedno nebo více těchto míst uspořádaných v pořadí, v němž jsou v přírodní sekvenci CTP, i když intervenující místa mohou být vynechána.
V některých případech se jednotky CTP mohou použít jako inzert nebo jako spojovníky v tande15 mu, „Tandemovými“ inzerty nebo extenzemi se míní, že inzert nebo extenze obsahuje nejméně dvě jednotky CTP“, Každá jednotka CTP může být úplná nebo fragment, a přírodní nebo varianta. Všechny jednotky CTP v tandemové extenzi nebo inzertu mohou být identické nebo se mohou jedna od druhé lišit.
„Spojovníková skupina“ je skupina spojující sekvence a a β aniž by ovlivňovala aktivitu, kterou by jinak tytéž a a β řetězce vykazovaly jako členové heterodimerů, nebo která mění aktivitu z aktivity agonisty na antagonistu. Úroveň aktivity se může v rozumném rozsahu měnit, ale přítomnost spojovníku nesmí zbavit jednořetězcovou formu ani podstatné části aktivity agonisty ani podstatné Části aktivity antagonisty. Jednořetězcová forma nepředstavuje propeptid, nýbrž zralý protein a musí vykazovat aktivitu vztahující se k hormonální aktivitě heterodimerů, jehož prvky tvoří jeho složky.
Bifunkční hormony podle vynálezu se nej efektivněji a nej ekonomičtěji připravují rekombinantními způsoby. Proto se dává přednost fúzním proteinům obsahujícím zmíněné formy a a β řetězců, jednotkám CTP a ostatním skupinám ve funkci spojovníků, které obsahují jen genově kódované aminokyseliny. Je však možné, jak uvedeno výše, konstruovat přinejmenším část jednořetězco. vých hormonů za použití způsobů pro syntetické peptidy nebo jiných technik organické syntézy a proto jsou varianty obsahující aminokyseliny nekódované genově a nepeptidické spojovníky rovněž v rozsahu tohoto patentu.
V nej výhodnějším provedení se v případě potřeby C-konec podjednotky β1 kovalentně váže přes spojovník, na N-konec zralé podjednotky a, jež se zase může kovalentně vázat přes a spojovník, na podjedriótku β2. Vazbou může být přímá peptidická vazba, při níž se C-konec aminokyseliny jedné podjednotky přímo váže peptidickou vazbou na N-konec jiné podjednotky; v mnoha přípa40 dech je však výhodné vložit mezi tyto dva konce skupinu spojovníku. V mnoha případech tato spojovníková skupina dodává mezi dva řetězce alespoň jednu β formu. Proto může být ve spojovníku výhodná přítomnost prolinového zbytku.
(Je třeba rozumět, že pokud jde o vazby mezi konci podjednotek obsahujících jednořetězcové formy, lze jeden nebo dva konce změnit substitucí a/nebo delecí jak popsáno výše).
V jednom zvláště výhodném provedení jde o vazbu typu N-konec - C-konec (head-to-tail) a skupina spojovníku obsahuje jednu nebo více jednotek CTP a/nebo varianty jejich vyštípnutých forem. Výhodné formy jednotek CTP použitých v podobných skupinách spojovníků jsou popsány v dalším.
Skupina spojovníku může rovněž obsahovat lék vázaný na skupinu spojovníku kovalentně a pokud možno tak aby jej bylo možno odštěpit. Způsoby připojení léku na spojovník a jeho odštěpení jsou běžně známé.
-6CZ 299742 Bó
Kromě výskytu ve skupině spojovníku se jednotky CTP a jejích varianty mohou vyskytovat v nekritické oblasti podjednotky a tak přispívat ke stavbě jednořetězcového hormonu jak je popsáno výše,
1 když jsou výhodnými inkluzemi ve skupinách spojovníku jednotky CTP, je jasné, že spojovníkem může být každý vhodný kovalentně vázaný materiál zajišťující vhodný odstup mezi podjednotkami a a β. Proto může být obecně spojovníkem pro konfigurace N-konec - C-konec dvoj vazná skupina jako je peptid obsahující libovolný počet aminokyselin, ale typicky méně než 100, raději však méně než 50, který má správný poměr hydrofilního k hydrofobnímu charakteru, ío aby zajistil vhodné rozmístění a konformaei v roztoku, nebo nepeptidický spojovník, který vykazuje tyto charakteristiky. Platí, že by spojovník měl být hydrofilní, aby se udržel v okolním roztoku a nebránil interakci mezi podjednotkami a a β nebo dvou β podjednotek. Je výhodné když spojovník má β struktury, jež typicky dodávají prolinové zbytky v peptidových spojovnících, nebo když obsahuje serin a/nebo glycinové zbytky. Může se použít kterýkoliv vhodný polymer včetně peptidových spojovníků s výše uvedenými vhodnými vlastnostmi.
Zvláště výhodná provedení bifunkčních hormonů podle vynálezu zahrnují konfigurace typu N-konec - C-konec.
βίβΗ-α-βΕδΗ; α^Η-βΓΉ; βΡδΗ-<χ-βΕΗ; βίΗ-α-βίΗ; a-pLH-PFSH; βΕΗ-α-βΡ8Η; βΤ8Η-α-βΤ8Η; βΤδΗ-βΡδΗ-α; βΤ8Η-α-βΡ8Η;
pCG-a^CG; a^CG-PFSH; a-pCG-pTSH; pCG-pFSH-a; pCG-a-pTSH; pFSH-CTP-a-pFSH; a-PFSH-CTP-pLH; pFSH-CTP-a-pLH;
pLH-CTP-a-pLH; a-PLH-CTP-pFSH; pLH-a-CTP-pFSH;
PLH(6115-123)-a-pFSH; βΤΗ(δ115-123)-<TP-<x-pFSH; pCGCTP-a CTP-pFSH-CTP-CTP;
pTSH-CTP-CTP-a PFSH-CTP-CTP; pFSH-CTP-CTP-a-pLH; PLH-CTP-CTP-pLH-a;
pCG-CTP-GTP-a-pTSH; pCG-CTP-CTP-pLH-a; pFSH-CTP-pLH(ól 15-123)-CTP-a;
a podobně. Lidské formy podjednotek jsou rovněž zvláště výhodné. V konfiguracích uvedených výše znamenají CTP takové CTP nebo jejich varianty, které obsahují vyštípnutí jak je popsáno v patentové přihlášce WO 96/05224.
Zatímco pro humánní medicínu jsou vhodné humánní formy podjednotek a a β, je třeba poznamenat, že odpovídající formy v ostatních obratlovcích jsou užitečné ve veterinárním lékařství. Takže podjednotky FSH, TSH a LH charakteristické pro hovězí dobytek, koně, prasata, kočky, psy a jiné druhy jsou vhodné při indikacích týkajících se těchto zvířecích druhů.
40
Vhodné léky, jež mohou být obsaženy ve spojovníkových skupinách, zahrnují peptidy nebo proteiny jako jsou růstové faktory typu inzulínu, epidermální růstové faktory, kyselý a zásaditý růstový faktor fibroplastu, růstový faktor na bázi krevní destičky, faktoiy stimulující růst různých kolonií, jako je granulocyt CSF, makrofág CSF a podobně, různé cytokiny jako IL-2, IL—3 a množství dalších proteinů interleukinu; různé interferony, faktor nekrózního tumoru a podobně. Mohou zde být vhodná místa pro odštěpení za účelem izolace léku jako jsou targentní sekvence pro proteázy, jejichž cílová místa nejsou přítomna v podjednotkách a a β. Výhodou léků na bázi peptidů nebo proteinů je, že je možno připravit celý konstrukt rekombinantní expresí jediného genu. Lze užít i léků s malou molekulou jako jsou antibiotika, protizánětlivé léky, toxiny a podobně. Všeobecně platí, že se od léků obsažených ve skupině spojovníku požaduje, aby působil v blízkosti receptorů na něž se hormony normálně váží. Zajišťuje se vhodné opatření pro uvolnění léku z inkluze ve spojovníku, například zajištěním míst pro enzymaticky katalyzovanou lýzu, jakje dále popsáno v kapitole věnované preparacním metodám.
-7CZ 299742 B6
Jednořetězcové proteiny podle vynálezu se též mohou spojovat nebo derivatizovat způsoby užívanými u sekvencí aminokyselin jako je fosforylace, glykosylace, deglykosylace normálně glykosylovaných forem, acylace, modifikace aminokyselinových postranních řetězců (například konverze prolinu na hydroxyprolin) a podobné modifikace analogické posttranslačním dějům, k nimž běžně dochází.
Stupeň glykosylace hormonů podle vynálezu je zvláště důležitý. Hormony se připravují v neglykosylované formě buď jejich tvorbou v prokaryotických hostitelích nebo mutacemi glykosy10 lačních míst, jež se normálně vyskytují v podjednotkách a/nebo všech jednotkách CTP jež se zde případně vyskytují. Jak neglykosylované verze, tak částečně gtykosylované verze hormonů se mohou připravit manipulací glykosylačních míst. Normálně jsou ovšem glykosylované verze rovněž zahrnuty v rozsahu tohoto vynálezu.
Jak je v oboru všeobecně známo, jednořetězcové proteiny podle vynálezu se též mohou vázat na radioaktivní prvky a jiné indikátory, nosiče, pevné podklady a podobně v závislosti na zamýšlené aplikaci. Značené formy se mohou užít pro sledování jejich metabolických osudů; vhodnými izotopy pro tento účel jsou zvláště radioizotopy jako jod 131, technecium 99, indium lila podobně. Značení radioizotopy se může použít i pro detekci jednořetězcových proteinů ve zkušebních systémech. V tomto případě se radioizotopy též mohou použít ve formě značených enzymů, fluorescentních indikátorů, chromogenních indikátorů a podobně. Použití takových indikátorů umožňuje lokalizaci příslušných receptorů, protože se mohou aplikovat jako targentní činidla takových receptorů.
Proteiny podle vynálezu se též mohou vázat na nosiče s cílem zvýšit jejich imunogenní charakter při přípravě protilátek se specifickou imunoreaktivitou vůči těmto novým modifikovaným formám. Vhodnými nosiči pro tento účel jsou hemocyanin z kuželnatky (keyhole limpet- KLH), albumin z bovinního séra (BSA), toxoid diftérie a podobně. Mohou se použít standardní kopulační způsoby pro vázání modifikovaných peptidů podle vynálezu na nosiče včetně použití bifunkčních spojovníků.
Podobné způsoby spojování se vedle ostatních mohou použít pro vazbu proteinů podle vynálezu na pevné podklady. Po kopulaci se tyto proteiny mohou použít jako afinitní reagenty pro separaci požadovaných složek, jež se účastní specifických reakcí. Proto jsou použitelné pro purifikaci a izolaci receptorů s nimiž reaguje vhodná β podjednotka.
Způsoby přípravy proteinů podle vynálezu jsou v oboru dobře známy. Jak je uvedeno výše,, pokud jsou přítomny jen genově kódované aminokyseliny á jeďnořetčzcová forma má uspořádání N-konec - C-konec, nej praktičtějším způsobem je v současné době syntetizovat tyto materiály rekombinantně expresí DNA kódující požadovaný protein. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci kódující jednořetězcovou formu včetně variant se může připravit z přírodních sekvencí nebo nově syntetizovat za použití kombinací těchto způsobů. V oboru jsou dnes dobře známy způsoby pro místně cílenou mutagenezi, ligaci dalších sekvencí, amplifikaci jako je PCR a konstrukce vhodných expresních systémů. DNA kódující potřebný protein nebo její částí se mohou konstruovat synteticky za použití standardních způsobů v pevné fázi, výhodně po vložení restrikčních míst pro usnadnění tigace. Pro kódující sekvenci DNA lze dodat vhodné regulační prvky pro transkripci a translaci vložené kódující sekvence. Jak je všeobecně známo, je dnes možno komerční cestou získat expresní systémy kompatibilní se širokým spektrem hostitelů, včetně prokaryotických hostitelů jako je E. coli nebo B. subtilis a eukaryotických hostitelů jako jsou kvasinky, ostatní houby jako Aspergillus a Neurospora, rostlinné buňky, hmyzí buňky, buňky savců jako jsou buňky CHO, ptačí buňky a podobně.
Volba hostitele je důležitá zvláště pro posttranslační děje a zvláště pro glykosylaci. Lokace glykosylace se nejčastěji reguluje povahou glykosylačních míst v molekule; povaha cukrů na
-8CZ 299742 Bó těchto místech se však ve velkém rozsahu řídí povahou hostitele. V důsledku toho lze jemného vyladění vlastností hormonů podle vynálezu dosáhnout správnou volbou hostitele.
Zvláště výhodnou formou genu pro část podjednotky a, ať je a podjednotka modifikovaná nebo nemodifikovaná, je konstrukce „minigenu“. Ve smyslu zde používaném se termín „minigen“ a podjednotky vztahuje ke konstrukci genu popsané Matzukem, Μ. M. a dalšími, Mol. Endocrinol. (1988), sv. 2,95-100 při popisování konstrukce (přípravy) pM2/CG a nebo pM2/I.
Při rekombinantní přípravě se používají modifikované hostitelské buňky za použití expresních io systémů a jsou kultivovány pro přípravu požadovaného proteinu. Zde se používá těchto termínů:
Termín „modifikovaná“ rekombinantní hostitelská buňka, to znamená hostitelská buňka „modifikovaná aby obsahovala“ rekombinantní expresní systémy podle vynálezu, se týká hostitelské buňky, jež byla změněna aby obsahovala expresní systém kterýmkoliv běžným způsobem intro15 dukce včetně transfekce, virové infekce a tak dále. „Modifikované buňky“ se týkají buněk obsahujících tento expresní systém, který může být buď integrován do chromosomu nebo extrachromosomální. „Modifikované buňky“ mohou být buď stabilní vzhledem k inkluzi expresního systému, nebo může být kódující sekvence exprimována přechodně. Stručně řečeno, rekombinantní hostitelské buňky „modifikované“ expresním systémem podle vynálezu jsou buňky obsahující tento expresní systém jako výsledek manipulace, jejímž cílem bylo aby jej obsahovaly, když jej v přírodním stavu neobsahovaly, a to bez ohledu na způsobu.jímž se této inkorporace dosáhne.
„Expresní systém“ se týká molekula DNA obsahující kódující nukleotidovou sekvencí, jež má být exprimována, a doprovodné regulační sekvence potřebné pro provedení exprese kódující sekvence. V typickém případě se tyto regulační sekvence skládají z promotoru, sekvencí regulujících zakončení a v některých případech operátoru nebo jiného mechanismu pro regulaci exprese. Regulační sekvence jsou konstruovány, aby byly funkční ve zvláštní cílové rekombinantní buňce hostitele a proto se musí hostitelská buňka zvolit tak, aby byla kompatibilní s regulačními sekvencemi v konstruovaném expresním systému.
Je-li žádoucí sekrece (vylučování) vzniklého proteinu, jsou též přítomny další nukleotidové sekvence kódující signální peptid s cílem vytvořit signální peptid operativně vázaný na žádaný jednořetězcový hormon a v dalším preprotein. Při sekreci se odštěpí signální peptid a uvolní se zralý jednořetězcový hormon.
Zde použité termíny „buňka“, „buněčná kultura“ a „buněčná linie“ jsou vzájemně zaměnitelné a nevěnuje se pozornost jemnostem významů. Pokud je nutné je rozlišovat, usnadní to kontext. Kde se použije jeden z těchto výrazů, byly míněny i všechny ostatní.
Takto připravený protein se může získat z buněčného lyzátu při intraeelulární přípravě nebo z média při přípravě sekrecí. Způsoby získání rekombinantních proteinů z buněčných kultur jsou v oboru dobře prostudovány a tyto proteiny se mohou přečistit za pomoci známých způsobů jako je chromatografie, gelová elektroforéza, selektivní precipitace a podobně.
Všechny hormony podle vynálezu nebo jejich část se mohou syntetizovat přímo za pomoci způsobů syntézy peptidů známých v oboru. Syntetizované části se mohou spojovat ligací a místa odštěpení kteréhokoliv léku obsaženého ve skupině spojovníku se mohou zavádět standardními chemickými prostředky. V provedeních s aminokyselinovými jež nejsou genově kódovány a v provedeních, kde se používá konfigurace N-konec - N-konec nebo C-konec - C-konec ovšem musí syntéza probíhat alespoň zčásti na úrovni proteinu. Spojení N-konec - N-konec na přírodním N-konci nebo v polohách proximálních k přírodním N“konci se musí provádět spojovníky obsahujícími funkční skupiny reaktivní s aminoskupinami jako jsou deriváty dikarboxylových kyselin. Konfigurace C-konec - C-konec na C~koncích nebo v polohách proximálních k C-koncům se může realizovat pomocí spojovníků jako jsou diaminy, dioly nebo jejich kombinace.
-9CZ 299742 B6
Protilátky
Proteiny podle vynálezu se mohou použít pro generování protilátek specificky imunoreaktivních vůči těmto novým sloučeninám. Tyto protilátky jsou použitelné při řadě diagnostických a terapeutických aplikací.
Protilátky se všeobecně připravují za použití standardních imunizačních postupů ze savců jako jsou králíci, ovce a krysy a titrují se jako polyklonální antíséra pro zajištění potřebné imunizace.
Polyklonální antíséra se potom mohou použít jako taková, například pro imunotesty. Protilátky vylučující buňky z hostitele, jako jsou buňky sleziny nebo leukocyty vylučující protilátky, se mohou usmrtit za pomoci známých technik a vytřídit pro produkci monoklonálních protilátek imunospecifických vůči proteinům podle vynálezu. „Protilátky“ obsahují jakýkoli fragment který si zachovává potřebnou imunospecificitu, jako je Fab, Fab-, Fv a tak dále. Protilátky se tedy mohou připravit rekombinantně, typicky izolací nukleotidových sekvencí kódujících přinejmenším variabilní regiony monoklonálních protilátek s vhodnou specifickou, a vytvořením příslušných expresních systémů. Tento přístup umožňuje jakoukoliv potřebnou modifikaci jako je příprava forem Fv, chimérických forem,“humanizovaných“ forem a podobně.
„ímunospecifickými pro proteiny podle vynálezu“ se míní protilátky, jež specificky váží příslušné sloučeniny podle vynálezu, ale nikoliv heterodimery nebo kterékoliv z obsažených podjednotek samotných nebo kterékoliv jednořetězcové formy obsahující jen jednotlivou β podjednotku obecně považovanou za určující pro afinitu nebo neafinitu. Je jasné, že specifičnost je relativní pojem a je možno zvolit subjektivní limit jako například lOOnásobný nebo větší rozdíl ve speci25 fické vazbě. Potom je imunospecifická protilátka spadající pod vynález 1 OOkrát reaktivnější vůči jednořetězcovému proteinu než vůči odpovídajícímu heterodimeru, starším jednořetězcovým formám nebo jednotlivým podjednotkám. Takové protilátky se mohou získat například vytříděním těch, které vázaly sloučeniny podle vynálezu a likvidací těch, jež rovněž váží heterodimery, podjednotky nebo starší jednořetězcové formy podle přihlášek WO 95/22340 a WO 96/05224.
Formulace a podávání
Proteiny podle vynálezu se formulují a podávají způsoby srovnatelnými se způsoby známými pro odpovídající heterodimeiy. Proto se způsoby formulace a administrace liší podle jednotlivých použitých hormonů nebo kombinací hormonů. Dávkování a frekvenci podávání lze však změnit ve srovnání s heterodimerem, zvláště když jsou přítomny jednotky CTP, vzhledem ke delšímu biologickému poločasu vlivem jeho přítomnosti.
Formulace proteinů podle vynálezu jsou formulace typické pro proteinové nebo peptidové léky jak je popisuje Remingtonů Pharmaceutical Sciences, poslední vydání, Mack Publíshing Company, Easton, Pa. Obecně platí, že proteiny se podávají injekčně, typicky intravenózně, intramuskulárně, subkutánně nebo intraperitoneálně, nebo za použití formulací pro transmukózní nebo transdermální administraci. Tyto formulace obecně obsahují detergent nebo penetrační činidlo jako jsou soli žlučových kyselin, kyselina fusidová a podobně. Tyto formulace se mohou podávat jako aerosoly nebo čípky nebo v případě transdermálního podávání jako náplasti. Orální podávání je také možné za předpokladu, že formulace chrání peptidy podle vynálezu před degradací v zažívacím traktu.
Optimalizace dávkovacího režimu a formulace je v oboru prováděna rutinně a jako obvykle. Tyto formulace se též mohou modifikovat a pak zahrnují i formulace vhodné pro veterinární účely.
Sloučeniny podle vynálezu se mohou použít mnoha způsoby, nejběžnější je použití jako náhrada heterodi měrní ch forem hormonů. Potom se podobně jako heterodimery mohou jednořetězcové hormony ve formě agonistů použít v léčbě neplodnosti jako pomocný prostředek ve fertilizaěních technikách in vitro a v dalších terapeutických způsobech spojených s přírodními hormony. Tyto
-10CZ 299742 B6 způsoby lze použít jak pro lidi, tak pro jiné živočichy. Volba způsobu derivace jednořetčzcového proteinu ovšem závisí na subjektu pro který se způsob používá. Je samozřejmé, že dvojí funkčnost vlastní sloučeninám se dvěma odlišnými β podjednotkami znamená pro terapii možnosti, jež zde dříve nebyly.
Sloučeniny podle vynálezu jsou též použitelné jako reagenty způsobem podobným jako u heterodimerů.
Kromě toho se sloučeniny podle vynálezu mohou použít jako diagnostické prostředky pro detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti protilátek, jež se váží na přírodní proteiny v rozsahu, v němž se tyto protilátky váží na odpovídající části těchto jednořetězcových sloučenin v biologických vzorcích. Rovněž jsou použitelné jako kontrolní reakční činidla v soupravách reagentů (assay kits) pro zjišťování koncentrací těchto hormonů v různých vzorcích. Protokoly (metodiky) zjišťování koncentrace samotných hormonů nebo protilátek vytvořených proti nim jsou standardní imuno15 logické metodiky běžně v oboru známé. Lze použít různých kompetitivních a přímých zkušebních způsobů včetně různých způsobů značení, jež zahrnují značení radioizotopy, fluorescenční značení, enzymové značení a podobně.
Sloučeniny podle vynálezu jsou též užitečné při detekci a purifikaci receptorů, na něž se váží přírodní hormony. Takto se mohou sloučeniny podle vynálezu vázat na pevné podklady a použít při přípravě receptorů nebo antihormonálních protilátek afinitní chromatografií. Výsledné receptory jsou samy o sobě použitelné při hodnocení aktivity hormonů jako možných léků při výběru možných terapeutických prostředků a činidel tříděním (screening tests). Je samozřejmě třeba vést v patrnosti podvojnou specifičnost β podjednotek ve všech sloučeninách, kde jsou β podjednotky rozdílné. Kde však jsou dvě β podjednotky identické, nabízejí účinný nástroj purifikace příslušného receptorů na základě afinity.
Protilátky s vysokou reaktivitou vůči sloučeninám podle vynálezu se mohou použít jako nástroje purifikace pro izolaci těchto materiálů z jejich pozdějších přípravků. Rovněž jich lze použít pro monitorování koncentrací těchto látek podávaných ve formě léků.
Následující příklady mají za úkol tento vynález ilustrovat, ale ne limitovat.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Příprava CGP-a-CTP-FSHp
Nukleotidová sekvence kódující sloučeninu uvedenu v titulku se připravila za pomocí dostupných nukleotidových sekvencí pro příslušné části podjednotky. Oblast CGP kóduje 145 aminokyselin lidského CGp; kódující nukleotidová sekvence a podjednotky kóduje 92 aminokyselin lidské ct podskupiny jako minigen; kódující sekvence CTP kóduje 28 aminokyselin reprezentujících polohy 118-145 lidského choriongonadotropinu; kódující region FSHp kóduje 111 amino45 kyselin lidské podjednotky FSHp.
Amplifikovaný fragment obsahující exon 3 CGp, a minigen, CTP a pFSH se vložily na místo Sall exonu 1,2 pM2HA-CGp, expresního vektoru, odvozeného od pM2 a obsahujícího CGp exony 1 a 2 způsobem který popsal Sachais, β Biol. Chem. (1993), sv. 268, 2319. pM2 obsahující
CGp exony 1 a 2 se popisuje v článku Matzuk, Μ. M. a další, Proč. Nati. Acad. USA (1987), sv. 84, 6354-6358, a Matzuk, Μ. M, a další, J. Cell. Biol. (1988), sv. 106, 1049-1059. Nejdříve se do tohoto vektoru po proudu (downstream) vložil jako inzert fragment obsahující a minigen exon 3 CGp a získán byl pM2-HACGPa. pM2-CGpa se potom odštěpil pomocí Seal a následovala
- ll CZ 299742 B6 ligace s pBIIKS(+)a-CTP-FSH po restrikci pomocí Seal. Výsledný expresní vektor pM2-HACG(3-a-CTP-FSH po inzerci do vhodného hostitele produkuje sloučeninu uvedenou v titulku.
Příklad 2
Produkce a aktivita CG(3-a-CTP-FSHp
Expresní vektor konstruovaný v příkladu 1 se transfektoval do buněk vaječníku čínského křečka (CHO) a produkce proteinu se testovala imunoprecipitací radioaktivně značeného proteinu na ío gelech SDS.
Kultivační médium se shromáždilo, zahustilo a testovalo na vazbu na receptor lidského LH (očekávána vazba části pCG-a).
Pro tento test se připravil receptor LH vložením cDNA kódujícího celý receptor lidského LH do expresního vektoru pCMX (Oikawa, J. .X-C a další, Mol. Endrocrinol. (1991), sv. 5, 759-768. Exponenciálně rostoucí buňky 293 se tímto vektorem transfektovaly za použití metod Chen, C. a dalších, Mol. Cell. Biol. (1987), sv. 7,2745-2752, což vedlo k expresi receptorů LH na povrchu.
V tomto pokusu byly buňky exprimující receptor lidského LH (2x105 na zkumavku) inkubovány s 1 ng značeného hCG v konkurenci s rostoucími koncentracemi neznačeného hCG nebo rostoucím množstvím vzorku testovaného 18 hodin při 22 °C. Pokles indikátoru v přítomnosti vzorkuje měřítkem schopnosti vázat se ve vzorku. V tomto pokusu měla heterodimemí hCG z hlediska receptorů pro lidský LH v buňkách 293 aktivitu typickou pro přírodní typ, jak bylo předem zjištěno, a médium obsahující CGp-a-CTP-FSHp rovněž vykázalo aktivitu. Výsledky jsou ukázány v obrázku L Jak je vidno, heterodimemí hCG (čtverečky) i bifunkční jednořetězcové proteiny podle vynálezu (kroužky) úspěšně konkurovaly značeným hCG o receptor LH. Bifunkční sloučenina je méně účinná vlivem karboxylového zakončení podjednotky a.
V obrázku 1 jsou též ukázány výsledky testu, v němž se zkoušela různá množství kultivační kalové vody (supernatant), získané z buněk modifikovaných tak, aby obsahovaly dva expresní systémy. Jeden expresní systém produkoval jednořetězcový FSHp~a; jiný produkoval β podjednotku hCG. Výsledný nekovalentně spojený jednořetězcový komplex Ε8Ηα-β/ΟΟβ (trojúhelníky) rovněž při vazbě úspěšně konkuroval.
Podobně se testovala kalová voda z kultivačního média obsahujícího ΟΟβ-α-ΟΤΡ-ΡβΗβ ž hlediska vazby na receptor pro FSH exprimovaný v buňkách 293. Test se prováděl výše popsaným způsobem stím rozdílem, že buňky exprimující receptor lidského LH byly nahrazeny buňkami exprimujícími receptor lidského FSH a značený FSH byl použit jako kompetitor (konkurující faktor). V obrázku 2 jsou ukázány výsledky tohoto testu.
Jak je zřejmé, jednořetězcová sloučenina uvedená v titulku (kroužky) úspěšně konkurovala při vazbě FSH (čtverečky). V nezávislém pokusu, jehož výsledky jsou rovněž ukázány v obrázku 2, směs odlišného typu komplexu, to znamená jednořetězcového ίβΗβ-α nekovalentně spojeného s ΟΟβ, který je smíchán s nadbytečným nekomplexním jednořetězcovým FSHP-α (trojúhelníky), byla vynikajícím konkurentem.
Příklad 3
Konstrukce dalších expresivních vektorů
Podobným způsobem jak je uvedeno v příkladu 1 se připravily expresní vektory pro produkci jednořetězcových bifunkčních FSHp-CTP-a-GGp, α^Ηβ-ΟΤΡ-Οΰβ, εθβ-βΡ8Η-ΰΤΡ-<χ a
-12CZ 299742 B6
PLH-CTP-pFSH-CTP-a a transfektovaly do buněk CHO. Kalové vody z kultivace se kultivují a zkoušejí, jak je popsáno výše, na receptory LH a FSH. Rovněž tyto sloučeniny vykazují schopnost vázat oba receptory.
Claims (17)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Glykosylovaný nebo neglykosylovaný agonistický nebo antagonistický protein vzorce p1(spojovníkt)m-a-(sPojovni^2)n-p2 (0, neboP^spojovník^m-p^spojovník^n-a (2), nebo a^spojovník^m-P^spojovrnVjn-p2 (3)15 kde každé β1 a β2 má aminokyselinovou sekvenci β podjednotky glykoproteinového hormonu obratlovců vybraného z choriongonadotropinu (CG), folikul stimulujícího hormonu (FSH), luteinizačního hormonu (LH) a thyreotropního hormonu (TSH) nebo varianty kterékoli z těchto β podjednotek mající 1 až 10 změn aminokyselin, kterými jsou delece nebo konzervativní substituce aminokyselin,20 „a“ označuje a podjednotku společnou uvedeným glykoproteinovým hormonům obratlovců nebo variantu této a podjednotky mající 1 až 10 změn aminokyselin, kterými jsou delece nebo konzervativní substituce aminokyselin, přičemž uvedené varianty β podjednotek a a podjednotky si podržují aktivitu jako agonista nebo antagonista,25 „spojovník“ se vztahuje na kovalentně vázanou skupinu, jež odděluje podjednotky β1 a β2 do takové vzdálenosti od podjednotky a a od sebe navzájem, aby se zachovala aktivita jako agonista nebo antagonista, kde spojovník je hydrofilní, aby se udržel v roztoku a nebránil interakci mezi podjednotkami, a každé n a m je nezávisle 0 nebo 1.
- 2. Protein podle nároku 1, kde uvedené m a n jsou 1.
- 3. Protein podle nároku 1 nebo 2, kde uvedené podjednotky nebo varianty jsou spojeny N-konec - C-konec a každým spojovníkem, pokud je přítomen, je peptid ό 1 až 100 amiho35 kyselinách.
- 4. Protein podle kteréhokoli z nároků 1 až 3, kde alespoň jedním spojovníkem je CTP nebo jeho varianta, kde uvedená varianta má 1, až 10 změn aminokyselin, kterými jsou delece nebo konzervativní substituce aminokyselin.
- 5. Protein podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, kde a podjednotka a/nebo jedna nebo více β podjednotek jsou modifikovány inzercí do nekritické oblasti kterékoli z uvedených podjednotek nebo jejich variant CTP jednotky nebo její varianty, kde uvedená varianta'má 1 až 10 změn aminokyselin, kterými jsou delece nebo konzervativní substituce aminokyselin.
- 6. Protein podle kteréhokoli z nároků 1 až 5, kde uvedená varianta obsahuje 1 až 5 konzervativních substitucí aminokyselin oproti přírodním sekvencím a/nebo to jsou formy uvedených sekvencí zkrácené o 1 až 5 aminokyselin.50
- 7. Protein podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, kde nejméně jedna uvedená spojovníková skupina zahrnuje lék, který má být zacílen na receptor pro glykoproteinový hormon.-13 CZ 299742 B6
- 8. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protein podle kteréhokoli z nároků 1 až 7 ve směsí s vhodným farmaceutickým vehikulem.5
- 9. Protein podle kteréhokoli z nároků 1 až 7, navázaný na pevný nosič.
- 10. Protilátky imunospecifické pro protein podle kteréhokoli z nároků 1 až 7.
- 11. Molekula DNA nebo RNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující protein podle ío nároku 3.
- 12. Expresní systém pro produkci agonisty a/nebo antagonisty glykoproteinového hormonu, kde tento systém obsahuje první nukleotidovou sekvenci kódující protein podle nároku 3, operativně vázanou na řídicí sekvence schopné provést expresi uvedené první nukleotidové sekvence.
- 13. Expresní systém podle nároku 12, který dále obsahuje druhou nukleotidovou sekvenci kódující signální peptid, operativně vázanou na protein kódovaný první nukleotidovou sekvencí.
- 14. Hostitelská buňka, modifikovaná tak, aby obsahovala expresní systém podle nároku 12.
- 15. Hostitelská buňka, modifikovaná tak, aby obsahovala expresní systém podle nároku 13.,
- 16. Způsob produkce jednořetězco vého proteinu, který je agonistou a/nebo antagonistou glykoproteinového hormonu, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci buněk podle nároku25 14 v podmínkách, v nichž je uvedený protein produkován, a získání uvedeného proteinu z kultury.
- 17. Způsob produkce jednořetezcového proteinu, který je agonistou a/nebo antagonistou glykoproteinového hormonu, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci buněk podle30 nároku 15 v podmínkách, v nichž je uvedený protein produkován, a získání uvedeného proteinu z kultury.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/971,439 US6103501A (en) | 1997-11-17 | 1997-11-17 | Single chain glycoprotein hormones comprising two β and one α subunits and recombinant production thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20001774A3 CZ20001774A3 (cs) | 2000-10-11 |
| CZ299742B6 true CZ299742B6 (cs) | 2008-11-05 |
Family
ID=25518394
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20001774A CZ299742B6 (cs) | 1997-11-17 | 1998-11-09 | Jednoretezcové bifunkcní glykoproteinové hormony |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6103501A (cs) |
| EP (1) | EP1032688B1 (cs) |
| JP (1) | JP4255618B2 (cs) |
| KR (1) | KR20010032147A (cs) |
| CN (1) | CN1173037C (cs) |
| AU (1) | AU754296B2 (cs) |
| BR (1) | BR9814880A (cs) |
| CA (1) | CA2308571C (cs) |
| CZ (1) | CZ299742B6 (cs) |
| DE (1) | DE69839779D1 (cs) |
| HU (1) | HUP0004394A3 (cs) |
| IL (2) | IL135995A0 (cs) |
| NO (1) | NO20002527L (cs) |
| PL (1) | PL342853A1 (cs) |
| TR (1) | TR200001406T2 (cs) |
| WO (1) | WO1999025849A1 (cs) |
Families Citing this family (47)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6319504B1 (en) | 1996-06-24 | 2001-11-20 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Treatment and prevention of HIV infection by administration of derivatives of human chorionic gonadotropin |
| US6583109B1 (en) | 1997-06-24 | 2003-06-24 | Robert C. Gallo | Therapeutic polypeptides from β-hCG and derivatives |
| US6635256B1 (en) * | 1998-10-19 | 2003-10-21 | Washington University | Glycoprotein hormone compositions comprising two β subunits and methods of use thereof |
| US7994278B1 (en) * | 1999-08-06 | 2011-08-09 | Nobel Biosciences Llc | Biologically active polypeptides derived from a novel early stage pregnancy factor designated maternin (MA) |
| AU7546600A (en) * | 1999-10-08 | 2001-04-23 | Biofocus Discovery Limited | Methods and compositions for targeting a cell |
| GB9924351D0 (en) | 1999-10-14 | 1999-12-15 | Brennan Frank | Immunomodulation methods and compositions |
| JP2001333772A (ja) * | 2000-04-25 | 2001-12-04 | Washington Univ | 可変性の活性を有する単鎖稔性ホルモン |
| AU2001255624A1 (en) * | 2000-04-25 | 2001-11-07 | Washington University | Single-chain fertility hormones with variable lh activity |
| US6987172B2 (en) * | 2001-03-05 | 2006-01-17 | Washington University In St. Louis | Multifunctional single chain glycoprotein hormones comprising three or more β subunits |
| US7081446B2 (en) * | 2002-01-31 | 2006-07-25 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Long-acting follicle stimulating hormone analogues and uses thereof |
| EP1610803B8 (en) | 2003-03-04 | 2011-09-14 | AspenBio Pharma, Inc. | LH for use in maintaining one or more pregnancies by inducing accessory corpus luteum formation. |
| JP4412989B2 (ja) * | 2003-12-15 | 2010-02-10 | 株式会社日立製作所 | 複数の記憶システムを有するデータ処理システム |
| US20080039372A1 (en) * | 2005-07-21 | 2008-02-14 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Human chorionic gonadotropin antagonists and methods to prevent ovarian hyperstimulation |
| JP5284789B2 (ja) * | 2005-11-15 | 2013-09-11 | グライコフィ， インコーポレイテッド | Ｏ−グリコシル化を減少している糖タンパク質の生成 |
| US20140113860A1 (en) | 2006-02-03 | 2014-04-24 | Prolor Biotech Ltd. | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same |
| US8048848B2 (en) | 2006-02-03 | 2011-11-01 | Prolor Biotech Ltd. | Long-acting interferons and derivatives thereof and methods thereof |
| US8450269B2 (en) | 2006-02-03 | 2013-05-28 | Prolor Biotech Ltd. | Long-acting growth hormone and methods of producing same |
| US10221228B2 (en) | 2006-02-03 | 2019-03-05 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same |
| US8946155B2 (en) | 2006-02-03 | 2015-02-03 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same |
| US9249407B2 (en) | 2006-02-03 | 2016-02-02 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
| US8759292B2 (en) | 2006-02-03 | 2014-06-24 | Prolor Biotech, Llc | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
| US20150038413A1 (en) | 2006-02-03 | 2015-02-05 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same |
| US9458444B2 (en) | 2006-02-03 | 2016-10-04 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
| US7553941B2 (en) | 2006-02-03 | 2009-06-30 | Modigene Inc | Long-acting polypeptides and methods of producing same |
| US8048849B2 (en) | 2006-02-03 | 2011-11-01 | Modigene, Inc. | Long-acting polypeptides and methods of producing same |
| US10351615B2 (en) | 2006-02-03 | 2019-07-16 | Opko Biologics Ltd. | Methods of treatment with long-acting growth hormone |
| CA2721459A1 (en) * | 2008-05-20 | 2009-11-26 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Efficient production of heterologous proteins using mannosyl transferase inhibitors |
| AU2009282228A1 (en) | 2008-08-12 | 2010-02-18 | Glycofi, Inc. | Improved vectors and yeast strains for protein production: Ca2+ ATPase overexpression |
| US9663778B2 (en) | 2009-07-09 | 2017-05-30 | OPKO Biologies Ltd. | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
| JP2014520869A (ja) | 2011-07-18 | 2014-08-25 | アルツ バイオロジクス アクティーゼルスカブ | 長期作用性で生物学的活性が有る黄体形成ホルモン（ｌｈ）化合物 |
| SG11201406671RA (en) | 2012-04-19 | 2014-11-27 | Opko Biolog Ltd | Long-acting oxyntomodulin variants and methods of producing same |
| MY172997A (en) | 2012-11-20 | 2019-12-18 | Opko Biologics Ltd | Method of increasing the hydrodynamic volume of polypeptides by attaching to gonadotrophin carboxy terminal peptides |
| EP2968391A1 (en) | 2013-03-13 | 2016-01-20 | Moderna Therapeutics, Inc. | Long-lived polynucleotide molecules |
| US20150158926A1 (en) | 2013-10-21 | 2015-06-11 | Opko Biologics, Ltd. | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same |
| IL301728A (en) | 2015-06-19 | 2023-05-01 | Opko Biologics Ltd | Long-term coagulation factors and methods for their preparation |
| BR112019000610A2 (pt) | 2016-07-11 | 2019-07-02 | Opko Biologics Ltd | fator vii de coagulação de longa ação e métodos de produção do mesmo |
| CN106279437B (zh) * | 2016-08-19 | 2017-10-31 | 安源医药科技（上海）有限公司 | 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途 |
| CN107759694B (zh) | 2016-08-19 | 2023-01-13 | 安源医药科技（上海）有限公司 | 双特异性抗体及其制备方法与用途 |
| EP3502143A4 (en) | 2016-08-19 | 2020-07-15 | Ampsource Biopharma Shanghai Inc. | BINDING PEPTIDE FOR THE CONSTRUCTION OF A FUSION PROTEIN |
| CN106256835A (zh) * | 2016-08-19 | 2016-12-28 | 安源医药科技（上海）有限公司 | 高糖基化人生长激素融合蛋白及其制备方法与用途 |
| CN106279436B (zh) * | 2016-08-19 | 2017-10-31 | 安源医药科技（上海）有限公司 | 活化的人凝血因子vii融合蛋白及其制备方法与用途 |
| CN107827987B (zh) * | 2017-01-04 | 2021-04-27 | 华侨大学 | 一种促黄体激素类似物及其制备方法 |
| CN113105562B (zh) * | 2018-09-26 | 2023-12-01 | 安源医药科技（上海）有限公司 | 突变型单链人凝血因子viii在制备融合蛋白中的应用 |
| BR102019004147A2 (pt) | 2019-02-28 | 2020-10-06 | Ouro Fino Saude Animal Participacoes S.A. | Gonadotrofina coriônica equina recombinante (recg) biologicamente ativa e processo para obtenção da mesma, composição veterinária e uso |
| US20220143131A1 (en) | 2019-05-16 | 2022-05-12 | Ceva Sante Animale | Compositions and Methods for increasing Reproduction Performance in Non Human Mammals Using Recombinant Luteinizing Hormone |
| CN114391020A (zh) * | 2019-08-30 | 2022-04-22 | 辛太克斯股份公司 | 重组绒膜促性腺激素、制备工艺、药物组合物及其用途 |
| US11981718B2 (en) | 2020-05-27 | 2024-05-14 | Ampsource Biopharma Shanghai Inc. | Dual-function protein for lipid and blood glucose regulation |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991016922A1 (en) * | 1990-05-08 | 1991-11-14 | University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey | Analogs of glycoprotein hormones having altered immunological characteristics, efficacy and/or receptor specificity |
| WO1995022340A1 (en) * | 1994-02-18 | 1995-08-24 | Sensi-Test | Methods for altering fertility |
| WO1996005224A1 (en) * | 1994-08-12 | 1996-02-22 | Washington University | Single-chain forms of the glycoprotein hormone quartet |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1985001959A1 (en) * | 1983-11-02 | 1985-05-09 | Integrated Genetics, Inc. | Production of heterodimeric human fertlity hormones |
| CA1213537A (en) * | 1984-05-01 | 1986-11-04 | Canadian Patents And Development Limited - Societe Canadienne Des Brevets Et D'exploitation Limitee | Polypeptide expression method |
| EP0461200B1 (en) * | 1989-02-21 | 1997-01-22 | Washington University | Modified forms of reproductive hormones |
| AU647566B2 (en) * | 1990-12-13 | 1994-03-24 | Immunex Corporation | Leukemia inhibitory factor receptors |
| ZA942206B (en) * | 1993-04-01 | 1994-10-31 | Amgen Inc | Biologically active polypeptide fusion dimers |
-
1997
- 1997-11-17 US US08/971,439 patent/US6103501A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-11-09 WO PCT/US1998/023744 patent/WO1999025849A1/en active IP Right Grant
- 1998-11-09 HU HU0004394A patent/HUP0004394A3/hu unknown
- 1998-11-09 TR TR2000/01406T patent/TR200001406T2/xx unknown
- 1998-11-09 CZ CZ20001774A patent/CZ299742B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-11-09 AU AU13131/99A patent/AU754296B2/en not_active Ceased
- 1998-11-09 IL IL13599598A patent/IL135995A0/xx active IP Right Grant
- 1998-11-09 PL PL98342853A patent/PL342853A1/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-11-09 JP JP2000521213A patent/JP4255618B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-11-09 EP EP98956662A patent/EP1032688B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-09 CN CNB988112353A patent/CN1173037C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-11-09 DE DE69839779T patent/DE69839779D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-09 CA CA2308571A patent/CA2308571C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-11-09 BR BR9814880-0A patent/BR9814880A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-11-09 KR KR1020007005334A patent/KR20010032147A/ko active IP Right Grant
-
2000
- 2000-05-05 IL IL135995A patent/IL135995A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-05-16 NO NO20002527A patent/NO20002527L/no not_active Application Discontinuation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991016922A1 (en) * | 1990-05-08 | 1991-11-14 | University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey | Analogs of glycoprotein hormones having altered immunological characteristics, efficacy and/or receptor specificity |
| WO1995022340A1 (en) * | 1994-02-18 | 1995-08-24 | Sensi-Test | Methods for altering fertility |
| WO1996005224A1 (en) * | 1994-08-12 | 1996-02-22 | Washington University | Single-chain forms of the glycoprotein hormone quartet |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL135995A (en) | 2007-03-08 |
| TR200001406T2 (tr) | 2000-12-21 |
| CZ20001774A3 (cs) | 2000-10-11 |
| PL342853A1 (en) | 2001-07-16 |
| HUP0004394A2 (hu) | 2001-09-28 |
| BR9814880A (pt) | 2000-10-03 |
| EP1032688A1 (en) | 2000-09-06 |
| JP2001523465A (ja) | 2001-11-27 |
| DE69839779D1 (de) | 2008-09-04 |
| EP1032688B1 (en) | 2008-07-23 |
| NO20002527D0 (no) | 2000-05-16 |
| CA2308571A1 (en) | 1999-05-27 |
| WO1999025849A1 (en) | 1999-05-27 |
| CN1173037C (zh) | 2004-10-27 |
| AU754296B2 (en) | 2002-11-14 |
| NO20002527L (no) | 2000-07-10 |
| JP4255618B2 (ja) | 2009-04-15 |
| US6103501A (en) | 2000-08-15 |
| AU1313199A (en) | 1999-06-07 |
| HUP0004394A3 (en) | 2003-04-28 |
| CA2308571C (en) | 2013-04-23 |
| CN1290301A (zh) | 2001-04-04 |
| KR20010032147A (ko) | 2001-04-16 |
| IL135995A0 (en) | 2001-05-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ299742B6 (cs) | Jednoretezcové bifunkcní glykoproteinové hormony | |
| US6987172B2 (en) | Multifunctional single chain glycoprotein hormones comprising three or more β subunits | |
| US5705478A (en) | Covalently linked β subunits of the glycoprotein hormones as antagonists | |
| US5958737A (en) | Single-chain β subunit dimers of the glycoprotein hormones and recombinant materials related thereto | |
| US6028177A (en) | Methods of detecting single-chain forms of the glycoprotein hormone quartet | |
| ES2210307T3 (es) | Formas monocatenarias del cuarteto de hormonas glicoproteinicas. | |
| US6635256B1 (en) | Glycoprotein hormone compositions comprising two β subunits and methods of use thereof | |
| US5883073A (en) | Single-chain double-alpha peptide | |
| US6689365B1 (en) | Single-chain fertility hormones with fsh and LH activity | |
| JP2009050278A (ja) | 糖タンパク質ホルモンカルテットの一本鎖形態 | |
| EP1276765B1 (en) | Single-chain fertility hormones with variable lh activity | |
| MXPA00004761A (en) | Single-chain bifunctional glycoprotein hormones | |
| MXPA01003947A (en) | Multiple domain glycoprotein hormones and methods of using |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20161109 |