KR20010006552A - 알츠하이머병의 사전 진단과 아밀로이드 침적의 생체내 조영과 예방을 위한 알킬, 알케닐 및 알키닐 크리사민 ｇ 유도체 - Google Patents

알츠하이머병의 사전 진단과 아밀로이드 침적의 생체내 조영과 예방을 위한 알킬, 알케닐 및 알키닐 크리사민 ｇ 유도체 Download PDF

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마티스케스터에이.
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제롬 코란츠
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Abstract

본 발명은 크리사민 G의 비-아조 유도체인 아밀로이드 결합 화합물, 이를 포함한 약제 조성물, 및 이와 같은 화합물을 사용하여 생체내에서 알츠하이머 뇌를 확인하고, 다운증후군과 같은 아밀로이드에 의해 특성화된 병리학적 증상을 진단하기 위한 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 크리사민 G의 비-아조 유도체를 포함하는 제약학적 조성물과, 이런 화합물을 이용하여 아밀로이도시스 관련된 증상에서 세포 변성과 아밀로이드-유도된 독성을 방지하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 비-아조 크리사민 G 유도체를 사용하여 생체 검사 또는 검시 조직에서 아밀로이드 침적을 착색하거나 검출하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 비-아조 크리사민 G 유도체를 사용하여 생체 검사 및 검시 조직의 균질체에서 아밀로이드 침적을 정량하는 방법에 관한 것이다.

Description

알츠하이머병의 사전 진단과 아밀로이드 침적의 생체내 조영과 예방을 위한 알킬, 알케닐 및 알키닐 크리사민 Ｇ 유도체{Alkyl, alkenyl and alkynyl chrysamine Ｇ derivatives for the antemortem diagnosis of Alzheimer's disease and in vivo imaging and prevention of amyloid deposition}
본 발명은 살아있는 환자들의 생체내 아밀로이드 침적 조영에 적합한 화합물의 식별과 관련된 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 알츠하이머병의 임종 전 증상을 알 수 있는 살아있는 두뇌내의 아밀로이드 침적을 조영하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그러한 화합물들을 치료적 용도로 사용하는 것에 관한 것이다.
알츠하이머병(AD)은 기억력 감소와 그 외의 인식 부족 등의 특징을 나타나는 신경쇠퇴성 병이다(McKhann et al., Neurology 34: 939(1984)). 이 병이 미국에서 치매의 가장 중요한 원인이다. AD는 40-50살의 젊은 사람들도 걸릴 수 있는 병이다. 그러나, 위험한 뇌 생체검사 없이는 발병을 쉽게 감지할 수 없으므로 병의 시작시기는 불분명하다. AD의 발병은 나이에 따라 증가하여, 85-90세의 나이가 되면 인구 중 많게는 40-50%의 사람들이 이 병에 걸리게 된다(Evans et al., JAMA 262:2551(1989); Katzman, Neurology 43:13(1993)).
정의에 의하면, AD는 뇌조직의 검사를 통해서, 일반적으로 부검을 통해서 명백하게 진단된다(Khachaturian, Arch. Neurol. 42: 1097(1985); McKhann et al., Neurology 34: 939(1984)). 신경병리학적으로, 이 병은 다른 다양한 증상과 더불어 신경염반점(neuritic plaques, NP), 신경원섬유엉킴(neurofibrillary tangles, NFT) 및 신경손실(neuronal loss) 등을 나타낸다(Mann, Mech. Ageing Dev. 31:213(1985)). 알츠하이머병으로 죽은 시체의 뇌조직에서는 AD의 특징인 신경염반점(neuritic plaques, NP)의 단백질을 함유한 세포외 중심 형태의 아밀로이드가 나타난다.
이러한 신경반점들의 아밀로이드 중심은 두드러지게 β 모양으로 주름진 종이 배치인 β-아밀로이드라 불리는 단백질로 구성된다(Mori et al., Journal of Biological Chemistry 267:17082(1992); Kirschner et al., PNAS 83: 503(1986)). 신경반점은 병의 초기에는 항상 나타난다(Mann et al., J. Neurol. Sci. 89: 169; Mann, Mech. Ageing Dev. 31:213(1985); Terry et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol 46: 262(1987)).
Aβ의 초기 침적은 임상증상이 눈에 띄기 오래 전부터 발생한다. 최근에 추천되는 AD 증상에 대한 "최소 현미경적 판단기준"은 뇌에서 발견되는 신경반점의 수가 그 기준이다(Khachaturian, Arch. Neurol., supra(1985)). 불행히도, 신경반점 수의 측정은 사망 후까지 미루어져야 한다.
아밀로이드-함유 신경반점은 다운증후군과 AD가 잘 발생할 것 같은 아포리포단백질 E4 대립형질이 동형접합체인 사람들뿐만 아니라 AD의 뇌의 선택된 영역에서도 두드러진다(Corder et al., Science 261:921(1993); Divry, P., J. Neurol. Psych. 27:643-657(1927); Wisniewski et al., in Zimmerman, H. M. (ed.): 신경병리학의 진행(PROGRESS IN NEUROPATHOLOGY), (Grune and Stratton, N. Y. 1973) pp. 1-26). 뇌 아밀로이드는 티오플라빈 S 또는 콩고 레드로 뇌 영역을 착색하여 쉽게 표시할 수 있다(Puchtler et al., J. Histochem. Cytochem. 10:35(1962)). 콩고 레드로 착색된 아밀로이드는 황녹색 편광색의 이색적인 색깔로 특징지어진다. 이색결합은 아밀로이드 단백질의 β 모양으로 주름진 종이 구조의 결과이다(Glenner, G. N. Eng. J. Med. 302:1283(1980)). 아밀로이드의 생화학과 역사화학에 관한 상세한 토의는 Glenner, N. Eng. J. Med., 302:1333(1980)에서 찾을 수 있다.
또한 더 나아가, AD의 증상은 거의 대부분 임상판단기준평가, 뇌 생체검사 및 검시를 통해 이루어졌다. 알츠하이머병의 생체내의 증상을 진단하기 위한 방법을 발전시키기 위한 연구 조사는 (1) 유전자 테스트, (2) 면역 분석법 및 (3) 조영술을 포함한다.
Aβ 물질대사에 있어서 비정상은 AD의 발현에 필요하고 충분한 증거로 AD의 우성 상염색체의 형태를 갖는 몇몇 희귀한 종의 Aβ 전구 단백질에서의 포인트 변형의 발견에 기초한다(Hardy, Nature Genetics 1: 233(1992); Hardy et al., Science 256: 184(1992)). 이러한 변형들은 그것의 전구 단백질로부터 Aβ의 발생에 충분한 N- 과 C-끝 갈라진 곳 근처에서 발생한다(St. George-Hyslop et al., Science 235: 885(1987); Kang et al., Nature 325: 733(1987); Potter WO 92/17152). 하지만, 다수의 AD군들의 유전적 분석을 통해 AD가 유전적으로 이종이라는 것을 입증하였다(St. George-Hyslop et al., Nature 347: 194(1990)). 크로모좀 21 마커들(markers)에 대한 연관은 단지 초기단계 AD의 몇몇 군에서 나타나며, 후기단계 AD의 어느 군에서도 그러한 연관은 나타나지 않는다. 더욱 최근에는 다중 교차세포막 도메인을 함유하고 복합적 세포막 단백질을 닮은 것으로 예측되는 것을 생성하는 크로모좀 14의 유전자가 Sherrington et al., Nature 375: 754-760(1995)에 확인되어 있다. 이 유전자가 AD 우성 상염색체 초기 발병의 70%까지 원인이 될 수 있다. 초기 데이터는 이 크로모좀 14 변형은 Aβ의 생성을 증가시키는 원인이 된다고 제시하고 있다(Scheuner et al., Soc. Neurosci. Abstr. 21: 1500(1995)). 아주 유사한 유전자에서의 변형이 초기 단계 AD와 동족인 볼가 저먼(Volga German)의 크로모좀 1에서 확인되었다(Levy-Lahad et al., Science 269: 973-977(1995)).
AD의 진단을 돕기 위해서 아포리포 단백질 E 유전자형에 대한 스크리닝(screening)이 제안되었다(Scott, Nature 366: 502(1993); Roses, Ann. Neurol. 38: 6-14(1995)). 하지만 이 기술에서 문제점들이 발생하는데, 아포리포 단백질 E4 대립형질은 단지 AD의 위험인자이지 병 마커가 아니기 때문이다. 이것은 많은 AD 환자들에게 결여되어 있고 많은 미치지 않은 나이 든 사람들에게 존재한다(Bird, Ann. Neurol. 38: 2-4(1995)).
면역분석법들은 AD 환자들에 있어서 신경화학적 마커의 존재를 감지하고 뇌척수액내의 AD 관련 아밀로이드 단백질을 감지하기 위해 발달해왔다(Warner, Anal. Chem. 59: 1203A(1987)); Potter의 국제 특허 제 92/17152 호; Glenner et al.의 미국 특허 제 4,666,829호). AD을 진단하기 위한 이런 방법들은 모든 환자들, 특히나 병의 초기 단계의 환자들, 에 있어서의 AD를 감지한다고 입증되지는 않았고 비교적 침해적이며 척추탭(spinal tab)이 필요하다. 또한, Aβ의 조영을 위한 탐침으로써 모노클론 항체를 발견하려는 시도가 행해져 왔다.(Majocha et al., J. Nucl. Med., 33:2184(1992); Majocha et al, WO 89/06242 및 Majocha et al, 미국 특허 제 5,231,000호). 항체 탐침의 주요 단점은 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier)을 넘어 이런 거대 분자들을 얻기 어렵다는 것이다. AD의 생체 내 진단용 항체를 사용하는 것은 뇌로의 접근을 위해서 혈액-뇌 장벽의 두드러진 비정상적인 것을 요구한다. 혈액-뇌 장벽의 비정상적인 것이 확실히 AD에 존재하는 지에 대해 믿을만한 기능적 증거가 없다(Kalaria, Cerebrovascular ＆ Brain Metabolism Reviews 4: 226(1992)).
Aβ 항체들 또한, 그들이 전형적으로 신경염반점뿐만 아니라 비-β쉬트(non-β-sheet)(non-fibrillar) Aβ를 함유하는 Aβ의 침적을 더럽히기 때문에 AD 진단법의 사용에 불리하다(Yamaguchi et al., Acta Neuropathol., 77: 314(1989)). 이러한 침적들은 떨어진 병변의 일종으로 AD의 치매진행 과정에 항상 관여하는 것은 아니다. 후자가 인식정상조절과 나이든 개들의 비원섬유 아밀로이드 침적의 발견을 통해 제시되고 있다(Moran et al., Medicina Clinica 98: 19(1992); Shimada et al., Journal of Veterinary Medical Science 54: 137(1992); Ishihara et al., Brain Res. 548: 196(1992); Giaccone et al., Neurosci. Lett. 114: 178(1990)). 비록 비원섬유 아밀로이드 침적이 신경염반점의 전구체라 하여도, AD의 주요 병리 현상은 양성 비원섬유 아밀로이드 침적의 쇠퇴로 신경반점으로 변하는 과정일 것이다. 그러므로, 비원섬유 아밀로이드 침적 또한 식별할 수 있는 항체보다 AD 이상생리학에 더욱 특정한 마커로써 원섬유 Aβ 침적 및 NFT에 특정한 탐침이 필요하다.
최근에, 방사성 동위 원소로 표시한 Aβ 펩티드를 사용해 AD 뇌부분에서의 콤팩트와 신경성 타입 반점이 확산되는 것을 감지하고 있다(Maggio et al., WO 93/04194). 하지만, 이러한 펩티드들은 항체들의 모든 불리한 점을 공유한다. 구체적으로, 펩티드들은 조영하기에 충분할 정도의 양만큼 혈액-뇌 장벽을 정상적으로 교차할 수 없다.
비뇌 유조직의 생체 내 아밀로이도시스(amyloidosis)를 진단하기 위해 콩고 레드가 사용될 수 있다. 하지만, 콩고 레드는 투여된 요오드화 콩고 레드의 0.03% 만이 뇌유조직에 들어갈 수 있기 때문에 뇌의 Aβ 침적의 생체내 진단에 적합하지 않다(Tubis et al., J. Amer. Pharm. Assn. 49: 422(1960)). 벤조 오렌지 R과 디렉트 블루 4 같은 콩고 레드와 관계가 있는 요오드의 방사성 동위 원소의 비스디아조벤지다인 화합물들은 환자 기관 내의 아밀로이드 침적의 생체 외 및 내의 존재 및 위치 탐지에 유용하다고 제안되어 왔다(Quay et al., 미국 특허 제 5,039,511 및 4,933,156호). 하지만, 콩고 레드와 같이, Quay에 위해 제안된 모든 다른 화합물들은 강한 산성인 술폰산기를 가지고 있어서 이러한 화합물들의 뇌로의 침투가 극도로 제한되어 조영 유효량 또는 뇌유조직내의 감지량을 달성하기 힘들다.
사망 후까지 AD의 아밀로이드 침적을 측정할 수 없었기에 이 지독한 병에 대한 연구가 진행되기 힘들었다. 사망 전 아미로이드 침적양을 측정하는 방법이 Aβ 침적을 막기 위한 치료의 효율성 측정 및 가벼운 또는 임상적으로 혼란스러운 경우에 대한 진단도구로써 필요하다. 그러므로, 생체 내 뇌유조직 속의 아밀로이드 조영에 의한 사망 전 AD 진단용의 안전하고 특정한 방법의 개발이 아주 중요하다. 비록 최근에 생체 내 AD를 진단하기 위한 다양한 시도가 행해졌지만, 사망 전 뇌 아밀로이드 탐침은 없다. 낮은 독성을 갖고, 혈액-뇌 장벽을 교차할 수 있고, 환자의 사망 전에 뇌내의 AD 아밀로이드 침적을 측정하기 위해 정상 뇌 보다 AD 뇌에 더 효율적으로 결합할 수 있는 고친화 탐침을 이용한 방법은 없었다. 또한, 이런 기준을 충족하는 AD 진단용 생체 내 방법은 입증되지 않고 있다.
가장 최근 데이터는 아미로이드-결합 화합물은 AD와 유형 2의 진성 당뇨병(type 2 diabetes mellitus)을 치료할 수 잇는 잠재성이 있음을 제시한다. 상기에서 언급했듯이, AD 뇌에는 광범위하게 확산(diffuse) 및 신경염(neuritic, 고전적) 2종류의 반점이 있다. 확산반점은 반응 애스트로사이트(reactive astrocyte), 영양실조 마이크로글리아 세포(dystrophic neurites, microglia cell), 시냅스 손실 및 신경염 반점에서 발견되는 모든 보충 활동을 유도하기 위해 나타나지 않는다(Joachim et al., Am. J. Pathol. 135: 309(1989); Masliah et al., loc. cit. 137:1293(1990); Lue and Rogers, Domentia 3: 308(1992)). 이런 모든 형태학적 반응들은 신경독성 및 세포 쇠퇴 과정들이 신경염반점의 원섬유 Aβ 침적에 근접한 곳에서 발생하고 있음을 나타낸다. Aβ-유도 신경 독성 및 세포 쇠퇴는 생체 외 여러 세포 종류에서 보고되고 있다(Yankner et al., Science 250: 279(1990); Roher et al., BBRC 174: 572(1991); Shearman et al., loc. cit. 91: 1470(1994)). Aβ 펩티드의 응집이 생체외 신경독성을 위해서는 필요하다(Yankner, Neurobiol. Aging 13: 615(1992)). 확산 반점과 신경염 반점내의 Aβ의 집합 상태의 차이들은 확산 반점을 둘러싼 신경 독성 반응의 결핍을 설명한다(Lorenzo and Yankner, Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 12243(1994)). 최근에, 3개의 실험실에서 콩고 레드가 생체 외 Aβ-유도 신경독성과 세포 쇠퇴를 방해한다는 결과를 보고하였다(Burgevin et al., NeuroReport 5: 2429(1994); Lorenzo and Yankner, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 12243(1994); Pollack et al., Neuroscience Letters 184: 113(1995); Pollack et al., Neuroscience Letters 197: 211(1995)). 메카니즘은 원섬유 생성의 제지와 형성된 원섬유의 신경독성 특성의 방해에 동시에 관여하는 것으로 나타난다(Lorenzo and Yankner, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:12243(1994)). 콩고 레드는 또한 아밀린에 의해 야기된 독성으로부터 판크레틱 섬 세포(pancreatic islet cells)를 보호하고 있다(Lorenzo and Yankner, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:12243(1994)). 아밀린은 Aβ와 유사한 원섬유 펩티드로 유형 2 진성 당뇨병의 췌장에 축적된다.
이 분야에서 어떤 아조 염료는 발암성이 있다고 알려져 있다(Morgan et al. 환경건강관점(Environmental Health Perspectives), 102(supp.) 2: 63-78, (1994)). 이런 잠재적 발암성은 아조 염료들이 심하게 물질대사화해 장내 박테리아에 의해 자유 모 아민(free parent amine)으로 변한다는 사실에 널리 기초하여 나타난다(Cerniglia et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 107: 1224-1229, (1982)). 벤지다인 염료의 경우는(그리고 많은 다른 치환된 벤지다인들), 발암물질은 자유 아민이다. 이러한 사실들은 극도로 작은 양의 고 특정 활성 방사성 동위 원소 표식 착색은 직접적으로 혈액내에 주입되는 아밀로이드 조영 연구와 거의 관계가 없음을 나타낸다. 이런 경우, 투여양은 아주 작을 것이며 염료는 장내 박테리아를 지나칠 것이다.
치료적 용도에 있어서, 이러한 사실들은 아주 중요하다. 치료 화합물로부터 알려진 발암성 물질이 방출되는 것은 허용되지 않는다. 디아조 염료 물질대사의 두 번째 문제는 많은 투여된 약이 흡수 전에 장내 박테리아에 의해 물질대사하여 변한다는 것이다. 이 낮아진 생체 이용율은 방출된 대사산물이 무독하더라도 단점이 된다.
또한, 콩고 레드와 유사하지만 뇌에 들어가는(콩고 레드는 뇌에 들어가지 않는다) 아밀로이드 결합 화합물이 필요하다. 그러한 화합물들은 원섬유 생성과 관계된 세포 쇠퇴의 예방에 사용되어 AD와 다운증후군 같은 아밀로이드 관련 질병의 병리적 조건을 치료하며 유형 2 진성 당뇨병내의 판크레틱 섬 세포 독성의 치료에 쓰일 수 있다.
나아가 비독성이고 생체 이용 가능하여 결과적으로 치료요법으로 쓰일 수 있는 아밀로이드 결합 화합물들이 필요하다.
발명의 요약
따라서 본 발명의 목적은 뇌유조직 내의 아밀로이드를 생체 내 조영함으로써 사망 전 AD를 진단하기 위한 안전하고 특정한 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 낮은 독성을 갖고, 혈액-뇌 장벽을 교차할 수 있으며 AD 뇌와 정상 뇌를 구별할 수 있는 아밀로이드용 고친화성 탐침을 사용함으로써 환자의 사망 전 뇌내의 AD 아밀로이드 침적을 확인하기 위한 접근법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 침적 또는 Aβ의 독성을 막을 수 있는 AD 치료법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 생체검사 또는 검시 견본의 아밀로이드 침적을 착색하고 찾아내기 위한 기술을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 생체 검사 또는 검시 견본의 균질체(homogenates) 내의 아밀로이드 침적을 정량하는 방법을 제공하는 것이다.
이러한 목적들을 달성하기 위해, 본 발명의 한 측면에 의하면, 하기 일반식(I)의 아밀로이드 결합 화합물 또는 그것의 수용성, 비독성 염이 제공된다.
(I)
상기 식 중,
는 C≡C, CR´=CR´, CR´2-CR´2, C≡C-C≡C, CR´=CR´-CR´=CR´, C≡C-CR´=CR´ 또는 CR´2-CR´2-CR´2-CR2´(식 중, R´은 각각 독립적으로 H 또는 저가 알킬기이다)이며,
X는 C(R″)2(식 중, R″은 각각 독립적으로 수소, 불소, 염소, 브롬, 요오드, 저가 알킬기, n=1~3의 정수인 (CH2)nOR´, CF3, CH2-CH2F, O-CH2-CH2F, CH2-CH2-CH2F, O-CH2-CH2-CH2F, CN, (C=O)-R´, N(R´)2, NO2, (C=O)N(R´)2O(CO)R´, OR´, SR´, COOR´, RPh, CR´=CR´-RPh, CR´2-CR´2-RPh(식 중, RPh는 R″으로 정의된 비페닐 치환체, 트리-알킬 주석, 테트라졸 또는 하기 일반식(II)을 갖는 옥사디아졸에서 선택된 페닐 치환체를 갖는 페닐기로 치환된거나 치환되지 않은 것을 나타낸다.)이거나 X는 CR´=CR´, N=N, C=O, O, NR´(식 중, R´은 H 또는 저가 알킬기이다), S 또는 SO2이며,
(II)
상기 식 중, R´은 H 또는 저가 알킬기이다.
R1및 R2는 각각 독립적으로 수소, 불소, 염소, 브롬, 요오드, 저가 알킬기, n=1~3의 정수인 (CH2)nOR´, CF3, CH2-CH2F, O-CH2-CH2F, CH2-CH2-CH2F, O-CH2-CH2-CH2F, CN, (C=O)-R´, N(R´)2, NO2, (C=O)N(R´)2O(CO)R´, OR´, SR´, COOR´, 트리알킬틴, RPh, CR´=CR´-RPh, CR´2-CR´2-RPh(식 중, RPh는 R1또는 R2로 정의된 비페닐 치환체, 트리-알킬 주석, 테트라졸 또는 하기 일반식(II)을 갖는 옥사디아졸에서 선택된 페닐 치환체를 갖는 페닐기로 치화된거나 치환되지 않은 것을 나타낸다.)이거나 또는 하기 일반식(III)의 트리아젠이거나 또는 하기 일반식(IV)이다.
(II)
상기 식 중, R´은 H 또는 저가 알킬기이다.
(III)
상기 식 중, R8및 R9는 저가 알킬기이다.
(IV)
Q는 각각 독립적으로 하기 구조식 IA, IB, IC, ID, IE, IF 및 IG 중에서 선택된 1종이다.
(IA)
상기 식 중, R3, R4, R5, R6또는 R7은 각각 독립적으로 상기 R1에서 정의한 바와 같다.
(IB)
상기 식 중, R10, R11, R12, R13, R14, R15또는 R16은 각각 독립적으로 상기 R1에서 정의한 바와 같다.
(IC)
상기 식 중, R17, R18, R19, R20또는 R21은 각각 독립적으로 상기 R1에서 정의한 바와 같다.
(ID)
상기 식 중, R22, R23또는 R24는 각각 독립적으로 상기 R1에서 정의한 바와 같으며,
는 하기 6개의 일반식(V) 중 1종의 헤테로 고리를 나타낸다.
(IE)
상기 식 중, R25, R26또는 R27은 각각 독립적으로 상기 R1에서 정의한 바와 같으며,
는 하기 6개의 일반식(V) 중 1종의 헤테로 고리를 나타낸다.
(IF)
상기 식 중, R28, R29, R30, R31또는 R32중 정확하게 하나는 상기 일반식(I)에 정의된이고, 그외 R28, R29, R30, R31또는 R32는 각각 독립적으로 상기 R1에서 정의한 바와 같다.
(IG)
상기 식 중, R33, R34, R35, R36,R37, R38또는 R39중 정확하게 하나는 상기 일반식(I)에 정의된이고, 그 외 R33, R34, R35, R36, R37, R38또는 R39는 각각 독립적으로 상기 R1에서 정의한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 목적은 치환체인 R1-R7과 R10-R35의 적어도 하나가131I,123I,76Br,75Br,18F,19F,125I, CH2-CH2-18F, O-CH2-CH2-18F, CH2-CH2-CH2-18F, O-CH2-CH2-CH2-18F 및 식 중 적어도 하나의 탄소가11C 또는13C인 탄소인 일반식(I)에 정의된 것과 같은 탄소-함유 치환체로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 상기에서 정의한 일반식(I)의 아밀로이드 결합 화합물 또는 그것의 수용성, 비독성 염을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 화합물이 합성 Aβ 펩티드 또는 알츠하이머병 뇌조직에 대한 결합으로 측정했을 때 해리상수(KD)가 0.0001~10.0μM인 Aβ에 결합되어 있는 상기에서 정의한 일반식(I)의 아밀로이드 결합 화합물 또는 그것의 수용성, 비독성 염을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 치환체인 R1-R7과 R10-R35의 적어도 하나가131I,123I,76Br,75Br,18F 및19F로 이루어진 군으로부터 선택된 상기에서 정의한 일반식(I)의 아밀로이드 결합 화합물 또는 그것의 수용성, 비독성 염을 합성하는 방법을 제공하는 것으로 치환체인 R1-R7과 R10-R35의 적어도 하나가 트리알킬인 상기에서 정의한 일반식(I)의 아밀로이드 결합 화합물 또는 그것의 수용성, 비독성 염과131I,123I,76Br,75Br,18F 또는19F를 함유하는 할로겐화제를 반응시키는 단계로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 목적은 아밀로이드 침적의 생체 내 조영용 약제 조성물로, (a) 치환체인 R1-R7과 R10-R35의 적어도 하나가131I,123I,76Br,75Br,18F,19F 및 식 중 적어도 하나의 탄소가11C 또는13C인 탄소인 일반식(I)에 정의된 것과 같은 탄소-함유 치환체로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 상기에서 정의한 일반식(I)의 아밀로이드 결합 화합물 또는 그것의 수용성, 비독성 염과 (b) 약학적으로 허용가능한 담체로 이루어진다.
하지만 본 발명의 또 다른 목적은 환자의 아밀로이드 침적을 검출하는 생체내 방법으로 (a) 상기 약제 조성물을 감지할 수 있는 양만큼 투여하는 단계, 및 (b) 상기 환자의 아밀로이드 침적과 화합물의 결합을 탐지하는 단계로 이루어진다. 환자의 뇌내에 아밀로이드 침적이 있는 환자의 아밀로이드 침적을 탐지하는 생체 내 방법을 제공하는 것 또한 본 발명의 목적이다. 본 발명의 이 방법은 아밀로이도시스 관련 질병 또는 알츠하이머병, 다운증후군 및 아포리포 단백질 E4 대립형질에 대한 동형 접합체로 이루어진 그룹에서 선택된 증상을 갖고 있다고 의심되는 환자들에게 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 AD와 유형 2의 진성 당뇨병 같은 아밀로이도시스 관련 상태의 원섬유 생성과 관련된 세포 변형 및 독성을 막을 수 있는 약제 조성물 및 방법에 관한 것이다. 그러한 약제 조성물은 크리사민 G의 알킬, 알케닐 및 알키닐 유도체 및 약학적으로 허용가능한 담체로 이루어진다. 그런 화합물은 비독성이어야 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 시각화한 생체검사 또는 검시 표본의 아밀로이드 침적 탐지를 위한 착색으로써 탐침의 사용에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 생체검사 또는 검시 표본의 아밀로이드 침적량을 정량하기 위해 방사성 동위 원소가 부착된 탐침을 사용하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 알츠하이머병에 걸린 뇌와 정상뇌를 구별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 목적, 특성 및 이점은 하기 상세한 설명을 통해 명백해질 것이다. 하지만, 상세한 설명과 구체적인 예가 본 발명의 바람직한 구현이긴 하지만이 분야에서 통상의 기술을 지닌 사람들은 본 발명의 취지와 범위 내에서 다양하게 변형할 수 있으므로 단지 실례로서만 이해되어야 한다.
본 발명은 국립 노화 기구의 허가번호 AG-05443, AG-05133 및 AG-08974 기금을 사용하여 이루어졌다. 이것은 1994년 7월 29일자로 출원된 미국특허출원 08/282,289호의 연속분할출원인 1995년 5월 1일자로 출원된 미국특허출원 08/432,019호의 연속분할출원인 동일자로 함께 출원된 미국 특허출원 제 08/640,740 및 PCT/US96/05918호의 연속분할출원이다.
도 1A는 합성되고 시험되는 크리사민 G와 여러개의 크리사민 G 동족체 또는 유사체의 화학적 구조를 나타낸 것이고, 구체적으로 3-아이오도 유도체(3-ICG), 3-아이오도 디메톡시 유도체(3-ICG(OMe)2), 디메틸 에스테르 유도체(CG(COOMe)2), 페놀 유도체, 살리실리산(SA), 아닐린 유도체(1/2CG), 콩고 레드, 3,3'-디아이오도 유도체(3,3'-I2CG), 3,3'-디브로머 유도체(3,3'-BR2CG), 3,3-디클로로 유도체(3,3'-Cl2CG), 3-브로모 유도체(3-BrCG), 및 5-플루오로살리실산 유도체((5-FSA)CG)를 포함한다. 도면에서 숫자는 합성 펩티드 Aβ(10-43)에 [14C]크리사민 G 결합을 억제하기 위한 각각의 화합물의 Ki(μM중)와 관련된다.
도 1B는 합성되고 시험되는 여러개의 크리사민 G 동족체 또는 유사체의 화학적 구조를 나타낸 것이고, 구체적으로 3,3'-디카르복실산 유도체(3,3'-(COOH)2CG), 크리사민 G의 2,2'-디설폰산 유도체(2,2'-(SO3)2CG), 3-브로머,3-이소프로필살리실산 유도체(3-Br-(3-iPrSA)CG), 3-이소프로필살리실산 유도체((3-iPrSA)CG), 2,4-디페놀 유도체(2,4-디페놀), γ-레조르실산 유도체((6-OHSA)CG), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 유도체(3,3',5,5'-(CH3)4CG), 3,3'-디메틸 유도체(2,2'-(CH3)2CG), 벤지속살졸 유도체(CG Benzisoazole) 및 3-카르복시 알킨 유도체(3-(COOH)-C3C)를 포함한다. 도면에서 숫자는 합성 펩티드 Aβ(10-43)에 [14C]크리사민 G 결합을 억제하기 위한 각각의 화합물의 Ki(μM중)와 관련된다.
도 2A 내지 2K는 크리사민 G의 알케닐 유도체와 크리사민 G 동족체, 특히 헤테로고리 동족체의 알케닐 트리-알킬 주석 유도체의 화학적 구조를 나타낸다. 이들 구조는 트리-알킬 주석 부분이 비페닐기의 한쪽면에만 있는 것을 제외하고는 상부 오른쪽의 파선을 대칭으로 돌린 ½분자로 나타냈다. 트리-알킬 주석 유도체는 안정한 중간체이고, 할로겐화된 방사성 유도체의 제조에 직접적인 전구체이다. 헤테로고리 동족체는 크리사민 G의 중간정도의 산성인 카르복실기와 동일한 구조에서 약 산성 부분을 위치시키는 선택적인 의미를 나타낸다. 이들 트리-알킬 주석 전구체 화합물은 이들의 프로톤화 형태로 나타냈지만, 당업자들은 이들의 탈프로톤화된 형태와 호변이 형태도 포함한다는 것을 인식할 것이다.
2A) 크리사민 G의 알케닐 유도체
2B) 크리사민 G의 알케닐 트리-알킬 주석 유도체
2C) 3-하이드록시-1,2-벤지속사졸 동족체의 알케닐 트리-알킬 주석 유도체
2D) 프탈이미드 또는 이소인돌-1,3(2H)-디온 동족체의 알케닐 트리-알킬 주석 유도체
2E) 프탈히드라진 또는 2,3-벤조디아진-1,4(2H, 3H)-디온 동족체
2F) 2,3-벤족사진-1,4(3H)-디온 동족체의 알케닐 트리-알킬 주석 유도체
2G) (2H)1,3-벤족사진-2,4(3H)-디온 동족체의 알케닐 트리-알킬 주석 유도체
2H) (3H)2-벤자진-1,3(2H)-디온 동족체의 알케닐 트리-알킬 주석 유도체
2I) 1,8-나프탈리미드 동족체의 알케닐 트리-알킬 주석 유도체
2K) 옥사디아졸 동족체의 알케닐 트리-알킬 주석 유도체.
도 3은 크리사민 G의 여러가지 구조 동족체에 의한 Aβ(10-43)에 결합하는 [14C]크리사민 G의 이동 곡선이다. 약어는 도 1에서 사용된 것을 참고한다. 도 3A) 크리사민 G(오픈 삼각형); (5-FSA)CG(채워진 다이아몬드); 2,2'-(SO3)2CG(채워진 원). 도 3B) 크리사민 G(오픈 삼각형); 콩고 레드(오픈 원); 아닐린 유도체(오픈 역삼각형); 페놀 유도체(오픈 사각형); 살리실산(X's). 고농도에서 증가된 결합을 나타낸 커브는 미쉘 형성 때문이다. Bedaux, F. et al., Pharm. Weekblad 98 : 189(1963).
도 4A는 Aβ(10-43)에 결합하는 크리사민 G의 스캐챠드 플롯이다. 곡선은 두개의 독립적으로 결합 위치 모델에 고정된 비선형의 최소-정사각형을 나타내고, 직선은 각각의 구성분을 나타낸다.
도 4B는 전형적인 대조군(다이아몬드)과 AD 뇌 표본(정사각형)에 결합하는 [14C]CG의 스캐챠드 분석이다. 점선은 AD 선과 동일한 기울기를 갖고, 대조군 기울기와 비교하는데 도움이 된다. 이 AD 뇌 표본은 48NP/x200 확대, KD0.35μM 및 Bmax790 fmol/㎍ 단백질을 갖는다. 대조군은 KD0.48μM 및 Bmax614 fmol/㎍ 단백질을 갖는다.
도 5는 펩티드 농도에 대한 결합 분석을 선으로 나타낸 그래프이다. 대략 Aβ(10-43) 0.9㎍은 전형적인 분석에 사용된다.
도 6A는 크리사민 G와 Aβ(10-43)의 결합의 시간 경과를 나타낸 그래프이다.
도 6B는 결합 속도 상수(k1)의 결정을 나타낸 그래프이다.
도 6C는 Aβ(10-43)으로부터 크리사민 G 해리의 시간 경과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 크리사민 G와 Aβ 사이의 상호관계를 분자 모델로 나타낸 그래프이다.
도 8A는 결합된 [14C]크리사민 G의 양과 AD 뇌 표본에서 신경 반점(NP)의 갯수와의 상관관계를 나타낸 그래프이다.
도 8B는 결합된 [14C]크리사민 G의 양과 AD 뇌 표본에서 신경원섬유 수초(NFT)의 갯수와의 상관관계를 나타낸 그래프이다. 도 8A 및 도 8B에서, X축은 상급/중급 전두부(n=10) 또는 상급 측두 피질(n=10) 중에서 비엘스초스키 착색된 단면에서 x200 확대에서 영역당 NP 또는 NFT의 평균 갯수를 나타낸다. 채워진 심볼과 굵은 선은 아밀로이드 혈관병이 없는 뇌를 나타내고, 오픈 심볼과 점선은 아밀로이드 혈관병에 걸린 뇌를 나타낸다. y축은 착색하기 위해 사용된 것과 근접한 전체 뇌 표본의 균질체에서 결합하는 [14C]크리사민 G를 나타낸다. 대략 단백질 75㎍과 [14C]크리사민 G 150nM가 사용되었다.
도 9A, 9B 및 9C. "고 반점 AD 뇌"로 일컷는 20 NPs/x200 확대보다 많은 AD 뇌의 표본에서 여러가지 뇌 영역에 대한 크리사민 G의 결합은 도 9A에 나타냈다. "저 반점 AD 뇌"로 일컷는 20 NPs/x200 확대보다 적은 AD 뇌의 표본에서 여러가지 뇌 영역에 대한 크리사민 G의 결합은 도 9B에 나타냈다. 데이타 점은 동일한 뇌의 소뇌(GB)에 결합하는 [14C]크리사민 G에 대한 지정된 뇌 영역에 결합하는 [14C]크리사민 G의 비율을 나타낸다. 수직 막대는 평균을 나타내고 오차 막대는 대조군(원), AD 뇌(도 9A 및 9B에서 다이아몬드)에 대한 표준 오차를 나타낸다. 뇌 영역은 전두부 폴(FP), 꼬리 부속기관의 머리(CAU), 상급/중급 전두부(SMF), 상급 측두(ST), 내부 두정부(IP) 및 후두엽 피질(OC)를 포함한다. 별표는 대조군과 비교된 현저한 차이를 나타낸다(*p＜0.05; **p＞0.001). 두명의 다운중후군 뇌 표본은 도 9C에 나타낸다. 도 9C에 다이아몬드는 아직까지 AD 증후가 없는 23살 다운증후군 환자의 뇌를 나타낸다. 도 9C에서 삼각형은 40대 대다수 다운 증후군환자와 같이 AD에 걸린 51살 다운증후군 환자를 나타낸다.
도 10은 측면의 꼬리 정맥에 [14C]크리사민 G가 주입되고, 나타낸 시간에서 희생된 쥐에서 크리사민 G의 조직에서의 표시를 나타낸 그래프이다. 오픈 심볼과 얇은 선은 cpm/g조직의 유니트에서 절대 방사능을 나타낸다(왼쪽 축). 닫혀진 심볼과 굵은 선은 신장(상부) 또는 혈액(중부)에서 방사능에 대한 뇌 방사능의 비율을 나타낸다. 비율은 오른쪽 축에 나타냈다.
도 11. 상부 : Stokes and Trickey, J. Clin. Pathol. 26: 241-242(1973)의 방법에 의해 1,4-비스(2-(3-카르복시-4-히드록시페닐)에텐-1-일)-벤젠으로 착색된 AD 뇌의 내부 측두엽으로부터 단편. 보여지는 것은 다수의 신경염 반점, 신경원섬유 수초 및 흔한 신경망사이다. 뇌혈관성 아밀로이드는 또한 강하게 착색된다(도시되지 않음). 바닥 : 1,4-비스(2-(3-카르복시-4-히드록시페닐)에텐-1-일)-벤젠으로 유사하게 착색된 유전자전이 쥐의 뇌[Tg(HuAPP695.SWE)2576; Hsiao et al. Science 274: 99-102(1996)]의 단편.
도 12는 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드, MTT, 환원에 의해 측정되는 바와 같이 래트 호크롬성세포증(PC-12) 세포의 세포 레독스 활성에서 크리사민 G의 존재 및 부재시에서 Aβ(25-35)의 농도 증가의 효과를 나타낸 막대 그래프이다. MTT의 환원 생성물은 수직축에 나타낸 560㎚에서 흡수한다. Aβ(25-35) 단독의 효과는 채워진 막대로 나타내고, MTT 환원에서 감소에 따른 투여량을 나타낸다. 대조군(Aβ(25-35) 없음, 크리사민 G 없음)과의 현저한 차이는 내부가 하얀 채워진 막대로 나타낸다. 20μM 크리사민 G의 보호 효과는 오픈 막대로 나타낸다. 크리사민 G의 존재 및 부재시 MTT 환원 사이의 현저한 차이는 내부가 검은 오픈 막대로 나타낸다.
도 13은 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드, MTT, 환원에 의해 측정되는 바와 같이 래트 호크롬성세포증(PC-12) 세포의 세포 레독스 활성의 Aβ(25-35) 유도된 환원에 대한 크리사민 G의 농도 증가의 보호적인 효과를 나타낸 막대 그래프이다. MTT의 환원 생성물은 수직축에 나타낸 560㎚에서 흡수한다. Aβ(25-35) 부재시의 크리사민 G의 효과는 채워진 막대로 나타낸다. 대조군(Aβ(25-35) 없음, 크리사민 G 없음)과 Aβ(25-35)의 부재시의 크리사민 G의 임의 농도에서의 현저한 차이는 없다. 1μM Aβ(25-35)의 존재시 MTT 환원과 크리사민 G의 농도 증가는 오픈 막대로 나타낸다. 각각의 크리사민 농도에서 Aβ(25-35)의 존재 및 부재 사이에 MTT 환원의 현저한 차이는 내부가 하얀 채워진 막대로 나타낸다. 크리사민 농도의 증가와 함께 Aβ(25-35) 대조군(크리사민 G 없음)과 Aβ(25-35) 사이의 MTT 환원에서 현저한 차이는 내부가 검은 오픈 막대로 나타낸다.
도 14는 Aβ(25-35)에 의해 유도된 독성에서 크리사민 G와 불활성 페놀 유도체의 효과를 비교한 것이다. 1μM Aβ(25-35)는 대조군을 제외하고 모든 실험에 존재한다. 크리사민 G는 0.1 및 1μM에서 보호효과를 나타내지만, 페놀 유도체는 보호효과가 없고, 아마도 Aβ의 독성이 증가한다.
바람직한 구현예의 상세한 설명
본 발명은 알킬, 알케닐 및 알키닐 크리사민 G 유도체와 그의 방사선 동위원소 표시된 유도체의 능력을 이용하여 생체내에서 혈액-뇌 장벽(blood brain barrier)를 통과하게 하고, 반점(plaque)에 침적된 Aβ, 뇌혈관 아밀로이드에 침적된 Aβ 및 NFT에 침적된 단백질로 구성된 아밀로이드에 결합한다. 크리사민 G는 콩고에서 발견된 설폰산 부분이 크리사민 G에서 카르복실산 기에 의해 교체되는 중요한 구조적 차이를 갖는 콩고 레드 유도체이다(도 1). 이 구조적인 차이는 크리사민 G가 콩고 레드와 항체와 같은 거대 마크로분자보다 보다 좋게 뇌로 들어가는 것을 허용한다. Tubis et al., J.Am. Pharmaceut. Assn. 49:422(1960) 참조. 또한, 크리사민 G는 항체보다 AD 이상병리학(pathophysiology)에 대해 더욱 특이적인 마커가 될 수 있고, 이것은 또한 불특정의 병리학적으로 중요한 표시 비-원섬유 Aβ 침적이다.
본 발명의 알킬, 알케닐 및 알키닐 크리사민 G 유도체는 각각 다음과 같은 특성을 갖는다: (1) 시험관내에서 합성 Aβ에 특이적 결합, (2) 뇌 단면에서 β-시트 원섬유에 결합, (3) 생체내에서 비절충된 혈액-뇌 장벽을 통과하는 능력.
본 발명의 방법은 환자의 기관 또는 신체 부위, 바람직하게는 뇌에서 아밀로이드 침적의 존재 및 위치를 결정한다. 본 방법은 상기에서 정의된 식 Ⅰ의 화합물(소위, 검출가능 화합물이라 함) 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 수용성 염을 포함한 제약학적 조성물의 검출량을 투여하는 것으로 이루어진다. 상기 "검출량"은 투여되는 검출가능 화합물의 양이 아밀로이드에 화합물의 결합을 검출할 수 있기에 충분한 것을 의미한다. "조영 유효량"은 투여되는 검출가능 화합물의 양이 아밀로이드에 화합물을 조영할 수 있기에 충분한 양을 의미한다.
본 발명은 자기 공명 분광 또는 자기 공명 영상 또는 양전자 방출 단층 X선 사진(PET) 또는 단일-전자 방출 전산화된 단층 X선 사진(SPECT)과 같은 감마 조영과 같은 비-침투 신경조영 기술과 관련있는 생체내에서 아밀로이드 침적을 정량하는데 사용되는 아밀로이드 탐침을 제공한다. "생체내 조영"이라는 용어는 본 발명의 상기에서 정의된 식(Ⅰ)의 라벨된 화합물의 검출을 허용하는 임의의 방법을 말한다. 감마 조영에서, 검사되는 기관 또는 부위로부터 방출된 방사선은 측정되고, 전체 결합으로서 또는 하나의 조직에 대한 전체 결합이 생체내 조영이 진행되는 동안 동일한 피험체의 또 다른 조직에 대한 전체 결합으로 표준화되는(예를 들면, 분할되는) 비율로서 표현된다. 생체내에서 전체 결합은 동일한 양의 표시된 화합물을 대량의 표시되지 않지만 화학적으로 동일한 화합물과 함께 두번째 주입하는 것에 의해 보정없이 생체내 조영 기술에 의해 조직에서 검출된 전체 신호로서 정의된다. 상기 "피험체"은 포유류, 바람직하게는 사람, 가장 바람직하게는 노인성 치매에 걸린 사람이다.
생체내 조영에서, 유용한 검출 기구 유형은 주어진 표시(label)을 선택하는데 주요한 변수이다. 예를 들면, 방사선 동위원소 및19F는 본 발명의 방법에서 생체내 조영을 위해 특히 적합하다. 사용된 기구의 유형은 방사성 핵종 또는 적합한 동위원소를 선택하게 한다. 예를 들면, 선택된 방사성 핵종은 주어진 기구의 유형에 의해 검출가능한 붕괴의 유형을 갖는다. 또 다른 고려는 방사능 핵종의 반감기와 관련된다. 상기 반감기는 이것이 타겟에 의한 최대 섭취 시간에서 검출될 수 있도록 충분히 길어야 하지만, 또한 호스트가 해로운 방사능에 견디지 못하기 때문에 충분히 짧야야 한다. 본 발명의 방사능 표시된 화합물은 적합한 파장의 방출된 감마 방사선이 검출될 수 있는 감마 조영을 사용하여 검출될 수 있다. 감마 조영의 방법은 이것으로 제한되는 것은 아니지만 SPECT 및 PET를 포함한다. 바람직하게, SPECT 검출에서, 선택된 방사성 동위원소에 의한 표시는 입자 방출은 부족하지만, 140 내지 200 keV의 범위에서 다수의 양성자를 생산해 낼 것이다. PET 검출에서, 방사성 동위원소에 의한 표시는 PET 카메라에 의해 검출될 수 있는 두개의 511 keV 감마 레이를 형성도록 쌍소멸하는19F와 같은 양전자 방출 방사성 핵종이 될 것이다.
본 발명에서, 생체내 조영과 아밀로이드 침적의 정량에 유용한 아밀로이드 결합 화합물/탐침이 만들어진다. 이들 화합물은 자기 공명 분광(MRS) 또는 자기 공명 영상(MRI) 또는 양전자 방출 단층 X선 사진(PET) 또는 단일-전자 방출 전산화된 단층 X선 사진(SPECT)과 같은 감마 조영과 같은 비-침투 신경조영 기술과 연결되어 사용될 수 있다. 본 발명에 따라서, 알킬, 알케닐 및 알키닐 크리사민 G 유도체는 이 분야에서 알려진 일반 유기 화학 기술에 의해 MRS/MRI에 대한19F 또는13C로 표시될 것이다. 예를 들면, March, J. "ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY; REACTIONS, MECHANISMS, AND STRUCTURE(3권, 1985)을 참조하고, 이 문헌의 내용은 참조로 본 명세서에 포함된다. 알킬, 알케닐 및 알키닐 크리사민 G 유도체는 또한 이 분야에 알려진 기술에 의해 PET에 대해서18F,11C,75Br 또는76Br로 방사성 동위원소 표시될 것이고, 이 내용은 Fowler, J. and Wolf, A.의 "POSITRON EMISSION TOMOGRAPHY AND AUTORADIOGRAPHY(Phelps, M., Mazziota, J., and Schelbert, H. eds) 391-450(Raven Press, NY 1986)에 기재되어 있고, 참조로서 본 명세서에 포함된다. 알킬, 알케닐 및 알키닐 크리사민 G 유도체는 또한 이 분야에 알려진 여러가지 기술에 의해 SPECT에 대한123I로 방사성 동위원소 표시될 것이다. 이것은 예를 들면 Kulkari, Int. J. Rad. Appl. ＆ Inst.(Part B) 18: 647(1991)을 참조하고, 이 내용은 참조로서 본 명세서에 포함된다. 추가로, 알킬, 알케닐 및 알키닐 크리사민 G 유도체는 요오드화 디아조늄을 통해 직접적으로 디아조티즈화된(diazotized) 아미노 유도체의 요오드화(Greenbaum, F.Am.J. Pharm. 108: 17(1936) 참조)에 의해 또는 불안정성의 디아조티즈화 아민을 안정한 트리아젠으로 전환하는 것에 의해 또는 비방사능 할로겐화된 전구체를 안정한 트리-알킬 주석 유도체(이것은 이어서 요오드 화합물로 이 분야의 잘 알려진 여러가지 기술에 의해 전환될 수 있다)로 전환하는 것에 의해 임의의 적합한 방사성 요오드 동위원소, 예를 들면, 이들로 제한되지는 않지만131I,125I 또는123I로 표시될 것이다. Satyamurthy and Barrio J. Org. Chem, 48: 4394(1983), Goodman et al., J. Org. Chem. 49: 2322(1984), and Mathis et al., J. Labell. Comp. and Radiopharm. 1994: 905; Chumpradit et al., J. Med. Chem. 34: 877(1991); Zhung et al., J. Med. Chem. 37: 1406(1994); Chupradit et al., J. Med. Chem. 37: 4245(1994) 참조. 예를 들면, 알킬, 알케닐 및 알키닐 크리사민 G 유도체의 안정한 트리아젠 또는 트리-알킬 주석 유도체는131I,125I,123I,76Br,75Br,18F 또는19F를 포함하는 할로겐화제와 반응한다. 따라서, 크리사민 G의 안정한 트리아젠 및 트리-알킬 주석 유도체와 그의 유사물은 본 발명내의 다수의 방사성 동위원소 표시된 화합물의 합성에 유용한 신규한 전구체이다. 이와 같이, 이들 트리아젠 및 트리-알킬 주석 유도체는 본 발명의 하나의 구현예이다.
알킬, 알케닐 및 알키닐 크리사민 G 유도체는 또한 알려진 금속 방사성 동위원소 표시, 예를 들면 테크네티움-99m(99mTc)로 표시될 수 있다. 이런 금속 이온을 결합하는 리간드를 도입하기 위한 치환체의 변형은 이 분야의 전문가에 의한 과도한 실험없이 효과적일 수 있다. 이어서,금속 방사성 동위원소 표시된 알킬, 알케닐 및 알킬닐 크리사민 G 유도체는 아밀로이드 침적을 검출하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 생체내 조영 및 분광을 위해 핵자기 공명 분광에 의해 검출가능한 동위원소를 사용할 수 있다. 특히 핵자기 공명 분광에 유용한 원소는19F 및13C를 포함한다.
본 발명의 목적을 위해 적합한 방사성 동위원소는 베타-방출제, 감마-방출제, 양전자-방출제 및 X-레이 방출제를 포함한다. 이들 방사성 동위원소는131I,123I,18F,11C,76Br,및75Br을 포함한다. 자기 공명 영상(MRI) 또는 자기 공명 분광(MRS)에 사용하기 위한 적합한 동위원소는19F와13C를 포함한다. 생체검사 또는 검시 조직의 균질체(homogenate)에서 아밀로이드의 시험관내 정량을 위한 적합한 방사성 동위원소는125I,14C 및3H를 포함한다.
바람직한 방사성 동위원소는 생체내 PET 조영에 사용하는 경우18F이고, SPECT 조영에 사용하는 경우123I이고, MRS/MRI의 경우19F이고, 시험관내 연구용으로3H 또는14C이다. 그러나, 진단 탐침을 가시화하기 위한 임의의 통상적인 방법은 본 발명에 따라 이용될 수 있다.
상기 방법은 온화한 또는 임상적으로 혼란스러운 경우에서 AD를 진단하는데 사용될 수 있다. 이 기술은 또한 다운 증후군, 가족성병 AD 및 아폴리포프로테인 E4 대립 유전자에 대한 동질 접합체와 같은 아밀로이드 침적으로 위협받고 있는 사람에서 아밀로이드 침적의 장기적인 연구를 또한 허용한다(Corder et al., Science 261: 921(1993). 후속되어질 수 있는 아밀로이드 침적의 일시적인 시퀀스는 침적이 노인성 치매 전에 오래동안 발생한 경우 또는 침적이 노인성 치매와 관련없는 경우 결정될 수 있다. 이 방법은 아밀로이드 침적을 방지하는 목적으로하는 치료의 효과를 관찰하는데 사용될 수 있다.
일반적으로, 검출될 수 있는 표시된 알킬, 알케닐 및 알키닐 크리사민 G 유도체의 투여량은 환자의 나이, 조건, 성별 및 질병의 정도와 같은 여러 변수, 반대로, 이 분야의 의사에 의해 조정된 부수되는 치료 및 다른 변수에 의해 결정될 것이다. 투여량은 0.001 내지 1000 ㎎/㎏으로 다양해질 것이고, 바람직하게는 0.1㎎/㎏이다.
피험체에 투여는 국소적으로 또는 계통적으로 그리고 정맥적으로, 동맥적으로, 초내(척수 유체를 통해) 등으로 수행될 수 있다. 투여는 또한 검사되는 신체 부위에 따라서 피하적으로 또는 동내로 투여될 수 있다. 아밀로이드와 결합하는 화합물에 대한 충분한 시간이 지난 후, 약 30분 내지 48시간 후에, 검사중인 피험체의 영역은 MRS/MRI, SPECT, 평면 신틸레이션 조영, PET 및 최근 개발 조영 기술 등과 같은 일반적인 조영 기술로 심사된다. 정확한 프로토콜은 상기와 같이 환자의 특이적인 변수에 따라 다양해질 것이고, 조사되는 신체 부위, 투여 방법 및 사용된 동위원소 유형에 따라 다양해질 것이다. 특이 절차의 결정은 당업자에게 일반적일 것이다. 뇌 조영을 위해, 바람직하게, 결합된 방사성 표시된 크리사민 G 또는 크리사민 G 유도체 또는 동족체의 양은 측정되고, 환자의 소뇌에 결합된 표시된 크리사민 G 또는 크리사민 G 유도체의 양과 비교된다. 이어서, 이 비율은 나이와 관련시켜 보통의 뇌에서 비율과 비교한다.
본 발명의 제약학적 조성물은 주사용 조성물의 형태로 투여되는 것이 바람직하다. 이런 목적을 위한 전형적인 조성물은 제약학적으로 허용가능한 담체로 이루어진다. 예를 들면, 조성물은 NaCl을 포함하는 인산 완충액 밀리리터당 사람 혈청 알부민 약 10㎎과 표시된 알킬, 알케닐 및 알키닐 크리사민 G 유도체 0.5 내지 500 마이크로그램을 포함할 수 있다. 다른 제약학적으로 허용가능한 담체는 수용액, 비독성 부형제(예를 들면, 염, 방부제, 완충액 등)를 포함한다. 예를 들면, REMINGTON,S PHARMACEUTUCAL SCIENCES, 15th Ed. Easton; Mack Publishing Co. pp. 1405-1412 및 1461-1487(9175) 및 THE NATIONAL FORMULARY XIV., 14th Ed. Washington; American Pharnaceutical Association(1975)를 참조하고, 이 내용은 참조로서 본 명세서에 포함된다.
비수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에티렌 글리콜, 야채 오일 및 주입용 유기 에스테르(예를 들면 에틸 올레이트)가 있다. 수성 담체로는 물, 알콜성/수성 용액, 염수, 비경구 부형제(예를 들면, 염화나트륨, 링거(Ringer's) 덱스트로즈 등)을 포함한다. 정맥용 부형제는 유체 및 영향 보충제를 포함한다. 방부제는 항균제, 산화방지제, 킬레이팅제 및 불활성 가스를 포함한다. 제약학적 조성물의 다양한 성분의 pH 및 추출 농도는 이 분야의 일반적인 기술에 따라 조정된다. Goodman and Gilman's THE PHARMACOLOGIGAL BASIS FOR THERAPEUTICS(7판) 참조.
본 발명의 특별히 바람직한 제약학적 조성물은 생체내에서 아밀로이드를 특이적으로 결합하고, 뇌혈 베리어를 통과할 수 있게 하는 것 이외에 또한 적당한 투여량에서 비독성이고 만족스러운 지속 효과를 갖는다.
분자 모델링
분자 모델링은 비-수평 베타-시트 배치에서 Aβ 펩티드 체인을 생산하기 위해 컴퓨터 모델링 프로그램 마크로모델(버젼 2.5, 콜롬비아 대학에서 C. Still로 시판)을 가동하는 에반스 및 슈터랜드 PS-330 컴퓨터 그래픽 시스템으로 수행하였다. Kirschner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 503(1986). 아밀로이드 펩티드는 또 다른 구조 재배열없이 사용하였다. Aβ 펩티드는 베타-시트 원섬유의 특징인 선택 체인이 4.76Å 떨어지도록 배열하였다. Kirschner, supra. 크리사민 G는 에너지 최소화하고 Aβ(10-43)의 리신-16과 소수성 페닐알라닌-19와 20 영역을 최대화하기 위해 원섬유 모델과 배열하였다.
Aβ 합성 펩티드에 대한 특이 결합의 특성화: 친화성, 속도, 최대 결합
크리사민 G와 크리사민 G 유도체 결합 특성은 합성 Aβ(10-43) 펩티드(소위 Aβ(10-43))을 사용하여 우선 분석하였다. 상기 10-43 펩티드는 이 펩티드가 Aβ 펩티드의 모든 특성적인 구조적 특징을 포함한 모델 시스템을 제공하기 때문에 선택되었다. Hilbich et al., J. Mol. Biol. 218:149(1991) 참조. Aβ의 10-43 아미노산 단편은 피츠버그 대학의 펩티드 합성 연구소에 의해 9-플루오레닐메틸 클로로포메이트(FOMC) 화학으로 합성하였다. 펩티드는 질량 분석에 의해 특성화하였고, 주된 성분은 MR3600g/mole을 갖는다(계산값 : 3598). 펩티드는 추가로 Hilbich et al.의 방법에 의해 추가로 정제하였다. 이것은 간단히, 70% 포름산중 Biogal P10 컬럼(2×180㎝, 200 내지 400 메쉬, Biorad, Richmond, CA) 상에 순차적인 크기-배제 크로마토그래피에 이어서 1M 아세트산중 Biogel P4 컬럼(2×180㎝, 200 내지 400 메쉬)을 통해 두번째 용출하는 것으로 구성된다. 펩티드는 동결건조하고 결합 분석에 사용될 때까지 -80℃에서 보관하였다.
Aβ(10-43)에 대한 아미노산 시퀀스는 다음과 같다.
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala
22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33
Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly
34 35 36 37 38 39 40 41 42 43
Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr
합성 Aβ(10-43)에 대한 결합 분석
결합분석은 12×75㎜ 보로실리케이트 유리 튜브에서 수행하였다. 여러가지 농도의 비방사성 크리사민 G 유도체를 10% 에탄올/물에 첨가하였다. 에탄올은 이들이 디아조 착색 유도체와 미쉘을 형성하는 것을 방지하는데 필요하다. 이는 미쉘이 펩티드가 없을 때에도 조차 여과기에 의해 걸리기 때문이다. 상기 용액에 물중의 Aβ(10-43)의 0.36㎎/㎖ 현탁액 25㎕를 첨가하고, 10% 에탄올을 첨가하여 부피가 950㎕로 되게 하였다. 실온에서 10분가 배양한 후에, 에탄올중의 [14C] 크리사민 G의 50㎕를 첨가하여, 사용된 [14C] 크리사민 G의 제조에 따라 100 내지 125nM의 [14C] 크리사민 G의 최종 농도를 얻었다. 결합 혼합물을 실온에서 30분 동안 배양하였다. 결합 및 비결합 방사능은 Brandel M-24R Cell Harvester을 사용하는 Whatman CF/B를 통해 진공 여과에 의해 분리하고, 이어서 실온에서 10% 에탄올로 2회 3-㎖ 세척하였다. 여과기는 카운팅 전에 플라스틱 신틸레이션 바이얼 7.0㎖중의 Cytoscintⓡ-ES 신틸란트(ICN Biomedicals, Inc., Irvine, CA) 4㎖중에서 밤새 평형화하였다. 이 결합 분석 및 모든 결합 분석에서 배양은 적어도 3회 실시하여 결과를 평균±표준오차로서 표현하였다.
반응 속도 연구
Aβ(10-43)에 결합하는 [14C]크리사민 G의 반응속도 연구는 상기에서 설명된 여과 분석에 의해 13×100㎜ 보로실리케이트 유리 튜브에서 수행하였다. 결합 속도에 대해서, 0.36㎎/㎖ Aβ(10-43)의 25㎕을 10% 에탄올 475㎕에 놓고, 125 nM[14C] 크리사민 G의 4.5㎖를 0시에 첨가하였다. 혼합물을 빠르게 저어주고, 결합 반응은 Brandel M-24R Cell Harvester(Gaithersburg, MD)를 사용하여 Whatman GF/B 여과기를 통해 진공 여과에 의해 멈추고, 이어서 실온에서 10% 에탄올로 5, 10, 20, 30, 45, 60, 75, 135, 240 및 300 초의 시간으로 2회 3-㎖ 세척하였다; 결합 방사능은 상기에서와 같이 결정하였다.
해리 속도에 대해서, 0.36㎎/㎖ Aβ(10-43)의 25㎕을 10% 에탄올 450㎕에 놓고, 이어서 40% 에탄올중 2.5μM [14C] 크리사민 G의 25㎕를 첨가하였다. 혼합물을 빠르게 흔들고, 30분 동안 실온에서 배양하였다. 혼합물을 10% 에탄올중의 10μM 비방사능 크리사민 G의 4.5㎖로 0시에 희석하고, 혼합물을 빠르게 흔들고, 해리는 상기와 같이 여과에 의해 0.5, 1.5, 3, 5 및 15분의 시간에서 멈추고, 결합 방사능은 상기에서와 같이 결정하였다.
알츠하이머 질병 뇌에 대한 특이 결합의 특성화
크리사민 G의 AD 및 대조 뇌 균질체에 대한 크리사민 G의 결합
검시 뇌 표본은 피츠버그 대학의 알츠하이머 병 연구 센터의 신경병리학부로부터 입수하였다. 대조군은 발행된 NIA 컨퍼런스 리포트에 특정화된 기준에 따라서 AD(충분한 수의 NPs 또는 NFTs)에 대한 병리학적 척도와 일치하지 않는 것으로 한정하였다. Khachaturian, Arch. Neurol. 42:1097(1985) 참조. 8명의 대조군(나이 58 내지 75), 11명의 AD(나이 61 내지 84), 및 2명의 다운 증후군(나이 23 및 51)으로부터 뇌 표본을 연구하였다. 11명의 AD중 6명은 반점이 많았고(＞20 NPs/x200 확대), 5명은 반점이 적었다(＜20 NPs/x200 확대). 두명의 대조군은 임상적으로 치매증이지만 NPs 또는 NFTs를 가지지 않고, "Dementia Lacking Distinctive Histology"의 진단을 받았다. Knopman Dementia 4:132(1993) 참조. 또 다른 대조군은 치매증 및 올리보폰토셀레벨라(olivopontocerebellar) 퇴화를 가졌다. 다른 대조군은 임상적으로 조직적으로 신경병의 증거가 없었다. 검시 표본을 즉시 -70℃로 동결하고, 그 온도에서 균질화될 때까지 저장하였다. 다수의 NPs 및 NFTs는 5부분으로 분리된 섹션이지만 상급 및 중급 전두부회의 연결 피질에서의 피질층 2와 4 및 모든 연구된 뇌의 상급 측두 등피질 사이의 근접 영역에서 계수하였다. 상급/중급 전두부 피질에서 아밀로이드 혈관병의 존재의 정성적인 평가를 하였다. 비엘스초스키 실버 주입 방법은 NPs와 NFTs를 확인하는데 사용하였고, 콩고 레드 착색은 뇌의 아밀로이드 혈관병을 확인하는데 사용하였다. 이 방법의 상세한 절차는 이전에 공개되었다. Moossy et al., Arch. Neurol. 45:251(1988). 상급/중급 전두부 또는 상급 측두 피질에 CG 결합을 위해 사용되는 표본은 NP와 NFT 계수하기 위해 사용된 것과 전체 해부(gross dissection)에서 근접하였다.
상급 및 중급 전두부회의 연결, 상급 측두 피질, 측두부 폴, 꼬리부속기관의 머리(head of the caudate), 내부 두정부 피질(inferior parietal cortex), 후두골 피질 또는 소뇌로부터 대략 조직 100㎎을 Polytronⓡ조직 균질기(PT 10/35, Brinkman Instruments Inc., Westbury, NY)로 30초 동안 10 내지 20㎎ 뇌/㎖의 농도로 10% 에탄올중 세팅 6에서 균질화하였다. 모든 영역이 전혀 유용하지 않았다. 25 내지 150㎕ 조직의 부분 표본(Lowry et al., J. Biol, Chem. 193:265(1951)의 방법에 의한 단백질 약 25 내지 300㎍)을 실온에서 30분 동안 10% 에탄올의 1.0㎖ 최종 부피중의 10 내지 750nM[14C]CG(26.8 Ci/mole)로 실온에서 12×75㎜ 보로실리케이트 유리 튜브에서 배양하였다. 표준 조건은 소뇌 비율 연구에서 약 단백질 150㎍과 75nM[14C]CG와 NPs, NFTs 및 아밀로이드 혈관병을 이용한 상관 연구에서 단백질 75㎍과 150nM [14C]CG을 제공하였다. 에탄올은 디아조 착색 유도체와 미셀 형성을 방지하는데 필요하다. 미쉘은 조직의 부재에서도 여과기에 의해 걸러진다. 결합된 및 결합되지 않는 방사능은 Brandel M-24R Cell Harvester(Gaithersburg, MD)를 사용하는 Whatman GF/B 여과기를 통과하는 진공 여과에 의해 분리하고, 이어서 실온에서 10% 에탄올로 2회 3-㎖ 세척하였다. 여과기는 계수전에 7.0㎖ 플라스틱 신틸레이션 바이알중의 4㎖ Cytoscintⓡ-ES 신틸렌트(ICN Biomedicals, Inc., Irvine, CA)에서 밤새 평형화하였다. 포화성(특이성) 결합은 전체 결합에서 20μM 표시되지 않은 CG의 존재시에 잔류(비-포화) 결합으로 정의된다. 모든 결합 분석에서, 배양은 적어도 3회 실시하고, 결과는 다른 것으로 나타내지 않는 이상 평균±표준오차를 나타낸다. 결과는 절대용어로서 주어진 뇌 영역에서 fmol [14C]CG 결합/㎍ 단백질 또는 동일한 뇌의 소뇌에서 fmol/㎍ 단백질에 대한 뇌영역에서 fmol/㎍ 단백질의 비율로서 나타낸다.
옥타놀/물 분별
크리사민 G 또는 그의 동족체의 대략 75μM 용액은 1-옥타놀 5.0㎖에서 제조하였다. 인산염 완충 염수(0.15M NaCl, 5mM 인산 칼륨, pH 7.4) 5㎖을 첨가하고, 층은 빠르게 저어주어서 혼합하였다. 이어서 혼합물을 두개의 깨끗한 상의 형성을 촉진하기 위해 1,000g에서 원심분리하였다. 층은 분별 깔대기를 이용하여 분리하고, 각각의 층 600㎕를 에탄올 400㎕로 희석하였다. 흡광도는 크리사민 G의 경우 389㎚에서, 각각의 동족체의 경우 λmax에서 측정하였다. 농도는 두개의 용매중에서의 몰 흡광도에 대한 보정후 결정하고, 옥탄올 층에서는 농도를 수성층에서의 농도로 나누어서 분별계수로 표현하였다. 실험은 3번 실시하였다.
알츠하이머병 뇌에서 아밀로이드 침적에 대한 크리사민의 결합 조영
조직에 결합하는 CG 유도체를 나타내기 위해, 뇌혈관성 아밀로이드의 무거운 침적을 갖는 AD 뇌의 8 미크론 파라핀 단편을 1,4-비스(2-(3-카르복시-4-히드록시페닐)에텐-1-일)-벤젠을 가지고 Stokes and Trickey, J. Clin. Pathol. 26: 241-242(1973)의 방법을 이용하여 단, 콩고 레드 대신 1,4-비스(2-(3-카르복시-4-히드록시페닐)에텐-1-일)-벤젠으로 변형시켰지만 다른 것은 동일하게 해서 착색하였다. 착색된 슬라이드는 형광 분석을 사용하여 조사하였다.
뇌혈 베리어를 통과하는 화합물의 능력 결정
쥐 연구 암컷 스위스-웹스터 쥐의 측벽 꼬리 정맥에 0.9% NaCl 용액중 [14C]크리사민 G 대략 0.03μCi/g을 주입하였다. 쥐를 15분, 35분, 1시간, 4시간 및 24시간의 간격으로 주입후 목을 탈골시켜 죽였다. 경동맥 혈액, 뇌, 간 및 신장을 빠르게 회수하고 측량한 후, 증류/탈이온된 물에서 그라운드 유리 균질기를 사용하여 균질화시켰다. 부분 표본을 18.0㎖ 플라스틱 신틸레이션 바이얼중에서 측량하고, 신틸레이션 칵테일(Cytoscintⓡ-ES(ICN)) 10.0㎖의 첨가 후에 계수하고 밤샘 평형화하였다. 조직의 [14C]크리사민 G 함량은 cpm/㎎ 조직으로서 표현했다.
방사능을 조직으로 부터 추출하는 실험은 [14C]크리사민 G의 0.05μCi/g을 주입하는 것과 쥐를 60분에 죽이는 것만 제외하고 상기에서와 동일하게 행하였다. 이어서, 뇌와 간을 제거하고, Folch 공정으로 추출하였다. Folch et al., J.Biol. Chem. 226: 447(1957). 양 조직에서, 추출된 방사능 95% 이상을 유기층에 포함하였다. 유기층은 건조로 증발시키고, 10% 메탄올/90% ACN의 최소량으로 재현탁시키고, 실리카 컬럼(Prep Nova Pak HR 실리카, 7.8×300㎜, 물, Milford, MA)에 주입하고, 동일한 용매로 동일하게 용출하였다. 이들 조건에서, 방사능 99%가 용매 프론트에 용출되지만, 대부분의 지질은 오래 유지되고, 상기 설명된 가역-상 C4 컬럼 시스템에 주입하기 적합한 용매 프론트에서 용출하는 분별을 만든다. 전체 용매 프론트는 수집되고, 건조되고, 10% ACN/90% 인산나트륨 완충액(5mM, pH 6)으로 재현탁하고, C4 컬럼에 확실히 비-방사능 크리사민 G와 함께 주입하였다. 1분 분류로 수집하고, Cytoscintⓡ-ES의 첨가후에 계수하였다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 알츠하이머병, 다운증후군 및 유형 2 진성당뇨병, 유전성의 뇌출혈 아밀로이도시스(Dutch), 아밀로이드 A(반응성), 2차 아밀로이도시스, 가족병 지중해열, 담마진과 난청을 갖는 가족병 아밀로이드 신장병, 아밀로이드 람다 L-체인 또는 아밀로이드 카파 L-체인(자연발생, 골수종 또는 고분자 글로불린혈증 관련), 에이 베타 2엠(만성 혈액투석증), ATTR(가족병 아밀로이드 다중신경병(Prttuguese, Japanese, Swedish), 가족병 아밀로이드 심장병(cardiomyopathy)(Danish), 단리된 심장병의 아밀로이드(계통적인 노인 아밀로이도시스), AIAPP 또는 아밀린 인슐리노마, 아트리얼 네츄러틱 펙터(atrial naturetic factor)(단리된 아트리얼 아밀로이드), 프로칼시토닌(갑상선의 수질 암), 겔솔린(가족병 아밀로이드(Finnish)), 시스타틴 C(아밀로이도시스를 갖는 유전성의 뇌출혈(Icelandic)), AApo-A-I(가족병 아밀로이드 다중신경병-Iowa), AApo-A-II(쥐에서 촉진된 노쇠), 피브로노겐-관련 아밀로이드; 및 Asor 또는 PrP-27(이질, 크로이츠펠드-야곱 증후군, 게르츠만-스타루슬러-쉬인커 증후군(Gertsmann-Straussler-Scheinker syndrome), 소의 해면모양의 뇌염)과 같은 "아밀로이드 관련" 증상에서 또는 아폴리포단백질 E4 대립형질에 대해 동형 접합인 사람의 경우에서 세포 퇴화와 원섬유 형성과 관련된 독성을 방지하는 제약학적 조성물과 방법에 관한 것이다. 이 방법은 크리사민 G 또는 상기 설명된 그의 유도체로 이루어진 제약학적 조성물을 이와 같은 아밀로이도시스 관련 증상에 걸린 피험자에게 투여하는 것을 포함한다.
특정한 디아조 화합물은 발암성이 될 수 있기 때문에, 본 발명의 치료적 화합물은 비독성, 비발암성 화합물만 포함한다. 즉, 본 발명은 발암성 벤지딘 화합물로 신진대사될 수 있는 기를 포함하지 않는 알킬, 알케닐 및 알키닐 화합물만 사용하는 것으로 잠재적인 발암성의 문제를 해결할 수 있다.
낮은 생체유용성에 따른 임의의 잠재적인 문제는 아조 화합물의 알킬, 알케닐 및 알키닐 유도체의 사용으로 회피된다. 이들 화합물은 박테리아 또는 포유류의 아조 환원제에 의한 환원에 대한 기질이 아니다.
실제로, 치료학적인 용도가 고려된 본 발명의 화합물은 이들이 장에서 박테리아의 아조-환원제에 대한 기질이 아닌 1,4-비스(2-(3-카르복시-4-히드록시페닐)에텐-1-일)-벤젠 연결을 포함하기 때문에 바람직하다.
시험관내 실험에서는 Aβ 신경독성이 원섬유 형성을 요구하고, 콩고 레드에 의해 억제된다는 것을 보여주었다. 특히, 아밀로이드 원섬유 결합 착색 콩고 레드는 원섬유 형성에 의해 또는 예비형성된 원섬유의 결합에 의해 원섬유 Aβ 신경독성을 억제한다는 것을 보여주었다. Lorenzo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:12243-12247(1994). 콩고 레드는 또한 아밀로이드 원섬유의 또 다른 유형인 당뇨병과 관련된 아밀린의 팬크래틱 섬(pancreatic islet) 세포 독성을 억제하는 것으로 나타났다. Lorenzo et al., supra. Burgevin et al. NeuroReport 5 : 2429(1994); Pollack et al., J. Neurosci. Letters 184; 113-116(1995): Pollack et al. Neuroscience Letters 197l:211(1995) 참조. 이들 데이터는 콩고 레드와 유사하지만 콩고 레드와 달리 뇌에 잘 들어가는 아밀로이드 결합 화합물, 예를 들면 크리사민 G의 알킬, 알케닐 및 알키닐 유도체가 세포 변성과 아밀로이도시스 관련된 증상에서 원섬유 형성과 관련된 독성을 방지하는데 효과적이 될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 8과 도 12 및 13에서, 크리사민 G는 래트 페크로모시토마 (pheochromocytoma)에서 투여량에 따른 보호 효과를 갖는 측면에서 콩코 레드에 대해 이전에 보고된 것와 매우 유사한 효과를 갖는 다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이들 시험관내 분석은 세포 변성과 원섬유 형성과 관련된 독성을 방지하기 위한 제약학적 조성물에 유용한 화합물을 선택하는 수단을 제공한다.
크리사민 G 및 상기 그의 유도체와 같은 화합물은 본 발명에 따라서 동물 모델에서 영양오염의 신경염(dystrophic neurites), 시냅스 손실, 신경원섬유 수초 형성 및 글리오시스(gliosis)에 의해 측정되는, 아밀로이드 원섬유 형성 또는 관련된 세포 변성을 방지하는데 생체내 효능에 대해서 시험되었다. 동물 모델은 예를 들면, Wisniewski et al., J. Neuropathol. ＆ Exp. Neurol. 32:566(1973)에서의 뇌 아밀로이도시스에 대한 "뇌쇠 동물" 모델, 가족병 지중해열의 쥐 모델(Neurochem., Inc. Kingston, Ontario, Canada) 및 알츠하이머-유형 신경병리학의 유전자전이 쥐모델(Games et al., Nature 373: 523-527(1995); Hsiao et al. Science 274: 99-102(1996)이 있다. 가족병 지중해열 모델에서, 동물은 계통적인 아밀로이도시스로 발전하였다. 본 발명에 따른 생체내 분석에서, 아밀로이드 형성의 억제를 평가하기 위해, 본 발명의 화합물로 치료된 및 치료되지 않은 동물에서 일련의 검시로 비교하였다. 뇌 아밀로이드 형성에 대한 동물 모델에서, 일련의 아밀로이드 형성에 이어서, 영양오염의 신경염(dystrophic neurites), 시냅스 손실, 신경원섬유 수초 형성 및 글리오시스(gliosis)에 의해 측정되는 아밀로이드-관련된 신경퇴화(neurodegeneration)의 존재가 또한 본 발명의 화합물로 처리된 및 처리되지 않은 동물에서 일련의 검시로 평가되었다.
본 발명에 따라서, 크리사민 G 또는 그의 유도체로 이루어진 제약학적 조성물은 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유 형성, 세포 변성 및 독성이 예상되는 피험체에 투여된다. 바람직한 구현예에서, 이와 같은 피험체는 사람이고, 예를 들면, 고령의 미치지 않은 노인 및 아밀로이도시스 관련된 질병 및 유형 2의 진성 당뇨병을 포함한 뇌 아밀로이드로 발전할 위험이 있는 사람을 포함한다. "개선"이라는 용어는 세포 변성과 원섬유 형성과 관련된 독성의 개선도 포함한다. 개선은 치매와 같은 독성의 징후가 이미 보이는 환자에게 세포 변성과 독성의 더 심해지는 것을 방지하는 것을 의미한다.
아밀로이도시스 관련된 질병에서 세포 변성과 원섬유 형성과 관련된 독성을 방지하기 위한 목적의 제약학적 조성물은 크리사민 G 또는 상기 그의 유도체와 제약학적으로 허용가능한 담체로 이루어진다. 하나의 구현예에서, 이런 제약학적 조성물은 혈청 알부민, 크리사민 G 또는 크리사민 G 유도체와 NaCl을 포함하는 인산염 완충액으로 이루어진다. 다른 제약학적으로 허용가능한 담체는 수성용액, 염을 포함한 비독성 부형제, 방부제, 완충액 등을 포함한다. 이들은 예를 들면 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 15th Ed., Easton; Mack Publishing Co., pp 1405-1412 및 1461-1478(1975) 및 THE NATIONAL FORMULARY XIV., 14th Ed. Washington; American Pharmaceutical Association(1975), 및 the UNITED STATES PHARMACOPEIA XVIII. 18th Ed. Washington; American Pharmaceutical Association(1995)에 기재되어 있다. 이 내용을 본 명세서에 참조로서 포함한다.
비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 야채 오일 및 주사용 유기 에스테르(예를 들면, 에틸 올레이트)가 있다. 수성 담체는 물, 알콜성/수성 용액, 염수, 염화 나트륨, 링거 덱스트로즈 등과 같은 비경구 부형제를 포함한다. 방부제는 항균제, 산화방지제, 킬레이팅제 및 불활성가스를 포함한다. 제약학적 조성물의 여러 가지 구성분의 pH와 정확한 농도는 이 분야의 통상적인 기술에 따라 조정된다. Goodman and Gilman's THE PHARMACOLOGICAL BAASIS FOR THERAPEUTICS(7th Ed.).
본 발명에 따라서, 이와 같은 제약학적 조성물은 액체 또는 고체의 형태로 경구적으로 투여될 수 있고, 또는 정맥으로 또는 근육으로 현탁액 또는 용액의 형태로 주입될 수 있다. "제약학적으로 유효량"의 용어는 세포 변성과 원섬유 형성과 관련된 독성을 억제하는 양을 의미한다. 이와 같은 양은 환자의 나이, 체중 및 증상에 따라 다양해질 필요가 있고, 잘 알려진 프로토콜에 따라서 당업자에 의해 조절될 수 있다. 하나의 구현예에서 투여량은 매일 0.1 내지 100㎎/㎏이 되거나, 하루에 2 내지 4번 투여될 수 있게 적은 양으로 나누어 투여될 수 있다. 이와 같은 섭생(regimen)은 환자의 생명을 위해 매일 기본적으로 계속될 것이다. 임의로, 제약학적 조성물은 1 내지 6주 동안 매일 0.1 내지 100㎎/㎏의 투여량으로 근육내로 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 생체 검사 또는 검시 조직에서 아밀로이드 침적을 검출하는 방법에 관한 것이다. 방법은 상기 식(Ⅰ)의 화합물 용액으로 포르말린-고정된 조직을 배양하는 것을 포함한다. 바람직하게, 용액은 식(Ⅰ)의 화합물로 포화된 25 내지 100% 에탄올이고, 나머지는 물이다. 배양에 따라, 화합물은 조직에서 아밀로이드 침적을 착색하거나 표시하고, 착색된 또는 표시된 침적은 임의의 표준 방법에 의해 검출될 수 있거나 또는 보여질 수 있다. 이와 같은 검출 수단은 브라이트-필드(bright-field), 형광, 레이져-공초점(laser-confocal) 및 십자-편광 현미경과 같은 현미경 기술을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 생체 검사 또는 검시 조직에서 아밀로이드 양을 정량하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 표시된 크리사민 G의 알켄, 알케닐 및 알키닐 유도체, 바람직하게는 식(Ⅰ)의 화합물 또는 그의 수용성의 비독성 염을 생체 검사 또는 검시 조직의 균질체로 배양하는 것을 포함한다. 상기 조직은 이 분야의 잘 알려진 방법에 의해 얻어지고 균질화된다. 바람직한 표시는 방사성 동위원소 표시이고, 효소, 화학형광 및 면역형광 화합물과 같은 다른 표시는 당업자에게 잘 알려진 것이다. 바람직한 방사성 동위원소 표시는125I,14C 또는3H이고, 식(Ⅰ)의 바람직한 표시 치환체는 R1-R7, R10-R27의 적어도 하나이다. 아밀로이드 침적을 포함한 조직은 크리사민 G의 표시된 알킬, 알케닐 및 알키닐에 결합할 것이다. 결합된 조직은 이어서 당업자에 알려진 임의의 메카니즘을 통해 비결합된 조직과 분리된다. 이어서 결합된 조직은 당업자에게 알려진 임의의 수단을 통해 정량화될 것이다. 실시예 3참조. 조직 결합된 방사성 동위원소 표시된 크리사민 G 유도체의 유니트는 방사성 동위원소 표시된 크리사민 G 유도체를 갖는 아밀로이드의 알려진 양을 배양하는 것으로 얻어진 표준 곡선으로 비교하여 조직 100㎎당 아밀로이드 ㎍의 유니트로 전환된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 (i)소뇌와 (ii) 소뇌 이외의 동일한 뇌의 다른 영역으로 부터 채취한 조직을 포함한 보통의 뇌, 정상 피험체, 알츠하이머 질병이 있는 피험체로 알츠하이머 병의 뇌를 구별하는 방법에 관한 것이다. 실시예 3 참조. 이와 같은 조직은 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 균질체를 분리하고, 이어서 방사성 동위원소 표시된 알킬, 알케닐 및 알키닐 크리사민 G 유도체로 배양된다. 방사성 동위원소 표시된 알킬, 알케닐 및 알키닐 크리사민 G에 결합하는 조직은 양은 이어서 각각의 조직 유형(예를 들면, 소뇌, 비소뇌, 정상, 비정상)에 대해 계산되고, 소뇌 조직에 대한 비소뇌의 결합에 대한 비율은 정상 조직에 대해서 및 알츠하이머 질병을 갖는 환자에 대해서 계산된다. 이어서, 이들 비율은 비교되어진다. 알츠하이머 병을 갖는 뇌로부터 비율이 정상 뇌로부터 얻은 비율의 90% 이상인 경우, 알츠하이머 병으로 진단된다.
＜실시예 1＞
크리사민 G(chrysamine G)와 그 유도체의 합성
크리사민 G의 합성
크리사민 G(즉, 4,4'-비스(3-카르복시-4-하이드록시페닐아조)-바이페닐)의 합성에는 다음과 같은 반응단계가 필요하다. 이러한 반응단계들은 "크리사민 G 합성"의 일반적인 과정이라고 불려질 것이다. 벤지딘·2염산(benzidine·2HCl; 28.9mg, 0.11mmole, Sigma chemical Company, St. Louis, MO)을 50cc 둥근바닥 플라스크에 있는 DMSO:증류된/탈이온화된 물 의 비율이 1:1인 용액 1.5ml에 첨가하였다. 각각의 반응단계는 0℃에서 실행되었으며, 만약 그렇지 않은 경우는 다르게 특정화 해 주었다. 29㎕의 농축된 염산을 첨가하고, 저어 주면 맑은 용액이 된다. DMSO/물이 1:1로 되어있는 300㎕의 액체에 NaNO3를 15.5 mg(0.22mmole) 녹인 용액을 벤지딘 용액에다 한 방울씩 첨가하면, pH가 약 2∼3이 된다. 그 반응 혼합물을 45분간 저어준다. 그리고 이 테트라-질소화 벤지딘(tetra-azotized benzidine)혼합물을, pH를 10,5로 유지하면서 10분에 걸쳐, 250mg/ml의 Na2CO3를 포함하는 100%의 DMSO 로만 된 현탁액에, 24.8mg(0.18mmole)의 살리실산메틸(Aldrich)이 녹아있는 용액에 적가하였다. 그 결과인 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 저어주고, 상온에서 밤새워둔다.
그 시간이 지난후, pH는 약 7로 조절하고, 그 혼합물은 세 개의 50ml 비율의 클로로포름으로 추출하였다. 결합된 클로로포름 추출물은 세 개의 50ml비율의 물에 씻고, 건조시켜서 크리사민 G의 디메틸 에스테르(dimethyl ester)(즉, 4,4'-bis (3-methoxycarbonyl-4-hydroxyphenylazo)-biphenyl)를 얻고, 클로르포름/헥산에서 재결정하여 정제하였다. 그 에스테르는 4개의 NaOH 균등체(equavalents)를 포함하는 에탄올과 물이 1:1의 비율로 된 100ml용액에 용해시켜 가수분해하고, 환류시켰다. 에탄올을 증류시키고, 물을 동결 건조시켜 크리사민 G의 4가 나트륨 염을 얻었다. 크리사민 G의 산(free acid)은, 4가 나트륨 염을 물에 녹이고, 가수분해되지 않은 다이메틸 에스테르를 제거하기 위하여 클로로프롬으로 세척하고, pH를 2정도로 낮춘 후, 세 개의 50ml 비율의 에틸 아세테이트로 추출하여 만들 수 있다. 결합되어진 에틸 아세테이트 추출물은 세 개의 50ml 비율의 물로 씻은 후 말린다.
이러한 조건하에서, 더 이상 살리실산 메틸, 살리실산 또는 벤지딘은 남아있지 않고, C4컬럼(Vydac 214-TP510)을 사용하고, 인산나트륨의 완충액(5mM, pH 6):아세토니트릴(ACN)의 비율이 90:10 인 비율에서 공평하게 10분간, 그 다음 아세토니트릴의 비율을 50%로 올려서 20분간 유속을 3.5ml/min으로 한 용매 시스템을 이용한 역상의 HPLC에 의하여 처리하면, 단지 미량의 1가 치환된 생성물, 4-하이드록시-4'-(3-카르복시-4-하이드록시페닐아조)-바이페닐만이 남아있게 된다. 이러한 조건 하에서, 크리사민 G는 17.6분에 추출하였다.
크리사민 G와 그 유도체들의 구조는 500 MHz에서 TMS를 내부 표준으로 하여 DMSO-d6 에서 양성자 NMR로 알아냈다. 크리사민 G의 4가 나트륨 염에 대한 피크의 할당은, 살리실산의 반쪽에 있는 특이적인 고리의 위치에 있는 양성자를 나타내는 SA와 벤지딘의 반쪽에 있는 양성자를 나타내는 BZ를 따른다: SA-3, 6.75 ppm에서 더블릿(doublet) J=8.73 Hz; SA-4, 7.82 ppm에서 더블릿의 더블릿(doublet of doublets) J=8.73 및 2.72 Hz; 7.91 ppm에서 BZ-2/6, 더블릿 J=8.44 Hz; 7.95 ppm에서 BZ-3/5, 더블릿 J=8.44 Hz; 8.28 ppm에서 SA-6, 더블릿 J=2.72 Hz 이다. 40%의 에탄올에서 UV/Visible 스펙트럼은 389nm에서 최대파장 λmax를 나타낸다. 크리사민 G의 분자흡광도는, NMR에 의한 피크의 면적을 내부 표준과 비교하여 크리사민 G 의 농도를 계산하고, 즉시 40%의 에탄올에 묽혀진 NMR 샘플의 분별된 부분의 UV/Vis 스펙트럼을 실행함으로써 결정할 수 있다. 389nm의 파장, 40%의 에탄올에서 분자 흡광도는 5.5×104AU/(cm·M) 이었다.
[14C]크리사민 G는 상기 과정을 적절히 조절하여 합성할 수 있다. 벤지딘의 4가 질소화(tetra-azotization)는 100%의 물을 사용한다는 것을 제외하고는 상기의방법과 동일하다. 0.5ml의 원뿔형 플라스크에 들어있는 50μCi의 살리실산-카르복시-14C (Sigma)에, 물에 녹아있는 2.5M Na2CO3용액 50μl를 첨가하였다. 60μl의 4가-질소화 벤지딘 혼합물을 그 원뿔형 플라스크에 첨가하고, 0℃를 유지하면서 1시간 동안 소용돌이가 생기도록 저어주었다. 1가 치환된(mono-substituted) 벤지딘의 부산물이 생기는 것을 막기 위해, 2.5M Na2CO3용액에 비 방사성 살리실산(Sigma)을 농도 250mM에서 12.5μl를 반응혼합물에 넣어주고, 0℃에서 1시간 동안 두었다. 플라스크를 상온에 밤새도록 방치했다. 전체 혼합물을 35%의 최소량의 ACN에 녹이고, 위에서 설명되어진 것처럼 C4컬럼에 투입했다. 크리사민 G 표준에 해당하는 피크는 따로 모아서 동결건조 하였다. 26.8 Ci/mole의 활동도는 389nm에서 흡수를 측정하고, 동 샘플에서 분리된 것의 방사성을 계산함으로써 계산 할 수 있었다. 크리사민 G는 40%의 에탄올에 저장하였다. 정제된 [4C]크리사민 G를 C4 컬럼에 다시 투여하고, 3.5ml/min에서 21%의 ACN으로 추출 할 때, 10.4 분에서 98% 이상의 진정한 크리사민 G의 방사능이 함께 추출되었다. 아래에 설명한 예외가 있겠지만, 많은 크리사민 G 의 유도체를 이러한 "크리사민 G 의 합성" 에 대한 일반적인 방법에 의해서 합성할 수 있다. 유도체들의 구조가 NMR에 의해서 밝혀졌다. 도 1은 크리사민 G와 그 유도체의 화학구조를 나타낸다.
마찬가지로, [3H]크리사민 G도 상기한 방법을 변형함으로써 합성할 수 있다. 3,3'-[3H]벤지딘은 3,3'-디요오드벤지딘 0.7mg과 팔라디움/활성탄 촉매 1 mg, N,N-디이소프로필에틸아민 200μl, 8.26Ci의 운반-자유(carrier free) 트리티움 가스를 상온에서 3시간 처리한 THF 500μl를 처리함으로써, 아메리칸 라디오라벨드 케미컬, Inc (St. Louis)에 의해 상업적으로 제조할 수 있다. 정확한 수율과 특이한 활성은 제공되지 않았다. 3,3'-[3H]벤지딘은 100%의 물(pH=6.0)에서 100%의 0.01N HCl(pH=2.2)로 10분에 걸쳐(4.0ml/min) 선형적으로 변하는 Vydac C4컬럼에 의해서 정제할 수 있다. 이러한 과정에 의해서 ,3,3'-[3H]벤지딘은 약 9.5분의 자유(free) N,N-디이소프로필 에틸아민과 2가질소화(diazotization) 반응방법이 수정없이 사용될 수 있는 용매에서 추출되었다. 100배의 과도한 질산나트륨을 가진 수 백 ㎕의 부피에서 2가질소화 작용에 뒤이어, NaCO3에서 100배의 과도한 살리실산의 커플링(coupling)이 있었고, 그 결과 크리사민 G(4,4'-비스(3-카르복시-4-하이드록시페닐아조)-3,3'-[3H]바이페닐)의, 3가의(tritiated) 유도체가 생겼는데, 이것은 대략 35Ci의 활성을 주는 HPLC에 의해서 상기한 것처럼 정제할 수 있다.
크리사민 G의 알케닐(CH=CH) 유도체의 합성
4,4'-바이페닐디카르복시산(4,4'-biphenyldicarboxylic acid; Aldrich)은 LiAlH4와의 환원에 의해서 변형되고, 다시 이것은 ACN 안에서 NaI와 BF3-에테르염과의 반응에 의해서 4,4'-비스(요오드메틸)바이페닐로 변했다. 요오드 화합물을 과량의 트리에틸 아인산염과 함께 1시간 동안 90℃에서 가열하여서, 테트라에틸 4,4'-바이페닐디메틸인산염을 만들었다. 1,4-나프탈렌-디카르복실산(Aldrich) 또는 9,10-안트라센-디카르복실산(Aldrich)을 동일하게 처리하여, 각각 테트라에틸 포스포네이트(tetraethyl phosphonate)를 제조하였다. 헥산으로부터 재결정 후에 그 포스포네이트는 DMF에 용해된 후에 10배 과량의 메톡시 나트륨과 함께 처리되고, 이어서 DMF에서 두 개의 균등환 5-포르밀살리실산에 처리된다. 상온에서 24시간 동안 저은 후, 물에 쏟아 붓는다. 염산으로 물을 pH가 5.0이 되도록 산성화시키면 형광성 생산물인 4,4'-비스(2-(3-카르복시-4-하이드록시페닐)에텐-1-일)-바이페닐의 침적이 생기는데, 이것은 어떠한 1가 치환된 부산물로부터도 선택적으로 에틸 아세테이트로 추출될 수 있다. 5-포르밀살리실산이나 그 유도체를 이용하여 테트라에틸 p-크실린디포스포네이트(TCI, America)를 비슷하게 처리하면 1,4-비스(2-(3-카르복시-4-하이드록시페닐)에텐-1-일)-벤젠이 얻어진다. 마찬가지로 1,4-비스(2-(3-카르복시-4-하이드록시페닐)에텐-1-일)-나프탈렌이나 9,10-비스(2-(3-카르복시-4-하이드록시페닐)에텐-1-일)-안트라센도 적당한 포스포네이트를 5-포르밀살리실산과 함께 처리함으로써 얻어질 수 있다. 다른 유도체들은 다른 포르밀살리실산 군에서 선택하거나, 포르밀벤조산, 또는 하이드록시-또는 메톡시벤즈알데하이드를 이용하여 얻을 수 있다.
기본 골격에 상기의 것과 다른 가지(linker)가 필요한 경우에는 적당한 카르복실산(2-브로모테레프탈산(Aldrich)과 같은)이 디올(diol)로 환원되고, 요오드화물로 변한 후, 상기 언급한 것처럼 테트라에틸 디포스포네이트로 변한다. 살리실산 외의 여타 군의 화합물이 필요할 때는 적당한 페놀(이들은 보통 산성 작용기를 동시에 포함한다)이, 먼저 페놀에 오르토나 파라형태로(다른 치환기의 존재에 의해서 결정된다)요오드화되고, 그 후 표준의 방법으로 요오드 자리가 포르밀레이트 된다.
크리사민 G의 부타디에닐(CH=CH-CH=CH) 유도체의 합성
p(파라)-크실렌디포스포닉산 테트라에틸 에스테르(p-Xylylenediphosphonic acid tetraethyl ester; TCI America, Portland, OR)를 건조 DMSO에 녹이고, 10배 과량의 터셔리-부톡시드 칼륨(potassium t-butoxide)으로 처리한 다음, 건조 DMSO에서 두 개의 3-메톡시카르보닐-4-메톡시시남알데하이드(3-methoxycarbonyl-4- methoxycinnamaldehyde; 5-요오드-2-메톡시벤조산 메틸 에스테르와 아크롤레인에 의해서 통상의 방법으로 제조할 수 있다.) 동등체에 처리된다. 상온에서 24시간 동안 저어준 후, 그 반응혼합물을 물에 쏟아 붓는다. 염산으로 물의 산성도를 pH 5.0 으로 맞춰주면 형광의 생성물, 즉 1,4-비스(4-(3-카르복시-4-메톡시페닐)-1,2-부타디엔-1-일)-벤젠의 침적이 생기는데, 이것은 1가 치환된 부산물로부터 에틸아세테이트로 추출된다. 역류(refluxing) DMF에서 과량의 황화에톡사이드 나트륨(sodium thioethoxide)과 처리하여 메톡시 그룹이 깨어지면, 살리실산의 유도체가 생긴다. 기본 골격에 대한 가지 포스포네이트와 적당한 시남알데하이드 유도체의 다른 조합을 처리함으로써 목적한 생성물을 얻을 수 있다.
크리사민-G의 알킬로 치환된 알케닐(CR'=CR') 유도체의 합성
4,4'-바이페닐디카르복실산(Aldrich) 또는 1,4-벤젠디카르복실산(Aldrich)을 먼저 LiAlH4로 환원시켜서 비스(하이드록시메틸) 화합물을 만들고, 그 다음 그것을 에틸아세테이트에서 BaMnO4로 처리하여, 디카르복스알데하이드로 변형시킨다. 이 알데하이드를 그리나드 반응을 통해 R'MgX(R'는 저급 알킬이고, X는 브롬이나 요오드 이다)와 반응시켜서 HOCR'H-Ph-Ph-CR'H-OH 또는 HOCR'H-Ph-CR'H-OH를 만든다. 알킬로 치환된 비스(하이드록시메틸) 화합물은, ACN에서 NaI와 BF3-에테레이트와 반응시켜서, 알킬로 치환된 비스(요오드메틸) 화합물을 만든다. 그 요오드 화합물은 과량의 트리에틸 아인산염(triethyl phosphite)으로 90℃에서 한시간 정도 가열하여 알킬로 치환된 테트라에틸 디메틸포스포네이트를 제조한다. 1,4-나프탈렌-디카르복실산(Aldrich) 또는 9,10-안트라센-디카르복실산(Aldrich)을 비슷하게 처리하여, 각각 알킬로 치환된 테트라에틸 디메틸포스포네이트를 제조한다.
알킬로 치환된 알케닐 화합물의 세가지 변종들, 예컨데, AR-CR'=CR'-Q, AR-CR'=CH-Q 또는 Ar-CH-CR'-Q (여기서, R'는 저급 알킬 그룹이고, Q는 요오드로 정의된다)는 그 다음에 합성될 수 있다. AR-CR'=CR'-Q 화합물은 알킬로 치환된 테트라에틸 디메틸포스포네이트를 5-아세틸살리실산(Crescent Chemical Co., Inc., Hauppage NY)과 같은 적당한 아릴 케톤과 반응시킴으로써 얻을 수 있다. AR-CR'=CH-Q 화합물은 알킬로 치환된 테트라에틸 디메틸포스포네이트를 5-포르밀살리실산과 같은 적당한 알데하이드와 반응시킴으로써 얻을 수 있다. AR-CH-CR'-Q화합물은 알킬로 치환된 테트라에틸 디메틸포스포네이트를 5-아세틸살리실산(Crescent Chemical Co., Inc., Hauppage NY)과 같은 적당한 아릴 케톤과 반응시킴으로써 얻을 수 있다. 반응 조건은 상기 알케닐(CH=CH)유도체를 만들기 위해서 사용한 조건과 동일하다.
크리사민 G의 알키닐(C??C) 유도체의 합성
5-요오드살리실산(Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI)은 메탄올, 트리메틸 오르토포르메이트 및 황산과 반응시킴으로써 메틸에스테르로 변화시킨다. 그렇게 하여 얻어진 5-요오드 살리실산 메틸 에스테르는 팔라디움 존재하에서 (트리메틸실릴)아세틸렌(Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI)과 반응시킨다. 트리메틸실릴 그룹이 제거되고, 결과물인 5-아세틸레닐살리실산 메틸 에스테르의 두 개의 등가체(equivalent)를, 위에서 설명한 것처럼 팔라디움의 존재하에서 4,4'-디브로모페닐(Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI)과 반응 시킨다. 결과물인, 크리사민 G의 알킬 유사체인 4,4'-비스(2-(3-메톡시카보닐-4-하이드록시페닐)아세틸렌-1-일)-바이페닐은 상기 설명한 것처럼 에스테르의 가수분해에 의해서 제조될 수 있다.
크리사민 G의 알키닐(C≡C) 유도체와 비닐(CH=CH)유도체의 선택적인 합성
5-브로모살리실산(Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI)을 상기 설명한 것처럼 K2CO3의 존재하에서 요오드메틸과 반응시켜서 메틸에스테르/메틸에테르로 변화시킨다. 이렇게 하여 얻은 2-메톡시-5-브로모벤조산 메틸 에스테르는 팔라디움의 존재하에서 (트리케틸실릴)아세틸렌(Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI)과 반응시킨다. 트리메틸실릴 그룹이 제거되고, 그 결과물인 5-아세틸살리실산메틸 에스테르의 두 개의 등가체(equivalent)를 상기 설명한 팔라디움의 존재하에서 4,4'-디브로모바이페닐(Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI)과 반응시킨다. 결과물인 크리사민 G의 알키닐 유사체인 4,4'-비스(2-(3-카르복시-4-메톡시페닐)아세틸렌-1-일)-바이페닐은 상기 설명된 것처럼 에스테르의 가수분해에 의해서 제조될 수 있다. 이 알케닐유사체는 통상의 방법으로 환원되어 크리사민 G의 비닐 유사체가 된다.
알케닐 유도체의 또다른 합성은 1,4-디-요오드벤젠, 4,4-디-요오드페닐, 또는 다는 디-요오드 또는 디-브로모 골격 가지와 커플링(coupling)하기 위해, 2-메톡시-5-아세티닐벤조산 메틸 에스테르(또는 상기 처럼 다른 수산(hydroxy acid)유도체)의 브롬 또는 주석 유도체의 커플링에 이용되는 스즈끼 또는 스틸 반응 중에 하나를 이용할 수 있다. 어떤 경우에는 1,4-디아세틸레닐벤젠(또는 4,4-디아세틸레닐바이페닐)의 브롬이나 주석의 유도체를 만들고 이것들을 5-요오드살리실산(또는 비슷한 요오드-하이드록시산)과 커플링 하는 것이 바람직하다.
크리사민 G의 디-알키닐(C≡C-C≡C) 유도체의 합성
5-요오드살리실산(Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI)을 메탄올, 트리메틸 오르토포르메이트 및 황산과 반응시켜서 메틸 에스테르로 변형시킨다. 그렇게 하여 얻어진 5-요오드살리실산 메틸 에스테르를 팔라디움의 존재하에서 (트리메틸실릴)아세틸렌(Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI)과 반응시킨다. 트리메틸실릴 그룹은 제거되고, 결과물인 5-아세틸살리실산메틸 에스테르의 두 개의 등가체를, 상기 팔라디움의 존재하에서, 4,4'-비스(2-브로모아세틸렌-1-일)벤젠(트리메틸실실 아세틸렌과 1,4-디요오드벤젠으로부터 합성된다)과 반응시킨다. 결과물인 크리사민 G의 디-알키닐 유사체인 4,4'-비스(4-(3-메톡시카보닐-4-하이드록시페닐) -1,3-부타디인-1-일)-벤젠은 상기 설명된 것처럼 에스테르의 가수분해에 의해서 제조될 수 있다.
크리사민 G의 알켄-알키닐 (C=C-C≡C) 유도체의 합성
상기 설명된 알케닐 유도체 및 알키닐 유도체의 합성과 비슷하게, 벤젠, 벤젠, 바이페닐 또는 다른 골격구조(backbone)를 가진 군의 금속-알케닐 유도체를 2-메톡시-5-(2-요오드아세틸렌-1-일)-벤조산 메틸 에스테르(다른 비슷한 수산화산 유도체)와 결합시키기 위해서 스즈키 또는 스틸(Steel) 반응이 사용되어 질 수 있으며, 2-메톡시벤조산 메틸 에스테르의 5-금속-알케닐 유도체는 선택적으로, 1,4-비스(2-요오드아세틸렌-1-일)-벤젠 또는 4,4'-비스(2-요오드아세틸렌-1-일)-바이페닐과 결합할 수 있다.
크리사민 G의 알킬(CH2-CH2) 또는 디-알킬( CH2-CH2-CH2-CH2) 유도체의 합성
상기 설명된 알케닐, 알키닐, 디-알케닐, 디-알키닐, 또는 알켄-일키닐 중의 하나는, 수소가스와 백금 또는 팔라디움 촉매를 사용하는 표준 방법에 의해 수소화 할 수 있다.
크리사민 G의 디-플루오르 알케닐 유도체의 합성
5-프루오르 유도체인 1,4-비스(2-(2-하이드록시-3-카르복시-5-플루오르페닐)에텐-1-일)-벤젠은 3-포르밀-5-플루오르살리실산을 5-포르밀 살리실산으로 치환함으로써 합성될 수 있다. 크리사민 G의 [18F]아릴 플루오르 유도체는, [18F]LiBF4와 같은18F가 붙은 전구체(precursor) 물질을 쉬멘반응(Schiemann reaction)에서, Cs[18F] 과 트리아젠 분해를 통해서 치환하거나, 또는 친핵성18F-for-X(여기서 X는 토실, 트리플레이트(triflate), NO2,+N(CH3), 또는 할로겐이다)의 치환을 통해서 제조될 수 있다. 참조; Fowler, J. and Wolf, A. in POSITRON EMISSION TOMOGRAPHY AND AUTORADIOGRAPHY (Phelps, M., Mazziota, J., and Schelbert, H. eds.) 391-450 (Raven Press, NY, 1986) and Kilbourn, M. Flourine-18 labeling of radiopharmaceuticals. (Natl. Acad. Press, Washington, D. C.) (1990)
방향성(aromatic)의 플루오르알킬 및 플루오르알콕시 유도체의 합성
방향성 플루오르알킬 유도체는 비숍(Bishop)등의 J. Med. Chem. 34: 1612 (1991)에 나타난 방법을 적용하여 합성할 수 있는데, 여기서는 적당한 O-알릴 에테르의 클라이젠 재배치(Claisen rearrangement)에 의해서 방향성 알릴 유도체를 만들 수 있고, 나아가 플루오르에틸이나 플루오르프로필 유도체를 얻기 위해 반응을 진행시킬 수 있다. 선택적으로, 방향성 요오드는 소노가쉬라(Sonogashira) 등의 Tetrahedron Letters 4467-4470 (1975) 에 나타나 있는 팔라디움을 이용한 커플링 방법을 이용하여, 쉽게 길이방향으로 2 내지 5개의 탄소 원자를 가지는 방향성 알켄으로 변화될 수 있다. 이어지는 알킨의 유도화 작용으로 플루오르알킬 유도체를 얻을 수 있다. 플루오르알킬 유도체는 츔프라디트(Chumpradit)등의 J. Med. Chem. 36: 21 (1993)에 의해서 제조될 수 있는데, 여기서 적당한 페놀을 적당한 1-브로모(또는, 요오드 또는 술포닐록시)-오메가-플루오르알칸으로 알킬화 시키면, 대응되는 플루오르알콕시 유도체를 얻을 수 있다.
방향성 알킬 술포닐록시 및 알콕시술포닐록시 유도체의 방사 플루오르화(Radiofluorination)
방향성 [18F]플루오르알킬 및 [18F]플루오르알콕시 유도체를 만들기 위한, 방사 플루오르화는 매티스등의 Nucl. Med. Biol. 19: 571 (1992) 의 방법에 의해서 실행할 수 있는데, 여기서는 방향성 알킬- 또는 알콕시술포닐록시 (즉, 알콕시토실레이트) 유도체는 [18F]플루오르와 치환되어, 방향성 [18F]플루오르 알킬과 [18F]플루오르알콕시 화합물이 된다.
트리알킬 주석 경로를 통한 방사성-요오드화 및 방사성-브롬화
트리알킬 주석 유도체의 합성
크리사민 G의 일케닐 트리알킬 주석 유도체의 일반적인 구조는 도 2B에 나타나 있다. 일반적으로 트리-알킬 주석 그룹은 바이페닐의 반쪽영역의 3번 위치에서 치환될 것이다. 그러나, 살리실산 또는 비균일고리(heterocyclic) 반쪽영역을 포함하는 다른 위치도 잠재적인 목표가 된다. 이러한 트리-알킬 주석유도체는 사람에게 사용하기 위한 방사성 요오드화 화합물 또는 방사성 브롬화 화합물의 제조에 있어서, 안정된 즉각적인 전구자이다. 좀 더 상세하게는, 이러한 트리-알킬 주석유도체들은 생체 내에서 녹말체를 형상화하는 투여에 이용 가능한, 할로겐화 방사활성 화합물의 제조에 이용된다.
트리-알킬 주석유도체 합성의 일반적인 과정
트리-알킬 주석 유도체들은 적당한 아릴할라이드,[(C6H5)3P]3Pd(0)과 헥사알킬 디틴(주석)을 기존의 문헌에 나타난 방법에 의해서 제조할 수 있다. 문헌들은 다음과 같다. Kosugi, M., et al., Chem. Lett. 1981: 829; Heck, R. Pure and Appl. Chem. 1978: 691; Echavarren, A. and Stille, J. J. Am. Chem. 1978: 5478; Mitchell, T. J. Organometallic Chem. 1986: 1; Stille, J. Pure and Appl. Chem. 1985: 1771. 이러한 유도체들은 또한 n-BuLi 와 트리알킬 주석 염소를 사용하여 Mathis et al., J. Labell. Comp. and Radiopharm. 1994: 905에 나타난 방법에 의해 제조될 수 있다.
4,4'-비스(3-메톡시카보닐-4-하이드록시페닐아조)-바이페닐의 합성
3-브로모 또는 3-요오드-4,4'-비스(3-메톡시카보닐-4-하이드록시페닐아조)-바이페닐 또는 이의 디메틸 에테르는 3-브로모- 또는 3-요오드벤젠의 합성(상기 참조), 4가 질소화(tetra-azotization) 및 크리사민 G를 합성하기 위한 메틸 살리실레이트로의 커플링, 및 메톡시 화합물이 필요한 경우는, 상기 설명된 것처럼 페놀의 메틸화에 의해서 제조될 수 있다. 아르곤 기체로 채워진 조건에서, 1mmol의 페놀 에스테르 또는 메톡시 에스테르[(C6H5)3P]3Pd(0) (0.1에서 0.2 mmol), 헥사부틸 디틴 또는 헥사메틸 디틴 (1.25 mmol), 다이옥산(25ml)을 70℃에서 한 시간 동안 가열한다. 혼합물을 냉각시키고, 용매를 증발시킨다. 트리알킬 주석 할라이드는 수용성 KF에 의해서 제거할 수 있다. 유기물들은 에틸 아세테이트로 추출하고, 황산마그네슘에서 건조 한 후 용매는 감압하에서 증발시킨다. 잔여물을 실리카겔로 정제하여 3-트리알킬주석-4,4'-비스(3-메톡시카보닐-4-하이드록시페닐아조)-바이페닐을 얻는다.
트리알킬 주석 유도체의 방사-요오드화 또는 방사-브롬화
트리부틸 또는 트리메틸 주석 유도체는 기존의 문헌에 나타난 방법에 의해서 Na[125I] 또는 Na[123I]로 방사-요오드화 되고, Na[75Br] 또는 Na[76Br]로 방사-브롬화 된다. Mathis et al., J. Labell. Comp. and Radiopharm. 1994: 905; Chumpradit et al., J. Med. Chem. 34: 877 (1991); Zhuang et al., J. Med. Chem. 37: 1406 (1994); Chumpradit et al., J. Med. Chem. 37: 4245 (1994). 일반적으로, 0.5mg의 트리 알킬 주석 화합물, 0.2ml의 무수아세토니트릴, 10μl의 2M H3PO4, pH 2-12의 NaOH에서 고활동도(2000Ci/mmol 이상)를 가지는 Na[125I] 또는 Na[123I] (또는 Na[75Br] 또는 Na[76Br]) 1-100μl, 및 디클로로아민 T(DCT) (아세토니트릴 내에서 2.5mg/ml의 농도를 가지는 20μl) 들을 1ml의 방사성 플라스크에 놓아둔다. 유리 플라스크는 뚜껑을 덮어두고, 혼합물을 상온의 어두운 곳에서 저어준다. 반응은 HPLC에 의해서 기록되고, 30분 후에 2M의 Na2S2O350μl를 넣어 반응을 억제시킨다. 그 생성물은 표준의 크로마토그래피 기술로 정제시킨다[참고 Mathis et al., J. Labell. Comp. and Radiopharm. 1994: 905.]. 비슷하게 낮은 방사성 활성도를 가진18F 유도체들도 비슷한 과정으로 제조된다.
비 방사성 I, Br, Cl, F 및 -SH 유도체의 제조를 위한 일반적인 과정
일반적으로, 5-포르밀 살리실산의 3- 또는 4-아미노 유도체들 또는 이에 대응되는, 도 2에 나타난 것과 같은 살리실산의 헤테로사이클릭형의 유사체의 유도체는, 질산나트륨 및 염산 또는 황산과 반응하여, 이에 대응되는 디아조 화합물로 변형된다. 요오드 유도체들은 디아조늄 요오드를 형성하면서 직접 제조되고, 이것은 아릴 요오드로 변형되거나 또는 트리아젠 중간체를 거친다. 참조 Greenbaum, M. Am. J. Pharm. 108: 17 (1936), Satymurthy, N. 및 Barrio, J., J. Org. Chem. 48: 4394 (1983) 및 Goodman, M. et al., J. Org. Chem. 49: 2322 (1984). 브롬화 및 염화 아릴은 샌드마이어 반응, 또는 요오드 유도체의 경우는 트리아젠을 통해 CuCl또는 CuBr과 반응시켜 다이아조 화합물로부터 제조된다. 플루오르화 아릴은, 요오드 유도체와 비슷하게, 지멘반응 또는 트리아젠 분해를 통해 디아조늄 화합물을 NaBF4, HBF4, NH4BF4와 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 아릴 티올은 디아조늄 화합물을 HS-, EtO-CSS-및 S2 2-와 같은 황을 포함하는 친핵성(nucleophile) 인자들과 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 선택적으로, 아릴 티올은 아릴 할라이드를 황을 포함하는 친핵성인자들과 교체함으로써 제조할 수 있다. 이러한 반응들은 MARCH, J., ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY: REACTIONS, MECHANISMS, AND STRUCTURE (3rd Edition, 1985)에 나타나 있다.
방사성 C, F 및 Tc 유도체의 합성의 일반적 과정
상기 과정에 더해서, 높은 특이적인 방사표지가 붙은 스펙트럼에 쓰이는99mTc, 또는11C,18F,75Br 및76Br 와 같은 양성자 방출 방사성 원소들을 가지는 것들은 당업자들에 의해서 기존의 문헌을 통해서 쉽게 실행될 수 있다. 몇 개의 중요한 방법들이 아래에 설명되어져 있지만, 당업자에게는 자명한 그 외의 잘 알려진 방법들인 Fowler, J. and Wolf, A. Positron emitter-labelled compounds in POSITRON EMISSION TOMOGRAPHY AND AUTORADIOGRAPHY (Phelps, M., Mazziota, J., and Schelbert, H. eds.) p 391-450 (Raven Press, NY) (1986), Coenen, H. et al., Radiochimica Acta 34: 47 (1983), 및 Kulkarni, Int. J. Rad. Appl. ＆ Inst. (Part B) 18: 647 (1991) 에 의해서 제조되며, 그 내용들은 여기서 참고문헌으로 인용되었다.
99mTc 유도체들은 아릴티올과의 혼합으로 제조될 수 있다.11C 원소를 붙이는 것은 상기 설명된 것처럼 적당한 알킬, 알케닐, 알키닐 크리마센 G 의 유사체의 [11C]메틸 요오드, [11C]알킬화, 또는 [11C]카르복실화를 상기 처럼 치환함으로써 N-메틸화, O-메틸화를 통해서 쉽게 제조될 수 있다. [18F]아릴 플루오르 유도체는, 상기 설명된 지멘 반응의 [18F]LiB4와 같은18F라벨이 붙은 전구자를 치환함으로써, Cs[18F]로 트리아제을 분해함으로써, 또는 친핵성18F-for-X 치환(여기서 X는 토실, 트리플레이트, NO2,+N(CH3)3, 또는 할로겐이다)에 의해서 제조될 수 있다.75Br 및76Br를 사용한 방사브롬화는 통상의 방사요오드화 기술과 유사한 전자친화성 (electrophilic; Br+) 또는 친핵성 (Br-) 유도체 기술중의 하나를 이용하여 할 수 있다.참조 Coene, H. supra.
3-하이드록시-1,2-벤지속사졸 유도체 및 그 관련 유도체의 합성(도 2C 참조)
2,6-디하이드록시벤조산 (γ-레조사이클산) 메틸 에스테르 (TCI America, Portland, OR)는 보샤겐의 방법(Chem. Ber 100: 954-960;1967)에 의해서 하이드록시아민 염산으로 변형된다. 하이드록사민산은 SOCL2및 트리에틸 아민을 사용하여 그에 대응하는 는 3-하이드록시-1,2-벤지속사졸로 변한다. 역시 보샤겐의 방법(Chem. Ber 100: 954-960;1967)에 의한다. 이 화합물은 그 후에 포르밀 유도체로 변하고 알케닐 유도체의 합성에서 언급한 것처럼 그후 적당한 테트라에틸 포스포네이트(경우에 따라서는 브롬화 할 수도 있다)로 변형된다. 브롬 유도체는 상기 언급한 것처럼 트리알킬 주석이나 요오드 유도체로 변형된다.
선택적으로, 5-포르밀 살리실산은 통상 적당한 테트라에틸 포스포네이트와커플링하고, 그 결과물인 4,4'-비스(2-(3-카복시-4-하이드록시페닐)에텐-1-일)-벤젠은 먼저 디메틸 에스테르로 변하고, 이어 하이드록사민산으로 변한 후 최종적으로 상기 설명한 보샤겐 방법에 의해서 벤지속사졸로 변한다. 3-하이드록시-1,2-벤지속사졸의 세 번째 형태는 4,6-디하이드록시-1,3-벤젠디카르복실산, 3,6-디하이드록시프탈산, 및 2,5-디하이드록시프탈산 (Aldrich Chem. Co., Milwaukee, WI)을 포함하는 몇 개의 이성질 디하이드록시 벤젠디카르복시산으로부터 제조된다. 일반적인 방법에 의한 포르밀화와 적당한 테트라에틸 디포스포네이트와의 커플링 후에 디메틸 에스테르로 변화시키고, 디히드록시/디에스테르는 상기 설명된 보샤겐 방법에 의해서 디하이드록시/디하이드록사믹 산으로 변한다. 2중 벤지속사졸의 변형은 역시 상기 설명된 보샤겐 방법에 의해서, SOCl2와 트리메틸아민으로의 처리에 영향을 받는다.
프탈리미드 또는 이소인돌-1,3(2H)-디온 유도체의 합성(도 2D 참조)
3-하이드록시프탈리미드는 상기 알케닐유도체의 합성에서 설명된 것처럼 3-하이드록시프탈릭 안하이드라이드(Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI)를 포르밀 유도체로 변형시키고, 적당한 테트라에틸 디포스포네이트(이것은 때로 브롬화할 수도 있다)와 커플링하여 제조한다. 브롬 유도체는 그 후 상기처럼 트리알킬 주석 및 요오드유도체로 변형될 수 있다.
프탈하이드라자이드 또는 2,3-벤조디아진-1,4(2H,3H)-디온 유도체의 합성 (도 2E 참조)
3-하이드록시프탈하이드라자이드는 3-하이드록시프탈릭 안하이드라이드 (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI)와 하이드라진을 반응시키고, 이를 포르밀 유도체로 변형시키고, 적당한 테트라에틸 디포스포네이트(이것은 때로 브롬화 할 수도 있다)와 커플링한다. 브롬 유도체는 그 후 상기처럼 트리알킬 주석 및 요오드 유도체로 변형될 수 있다.
2,3-벤족사진-1,4(3H)-디온 유도체의 합성 (도 2F참조)
3-하이드록시프탈릭 안하이드라이드(Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI)를 하이드록실아민을 사용하여 2,3-벤족사진으로 변형시킨다. 벤족사진 유도체는 그 후 이를 포르밀 유도체로 변형시키고, 적당한 테트라에틸 디포스포네이트(이것은 때로 브롬화 할 수도 있다)와 커플링한다. 브롬 유도체은 그 후 상기 처럼 트리알킬 주석 및 요오드 유도체로 변형될 수 있다.
(2H)1,3-벤족사진-2,4(3H)-디온유도체의 합성 (도 2G 참조)
이 화합물은 에펜베르게르 등의 방법에 의해서 합성될 수 있다. Effenberger et al., (Chem. Ber. 105: 1926-1942; 1973). 간단히 설명하면, 4-하이드록시벤즈알데하이드(Aldrich)를 포르밀살리실산 유도체의 합성에서 사용된 것과 동일한 과정을 통해서, 적당한 테트라에틸 디포스포네이트와 커플링한다. 이 부가물(adduct)은 그 후, 트리에틸아민의 존재하에서 에톡시카보닐이소시아네이트(O=C=N-CO-O-Et)와의 반응에 의해서, 카바메이트(carbamate)로 변형된다. 이 치환된 카바메이트(또는 N-에톡시카보닐-카바믹산-페닐 에스테르)는 디페닐 에테르 안에서 가열되어, 벤족사진디온으로 변형된다. 벤족사진디온은 상기처럼 트리알킬 주석 및 요오드 유도체로 변형된다.
(3H)2-벤자진-1,3(2H)-디온((3H)2-benzazine-1,3(2H)-dione) 유도체의 합성 (도 2H 참조)
3-하이드록시페닐아세트산(Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI)을 포르밀화하고, 아미드로 변형시킨 후, 포르밀산 유도체에 사용했던 과정과 동일한 과정을 통해서 적당한 테트라에틸 포스포네이트와 커플링시킨다. 이 부가물(adduct)을 에틸 클로로포르메이트와의 반응시켜서 N-(3-하이드록시페닐아세톡시)-카바믹산 에틸 에스테르로 변형시킨다. 이 치환된 카바마이트를 디페닐 에테르에서 가열시킴으로써 벤자진디온으로 변형시킨다. 벤자진디온은 상기처럼 트리알킬 주석 및 요오드 유도체로 변형시킨다.
1,8-나프탈이마이드 유도체의 합성 (도 2I 참조)
4-아미노-1,8-나프탈아미드를 포르밀 유도체로 변형시키고, 상기 알케닐 유도체의 합성에서처럼, 적당한 테트라에틸 디포스포네이트(이것은 때로 브롬화 할 수도 있다)와 커플링한다. 브롬 유도체는 그 후, 상기처럼 트리알킬 주석 및 요오드 유도체로 변형될 수 있다.
테트라졸 및 옥사디아졸 유도체의 합성 (도 2J 및 2K 참조)
2-시아노페닐(Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI)을 하기 문헌에 따라 나트륨 또는 알루미늄 아자이드(azide)와 반응시켜서 테트라졸로 변형시킨다[Holland and Pereira J. Mwd. Chem. 10: 149 (1967) 및 Holland U. S. Patent No. 3,448,107]. 간단히 설명하면, 크리사민 G의 2-시아노페놀 또는 알케닐 시아노페놀 유도체(4-포르밀-2-시아노페놀을 적당한 테트라에틸 디포스포네이트와 커플링하여 만들어진다) 1mmol을 40ml의 DMF안에서, 아르곤가스 하에서 나트륨 아자이드(10 mmol) 및 트리에닐아민 염산(10 mmol)으로 처리하였다. 혼합물을 120℃에서 1시간 동안 저어주고, 그 후 혼합물을 냉각시킨 후, 상기 크리사민 G와 비슷한 방법으로 처리하였다.
옥사디아졸은 상기처럼 제조된 테트라졸을 산성 안하이드라이드(예, 아세틱안하이드라드)와 처리하여 제조한다. 다른 방법은 Bamford et al., J. Med. Chem. 38: 3502 (1995) 에 나타나 있다. 이 과정에서는 크리사민 G 또는 살리실산의 하이드라자이드 알케닐 유도체(각각의 에스테르를 하이드라진과 처리하여 얻어진다)를 디시클로헥실카르보디이마이드(dicyclohexylcarbodiimide)의 존재 하에서 메틸 이소시아네이트와 처리하여 얻어진다.
대조군(controls)으로 이용하기 위한 크리사민 G 유도체의 합성
아닐린 유도체는 두개의 아닐린 등가체(Fisher Chemical Co., Fair Lawn, NJ)를 각각의 벤지딘 등가체와 치환함으로써 얻어진다. 2,2'-디술포닉산 유도체는 벤지딘-2,2'-디술포닉산(Pfaltz ＆ Bauer, Inc., Waterbury, CT)을 벤지딘으로 치환함으로써 합성될 수 있다. 페놀 유도체는 하나의 페닐 등가체를 각각의 살리실산 등가체로 치환함으로써 얻어진다. 콩고 레드(Congo red; 알드리히에서 확인한 등급)는 상업적으로 얻어진다.
실시예 2
크리사민 G 및 크리사민 G 유도체의 Aβ와의 특이적인 결합
합성 Aβ(10-43)와의 결합
크리사민 G는 시험관 내에서 합성의 Aβ(10-43)와 잘 결합한다. 더 높은 친화성 인자는 0.257μM의 KD및 3.18nmol 크리사민 G/mg Aβ(10-43)의 Bmax를 가진다. 더 낮은 친화성인자는 이 데이터로는 잘 정의되지 않지만, 4.01μM의 KD및 18.7nmol 크리사민 G/mg Aβ(10-43)의 Bmax를 가는 것을 보인다. 낮은 친화성 인자는 크리사민 G의 구분될 정도로 높은 농도에서의 결합, 낮은 친화성 위치를 나타내며, 제조에서 불순물과 반응하지 않음을 나타낸다. 생체내로 투입된(in vivo) 크리사민 G의 양이 워낙 적어서, 낮은 친화성 인자와의 결합이 없다. 매우 낮은 농도에서, 높은 경우 대 낮은 경우의 비율은 매우 크다. 크리사민 G의 결합의 양은 도 5에서 보는 것처럼 제안된 범위에 걸쳐 펩티드에 대해서 선형을 나타낸다.
결합 속도
속도 연구는 비교적 빠른 결합(association)을 보여주며(도 6A), 본질적으로 1분에 완료되고, [크리사민 G]=112μM에서 8.9±1.8 초의 t1/2및 좀 덜 빠른 분해(도 6C)에서 t1/2=55±9.4 초이다[분해율 상수 (K-1)=1.26×10-2초-1]. 도 6은 베네트와 야마무라 방법에 따른 결합속도의 변환을 보여준다 [Bennet, J. P. and Yamamura, H. I. in NEUROTRANSMITTER RECEPTOR BINDING (N.Y.: Raven Press 1985) pp. 61-89. 도 6A에서의 결합커브의 직선비율은 도 6B의 직선으로 변형되는데 여기서, ln[Beq/(Beq-Bt)] 는 시간에 대비해서 표로 그려지고, Beq는 평형에서(4분) 크리사민 G의 결합의 양이며, Bt는 시간=t에서 결합의 양이다. 이 선의 경사는 kobserved및 k1=(kobserved-k-1)/[크리사민 G]이고, 여기서 k-1은 도 6C 에서의 데이터로부터 결정되는 분해비율상수이다. 도 6C에서 곡선은 다음식을 따른다:
At=A0e-k-1t
여기서, At는 시간 t에서 크리사민 G의 남은 결합의 양을 나타내며, A0는 시간=0 에서의 크리사민 G의 결합의 양이고, t는 분단위의 시간이며, k-1은 분해비율 상수이다. 이러한 분석으로부터, 스캐차드 분석(Scatchard analysis)과 잘 일치되게, 분해비율 상수 (k1)은 3.75×104M-1초-1로 계산되며 KD= k-1/k1= 0.34 μM을 나타낸다.
크리사민 G의 유도체는 크리사민 G가 Aβ와 결합하는 것을 막을 수 있다
크리사민 G의 유사체에 의한 [14C]크리사민 G가 Aβ(10-43)와 결합하는 것을 억제하는 것에 대한 값인 Ki값은, 도 1에서 화학구조 하에서 보여지며, 몇 개의 변위 곡선은 도 3에 나타나 있다. Ki는 IC50/(1+[L]/KD)로 정의되며, [L]은 시험에서의 [14C]크리사민 G의 농도를 나타내고(.100-.125 μM), 크리사민 G의 KD는 상기 스캐챠드 분석에 의해서 결정된다. 크리사민 G 자체로 0.37±0.04μM 의 Ki값을 주는데, 이는 스캐챠드와 속도 분석에서 얻어진 값과 상응한다. 콩고 레드는 2.82±.84μM의 Ki값을 가진다. 크리사민 G의 디플루오르 유도체, (5-FSA)CG (도 1)는 크리사민 G 자체 (Ki=1.16±0.19μM)보다 3분의 1만큼 효능이 있다. 디플루오르 크리사민 G의 활동도에서,18F디플루오르 유도체는 PET형성에 작용을 하며,19F디플루오르 크리사민 G 유도체는 뇌의 MRS/MRI형성에 작용한다는 것을 의미한다.
3-ICG는 크리사민 G 보다 약간 더 효능이 있다. 3-ICG의 활동도는123I디플루오르 크리사민 G 유도체가 SPECT 형상화에 작용한다는 것을 암시한다. 3-ICG의 페놀의 메틸화는 3-ICG(OMe)2에서 10의 비율로 친화성을 감소시킨다. 카르복실레이트 그룹을 메틸화하는 것은 3-ICG(COOMe)2에서 친화성을 훨씬 크게(약 200배) 감소시킨다. 페놀 유도체에서처럼 산의 반쪽을 완전히 제거하면, 결합 친화성을 완전히 파괴한다.
이러한 결과들은, 크리사민 G 유사체에서 산의 반쪽 부분은 Aβ에 결합하는 데 중요한 역할을 하며, 페놀의 반쪽 부분은 유용하게 하는 역할을 하는 것을 암시한다. 페놀의 효과는 수소를 산에 결합시키는 데서 발생하는데, 이는 산의 반쪽을 구조적으로 안정화하는 데에서 발생한다. 오르토 위치에서 페놀의 존재는, 수소결합을 통해서 또는 방향성 구조 전체를 통한 전하 분포의 변화를 통해서, 산의 전하분포를 변화시킨다. 선택적으로 페놀은, 아밀로이드의 결합 위치에 페놀 및 산이 양날톱니모양으로 붙어서, 아밀로이드와 결합하는 데 직접적인 역할을 한다. 레조사이클릭산 유도체,(6-OHSA)CG 에서 처럼, 카르복실레이트의 오르토 위치에 2차 페놀을 결합하는 것은 0.094±.2 μM의 K1을 가지는 군들 중에서 가장 높은 친화성 화합물을 만든다. 바이페닐 골격의 지질친화성(lipophilicity)을 증가시키는 것은, 친화성을 어느 정도 높이는 것으로 보인다. 디-할로 유도체인 3,3'-I2CG, 3,3'-Br2CG, 및 3,3'-Cl2CG 모두는 비슷한 Ki값을 가지는데 이것은 크리사민 G의 값의 반 정도이다.
2-위치에서의 치환에 의한 바이페닐 그룹의 페닐링들 사이의 2면각의 찌그러짐은 친화성을 상당히 감소시킨다. 이것은 크리사민 G의 2,2'-디-술폰산 유도체인 2,2-(SO3)2CG의 불활성에 의해서 예증된다. 3,3'-디-카르복실릭 유도체인 3,3'- (COOH)2CG는 크리사민 G로부터의 활동도의 7배의 감소가 있기 때문에, 부가된 산의 반쪽들은 2,2'-디술폰산에서 독자적인 활동도의 감소를 나타내는 이유처럼 보이지는 않는다. 이러한 2,2'- 유도체는 2- 위치에서 거대한 술폰화 그룹이 바이페닐 그룹을 평면 밖으로 밀어낸다는 점에서 특이하다. 분자 모델링 연구는 2,2'-디술폰산 유도체에서 두 개의 바이페닐 벤젠 고리의 이면각이 83℃임을 보인다.
크리사민 G의 작용기의 양날톱니성의 성질의 중요성을 연구하기 위하여, 크리사민 G 분자의 2분의 1을 나타내는, 아닐린 유도체의 결합(도 1)을 연구하였다. 대략적인 결합에너지는 다음식으로 계산 될 수 있다:
△G = -RTlnKeq
여기서, △G는 결합반응의 에너지이며, R은 분자가스 상수[8.31441J/ mole·°K] 이며, T는 °K단위의 온도이고, Keq는 반응의 평형상수이다:
[탐침(probe)]+[펩티드]↔[탐침·펩티드]
및 Keq=1/ KD Ki이다. 크리사민 G의 KD에 대한 0.26μM의 값을 이용하면, 결합에너지는 대략 38KJ/mole 이다. 아닐린 유도체가 이 에너지의 반만큼 결합한다면 기대되는 결합에너지는 19KJ/mole 이 될 것이다. 아닐린 유도체에 대한 73μM의 Ki로부터 결합에너지는 23KJ/mole이 되는데 이는 예견된 값과 수긍할 수 있을 정도로 일치한다. 크리사민 G 및 아닐린 유도체의 반수성(hydrophobic)영역의 중요성은 살리실산 자체의 결합활성의 전체적인 부족에 의해서 예증될 수 있다.
Aβ에 대한 크리사민 G의 친화성은, 콩고 레드가 이에 대한 친화성에 비해서 몇 배나 더 높음을 보인다. 스캐챠드 분석, 속도 방법, 결합 억제에 의하든 대략 250-400 nM의 분해상수를 가지면서, 그 결합은 가역적이다. 아밀로이드 섬유의 비결정성이고, 잘 녹지 않는 성질 때문에, 콩고 레드나 크리사민 G의 아밀로이드와의 혼합물은 X-ray 결정법, 또는 다중차원 NMR 과 같은 정확한 기술에 의해서도 정확한 구조가 밝혀지지 않았다. 콩고 레드의 아밀로이드와의 내부작용은 다음과 같이 제안되었다. Cooper, Lab. Invest. 31: 232 (1974); Rpmhanyi, Virchows Arch. 354: 209 (1971). 이러한 일들은 콩고 레드는 단일의 아밀로이드 펩티드와는 결합하지 않지만, 베타-쉬트(beta-sheet) 섬유를 지향하는 몇 개의 Aβ분자를 가로질러서는 결합함을 나타낸다. Klunk et al., J. Histochem. Cytochem. 37: 1273 (1989).
도 7은 메크로모델 2.5(MacroModel 2.5)를 사용하여 만들어낸 이러한 모형의 개략적인 모습을 나타낸다. 여기서 크리사민 G는 반병렬(anti-parelled)의 베타 쉬트 형태에서, 5개의 펩티드 체인에 걸쳐 있다. 그 텝티드들은 더 이상의 구조적인 재정제(refinement) 없이 사용되었다. 펩티드들이 일렬로 정렬되어 있으므로, 선택적인 체인들은 베타-쉬트 섬유의 특징인 4.76Å만큼 떨어져있다. 선택적인 펩티드 체인들은 검정과 흰색으로 그려져 있다. 크리사민 G(검정)는 에너지가 최소화되고, 리신-16(lysine-16)(꼭대기의 그림에서 밝은 회색의 계란형) 및 19/20영역의(바닥) 반수성 페닐알라닌과의 접촉을 최대로 하기 위해, 섬유 모델과 일렬로 정렬되어 있다. 두 개의 그림은 각각에서 대략 90°에서 보면 동일하다. 흰색 화살표는 선택적인 모습을 보는 방향을 가리킨다.
크리사민 G의 카르복시산들 사이의 19.1Å 간격은 5개 체인을 관통하는 19.0Å거리와 대응된다(이웃한 체인들의 4×4.76 Å은 Kirschner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 503 (1986)에 나타나 있다.). Aβ의 타고난 구조가 힐비히 등의 머리핀 루프 구조(즉, Hilbich et al., J. Mol. Biol. 218: 149(1991)를 보라)를 포함한다면, 체인 1 및 2, 3 및 4, 5 및 6, 등은 같은 분자의 반으로 접혀지지만, 그렇지 않은 경우는 동일할 것이다. 마찬가지로 주목해야 할 중요한 것은, Aβ에서 리신-16과 같은, 이 모델에서 양전하를 띠는 아미노산의 잔여물이다. 종래의 업적들은, 콩고 레드의 결합은 아밀로이드 섬유의 샘플에서 양전하를 띠는 아미노산의 수와 잘 일치한다고 하고 있다. Klunk et al., J. Histochem. Cytochem. 37: 1273 (1989). 도 7에서 모델의 양날톱니성의 성질 및 반수성 작용의 중요성은 벤지딘의 반쪽에 두 개의 할로겐을 가진(도 1 참조) 더 동결건조 된 화합물의 효능의 증가뿐만 아니라, 단일 톱니형의 크리사민 G의 아닐린 유사체의 친화성의 감소 및 살리실산의 불활성에 의해 지지된다. 거의 평면형의 바이페닐 그룹의 중요성은 2,2'-다이술폰산 유도체의 비활성에 의해 암시된다.
실시예 3. 크리사민 G는 정상뇌와 알츠하이머병 뇌를 구별한다.
AD 뇌 표본에 크리사민 G와 크리사민 G 유도체 결합의 스캐챠드 분석은 AD뇌에 대한 크리사민 G의 증가된 결합을 이해하기 위해 실시하였다(도 4B, 표 1). 이용된 조건하에서, 대조 및 AD 뇌는 단일 결합 성분을 보여 주었다. AD 뇌에서 KD는 대조보다 낮은 16% 이었지만, 그 차이는 크지 않았다(p=.29). AD 뇌에서 Bmax는 대조 뇌에서 Bmax보다 높은 36% 이었지만, 그 차이가 중요한 정도에 이르지는 않았다(p=.09). 그러므로, 독특한 성분보다는 오히려 대조 뇌에 존재하는 동일한 결합 성분이 존재하기 때문에, AD 뇌에서 주로 증가된 결합이 나타난다.
AD 뇌 및 대조 뇌에서 결합 변수들의 비교
KD(μM) Bmax(pmol/㎍ prot)
대조(n=6) 0.47 ± .049 0.576 ± .092
AD (n=5) 0.39 ± .048 0.784 ± .061
AD 뇌에 CG 뇌의 결합은 뇌의 연관 피류(cortices)에서 NPs의 개수와 상당히 상관이 있었다. 도 8a는 AD 뇌의 상부/중간 전두골 및 상부 측두골 피질(cortex)에서 NPs의 개수와 결합하는 [14C]CG의 상관을 도시한다. NPs와의 상관은 대조가 포함되던지(r=0.69; p=0.001) 또는 AD 뇌가 홀로 간주된다면 상당하다(r=0.59; p=0.007). 도 8b는 NFT 계산치와 유사한 상관을 도시한다. NPs로부터, NFTs와의 상관은 대조가 포함되던지(r=0.60; p=0.001) 또는 AD 뇌가 홀로 간주되던지 상당하다(r=0.50; p=0.026)는 것을 알 수 있다. NFTs와의 상관은, CG가 NFTs를 착색하는 콩고 레드(Congo red)의 유도체이므로, 놀랄만하지는 않다. NPs의 개수는 NFTs의 개수와 상당히 상관되어 있었다(r=0.82; p=.0001).
아밀로이드 혈관병증(angiopathy)의 존재 유무의 질적(qualitative) 자료만이 이 연구조사에 사용되는 뇌에 유용하여서, 유사한 상관이 CG 결합층과 뇌혈관성 아밀로이드 층 사이에서 수행될 수 없다. 아밀로이드 혈관병증의 존재는 NP 계산치와 결합하는 CG의 상관에서 혼동 변수가 나타난다. 도 8a는 뇌혈관성 아밀로이드 침착물(r=0.49; p=0.15)이 있는 뇌와 비교하여 아밀로이드 혈관병증(r=0.79; p=0.01)이 없는 뇌에서 NP 계수치에 결합하는 CG의 향상된 상관을 도시한다. 유사한 향상은 NFT 계산치와의 상관에서는 발견되지 않았다.
AD 뇌에 결합하는 [14C] 크리사민 G 결합용 KD는 시험관 내에서 합성 Aβ에 결합하는 [14C] 크리사민 G를 위한 뇌 균등질에서의 결합이 Aβ와의 상호작용을 나타내는 것을 시사한다는 것과 유사하다. NFTs에 결합하는 크리사민 G의 상관은 크리사민 G가 뇌 균등질에서 뿐만 아니라 NFTs 구성에 결합한다는 것을 나타낼 수 있다. 또 다르게, NFTs의 개수가 NPs의 개수와 밀접하게 상관되어 있으므로, NFTs에 결합하는 [14C] 크리사민 G는 NPs에 결합하는 크리사민 G의 부대 징후가 될 수 있다.
여기에서 제공된 유용한 크리사민 G 유도체 또는 동족체는 합성 Aβ 펩티드 또는 알츠하이머 병의 뇌조직 중의 하나에 결합함으로써 측정되어 적어도 0.01∼10.0μM KD내의 범위에 있는 결합 친화력을 가지고 있고; 0.0001∼0.01μM의 범위에서 결합 친화력을 가지고 있는 고친화 화합물은 본 발명의 방법에도 유용하다.
상술한 바와 같이, 결합하는 크리사민 G는 Aβ에 특이하지 않아도 된다. 대신에, 결합하는 크리사민 G는 신경성 반점(plaques) 및 뇌혈관성 아밀로이드에서 Aβ의 응집된 침착물로 구성된 뇌의 총 아밀로이드 "부하(load)"를 반사할 수 있다. NFTs에서 인산화된 타우(tau) 단백질의 침착물은 게다가 크리사민 G에도 기여할 수 있다. Goedert, M. et al., PNAS 85: 4051(1988). NFTs도 Aβ의 원섬유(fibrils)의 4기 구조와 유사한 비평행 베타-시트(beta-sheet) 원섬유로 구성된다. Kirschner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 503(1986).
결합하는 총 및 비교적인 크리사민 G에 의해 정상 뇌와 AD 뇌의 구별
상술하고 후술할 시험관 내에서의 결합 시험은 생체 내에서 결합하는 화합물을 영사(screen)하고 생체 내에서 영상 연구에 연이어서 성공을 예측하기 위한 모델로서 당업계에서 광범위하게 사용된다. POSITRON EMISSION TOMOGRAPHY AND AUTORADIOGRAPHY(Phelps, M., Mazziota, J., and Schelbert, H. eds.) pp. 73-111(1986)에서, Young, A. et al., Receptor Assays: 시험관 내에서 및 생체 내에서(In Vitro and In Vivo)를 참조한다. 본 발명의 라벨이 붙어 있는 크리사민 G 및 크리사민 G 유도체는 생체검사 또는 사후 표본에서 아밀로이드 침착체의 양을 측정하기 위해 상술하고 후술할 시험관 내에서 결합 시험에 사용될 수 있다.
[14C] 크리사민 G의 포화(특이) 결합이 AD 뇌 균등질 및 대조 뇌 균등질 모두에서 관찰되었고, AD 뇌에서 총결합의 60-80%을 구성하였다. 불포화 결합도 AD 뇌 및 대조 뇌에서 매우 유사하였다. 포화 결합 및 총 결합 모두다 대조에서 보다는 AD 뇌에서 컸었다. 총 결합을 사용하는 경우에 낮은 감도를 얻게 됨에도 불구하고, 이 변수로 본 발명의 최종 목적인 생체 내에서 연구 조사의 성공이 한층 더 확실하게 예측된다. 또한, 생체 내에서 연구의 연장을 위해서는, 피질 영역에서 결합하는 크리사민 G는, 이 결합 크리사민 G가 AD 뇌 및 대조 뇌 모두와 매우 유사한 뇌 영역으로 정상화되는 경우에 유리하다. 이로 인해, 생체 내에서 계산하기가 어려운 절대량 한정을 계산할 필요를 미연에 방지한다. 전형적인 NPs가 이 뇌 영역에서 굉장히 드물기 때문에, 잠재적인 대조로서 소뇌에서의 결합을 시험하였다(Joachim et al., Am. J. Pathol. 135: 309(1989)).
대조 소뇌에 결합된 [14C] 크리사민 G의 평균량은 내부 대조로서 소뇌의 사용을 지지하는 AD 소뇌에 결합량과 거의 동일하다(표 2). 그러므로, 소뇌의 비(cerebellar ratio: CBR)는 결합된 크리사민 G의 절대량을 정확하게 반사하고, 각 뇌에서 내부 대조를 제공하는 이점을 제공한다. fmol/㎍ 단백질의 "절대"라는 용어로 표현되거나(표 2) 동일한 뇌의 소뇌에서 결합에 대한 비로서 표현되던지(표 3), AD 뇌에서의 결합은 보다 커진다. 이 CBR은 보다 민감한 측정이고, 뇌들 사이에서 낮은 변이를 나타낸다. 총 결합 및 CBR의 사용으로 생체 밖에서의 확대 결과 및 생체 내에서의 확대 연구가 상당히 용이해진다. 따라서, 이들 결과를 적절한 용어로 하기에 나타낸다.
AD 뇌와 대조 뇌의 총 결합의 비교
뇌 영역 대조(CBR) AD(CBR) p 값
전두폴(pole) 0.87 ± .04(n=6) 1.87 ± .25(n=10) p ＜ 0.004
상부/중간 전두골 0.73 ± .02(n=8) 1.84 ± .18(n=11) p ＜ 0.001
상부 측두골 0.86 ± .08(n=8) 1.63 ± .17(n=11) p ＜ 0.002
미형의(caudate) 머리 0.95 ± .04(n=4) 1.76 ± .31(n=7) p ＜ 0.04
아래쪽 정수리뼈 0.90 ± .08(n=8) 1.93 ± .20(n=11) p ＜ 0.001
후두부 0.77 ± .13(n=8) 1.44 ± .20(n=11) p ＜ 0.02
소뇌의 비로서 AD 뇌와 대조 뇌의 총 결합의 비교
뇌 영역 대조(fmol/㎍ 단백질) AD(fmol/㎍ 단백질) p값
소뇌 75 ± 13(n=8) 73 ± 9(n=11) p ＝ 0.91
전두폴 58 ± 8(n=6) 124 ± 16(n=10) p ＜ 0.006
상부/중간 전두골 54 ± 10(n=8) 130 ± 21(n=11) p ＜ 0.005
상부 측두골 66 ± 17(n=8) 121 ± 14(n=11) p ＜ 0.02
미형의 머리 73 ± 11(n=4) 123 ± 22(n=7) p ＝ 0.14
아래쪽 정수리뼈 76 ± 13(n=8) 137 ± 19(n=11) p ＜ 0.03
후두뼈 64 ± 16(n=8) 95 ± 12(n=11) p ＝ 0.15
상기 표 2에서, 고저 반점(high-and low-plaque) AD 뇌는 결합되었다.
상기 표 3에서, 각 샘플에 대한 CBR은 결합하는 [14C] 크리사민 G의 절대치를 동일한 뇌로부터 소뇌의 샘플에서 결합하는 [14C] 크리사민 G의 절대치에 의한 샘플로 분할함으로써 얻을 수 있다.
도 9a 및 도 9b는 동일한 뇌의 소뇌에 정규화되는 6개의 뇌 영역에 [14C] 크리사민 G의 결합을 도시한다. 20 NPs/x200 확대보다 큰 AD 뇌, 즉 "높은 반점 AD 뇌"에서 AD 뇌 영역에 크리사민 G의 결합을 도 9a에 도시한다. 20 NPs/x200 확대보다 낮은 AD 뇌, 즉 "낮은 반점 AD 뇌"에서 AD 뇌 영역에 크리사민 G의 결합을 도 9b에 도시한다. 모든 뇌의 영역에서, AD 뇌와의 결합은 대조와의 결합보다 상당히 크다(표 3 참조). 상부/중간 전두골 피질에는, 대조와 어떠한 AD 샘플과의 사이에 중첩이 없다. 후두골 피질을 제외한 모든 뇌 영역에도, 대조와 20 NPs/x200 확대보다 큰 어떠한 AD 샘플과의 사이에 중첩이 없다. 예를 들어 후두골 피질(및 소뇌) 등의 적어도 전형적인 NPs의 침착물이 있는 뇌 영역에서, AD와 대조 사이에 최대의 중첩이 관찰되었다.
도 9c는 다운 증후군을 앓고 있는 2명의 환자들로부터 얻은 자료를 도시한다. 모든 다운 증후군 환자들에게는 40개의 Aβ의 침착물이 현상되어 있고(develop), AD가 다수 현상되어 있다. Wisniewski et al., Neurology 35: 957(1985); Schapiro et al., Neurobiol. Aging 13, 723(1992). 이들 2명의 환자들에게는 상기 대조 범위를 결합시키는 [14C] 크리사민 G가 나타났다. 젊은 환자(23세)는 아밀로이드 침착물을 가지고 있지만, 임상적으로 아직 치매 증상을 보이지 않았으므로, 도 9c는, 크리사민 G가 임상적으로 치매가 나타나기 오래 전에 AD가 현상되는 치매 증상이 없는 대조 환자들로부터 차이점을 검출할 수 있다는 것을 시사한다.
본 발명의 화합물 및 방법은 AD 뇌와 정상 뇌의 차이점을 측정하는 2가지 유용한 방법을 제공한다; (1) 총 크리사민 G 결합(표 2) 또는 (2) 동일한 뇌의 소뇌에서 결합하는 주어진 뇌 영역에서 크리사민 G의 결합비(표 3). 이 측정방법들은 AD 신경성 반점의 생체 내에서의 정량에 대한 2가지 큰 이점을 제공한다. 첫 번째로, 총 Aβ 결합을 측정하기 위한 수단을 제공함으로써, 특정한 Aβ 결합보다는 오히려, 본 발명은 통상적인 결합을 측정하기 위해서 방사능 재료를 제 2 주입하도록 노출시키지 않고도 Aβ 침착물을 정량할 수 있다. 이 이유 때문에, 총 결합으로서만 자료를 나타낼 수 있다. 모든 실험에서, 특이 결합 자료는 AD 뇌와 대조 뇌 사이의 차이점이 크더라도 양산될 수 있다.
두 번째로, 크리사민 G 유도체의 뇌 흡수에서의 변이가 뇌에서 크리사민 G의 절대 농도에 영향을 줄 것이다. 피검자들간의 변이 때문에, 여러 개의 메카니즘이 필요할 것이다. Aβ 침착물이 거의 없는(즉, 실험상 "빈 공간(blank)") 뇌 영역을 발견함으로써 각 대조 환자들에게 자신에게 적합한 메카니즘을 제공할 수 있다. 전형적인 NPs가 소뇌에서 굉장히 드물기 때문에(Joachim et al., Am. J. Pathol. 135: 309(1989)), 소뇌에 결합하는 크리사민 G는 연구된 각 대조 뇌로서 사용되었다. 이 결과를 동일한 뇌의 소뇌에서 결합하는 주어진 뇌 영역에서 결합하는 크리사민 G의 비에 대해서 나타내었다(도 9 및 표 3).
생체 내에서 AD에 있는 아밀로이드의 정량을 측정하기 위해서, 뇌 퇴화의 효과를 고찰하여야 한다. 그러므로, 아밀로이드의 정량을 측정하기 위해서 생체 내에서 크리사민 G 프로브(probe) 및 크리사민 G 유도체 프로브를 사용하는 경우에, MRI 체적 측정법을 토대로 뇌의 퇴화를 교정할 수 있다. 본 발명의 방법과 연관하여 수행되는 MRI 체적 측정법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법과 유사하다. Pearlson, G. and Marsh, L. MAGNETIC RESONANCE IMAGING IN PSYCHIATRY in Annual Review of Psychiatry(Vol. 12) Oldham, J. et al., eds. p. 347-381(1993)를 참조한다. 그러므로, 뇌 영역의 체적 당 총 방사능을 결정하는 방법은 하기 방정식을 사용할 것이다;
뇌 영역 "A"로부터 총 스펙트(SPECT) 또는 PET 신호
뇌 영역 "A"에서 MRI로 결정된 뇌 체적(CSF를 제외하고)
뇌 영역 "A" 또는 S/VA용의 신호/체적으로서 이 측정방법의 적용은 소뇌의 비가 하기 식으로 표현된다는 것을 의미한다;
상기 식에서, S/VCB는 동일한 영상 연구 동안에 동일한 피검자의 소뇌에서 신호/체적을 말한다. 따라서, AD를 가지고 있거나 아밀로이드의 침착물에 의한 특징이 있는 치료적인 조건을 가지고 있다고 잠작되는 환자로부터 소뇌 이외의 어떤 뇌 영역으로부터의 비는 한 그룹의 동년배의 정상 대조군의 동일한 뇌 영역으로부터 유사한 비의 정상 범위와 비교될 수 있다. 소뇌에 신경성 반점의 높은 침착물이 있는 뇌 영역과의 결합비는 대조군들로부터 알츠하이머를 구별하는 변수로서 사용될 수 있다.
실시예 4: 크리사민 G, 크리사민 G 유도체 및 콩고 레드의 옥탄올-물 분별 계수
옥탄올-물 분별 계수는 화합물의 비지용성(relative lipophilicity)의 측정이다. 화합물의 지용성이 클수록 혈액수액관문(blood-brain barrier)은 교차할 가능성이 있다. Goodman and Gilman's THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICS (7th Ed.)를 참조한다. 옥탄올-물 분별 계수가, 크리사민 G는 60.22±3.97이고, 콩고 레드는 0.665±0.037(p＜0.001) 이다. 이로 인해, 크리사민 G가 콩고 레드보다 지용성이 대략 90배이므로, 포유류의 혈액수액관문이 이론적으로 교차할 가능성이 있다는 것을 시사한다. 크리사민 G의 3-iodo 및 3'-diiodo 유도체용 옥탄올-물 분별 계수(도 1)는 각각 72.53±.74이고, 112.9±7.3이다. 옥탄올-물 분별 계수는, 생체 내에서의 연구에 사용되고 방사능 동위원소로 식별되는 여러개의 크리사민 G 유도체의 비방사능 동족체가 되는 유도체가 콩고 레드보다 지용성이 170배에 이르고, 크리사민 G의 지용성에 2배에 이른다는 것을 나타낸다. 이로 인해. 상기 유도체가 콩고 레드 또는 크리사민 G보다 뇌에 훨씬 유용하게 들어갈 것이라는 것을 시사한다.
실시예 5: 크리사민 G의 혈액수액관문 및 신진대사를 교차하게 하는 크리사민 G 및 크리사민 G 유도체의 성능
생체 내에서 AD를 진단하기 위한 아밀로이드의 사용으로 혈액수액관문의 교차가 가능해 지고, 실질(parenchymal) 아밀로이드 침착물에 대한 접촉성(access)을 얻는 것이 가능해진다.
혈액수액관문을 교차시키는 크리사민 G의 성능은 Swiss-Webster mice에서 연구 조사되었다. 생체 내에 주입한 후에, 15분 후에 측정된 뇌/혈액의 비는 10:1을 넘어섰고, 35분 후에는 20:1에 도달하였다(도 10). 뇌에서의 방사능은 이 시간의 주기를 넘어서서는 거의 일정하게 유지되었지만, 혈액에서는 감소되었고, 간에서는 증가되었다. 뇌/신장의 비는 15분 후에 최고조에 이르렀고(검사된 이 지점을 넘어서서), 그 값은 0.5에 도달하였다. [14C] 크리사민 G의 생체 내에 주입 후에, 뇌 및 간은 60분 동안 추출되었고, 95%를 초과하는 회복된 방사능은 이 시간의 주기 동안에 크리사민 G의 상당한 신진대사가 없는 것을 적용하여, 역상 HPLC에서 확실한 크리사민 G와 상호 용출되었다.
크리사민 G로 정상 쥐의 뇌로 변하되고, 뇌/혈액의 비가 높아진다. 뇌에서의 방사능은 처음 30분을 넘어서서는 비교적 일정하게 유지되었지만, 혈액에서는 감소되었고, 간에서는 증가되었다. 이것은, 뇌에 축적된 혈액 이상으로 간에 축적된 혈액으로부터 크리사민 G의 효과적인 제거의 결과라는 것을 시사한다. 60분에서, 실질적인 방사능 모두가 뇌에서 발견되었고, 간은 크리사민 G를 변화시키지 않는다는 것을 증명하였다. 콩고 레드도 혈액수액관문을 교차하지 않는다. Tubis et al., J. Amer. Pharm. Assn. 49: 422(1960). 대부분의 콩고 레드는 간에 의해 맑아지고, 기니아픽(guinea-pigs)에 이루어진 비장(spleen) 및 뇌/신장의 비는 대략 0.07이다. Tubis et al., Supra. 크리사민 G도 또한 간에 의해 맑아지지만, 뇌의 삽입이 보다 커진다.
생체 내에서의 동물 시험은 투여량의 범위, 혈액관문을 통한 전달 효과 및 결합 성능을 결정하기 위한 토대를 제공한다. 이 목적을 위해 특히 바람직한 것은 Games et al., (Nature 373: 523(1995)) 또는 Hsiao et al., Science 274: 99-102(1996)의 형질전환(transgenic) 쥐 모델 및 대뇌 아밀로이드용의 "늙은 동물"; 즉, Wisniewski et al., J. Neuropathol. ＆ Exp. Neurol. 32: 566(1973), Selkoe et al., Science 235: 873(1987)을 참조하여, 알쯔하이머-타입의 뇌의 신경성 반점의 변이 개수를 성장시킨다고 인지된 형질전환된 쥐, 비슷한 연수의 개 또는 원숭이 등의 동물이 결합 및 검출 성능을 위해 시험되었다. 생체 내에서의 이 시험은 아밀로이드 침착물을 확인하고 양을 측정하기 위해 대조-생체검사 또는 부검이 필요하다.
본 발명의 조성물 및 방법을 시험하는데에 사용하기 위해 적합한 또 다른 동물 모델은 형질전환적으로 생성되었다. 예를 들어, Quon et al., Nature, 352: 239-241(1991)은 형질전화 쥐를 제공하기 위해서 신경성 특이적 에놀효소 촉진제 저지인자 영역의 래트를 사용하였다. 또한, Wirak et al., Science, 253: 323-325(1991)를 참조한다. 또 다른 모델이 동물에 직접적으로 β/A4 펩티드의 두개 내의(Intracranial) 투여에 의해 생산되었다(Tate et al., Bull. Clin. Neurosci., 56: 131-139(1991)).
생체 내에서의 어떠한 동물 모델도 AD 신경병리학용으로 극히 양호하지 못한 모델이라는 것을 주지한다. 대신에, 동물 모델들이 정상적으로 노화된 아밀로이드 침착물에 근접한 모델은 될 수 있다. 이것은 특히 노화된 포유류 모델에 적합하다. 이들 모델들 모두는 상술한 바와 같은 동년의 개의 모델에서 반점의 산재가 우수하다는 것을 보여준다. 여러개의 뇌혈관성 아밀로이드가 있으면서, Games et al. 및 Hsiao et al. 에서 형질전환 쥐 모델를 제외하고는 신경성 반점이 거의 없다. 또 다른 형질전환 쥐 모델이 때때로 산재 반점만을 도시한다. 그러므로, 이 모델들이 뇌에서 프로브의 확산을 연구하기 위해 사용되면서, 이들 모델들이 시험관 내에서 상술한 AD 뇌에 결합하는 크리사민 G의 연구를 토대로 하여 AD 뇌에 보여질 수 있는 동일한 정량의 차이를 도시할 가능성은 낮다.
사람의 혈액수액관문을 알킬, 알케닐 또는 알케닐 크리사민 G의 교차 성능 평가
적당한 방사능 동위원소로 라벨이 붙여진 대략 500Ci/mole 이상의 비활성을 가지고 있는 크리사민 G의 유도체를 투여량 약 10mCi로 정상 피검자들 및 AD를 가지고 있다고 추측되며, 다른 장기에 대한 뇌에서 유도체의 검출성을 분석하고 뇌에서의 검출성 과정을 한정하기 위한 SPECT 또는 PET 영상이 모니터되는 환자들에게 정맥내로 주사하였다. 신뢰성있게 검출될 수 있는 투여량은 "영상 유효량"으로서 한정된다.
AD를 가지고 있는 사람과 동년의 대조군을 구별하는 알킬, 알케닐 또는 알케닐 크리사민 G의 평가
적당한 방사능 동위원소로 식별되는 크리사민 G의 유도체의 영상 유효 투여량을 AD 등의 병리학 조건 때문에, 뇌의 아밀로이드 침착물을 갖고 있다고 추측되는 피검자에게 주입한다. 15분∼24시간의 주기 후에, 뇌로부터 방사능 신호가 SPECT 또는 PET에 의해 검출된다. 검출기 분야에 포함되는 모든 뇌 영역에서 방사능이 동시에 검출된다. 이 분야는 소뇌 영역, 상부 측두골 피질 영역, 상부/중간 전두골 피질 영역 및 개재된 뇌 영역의 큰 부분을 포함하도록 설정될 것이다. MRI 주사(scan)가 연구 이전에 실행되어, 상기 실시예 3에서 기술된 방법에 의해 이익(interest) 영역에서 뇌 퇴화에 대한 정정이 이루어진다. 상기 실시예 3에 기술된 S/VA, S/VCB및 RatioA변수들을 계산하여, 동년배의 정상적인 대조군으로부터 미리 얻은 정상적인 비와 유사한지를 비교할 것이다.
실시예 6: 아밀로이드와 알케닐 크리사민 G 유도체의 결합의 조직학 정위(localization)
도 11의 상부 프레임(frame)은 1, 4-bis(2-(3-카르복시-4-하이드록시페닐)에텐-1-yl)-벤젠에 의해 착색된 사람의 AD 뇌를 나타낸다. 이 착색 방법은 콩고 레드으로 포화된 1, 4-bis(2-(3-카르복시-4-하이드록시페닐)에텐-1-yl)-벤젠을 함유하고 있는 Stokes and Trickey, J. Clin. Pathol. 26: 241-242(1973)의 방법이었다. 이 착색의 명암도는 크리사민 G, 콩고 레드 또는 티오플라빈 S가 관찰된 명암으로 한층 더 강하다. 신경성 아밀로이드 반점 및 신경망 나사는 신경원섬유 (neurofibrillary)의 섬유농축체(tangle)를 용이하게 확인할 수 있다. 도 11에서 하부 현미경 사진은 1, 4-bis(2-(3-카르복시-4-하이드록시페닐)에텐-1-yl)-벤젠으로 착색된 [Tg(HuApp695. SWE)2576: Hsiao et al. Science 274: 99-102(1996)]의 형질전환된 쥐의 뇌의 일부를 도시한다.
밀집된 아밀로이드 반점은 강하게 착색되었다. 뇌혈관성 아밀로이드도 또한 사람과 쥐의 뇌 모두에서 착색되었다(자료는 도시하지 않음).
실시예 7: 알킬, 알케닐 또는 알케닐 크리사민 G 유도체의 독성의 평가
비방사성 크리사민 G를 10㎎/㎏ 및 100㎎/㎏을 복강 내에 투여할 때, 72시간의 주기 동안에 쥐들에게서 어떤 주목할만한 행동 효과나 독성이 관찰되지 않았다. 투여된 [14C]크리사민 G는 1㎎/㎏씩 순차적으로 투여되었다.
크리사민 G에 의해 LD50을 만들기 위한 시도를 토대로 급성 독성이 거의 보이지 않았다. 크리사민 G의 포화 용액의 유체 부피 효과(대략 0.025㎖/g)로부터 쥐에 상해없이 주입될 수 있는 최대 체적을 쥐에 주입할 때에도(100㎎/㎏), 시험된 가장 장기간의 시간, 적어도 72시간 동안에는 어떠한 행동 변화도 나타나지 않았다. SPECT 또는 PET에 의한 방사성 동위원소로 식별되는 유도체의 검출에 필요한 투여량은 하기 투여량 크기의 차수가 될 것이다.
콩고 레드는 방사성 크리사민 G 유도체가 사용된 정량보다 많은 양이 사람에게 안전하게 주입되었다. 콩고 레드의 LD50은 크리사민 G에 나타나는 유사한 화합물로 100㎎/㎏보다 다량의 190㎎/㎏(Tubis et al., J. Amer. Pharm. Assoc. 49: 422(1960))이 되도록 나타났다. 따라서, 2개의 화학적으로 유사한 화합물은 쥐들에게 유사하게 낮은 독성을 일으켰다.
다른 알킬, 알케닐 또는 알케닐 크리사민 G 유도체를 쥐 및 또 다른 고차 포유류에게 당업계에 인지된 방법에 의해 동물에 광범위한 범위의 농도로 주입하고 동물에 대한 독성의 각종 징후에 대해서 연구함으로써 유사하게 시험할 수 있다. Goodman and Gilman's THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICS(7th Ed.)를 참조한다.
실시예 8 Aβ(25-35) 유도 독성을 막기 위한 크리사민 G의 능력 평가
PC 12 세포에서 Aβ(25-35) 유도 독성으로부터의 보호
래트 크롬친화성세포종 세포 (PC-12)는 10% 태아 우형의 혈청으로 RPMI 1640 배양(media)에서 성장하였다. 대략 5,000 지수증식 세포는 배양의 100㎕ 체적에서 96-우물(well) 플레이트(plate)에서 플레이트되고, 37℃ 하루 밤 동안 배양되도록 설정되었다. Aβ(25-35)는 37℃에서 7일간 사전 응집되었고, 주어진 최종 농도(0.01∼10μM Aβ(25-35) 및 0.03∼20μM CG)를 얻기 위하여 20㎕를 추가하기 전에 수성용액에서 크리사민 G (CG) 또는 관련 화합물로 사전 배양되었다. 세포는 멸균 인산염 완충 식염수에서 5 ㎎/㎖ MTT(3,(4,5-디메틸디아졸-2-yl)2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드)의 13.3㎕를 추가하기에 앞서 24시간 동안 배양되었다. 37℃에서 4.5시간 경과한 후, 추출 완충제(50% DMF/물 중의 20% w/v SDS; 80% 아세트산 및 2.5% 1N HCl의 2.5%로 pH를 4.7로 조정)가 추가되었고, 플레이트는 밤새 배양되었다. Hansen et al., J. Immunol. Methods 119: 203(1989). 면역법 119: 203 (1989). 다음으로, 색의 변화는 560㎚에서 측정되었다. 최고 생육성은 단지 증류되고 탈이온화된 H2O가 추가된 조정 우물의 흡수도로 정의된다. 최고 독성은 트리톤(Triton) X-100이 0.1%(최종농도) 추가됨으로서 용균된 세포에서의 우물로 정의되었다.
Aβ(25-35)에서 PC12 세포의 배양은 MTT(도 12)를 줄이기 위한 상기 세포의 능력에서 농도 의존성 감소를 일으킨다. 도 12는 MTT의 환원에 의하여 측정되었듯이 PC12 세포의 세포상 산화환원 활성(cellar redox activity)에서의 크리사민 G의 존재 및 결여에서 Aβ(25-35)의 농도를 감소시키는 효과를 보여준다. MTT 환원물은 세로축에 도시된 560㎚에서 흡수된다. Aβ(25-35)의 효과는 채워진 바(bar)에서 보여지고, MTT 환원에서 용량 의존성 감소를 보여주었다. 대조의 중요한 차이점(Aβ가 없을 경우, 크리사민 G가 없을 경우)은 충전된 바 안의 흰색 번호로 나타내었다. 20μM의 크리사민 G의 보호 효과는 개방 바에서 나타내었다. 크리사민 G의 존재 및 결여시 MTT 환원간의 중요한 차이는 개방 바 안의 검은색 번호로 나타내었다.
도 13은 PC12 세포의 세포 산화환원 활성의 Aβ(25-35)-유도 환원에 대한 크리사민 G의 농도 증가 효과를 사시적으로 도시한다. Aβ(25-35)의 결여로 인한 크리사민 G의 효과는 채워진 바에 도시된다. Aβ(25-35)의 부재에서 대조(Aβ 및 크리사민 G가 없음)와 크리사민 G의 어떤 농도 사이에 중요한 차이가 없다. 1μM의 Aβ(25-35)의 존재에서 MTT 환원과 크리사민 G의 증가 농도는 개방 바에 나타났다. 크리사민 G의 각 농도에서 Aβ(25-35)의 존재 유무 사이에서 MTT 환원의 중요한 차이는 채워진 바 내부에 흰색 번호로 나타내었다. 크리사민 G의 증가 농도에 더하여 Aβ(25-35) 대조와 Aβ(25-35) 사이에서 MTT 환원의 중요한 차이는 개방 바 내부에 검은색 번호로 나타내었다.
이전에 보고한 바와 같이, 콩고 레드는 2μM을 넘어선 농도에서 Aβ-유도 독성을 막아서, 20μM에서 완벽한 보호를 이룬다. Burgevin et al. NeuroReport 5: 2429(1994); Lorenzo and Yankner, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 12243(1994); Pollack et al., Neuroscience Letters 184: 113(1995); Pollack et al. Neuroscience Letters 197: 211(1995).
크리사민 G는 Aβ(25-35)의 농도와 크리사민 G(도 13)의 농도 모두에 의존하는 보호 효과를 보여준다. 크리사민 G의 보호 효과는 0.37μM의 합성 Aβ에 결합시키기 위한 크리사민 G의 Ki에 매우 근접한 농도인 0.2μM에서 확인된다. 크리사민 G는 0.1∼1.0μM의 범위에서 효과가 나타나는 콩고 레드보다 유력하게 나타난다. 이것은 크리사민 G의 0.37μM의 합성 Aβ와 2.8μM의 콩고 레드에 결합시키는 Ki값에 연관이 있다.
다른 실험에서(도 14), 크리사민 G와 Aβ를 결합시키지 않는 페놀 유도체의 효과가 1μM의 Aβ(25-35)로 배양되는 세포에서 시험되었다. 크리사민 G는 0.1μM 및 1μM에서 보호 효과가 나타났지만, 페놀 유도체는 보호 효과를 나타내지 않았고, Aβ의 독성을 강화시켰을 것이다.
이 결과는, 콩고 레드, 크리사민 G의 지용성 유도체가 Aβ를 결합시키는 농도와 매우 유사한 농도에서 세로 배양으로 Aβ-유도 세포독성을 방지하는 것을 시사한다. 합성 Aβ에 결합되지 않는 페놀 유도체가 Aβ-유도 세포독성을 방지하지 않으므로 이 보호가 구조적인 특이성을 보여준다. 크리사민 G가 뇌를 분별하므로, 이들 결과는 크리사민 G와 크리사민 G의 Aβ 결합 유도체가 AD의 치료에 잠재적인 치료법이라는 것의 증거를 제공한다.
크리사민 G의 보호 효과의 메카니즘은 현재 알려져 있지 않다. 2개의 광범위한 가능성이 있다. 첫 번째로, 크리사민 G는 Aβ의 응집을 방해할 수 있다. 두 번째로, 크리사민 G는 목표 세포 상에서 Aβ의 효과를(직접적으로 또는 간접적으로) 방해할 수 있다. 콩고 레드는 응집된 Aβ의 독성 효과에 대한 보호 및 Aβ의 응집을 억제하지 않는다. Lorenzo and Yankner, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 12243(1994). Aβ가 크리사민 G의 배양에 앞서 먼저 응집되었으므로, 상기 실험에서 응집의 방해는 일어나지 않을 것이다. 따라서, 응집의 억제가 크리사민 G의 중요한 치료 효과가 될 것이라는 것을 증명할 수 있지만, 미리 응집된 Aβ에 대한 크리사민 G의 보호 효과를 설명하는 것은 힘들다. 도 7에 기술된 Aβ에 결합시키는 크리사민 G의 모델은 크리사민 G가 Aβ의 표면을 "피복하는(coat)" 방법을 나타낸다. 이것은, 원섬유 침착물이 보충 단백질 등의 세포-표면 수용기 또는 다른 고분자에 의해 인지되고, 이들 고분자들에 의해 조정될 수 있는 Aβ의 독성 효과를 벙해하는 방법을 나타낸다. 크리사민 G 및 콩고 레드는 Aβ의 응집 전후 모두에 다수의 효과를 발휘할 수 있다. 아밀로이드 침착물이 진행중일 뿐만 아니라 Aβ 응집이 미리 존재할 때 환자들에게 동시에 존재할 수 있으므로, 이것은 치료의 관점에서 유리하다.
본 발명은 크리사민 G를 이용하여 알츠하이머병을 사전에 진단하고, 알츠하이머병과 관련되는 아밀로이드 침적을 조영하고 예방할 수 있다.

Claims (23)

  1. 식 1의 아밀로이드 결합 화합물 또는 그것의 수용성, 비독성염.
    ＜식 1＞
    단 :
    (1) ZZ는 C≡C, CR'=CR', CR'2-CR'2,C≡C-CR'=CR' 또는 CR'2-CR'2-CR'2-CR'2,(여기서 각각의 R'는 H 또는 저급 알킬 그룹으로 독립적으로 표현된다.);
    (2) X는 C(R")2(여기서 각각의 R"는 독립적으로 H, F, Cl, Br, I, 저급 알킬 그룹(lower alkil group), (CH2)nOR', 단 n은 1, 2, 또는 3, CF3, CH2-CH2F, O-CH2-CH2F, CH2-CCH2-CH2F, O-CH2-CCH2-CH2F, CN, (C=O)-R', N(R')2, NO2, (C=O)N(R')2O(CO)R', OR', SR', COOR', Rph, CR'=CR'-Rph, CR'2-CR'2-Rph, (여기서, Rph는 R", 트리-알킬 주석, 테트라졸 또는 식
    (R'는 H 또는 저급 알킬 그룹이다.)
    을 갖는 옥사디아졸로 정의 되는 소정의 비-페닐 치환기로 부터 선택된 페닐 치환기인 비치환 또는 치환 페닐 그룹을 나타낸다.) 또는 X는 CR'=CR', N=N, C=O, O, NR'(여기서, R'는 H 또는 저급 알킬 그룹이다.);
    (3) 각각의 R1및 R2는 독립적으로 H, F, Cl, Br, I, 저급 알킬 그룹(lower alkil group), (CH2)nOR'(단 n은 1, 2, 또는 3), CF3, CH2-CH2F, O-CH2-CH2F, CH2-CCH2-CH2F, O-CH2-CCH2-CH2F, CN, (C=O)-R', N(R')2, NO2, (C=O)N(R')2O(CO)R', OR', SR', COOR', 트리-알킬 주석, Rph, CR'=CR'-Rph, CR'2-CR'2-Rph로 표현되고,
    {단, Rph는 R1또는 R2, 아래 식
    (R'는 H 또는 저급 알킬 그룹이다.)
    을 갖는 옥사디아졸 또는 테트라졸, 또는 아래 식
    (단 R6및 R9는 저급 알킬 그룹)
    을 갖는 트리아진으로 정의 되는 소정의 비-페닐 치환기로 부터 선택된 페닐 치환기인 비치환 또는 치환 페닐 그룹을 나타낸다}
    (4) 각각의 Q는 독립적으로 아래 식 IA, IB, IC, ID, IE, IF 및 IG로 부터 선택된 적어도 하나.
    (단, IA는 식
    을 갖고, (단, R3, R4, R5, R6또는 R7은 상기 R1과 동일하게 정의된다.)
    IB는 식
    을 갖고, (단, R10, R11, R12, R13, R14, R15또는 R16은 상기 R1과 동일하게 정의된다.)
    IC는 식
    을 갖고, (단, R17, R18, R19, R20또는 R21은 상기 R1과 동일하게 정의된다.)
    ID는 식
    을 갖고, (단, R22, R23또는 R24는 상기 R1과 동일하게 정의되고,
    은 아래 6개의 식 중의 하나의 복합고리를 나타낸다.)
    IE는 식
    을 갖고, (단, R25, R26또는 R27은 상기 R1과 동일하게 정의되고,
    은 아래 6개의 식 중의 하나의 복합고리를 나타낸다.)
    IF는 식
    을 갖고, (단, R28, R29, R30, R31또는 R32의 하나는 상기 식 1에서 정의된 ZZ 결합이고, R28, R29, R30, R31또는 R32의 나머지들은 상기 R1과 동일하게 정의된다.)
    IG는 식
    을 갖는다. (단, R33, R34, R35, R36, R37, R38또는 R39의 하나는 상기 식 1에서 정의된 ZZ 결합이고, 나머지 R33, R34, R35, R36, R37, R38또는 R39는 독립적으로 상기 R1과 동일하게 정의된다.)
  2. 제 1항에 있어서, 치환기 R1-R7및 R10-R39의 적어도 하나는131I,123I,76Br,18F, CH2-CH2-18F, O-CH2-CH2-18F, CH2-CH2-CH2-18F, O-CH2-CH2-CH2-18F,19F,125I 및 식 1로 특정된 탄소포함 치환기이고, 적어도 하나의 탄소는11C 또는13C인 것을 특징으로 하는 화합물.
  3. 제 1항에 있어서, 합성 Aβ 펩티드 또는 알츠하이머 병 두뇌 조직에 결합함으로서 측정될 때, 0.0001 및 10.0 ㎛ 사이의 해리상수(dissociation constant; KD)로 Aβ에 결합되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  4. 제 1항의 화합물을 합성하기 위한 방법에 있어서, 치환기 R1-R7및 R10-R39의 적어도 하나는131I,123I,125I,76Br,75Br,18F,19F로 구성된 그룹으로 부터 선택되고, 제 1 항의 화합물을 반응시키는 단계를 포함하고, 치환기 R1-R7및 R10-R39의 적어도 하나는131I,123I,125I,76Br,75Br,18F,19F를 포함하는 작용물질로 트리-알킬 주석 또는 트리아진이 되는 것을 특징으로 하는 합성방법.
  5. (a) 제 2항의 화합물 및 (b) 제약적으로 수용가능한 담체(carrier)를 포함하는 아밀로이드 침적(deposite)을 생체내에서 조영하기 위한 약제 조성물.
  6. 피험체(subject)에서 아밀로이드 침적을 검출하기 위한 생체내 방법에 있어서,
    (a) 제 5항의 약제 조성물의 검출 가능한 양을 투약하는 단계; 및
    (b) 상기 피험체에서 아밀로이드 침적에 상기 화합물의 결합을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 아밀로이드 침적은 상기 상기 피험체의 대뇌안에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 피험체는 알츠하이머 병, 가족성 알츠하이머 병, 다운 증후군 및 아폴리포단백질(apolipoprotein) E4 대립 형질로 구성된 그룹으로부터 선택된 질병 또는 증후군을 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 6항에 있어서, 상기 검출은 감마 영상법(gamma imaging), 자기 공명 영상법(magnetic resonant imaging) 및 자기 공명 분광법으로 구성된 그룹으로 부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 감마 영상법은 PET 또는 SPECT인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 7항에 있어서, 상기 약제 조성물은 정맥내 주사에 의하여 투약되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 7항에 있어서 (a) 소뇌가 아닌 대뇌 영역에서의 상기 화합물의 결합과 소뇌 영역에서 상기 화합물의 결합의 비율은 정상 피험체에서의 상기 비율과 비교되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 아밀로이드 증후군 관련 상태에서 원섬유(fibrill) 형성과 관련한 세포 퇴화 및 독성을 억제하는 방법에 있어서, 상기 방법은 크리사민 G 또는 그 유도체의 의학적으로 효과적인 양이 되도록 또는 그러한 양이 될 것으로 기대되는 만큼 피험체에 투약하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 크리사민 G의 유도체는 식 1의 아밀로이드 결합 화합물 또는 그것의 수용성, 비독성염인 것을 특징으로 하는 방법.
    ＜식 1＞
    단 :
    (1) ZZ는 C≡C, CR'=CR', CR'2-CR'2,C≡C-CR'=CR' 또는 CR'2-CR'2-CR'2-CR'2,(여기서 각각의 R'는 H 또는 저급 알킬 그룹으로 독립적으로 표현된다.);
    (2) X는 C(R")2(여기서 각각의 R"는 독립적으로 H, F, Cl, Br, I, 저급 알킬 그룹(lower alkil group), (CH2)nOR', 단 n은 1, 2, 또는 3, CF3, CH2-CH2F, O-CH2-CH2F, CH2-CCH2-CH2F, O-CH2-CCH2-CH2F, CN, (C=O)-R', N(R')2, NO2, (C=O)N(R')2O(CO)R', OR', SR', COOR', Rph, CR'=CR'-Rph, CR'2-CR'2-Rph, (여기서, Rph는 R", 트리-알킬 주석, 테트라졸 또는 식
    (R'는 H 또는 저급 알킬 그룹이다.)
    을 갖는 옥사디아졸로 정의되는 소정의 비-페닐 치환기로 부터 선택된 페닐 치환기인 비치환 또는 치환 페닐 그룹을 나타낸다.) 또는 X는 CR'=CR', N=N, C=O, O, NR'(여기서, R'는 H 또는 저급 알킬 그룹이다.);
    (3) 각각의 R1및 R2는 독립적으로 H, F, Cl, Br, I, 저급 알킬 그룹(lower alkil group), (CH2)nOR'(단 n은 1, 2, 또는 3), CF3, CH2-CH2F, O-CH2-CH2F, CH2-CCH2-CH2F, O-CH2-CCH2-CH2F, CN, (C=O)-R', N(R')2, NO2, (C=O)N(R')2O(CO)R', OR', SR', COOR', 트리-알킬 주석, Rph, CR'=CR'-Rph, CR'2-CR'2-Rph로 표현되고,
    {단, Rph는 R1또는 R2, 아래 식
    (R'는 H 또는 저급 알킬 그룹이다.)
    을 갖는 옥사디아졸 또는 테트라졸, 또는 아래 식
    (단 R6및 R9는 저급 알킬 그룹)
    을 갖는 트리아진으로 정의되는 소정의 비-페닐 치환기로 부터 선택된 페닐 치환기인 비치환 또는 치환 페닐 그룹을 나타낸다}
    (4) 각각의 Q는 독립적으로 아래 식 IA, IB, IC, ID, IE, IF 및 IG로 부터 선택된 적어도 하나.
    (단, IA는 식
    을 갖고, (단, R3, R4, R5, R6또는 R7은 상기 R1과 동일하게 정의된다.)
    IB는 식
    을 갖고, (단, R10, R11, R12, R13, R14, R15또는 R16은 상기 R1과 동일하게 정의된다.)
    IC는 식
    을 갖고, (단, R17, R18, R19, R20또는 R21은 상기 R1과 동일하게 정의된다.)
    ID는 식
    을 갖고, (단, R22, R23또는 R24는 상기 R1과 동일하게 정의되고,
    은 아래 6개의 식 중의 하나의 복합고리를 나타낸다.)
    IE는 식
    을 갖고, (단, R25, R26또는 R27은 상기 R1과 동일하게 정의되고,
    은 아래 6개의 식 중의 하나의 복합고리를 나타낸다.)
    IF는 식
    을 갖고, (단, R28, R29, R30, R31또는 R32의 하나는 상기 식 1에서 정의된 ZZ 결합이고, R28, R29, R30, R31또는 R32의 나머지들은 상기 R1과 동일하게 정의된다.)
    IG는 식
    을 갖는다. (단, R33, R34, R35, R36, R37, R38또는 R39의 하나는 상기 식 1에서 정의된 ZZ 결합이고, 나머지 R33, R34, R35, R36, R37, R38또는 R39는 독립적으로 상기 R1과 동일하게 정의된다.)
  15. 제 13항에 있어서, 상기 아밀로이드 증후군 관련 상태는 알츠하이머 병, 다운 증후군, 2형 진성 당뇨병, 유전적인 대내 출혈 아밀로이드 증후군(네덜란드형(Dutch)), 아밀로이드 A(반응성), 제 2 아밀로이드 증후군, 가족성 지중해성 열병, 두드러기 및 난청을 동반한 가족성 아밀로이드 네프로패시(무클-웰스 증후군), 아밀로이드 람다 L-고리 및 아밀로이드 카파 L-고리(특발성, 골수종 또는 마크로글로불린미아 관련) A 베타 2M(만성 혈액 투석), ATTR(가족성 아밀로이드 다발성신경병(포르투칼, 일본, 스웨덴)), 가족성 아밀로이드 심근병증(덴마크 종), 고립된 심장의 아밀로이드(전신 노화 아밀로이드 증후군), AIAPP 또는 아밀린 인슐린노마(insulinoma), 심방 네이쳐틱 요소(atrial natuetic factor), 프로칼시토닌(갑상선의 수강 암종), 겔소린(gelsolin; 가족성 아밀로이드 증후군 (핀란드산)), 시스타틴 C(아밀로이드 증후군에 따른 유전성 대뇌출혈(아이슬랜드 산), AApo-A-I(가족성 아밀로이드 증후군의 다발성 신경병-아이오와), AApo-A-Ⅱ(쥐에서 촉진 노화), 피브리노겐 관련 아밀로이드; 및 Asor 또는 Pr P-27(스크래피, 크로이츠펠트-야곱 병, 걸츠만-스트라우슬러-샤인커(Gertsmann-Straussler-Scheiner) 증후군, 우형 스폰지폼(spongiform) 뇌염) 또는 아폴리포단백질 E4 대립 형질을 위한 동형 접합인 사람의 경우, 및 아폴리포단백질 E4 대립 형질을 위한 동형 접합성과 관련한 상태로 구성된 그룹으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 아밀로이드 관련 상태에서 원섬유 형성과 관련한 세포 퇴화 및 독성의 방지를 위한 약제 조성물에 있어서, 제 1항의 크리사민 G의 유도체 및 의학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
  17. 생체검사(biopsy) 또는 검시의 인간 또는 동물 조직에서 아밀로이드 침적을 검출하는 방법에 있어서,
    (a) 제 1항에 따른 화합물의 용액에서 포르말린(formalin) 고정 조직을 배양해서 표지된 침적층을 형성하는 단계; 및
    (b) 상기 표지된 침적층을 검출하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 용액은 제 1항의 화합물로 포화된 25-100% 에탄올(나머지는 물)로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 17항에 있어서, 상기 검출은 명시야(bright field), 형광, 레이저 동초점(laser confogel) 및 교차편파 현미경검사법으로 선택된 그룹으로부터 선택된 미시적 검사에 의하여 성취되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 생체 검사 또는 검시 조직에서 아밀로이드의 양을 측정하는 방법에 있어서,
    (a) 생체 검사 또는 검시조직의 균질화액으로 크리사민 G의 방사성표지 유도체를 배양하는 단계;
    (b) 조직 미결합(tissue-unbound) 크리사민 G 방사성표지 유도체로 부터 조직 결합을 분리하는 단계;
    (c) 조직 결합 크리사민 G 방사성표지 유도체의 양을 측정하는 단계;
    (d) 조직 결합 크리사민 G의 방사성표지 유도체의 유닛(unit)을 표준상태와 비교하여 조직 100mg당 아밀로이드 마이크로 그램의 유닛으로 변경하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 크리사민 G 방사성표지 유도체는 식 1의 아밀로이드 결합 화합물 또는 그것의 수용성, 비독성염인 것을 특징으로 하는 방법.
    ＜식 1＞
    단 :
    (1) ZZ는 C≡C, CR'=CR', CR'2-CR'2,C≡C-CR'=CR' 또는 CR'2-CR'2-CR'2-CR'2,(여기서 각각의 R'는 H 또는 저급 알킬 그룹으로 독립적으로 표현된다.);
    (2) X는 C(R")2(여기서 각각의 R"는 독립적으로 H, F, Cl, Br, I, 저급 알킬 그룹(lower alkil group), (CH2)nOR', 단 n은 1, 2, 또는 3, CF3, CH2-CH2F, O-CH2-CH2F, CH2-CCH2-CH2F, O-CH2-CCH2-CH2F, CN, (C=O)-R', N(R')2, NO2, (C=O)N(R')2O(CO)R', OR', SR', COOR', Rph, CR'=CR'-Rph, CR'2-CR'2-Rph, (여기서, Rph는 R", 트리-알킬 주석, 테트라졸 또는 식
    (R'는 H 또는 저급 알킬 그룹이다.)
    을 갖는 옥사디아졸로 정의 되는 소정의 비-페닐 치환기로 부터 선택된 페닐 치환기인 비치환 또는 치환 페닐 그룹을 나타낸다.) 또는 X는 CR'=CR', N=N, C=O, O, NR'(여기서, R'는 H 또는 저급 알킬 그룹이다.);
    (3) 각각의 R1및 R2는 독립적으로 H, F, Cl, Br, I, 저급 알킬 그룹(lower alkil group), (CH2)nOR'(단 n은 1, 2, 또는 3), CF3, CH2-CH2F, O-CH2-CH2F, CH2-CCH2-CH2F, O-CH2-CCH2-CH2F, CN, (C=O)-R', N(R')2, NO2, (C=O)N(R')2O(CO)R', OR', SR', COOR', 트리-알킬 주석, Rph, CR'=CR'-Rph, CR'2-CR'2-Rph로 표현되고,
    {단, Rph는 R1또는 R2, 아래 식
    (R'는 H 또는 저급 알킬 그룹이다.)
    을 갖는 옥사디아졸 또는 테트라졸, 또는 아래 식
    (단 R6및 R9는 저급 알킬 그룹)
    을 갖는 트리아진으로 정의 되는 소정의 비-페닐 치환기로 부터 선택된 페닐 치환기인 비치환 또는 치환 페닐 그룹을 나타낸다}
    (4) 각각의 Q는 독립적으로 아래 식 IA, IB, IC, ID, IE, IF 및 IG로 부터 선택된 적어도 하나.
    (단, IA는 식
    을 갖고, (단, R3, R4, R5, R6또는 R7은 상기 R1과 동일하게 정의된다.)
    IB는 식
    을 갖고, (단, R10, R11, R12, R13, R14, R15또는 R16은 상기 R1과 동일하게 정의된다.)
    IC는 식
    을 갖고, (단, R17, R18, R19, R20또는 R21은 상기 R1과 동일하게 정의된다.)
    ID는 식
    을 갖고, (단, R22, R23또는 R24는 상기 R1과 동일하게 정의되고,
    은 아래 6개의 식 중의 하나의 복합고리를 나타낸다.)
    IE는 식
    을 갖고, (단, R25, R26또는 R27은 상기 R1과 동일하게 정의되고,
    은 아래 6개의 식 중의 하나의 복합고리를 나타낸다.)
    IF는 식
    을 갖고, (단, R28, R29, R30, R31또는 R32의 하나는 상기 식 1에서 정의된 ZZ 결합이고, R28, R29, R30, R31또는 R32의 나머지들은 상기 R1과 동일하게 정의된다.)
    IG는 식
    을 갖는다. (단, R33, R34, R35, R36, R37, R38또는 R39의 하나는 상기 식 1에서 정의된 ZZ 결합이고, 나머지 R33, R34, R35, R36, R37, R38또는 R39는 독립적으로 상기 R1과 동일하게 정의된다.)
  22. 치환기 R1-R7및 R10-R39중의 적어도 하나는 화학식 1에서 특정된125I,3H 및 탄소함유 치환기로 구성된 그룹으로부터 선택된 방사성표지가 부착되어 있고, 탄소 중의 적어도 하나가14C인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 정상 대뇌와 알츠하이머 병에 걸린 대뇌를 구별하는 방법에 있어서,
    (a) 정상 피험체 및 알츠하이머 병에 걸린 것으로 추측되는 피험체로 부터 소뇌 및 상기 소뇌가 아닌 대뇌의 다른 영역에서 조직을 얻는 단계;
    (b) 방사성표시 크리사민 G 유도체로 상기 조직을 배양하여, 상기 조직에 있는 아밀로이드가 상기 방사성표시 크리사민 G 유도체와 결합하는 단계;
    (c) 제 20항의 방법에 따라, 상기 방사성표시 크리사민 G 유도체와 결합한 아밀로이드의 양을 측정하는 단계;
    (d) 소뇌에 있는 아밀로이드의 양과 소뇌 이외의 대뇌 지역에서 아밀로이드의 양의 비율을 측정하는 단계;
    (e) 정상 피험체로부터 얻은 상기 조직에서 상기 아밀로이드 양의 상기 비율과 알츠하이머 병을 갖는 것으로 추측되는 피험체로부터 얻은 상기 조직에서 상기 아밀로이드 양의 비율을 비교하는 단계;
    (f) 알츠하이머 병을 갖는 것으로 추측되는 피험체의 대뇌로부터 얻은 상기 비율이 정상 피험체의 대뇌로부터 얻은 상기 비율의 90%이상인 경우 알츠하이머 병의 존재를 확정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단계.
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