CN1261906A - 用于阿尔茨海默氏症的死前诊断和体内成像以及防止淀粉样蛋白沉淀的柯胺g的烷基、链烯基和炔基衍生物 - Google Patents

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Abstract

本文描述了可与淀粉样蛋白结合的柯胺G的非偶氮衍生物化合物,含有这些化合物的药物组合物以及使用这些化合物体内鉴别阿尔茨海默氏症脑组织和诊断以淀粉样变性为特征的其它病症,例如Down氏综合症。还描述了含有柯胺G的非偶氮衍生物的药物组合物和使用这些组合物在淀粉样变性相关性适应症中防止细胞变性和淀粉样蛋白诱导的毒性的方法。还描述了在活组织检查和死后组织样品检查中使用非偶氮类柯胺G衍生物染色或检测淀粉样蛋白沉淀的方法以及使用非偶氮柯胺G衍生物定量活组织检查和死后组织的匀浆物中淀粉样蛋白沉淀的方法。

Description

用于阿尔茨海默氏症的 死前诊断和体内成像以及防止淀粉样蛋白沉淀的 柯胺G的烷基、链烯基和炔基衍生物
本发明利用国立老化研究所(the Institute of Ageing，批准号为AG-05443，AG-05133和AG-08974)的基金完成。该申请是1996年5月1日递交的美国专利申请08/640740和PCT/US96/05918的后续申请，以及1995年5月1日递交的美国专利申请08/432019和1994年7月29日递交的美国专利申请08/282289的部分后续申请。
发明背景
本发明涉及适于在活体患者内使淀粉样蛋白沉淀物成像的化合物的鉴别。更具体地说，本发明涉及使体内脑组织中的淀粉样蛋白沉淀物成像，进行阿尔茨海默氏症的死前诊断的方法。本发明还涉及这类化合物的治疗用途。
阿尔茨海默氏症(“AD”)是一种神经变性疾病，特征为记忆丧失和其它认知性缺陷。McKhann等，神经学(Neurology)34：939(1984)。在美国，它是引起痴呆的最常见原因。AD可打击年龄在40-50岁左右的年轻人。然而，不进行危险的脑组织活组织检查，该疾病很难确诊，发病的时间也未可知。AD的发病趋势随年龄增加而增加，85-90岁老年人中的该病患者比例估计可高达40-50％。Evans等，JAMA 262：2551(1989)；Katzman，神经学(Neurology)43：13(1993)。
根据定义，AD通过对脑组织的检查，通常是采用活组织检查来确诊。Khachaturian，Arch.Neurol.42：1097(1985)；McKhann等，神经学(Neurology)34：939(1984)。从神经病理学上说，该病的特征为存在神经斑(NP)、神经纤维结(NFT)和神经元丧失，以及多种其它的发现物。Mann，Mech.Ageing Dev.31：213(1985)。阿尔茨海默氏症患者的死后脑组织切片显示出以神经斑的蛋白质胞外核形式存在的淀粉样蛋白，这就是AD的特征。
这些神经斑的淀粉样蛋白核由称之为β-淀粉样蛋白(Aβ)的蛋白质主要通过β-褶皱样片状构型排列而成。Mori等，生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry)267：17082(1992)；Kirschner等，PNAS 83：503(1986)。神经斑是该疾病的早期症状，固定不变。Mann等，神经科学杂志(J.Neurol.Sci.)89：169；Mann，Mech.Ageing Dev.31：213(1985)；Terry等，J.Neuropathol.Exp.Neurol 46：262(1987)。
Aβ的最初沉淀可能发生在临床症状出现的很久以前，这值得注意。目前建议的诊断AD的“显微镜最低标准”是基于大脑组织中发现的神经斑的数量。Khachaturian，Arch.Neurol.，supra(1985)。不幸的是，神经斑的计数必须延迟到死后。
含淀粉样蛋白的神经斑是AD和Down氏综合症患者以及载脂蛋白E4等位基因同型接合者的大脑组织的选择性区域的主要特征，后者很容易发展为AD。Corder等，科学(Science)261：921(1993)；Divry，P.，神经物理学杂志(J.Neurol.Psych.)27：643-657(1927)；Wisniewski等在Zimmerman，H.M.编辑的：《神经病理学进展》(Progress in Neuropathology)(Grune和Stratton，N.Y.1973)pp.1-26。通过用硫黄素S或刚果红对大脑组织切片染色可方便地证实大脑组织的淀粉样蛋白。Puchtler等，J.Histochem.Cytochem.10：35(1962)。刚果红染色的淀粉样蛋白特征为二色外观，显示出黄绿偏振色。该二色带是淀粉样蛋白的β-褶皱样片状结构的结果。Glenner，G.N.Eng.J.Med.，302：1283(1980)。淀粉样蛋白的生物化学和组织化学的详细讨论可参见Glenner，N.Eng.J.Med.，302：1333(1980)。
至今为止，AD的诊断大多仍通过临床标准评价、脑组织活体检查和死后组织研究进行。开发阿尔茨海默氏症体内诊断方法的研究包括(1)基因测试，(2)免疫分析方法和(3)成像方法。
基于对数个稀有正染色体显性的AD家族中的Aβ前体蛋白的点突变的发现证实Aβ代谢异常是AD发展的必需和充分条件。Hardy，Nature Genetics 1：233(1992)；Hardy等，科学(Science)256：184(1992)。这些突变发生在Aβ由其前体蛋白生成Aβ所需的N-和C-末端开裂点附近。St.George-Hyslop等，科学(Science)235：885(1987)；Kang等，自然(Nature)325：733(1987)；Potter WO92/17152。然而，对大量AD家族的基因分析证实AD是基因异源的。St.George-Hyslop等，自然(Nature)347：194(1990)。仅在某些早发性AD家族中显示出与第21对标志染色体的连接，但在迟发性AD家族中未观察到该连接。最近，Sherrington等鉴别了染色体14上的一种基因，该基因预计含有多个跨膜结构域，类似一完整的膜蛋白[自然(Nature)375：754-760(1995)]。该基因可引发高达70％的早发性正染色体显性AD。初步的数据认为染色体14的突变引起Aβ产量的增加。Scheuner等，Soc.Neurosci.Abstr.21：1500(1995)。在患早发性AD的Volga德国家族中的第1对染色体上鉴别出非常类似的基因突变。Levy-Lahad等，科学(Science)269：973-977(1995)。
载脂蛋白E基因型的筛选已被建议作为诊断AD的辅助手段。Scott，Nature 366：502(1993)；Roses，Ann.Neurol.38：6-14(1995)。但由于载脂蛋白E4等位基因仅是AD的一种危险因素，而非该疾病的标志，因此该技术的运用产生了困难。在许多AD患者中不存在该基因，但在许多非痴呆的老年人中却存在着该基团。Bird，Ann.Neurol.38：2-4(1995)。
已经开发了用于检测AD患者中存在的神经化学标志物和检测脑脊液中AD相关的淀粉样蛋白的免疫分析方法。Warner，Anal，Chem.59：1203A(1987)；Potter的世界专利92/17152；Glenner等的美国专利4666829。据证明这些诊断AD的方法不能检测所有患者的AD，尤其是在该疾病的早期，这些方法是介入性的，需要脊柱穿刺放液。另外，已进行了开发单克隆抗体用作Aβ成像探针的尝试。Majocha等，J.Nucl.Med.，33：2184(1992)；Majocha等，WO 89/06242和Majocha等，美国专利5231000。抗体探针的主要缺陷是存在使这些大分子穿过血脑屏障的困难。使用抗体体内诊断AD将需血脑屏障显著异常以获得进入脑的通路。还没有使人信服的功能性证据表明AD中确实存在血脑屏障异常。Kalaria，Cerebrovascular&BrainMetabolism Reviews 4：226(1992)。
在AD诊断中使用Aβ抗体也有缺陷，因为它们除使神经斑着色外，还典型地使含非β片状(非纤维状)Aβ的Aβ沉淀着色。Yamaguchi等，Acta Neuropathol.，77：314(1989)。这些沉淀可以是一种单独的损伤类型，并非一定与AD的痴呆病程有关。后一种论点是基于在认知正常的对照动物和老龄狗中发现了非纤维状的淀粉样蛋白沉淀提出的。Moran等，临床医学(Medicina Clinica)98：19(1992)；Shimada等，兽医科学杂志(Journal of Veterinary MedicalScience)54：137(1992)；Ishihara等，脑组织研究(Brain Res.)548；196(1991)；Giaccone等，神经科学通讯(Neurosci.Lett.)114：178(1990)。即使非纤维状淀粉样蛋白沉淀是神经斑的前体，AD的关键病理学过程可能是明显良性的非纤维状淀粉样蛋白沉淀进入神经斑，产生其相关的变性晕。因此，需要一种对纤维状Aβ沉淀和NFT具特异性的探针，作为比抗体对AD病理学更具特异性的标记物，它还可以标记非纤维状淀粉样蛋白沉淀。
最近，放射性标记的Aβ肽已被用于标记AD脑组织中的扩散的、致密的和神经性斑。Maggio等，WO93/04194。然而，这些肽都具有抗体的缺点。具体地说，肽一般不能穿过血脑屏障，以达到成像所需的量。
刚果红可用于体内诊断非脑实质中的淀粉样变性。但是刚果红不适于体内诊断脑组织中Aβ的沉淀，因为仅有0.03％注射剂量的碘化刚果红可进入脑实质。Tubis等，J.Amer.Pharm.Assn.49：422(1960)。与刚果红相关的放射碘化的重氮联苯胺化合物如BenzoOrange R和Direct Blue 4曾被建议用于体外和体内检测患者器官中淀粉样蛋白沉淀的存在和定位。Quay等，美国专利5039511和4933156。然而，同刚果红一样，Quay建议的所有化合物都包含强酸性的磺酸基团，该基团严重地限制了这些化合物进入脑，以致它们在脑实质中很难达到成像有效量或可检测量。
直至死后才能评估AD中的淀粉样蛋白沉淀妨碍了该毁灭性疾病的研究。十分需要一种死前定量淀粉样蛋白沉淀的方法作为轻度的或临床上易混淆的病症的诊断工具以及检测防治Aβ沉淀的有效性的工具。因此，开发一种通过成像脑实质中淀粉样蛋白沉淀死前体内诊断AD的安全和特异性的方法具有极大的意义。虽然，对于体内诊断AD已进行过各种尝试，但目前还没有死前探测脑组织淀粉样蛋白沉淀的方法。还没有一种使用高亲和性探针探测淀粉样蛋白沉淀的方法，所述探针毒性低，能够穿过血脑屏障，并且与正常脑组织相比能更有效地结合于AD脑组织，从而在患者死前可识别脑组织中的AD淀粉样蛋白沉淀。可以说，没有一种体内AD诊断方法已被证明是达到了这些标准。
新近的数据表明结合淀粉样蛋白沉淀的化合物对AD和II型糖尿病具有潜在的治疗作用。如上所述，它们是存在AD脑组织中的、扩散性和神经性斑块(典型的)的两大类疾病。扩散斑块不显示诱发形态学反应，例如神经斑中发现的反应性星形胶质细胞、营养障碍性轴突、小神经胶质细胞、突触丧失和全补体激活。Joachim等，Am.J.Pathol.135：309(1989)；Masliah等，Loc.Cit.137：1293(1990)；Lue和Rogers，Demential 3：308(1992)。这些形态学反应预示了所有神经毒性和细胞变性过程发生于神经斑的纤维性Aβ沉淀的邻近区域。据报道，在体外，有许多类型的细胞都会发生Aβ-诱发的神经毒性和细胞变性。Yankner等，科学(Science)250：279(1990)；Roher等，BBRC 174：572(1991)；Frautschy等，Proc.Natl.Acad.Sci.88：83362(1991)；Shearman等，Loc.cit.91：1470(1994)。据显示，Aβ肽的聚集是体外神经毒性产生的前提。Yankner，Neurobiol.Aging 13：615(1992)。在扩散和神经斑中的Aβ积聚状态的差异可解释围绕扩散斑的神经毒性反应缺乏。Lorenzo和Yankner，Proc.Natl.Acad.Sci.，91：12243(1994)。最近，有三个实验室的报道认为刚果红抑制体外Aβ-诱发的神经毒性和细胞变性。Burgevin等，NeuroReport 5：2429(1994)；Lorenzo和Yankner，Proc.Natl.Acad.Sci.91：12243(1994)；Pollack等，神经科学通讯(Neuroscience Letters)184：113(1995)；Pollack等，神经科学通讯(Neuroscience Letters)197：211(1995)。已经揭示了涉及抑制纤维形成和预防所形成纤维的神经毒性的两种机理。Lorenzo和Yankner，Proc，Natl.Acad. Sci.91：12243(1994)。据显示，刚果红可使胰腺的胰岛细胞免受淀粉不溶素引起的毒性作用。Lorenzo和Yankner，Proc，Natl.Acad.Sci.91：12243(1994)。淀粉不溶素是一种类似于Aβ的纤维性肽，它沉积于II型糖尿病的胰腺中。
某些偶氮染料可致癌是本领域已知的。Morgan等，Environmental Health Perspectives，102(增补)2：63-78，(1994)。这种潜在的致癌性是建立在偶氮染料可通过肠细菌被广泛代谢为游离的母体胺这一事实基础上的。Cerniglia等，生物化学和生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Com.)107：1224-1229(1982)。在联苯胺染料(和许多其它取代的联苯胺)的情况下，致癌物是游离胺。这些事实对于淀粉样蛋白的成像研究没有什么暗示，因为在这些研究中仅有极少量的高特异活性的放射性标记染料被直接注入血流中。在此，施用的量可忽略不计，并且染料也不与肠细菌接触。
在治疗用途方面，这些事实也具有重大意义。从治疗化合物释放出一种已知的致癌物是无法令人接受的。重氮染料代谢的第二个问题是许多给药的药物在吸收前是通过肠细菌代谢的。即使释放的代谢物是无毒的，也存在着降低了生物利用度的缺陷。
因此，仍然需要可结合淀粉样蛋白的化合物，它们与刚果红类似，但能够进入脑组织中(而刚果红不能)。这类化合物可用于预防与纤维形成有关的细胞变性，由此治疗淀粉样蛋白相关性疾病，例如AD和Downs综合症，并用于治疗II型糖尿病的胰腺胰岛细胞毒性。
仍需要可结合淀粉样蛋白的化合物，它们是无毒性的和可生物利用的，并且可用于治疗。
发明概述
本发明的目的是提供一种通过体内成像脑实质中的淀粉样蛋白死前诊断AD的安全特异性方法。本发明的另一个目的是提供一种识别患者死前的脑组织中AD淀粉样蛋白沉淀的方法，该方法使用一种低毒的、可穿过血脑屏障的并能区分AD脑组织与正常脑组织的高亲和性的探针探测淀粉样蛋白。另一个目的是提供一种治疗AD的方法，该方法防止Aβ沉淀或产生毒性。另一个目的是提供一种在活组织检查或死后组织分析中染色和检测淀粉样蛋白沉淀的技术。另一个目的是提供一种在活组织检查和死后组织分析中定量组织匀浆中淀粉样蛋白沉淀的方法。
为实现上述和其他目的，本发明一方面，提供一种可结合淀粉样蛋白的式I化合物或其水溶性无毒盐：
Figure A9880631800291
是C≡C，CR’＝CR’，CR’2-CR’2，C≡C-C≡C，CR’＝CR’-CR’＝CR’，C≡C-CR’＝CR’或CR’2-CR’2-CR’2-CR’2(其中各个R’独立地表示H或低级烷基)；
X是C(R”)2
(其中各个R”独立地是H、F、Cl、Br、I、低级烷基、(CH2)nOR’(其中n＝1，2或3)、CF3、CH2-CH2F、O-CH2-CH2F、CH2-CH2-CH2F、O-CH2-CH2-CH2F、CN、(C＝O)-R’、N(R’)2、NO2、(C＝O)N(R’)2O(CO)R’、OR’、SR’、COOR’、Rph、CR’＝CR’-Rph、CR’2-CR’2-Rph(其中Rph表示未取代或取代的苯基(苯基的取代基可选自R”中定义的非苯基取代基)、三-烷基锡、下式的四唑或噁二唑：
Figure A9880631800292
其中R’是H或低级烷基)
或者X是CR’＝CR’，N＝N，C＝O，O，NR’(其中R’表示H或低级烷基)，S或SO2；
R1和R2各自独立地是H、F、Cl、Br、I、低级烷基、(CH2)nOR’(其中n＝1，2或3)、CF3、CH2-CH2F、O-CH2-CH2F、CH2-CH2-CH2F、O-CH2-CH2-CH2F、CN、(C＝O)-R’、N(R’)2、NO2、(C＝O)N(R’)2O(CO)R’、OR’、SR’、COOR’、三-烷基锡，Rph、CR’＝CR’-Rph、CR’2-CR’2-Rph，其中Rph表示未取代或取代的苯基(苯基的取代基可选自R1和R2中定义的非苯基取代基)、下式的四唑或噁二唑：
Figure A9880631800301
(其中R’是H或低级烷基)、或下式的三氮烯：
Figure A9880631800302
(其中R8和R9是低级烷基)
或者
Figure A9880631800303
各个Q独立地选自下列的结构之一：
IA、IB、IC、ID、IE、IF和IG，其中
IA具有下列结构：
Figure A9880631800311
其中R3、R4、R5、R6或R7各自独立地是如上R1所定义的；
IB具有下列结构：
Figure A9880631800312
其中R10、R11、R12、R13、R14、R15或R16各自独立地是如上R1所定义的；
IC具有下列结构：
Figure A9880631800313
其中R17、R18、R19、R20或R21各自独立地是如上R1所定义的；
ID具有下列结构：
Figure A9880631800321
其中R22、R23或R24各自独立地是如上R1所定义的；和 表示下式的六个杂环之一：
Figure A9880631800323
IE具有下列结构：其中R25、R26或R27各自独立地是如上R1所定义的；和
Figure A9880631800331
表示下式的六个杂环之一：IF具有下列结构：
Figure A9880631800333
其中R28、R29、R30、R31或R32中之一是如上式I中所定义的连接
Figure A9880631800334
并且R28、R29、R30、R32或R32彼此独立地如上R1所定义；
IG具有下列结构：
其中R33、R34、R35、R36、R37、R38或R39中之一是如上式I中所定义的连接
Figure A9880631800342
并且R33、R34、R35、R36、R37、R38或R39彼此独立地如上R1所定义。
本发明的另一个目的是提供一种如上定义的可结合淀粉样蛋白的式I化合物或其水溶性无毒盐，其中取代基R1-R7和R10-R39中的至少一个选自131I，123I，76Br，75Br，18F，19F，125I，CH2-CH2-18F，O-CH2-CH2-18F，CH2-CH2-CH2-18F，O-CH2-CH2-CH2-18F和式I中特别说明的含碳取代基，其中的至少一个碳是11C或13C。
本发明的另一个目的是提供一种可与淀粉样蛋白结合的如上定义的式I化合物或其水溶性无毒盐，其中通过与合成Aβ肽或阿尔茨海默氏症脑组织结合测定的该化合物与Aβ结合的离解常数(KD)为0.0001～10.0μM。
本发明的另一个目的是提供一种可与淀粉样蛋白结合的如上定义的式I化合物或其水溶性无毒盐的合成方法，式I中取代基R1-R7和R10-R39中的至少一个选自131I，123I，76Br，75Br，18F和19F，该方法包括可与淀粉样蛋白结合的如上定义的式I化合物或其水溶性无毒盐(其中取代基R1-R7和R10-R39中的至少一个是三-烷基锡)与含131I，123I，76Br，75Br，18F或19F的卤化试剂反应的步骤。
本发明的另一个目的是提供一种用于体内成像淀粉样蛋白沉淀的药物组合物，该组合物包含(a)可与淀粉样蛋白结合的如上定义的式I化合物或其水溶性无毒盐，其中其中取代基R1-R7和R10-R39中的至少一个选自131I，123I，76Br，75Br，18F，19F和式I中特别说明的含碳取代基，其中的至少一个碳是11C或13C，和(b)可药用载体。
本发明的另一个目的是提供一种在被测试者体内检测淀粉样蛋白沉淀的方法，该方法包括下述步骤：(a)使用可检测量的上述药物组合物，和(b)检测化合物与所述被测试者中淀粉样蛋白沉淀的结合。本发明的另一个目的是提供一种在被测试者体内检测淀粉样蛋白沉淀的方法，其中的淀粉样蛋白沉淀位于被测试者的大脑中。本发明的该方法可用于疑患有淀粉样变性相关性疾病或综合症，它们选自阿尔茨海默氏症、Down氏综合症和载脂蛋白E4等位基因同型接合者。
本发明的另一个目的涉及防止与淀粉样变性相关性适应症中的纤维形成有关的细胞变性和毒性的药物组合物及方法，所述适应症是例如AD和II型糖尿病。这类药物组合物含有柯胺G的烷基、链烯基和炔基衍生物和可药用载体。这类化合物是无毒的。
本发明的另一个目的涉及在活组织检查和死后组织样品分析中作为观察和测定淀粉样蛋白沉淀的着色剂的探针的用途。
本发明的另一个目的涉及在活组织检查和死后组织样品的分析中用于定量淀粉样蛋白沉淀的放射性标记的探针的用途。
本发明的另一个目的涉及一种识别阿尔茨海默氏症脑组织与正常脑组织的方法。
本发明的其它目的、特征和优势将通过下列详细说明体现。然而，应该清楚这些详细说明和具体的实施例在表明本发明优选实施方案的同时，仅是以说明方式给出的，因为本领域普通技术人员显然可根据这些详细描述在本发明的精神和范围内进行各种变化和修饰。
附图概述
附图1A说明了柯胺G和几种已经合成和试验了的柯胺G类似物或衍生物的化学结构，包括3-碘代衍生物(3-ICG)、3-碘代二甲氧基衍生物(3-ICG(OMe)2)、二甲酯衍生物(CG(COOMe)2)、苯酚衍生物、水杨酸(SA)、苯胺衍生物(1/2CG)、刚果红、3，3’-二碘代衍生物(3，3’-I2CG)、3，3’-二溴代衍生物(3，3’-Br2CG)、3，3’-二氯代衍生物(3，3’-Cl2CG)、3-溴衍生物(3-BrCG)和5-氟水杨酸衍生物((5-FSA)CG)。附图中的数量是指各化合物抑制[14C]柯胺G与合成肽、Aβ(10-43)结合的Ki(μM)。
附图1B说明了几种已经合成和试验了的柯胺G类似物或衍生物的化学结构，包括柯胺G的3，3’-二羧酸衍生物(3，3’-(COOH)2CG)、2，2’-二磺酸衍生物(2，2’-(SO3)2CG)、3-溴，3-异丙基水杨酸衍生物(3-Br-(3-iPrSA)CG)、3-异丙基水杨酸衍生物((3-iPrSA)CG)、2，4-二苯酚衍生物(2，4-二苯酚)、间羟苯甲酸盐衍生物((6-OHSA)CG)、3，3’，5，5’-四甲基联苯胺衍生物(3，3’，5，5’-(CH3)4)CG)、3，3’-二甲基衍生物(3，3’-(CH3)2CG)、2，2’-二甲基衍生物(2，2’-(CH3)2CG)、苯并异噁唑衍生物(CG苯并异噁唑)，和3-羧基炔衍生物(3-(COOH)-C3C)。附图中的数量是指各化合物抑制[14C]柯胺G与合成肽、Aβ(10-43)结合的Ki(μM)。
附图2A-2K说明了柯胺G的链烯基衍生物和柯胺G类似物、尤其是杂环类似物的链烯基三-烷基锡衍生物的化学结构。注意除三-烷基锡部分仅存在于联苯基的一侧外，这些结构表示分子的一半，该分子是围绕结构中右上角所示的波折线键对称。三-烷基锡衍生物是制备高特异性活性的卤代放射性衍生物的稳定中间体和中间体前体。杂环类似物表示在相同结构位置上代替弱酸性结构部分作为柯胺G的酸度适当的羧基基团的替代物。这些三-烷基锡前体化合物虽以其质子化形式表示，但本领域专业技术人员将认识到它们的去质子化形式和互变异构体也包括于这些附图中。
2A)柯胺G的链烯基衍生物；
2B)柯胺G的链烯基三-烷基锡衍生物；
2C)3-羟基-1，2-苯并异噁唑类似物的链烯基三-烷基锡衍生物；
2D)邻苯二甲酰亚胺或异吲哚-1，3(2H)-二酮类似物的链烯基三-烷基烯衍生物；
2E)邻苯二甲酰肼或2，3-苯并二嗪-1，4(2H，3H)-二酮类似物的链烯基三-烷基锡衍生物；
2F)2，3-苯并噁嗪-1，4(3H)-二酮类似物的链烯基三-烷基细衍生物；
2G)(2H)1，3-苯并噁嗪-2，4(3H)-二酮类似物的链烯基三-烷基锡衍生物；
2H)(3H)2-苯并吖嗪-1，3(2H)-二酮类似物的链烯基三-烷基锡衍生物；
2I)1，8-萘二甲酰亚胺类似物的链烯基三-烷基锡衍生物。
2J)四唑类似物的链烯基三-烷基锡衍生物。
2K)噁二唑类似物的链烯基三-烷基锡衍生物。
附图3通过数种柯胺G的结构类似物表示的[14C]柯胺G与Aβ(10-43)结合的移位曲线。采用的缩略语与附图1中的相同。附图3A)柯胺G(空心三角形)；(5-FSA)CG(实心菱形)；3，3’-(COOH)2CG(实心正方形)；2，2’-(SO3)2CG(实心圆圈)。附图3B)柯胺G(空心三角形)；刚果红(空心圆圈)；苯胺衍生物(空心倒置三角形)；苯酚衍生物(空心正方形)；水杨酸(X)。该曲线表示由于微团的形成在高浓度下的结合增加了。Bedaux，F.等，Pharm.Weekblad 98：189(1963)。
附图4A是柯胺G与Aβ(10-43)结合的Scatchard图。该曲线表示适于一个具两个独立结合位点的模型的非线性最小二乘方。该直线表示单一成分。
附图4B[14C]CG与典型对照品(菱形)和AD脑组织样品(正方形)结合的Scatchard分析。虚线与AD线的斜率相同，以有助于与对照品斜率的比较。AD脑组织样品的放大率为48 NP/x200，Kd为0.35μM，Bmax为790 fmol/μg蛋白。对照品的KD为0.48μM，Bmax为614 fmo1/μg蛋白。
附图5是说明结合分析与肽浓度的线性关系图。在典型分析中采用约0.9μg Aβ(10-43)。
附图6A是说明柯胺G与Aβ(10-43)结合的时间过程图。
附图6B是说明结合速率常数(Ki)测定的图。
附图6C是柯胺G从Aβ(10-43)离解的时间过程图。
附图7是表示柯胺G与Aβ间相互作用的分子模型图。
附图8A是说明AD脑组织中被结合的[14C]柯胺G的量与神经斑(NP)的数量间的相互关系图。
附图8B是说明AD脑组织中被结合的[14C]柯胺G的量与神经纤维缠结(NFT)的数量间的相互关系图。在附图8A和8B中，X-轴表示在x200放大比率下每视野中上/中额(n＝10)或上颞皮层(n＝10)的染色切片平均NP或NFT数量。实心符号和加重线表示没有淀粉样蛋白沉淀血管病的脑组织，空心符号和虚线表示具有淀粉样蛋白沉淀血管病的脑组织。Y-轴表示与用于染色的组织相邻的脑组织样品匀浆中的总的、绝对[14C]柯胺G结合(fmol/μg蛋白)。使用约75μg和150nM[14C]柯胺G。
附图9A、9B和9C。附图9A显示了放大率高于20 NP/x200的柯胺G与AD脑组织样品的各种脑组织区域的结合，称为“高斑AD脑”。附图9B显示了放大率低于20 NP/x200的柯胺G与AD脑组织样品的各种脑组织区域的结合，称为“低斑AD脑”。数据点表示在指定脑组织区域中的[14C]柯胺G结合与在该同一大脑的小脑(CB)中[14C]柯胺G结合的比率。水平线表示平均值，误差线表示对照品(圆圈)和AD脑组织(9A和9B中的菱形)的标准误差。脑组织区域包括额极(FP)、尾头(head of caudate，CAU)、上额和中额(SMF)、颞上(ST)、下顶骨(IP)和枕(OC)皮层。星号表示与对照比较的显著差异(*p＜0.05；**p＜0.001)。附图9C中表示了两份Down氏综合症脑组织样品。9C中的菱形表示一名23岁的Down氏综合症患者(但还没有AD症状)的脑组织。9C中的三角形表示一名已发展为AD的51岁Down氏综合症患者的脑组织(绝大多数Down氏综合症患者在40多岁时就发展为AD)。
附图10图示说明经尾静脉注射了[14C]柯胺G并在所示时间处死的小鼠中柯胺G的组织水平。空心符号和细线表示绝对放射性(以cpm/g组织(左轴)为单位)。实心符号和重划线表示脑组织放射性与肾(最高)或血液(中等)放射性的比率。右轴标绘了该比率。
附图11上图(TOP)：通过Stokes和Trickey的“临床病理学杂志”(J.Clin.Pathol.)26：241-242(1973)描述的方法，用1，4-二(2-(3-羧基-4-羟苯基)乙烯-1-基)-苯染色的AD脑组织颞下叶切片。可见大量神经斑、一神经纤维缠结和频繁的神经纤维网线。脑血管淀粉样蛋白也被浓重地染色(但未显示)。使用荧光显微镜获得显微照片。下图(BOTTOM)：同样用1，4-二(2-(3-羧基-4-羟苯基)乙烯-1-基)-苯染色的转基因鼠的脑组织切片[Tg(HuAPP695.SWE)2576；Hsiao等，科学(Science)274：99-102(1996)]显示了浓重的染色斑。
附图12的条棒图显示在有或没有柯胺G的存在下，通过3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基溴化四唑鎓，MTT，还原测定的Aβ(25-35)的浓度增加对大鼠嗜铬细胞瘤(PC-12)的细胞氧化还原活性的影响。纵轴标绘了MTT还原产物在560nm处的吸收。实心条棒显示了单独Aβ(25-35)的影响，在MTT还原中该影响作用是剂量依赖性减少的。实心条棒内的白色显示了与对照品(无Aβ(25-35)，无柯胺G)的显著性差异。空心条棒显示了20μM柯胺G的保护作用。空心条棒内部的黑色显示了在有或没有柯胺G的存在下的MTT还原之间的显著性差异。
附图13的条棒图显示了通过3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑鎓溴化物，MTT，还原测定的增加浓度的柯胺G对Aβ(25-35)诱导的大鼠嗜铬细胞瘤(PC-12)的氧化还原活性的还原作用的保护性作用。纵轴标绘了MTT还原产物在560nm处的吸收。实心条棒显示了没有Aβ(25-35)存在下的柯胺G的作用。在对照品(无Aβ(25-35)，无柯胺G)和没有Aβ(25-35)存在下的各浓度的柯胺G之间没有显著性差异。空心条棒显示了在1μM Aβ(25-35)和增加浓度的柯胺G的存在下的MTT还原。实心条棒内部的白色显示在各浓度柯胺G下，在有或没有Aβ(25-35)存在下的MTT还原反应的显著性差异。空心条棒内部的黑色显示了Aβ(25-35)对照品(无柯胺G)与Aβ(25-35)加增加浓度的柯胺G之间的MTT还原的显著性差异。
附图14比较了柯胺G与失活苯酚衍生物对由Aβ(25-35)诱发的毒性的影响。除对照试验外，各试验中的Aβ(25-35)浓度均为1μM。柯胺G在0.1和1μM显示了保护作用，苯酚衍生物未显示出保护作用，它或许还促进了Aβ的毒性。
优选实施方案的详细描述
本发明探索了烷基、链烯基和炔基柯胺G衍生物和其放射性标记的衍生物具备穿过体内血脑屏障以及与斑块中沉淀的Aβ、脑血管中淀粉样蛋白中沉淀的Aβ和构成NFT中沉淀蛋白的淀粉样蛋白结合的能力。柯胺G是一种刚果红衍生物，其关键结构的差异是刚果红中的磺酸结构部分在柯胺G(附图1)中被羧基代替。该结构的变化使得柯胺G比刚果红和大分子如抗体能更好地进入大脑中。Tubis等，美国化学会志(J.Am.Pharmaceut.Assn.)49：422(1960)。另外，柯胺G是特异性较抗体更强的AD病理生理学标记物，抗体也可以标记不确定的病理学症状的非纤维性Aβ沉淀。
本发明的烷基、链烯基和炔基柯胺G衍生物具有下列特性：(1)体外与合成Aβ特异性结合，(2)与脑组织切片中的β-片状纤维沉淀结合，和(3)体内穿过不妥协(non-compromised)血脑屏障的能力。
本发明的方法可确认患者器官或机体内，优选大脑中的淀粉样蛋白沉淀的存在和位置。本发明的方法包括将可测定量的含如上定义的式I化合物(称为“可检测化合物”)或其可药用水溶性盐的药物组合物施用于患者。“可测定量”是指足以能够检测所述化合物与淀粉样蛋白结合所施用的可检测化合物的量。“成像有效量”是指足以使可检测化合物与淀粉样蛋白结合成像所施用的化合物的量。
本发明采用淀粉样蛋白探针，该探针与非侵入性神经成像技术协同用于体外定量淀粉样蛋白的沉淀，后者是例如磁共振光谱(MRS)或磁共振成像(MRI)，或者γ成像，如正电子成像术(PET)或单光子发射计算机成像术(SPECT)。术语“体内成像”是指可检测本发明的上述标记的式I化合物的任何方法。对于γ成像，在同次体内成像过程中，测定由被检测器官或区域放出的辐射并以总结合或其中一种组织中的总结合与(例如，除以)同一被检测对象的另一种组织的总结合比率表示。体内总结合被定义为通过体内成像技术的整个信号，无需通过第二次注射相同量的标记的化合物与未标记的、但化学结构相同的化合物校准。“被检测者”是哺乳动物，优选人类，最优选疑患痴呆的人。
对于体内成像，使用的检测仪器类型是选择确定标记的主要因素。例如放射性同位素和19F特别适于本发明方法中的体内成像。使用的仪器类型将指导放射性核素或稳定同位素的选择。例如选择的放射性核素须是采用选定类型的仪器可检测衰退的一类。另一种考虑涉及放射性核素的半衰期。半衰期应足够长，以使在被靶最大摄取所需的时间仍可被检测到；但又应足够短，以使被检测者不会遭受有害的辐射。本发明的放射性标记化合物可使用γ成像检测，该成像检测可检测到放射出的适当波长的γ辐射。γ成像方法包括，但不限于，SPECT和PET。对于SPECT测定，选择的放射性标记优选不具有特定的发射，但在140-200 Kev范围产生大量光子。对于PET测定，放射性标记将是发射正电子的放射性核素，例如19F湮没形成两种511Revγ射线，该射线可被PET照相机检测。
本发明中，制备可与淀粉样蛋白结合的化合物/探针，它们用于体内成像和定量淀粉样蛋白沉淀。将这些化合物与非侵入性神经成像技术协同应用，后者是例如磁共振光谱(MRS)或磁共振成像(MRI)，正电子成像术(PET)或单光子发射计算机成像术(SPECT)。依据本发明，烷基、链烯基和炔基柯胺G衍生物可通过本领域已知的通用有机化学技术用19F或13C标记应用于MRS/MRI。参见，例如March，J.“高级有机化学：反应，机理与结构”(第3版，1985)，其内容引入本文以供参考。烷基、链烯基和炔基柯胺G衍生物还可以通过本领域已知的技术用18F、11C、75Br或76Br放射标记应用于PET，Fowler，J.和Wolf，A.在“正电子成像术和放射自显影法”(Positron EmissionTomography and Autoradiography)(Phelps，M.，Mazziota，J.，和Schelbert，H.编辑)391-450(Raven Press，NY 1986)对该方法进行了描述，该内容引入本文以供参考。烷基、链烯基和炔基柯胺G衍生物还可以通过本领域已知的几种技术用123I放射标记应用于SPECT。参见，例如Kulkarni，Int.J.Rad.Appl.&Inst.(PartB)18：647(1991)，其内容引入本文以供参考。此外，烷基、链烯基和炔基的柯胺G衍生物可用任何适宜的放射性碘同位素标记，例如，但不限于，131I、125I或123I，该标记可直接通过碘化重氮碘化重氮化的氨基衍生物(参见Greenbaum，F.Am.J.Pharm.108：17(1936))，或者通过将不稳定的重氮化胺转化为稳定的三氮烯，或通过将非放射性的卤代前体转化为稳定的三-烷基锡衍生物，然后采用数种本领域熟知的方法将其转化为碘化合物。参见Satyamurthy和Barrio，有机化学杂志(J.Org.Chem.)48：4394(1983)，Goodman等，有机化学杂志(J.Org.Chem.)49：2322(1984)，和Mathis等，J.Labell.Comp.and Radiopharm.1994：905；Chumpradit等，药物化学杂志(J.Med.Chem.)34：877(1991)；Zhuang等，J.Med.Chem.37：1406(1994)；Chumpradit等，药物化学杂志(J.Med.Chem.)37：4245(1994)。例如将烷基、链烯基和炔基柯胺G衍生物的稳定三氮烯或三-烷基锡衍生物与含131I、125I、123I、76Br、75Br、18F或19F的卤化试剂反应。柯胺G的稳定三氮烯和三-烷基烯衍生物和其类似物是新的前体，它们可用于合成许多本发明的放射性标记化合物。因此，这些三氮烯和三-烷基锡衍生物也构成本发明的一类实施方案。
烷基、链烯基和炔基柯胺G衍生物也可用已知的金属放射性标记物标记，例如用锝-99m(99mTc)。引入与这类金属离子结合的配体的取代基改性无需放射性领域的普通技术人员的过度试验就可进行。然后使用这些金属放射性标记的烷基、链烯基和炔基柯胺G衍生物检测淀粉样蛋白沉淀。
本发明的方法可以使用可通过核磁共振光谱检测的同位素进行体内成像和光谱测定。特别适用于磁共振光谱的元素包括19F和13C。
适用于本发明目的的放射性同位素包括β-放射体、γ-放射体、正电子-放射体和X-射线放射体。这些放射性同位素包括131I、123I、18F、11C、75Br和76Br。依据本发明，适用于磁共振成像(MRI)或磁共振光谱(MRI)的稳定同位素包括19F和13C。适用于体外定量或组织检查或死后组织分析的匀浆物中淀粉样蛋白的放射性同位素包括125I、14C和3H。用于PET体内成像的优选放射性标记是18F，用于SPECT成像的放射性同位素优选123I，用于MRS/MRI的放射性同位素优选15F，用于体外研究的放射性同位素优选3H或14C。依据本发明，也可利用任何常规的可视诊断探针探测方法。
该方法可用于诊断轻度或临床上难以确诊的AD。采用这一技术可对淀粉样蛋白沉淀的高危人群的淀粉样蛋白沉淀进行纵向研究，所述高危人群是例如Down氏综合症、家族性AD和载脂蛋白E4等位基因同型接合者。Corder等，科学(Science)261：921(1993)。如果沉淀发生在痴呆发生的很久以前或如果沉淀与痴呆无关，该方法可确定产生暂时性后果的淀粉样蛋白沉淀。该方法可用于检测预防淀粉样蛋白沉淀的治疗效果。
通常，可测定的标记的烷基、链烯基和炔基柯胺G衍生物的剂量可根据，例如患者年龄、健康状况、性别和疾病的程度有所变化，相反，如果存在伴随治疗和其它变化，该剂量应由本领域的专业医师加以调整。剂量可在0.001mg/kg～1000mg/kg、优选在0.1mg/kg～100mg/kg范围内变化。
对被检测者的施用可局部或系统性进行，通过静脉内、动脉内、鞘内(通过脊髓液)等进行。施用也可在皮内或腔内进行，这取决于检测部位。经过使化合物与淀粉样蛋白产生结合的足够时间，例如30分钟～48小时，通过常规成像技术，例如MRS/MRI、SPECT、平面闪烁成像、PET以及浮出(emerging)成像技术检测观察下的被检测区域。确切的方案需根据患者的具体情况加以调整，例如根据上述的检测的身体部位、施用的方法和使用的标记类型；对于本领域技术人员而言，特定的方法的确定是常规性的。对于脑组织成像，优选测定结合的放射性标记的柯胺G或柯胺G衍生物或其类似物的量并与与患者小脑组织结合的标记的柯胺G或柯胺G衍生物的量比较(以比率形式)。然后将该比率与年龄相当的正常脑组织进行比较。
本发明的药物组合物以注射组合物的形式施用是有益的。适于此目的的典型组合物包含可药用载体。例如组合物在每毫升含氯化钠的磷酸盐缓冲液中可含有约10mg人血清白蛋白和约0.5～500微克标记的烷基、链烯基和炔基柯胺G衍生物。其它的可药用载体包括水溶液、无毒赋形剂，包括盐、防腐剂和缓冲剂等，例如在REMINGTON’SPHARMACEUTICAL SCIENCES，15th Ed.Easton：Mack Publishing Co.pp.1405-1412和1461-1487(1975)和THE NATIONAL FORMULARYXIV.，第14版，华盛顿，美国药物协会(14th Ed.Washington：American Pharmaceutical Association)(1975)中所述，这些内容均引入本文以供参考。
非水性溶剂的实例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射有机酯溶剂，例如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、盐水溶液、非胃肠载体，例如氯化钠、林格氏葡萄糖溶液等。静脉内载体包括流体和营养补充剂。防腐剂包括抗微生物剂、抗氧剂、螯合剂和惰性气体。根据本领域普通技术人员的常识调整药物组合物的pH和各成分的浓度。参见，Goodman和Gilman的《治疗的药理学基础》(THEPHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICS)(第7版)。
本发明的特别优选的药物组合物是除特异性地与体内淀粉样蛋白结合外，还能够穿过血脑屏障并且在适宜剂量水平是无毒的和具有满意作用时间的那些组合物。
分子模型
在Evans Sutherland PS-330计算机绘图系统上，运行计算机模型制作程序Macromodel(哥伦比亚大学C.Still 2.5版)制作分子模型，产生具反平行β-片状构型的Aβ肽链。Kirschner等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83：503(1986)。使用无需进一步进行结构修饰的淀粉样肽。排列Aβ肽以使交互链间距为4.76埃，即β-片状纤维的特征。Kirschner，出处同上。柯胺G能量被降至最低，以纤维模型排列以达到与Aβ(10-43)的赖氨酸-16与疏水苯丙氨酸-19和-20区的最大接触。
与Aβ合成肽的特异性结合的特点：亲和性、动力学、最大结合
首先用称为Aβ(10-43)的合成Aβ肽分析柯胺G和柯胺G衍生物结合的特点。选择10-43肽的原因是据显示该肽提供包含Aβ肽的所有特征结构的模型体系。Hilbich等，J.Mol.Biol.218：149(1991)。Aβ的10-43氨基酸片段采用匹兹堡大学的肽合成设备用9-芴基甲基氯甲酸酯(FMOC)化学合成。用质谱分析该肽，其主要成分的Ma为3600g/mole(计算值：3598)。该肽采用Hilbich等的方法进一步纯化，概括地说，包括在Biogel P10柱(2×180cm，200-400目，Biorad，Richmond，CA)上用70％甲酸进行连续分子大小排除色谱，然后通过Biogel P4柱(2×100cm，200-400目)用1M乙酸进行第二次洗脱。Hilbich等，J.Mol.Biol.218：149(1991)。将该肽冻干并贮存于-80℃至用于结合分析时。
Aβ(10-43)的氨基酸序列如下：
  10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21
  Tyr   Glu   Val   His   His   Gln   Lys   Leu   Val   Phe   Phe   Ala
  22   23   24   25   26   27   28   29   30   31   32   33
  Glu   Asp   Val   Gly   Ser   Asn   Lys   Gly   Ala   Ile   Ile   GLy
  34   35   36   37   38   39   40   41   42   43
  Leu   Met   Val   Gly   Gly   Val   Val   Ile   Ala   Thr
合成Aβ(10-43)的结合分析
在12×75mm的硼硅酸盐玻璃管中进行结合分析。在10％乙醇/水中加入各种浓度的非放射性柯胺G衍生物。乙醇是防止微团形成所必需的，该微团是与重氮染料衍生物形成的，在没有肽的存在下，滤器可捕获微团。往上述溶液中，加入25μl 0.36 mg/ml Aβ(10-43)的水悬浮液并加入10％乙醇，使体积达950μl。在室温培养10分钟后，加入50μl[14C]柯胺G的40％乙醇溶液，根据使用的[14C]柯胺G制品，得到[14C]柯胺G终浓度为100-125nM的溶液。将结合混合物在室温培养30分钟。通过真空滤过Whatman GF/B滤器，用BrandelM-24R细胞捕获器(Gaithersburg，MD)分离结合的和游离的放射性，然后在室温用3毫升10％乙醇洗涤两次。滤器用7.0ml塑料闪烁瓶中的4 ml Cytoscint-ES(ICN Biomedicals，Inc.，Irvine，CA)平衡过夜后，计数。在该次和所有各次结合分析中，培养至少重复进行三次，结果以平均值±标准偏差表示。
动力学研究
在13×100mm硼硅酸盐玻璃管中通过上述过滤分析样品进行柯胺G与Aβ(10-43)结合的动力学研究。为测定结合的动力学，将25μl0.36 mg/ml Aβ(10-43)放入475μl 10％乙醇中并在零时间向该溶液中加入4.5ml 125nM[14C]柯胺G。使该混合物快速涡旋并在5、10、20、30、45、60、75、135、240和300秒的时间通过真空滤过WhatmanGF/B滤器，用Brandel M-24R细胞捕获器(Gaithersburg，MD)使结合反应停止，然后在室温用3毫升10％乙醇洗涤两次；如上测定结合的放射性。
为测定结合动力学，将25μl 0.36mg/ml Aβ(10-43)放入450μl10％乙醇中，然后加入25μl 2.5μM[14C]柯胺G的40％乙醇溶液。使该混合物快速涡旋并在室温培养30分钟。该混合物在零时间用4.5ml 10μM非放射性柯胺G的10％乙醇溶液稀释，使该混合物快速涡旋，如上在0.5、1.5、3、5和15分钟的时间使解离停止，如上测定结合的放射性。
与阿尔茨海默氏症脑组织的特异性结合特点
柯胺G与AD和对照脑组织匀浆物的结合
由匹兹堡大学的阿尔茨海默氏症研究中心的神经病理学中心获得活检脑组织样品。对照品定义为按照出版的NIA会议报道设立的标准未达到AD神经病理学标准(足够的NP或NFT数量)的样品。Khachaturian，Arch.Neurol.42：1097(1985)。对由8名对照者(年龄58-75岁)、11名AD(年龄61-84岁)和两名Down氏综合症患者(年龄23和51岁)获取的脑组织样品进行研究。有六名高密斑(放大率＞NP/x200)和五名低密斑(放大率＜20 NP/x200)AD脑。有两名临床有痴呆表现、但没有NP或NFT的对照者接受了“缺乏组织学特征的痴呆患者”诊断。Knopman Dementia 4：132(1993)。另一名对照者患痴呆和橄榄体小脑脑桥萎缩。其它的对照者没有神经性疾病的临床或组织学证据。将活检样品立即在-70℃冷冻并贮存在该温度下直至匀化。计数所研究的各脑组织的上中额脑回和颞上同形皮质连接处的皮层2和4之间的五个独立但相邻的区域(放大率x200)NP和NFT数量。定量评价上/中额皮层中淀粉样蛋白血管病的存在。采用Bielschowsky银浸渗方法识别NP和NFT，用刚果红染色识别脑淀粉样蛋白血管病。该方法的细节先前已有报道。Moossy等，Arch.Neurol.45：251(1988)。在解剖学上，用于CG与上/中额或颞上皮层结合的样品与用于NP和NFT计数的样品相邻。
将上额和中额皮层连接处、颞上皮层、额极、尾头(head ofcaudate)、顶下皮层、枕皮层或小脑的组织约100mg分别用Polytron组织匀浆器(PT 10/35，Brinkman Instruments Inc.，Westbury，NY)在6档在10％乙醇中以10-20mg脑组织/毫升的浓度匀浆30秒。从每个脑组织并不能获得所有个区域。在12×75mm硼硅酸盐玻璃试管中，在室温下将25-150μl每份的组织样品(通过Lowry等，生物化学杂志(J.Biol，Chem.)193：265(1951)的方法测得蛋白质为约25-300μg)与10-750nM[14C]CG(26.8 Ci/mole)在终体积为1.0ml的10％乙醇中在室温培养30分钟。对于小脑比率研究，采用约150μg蛋白和75nM[14C]CG的标准条件，对于涉及NP、NFT和淀粉样蛋白血管病的研究，采用约75μg蛋白和150nM[14C]CG的标准条件。乙醇是阻止微团形成所必需的，微团是与重氮染料衍生物形成而发生的，因为在没有组织存在的情况下，通过滤器可捕获微团。通过使用Brandel M-24R细胞捕获器(Gasithersburg，MD)真空滤过Whatman GF/B滤器分离结合了的和游离的放射性，然后在室温用10％乙醇洗涤两次。滤器在4ml Cytoscint-ES闪烁剂(ICN Biomedicals，Inc.，Irvine，CA)在7.0ml塑料闪烁瓶中平衡后，计数。可饱和的(特异性)结合定义为总结合减去在20μM未标记的CG存在下的剩余的(非可饱和的)结合。在所有结合测定中，培养进行至少三次，结果用平均值±标准误差(除非有其它具体说明)表示。结果以确定的脑组织区域的fmol[14C]/μg蛋白的绝对值表示，或以该脑组织区域的fmol/μg蛋白与该脑中小脑的fmol/μg蛋白的比率表示。
辛醇/水的分配
在5.0ml 1-辛醇中制备柯胺G或其类似物的约75μM溶液。加入5ml磷酸盐缓冲盐水(0.15M NaCl，5mM磷酸钾，pH7.4)，通过快速涡旋使两层混合。然后将该化合物在1000g离心，以便于两个澄明相的形成。用分液漏斗分离两层，将每层600μl的溶液用400μl乙醇稀释并在389nm测定柯胺G的吸收或各类似物的λmax。在两种溶剂中校准摩尔吸收差后，测定浓度，分配系数用辛醇层中浓度除以水层中的浓度表示。实验重复进行三次。
阿尔茨海默氏症脑组织中柯胺G与淀粉样蛋白沉淀结合成像
为肉眼观察证实CG衍生物与组织的结合，将具有严重脑血管淀粉样蛋白沉淀的AD脑组织的8微米石蜡切片采用改进的斯托克斯氏方法用1，4-二(2-(3-羧基-4-羟基苯基)乙烯-1-基)-苯染色，以及采用Trickey，临床病理学杂志(J.Clin.Pathol.)26：241-242(1973)中记载的方法用1mM 1，4-二(2-(3-羧基-4-羟基苯基)乙烯-1-基)-苯代替刚果红染色，该方法其它条件相同。将染了色的切片用萤光显微镜检查。
测定化合物穿过血脑屏障的能力
小鼠研究  在雌性Swiss-Webster小鼠的尾静脉注射0.03μCi/g[14C]柯胺G的0.9％氯化钠溶液。在注射15分钟、35分钟、1小时、4小时和24小时后断颈处死小鼠。快速获取颈动脉血、脑、肝和肾组织，称重并在蒸馏/去离子水中用磨沙玻璃匀浆器匀化。称取等份重量的样品加到18.0ml塑料闪烁瓶(Beckman Poly-Q-Vial)中并加入10.0ml闪烁合剂(Cytoscint-ES(ICN))并平衡过夜后计数。组织中[14C]柯胺G的含量以cpm/mg组织表示。
由组织提取放射性的实验如上所述进行，不同的是注射0.05μCi/g[14C]柯胺G并在60分钟时处死小鼠。然后取出脑和肝组织，采用Folch方法提取。Folch等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)226：447(1957)。在两种组织中，有机层中含有的提取的放射性活性超过95％。将有机层蒸发至干，再悬浮于少量10％甲醇/90％ACN中，加注到硅胶柱(Prep Nova Pak HR Silica，7.8×300mm，Waters，Milford，MA)上，用相同的溶剂等度洗脱。在这些条件下，溶剂前期的馏分洗脱了99％的放射性，但大多数脂质被保留的时间更长，使溶剂前期洗脱的馏分适于加注到上述的反相C4柱上。将全部的溶剂前馏分收集、干燥并再悬浮于10％ACN/90％磷酸钠缓冲液(5mM，pH6)，然后与真实的非放射性柯胺G一起加注到C4柱上。收集每分钟的馏分，加入10ml Cytoscint-ES后，计数。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种药物组合物和防止与在某些“淀粉样变性相关性”适应症中的纤维形成相关的细胞变性和毒性的方法，所述适应症是例如阿尔茨海默氏症、Down氏综合症和II型糖尿病，遗传性脑出血性淀粉样变性(荷兰人)、淀粉样蛋白A(反应性)、继发性淀粉样变性、家族性地中海热、伴随荨麻疹和聋哑的家族性肾病(Muckle-wells综合症)、淀粉样蛋白λL-链或淀粉样蛋白κL-链(自发的、骨髓瘤或巨球蛋白血症相关的)Aβ 2M(长期血液透析)、ATTR(家族性淀粉样蛋白多神经病)(葡萄牙人、日本人、瑞典人)、家族性淀粉样蛋白心肌病(丹麦人)、单独的心脏淀粉样蛋白(系统性老年淀粉样变性)、AIAPP或淀粉不溶素胰岛瘤、心钠素(单独的心房淀粉样蛋白)、procalcitonin(甲状腺髓瘤)，凝溶胶蛋白(家族性淀粉样变性(芬兰人))、cystatin C(伴随淀粉样变性的遗传性脑缺血(冰岛人))、AApo-A-I(家族性淀粉样变性多神经病(衣阿华州))、AApo-A-II(小鼠的加速敏感)、纤维蛋白原相关性淀粉样蛋白；和Asor或PrP-27(瘙痒病，Creutzfeld Jacob病，Gertsmann-Straussler-Scheinker综合症，牛海绵状脑炎)或载脂蛋白E4等位基因同型接合者。该方法包括向疑患或易发展为这类淀粉样变性相关性适应症的对象施用含柯胺G或一种其上述的衍生物的药物组合物。
由于某些重氮化合物致癌，本发明的治疗化合物仅包括无毒的、非致癌性化合物。即，本发明通过使用不含可被代谢为致癌联苯胺化合物的基团的烷基、链烯基和炔基化合物解决了潜在致癌性的问题。
任何涉及低生物利用度的潜在问题也通过使用偶氮化合物的烷基、链烯基和炔基衍生物而得以避免。这些化合物不是细菌或哺乳动物偶氮还原酶的底物。
确实，本发明的化合物由于存在含1，4-二(2-(3-羧基-4-羟基苯基)乙烯-1-基)-苯键的化合物而具有有益的治疗用途，该化合物不是肠细菌偶氮还原酶的底物。
体外研究表明Aβ神经毒性需要纤维形成，并被刚果红抑制。具体地研究还表明结合淀粉样纤维的染料刚果红通过抑制纤维形成或结合形成的纤维抑制纤维状Aβ的神经毒性。Lorenzo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：12243-12247(1994)。还表明刚果红抑制糖尿病相关性淀粉不溶素(另一种类型的淀粉样纤维)的胰腺胰岛细胞毒性。Lorenzo等，出处同上。还参见Burgevin等，NeuroReport 5：2429(1994)；Pollack等，J.Neurosci.Letters 184：113-116(1995)；Pollack等，Neuroscience.Letters 197：211(1995)。这些数据表明可结合淀粉样蛋白的化合物，例如柯胺G的烷基、链烯基和炔基衍生物，它们与刚果红类似，但又与刚果红不同，它们可进入血脑屏障，可有效地防止与淀粉样变性相关性适应症中的纤维形成有关的细胞变性和毒性。
实施例8及附图12和13表明柯胺G的作用非常相似于那些先前报道的刚果红，它们具有剂量依赖性，对嗜铬细胞瘤有预防作用。因此，这些体外分析提供了选择用于防止与纤维形成有关的细胞变性和毒性的药物组合物的化合物。
本发明试验了化合物，例如柯胺G和其上述的衍生物体内防止淀粉样纤维形成或相关性细胞变性的效能，所述试验是通过测定动物模型的营养障碍性轴突的形成、突触减少、神经原纤维缠结形成和神经胶质增生进行的，所述动物模型是例如脑淀粉样变性的“老年性动物模型”，Wisniewski等，J.Neuropathol.&Exp.Neurol.32：566(1973)；家族性地中海热的小鼠模型(Neurochem.，Inc.Kingston，Ontario，加拿大)和阿尔茨海默氏症类型神经病的转基因鼠模型，Games等，Nature 373：523-527(1995)；Hsiao等，Science 274：99-102(1996)。在家族性地中海热模型中，动物发展为系统性淀粉样变性。在本发明的体内分析中，比较使用了和未使用本发明的化合物处理的动物的系列尸体剖检。在脑淀粉样蛋白形成的动物模型中，除了下述系列的淀粉样蛋白形成，还通过营养障碍轴突的形成、突触的减少、神经原纤维缠结形成和神经胶质增生在使用了和未使用本发明的化合物处理的动物的系列尸体剖检中测定了与淀粉样蛋白有关的神经变性。
依据本发明，将含有柯胺G或其衍生物的药物组合物施用于预期存在淀粉样蛋白或淀粉样纤维形成、细胞变性和毒性的对象。在优选的实施方案中，这类对象是人类，包括例如那些易发展脑淀粉样蛋白的危险人群，包括老年非痴呆人群及淀粉样变性相关性疾病和II型糖尿病患者。术语“防止”包括改善与纤维形成相关的细胞变性和毒性。“改善”是指防止已具毒性表征，例如痴呆患者的细胞变性和毒性发展为更严重的形式。
用于防止与淀粉样变性相关性疾病中的纤维形成有关的细胞变性和毒性的药物组合物含有柯胺G或其上述的衍生物和可药用载体。在一种实施方案中，这类药物组合物含有血清白蛋白、柯胺G或柯胺G衍生物和含氯化钠的磷酸盐缓冲剂。其它的可药用载体包括水溶液，无毒的赋形剂，包括盐、防腐剂和缓冲剂等，它们是例如在“REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES”(第15版，Easton：MackPublishing Co.，pp.1405-1412和1461-1487(1975))、“THENATIONAL FORMULATION XIV.”(第14版，Washington：AmericanPharmaceutical Association (1975))和“UNITED  STATESPHARMACOPEIA XVIII”(第18版，Washington：AmericanPharmaceutical Association(1995))中所述的赋形剂，这些内容均引入本文以供参考。
非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射的有机酯，例如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液，盐水溶液、非胃肠载体，例如氯化钠、林格氏葡萄糖溶液等。静脉载体包括流体和营养补充剂。防腐剂包括抗微生物剂、抗氧剂、螯合剂和惰性气体。根据本领域普通技术人员掌握的技术调整药物组合物的pH和各种成分的确切浓度。参见，Goodman和Gilman的“THE PHARMACOLOGICALBASIS FOR THERAPEUTICS”(第7版)。
依据本发明，这类药物组合物可以液体或固体形式口服或以悬浮液或溶液形式静脉或肌内注射给药。术语“药学有效量”是指可防止与纤维形成有关的细胞变性和毒性的量。该量可根据患者的年龄、体重和健康状况发生所需的变化，可由本领域普通技术人员按照熟知的方案加以调整。在一种实施方案中，每日剂量在0.1～100mg/公斤，或者可划分为较小剂量每日分2～4次给药。这样的方案可每日终生给药。或者，药物组合物可以0.1～100mg/kg的剂量肌内给药，每周一至六次。
在另一种实施方案中，本发明涉及一种在活组织检查或死后组织分析中检测淀粉样蛋白沉淀的方法。该方法包括将福尔马林固定的组织与上述式I化合物的溶液一起培养。该溶液优选是用式I化合物饱和的25～100％乙醇溶液(剩余为水)。培养完后，将化合物染色或标记组织中的淀粉样蛋白沉淀，然后可通过标准方法检测或肉眼观察染色了的或标记了的沉淀。这类检测手段包括显微技术，例如亮视野显微镜检查、荧光显微法、激光同焦点和交叉极化显微法。
在另一种实施方案中，本发明涉及一种在活组织检查和死后组织分析中定量淀粉样蛋白的方法。该方法包括将标记的柯胺G的烷基、链烯基和炔基衍生物，优选式I化合物或其水溶性无毒盐与活组织检查或死后组织的匀浆一起培养。获取组织并用本领域熟知的方法匀化。优选的标记是放射性标记，当然也可以使用其它本领域技术人员熟知的标记物，例如酶、化学发光剂和免疫荧光化合物。优选的放射性标记是125I、14C或3H，式I的优选标记取代基是R1～R7、R10～R27中的至少一个。含淀粉样蛋白沉淀的组织将与标记的柯胺G的烷基、链烯基或炔基衍生物结合。然后采用本领域技术人员已知的各种机理，例如过滤将结合了的组织与未结合的组织分离。然后通过本领域普通技术人员已知的任何方法定量结合的组织。参见实施例3。然后通过与用已知量的淀粉样蛋白和放射性标记的柯胺G衍生物产生的标准曲线进行比较，将组织结合的放射性标记的柯胺G衍生物的单位转化为每100mg组织中的淀粉样蛋白的毫克单位。
在另一个实施方案中，本发明涉及区别阿尔茨海默氏症脑组织与正常脑组织的方法，包括从正常者和疑患阿尔茨海默氏症者的脑组织中获取(i)小脑组织和(ii)同一脑的除小脑外的另一区域的组织。参见实施例3。采用本领域技术人员熟知的方法匀化分离的组织，然后将其与放射性标记的烷基、链烯基和炔基柯胺G衍生物一起培养。计算各类型组织(例如小脑、非小脑、正常和异常脑组织)与放射性标记的烷基、链烯基和炔基柯胺G衍生物结合的组织的量，计算从正常者脑组织与疑患阿尔茨海默氏症者脑组织获取的非小脑与小脑组织的结合比率。比较这些比率。如果疑患阿尔茨海默氏症患者脑组织的比率超过正常脑组织的90％，确诊为阿尔茨海默氏症。
实施例1、柯胺G和其衍生物的合成
柯胺G的合成
合成柯胺G(即，4，4’-二(3-羧基-4-羟基苯基偶氮)-联苯)需要下列反应步骤。这些反应步骤被称为“柯胺G合成”的通用方法。将联苯胺·2HCl(28.9mg，0.11mmol，Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)加到50毫升园底烧瓶中的1.5ml 1∶1 DMSO∶蒸馏/去离子水中。除非另有说明，各反应步骤均在0℃下进行，加入29μl浓盐酸，搅拌后得到一澄明溶液。往该联苯胺溶液中，滴加15.5mg(0.22mmol)NaNO2在300μl 1∶1 DMSO/H2O中的溶液，所得溶液pH约为2-3。将该反应混合物搅拌45分钟，然后往该四氮化联苯胺混合物中在10分钟期间滴加24.8mg(0.18mmol)溶于2.0ml含250mg/ml Na2CO3的100％DMSO悬浮液中的水杨酸甲酯(Aldrich)，期间保持pH约为10.5。将所得混合物在0℃搅拌1小时，然后室温搅拌过夜。
之后，调整pH至约7后，该混合物用每次50ml氯仿萃取三次。合并的氯仿萃取液用每次50ml水洗涤三次，然后使其干燥，得柯胺G二甲酯(即，4，4’-二(3-羧基-4-羟基苯基偶氮)-联苯)，该产物进一步用氯/己烷重结晶纯化。该酯然后用约100ml含四当量氢氧化钠的1∶1乙醇∶水解离水解并回流3小时。蒸发乙醇后，冻干水分，得到柯胺G的四钠盐。通过将四钠盐溶于水中，用氯洗涤一次除去未水解的二甲酯，将pH调至约2并用每次50ml乙酸乙酯萃取三次，形成柯胺G的游离酸。将合并的乙酸乙酯萃取液用每次50ml的水洗涤三次并使其干燥。
在这些条件下，通过反相HPLC，用C4柱(Vydac 214-TP510)和磷酸钠缓冲液(5mM，pH6)∶乙腈(ACN)90∶10溶剂系统等度洗脱10分钟，然后将乙腈的含量增至50％洗脱20分钟(流速3.5ml/分)分析表明所得产物不残留水杨酸甲酯、水杨酸或联苯胺，仅有微量单取代的产物，4-羟基-4’-(3-羧基-4-羟基苯基偶氮)-联苯。用双波长、二极管阵列检测仪(Perkin Elmer 235C)在290和365nm检测柱洗脱液。在这些条件下，柯胺G在17.6分钟洗脱。
通过质子NMR在500MHz于DMSO-d6中用TMS作为内标证实柯胺G和其衍生物的结构。用SA表示水杨酸结构部分的特定环位置上的质子，BZ表示联苯胺结构部分的质子，柯胺G四钠盐的峰分布如下：百万分之6.75(ppm)，SA-3，双峰J＝8.73Hz；7.82ppm，SA-4，双双峰J＝8.73和2.72Hz；7.91ppm，BZ-2/6，双峰J＝8.44；7.95ppm，BZ-3/5，双峰J＝8.44Hz；和8.28ppm，SA-6，双峰J＝2.72Hz。在40％乙醇中的UV/可见光谱显示λ最大在398nm。通过NMR与内标比较峰面积，计算柯胺G的浓度测定柯胺G的摩尔吸收，然后立即测定在40％乙醇中稀释的NMR等份样品进行UV/可见光谱。在40％乙醇中于398 nm的摩尔吸收为5.5×104AU/(cm·M)。
通过改进的上述方法合成[14C]柯胺G。除在100％水中使用四氮化联苯胺外，其余如上所述。将50μl 2.5M碳酸钠水溶液加到0.5ml圆锥形小瓶中的50μCi结晶水杨酸-羧基-14C(Sigma)中。将60μl四氮化联苯胺的混合物加到该圆锥形小瓶中，在0℃涡旋并保持1小时。为避免单取代的联苯胺副产物的形成，将12.5μl 250mM非放射性水杨酸(Sigma)在2.5M碳酸钠中的溶液加到该反应混合物中并在0℃保持1小时。使小瓶在室温保持过夜。将全部混合物溶于少量35％ACN后，注入上述的C4柱中。收集对应于柯胺G标准品的峰洗脱液并冻干。通过测定398nm处的吸收，然后计数相同等份样品的放射性，计算的特定活性为26.8 Ci/mol。将该[14C]柯胺G贮存于40％乙醇中。当将纯化了的[14C]柯胺G再注入C4柱时，用21％ACN以3.5ml/分流速等梯度洗脱，在10.4分钟时与真实柯胺G共同洗脱的放射性＞98％。除下述例外，许多柯胺G衍生物都可采用“柯胺G合成”通用方法合成。衍生物的结构可由NMR鉴别。附图1显示了柯胺G和其数种衍生物的结构。
同样，可采用改进的上述方法合成[3H]柯胺G。用美国放射性标记化学公司(American Radiolabelled Chemical，Inc.(St.Louis))制备的商品3，3’-[3H]联苯胺将含8.26Ci无载气氚气的0.7mg 3，3’-二碘代联苯胺、1mg钯/碳催化剂、200μl N，N-二异丙基乙基胺和500μlTHF的混合物在室温处理3小时。未提供确切收率和特定活性。3，3’-[3H]联苯胺与真实联苯胺一起洗脱并显示没有单碘取代的杂质。由于市售提供的原料含某些残留的N，N-二异丙基乙基胺，它会干扰重氮化，3，3’-[3H]联苯胺通过从Vydac C4柱上用100％水(pH＝6.0)～100％0.01N HCl(pH＝2.2)的10分钟线性梯度洗脱(4.0ml/分)纯化。采用该方法，在约9.5分钟时洗脱3，3’-[3H]联苯胺，其不含N，N-二异丙基乙基胺，可采用不会影响重氮化反应的溶剂。在数百微升体积中用100倍过量亚硝酸钠重氮化，然后与百倍过量的水杨酸碳酸钠溶液偶联，得到柯胺G的含氚衍生物(4，4’-二(3-羧基-4-羟基苯基偶氮)-3，3’-[3H]联苯)，如上通过HPLC纯化，得出其特异性活性为～35 Ci/mmol。
柯胺G的链烯基(CH＝CH)衍生物的合成
通过氢化铝锂还原，将4，4’-联苯二羧酸(Aldrich)转化为4，4’-二(羟甲基)联苯，该产物随后通过与碘化钠和三氟化硼乙醚化物在ACN中反应转化为4，4’-二(碘甲基)联苯。该碘代化合物与过量亚磷酸三乙酯在90℃加热1小时，得到4，4’-联苯基二甲基膦酸四乙酯。类似地处理1，4-萘-二羧酸(Aldrich)或9，10-蒽-二羧酸(Aldrich)，得到相应的膦酸四乙酯。用己烷重结晶后，将磷酸酯溶于DMF，用10倍量的甲醇钠处理，然后用2当量的5-甲酰基水杨酸的DMF溶液处理。在室温搅拌24小时后，将反应混合物倾入水中。用盐酸将水酸化至pH5.0，沉淀出荧光产物，4，4’-二(2-(3-羧基-4-羟基苯基)乙烯-1-基)-联苯，该产物可被选择性地萃取到乙酸乙酯中，从而与任何单取代的副产物分离。类似地用5-甲酰基水杨酸处理对亚二甲苯基二膦酸四乙酯(TCI America)或其衍生物，得到1，4-二(2-(3-羧基-4-羟基苯基)乙烯-1-基)-苯。同样，通过用5-甲酰基水杨酸处理相应的磷酸酯可得到1，4-二(2-(3-羧基-4-羟基苯基)乙烯-1-基)-萘或9，10-二(2-(3-羧基-4-羟基苯基)乙烯-1-基)-蒽。其它衍生物可通过使用其它的甲酰基水杨酸类似物、甲酰基苯甲酸或者羟基-或甲氧基苯甲醛获得。
当所需的骨架连接物不是上述列出的那些时，可将适宜的二羧酸(例如，2-溴对苯二甲酸(Aldrich))还原为二醇，转化为碘化物，然后转化为上述二膦酸四乙酯。当所需的侧链基团不是水杨酸时，可首先使适宜的酚(该酚通常也包含一酸性功能基)在酚基的邻位或对位碘代(取决于存在的其它取代基)，然后采用标准方法在碘代的位置甲酰化。
柯胺G的丁二烯基(CH＝CH-CH＝CH)衍生物的合成
将对亚二甲苯基二膦酸四乙酯(TCI America，Portland，OR)溶于无水DMSO中，用10倍过量的叔丁醇钾(Aldrich)处理，再在无水DMSO中用2当量3-甲氧基羰基-4-甲氧基肉桂醛(由5-碘-2-甲氧基苯甲酸甲酯和丙烯醛用标准方法)处理。在室温搅拌24小时后，将反应混合物倾入水中。水用盐酸酸化到pH5.0后，沉淀出荧光产物，1，4-二(4-(3-羧基-4-甲氧基苯基)-1，3-丁二烯-1-基)-苯，该产物可被选择性地萃取到乙酸乙酯中与任何单取代的副产物分离。用过量硫代乙醇钠在DMF中回流开裂甲氧基，得到水杨酸衍生物。如上所述，类似地处理其它骨架连接的磷酸酯和适宜肉桂醛衍生物的混合物，得到所需产物。
柯胺G的烷基取代的链烯基(CR’＝CR’)衍生物的合成
首先用氢化铝锂还原，将4，4’-联苯二羧酸(Aldrich)或1，4-苯二羧酸(Aldrich)转化为二(羟甲基)化合物，随后用BaMnO4在乙酸乙酯中处理，转化为二甲醛。该二甲醛与R’MgX(其中R’是低级烷基，X是Br或I)通过格利雅反应产生HOCR’H-Ph-Ph-CR’H-OH或HOCR’H-Ph-CR’H-OH。将烷基取代的二(羟甲基)化合物通过与碘化钠和三氟化硼的乙醚化物在ACN中转化为烷基取代的二(碘甲基)化合物。该碘代化合物与过量亚磷酸三乙酯在90℃加热约1小时，得到烷基取代的二甲基膦酸四乙酯。类似地处理1，4-萘-二羧酸(Aldrich)或9，10-蒽二羧酸(Aldrich)可得到相应的烷基取代的二甲基膦酸四乙酯。
然后，可合成三种烷基取代的化合物，即AR-CR’＝CR’-Q，AR-CR’＝CH-Q或AR-CH＝CR’-Q(其中R’是低级烷基，Q如式I中所定义)。AR-CR’＝CR’-Q化合物的制备可通过烷基取代的二甲基膦酸四乙酯与适宜的芳基酮，如5-乙酰基水杨酸的反应进行(Crescent ChemicalCo.，Inc.，Hauppage NY)。AR-CR’＝CH-Q的制备可通过烷基取代的二甲基膦酸四乙酯与适宜的醛，如5-甲酰基水杨酸(aldrich)的反应进行。AR-CH＝CR’-Q化合物的制备可通过二甲基膦酸四乙酯与适宜的芳基酮，如5-乙酰基水杨酸的反应进行(Crescent Chemical Co.，Inc.，Hauppage NY)。反应条件与上述制备链烯基(CH＝CH)衍生物的条件相同。
柯胺G的炔基(C≡C)衍生物的合成
通过与甲醇、原甲酸三甲酯和硫酸反应，将5-碘代水杨酸(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)转化为甲酯。然后在钯的存在下，将获得的5-碘代水杨酸甲酯与(三甲硅烷基)乙炔(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)反应。除去三甲硅烷基，如上在钯的存在下，将2当量的所得5-乙炔基水杨酸甲酯与4，4’-二溴代联苯(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)反应。通过上述的酯水解制备柯胺G的炔基类似物，4，4’-二(2-(3-甲氧基羰基-4-羟基苯基)乙炔-1-基)-联苯。
柯胺G的炔基(C≡C)和乙烯基(CH＝CH)衍生物合成的另一种方法
如上所述，在碳酸钾的存在下，通过与碘甲烷反应将5-溴水杨酸(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)转化为甲酯/甲基醚。在钯的存在下，将如此获得的2-甲氧基-5-溴代苯甲酸甲酯与(三甲硅烷基)乙炔(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)反应。除去三甲硅烷基，如上在钯的存在下，将2当量的所得2-甲氧基-5-乙炔基水杨酸甲酯与4，4’-二溴代联苯(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)反应。通过上述的酯水解制备柯胺G的炔基类似物，4，4’-二(2-(3-羧基-4-甲氧基苯基)乙炔-1-基)-联苯。通过常规方法将该炔基类似物还原形成柯胺G的乙烯基类似物。
另一种合成链烯基衍生物的方法可采用Suzuki或Steel反应，它们将2-甲氧基-5-乙炔基苯甲酸的硼或锡衍生物(或其它上述的羟基-酸衍生物)与1，4-二碘代苯、4，4’-二碘代联苯或其它的二碘代或二溴代骨架连接物偶联。在某些情况下，优选制备1，4-二乙炔基苯(或4，4’-二乙炔基联苯)并将其与5-碘代水杨酸(或类似的碘代羟基-酸)偶联。
柯胺G的二-炔基(C≡C-C≡C)衍生物的合成
通过与甲醇、原甲酸三甲酯和硫酸反应，将5-碘代水杨酸(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)转化为甲酯。然后在钯的存在下，将获得的5-碘代水杨酸甲酯与(三甲硅烷基)乙炔(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)反应。除去三甲硅烷基，如上在钯的存在下，将2当量的所得5-乙炔基水杨酸甲酯与4，4’-二(2-溴乙炔-1-基)苯(由三甲硅烷基乙炔与1，4-二碘代苯合成)反应。通过上述的酯水解制备柯胺G的二-炔基类似物，4，4’-二(4-(3-甲氧基羰基-4-羟基苯基)-1，3-丁二炔-1-基)-苯。
柯胺G的链烯-炔基(C＝C-C≡C)衍生物的合成
类似于上述的链烯基和炔基衍生物的合成，用Suzuki或Steel反应将苯、联苯或其它骨架基团的金属-链烯基衍生物与2-甲氧基-5-(2-碘代乙炔-1-基)-苯甲酸甲酯(其它适宜的羟基酸衍生物)偶联，或者可将2-甲氧基苯甲酸甲酯的5-金属-链烯基衍生物与1，4-二(2-碘代乙炔-1-基-苯(或4，4’-二(2-碘代乙炔-1-基)-联苯)偶联。
柯胺G的烷基(CH2-CH2)或二-烷基(CH2-CH2-CH2-CH2)衍生物的合成
将上述的链烯基、炔基、二-链烯基、二炔基或链烯-炔基衍生物采用标准方法用氢气和铂或钯催化剂氢化。
二-氟链烯基柯胺G衍生物的合成
通过用3-甲酰基-5-氟水杨酸取代5-甲酰基水杨酸合成5-氟衍生物，1，4-二(2-(2-羟基-3-羧基-5-氟苯基)乙烯-1-基)-苯。在Schiemann反应中，柯胺G的[18F]芳基氟化物衍生物可通过用18F-标记的前体，例如[18F]LiBF4，通过用Cs[18F]分解三氮烯或者通过亲核性18F取代X取代基合成，其中X＝甲苯磺酰基、三氟甲磺酸基、NO2、N(CH3)3或卤素。参见Fowler，J.和Wolf，A.，“正电子成像术和放射自显影法”(Phelps，M.，Mazziota，J.，和Schelbert，H.编辑)391-450(Raven Press，NY，1986)和Kilbourn，M.，氟-18标记的放射性药物(Natl.Acad.Press，Washington，D.C.)(1990)。
芳族氟烷基和氟烷氧基衍生物的合成
芳族氟烷基衍生物可采用Bishop等在“药物化学杂志”(J.Med.Chem.)34：1612(1991)中描述的方法合成，其中适宜的O-烯丙基醚的克莱森重排形成芳族烯丙基衍生物，该衍生物可进一步功能化，得到氟乙基或氟丙基衍生物。或者，可采用Sonogashira等(四面体通讯(Tetrahedron Letters)4467-4470(19759))的借助钯的偶联方法将芳族的碘化物方便地转化为长度为2-5个碳原子的芳族炔。接下来将炔衍生得到氟烷基衍生物。氟烷氧基衍生物可采用Chumpradit等，“药物化学杂志”(J.Med.Chem.)36：21(1993)中的方法制备，其中将适宜的酚用适宜的1-溴代(或碘代或磺酰氧)-ω-氟烷烃烷基化，得到相应的氟烷氧基衍生物。
芳族烷基磺酰氧基和烷氧基磺酰氧基衍生物的放射性氟化
获得芳族[18F]氟烷基和[18F]氟烷氧基衍生物的放射性氟化是采用Mathi s等的方法(Nucl.Med.Biol.19：571(1992))进行的，其中将芳族烷基或烷氧基磺酰氧基(例如，烷氧基甲磺酸基)衍生物用[18F]氟取代得到芳族[18F]氟烷基和[18F]氟烷氧基化合物。
通过三-烷基锡途径的放射性碘化和放射性溴化
合成三烷基锡衍生物
柯胺G的链烯基三-烷基锡衍生物的通式结构如附图2B所示。在通式中，联苯结构部分一侧上3位的三-烷基锡基通常被取代，但其它位置，包括水杨酸或杂环结构部分上的三-烷基锡基团也有可能被取代。这些三-烷基锡衍生物是制备用于人类的放射性碘化和放射性溴化化合物的稳定中间体。更具体地说，这些三-烷基锡衍生物用于制备适用于体内成像淀粉样蛋白的卤代的放射性化合物。
合成三-烷基锡衍生物的通用方法
采用先前公开的方法，由适宜的芳基卤化物、[(C6H5)3P]3Pd(0)和六烷基二锡制备三-烷基锡衍生物，先前公开的方法包括Kosugi，M.等，化学通讯(Chem.Lett.)1981：829；Heck，R.纯化学和应用化学(Pure and Appl.Chem.)1978：691；Echavarren，A.和Stille，J.美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)1987：5478；Mitchell，T.有机金属化学杂志(J.Organometallic Chem.)1986：1；和Stille，J.纯化学和应用化学(Pure and Applied Chem.)1985：1771。这些衍生物也可通过Mathis等的方法(J.Labell.Comp.andRadiopharm.1994：905)用正丁基锂和三-烷基氯化锡获得。
4，4’-二(3-甲氧基羰基-4-羟基苯基偶氮)-联苯的3-三-烷基锡衍生物的合成
通过合成3-溴联苯胺或3-碘联苯胺(出处同上)、四氮化和与水杨酸甲酯偶联(如合成柯胺G中的)合成3-溴代或3-碘代-4，4’-二(3-甲氧基羰基-4-羟基苯基偶氮)-联苯或其二甲酯衍生物，当需要甲氧基化合物时，将上述的酚甲基化。在氩气氛下，将1mmol酚的酯或甲氧基酯、[(C6H5)3P]3Pd(0)(0.1～0.2mmol)、六丁基二锡或六甲基二锡(1.25mmol)和二氧六环(25ml)在70℃加热16小时。将反应混合物冷却并蒸发溶剂。用氟化钾水溶液除去卤化物。有机物用乙酸乙酯萃取，经硫酸镁干燥，过滤，减压除去溶剂。残余物经硅胶纯化，得到3-三-烷基锡-4，4’-二(3-甲氧基羰基-4-羟基苯基偶氮)-联苯。
三-烷基锡衍生物的放射性碘化或放射性溴化
三丁基或三甲基锡衍生物采用公开的方法用Na[125I]或Na[123I]进行放射性碘化，或者用Na[75Br]或Na[76Br]进行放射性溴化，这些方法是例如Mathis等，J.Labell.Comp.and Radiopharm.1994：905；Chumpradit等，药物化学杂志(J.Med.Chem.)34：877(1991)；Zhuang等，J.Med.Chem.37：1406(1994)；Chumpradit等，药物化学杂志(J.Med.Chem.)37：4245(1994)。通常，0.5mg三-烷基锡化合物、0.2ml无水乙腈、10μl 2M H3PO4、2～100μl高特异性活性(＞2000 Ci/mmol)的Na[125I]或Na[123I](或者Na[75Br]或Na[76Br])在pH 9-12的氢氧化钠中的溶液和二氯胺-T(DCT)(20μl2.5mg/ml DCT，在乙腈中)放在1ml的反应小瓶中。将小瓶盖盖并在室温暗处下搅拌。通过HPLC检测反应，30分钟后用50μl 2M Na2S2O3使反应停止。产物通过标准色谱技术纯化。Mathis等，J.Labell.Comp.and Radiopharm.1994：905。同样，可采用类似方法制备低特异活性18F衍生物。
制备非放射性I、Br、Cl、F和-SH衍生物的通用方法
一般说来，5-甲酰基水杨酸的3-或4-氨基衍生物或附图2所示的水杨酸的杂环类似物的相应衍生物可用亚硝酸钠和盐酸或硫酸转化为相应的重氮化合物。碘衍生物可通过形成碘化重氮，然后转化为芳基碘化物，或者通过三氮烯中间体直接制备。参见，例如Greenbaum，F.Am.J.Pharm.108：17(1936))；Satyamurthy N.和Barrio J.，有机化学杂志(J.Org.Chem.)48：4394(1983)；和Goodman M.等，有机化学杂志(J.Org.Chem.)49：2322(1984)。芳基溴化物和氯化物可按照Sandmeyer反应用CuCl或CuBr处理重氮化合物或者通过如制备碘衍生物的三氮烯制备。芳基氟化物可按照Schiemann反应用NaBF4、HBF3或NH4BF4处理或者通过如合成碘衍生物的三氮烯分解制备。芳基硫醇可用含硫的亲核性物质，例如HS-、EtO-CSS-和S2 2-处理重氮化合物制备。或者，芳基硫醇可用含硫的亲核性物质置换芳基卤化物制备。这些方法记载于March，J.，高等有机化学：反应、机理和结构(ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY：REACTIONS，MECHANISM，AND STRUCTURE)(第3版，1985)中。
制备放射性C、F和Tc衍生物的通用方法
除上述方法外，用99mTc或用发射正电子的放射性核素11C、18F、75Br和75Br放射性标记的高特异活性可采用本领域熟知的文献方法实现。下面描述了几种可能的特异性方法，但对于本领域专业人员而言，也存在其它熟知的方法，例如Fowler，J.和Wolf，A.“正电子成像术和放射自显影法”的“正电子发射体标记的化合物”(Phelps，M.，Mazziota，J.，和Schelbert，H.编辑)391-450(Raven Press，NY 1986)；Coenen，H.等，Radiochimica Acta 34：47(1983)；和Kulkarni，Int.J.Rad.Appl.&Inst.(Part B)18：647(1991)，这些内容引入本文以供参考。
99mTc衍生物可通过与芳基硫醇复合制备。用11C的放射性标记可方便地通过上述的N-甲基化、O-甲基化，对适宜的烷基、链烯基或炔基柯胺G类似物进行[11C]碘甲烷、[11C]烷基化或[11C]羧基化实现。[18F]芳基氟化物衍生物可通过上述Schiemann反应中的取代18F-标记的前体，例如[18F]LiB4，通过用Cs[18F]进行三氮烯分解，或通过亲核性18F取代X取代基(其中X＝甲苯磺酰基、三氟甲磺酸基、NO2、N(CH3)3或卤素)进行制备。采用75Br或76Br的放射性溴化可使用类似于放射性碘化的亲电性(Br-)或亲核性(Br-)取代技术完成，参见Coenen，H.出处同上。
3-羟基-1，2-苯并异噁唑衍生物和相关衍生物(参见附图2C)的合成
按照Bshagen的方法(Chem.Ber 100：954-960；1967)，用羟胺盐酸盐将2，6-二羟基苯甲酸(γ-间羟苯甲酸)甲酯(TCL America，Portland，OR)转化为羟肟酸。仍按照Boshagen的方法，使用SOCl2，然后用三乙胺将羟肟酸转化为相应的3-羟基-1，2-苯并并噁唑(Chem.Ber 100：954-960；1967)。将该化合物转化为甲酰基衍生物后，如上链烯基衍生物合成中所述，与适宜的二膦酸四乙酯偶合(在某些情况下可以是溴化的)。之后，如上所述将溴代衍生物转化为三-烷基锡和碘代衍生物。
或者按常规将5-甲酰基水杨酸与适宜的二膦酸四乙酯偶合，将所得的4，4’-二(2-(3-羧基-4-羟基苯基)乙烯-1-基)-苯首先转化为二甲酯，然后转化为羟肟酸，最后通过上述Boshagen的方法得到苯并异噁唑。第三类3-羟基-1，2-苯并异噁唑可由包括4，6-二羟基-1，3-苯并二甲酸、3，6-二羟基苯二甲酸和2，5-二羟基对苯二甲酸(Aldrich Chem.Co.，Milwaukee，WI)的几种二羟基苯二甲酸合成。甲酰基化后，通过标准方法与适宜的二膦酸四乙酯偶联，然后转化为二甲酯，二羟基/二甲酯通过上述Boshagen方法与羟胺反应转化为二羟基/二羟肟酸。向双苯并异噁唑的转化可通过用SOCl2和三乙胺处理，然后再采用上述的Boshagen方法进行。
邻苯二甲酰亚胺或异吲哚-1，3(2H)-二酮衍生物(参见附图2D)的合成
如上链烯基衍生物合成中所述，将由3-羟基邻苯二甲酸酐(Aldrich Chem.Co.，Milwaukee，WI)制备的3-羟基邻苯二甲酰亚胺转化为甲酰基衍生物并与适宜的二膦酸四乙酯(在某些情况下可以是溴代的)偶联。然后如上所述，将溴衍生物转化为三-烷基锡和碘代衍生物。
2，3-苯并二嗪-1，4(2H，3H)-二酮衍生物(参见附图2E)的合成
用肼将由3-羟基邻苯二甲酸酐(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)制备的3-羟基邻苯二甲酰肼转化为甲酰基衍生物，并如上在链烯基衍生物的合成中所述，与合适的二膦酸四乙酯(在某些情况下可以是溴代的)偶合。然后如上所述，将溴衍生物转化为三-烷基锡和碘代衍生物。
2，3-苯并噁嗪-1，4(3H)-二酮衍生物(参见附图2F)的合成
使用羟胺将3-羟基邻苯二甲酸酐(Aldrich Chem.Co.，Milwaukee，WI)转化为2，3-苯并噁嗪。然后如上链烯基衍生物的合成中所述，将苯并噁嗪衍生物转化为甲酰基衍生物并与适宜的二膦酸四乙酯(在某些情况下可以是溴代的)偶联。然后如上所述，将溴衍生物转化为三-烷基锡和碘代衍生物。
(2H)1，3-苯并噁嗪-2，4(3H)-二酮衍生物(参见附图2G)的合成
采用Effenberger等的方法(Chem.Ber.105：1926-1942；1972)合成该化合物。概括地说，是通过甲酰基水杨酸衍生物合成中使用的相同方法，将4-羟基苯甲醛(Aldrich)与适宜的二膦酸四乙酯偶联。然后通过在三乙胺的存在下与乙氧羰基异氰酸酯(O＝C＝N-CO-O-Et)反应将所得加成物转化为氨基甲酸酯。通过在二苯基醚中加热将该取代的氨基甲酸酯(或N-乙氧羰基-氨基甲酸苯基酯)转化为苯并噁嗪二酮。然后如上所述，将苯并噁嗪二酮转化为三-烷基锡和碘代衍生物。
(3H)2-苯并吖嗪-1，3(3H)-二酮衍生物(参见附图2H)的合成
将3-羟基苯乙酸(Aldrich Chem.Co.，Milwaukee，WI)甲酰化，转化为酰胺，然后通过如上甲酰基水杨酸衍生物合成的相同方法，将其与适宜的二膦酸四乙酯偶联。然后通过与氯甲酸乙酯反应，将该加成物转化为N-(3-羟基苯基乙酰氧基)-氨基甲酸乙酯。通过在二苯基醚中加热将该取代的氨基甲酸酯(或N-乙氧羰基-氨基甲酸苯基酯)转化为苯并吖嗪二酮。然后如上所述，将苯并噁嗪二酮转化为三-烷基锡和碘代衍生物。
1，8-萘二甲酰亚胺衍生物(参见附图2I)的合成
如上链烯基衍生物合成中所述，将4-氨基-1，8-萘二甲酰亚胺转化为甲酰基衍生物并与适宜的二膦酸四乙酯(在某些情况下可以是溴代的)偶联。然后如上所述，将溴衍生物转化为三-烷基锡和碘代衍生物。
四唑和噁二唑衍生物(参见附图2J和2K)的的合成
按照Holland和Pereira的方法(J.Med.Chem.10：149(1967))和Holland的美国专利3448107，通过与叠氮化钠或叠氮化铝反应，将2-氰基苯酚(Aldrich Chem.Co.，Milwaukee，WI)转化为四唑。概括地说，是在氩气氛下，将柯胺G的2-氰基苯酚或链烯基氰基苯酚衍生物(由4-甲酰基-2-氰基苯酚与适宜的二膦酸四乙酯偶联制备)(1mmol)的40ml DMF溶液用叠氮化钠(10mmol)和三乙胺盐酸盐(10mmol)处理。将该混合物在120℃搅拌2小时后，将其冷却并以上述柯胺G合成中描述的后处理方式进行后处理。
通过用酸酐(如，乙酸酐)处理如上制备的四唑合成噁二唑。另一种方法是Bamford等在J.Med.Chem 38：3502(1995)中描述的方法。在该方法中，将柯胺G或水杨酸的酰肼链烯基衍生物(通过用肼处理相应的酯获得)在二环己基碳化二亚胺的存在下用异硫氰酸甲酯处理。
用作对照的柯胺G衍生物的合成
通过用两当量的苯胺(Fisher Chemical Co.，Fair Lawn，NJ)代替一当量的联苯胺合成该苯胺衍生物。通过用联苯胺-2，2’-二磺酸(Pfaltz&Bauer，Inc.，Waterbury，CT)代替联苯胺合成2，2’-二磺酸衍生物。通过用一当量的苯酚代替一当量的水杨酸合成苯酚衍生物。刚果红(Aldrich认可的级别)可从市场获得。
实施例2柯胺G和柯胺G衍生物与Aβ的结合特异性
与合成Aβ(10-43)的结合
在体外，柯胺G可与合成Aβ(10-43)很好地结合。附图4A显示了柯胺G与Aβ(10-43)结合的Scatchard分析。高亲和性成分的KD为0.257μM，B最大为3.18nmol柯胺G/mg Aβ(10-43)。低亲和性成分用这些数据来定义不是太好，其表现出的KD为4.01μM，B最大为18.7nmol柯胺G/mg Aβ(10-43)。低亲和性成分表示高浓度的柯胺G与明显的低亲和性位点的结合，而不是与制品中杂质的结合。注射到体内的柯胺G的量是如此之低，以致不会与任何低亲和性成分产生结合。在极低的浓度下，高亲和性结合与低亲和性结合的比率非常大。
柯胺G结合的量与使用范围内的肽浓度呈线性关系，如附图5所示。
结合动力学
动力学研究显示了相当快速的结合(附图6A)，基本用1分钟就可完成，[柯胺G]＝112μM时的t为8.9±1.8秒，也显示了速度稍慢的结合(附图6C)，t＝55±9.4秒[结合速率常数(K-1)＝1.26×10-2秒-1]。附图6B显示了根据Bennett和Yamamura.Bennett，J.P.和Yamamura，H.I.在神经递质受体结合(NEUTOTRANSMITTERRECEPTOR BINDING)(N.Y.：Raven Press 1985)pp.61-89中描述的方法转化的结合动力学数据。附图6A中结合曲线的线性部分转化为附图6B中的直线，其中将ln[Beq/(Beq-Bt)]对时间作图，其中Beq是达平衡时(4分钟)结合的柯胺G的量，Bt是在t时间时结合的量。该直线的斜率等于K观察，K1＝(K观察-K1)/[柯胺G]，其中K1是由附图6C的数据测定的解离速率常数。附图6C中的曲线尊从下列等式： A t = A 0 e - k - 1 t
其中At是在t时间时仍保持结合的柯胺G的量，A0是在0时间时结合的柯胺G的量，t是以分钟为单位的时间，K-1是解离速率常数。由该分析计算得到的结合速率常数(K1)为3.75×10M-1秒-1，KD＝K-1/K1＝0.34μM，与Scatchard分析保持了良好的一致性。
柯胺G衍生物可抑制柯胺G与Aβ的结合
在附图1的化学结构下面和附图3显示的数种替代曲线显示了柯胺G衍生物抑制[14C]柯胺G与Aβ(10-43)结合的K1值。K1被定义为IC50/(1+[L]/KD)，其中[L]是分析中[14C]柯胺G的浓度(0.100～0.125μM)，KD是0.26μM，柯胺G的KD通过上面的Scatchard分析测定。柯胺G自身的K1为0.37±0.04μM，该值与由Scatchard和动力学分析中获得的值非常一致。刚果红的K1为2.82±0.84μM。柯胺G的二氟代衍生物、(5-FSA)CG(附图1)是柯胺G自身效能的三分之一(K1＝1.16±0.19μM)。根据二氟代柯胺G衍生物的活性，认为18F二氟代柯胺G衍生物可用于PET成像，19F二氟代柯胺G衍生物可用于脑组织的MRS/MRI成像。
3-ICG的效能较柯胺稍强。根据3-ICG的活性，认为123I二氟代柯胺G衍生物可用于SPECT成像。甲基化的3-ICG的酚(3-ICG(OMe)2)将亲和性降低了10倍。CG(COOMe)2中的甲基化的羧基使亲和性降低了更多(约200倍)。如果将酸性结构部分全部除去，象苯酚衍生物中那样，就完全消除了结合亲和性。
这些结果表明在与Aβ的结合中，柯胺G类似物的酸性结构部分起着重要作用，酚结构部分起着辅助作用。通过氢与酸结合，酚可以发生作用，该结合作用稳定了酸结构部分的结构取向。邻位酚基的存在也可能通过氢结合或通过芳香系统整体的电荷分布变化改变酸上电荷的分布。或者，酚基可通过连接酚和酸与淀粉样蛋白结合位点的两个配位基直接参与与淀粉样蛋白的结合。如在间羟苯甲酸衍生物，(6-OHSA)CG中那样，在羧基的邻位加上第二个酚基可产生出该系列中最高的亲和性化合物，其K1为0.094+0.02μM。
增加联苯骨架的亲脂性在一定程度上表现出亲和性的增加。二卤代衍生物，3，3’-I2CG、3，3’-Br2CG和3，3’-Cl2CG均具有非常类似的K1值，它们约是柯胺G的一半。
通过在2位进行取代扭转联苯基的两个苯环间的两面角的角度，大大降低了亲和性。这通过柯胺G的2，2’-二-磺酸衍生物，2，2’-(SO3)2CG的失活得以证实。由于3，3’二羧酸衍生物、3，3’(COOH)2CG，仅显示失去7倍柯胺G的活性，附加的酸性结构未必是使2，2’-二-磺酸活性丧失的唯一原因。该2，2’-衍生物是独特的，即2位庞大的磺酸基破坏了联苯基的平面化。分子模型研究表明2，2’-二磺酸衍生物中联苯基的两个苯环间的两面角为83°。柯胺G和所有其它活性衍生物中的该角约为35-40°。
在探索柯胺G的功能基配位基性质的重要性中，研究了苯胺衍生物的结合，这些衍生物在附图1中仅表示出了半个分子。可按照下式计算大约的结合能量：
AG＝-RT ln Keq
其中ΔG是结合反应的能量，R是摩尔气态常数[8.31441J/(mol·°K)]，T是°K时的温度，Keq是该反应的平衡常数：
[探针]+[肽]＝[探针·肽]
和Keq＝1/KD-1/K1。使用的柯胺G的KD值为0.26μM，结合能量大概为38KJ/mol。如果苯胺衍生物以一半的能量进行结合，则预期的解离能量约为19KJ/mol。如果苯胺衍生物的K1为73μM，则结合能量为23KJ/mol，该值与预期值的一致性可被接受。水杨酸自身全然缺乏结合活性证实了柯胺G和苯胺衍生物中的疏水性区域的重要性。
柯胺G对Aβ的亲和性比刚果红对该肽的亲和性高数倍。该结合是可逆的，无论是通过Scatchard分析、动力学方法或结合抑制测定法测定的结合常数均约为250～400nM。由于其非结晶性，淀粉样蛋白纤维具有较差的溶解性，刚果红或柯胺G与淀粉样蛋白配合的结构还从未被精确的结构测定技术，例如X线晶体照相术或多维NMR所确定。已有人提出了刚果红与淀粉样蛋白相互作用的模型。Cooper，实验室研究(Lab.Invest.)31：232(1974)；Romhanyi，VirchowsArch.354：209(1971)。该研究认为刚果红不与单个淀粉样蛋白肽分子结合，但与由于β片状纤维定向的交叉的数个Aβ分子结合。Klunk等，组织化学和细胞化学杂志(J.Histochem.Cytochem.)37：1273(1989)。
附图7显示了该模型图，该图是用MacroModel 2.5生成的，其中柯胺G跨越了反平行β片状构型的5个肽链。使用的这些肽未进行结构精确化。排列Aβ以使交互链间距为4.76埃，即β-片状纤维的特征。以黑色和白色划出交互的肽链。柯胺G(黑色)被能量最小化，与纤维模型排列，使与赖氨酸-16(附图顶部的浅灰色椭圆形)和疏水性苯丙氨酸19/20区域(底部)的接触达到最大。两个视角对于该同一模型而言，彼此相差90°。白色箭头表示获得另一个视角采用的方向。
柯胺G的羧基结构间的19.1埃间距与跨越5个链的距离19.0埃匹配得很好(4×4.76埃，相邻两个链间距4.76埃，Kirschner等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83：503(1986))。如果象Hilbich等认为的那样，Aβ的天然结构与发夹环形结构有关(Hilbich等，J.Mol.Biol.218：149(1991))，那么链1与2、3与4、5与6等将被折叠为同分子的一半，而模型却是完整的。另一值得注意的重要点是该模型中的正电荷氨基酸残基是必需的，例如Aβ中的赖氨酸-16。先前的研究显示了刚果红的结合与淀粉样蛋白纤维样品中的正电荷氨基酸的数量密切相关。Klunk等，组织化学和细胞化学杂志(J.Histochem.Cytochem.)37：1273(1989)。柯胺G的单配位基苯胺类似物的亲和性降低、水杨酸的失活以及联苯胺结构上具有两个卤素的较强亲脂性化合物(见附图1)效能的增强支持了附图7中模型的二配位基性质和疏水性相互作用的重要性。2/2’-二磺酸衍生物的失活证明了接近平面的联苯基的重要性。
实施例3、柯胺G对阿尔茨海默氏症脑组织与正常脑组织的识别
柯胺G与AD脑组织的结合特性
为搞清柯胺G与AD脑组织的增加的结合，对柯胺G和柯胺G衍生物与AD脑组织样品的结合进行Scatchard分析。(附图4B，表1)。在采用的条件下，对照品和AD脑组织显示了单一结合成分。AD脑组织的KD较对照品低16％，但差异不明显(p＝0.29)。AD脑组织的B最大较对照脑组织高36％，但差异仍不够显著(p＝0.09)。因此，AD脑组织中的增加的结合主要是由于其中存在的同样的结合成分较对照脑组织多，而不是有独特成分的存在。
表1、AD与对照脑组织的结合参数比较
    KD(μM)     B最大(pmol/μg prot)
    对照(n＝6)    0.47±0.049       0.576±0.092
    AD(n＝5)    0.39±0.048       0.784±0.061
CG与AD脑组织的结合与脑组织结合皮层中的NP数量明显相关。附图8A显示了[14C]CG结合与AD脑组织的上/中额和颞上皮层中的NP数量的关系。无论是否包括对照(r＝0.69；p＝0.001)，或是单独考虑AD脑组织(r＝0.59；p＝0.007)，与NP的关系都是明显的。附图8B显示了与NFT数量的类似关系。正如与NP的关系一样，无论是否包括对照(r＝0.60；p＝0.001)，或是单独考虑AD脑组织(r＝0.50；p＝0.026)，结合与NFT的关系也是显然的。结合与NFT有关并不出人意料，因为CG是刚果红的衍生物，而刚果红可使NFT染色。NP的数量与NFT数量也显著相关(r＝0.82；p＝0.0001)。
由于在该研究中，对使用的脑组织，无论淀粉样蛋白血管病是否存在都只能获得定性的数据，因此未能进行CG结合与脑血管淀粉样蛋白水平的类似相关性研究。当存在淀粉样蛋白血管病时，CG结合与NP数量的关系出现混淆变化。附图8A显示出在没有淀粉样蛋白血管病的脑组织中CG结合与NP比例数量关系(r＝0.79；p＝0.01)与具有脑血管淀粉样蛋白沉淀的脑组织(r＝0.49；p＝0.15)相比有所提高。但在与NFT数量的比例关系中，没有发现类似的提高。
[14C]柯胺G与AD脑组织结合的KD与在[14C]柯胺G与合成的Aβ的体外结合中测得的类似，表明在脑组织匀浆物中的结合也可表示为与Aβ间的相互作用。柯胺G的结合与NFT的关系表明了柯胺G也是与脑组织中的这些结构物结合。此外，由于NFT数量与NP数量密切相关，[14C]柯胺G与NF的结合关系可能刚好是[14C]柯胺G与NP结合的附带现象。
通过与合成Aβ肽或阿尔茨海默氏症脑组织的结合测定的本发明提供的有价值的柯胺G衍生物或类似物的亲和性KD至少为0.01～10.0μM；在本发明方法中也使用结合亲和性在0.0001～0.01μM的具有较高亲和性的化合物。
鉴于上述考虑，柯胺G结合不是Aβ特异性的。相反，柯胺G结合可以反映出脑组织中包含的淀粉样蛋白总量，包括神经斑中聚集的Aβ沉淀和脑血管淀粉样蛋白沉淀。NFT中的磷酰化σ蛋白沉淀也可与柯胺G结合。Goedert，M.等，PNAS 85：4051(1988)。NFT也包括四元结构类似于Aβ纤维的反平行β-片状纤维。Kirschner等，Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83：503(1986)。
总柯胺G结合和相对柯胺G结合区分AD与正常脑组织
如上和如下所述的体外结合分析在本领域中被广泛地用作筛选用于体内脑组织结合化合物的模型和预知随后体内成像研究成功的模型。参见，Young，A.等，在“正电子成象术和放射自显影术”的“受体测定：体外和体内”部分(Phelps，M.，Mazziota，J.和Schelbert，H.编辑)pp.73-111(1986)。本发明的标记的柯胺G和柯胺G衍生物还可用于上述和下述的体外结合分析，用于在活组织检查和死后样品分析中定量淀粉样蛋白沉淀。
在AD脑组织和对照脑组织中均观察到了[14C]柯胺G的浸透性(特异性)结合，它占AD脑组织中总结合的60～80％。非浸透性结合在AD脑组织和对照脑组织中非常相象。AD脑组织中的浸透性结合和总结合均多于对照。尽管采用总结合时获得的敏感性较低，但该参数更能预知体内研究的成功性，而体内研究才是本发明的最终目的。如果使皮层区域的柯胺G结合标准化为其中AD和对照脑组织中的柯胺G结合非常相象的脑组织区域的结合，对于目的扩展的体内研究将是有益的。这免除计算绝对结合量的需要，体内该量的计算是较为困难的。我们测定了小脑组织中的结合作为可能的对照区域，因为在该脑组织区域中典型NP非常地少(Joachim等，Am.J.Pathol.135：309(1989))。
[14C]柯胺G与对照小脑组织结合的平均数量和与AD小脑组织结合的数量基本相同(表2)，支持了小脑作为内部对照的应用。因此，小脑比率(CBR)准确反映了[14C]柯胺G结合的绝对数量，体现了对各脑组织提供内部对照的优点。在无论是以绝对值(fmol/μg蛋白)(表2)还是以与同一大脑的小脑中结合的比率(表3)表示，AD脑组织中的结合都是高的。CBR是更敏感的量度，并且在两种脑组织中显示了较低的变化性。使用总结合和CBR将大大有助于这些离体结果向体内研究的扩展。因此，每当合适时就采用这些参数来表示下面的结果。
表2、AD和对照脑组织中的总结合比较*
脑组织区域     对照(CBR)     AD(CBR)     p值
    额极   0.87±0.04(n＝6)   1.87±0.25(n＝10)   p＜0.004
  上/中额   0.73±0.02(n＝8)   1.84±0.18(n＝11)   p＜0.001
    颞上   0.86±0.08(n＝8)   1.63±0.17(n＝11)   p＜0.002
    尾头   0.95±0.04(n＝4)   1.76±0.31(n＝7)   p＜0.04
    顶骨内   0.90±0.08(n＝8)   1.93±0.20(n＝11)   p＜0.001
    枕骨   0.77±0.13(n＝8)   1.44±0.20(n＝11)   p＜0.02
*高密斑和低密斑脑混合。
表3、以与小脑的比率形式比较AD和对照脑组织中总结合*
  脑组织 对照(fmol/μg蛋白) AD(fmol/μg蛋白)     p值
    小脑     75±13  (n＝8)     73±9(n＝11)     p＝0.91
  额极     78±8   (n＝6)     124±16(n＝10)     p＜0.006
  上/中额     54±10  (n＝8)     130±21(n＝11)     p＜0.003
  颞上     66±17  (n＝8)     121±14(n＝11)     p＜0.02
  尾头     73±11  (n＝4)     123±22(n＝7)     p＝0.14
  顶骨内     76±13  (n＝8)     137±19(n＝11)     p＜0.03
  枕骨     64±16  (n＝8)     95±12(n＝11)     p＝0.15
*各样品的CBR通过用样品中[14C]柯胺G结合的绝对值除以同一大脑的小脑样品中的[14C]柯胺G结合的绝对值获得。表中的值是从各脑组织区域获得的平均值(±SEM)。高密斑和低密斑脑混合。
附图9A和9B显示了被标准化为同一脑中小脑中结合的[14C]柯胺G与六个脑组织区域的结合。附图9A中显示了柯胺G与AD脑组织区域的结合的放大率大于20 NP/x200，为“高密斑AD脑”。附图9B中显示了柯胺G与AD脑组织区域的结合的放大率小于20 NP/x200，为“低密斑AD脑”。在所有各个脑组织区域中，与AD脑组织的结合明显要比对照多(见表3)。在上/中额皮层，对照样品与AD的各样品之间没有重叠。在除枕骨皮层外的各脑组织区域中，在对照和AD样品之间也没有重叠(放大率为＞20 NP/x200)。在典型NP沉淀最少的脑组织区域中，例如枕骨皮层(和小脑)中观察到了AD与对照结合之间的最大重叠。
附图9C显示了从两名Down氏综合症患者获得的数据。所有Down氏综合症患者到其四十多岁时均产生Aβ沉淀，有许多发展为AD。Wisniewski等，Neurology 35：957(1985)；Schapiro等，Neurobol.Aging 13，723(1992)。这两类患者均显示出超出对照范围的[14C]柯胺G结合。由于年轻患者(23岁)有淀粉样蛋白沉淀，但没有临床痴呆症状，附图9C表明柯胺G可测定其与非痴呆患者对照的差异，该对照者在临床痴呆症状出现很久以前，最终发展为AD。
本发明的化合物和方法提供了两种区分AD脑与正常脑组织的测量；(1)总的柯胺G结合(表2)或(2)在指定脑组织区域中的柯胺G结合与同一脑中的小脑组织中的柯胺G结合比率(表3)。这些测量对于体内定量AD神经斑提供了两大优点。第一，通过提供一种测量总结合，而非特异性Aβ结合的方法，患者无需接受为测量非特异性结合而进行的第二次放射性物质注射，本发明即可定量Aβ沉淀。因此，数据可以只用总结合表示。在所示的各种实验中，获得的特异性结合的数据甚至高于AD与对照脑组织间的差异。
第二，脑组织摄取的柯胺G衍生物的差异将影响脑组织中柯胺G的绝对浓度。因此，需要某些解释这些被检测对象间差异的机理。通过寻找几乎没有Aβ沉淀显示的脑组织区域，将每位患者作为其自身的对照(即，实验“空白”)。由于典型NP很少存在于小脑中(Joachim等，Am.J.Pathol.135：309(1989))，将柯胺G与小脑的结合用作各脑组织研究的对照。结果以在指定脑组织区域中的柯胺G结合与同一脑的小脑中的柯胺G结合的比率表示(附图9和表3)。
在体内定量AD中淀粉样蛋白时，应考虑脑萎缩的影响。因此，当使用柯胺G和柯胺G的衍生物探针体内定量淀粉样蛋白时，脑组织萎缩可根据MRI体积测量法加以校准。与本发明的方法协同进行的MRI体积测量法与本领域常规采用的那些方法类似。参见，Pearlson，G.和Marsh，L.在“精神病学年度综述(Annual Review ofPsychiatry)(第12卷)”中的“精神病学中的磁共振成象术”(Oldham，J.等编辑，第347-381(1993))。因此，测定单位体积脑组织区域的总放射性的方法将使用下面的等式：
Figure A9880631800711
指定测量的信号/脑组织区域“A”的体积或S/VA是指表示如下的小脑比率：
Figure A9880631800712
其中S/VCB是信号/该成像研究中同一被测试者的小脑的体积。将疑患有AD或其它以淀粉样蛋白沉淀为特征的病症患者的除小脑外的任何脑组织区域的该比率与年龄相当的正常对照者组的相同脑组织区域的该比率正常范围进行比较。将和神经斑高度沉淀的脑组织区域结合与和小脑结合的比率用作区别阿尔茨海默氏症与对照者参数。
实施例4柯胺G、柯胺G衍生物和刚果红的辛醇-水分配系数
辛醇-水分配系数是化合物相对亲脂性的一种量度。亲脂性越强的化合物，越容易穿过血脑屏障。参见，Goodman和Gilman的《治疗的药理学基础》(THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICS)(第7版)。柯胺G的辛醇/水分配系数为60.22±3.97，刚果红的该系数为0.665±0.037(p＜0.001)。这表明柯胺G的亲脂性比刚果红强约90倍，因此从理论上说，柯胺G更易于穿过哺乳动物的血脑屏障。柯胺G的3-碘代和3，3’-二碘代衍生物(附图1)的辛醇/水分配系数分别为72.53±0.74和112.9±7.3。这些辛醇/水分配系数表明这些衍生物(它们是某些用于体内研究的放射性标记的柯胺G衍生物的非放射性类似物)的亲脂性比刚果红强170倍，是柯胺G的两倍。这表明它们将比刚果红或柯胺G能更好地进入脑组织。
实施例5柯胺G和柯胺G衍生物穿过血脑屏障的能力及柯胺G的代谢
用淀粉样蛋白探针体内诊断AD需要它们能够穿过血脑屏障，进入脑实质的淀粉样蛋白沉淀中。
用Swiss-Webster小鼠进行柯胺G穿过血脑屏障的能力的研究。静脉注射后，在15分钟时测定的脑/血比率超过10∶1，在35分钟时达到20∶1(附图10)。超过该时间，脑组织中保持的放射性接近恒定，但血中的放射性逐渐降低，而肝脏中的放射性逐渐增高。脑/肾比率在15分钟时最高(加样后经过的时间)，达到0.5。当静脉注射[14C]柯胺G后60分钟取出脑和肝脏时，在反相HPLC上，有＞95％的回收放射性与真实柯胺G一同洗脱，表明在该段时间内，柯胺G没有发生明显代谢。
柯胺G能进入正常小鼠的脑中，脑/血比率很高。经过30分钟后，脑中的放射性保持相对恒定，但血液中的放射性逐渐降低，而肝脏中的放射性逐渐增高。这表明高的脑/血比率是由于肝脏有效除去血液中柯胺G的结果，而不是柯胺G在脑中进一步积累的结果。在60分钟时，在脑和肝脏中测得了基本上所有的放射性，证明了未变化的柯胺G。刚果红不能穿过血脑屏障。Tubis等，J，Amer.Pharm.Assn.49：422(1960)。大部分刚果红通过肝脏和脾脏清除，豚鼠中的脑/肾比率约为0.07。Tubis等，出处同上。柯胺G也通过肝脏清除，但较容易进入脑中。
体内动物测试为确定剂量范围、转运通过血液屏障的效力和结合能力提供了另一种基础。为此，特别优选使用Games等(Nature 373：523(1995))或Hsiao等(Science 274：99-102(1996))的转基因鼠模型以及用于脑淀粉样蛋白变性的“老年性动物”模型，即转基因鼠动物或者老龄的狗或猴子，已知它们可发展为可变数量的阿尔茨海默氏症类型的脑神经斑，参见Wisniewski等，J.Neuropathol.&Exp.Neurol.32：566(1973)；Selkoe等，Science 235：873(1987)，测试结合和测定效力。这种体内测定需要对照-活检或尸检检查以证实和定量淀粉样蛋白沉淀的存在。
用于测试本发明组合物和方法的其它适宜的动物模型通过转基因生产。例如，Quon等，Nature，352：239-241(1991)用大鼠神经特异性烯醇化酶助催化剂抑制剂区域制备转基因小鼠。参见，Wirak等，Science，253：323-325(1991)。其它模型可通过对动物直接颅内给予β/A4肽来生产(Tate等，Bull.Clin.Neurosci.，56：131-139(1991))。
值得注意的是，没有一种体内动物模型被证明是AD神经病理学研究的极好模型。相反，它们可能更接近正常老化的淀粉样蛋白沉淀模型。这是一种特别真实的老龄哺乳动物模型。所有这些模型都显示出了如上面在老龄狗模型中讨论的扩散斑优势。虽然有一些脑血管淀粉样蛋白，但基本没有神经斑(除Games等和Hsiao等的转基因鼠外)。其它转基因鼠模型常仅显示出扩散斑。因此，虽然这些模型可用于研究脑组织中探针的分布，但这些模型显示根据上述柯胺G与AD脑组织结合的体外研究预期在AD大脑组织中观察到的相同数量差异的可能性极小。
烷基、链烯基或炔基柯胺G衍生物穿过血脑屏障的能力的评价
将剂量为约10mCi特异活性为约500Ci/mol或更高的适宜放射性标记的柯胺G衍生物静脉注射到正常被测试者和疑患有AD的患者中，通过SPECT或PET成像检测分析该衍生物在脑(相对于其它器官)中的可检测性，并定义脑检测性的时间过程。将能够进行可靠检测的剂量定义为“成像有效剂量”。
对烷基、链烯基或炔基柯胺G衍生物区别AD与年龄相当的人对照者的评价
将成像有效剂量的适宜的放射性标记的柯胺G衍生物注射到疑患由于病症，如AD引起的脑组织淀粉样蛋白沉淀的被检测者中。经过15分钟至24小时，通过SPECT或PET检测脑组织的放射性信号。同时检测包括检测仪视野下的所有脑组织区域。建立视野以使其包括小脑的大部分区域、颞上皮层、上/中额皮层和间脑区。在研究前可进行MRI扫描以通过实施例3中讨论的方法校准在目的区域内脑萎缩产生的误差。计算实施例3中讨论的可变S/VA、S/VCB和比率A并将它们与之前由年龄相当的正常对照检测者获得的类似标准比率进行比较。
实施例6链烯基柯胺G衍生物与淀粉样蛋白结合的组织学定位
附图11上部的图示范了通过1，4-二(2-(3-羧基-4-羟基苯基)乙烯-1-基)-苯染色的人AD脑组织。该染色方法是Stokes和Trickey(J.Clin.Pathol.26：241-242(1973))用1，4-二(2-(3-羧基-4-羟基苯基)乙烯-1-基)-苯代替刚果红进行的染色方法。该方法着染的颜色较用柯胺G、刚果红或硫黄素S观察到的颜色浓厚得多。许多淀粉样蛋白斑和神经纤维网以及神经纤维缠结都很容易被识别。附图11底部的照片显示了用1，4-二(2-(3-羧基-4-羟基苯基)乙烯-1-基)-苯染色的转基因鼠脑组织的切片[Tg(HuAPP695.SWE)2576；Hsiao等，Science 274：99-102(1996)]。密集的淀粉样蛋白斑被强烈地染色。在人和小鼠脑组织中，脑血管淀粉样蛋白都被强烈地染了色(未显示数据)。
实施例7烷基、链烯基或炔基柯胺G衍生物的毒性评价
将剂量为10～100mg/kg的非放射性柯胺G对小鼠进行腹膜内给药，在72小时时间内未观察到明显的行为影响或毒性。[14C]柯胺G的施用剂量在1mg/kg数量级。
根据建立LD50的实验，柯胺G基本未显示出急性毒性。甚至当将不会由于注射液体积的影响而产生有害作用的可注射到小鼠的最大体积(约0.025ml/g)的饱和柯胺G溶液注射到小鼠(100mg/kg)中时，在72小时的最长试验期间也未观察到明显行为变化。通过SPECT或PET检测放射性标记的衍生物所需的剂量的数量级低于该剂量。
刚果红可以较放射性柯胺G衍生物大得多的剂量注射到人体中。刚果红显示的LD50为190mg/kg小鼠(Tubis等，J.Amer.Pharm.Assoc.49：422(1960))，该值与柯胺G显示的＞100mg/kg的LD50相当。因此，这两种化学类似物在小鼠中都产生类似的低毒性。
可将其它的烷基、链烯基或炔基柯胺G衍生物在小鼠和其它高等哺乳动物中通过较宽浓度范围的注射，通过本领域熟知的方法研究动物对各种毒性信号的反应，进行类似的毒性试验。参见，Goodman和Gilman的《治疗的药理学基础》(第7版)。
实施例8柯胺G防止Aβ(25-35)诱导的毒性的能力评价
防止Aβ(25-35)在PC-12细胞中诱导的毒性
使大鼠嗜铬细胞瘤细胞(PC-12)在加有10％胎牛血清的RPMI1640培养基中生长。将100μl培养基中的约5000指数生长细胞平铺在96孔培养板中，使其在37℃下过夜。在加入20μl以获得指定终浓度(0.01～10μM Aβ(25-35)和0.03～20μMCG)之前，将在37℃预聚集7天的Aβ(25-25)与柯胺G(CG)或相关化合物在水溶液中进行预培养。将细胞培养24小时后，加入13.3μl 5mg/ml MTT(3，(4，5-二甲基噻唑-2-基)2，5-二苯基溴化四唑鎓)的无菌磷酸盐缓冲盐水溶液。在37℃培养4.5小时后，加入100μl萃取缓冲液(20％w/v SDS在50％DMF/水中的溶液；用2.5％80％乙酸和2.5％1N HCl将其pH调至4.7)并将培养板培养过夜。Hansen等，J.Immunol.Methods 119：203(1989)。然后测定560nm的显色。将最大生存力定义为其中仅加入了20μl蒸馏的去离子水的对照孔的吸收。最大毒性由其中细胞通过加入0.1％(终浓度)Triton X-100溶解的孔来定义。
PC12细胞与Aβ(25-25)一起培养导致这些细胞还原MTT的能力呈浓度依赖性降低(附图12)。附图12显示了通过测定MTT的还原反应，在有或没有柯胺G的存在下，Aβ(25-25)浓度增高对PC12细胞的细胞还原氧化活性的影响。MTT的还原产物在560nm产生吸收，将该吸收作为纵轴作图。实心条棒显示了单独存在的Aβ(25-25)的影响，表明Aβ(25-25)对MTT还原程剂量依赖性降低。实心条棒内部的白色显示出与对照(无Aβ，无柯胺G)的明显差异。空心条棒显示了20μM柯胺G的防护作用。空心条棒内部的黑色显示出在有或没有柯胺G存在下的MTT还原反应间的明显差异。
附图13表明柯胺G浓度的增加对Aβ(25-25)诱导的PC12细胞的细胞还原氧化活性的还原作用的影响。实心条棒显示了在没有Aβ(25-25)存在下的柯胺G影响。对照(无Aβ、无柯胺G)与有任意浓度的柯胺G存在、但没有Aβ(25-25)存在的情况之间没有显著差异。空心条棒显示了在1μMAβ(25-25)存在下和柯胺G浓度增高下的MTT还原反应。实心条棒内部的白色显示了在有或没有Aβ(25-25)存在下的各浓度柯胺G下的MTT还原反应的显著差异。空心条棒内部的黑色显示了在Aβ(25-25)对照(无柯胺G)和Aβ(25-25)加浓度增高的柯胺G之间的MTT还原反应的显著差异。
先前已有报道，刚果红在2μM浓度下防止Aβ诱导的毒性，达20μM时才能产生完全防护作用。Burgevin等，NeuroReport 5：2429(1994)：Lorenzo和Yankner，Proc.Natl.Acad.Sci.91：12243(1994)；Pollack等，Neuroscience Letters 184：113(1995)；Pollack等，Neuroscience Letters 197：211(1995)。柯胺G显示的防护作用依赖于Aβ(25-25)的浓度(附图12)和柯胺G的浓度(附图13)。柯胺G在0.2μM浓度下产生防护作用，该浓度与柯胺G与合成Aβ结合的Ki，0.37μM(附图1)非常接近。柯胺G显示出比刚果红更有效，其产生作用的范围在0.1～1.0μM。这与柯胺G和合成Aβ结合的Ki值0.37μM和刚果红与合成Aβ的Ki值0.28μM相一致。
在另一个实验(附图14)中，在与1μMAβ(25-25)一起培养的细胞中测定了柯胺G和酚衍生物(参见附图1)的影响，后者不与Aβ结合。柯胺G在0.1和1μM下显示出防护作用，但酚衍生物不显示出防护作用，它或许还增高了Aβ的毒性。
这些结果表明刚果红、柯胺G的亲脂性衍生物在非常接近于与Aβ结合的浓度下可防止细胞培养物中Aβ诱导的细胞毒性。该防护作用显示了结构特异性，因为不与合成Aβ结合的酚衍生物也不能防止Aβ诱导的细胞毒性。由于柯胺G能很好地分配到脑组织中，这些结果为柯胺G和结合Aβ的柯胺G衍生物具有潜在AD治疗作用提供了根据。
柯胺G的防护作用的机理目前尚未清楚。存在两种可能性。一种是，柯胺G可能干扰Aβ的聚集。另一种是，柯胺G可能干扰靶细胞上Aβ的作用(直接或间接的)。刚果红确实抑制Aβ的聚集并且防止聚集Aβ的毒性作用。Lorenzo和Yankner，Proc.Natl.Acad.Sci.91：12243(1994)。在上面的实验中，未必是干扰聚集，因为在与柯胺G一起培养之前，Aβ已被预聚集。因此，对聚集的抑制可以证明是柯胺G的重要治疗作用，但不可能解释柯胺G对预聚集的Aβ的防护作用。附图7中描述的柯胺G与Aβ结合的模型显示了柯胺G是如何“包覆”Aβ表面的。这可能会改变人们关于如何通过细胞表面受体或其它大分子，例如补体蛋白产生纤维沉淀以及干扰由这些大分子介导的Aβ的毒性作用的认识。柯胺G和刚果红有可能在Aβ聚集之前和之后产生多种作用。从治疗学的观点看，这是非常有益的，因为患者可能出现在有Aβ聚集物预先存在时，也有可能出现在淀粉样蛋白沉淀继续时。

Claims (23)

1、一种可结合淀粉样蛋白的式I化合物或其水溶性无毒盐：
是C≡C，CR’＝CR’，CR’2-CR’2，C≡C-C≡C，CR’＝CR’-CR’＝CR’，C≡C-CR’＝CR’或CR’2-CR’2-CR’2-CR’2(其中各个R’独立地表示H或低级烷基)；
X是C(R”)2
(其中各个R”独立地是H，F，Cl，Br，I，低级烷基，(CH2)nOR’，其中n＝1，2或3，CF3，CH2-CH2F，O-CH2-CH2F，CH2-CH2-CH2F，O-CH2-CH2-CH2F，CN，(C＝O)-R’，N(R’)2，NO2，(C＝O)N(R’)2O(CO)R’，OR’，SR’，COOR’，Rph，CR’＝CR’-Rph，CR’2-CR’2-Rph(其中Rph表示未取代或取代的苯基，苯基的取代基可选自R”中定义的非苯基取代基，三-烷基锡，下式的四唑或噁二唑：
其中R’是H或低级烷基)
或者X是CR’＝CR’，N＝N，C＝O，O，NR’(其中R’表示H或低级烷基)，S或SO2；
R1和R2各自独立地是H、F、Cl、Br、I、低级烷基、(CH2)nOR’(其中n＝1，2或3)、CF3、CH2-CH2F、O-CH2-CH2F、CH2-CH2-CH2F、O-CH2-CH2-CH2F、CN、(C＝O)-R’、N(R’)2、NO2、(C＝O)N(R’)2O(CO)R’、OR’、SR’、COOR’、三-烷基锡，Rph、CR’＝CR’-Rph、CR’2-CR’2-Rph，其中Rph表示未取代或取代的苯基(苯基的取代基可选自R1和R2中定义的非苯基取代基)、下式的四唑或噁二唑：
(其中R’是H或低级烷基)、或下式的三氮烯：
Figure A9880631800033
(其中R8和R9是低级烷基)
或者
Figure A9880631800034
各个Q独立地选自下列的结构之一：
IA、IB、IC、ID、IE、IF和IG，其中
IA具有下列结构：
其中R3、R4、R5、R6或R7各自独立地是如上R1所定义的；
IB具有下列结构：
Figure A9880631800042
其中R10、R11、R12、R13、R14、R15或R16各自独立地是如上R1所定义的；
IC具有下列结构：
其中R17、R18、R19、R20或R21各自独立地是如上R1所定义的；
ID具有下列结构：其中R22、R23或R24各自独立地是如上R1所定义的；和
Figure A9880631800052
表示下式的六个杂环之一：IE具有下列结构：其中R25、R26或R27各自独立地是如上R1所定义的；表示下式的六个杂环之一：
Figure A9880631800062
IF具有下列结构：其中R28、R29、R30、R31或R32中之一是如上式I中所定义的连接
Figure A9880631800064
并且R28、R29、R30、R31或R32彼此独立地如上R1所定义；
IG具有下列结构：
其中R33、R34、R35、R36、R37、R38或R39中之一是如上式I中所定义的连接
并且R33、R34、R36、R36、R37R38或R39彼此独立地如上R1所定义。
2、权利要求1的化合物，其中取代基R1-R7和R10-R39中的至少一个选自131I，123I，76Br，76Br，75F，18F，CH2-CH2-18F，O-CH2-CH2-18F，CH2-CH2-CH2-18F，O-CH2-CH2-CH2-18F，19F，125I，和如式I中说明的含碳取代基，其中的至少一个碳是11C或13C。
3、权利要求1的化合物，其中通过与合成Aβ肽或阿尔茨海默氏症脑组织结合测定的该化合物与Aβ结合的离解常数(KD)为0.0001～10.0μM。
4、一种合成权利要求1的化合物的方法，式I中取代基R1-R7和R10-R39中的至少一个选自131I，125I，123I，76Br，75Br，18F和19F，该方法包括将权利要求1的化合物与含131I，125I，123I，76Br，75Br，18F和19F的卤化试剂反应的步骤，所述权利要求1的化合物中取代基R1-R7和R10-R39中的至少一个是三-烷基锡或三嗪。
5、一种用于体内成像淀粉样蛋白沉淀的药物组合物，该组合物包含(a)权利要求2的化合物，和(b)可药用载体。
6、一种在被测试者体内检测淀粉样蛋白沉淀的方法，该方法包括下述步骤：(a)使用可检测量的权利要求5的组合物，和(b)检测所述化合物与所述被测试者中淀粉样蛋白沉淀的结合。
7、权利要求6的方法，其中的淀粉样蛋白沉淀位于被测试者的脑组织。
8、权利要求6的方法，其中所述被检测者疑患有选自阿尔茨海默氏症、遗传性阿尔茨海默氏症、Down氏综合症和载脂蛋白E4等位基因同型接合者的疾病或综合症。
9、权利要求6的方法，所述检测选自γ成像、磁共振成像和磁共振分光光谱法。
10、权利要求9的方法，其中所述γ成像是PET或SPECT。
11、权利要求7的方法，其中所述药物组合物通过静脉注射给药。
12、权利要求7的方法，其中将所述被检测者的(i)所述化合物与除小脑外的脑组织的结合与(ii)所述化合物与小脑的结合的比率与正常被检测者的所述比率进行比较。
13、一种抑制与淀粉样变性相关性疾病中的纤维形成有关的细胞变性和毒性的方法，所述方法包括向患有或疑患这类疾病者施用药学有效量的柯胺G或其衍生物。
14、权利要求13的方法，其中所述的柯胺G衍生物是可与淀粉样蛋白结合的式I化合物或其水溶性无毒盐：
Figure A9880631800091
是C≡C，CR’＝CR’，CR’2-CR’2，C≡C-C≡C，CR’＝CR’-CR’＝CR’，C≡C-CR’＝CR’或CR’2-CR’2-CR’2-CR’2(其中各个R’独立地表示H或低级烷基)；
X是C(R”)2
(其中各个R”独立地是H，F，Cl，Br，I，低级烷基，(CH2)nOR’，其中n＝1，2或3，CF3，CH2-CH2F，O-CH2-CH2F，CH2-CH2-CH2F，O-CH2-CH2-CH2F，CN，(C＝O)-R’，N(R’)2，NO2，(C＝O)N(R’)2O(CO)R’，OR’，SR’，COOR’，Rph，CR’＝CR’-Rph，CR’2-CR’2-Rph(其中Rph表示未取代或取代的苯基，苯基的取代基可选自R”中定义的非苯基取代基，三-烷基锡，下式的四唑或噁二唑：
其中R’是H或低级烷基)
或者X是CR’＝CR’，N＝N，C＝O，O，NR’(其中R’表示H低级烷基)，S或SO2；
R1和R2各自独立地是H、F、Cl、Br、I、低级烷基、(CH2)nOR’，(其中n＝1，2或3)、CF3、CH2-CH2F、O-CH2-CH2F、CH2-CH2-CH2F、O-CH2-CH2-CH2F、CN、(C＝O)-R’、N(R’)2、NO2、(C＝O)N(R’)2O(CO)R’、OR’、SR’、COOR’、三-烷基锡，Rph、CR’＝CR’-Rph、CR’2-CR’2-Rph，其中Rph表示未取代或取代的苯基(苯基的取代基可选自R1和R2中定义的非苯基取代基)、下式的四唑或噁二唑：
Figure A9880631800101
其中R’是H或低级烷基、或下式的三氮烯：
Figure A9880631800102
(其中R8和R9是低级烷基)
或者
Figure A9880631800103
各个Q独立地选自下列的结构之一：
IA、IB、IC、ID、IE、IF和IG，其中
IA具有下列结构：
其中R3、R4、R5、R6或R7各自独立地是如上R1所定义的；
IB具有下列结构：
其中R10、R11、R12、R13、R14、R15或R16各自独立地是如上R1所定义的；
IC具有下列结构：
Figure A9880631800113
其中R17、R18、R19、R20或R21各自独立地是如上R1所定义的；
ID具有下列结构：
Figure A9880631800121
其中R22、R23或R24各自独立地是如上R1所定义的；和 表示下式的六个杂环之一：
Figure A9880631800123
IE具有下列结构：其中R25、R26或R27各自独立地是如上R1所定义的；和 表示下式的六个杂环之一：
Figure A9880631800132
IF具有下列结构：
Figure A9880631800133
其中R28、R29、R30、R31或R32中之一是如上式I中所定义的连接
Figure A9880631800134
并且R28、R29、R30、R31或R32彼此独立地如上R1所定义；
IG具有下列结构：
Figure A9880631800141
其中R33、R34、R35、R36、R37、R38或R39中之一是如上式I中所定义的连接
Figure A9880631800142
并且R33、R34、R35、R36、R37、R38或R39彼此独立地如上R1所定义。
15、权利要求13的方法，其中所述淀粉样变性适应症选自阿尔茨海默氏症、Down氏综合症和II型糖尿病、遗传性脑出血性淀粉样变性(荷兰人)、淀粉样蛋白A(反应性)、继发性淀粉样变性、家族性地中海热、伴随荨麻疹和聋哑的家族性淀粉性变性肾病(Muckle-wells综合症)、淀粉样蛋白λL-链或淀粉样蛋白κL-链(自发的、骨髓瘤或巨球蛋白血症相关的)Aβ2M(长期血液透析)、ATTR(家族性淀粉样蛋白多神经病)(葡萄牙人、日本人、瑞典人)、家族性淀粉样蛋白心肌病(丹麦人)、单独的心脏淀粉样蛋白(系统性老年淀粉样变性)、AIAPP或淀粉不溶素胰岛瘤、心钠素(单独的心房淀粉样变性)、procalcitonin(甲状腺髓瘤)，凝溶胶蛋白(家族性淀粉样变性(芬兰人))、cystatin C(伴随淀粉样变性的遗传性脑缺血(冰岛人))、AApo-A-I(家族性淀粉样变性多神经病(衣阿华州))、AApo-A-II(小鼠的加速敏感)、纤维蛋白原相关性淀粉样蛋白；和Asor或PrP-27(瘙痒病，Creutzfeld Jacob病，Gertsmann-Straussler-Scheinker综合症，牛海绵状脑炎)或载脂蛋白E4等位基因同型接合者，以及与载脂蛋白E4等位基因同型接合相关的适应症。
16、一种防止与淀粉样变性相关性适应症中的纤维形成有关的细胞变性和毒性的药物组合物，它含有权利要求1的柯胺G衍生物和可药用载体。
17、一种检测活组织检查或死后的人或动物组织中的淀粉样蛋白沉淀的方法，包括下述步骤：
(a)将用福尔马林固定的组织与权利要求1化合物的溶液一起培养生成标记的沉淀，然后
(b)检测标记的沉淀。
18、权利要求17的方法，其中所述溶液由用权利要求1的化合物饱和的25～100％乙醇(其余为水)组成。
19、权利要求17的方法，其中所述检测通过选自亮视野显微镜检查、荧光显微法、激光同焦点和交叉极化显微法的显微技术进行。
20、一种在活组织检查和死后组织分析中定量淀粉样蛋白的方法，该方法包括下列步骤：
a)将放射性标记的柯胺G衍生物与活组织检查或死后组织的匀浆一起培养，
b)将与组织结合了的放射性标记的柯胺G衍生物与未与组织结合的放射性标记的柯胺G衍生物分离，
c)定量与组织结合的放射性标记的柯胺G衍生物，和
d)通过与标准曲线进行比较，将与组织结合的放射性标记的柯胺G衍生物的单位转化为每100mg组织中的淀粉样蛋白的毫克单位。
21、权利要求20的方法，其中所述的放射性标记的柯胺G衍生物是可与淀粉样蛋白结合的式I化合物或其水溶性无毒盐：
Figure A9880631800161
是C≡C，CR’＝CR’，CR’2-CR’2，C≡C-C≡C，CR’＝CR’-CR’＝CR’，C≡C-CR’＝CR’或CR’2-CR’2-CR’2-CR’2(其中各个R’独立地表示H或低级烷基)；
X是C(R”)2
(其中各个R”独立地是H，F，Cl，Br，I，低级烷基，(CH2)nOR’，其中n＝1，2或3，CF3，CH2-CH2F，O-CH2-CH2F，CH2-CH2-CH2F，O-CH2-CH2-CH2F，CN，(C＝O)-R’，N(R’)2，NO2，(C＝O)N(R’)2O(CO)R’，OR’，SR’，COOR’，Rph，CR’＝CR’-Rph，CR’2-CR’2-Rph(其中Rph表示未取代或取代的苯基，苯基的取代基可选自R”中定义的非苯基取代基，三-烷基锡，下式的四唑或噁二唑：
其中R’是H或低级烷基)
或者X是CR’＝CR’，N＝N，C＝O，O，NR’(其中R’表示H低级烷基)，S或SO2；
R1和R2各自独立地是H、F、Cl、Br、I、低级烷基、(CH2)nOR’(其中n＝1，2或3)、CF3、CH2-CH2F、O-CH2-CH2F、CH2-CH2-CH2F、O-CH2-CH2-CH2F、CN、(C＝O)-R’、N(R’)2、NO2、(C＝O)N(R’)2O(CO)R’、OR’、SR’、COOR’、三-烷基锡、Rph、CR’＝CR’-Rph、CR’2-CR’2-Rph，其中Rph表示未取代或取代的苯基(苯基的取代基可选自R1和R2中定义的非苯基取代基)、下式的四唑或噁二唑：
Figure A9880631800171
其中R’是H或低级烷基、或下式的三氮烯：
Figure A9880631800172
(其中R8和R9是低级烷基)
或者
Figure A9880631800173
各个Q独立地选自下列的结构之一：
IA、IB、IC、ID、IE、IF和IG，其中
IA具有下列结构：
其中R3、R4、R5、R6或R7各自独立地是如上R1所定义的；
IB具有下列结构：
Figure A9880631800182
其中R10、R11、R12、R13、R14、R15或R16各自独立地是如上R1所定义的；
IC具有下列结构：
Figure A9880631800183
其中R17、R18、R19、R20或R21各自独立地是如上R1所定义的；
ID具有下列结构：其中R22、R23或R24各自独立地是如上R1所定义的；和 表示下式的六个杂环之一：
Figure A9880631800193
IE具有下列结构：
Figure A9880631800194
其中R25、R26或R27各自独立地是如上R1所定义的；和
Figure A9880631800201
表示下式的六个杂环之一：
Figure A9880631800202
IF具有下列结构：
Figure A9880631800203
其中R28、R29、R30、R31或R32中之一是如上式I中所定义的连接
并且R28、R29、R30、R31或R32彼此独立地如上R1所定义；
IG具有下列结构：
其中R33、R34、R35、R36、R37、R38或R39中之一是如上式I中所定义的连接
并且R33、R34、R35、R36、R37、R38或R39彼此独立地如上R1所定义。
22、权利要求21的方法，其中R1-R7和R10-R39中的至少一个是用选自125I、3H和在式I中说明的含碳取代基的放射性物标记的，所述含碳取代基中的至少一个碳是14C。
23、一种区别阿尔茨海默氏症脑组织与正常脑组织的方法，包括下列步骤：
a)从正常者和疑患阿尔茨海默氏症者的脑组织中获取(i)小脑组织和(ii)同一大脑的除小脑外的另一区域的组织；
b)将所述组织与放射性标记的柯胺G衍生物一起培养，以使所述组织与所述放射性标记的柯胺G衍生物结合；
c)根据权利要求20的方法，定量与放射性标记的柯胺G衍生物结合的淀粉样蛋白的量；
d)计算非小脑的脑组织区域中淀粉样蛋白的量与小脑中淀粉样蛋白的量的比率；
e)比较正常者的所述组织中淀粉样蛋白的量的比率与疑患阿尔茨海默氏症者的组织中淀粉样蛋白的量的比率；
f)如果疑患阿尔茨海默氏症者脑组织的所述比率高于正常者脑组织得到的比率的90％，则确诊为阿尔茨海默氏症。
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