CZ20001774A3

CZ20001774A3 - Jednořetězcové bifunkční glykoproteinové hormony

Info

Publication number: CZ20001774A3
Application number: CZ20001774A
Authority: CZ
Inventors: Irving Boime; David Ben-Menahem
Original assignee: Washington University
Priority date: 1997-11-17
Filing date: 1998-11-09
Publication date: 2000-10-11
Also published as: HUP0004394A3; JP2001523465A; NO20002527D0; JP4255618B2; EP1032688A1; EP1032688B1; WO1999025849A1; KR20010032147A; TR200001406T2; HUP0004394A2; PL342853A1; CN1173037C; AU754296B2; DE69839779D1; CZ299742B6; IL135995A0; CA2308571A1; NO20002527L; AU1313199A; CN1290301A

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká oblastí proteinového inženýrství, zvláště modifikovaných forem určitých glykoproteinových hormonů, normálně se vyskytujících jako heterodimery.

Vynález se týká modifikovaných jednořetězcových forem choriogonadotropinu (CG), hormonu stimulujícího štítnou žlázu (TSH), luteinizačního hormonu (LH) a hormonu stimulujícího folíkuly (FSH), jež vykazují dvojí účinky nebo funkce nebo se zpravidla mohou chovat jako agonísty a/nebo antagonisty přírodních hormonů.

U lidí mají čtyři důležité glykoproteinové heterodimery hormonů (LH, FSH, TSH a CG) identické a podjednotky a rozdílné β podjednotky. Tři z nich se rovněž vyskytují prakticky ve všech druzích obratlovců; CG byl dosud nalezen jen v primátech a v placentě a moči březích klisen.

Dosavadní stav techniky

Přihláška PCT WO 90/09800 publikovaná 7. září 1990, a zde uváděná jako odkaz, popisuje množství modifikovaných forem těchto hormonů. Jedna důležitá modifikace je extenze C-konce polypeptidu β podjednotky peptidem zakončeným karboxylem (CTP) lidského choriogonadotropinu nebo jeho variantou. Jsou rovněž popsány další muteiny těchto hormonů. CTP je sekvence aminokyselin sahající od kterékoliv z poloh 112-118 do polohy 145 β podjednotky choriogonadotropinu.

·· ····

Přihláška PCT popisuje varianty extenze CTP dosažené konzervativními aminokyselinovými substitucemi tak aby se nezničila schopnost CTP měnit clearance. Kromě toho přihláška PCT WO 94/24148 publikovaná 27. října 1994, zde uváděná jako odkaz, popisuje úpravu těchto hormonů extenzí nebo inserci CTP v jiných místech než je C-konec polypeptidu, a fragmenty CTP kratší než je sekvence sahající od poloh 112-118 do 145.

β Podjednotka FSH rozšířená CTP se též popisuje ve dvou článcích přihlašovatelů tohoto patentu: LaPolt,P.S., a další; Endokrinology (1992) sv. 131: 2514-2520, a Fares,

F.A. a další; Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1992), sv. 89, 4304-4308. Oba články jsou zde zahrnuty odkazem.

Krystalová struktura heterodimerní formy lidského choriogonadotropinu byla nyní publikována ve více nebo méně současných článcích; jedním byl Lapthorn,. A.J. a další: Nátuře (1994), sv. 369, 455-461 a jiný článek: Wu, H a další: Structure (1994), sv. 2, 545-558. Závěry těchto článků sumarizoval Patel, D.J., Nátuře (1994), sv. 369, 438439.

Přihláška PCT WO 91/16922 publikovaná 14. listopadu 1991 popisuje větší počet chimérických a jinak modifikovaných forem heterodimerních glykoproteinových hormonů. Popis se všeobecně zaměřuje na chiméry podjednotek a a β včetně částí různých řetězců ct a β. Jeden konstrukt pouze uvedený v této přihlášce, ale blíže nepopsaný, fúzuje v podstatě celý p řetězec lidského choriogonadotropinu k preproteinu a podjednotky, to znamená včetně vylučovací signální sekvence pro tuto podjednotku.

Dvě rovněž publikované přihlášky PCT popisují jednořetězcové formy těchto hormonů, v nichž jsou a a β jednotky kovalentně vázány za vzniku fúzního peptidu (fusion • · peptide) obecné formule: β (spojovník) _n (X, nebo a (spojovník)_n β přičemž n je od 0 do 1 a a a β představují podjednotky těchto hormonů: Moyle, W.R., přihláška PCT WO 95/22340, publikovaná 24. srpna 1995 a přihláška téhož vynálezce WO 96/05224 publikovaná 22. února 1996. Popis těchto dokumentů je zde rovněž zahrnut odkazem.

Formy výše popsaných jednořetězcových glykoproteinových hormonů, v nichž se redukoval počet cistinových můstků, se popisují v patentu USA č. 08//933.693 registrovaném 19.9.1997 a zde uvedeném ve formě odkazu.

Nyní bylo zjištěno, že je možné konstruovat jednořetězcové formy glykoproteinových hormonů se zvýšenou agonistickou a/nebo antagonistickou aktivitou a/nebo bifunkčních, které obsahují dvě β podjednotky v jednom řetězci, takže mají společnou a podjednotku. Tyto formy mohou obsahovat různé extenze a inzerce CTP stejně jako varianty přírodních forem podjednotek a a β a CTP, jak se popisuje ve výše uvedených dokumentech.

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje jednořetězcovou formu glykoproteinových hormonů obsahujících dvě β podjednotky, jež mohou být buď tytéž nebo rozdílné. Jednořetězcové formy podle vynálezu mohou být buď glykosylované, částečně glykosylované nebo neglykosylované a a a β řetězce vyskytující se v přírodních glykoproteinových hormonech nebo jejich variantách mohou být podle přáni spojeny skupinou spojovníku. Zvláště výhodné skupiny ve funkci spojovníku zahrnují peptidovou jednotku ukončenou karboxylem (CTP), buď • · • · ···· *

• · • · · • · · • · · · jako kompletní jednotku nebo jako variantu obsahující varianty představující jen její část. Výsledné jednořetězcové hormony bud zachovávají aktivitu nemodifikovaných heterodimerních forem, nebo jsou vůči této aktivitě antagonisty. Jsou-li. dvě β podjednotky odlišné, jsou jako agonisty a/nebo antagonisty bifunkční.

Proto je v jednom ohledu tento vynález zaměřen na cjlykosylovaný nebo neglykosylovaný protein vzorce β¹- (spojovník^p-a- (spojovník²) _η-β² (1) , nebo β¹- (spojovník¹),,,-^²- (spojovník²) _n-a (2), nebo a- (spojovník¹) m-β¹- (spojovník²) _η-β² (3) přičemž každá β¹ a β² má sekvenci aminokyselin β podjednotky glykoproteinového hormonu obratlovců nebo variantu uvedené sekvence aminokyselin, přičemž uvedené varianty jsou zde definovány, a označuje a podjednotku glykoproteinového hormonu obratlovců nebo její variantu; spojovník se týká kovalentně vázané skupiny jež vymezuje vhodnou vzdálenost jednak mezi podjednotkami β¹ a β² samotnými a mezi nimi a podjednotkou a. Každé n a m je nezávisle 0 nebo 1.

Ve všech předchozích případech zachovává jednořetězcová forma konformaci, takže je v jednořetězcových formách nutná inkluze celých podjednotek. Vynález proto zahrnuje sloučeniny vzorců (1), (2) a (3) obsahující fragmenty a a/nebo β podjednotek, přičemž tyto formy zachovávají biologickou aktivitu, jakou vykazují odpovídající formy,jež obsahuji kompletní podjednotky.

V dalších ohledech je vynález zaměřen na rekombinantní materiály a způsoby produkce proteinů podle vynálezu a na farmaceutické kompozice jež je obsahují; dále na specifické protilátky pro tyto proteiny a způsoby jejich užiti.

• · · · · · ♦

Stručný popis obrázků

Obrázek 1 ukazuje vazbu sloučeniny CGp-a-CTP-FSHp na receptor RH v konkurenci hCG.

Obrázek 2 ukazuje vazbu sloučeniny z obrázku 1 na receptor FSH v konkurenci FSH.

Realizace vynálezu

Čtyři lidské glykoproteinové hormony tvoří rodinu složenou z lidského choriogonadotropinu (hCG), hormonu stimulujícího folikuly (FSH), luteinizačního hormonu (LH) a hormonu stimulujícího štítnou žlázu (TSH). Zde používaný termín glykoproteinové hormony” se vztahuje ke všem členům této rodiny. Všechny tyto hormony jsou heterodimery složené z a podjednotek, které jsou ve skupině identické co do sekvence aminokyselin, a z β podjednotek, které se u různých členů rodiny liší. Proto se tyto glykoproteinové hormony vyskytují jako heterodimery složené z a a β podjednotek, jež jsou spojeny, ale ne kovalentní vazbou.

FSH, TSH a LH vytváří většina obratlovců; choriogonadotropin byl nalezen jen v primátech včetně lidí a březích klisnách.

Ve zvířatech jsou a a β podjednotky všech hormonů kódovány v různých genech, syntetizují se odděleně a potom jsou složeny do nekovalentního heterodimerního komplexu. Ve sloučeninách podle vynálezu se β podjednotky přímo váží na a podjednotku do jednořetězcové molekuly, jež je v primární struktuře v podstatě lineární. Trojrozměrná struktura vyplývající ze sekundárních a terciárních strukturálních skutečností a z konformace je zřejmě dostatečně podobná heterodimerní formě, aby umožnila uplatnění funkčnosti heterodimeru představované β podjednotkami. Při vhodné proměně struktury podjednotek může však mít. sloučenina podle

• · ·· ·· • Β ♦

Β · · • · · • · · vynálezu aktivitu agonisty nebo antagonisty; když jsou kupříkladu β podjednotky rozdílné, sloučeniny mohou mít aktivitu antagonisty ve vztahu k receptoru jednoho glykoproteinového hormonu, ale aktivitu agonisty pro receptor jiného hormonu, nebo může mít aktivitu agonisty nebo antagonisty pro oba. Spektrum aktivit jež vykazují sloučeniny podle vynálezu bude stejně záviset na volbě jednotlivých a a β podjednotek, na povaze skupin spojovníku i na orientaci a a β podjednotek.

V nejvýhodnějšim provedení vynálezu jsou sloučeniny vzorců (1), (2) nebo (3) fúzní proteiny (fusion proteins), v nichž jsou a a β podjednotky spojeny N-konec - C-konec (head -to-tail) buď přímo nebo přes peptidové spojovníky. Když sekvenci tvoří jen genově kódované aminokyseliny, lze sloučeninu syntetizovat rekombinantně. U takových sloučenin podle vynálezu je však nutno provést restrikci; a a β podjednotky stejně jako spojovníky mohou obsahovat aminokseliny, jež nejsou kódovány genově. Kromě toho spojovníky nemusí být nutně peptidy, nýbrž například dikarboxylové kyseliny nebo anhydridy, diaminy nebo bifunkční spojovníky od firmy Pierce Chemical Co., Rockford, II. a podobně. Kromě toho se mohou podjednotky spojovat buď přímo nebo přes spojovník v konfiguraci N-konec - N-konec (head-to-head) nebo C-konec - C-konec (tail-to-tail) stejně jako v konfiguraci N-konec - C-konec, jak se vyžaduje u fúzních proteinů. V těchto případech se v konfiguraci Nkonec - N-konec mohou dvě aminoskupiny spojit prostřednictvím anhydridu nebo derivátu dixarboxylové kyseliny; dvě karboxylové skupiny se mohou spojit přes diaminy nabo dioly za použití standardních aktivačních t.echni.k.

Z praktických důvodů je však nej výhodnější formou

99·· • ·

• · ·

9 · ·

konfigurace N-konec - C-konec, při kterých postačují standardní peptidové vazby a sloučenina se může připravit rekombinantně jako fúzní protein nebo za použití způsobu pro přípravu syntetického peptidu buď v jediném sledu reakcí nebo výhodněji ligací jednotlivých částí celé sekvence.

Ve všech provedeních jsou však a a β podjednotky připojeny ke zbytku molekuly v polohách blízkých jejich N a C koncům. Dává se přednost, aby se tyto podjednotky vázaly přímo přes svá zakončení, avšak toto spojení může být jednoduše proximální. Obecně platí, že proximální znamená polohu, jež je v rozsahu méně než 10 aminokyselin, raději do 5 aminokyselin, ještě výhodněji pod dvě aminokyeliny a nej raděj i na samotném zakončení.

Podjednotky jako strukturní složky

Zde uváděné společné a podjednotky a β podjednotky FSH, LH, TSH a CG, stejně jako heterodimerní formy, mají své konvenční definice a vztahují se k proteinům se sekvencemi známými v oboru, nebo k jejich alelickými variantám, bez ohledu na to zda jsou aminokyseliny postranních řetězců glykosylovány nebo jinak derivatizovány.

Přírodní formy těchto peptidů jsou ty, které mají sekvence aminokyselin, jež byly izolovány z odpovídajících tkání obratlovců, a mají tyto známé sekvence buď jako takové nebo v podobě jejich alelických variant.

Variantní formy těchto proteinů a jednotek CTP (viz dole) jsou takové, které vykazují záměrné změny včetně vyštípnutí sekvencí aminokyselin přírodního proteinu, vzniklé například místně specifickou mutagenezí nebo jinou rekombinantní technikou, nebo připravené synteticky.

Tyto změny spočívají ve změnách 1-10, raději 1-8 a nejraději 1-5 aminokyselin, kteréžto změny zahrnují delece, ·· ··♦· ♦· ···· konzervativní substituce musí zachovávat aktivitu inserce a substituce, nejraději aminokyselin. Výsledné varianty ovlivňující odpovídající aktivitu přírodního hormonu, to znamená že musí zachovat biologickou aktivitu přírodního hormonu aby se choval jako agonlsta, nebo se musí chovat jako antagonisty zpravidla v důsledku schopnosti vázat receptory pro přírodní hormony a neschopnosti provést transdukci signálu.

Konzervativní analog v konvenčním smyslu znamená analog, v němž nahrazený zbytek patří do téže obecné kategorie aminokyselin jako zbytek, jímž se nahražuje. Aminokyseliny byly zařazeny do skupin jež popisuje odborná literatura, například Dayhoff, M. a další, Atlas of Protein Sequences and Structure (1972), sv. 5, 89-99. Obecně platí, že jednu skupinu tvoří kyselé aminokyseliny, bazické druhou, neutrální hydrofilní tvoří třetí a tak dále. Podrobnější klasifikaci uvádí patent WO 96/05224, výše uvedený jako odkaz.

Jednou ze souborů výhodných variant je varianta v níž jsou pozměněna místa glykosylace buď a nebo β podjednotky nebo obou. Některé z užitečných zde popsaných variant kvarteta hormonů jsou uvedeny v patentu USA 5,177.193 z 5.ledna 1993 a zde zahrnuty jako odkaz. Jak je v nich zřejmé, schémata glykosylace se mohou změnit, zničením odpovídajících míst nebo alternativně volbou hostitelských buněk, v nichž protein vzniká.

Změny sekvence aminokyseliny též zahrnují inserce a delece. Proto jsou mezi variantami vyštípnuté formy hormonů, například mutanty a podjednotky, kterým chybějí některé nebo všechny aminokyseliny na pozicích 85-92 při C-konci. Kromě toho jsou zde oc podjednotky s deletovanými aminokyselinami 1-10 od N-konce.

φφ φ φ • ΦΦΦ φ φ φ φ φφ ·· φφ φφ φ · φ φ φ φ φ · φ φ φ φ · φ φ φ φ φ φ φ φ

Varianty též zahrnují takové, jejichž nekritické regiony byly změněny nebo odstraněny. Takové delece nebo změny mohou zahrnovat celé smyčky, takže deletovány nebo změněny mohou být sekvence obsahující o mnoho více než 10 aminokyselin. Výsledné varianty si však musí podržet alespoň domény s vazbou na receptory a/nebo oblasti, jichž se týká transdukce signálu.

Existuje obsáhlá literatura týkající se variant glykoproteinových hormonů a je jasné, že lze připravit velký počet možných variant, jež vykazují aktivitu agonistů a antagonistů. Takové varianty popisuje například Chen, F. a další, Molec. Endocrinol. (1992),sv. 6, 914-919; Yoo, J. a další, J. Biol.Chem. (1993), sv. 268, 13034-13042; Yoo, J. a další, J. Biol.Chem. (1991), sv. 266, 17741-17743; Puett, D. a další, Glycoprotein Hormones, Lusbader, J.W. a další, EDS, Springer Verlag New York (1994), 122-134; Kuetmann, H.T. a další (tamtéž), s. 103-117; Erickson, L.D. a další, Endocrinology (1990), sv. 126, 2555-2560; a Bielinska, M. a další, J.Cell.Biol. (1990), sv.lll, 330a (Abstract 1844).

Mezi jinými variantami jsou i takové, v nichž je deletovánS jedrt<& nebo více cystinových vazeb, typicky náhradou jednoho nebo obou cysteinů, které se zúčastňují na vazbě, neutrální aminokyselinou. Zvláště výhodnými cystinovými vazbami, jež lze deletovat, jsou vazby mezi polohami 26 a 110 a mezi polohami 23 a 72.

Navíc bylo ukázáno, že β podjednotky hormonového kvarteta se mohou konstruovat v chimérických formách s cílem získat biologické funkce obou složek chiméry, nebo obecně hormony se změněnou biologickou funkcí. Takto se mohou chimérické molekuly s aktivitami jak FSH tak LH/CG připravit podle popisu Moyle, Proč. Nati. Acad. Sci. (1991), sv. 88, 760-764; Moyle, Nátuře (1994), sv. 368, 251-255. Jak se v

9999

9 ·

9 9

9 9 • 9 9 9

99 «

· 9

9 9

9

99 těchto článcích popisuje, náhrada zbytků v CG-β podjednotkách odpovídajícími aminokyselinami 101-109 FSH-β poskytuje analog s oběma aktivitami hCG i FSH.

Zde používané termíny peptid a protein jsou vzájemně zaměnitelné, protože rozdíl v jejich délce je věcí názoru.

Jak je výše uvedeno, varianty použité jako a a β podjednotky při vytváření sloučeniny podle vynálezu se spojovacími skupinami nebo bez nich mohou představovat úplné sekvence aminokyselin v podjednotkách nebo jen jejich částech.

Varianty také zahrnují a a/nebo β řetězce obsahující CTP (nebo variantu CTP) vložené do nekritické oblasti.

Nekritické oblasti a a β podjednotek jsou takové oblasti molekul, jichž není třeba pro biologickou aktivitu (včetně aktivity agonisty a antagonisty). Zpravidla se tyto oblasti odstraňuji z vazebných míst, míst pro odštěpení prekurzoru a z katalytických regionů. Je třeba zjistit oblasti kritické pro zajištění správného skládání, vazby na receptory, katalytické aktivity a podobně. Zmiňme se, že některé oblasti, které jsou kritické u d.imerů, se v případě jednořetězcových forem stávají nekritickými, protože konformační restrikce způsobená molekulou může zrušit nezbytnost těchto oblastí. Určení nekritických oblastí se snadno zajistí delecí nebo modifikováním dotyčných oblastí a uskutečněním vhodného testu pro hledanou aktivitu. Oblasti, v nichž modifikace mají za následek ztrátu aktivity, jsou kritické; oblasti, v nichž se po změně zachová tatáž nebo podobná aktivita (včetně aktivity agonisty), jsou považovány za nekritické.

Opět je třeba zdůraznit, že biologckou aktivitou se míní aktivita, jež je buď agoni.stická nebo antagonistická k •a «·«· «« · «.· · aktivitě přírodních hormonů. Proto jsou určité oblasti kritické pro chováni varianty jako antagonisty, i když tento antagonista není schopen přímo zajistit fysiologický účinek hormonu.

Například polohy 33-59 jsou v případě a podjednotky považovány za nezbytné pro transdukci signálu a rozšíření aminokyseliny 20 na karboxylovém konci je nutné pro vazbu transdukce signálu na receptor. Zbytky kritické pro spojení s β podjednotkou jsou minimálně zbytky 33-58 a zvláště 37-40.

Kde je nekritický region proximální k N- nebo C-konci, dochází k inserci v kterékoliv poloze do 10 aminokyselin od konce, výhodně do 5 aminokyselin a nej výhodněji na konce samotném.

Zde používaný termín jednotka CTP se týká aminokyselinové sekvence nalézající se na karboxylovém konci β jednotky lidského choriogonadotropinu sahající od aminokyseliny 112-118 ke zbytku 145 na C-zakončení, nebo její části. Proto každá úplná jednotka CTP obsahuje 28-34 aminokyselin v závislosti na N-konci CTP.

Částečnou jednotkou CTP se míní aminokyselinová sekvence mezi polohami 112-118 až 145 včetně, která však má nejméně jednu aminokyselinu deletovanou vzhledem k nejkratší možné úplné jednotce CTP (to znamená od polohy 118-145). Tyto částečné jednotky CTP jsou zahrnuty v definici, varianty. Částečná jednotka CTP výhodně obsahuje nejméně jedno místo O-glykosylace. Některé neglykosylované formy hormonů jsou antagonisté a jako takové jsou užitečné. Jednotka CTP obsahuje čtyři glykosylační místa na serinových zbytcích v polohách 121 (místo 1), 127 (místo 2), 132 (místo 3) a 138 (místo 4). Částečné formy CTP použitelné jako agonisty obsahují jedno nebo více těchto míst uspořádaných v •4 4444 «4 4444 · ·

4 4 · • · · · • 4 ··

44

4 4 4

4 4 * · · ·

4 4 4 pořadí, v němž jsou v přírodní sekvenci CTP, i když

Intervenující místa mohou být vynechána.

V některých případech se jednotky CTP mohou použít jako inzert nebo jako spojovníky v tandemu. Tandemovými inzerty nebo extenzemi se míní, že inzert nebo extenze obsahuje nejméně dvě jednotky CTP. Každá jednotka CTP může být úplná nebo fragment, a přírodní nebo varianta. Všechny jednotky CTP v tandemové extenzi nebo inzertu mohou být identické nebo se mohou jedna od druhé lišit.

Spojovníková skupina je skupina spojující sekvence a a β aniž by ovlivňovala aktivitu, kterou by jinak tytéž a a β řetězce vykazovaly jako členové heterodimeru, nebo která mění aktivitu z aktivity agonisty na antagonistu. Úroveň aktivity se může v rozumném rozsahu měnit, ale přítomnost spojovníku nesmí zbavit jednořetězcovou formu ani podstatné části aktivity agonisty ani podstatné části aktivity antagonisty. Jednořetězcc-vá forma nepředstavuje propeptid, nýbrž zralý protein a musí vykazovat aktivitu vztahující se k hormonální aktivitě heterodimeru, jehož prvky tvoří jeho složky.

Bifunkční hormony podle vynálezu se nejefektivněji a nejekonomičtěji připravují rekombinantními způsoby. Proto se dává přednost fúzním proteinům obsahujícím zmíněné formy a a β řetězců, jednotkám CTP a ostatním skupinám ve funkci spojovníků, které obsahují jen genově kódované aminokyseliny. Je však možné, jak uvedeno výše, konstruovat přinejmenším část jednořetězcových hormonů za použití způsobů pro syntetické peptidy nebo jiných technik organické syntézy a proto jsou varianty obsahující aminokyseliny nekódované genově a nepeptidícké spojovníky rovněž v rozsahu tohoto patentu.

V nej výhodnějšim provedení se v případě potřeby C-konec

Η ···· »» »11» podjednotky β¹ kovalentně váže přes spojovník, na N-konec zralé podjednotky a, jež se zase může kovalentně vázat přes a spojovník na podjednotku β². Vazbou může být přímá peptidická vazba, při níž se C-konec aminokyseliny jedné podjednotky přímo váže peptidickou vazbou na N-konec jiné podjednotky; v mnoha případech je však výhodné vložit mezi tyto dva konce skupinu spojovníku. V mnoha případech tato spojovníková skupina dodává mezi dva řetězce alespoň jednu β formu. Proto může být ve spojovníku výhodná přítomnost prolinového zbytku.

(Je třeba rozumět, že pokud jde o vazby mezi konci podjednotek obsahujících jednořetězcové formy, lze jeden nebo dva konce změnit substitucí a/nebo delecí jak popsáno výše).

V jednom zvláště výhodném provedení jde o vazbu typu Nkonec - C-konec (head-to-tail) a skupina spojovníku obsahuje jednu nebo více jednotek CTP a/nebo varianty jejích vyštípnutých forem. Výhodné formy jednotek CTP použitých v podobných skupinách spojovníků jsou popsány v dalším.

Skupina spojovníku může rovněž obsahovat lék vázaný na skupinu spojovníku kovalentně a pokud možno tak aby jej bylo možno odštěpit. Způsoby připojeni léku na spojovník a jeho odštěpení jsou běžně známé.

Kromě výskytu ve skupině spojovníku se jednoty CTP a jejich varianty mohou vyskytovat v nekritické oblasti podjednotky a tak přispívat ke stavbě jednořetězcového hormonu jak je popsáno výše.

I když jsou výhodnými inkluzemi ve skupinách spojovníku jednotky CTP, je jasné, že spojovníkem může být každý vhodný kovalentně vázaný materiál zajištující vhodný odstup mezi podjednotkami a a β. Proto může být obecně spojovníkem pro konfigurace N-konec - C-konec dvoj vazná skupina jako je »· «>« ·*« · • · · · · » · · · · ·· ·· peptid obsahující libovolný počet aminokyselin, ale typicky méně než 100, raději však méně než 50, který má správný poměr hydrofilního k hydrofobnímu charakteru, aby zajistil vhodné rozmístění a konformaci v roztoku, nebo nepeptidický spojovník, který vykazuje tyto charakteristiky. Platí, že by spojovník měl být hydrofilní, aby se udržel v okolním roztoku a nebránil interakci mezi podjednotkami a a β nebo dvou β podjednotek. Je výhodné když spojovník má β struktury, jež typicky dodávají prolinové zbytky v peptidových spojovnících, nebo když obsahuje serin a/nebo glycinové zbytky. Může se použít kterýkoliv vhodný polymer včetně peptidových spojovníků s výše uvedenými vhodnými vlastnostmi.

Zvláště výhodná provedení bifunkčních hormonů podle vynálezu zahrnují konfigurace typu N-konec - C-konec.

βΕδΗ-α-βΕδΗ; α-βΕδΗ-βύΗ; βΕδΗ-α-βΣΗ;

βύΗ-α-βύΗ; α-βύΗ-βΕδΗ; βΣΗ-α-βΕδΗ;

βΤδΗ-α-βΤδΗ; βΤδΗ-βΕδΗ-α; βΤδΗ-α-βΕδΗ;

βΟβ-α-βΟδ; α-βΟβ-βΕδΗ; α-βΟΘ-βΤδΗ; βΟΘ-βΕδΗ-α; βΟΘ-αβΤδΗ;

βΕδΗ-ΟΤΡ-α-βΕδΗ; α-βΕδΗ-ΟΤΡ-βΣΗ; βΕδΗ-ΟΤΡ-α-βΣΗ; βύΗ-ΟΤΡ-α-βύΗ; α-βΣΗ-ΟΤΡ-βΕδΗ; βΣΗ-α-ΟΤΡ-βΕδΗ; βύΗ(5115-123)-α-βΕδΗ; βΣΗ(5115-123)-CTP-α-βΕδΗ; βΟΘ-ΟΤΡ-α <3ΤΡ-βΕ5Η-ΟΤΡ-<3ΤΡ;

βΤδΗ -CTP-CTP-a βΕδΗ-CTP-CTP; βΕδΗ-ΟΤΡ-ΟΤΡ-α-βΒΗ; βύΗ-ΟΤΡ-ΟΤΡ-βύΗ-α; βΟΘ-ΟΤΡ-ύΤΡ-α-βΤδΗ; βΟΘ-ΟΤΡ-ΟΤΡ-βύΗ-α; βΕδΗ-ΟΤΡ-βΐιΗ (5115-123)-CTP-a;

a podobně. Lidské formy podjednotek jsou rovněž zvláště výhodné. V konfiguracích uvedených výše znamenají CTP takové • 9 ··

9» ··»· • · ·

9 · • · · • · · ·

9« ·* *>· ···« • · * • · » • · · · *

9 · ·· · • · · · · • · · • · 9

CTP nebo jejich varianty, které obsahuji vyštípnutí jak je popsáno v patentu č. 96/05224.

Zatímco pro humánní medicínu jsou vhodné humánní formy podjednotek ot a β, je třeba poznamenat, že odpovídající formy v ostatních obratlovcích jsou užitečné ve veterinárním lékařství. Takže podjednotky FSH, TSH a LH charakteristické pro hovězí dobytek, koně, prasata, kočky, psy a jiné druhy jsou vhodné při indikacích týkajících se těchto zvířecích druhů.

Vhodné léky, jež mohou být obsaženy ve spojovníkových skupinách, zahrnují peptidy nebo proteiny jako jsou růstové faktory typu insulinu, epidermální růstové faktory, kyselý a zásaditý růstový faktor fibroplastu, růstový faktor na bázi krevní destičky, faktory stimulující růst různých kolonií, jako je granulocyt. CSF, makrofág CSF a podobně, různé cytokiny jako IL-2, IL-3 a množství dalších proteinů interleukinu; různé interferony, faktor nekrózního tumoru a podobně. Mohou zde být vhodná místa pro odštěpení za účelem izolace léku jako jsou targetní sekvence pro proteázy, jejichž cílová místa nejsou přítomna v podjednotkách a a β. Výhodou léků na bázi peptidů nebo proteinů je, že je možno připravit celý konstrukt rekombinantni expresi jediného genu. Lze užít i léků s malou molekulou jako jsou antibiotika, protizánětlivé léky, toxiny a podobně.

Všeobecně platí, že se od léků obsažených ve skupině spojovníku požaduje, aby působil v blízkosti receptorů na něž se hormony normálně váží. Zajištuje se vhodné opatření pro uvolnění léku z inkluze ve spojovníku, například zajištěním míst pro enzymaticky katalyzovanou lýzu, jak je dále popsáno v kapitole věnované preparačním metodám.

Jednořetězcové proteiny podle vynálezu se též mohou spojovat nebo derivatizovat způsoby užívanými u sekvencí

V „ -«--ΙΜΗκι

aminokyselin jako je fosforylace, glykosylaee, deglykosylace normálně glykosylovaných forem, acylace, modifikace aminokyselinových postranních řetězců (například konverze prolinu na hydroxyprolin) a podobné modifikace analogické posttranslačním dějům, k nímž běžně dochází.

Stupeň glykosylaee hormonů podle vynálezu je zvláště důležitý. Hormony se připravují v neglykosylované formě buď jejich tvorbou v prokaryotických hostitelích nebo mutacemi glykosylačnich míst, jež se normálně vyskytují v podjednotkách a/nebo všech jednotkách CTP jež se zde případně vyskytují. Jak neglykosylované verze, tak částečně glykosylované verze hormonů se mohou připravit manipulací glykosylačnich míst. Normálně jsou ovšem glykosylované verze rovněž zahrnuty v rozsahu tohoto vynálezu.

Jak je v oboru všeobecně známo, jednořetězcové proteiny podle vynálezu se též mohou vázat na radioaktivní prvky a jiné indikátory, nosiče, pevné podklady a podobně v závislosti na zamýšlené aplikaci. Značené formy se mohou užít pro sledováni jejich metabolických osudů; vhodnými isotopy pro tento účel jsou zvláště radioisotopy jako jod 131, technecium 99, indium 111 a podobně. Značení radioisotopy se může použit i pro detekci jednořetězcových proteinů ve zkušebních systémech. V tomto případě se radioisotopy též mohou použít ve formě značených enzymů, fluorescentních indikátorů, chromogenních indikátorů a podobně.Použiti takových indikátorů umožňuje lokalizaci příslušných receptorů, protože se mohou aplikovat jako targetni činidla takových receptorů.

Proteiny podle vynálezu se též mohou vázat na nosiče s cílem zvýšit jejich imunogenní charakter při přípravě protilátek se specifickou imunoreaktivitou vůči těmto novým modifikovaným formám. Vhodnými nosiči pro tento účel jsou

9999

9 ·«····· ··· _ ·· ·· ·· · ·· hemocyanin z kuželnatky (keyhole limpet - KLH), albumin z bovinního séra (BSA), toxoid diftérie a podobně. Mohou se použít standardní kopulační způsoby pro vázání modifikovaných peptidů podle vynálezu na nosiče včetně použití bifunkčních spojovníků.

Podobné způsoby spojování se vedle ostatních mohou použít pro vazbu proteinů podle vynálezu na pevné podklady. Po kopulaci se tyto ρχ-oteiny mohou použit jako afinitní reagenty pro separaci požadovaných složek, jež se účastní specifických reakcí. Proto jsou použitelné pro purifikaci a izolaci receptorů s nimiž reaguje vhodná β podjednotka.

Způsoby přípravy proteinů podle vynálezu jsou v oboru dobře známy. Jak je uvedeno výše, pokud jsou přítomny jen genově kódované aminokyseliny a jednořetězcová forma má uspořádání N-konec - C-konec, nejpraktičtějším způsobem je v současné době syntetizovat tyto materiály rekombinantně expresí DNA kódující požadovaný protein. DNA obsahující nukleoťidovou sekvenci kódující jednořetězcovou formu včetně variant se může připravit z přírodních sekvencí nebo nově syntetizovat za použití kombinací těchto způsobů. V oboru jsou dnes dobře známy způsoby pro místně cílenou mutagenezi, ligaci dalších sekvencí, amplifikaci jako je PCR a konstrukce vhodných expresních systémů. DNA kódující potřebný protein nebo její části se mohou konstruovat synteticky za použití standardních způsobů v pevné fázi, výhodně po vložení restrikčnich míst pro usnadnění ligace. Pro kódující sekvenci DNA lze dodat vhodné regulační prvky pro transkripci a translaci vložené kódující sekvence. Jak je všeobecně známo, je dnes možno komerční cestou získat expresní systémy kompatibilní se širokým spektrem hostitelů, včetně prokaryotických hostitelů jako je E. coli neb B. subtilis a eukaryotických hostitelů jako jsou kvasinky,

ostatní houby jako Aspergillus a Neurospora, rostlinné buňky, hmyzí buňky, buňky savců jako buňky jsou CHO, ptačí buňky a podobně.

Volba hostitele je důležitá zvláště pro posttranslační děje a zvláště pro glykosylaci. Lokace glykosylace se nejčastěji reguluje povahou glykosylačních míst v molekule; povaha cukrů na těchto místech se však ve velkém rozsahu řídí povahou hostitele. V důsledku toho lze jemného vyladění vlastností hormonů podle vynálezu dosáhnout správnou volbou hostitele.

Zvláště výhodnou formou genu pro část podjednotky a, ať je a podjednotka modifikovaná nebo nemodifikovaná, je konstrukce rninigenu. Ve smyslu zde používaném se termín minigen a podjednotky vztahuje ke konstrukci genu popsané Matzukem, M.M. a dalšími, Mol. Endocrinol. (1988), sv. 2, 95-100 při popisování konstrukce (přípravy) pM²/CG a nebo pM²/I.

Při rekombinantní přípravě se používají modifikované hostitelské buňky za použití expresních systémů a jsou kultivovány pro přípravu požadovaného proteinu. Zde se používá těchto termínů:

Termín modifikovaná rekombinantní hostitelská buňka, to znamená hostitelská buňka modifikovaná aby obsahovala rekombinantní expresní systémy podle vynálezu, se týká hostitelské buňky,jež byla změněna aby obsahovala expresní systém kterýmkoliv běžným způsobem introdukce včetně transfekce, virové infekce a tak dále. Modifikované buňky se týkají buněk obsahujících tento expresní systém, který může být bud’ integrován do chromosomu nebo extrachromosomálrii. Modifikované buňky mohou být buď stabilní vzhledem k inkluz.i expresního systému, nebo může být kódující sekvence exprimována přechodně. Stručně řečeno, • · • · · · · · • · ·» ·· rekombinantni hostitelské buňky modifikované expresním systémem podle vynálezu jsou buňky obsahující tento expresní systém jako výsledek manipulace, jejímž cílem bylo aby jej obsahovaly, když jej v přírodním stavu neobsahovaly, a to bez ohledu na způsob jímž se této inkorporace dosáhne.

Expresní systém se týká molekuly DNA obsahující kódující nukleotidovou sekvenci, jež má být exprimována, a doprovodné regulační sekvence potřebné pro provedení exprese kódující sekvence. V typickém případě se tyto regulační sekvence skládají z promotoru, sekvencí regulujících zakončení a v některých případech operátoru nebo jiného mechanismu pro regulaci exprese. Regulační sekvence jsou konstruovány, aby byly funkční ve zvláštní cílové rekombinantní buňce hostitele a proto se musí hostitelská buňka zvolit tak, aby byla kompatibilní s regulačními sekvencemi v konstruovaném expresním systému.

Je-li žádoucí sekrece (vylučování) vzniklého proteinu, jsou.též přítomny další nukleotidové sekvence kódující signální peptid s cílem vytvořit signální peptid operativně vázaný na žádaný jednořetězcový hormon a v dalším preprotein. Při sekreci se odštěpí signální peptid a uvolní se zralý jednořetězcový hormon.

Zde použité termíny buňka, buněčná kultura a buněčná linie jsou vzájemně zaměnitelné a nevěnuje se pozornost jemnostem významů. Pokud je nutné je rozlišovat, usnadní to kontext. Kde se použije jeden z těchto výrazů, byly míněny i všechny ostatní.

Takto připravený protein se může získat z buněčného lyzátu při intracelulární přípravě nebo z média při přípravě sekrecí. Způsoby získání rekombinantních proteinů z buněčných kultur jsou v oboru dobře prostudovány a tyto proteiny se mohou přečistit za pomoci známých způsobů jako • · · · · · je chromatografie, gel.ová elektroforéza, selektivní precipitace a podobně.

Všechny hormony podle vynálezu nebo jejich část se mohou syntetizovat přímo za pomoci způsobů syntézy peptidů známých v oboru. Syntetizované části se mohou spojovat ligací a místa odštěpení kteréhokoliv léku obsaženého ve skupině spojovníku se mohou zavádět standardními chemickými prostředky. V provedeních s aminokyselinami jež nejsou genově kódovány a v provedeních, kde se používá konfigurace N-konec - N-konec nebo C-konec - C-konec ovšem musí syntéza probíhat alespoň zčásti na úrovni proteinu. Spojení N-konec - N-konec na přírodním N-konci nebo v polohách proximálních k přírodním N-konci se musí provádět spojovníky obsahujícími funkční skupiny reaktivní s aminoskupínámi jako jsou deriváty dikarboxylových kyselin. Konfigurace C-konec - Ckonec na C-koncích nebo v polohách proximálních k C-koncům se může realizovat pomocí spojovníků jako jsou diaminy, dioly nebo jejich kombinace.

Protilátky

Proteiny podle vynálezu se mohou použít pro generování protilátkek specificky imunoreaktivnich vůči těmto novým sloučeninám. Tyto protilátky jsou použitelné při řadě diagnostických a terapeutických aplikaci* .

Protilátky se všeobecně připravují za použití standardních imunizačních postupů ze savců jako jsou králíci, ovce a krysy a titrují se jako polyklonální antiséra pro zajištění potřebné imunizace. Polyklonální antiséra se potom mohou použít jako taková, například pro imunotesty. Protilátky vylučující buňky z hostitele, jako jsou buňky sleziny nebo leukocyty vylučující protilátky, se mohou usmrtit za pomoci známých technik a vytřídit pro • 9 ·♦·· • · • · 9 · 9 ·· 99 99 produkci monoklonálních protilátek imunospecifických vůči proteinům podle vynálezu. Protilátky obsahují jakýkoli fragment který si zachovává potřebnou imunospecificitu, jako je F_ab, F_ab , F_(ab-₎₂, F_v a tak dále. Protilátky se tedy mohou připravit rekombinantně, typicky izolací nukleotidových sekvencí kódujících při nejmenším variabilní regiony raonoklonálnich protilátek s vhodnou specificitou, a vytvořením příslušných expresních systémů. Tento přístup umožňuje jakoukoliv potřebnou modifikaci jako je příprava forem F_v , chimérických forem, humanizovaných forem a podobně.

Imunospecifickými pro proteiny podle vynálezu se míní protilátky, jež specificky váží příslušné sloučeniny podle vynálezu, ale nikoliv heterodimery nebo kterékoliv z obsažených podjednotek samotných nebo kterékoliv jednořetězcové formy obsahující jen jednotlivou β podjednotku obecně považovanou za určující pro afinitu nebo neafinitu. Je jasné, že specifičnost je relativní pojem a je možno zvolit subjektivní limit jako například lOOnásobný nebo větší rozdíl ve specifické vazbě. Potom je imunospecifická protilátka spadající pod vynález lOOkrát reaktivnější vůči jednořetězcovému proteinu než vůči odpovídajícímu heterodimeru, starším jednořetězcovým formám nebo jednotlivým podjednotkám. Takové protilátky se mohou získat například vytříděním těch, které vázaly sloučeniny podle vynálezu a likvidaci těch, jez rovněž váží heterodimery, podjednotky nebo starší jednořetězcové formy podle patentů WO 95/22340 a WO 96/05224.

Formulace a podávání

Proteiny podle vynálezu se formulují a podávají způsoby srovnatelnými se způsoby známými pro odpovídající ·· 44·· 4· 4444

4 4 4 4 4 heterodimery. Proto se způsoby formulace a administrace liší podle jednotlivých použitých hormonů nebo kombinací hormonů. Dávkování a frekvenci podávání lze však změnit ve srovnání s heterodimerem, zvláště když jsou přítomny jednotky CTP, vzhledem k delšímu biologickému poločasu vlivem jeho přítomnosti.

Formulace proteinů podle vynálezu jsou formulace typické pro proteinové nebo peptidové léky jak je popisuje Remington's Pharmaceutical Sciences, poslední vydání, Mack Publishing Company, Easton, Pa. Obecně platí, že proteiny se podávají ínjekčně, typicky íntravenózně, intramuskulárně, subkutánně nebo intraperitoneálně, nebo za použití formulací pro transmukózní nebo transdermální administraci. Tyto formulace obecně obsahují detergent nebo penetracní činidlo jako jsou soli žlučových kyselin, kyselina fusidová a podobně. Tyto formulace se mohou podávat jako aerosoly nebo čípky nebo v případě transdermálního podávání jako náplasti. Orální podávání je také možné za předpokladu, že formulace chrání peptidy podle vynálezu před degradací v zažívacím traktu.

Optimalizace dávkovacího režimu a formulace je v oboru prováděna rutinně a jako obvykle. Tyto formulace se též mohou modifikovat a pak zahrnují i formulace vhodné pro veterinární účely.

Sloučeniny podle vynálezu se mohou použít mnoha způsoby, nejběžnější je použití jako náhrada heterodimerních forem hormonů. Potom se podobně jako heterodimery mohou jednořetězcové hormony ve formě agonistů použit v léčbě neplodnosti jako pomocný prostředek ve fertilizačních technikách in vitro a v dalších terapeutických způsobech spojených s přírodními hormony. Tyto způsoby lze použít jak pro lidi, tak pro jiné živočichy. Volba způsobu derivace

·· ♦· ·· ♦ ·♦ jednořetězcového proteinu ovšem závisí na subjektu pro který se způsob používá. Je samozřejmé, že dvojí funkčnost vlastní sloučeninám se dvěma odlišnými β podjednotkami znamená pro terapii možnosti, jež zde dříve nebyly.

Sloučeniny podle vynálezu jsou též použitelné jako reagenty způsobem podobným jako u heterodimerů.

Kromě toho se sloučeniny podle vynálezu mohou použít jako diagnostické prostředky pro detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti protilátek, jež se váží na přírodní proteiny v rozsahu, v němž se tyto protilátky váží na odpovídající části těchto jednořetězcových sloučenin v biologických vzorcích. Rovněž jsou použitelné jako kontrolní reakční činidla v soupravách reagentů (assay kits) pro zjišťování koncentrací těchto hormonů v různých vzorcích. Protokoly (metodiky) zjišťování koncentrace samotných hormonů nebo protilátek vytvořených proti nim jsou standardní imunologické metodiky běžně v oboru známé. Lze použít různých kompetitivnich a přímých zkušebních způsobů včetně různých způsobů značeni, jež zahrnují značení radioizotopy, fluorescenční značení, enzymové značení a podobně.

Sloučeniny podle vynálezu jsou též užitečné při detekci a purifikaci. receptorů, na něž se váží přírodní hormony. Takto se mohou sloučeniny podle vynálezu vázat na pevné podklady a použít při přípravě receptorů nebo antihormonálních protilátek afinitní chromatografií.

Výsledné receptory jsou samy o sobě použitelné při hodnocení aktivity hormonů jako možných léků při výběru možných terapeutických prostředků a činidel tříděním (screening tests) . Je samozřejmě třeba vést. v patrnosti podvojnou specifičnost β podjednotek ve všech sloučeninách, kde jsou β podjednotky rozdílné. Kde však jsou dvě β podjednotky identické, nabízejí účinný nástroj purifikace příslušného ·· ♦··· ·· ···· ·· ·· • · · · * · · · · · receptoru na základě afinity.

Protilátky s vysokou reaktivitou vůči sloučeninám podle vynálezu se mohou použit jako nástroje purifikace pro izolaci těchto materiálů z jejich pozdějších přípravků. Rovněž jich lze použít pro monitorování koncentrací těchto látek podávaných ve formě léků.

Následující příklady mají za úkol tento vynález ilustrovat, ale ne limitovat.

Příklady provedení vynálezu

PŘÍKLAD 1

Příprava CGfi-a-CTP-FSHfi

Nukleotidová sekvence kódující sloučeninu uvedenou v titulku se připravila za pomoci dostupných nukleotidových sekvencí pro příslušné části podjednotky. Oblast CGp kóduje 145 aminokyselin lidského CGp; kódující nukleotidová sekvence a podjednotky kóduje 92 aminokyselin lidské a podskupiny jako minigen; kódující sekvence CTP kóduje 28 aminokyselin reprezentujících polohy 118-145 lidského choriogonadotropinu; kódující region FSHp kóduje 111 aminokyselin lidské podjednotky FSHp.

Amplifikovaný fragment obsahující exon 3 CGp, a minigen, CTP a pFSH se vložily na místo Sáli exonu 1,2 ρΜ²ΗΑ-06β, expresního vektoru, odvozeného od pM² a obsahujícího CGp exony 1 a 2 způsobem který popsal Sachais, β Biol. Chem. (1993), sv. 268, 2319. pM² obsahující CGp exony 1 a 2 se popisuje v článku Matzuk, M.M. a další, Proč. Nati. Acad. USA (1987), sv. 84, 6354-6358, a Matzuk, M.M. a další, J.Cell.Biol. (1988), sv. 106, 1049-1059. Nejdříve se do tohoto vektoru po proudu (downstream) vložil jako insert ·· ♦·»· ·· ···· ·* ·· « · ··» · · ♦ · · • · · · · · ···· • · · · · · · · · · · · fragment obsahující a minigen exon 3 ΟΘβ a získán byl pM²ΗΑΟΘβα. ρΜ²-Οΰβα se potom odštěpil pomocí Seal a následovala ligace s pBIIKS(+)α-CTP-FSH po restrikci pomocí Seal. Výsledný expresní vektor ρΜ²-ΗΑ0Θβ-α-0ΤΡ-Ρ3Η po inserci do vhodného hostitele produkuje sloučeninu uvedenou v titulku.

PŘÍKLAD 2

Produkce a aktivita CGfi-a-CTP-FSHfi

Expresní vektor konstruovaný v příkladu 1 se transfektoval do buněk vaječníku čínského křečka (CHO) a produkce proteinu se testovala imunoprecipitací radioaktivně značeného proteinu na gelech SDS.

Kultivační médium se shromáždilo, zahustilo a testovalo na vazbu na receptor lidského LH (očekávána vazba části βΟΘ-α).

Pro tento test se připravil receptor LH vložením cDNA kódujícího celý receptor lidského LH do expresního vektoru pCMX (Oikawa, J.X-C a další, Mol. Endocrinol. (1991), sv. 5, 759-768. Exponenciálně rostoucí buňky 293 se tímto vektorem transfektovaly za použití metod Chen, C. a dalších,

Mol.Cell.Biol. (1987), sv. 7, 2745-2752, což vedlo k expresi receptoru LH na povrchu.

V tomto pokusu byly buňky exprimující receptor lidského LH (2xl0⁵ na zkumavku) inkubovány s 1 ng značeného hCG v konkurenci s rostoucími koncentracemi neznačeného hCG nebo rostoucím množstvím vzorku testovaného 18 hodin při 22 °C. Pokles indikátoru v přítomnosti vzorku je měřítkem schopnosti vázat se ve vzorku. V tomto pokusu měla heterodimerní hCG z hlediska receptoru pro lidský LH v buňkách 293 aktivitu typickou pro přírodní typ, jak bylo předem zjištěno, a médium obsahující 06β-α-<3ΤΡ-Ε3Ηβ rovněž vykázalo aktivitu. Výsledky jsou ukázány v obrázku 1. Jak je vidno, heterodimerní hCG (čtverečky) i bifunkční

·· 9·»· 9· 9999

9 9 9 9 9

9 9

9 9 9 9 9 9

99 99 9

99 jednořetězcové proteiny podle vynálezu (kroužky) úspěšně konkurovaly značeným hCG o receptor LH. Bifunkční sloučenina je méně účinná vlivem karboxylového zakončení podjednotky a.

V obrázku 1 jsou též ukázány výsledky testu, v němž se zkoušela různá množství kultivační kalové vody (supernatant), získané z buněk modifikovaných tak, aby obsahovaly dva expresní systémy. Jeden expresní systém produkoval jednořetězcový FSHP-a; jiný produkoval β podjednotku hCG. Výsledný nekovalentně spojený jednořetězcový komplex ΡδΗα-β/ΟΟβ (trojúhelníky) rovněž při vazbě úspěšně konkurovaly.

Podobně se testovala kalová voda z kultivačního média obsahujícího CGp-a-CTP-FS^ z hlediska vazby na receptor pro FSH exprimovaný v buňkách 293. Test se prováděl výše popsaným způsobem s tím rozdílem, že buňky exprimující receptor lidského LH byly nahrazeny buňkami exprimujícími receptor lidského FSH a značený. FSH byl použit jako kompetitor (konkurující faktor). V obrázku 2 jsou ukázány výsledky tohoto testu.

Jak je zřejmé, jednořetězcová sloučenina uvedená v titulku (kroužky) úspěšně konkurovala při vazbě FSH (čtverečky). V nezávislém pokusu, jehož výsledky jsou rovněž ukázány v obrázku 2, směs odlišného typu komplexu, to znamená jednořetězcového ΓΞΗβ-α nekovalentně spojeného s Οΰβ, který je smíchán s nadbytečným nekomplexním jednořetězcovým ΓΞΗβ-α (trojúhelníky), byla vynikajícím konkurentem.

PŘÍKLAD 3

Konstrukce dalších expresivních vektorů Podobným způsobem jak je uvedeno v příkladu 1 se připravily expresní vektory pro produkci jednořetězcových ·· ···· 9 9 · • · ·

9999

9 9

9 9 • · · · 99 99

9 9

9

99

9 9 9

99 bifunkčních FSHp-CTP-a-CGp, a-FSHp-CTP-CGp, CGp-pFSH-CTP-a a PLH-CTP-pFSH-CTP-a a transfektovaly do buněk CHO. Kalové vody z kultivace se kultivují a zkoušejí, jak je popsáno výše, na receptory LH a FSH. Rovněž tyto sloučeniny vykazují schopnost vázat oba receptory.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Glykosylovaný nebo neglykosylovaný protein s aktivitou agonisty nebo antagonisty vzorce β¹- (spojovník¹) m-a- (spojovník²) η-β²β¹- (spojovníkem^²- (spojovník²) η-α a- (spojovník¹)™^¹- (spojovník²) η-β² (1) ,nebo (2) ,nebo (3) kde každé β¹ a β² má aminokyselinovou sekvenci β podjednotky glykoproteinového hormonu obratlovců nebo její varianty;

a označuje a podjednotku glykoproteinového hormonu obratlovců nebo její variantu;

spojovník znamená kovalentně vázanou skupinu jež odděluje β¹ a β² podjednotky do takové vzdálenosti od podjednotky a a od sebe navzájem, aby se zachovala uvedená aktivita a každé m a n je nezávisle 0 nebo 1.
2. Protein podle nároku 1, kde uvedené man jsou 1.
3. Protein podle nároku 1, kde nejméně jedna uvedená spojovníková skupina zahrnuje lék, který má být zacílen na receptor pro glykoproteinový hormon, nebo kde nejméně jeden spojovník je CTP nebo jeho varianta.
4. Protein podle nároku 1, kde β¹ je β podjednotka FSH, LH nebo TSH rozšířená v poloze proximální ke svému Ckonci úplnou nebo částečnou jednotkou CTP nebo její variantou.
5. Protein podle nároku 1, kde a podjednotka nebo jedna <4 4 · ·

44 4 4« 4

4 4 4 4 4 ·

4 4 4 4 4 4

4· ·9 44

44 44 • 4 4 4 • 4 4 · • 4 4 4 • 4 4 4

44 ·· nebo více β podjednotek nebo obě podjednotky jsou modifikovány insercí jednotky CTP nebo její varianty do jejich nekritické oblasti a/nebo kde uvedená spojovníková skupina obsahuje jednotku CTP nebo její variantu.
6. Protein podle nároku 1, kde uvedené varianty obsahují 1-5 konzervativních aminokyselinových substitucí oproti přírodním formám, nebo to jsou zkrácené formy uvedených sekvencí, nebo obojí.
7. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protein podle nároku 1 s příměsí vhodného farmaceutického vehikula.
8. Protein podle nároku 1, navázaný na pevný nosič.
9. Protilátky imunospecifické pro protein podle nároku

1.
10. Molekula DNA nebo RNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující protein podle nároku 1.
11. Expresní systém pro produkci agonísty a/nebo antagonisty glykoproteinového hormonu, kde tento systém obsahuje obsahuje první nukleotidovou sekvenci kódující protein podle nároku 1, operativně vázanou na řídící sekvence schopné provést expresi uvedené první nukleotidové sekvence.
12. Expresní systém podle nároku 11, který dále obsahuje druhou nukleotidovou sekvenci kódující signální peptid, operativně vázanou na protein kódovaný první nukleotidovou sekvencí.

99 9 99·

9 9 9 9

9 9 9 9

99 99
13. Hostitelská buňka, modifikovaná tak, aby obsahovala expresní systém podle nároku 11.
14. Hostitelská buňka, modifikovaná tak, aby obsahovala expresní systém podle nároku 12.
15. Způsob produkce jednořetězcového proteinu, který je agonistou a/nebo antagonistou glykoproteinového hormonu, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci buněk podle nároku 14 v podmínkách, v nichž je uvedený protein produkován, a získávání uvedeného proteinu z kultury.
16. Způsob produkce jednořetězcového proteinu, který je agonistou a/nebo antagonistou glykoproteinového hormonu, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci buněk podle nároku 14 v podmínkách, v nichž je uvedený protein produkován, a získávání uvedeného proteinu z kultury.