SK144099A3 - Alkyl, alkenyl and alkynyl chrysamine g derivatives for the antemortem diagnosis of alzheimer's disease and i(in vivo) imaging and prevention of amyloid deposition - Google Patents

Alkyl, alkenyl and alkynyl chrysamine g derivatives for the antemortem diagnosis of alzheimer's disease and i(in vivo) imaging and prevention of amyloid deposition Download PDF

Info

Publication number
SK144099A3
SK144099A3 SK1440-99A SK144099A SK144099A3 SK 144099 A3 SK144099 A3 SK 144099A3 SK 144099 A SK144099 A SK 144099A SK 144099 A3 SK144099 A3 SK 144099A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
group
chrysamine
lower alkyl
amyloid
independently
Prior art date
Application number
SK1440-99A
Other languages
English (en)
Inventor
William E Klunk
Jay W Pettegrew
Chester A Mathis Jr
Original Assignee
Univ Pittsburgh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Pittsburgh filed Critical Univ Pittsburgh
Publication of SK144099A3 publication Critical patent/SK144099A3/sk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/44—Iso-indoles; Hydrogenated iso-indoles
    • C07D209/48—Iso-indoles; Hydrogenated iso-indoles with oxygen atoms in positions 1 and 3, e.g. phthalimide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B59/00—Introduction of isotopes of elements into organic compounds ; Labelled organic compounds per se
    • C07B59/001—Acyclic or carbocyclic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B59/00—Introduction of isotopes of elements into organic compounds ; Labelled organic compounds per se
    • C07B59/002—Heterocyclic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C63/00—Compounds having carboxyl groups bound to a carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C63/66—Polycyclic acids with unsaturation outside the aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/76—Esters of carboxylic acids having a carboxyl group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C69/94—Esters of carboxylic acids having a carboxyl group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring of polycyclic hydroxy carboxylic acids, the hydroxy groups and the carboxyl groups of which are bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/78—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms, with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C07D213/79—Acids; Esters
    • C07D213/80—Acids; Esters in position 3
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D217/00—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems
    • C07D217/22—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to carbon atoms of the nitrogen-containing ring
    • C07D217/24—Oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D221/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom as the only ring hetero atom, not provided for by groups C07D211/00 - C07D219/00
    • C07D221/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom as the only ring hetero atom, not provided for by groups C07D211/00 - C07D219/00 condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D221/04—Ortho- or peri-condensed ring systems
    • C07D221/06—Ring systems of three rings
    • C07D221/14—Aza-phenalenes, e.g. 1,8-naphthalimide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D237/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazine or hydrogenated 1,2-diazine rings
    • C07D237/26—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazine or hydrogenated 1,2-diazine rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D237/28—Cinnolines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D237/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazine or hydrogenated 1,2-diazine rings
    • C07D237/26—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazine or hydrogenated 1,2-diazine rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D237/30—Phthalazines
    • C07D237/32—Phthalazines with oxygen atoms directly attached to carbon atoms of the nitrogen-containing ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D257/00—Heterocyclic compounds containing rings having four nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D257/02—Heterocyclic compounds containing rings having four nitrogen atoms as the only ring hetero atoms not condensed with other rings
    • C07D257/04—Five-membered rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D261/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-oxazole or hydrogenated 1,2-oxazole rings
    • C07D261/20—Heterocyclic compounds containing 1,2-oxazole or hydrogenated 1,2-oxazole rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D265/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom and one oxygen atom as the only ring hetero atoms
    • C07D265/02—1,2-Oxazines; Hydrogenated 1,2-oxazines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D265/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom and one oxygen atom as the only ring hetero atoms
    • C07D265/04—1,3-Oxazines; Hydrogenated 1,3-oxazines
    • C07D265/12—1,3-Oxazines; Hydrogenated 1,3-oxazines condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D265/14—1,3-Oxazines; Hydrogenated 1,3-oxazines condensed with carbocyclic rings or ring systems condensed with one six-membered ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D265/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom and one oxygen atom as the only ring hetero atoms
    • C07D265/04—1,3-Oxazines; Hydrogenated 1,3-oxazines
    • C07D265/12—1,3-Oxazines; Hydrogenated 1,3-oxazines condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D265/14—1,3-Oxazines; Hydrogenated 1,3-oxazines condensed with carbocyclic rings or ring systems condensed with one six-membered ring
    • C07D265/24—1,3-Oxazines; Hydrogenated 1,3-oxazines condensed with carbocyclic rings or ring systems condensed with one six-membered ring with hetero atoms directly attached in positions 2 and 4
    • C07D265/26—Two oxygen atoms, e.g. isatoic anhydride
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D271/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two nitrogen atoms and one oxygen atom as the only ring hetero atoms
    • C07D271/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two nitrogen atoms and one oxygen atom as the only ring hetero atoms not condensed with other rings
    • C07D271/10—1,3,4-Oxadiazoles; Hydrogenated 1,3,4-oxadiazoles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F7/00—Compounds containing elements of Groups 4 or 14 of the Periodic System
    • C07F7/22—Tin compounds
    • C07F7/2208—Compounds having tin linked only to carbon, hydrogen and/or halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
    • C09B23/14—Styryl dyes
    • C09B23/141—Bis styryl dyes containing two radicals C6H5-CH=CH-
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer

Description

Oblasť vynálezu
Predkladaný vynález sa týka identifikácie zlúčenín, ktoré sú vhodné na zobrazenie amyloidu u žijúcich pacientov. Presnejšie sa predkladaný vynález týka spôsobov na zobrazenie depozít amyloidu v mozgu in vivo na diagnózu Alzheimerovej choroby uskutočnenú za života pacientov. Predkladaný vynález sa tiež týka terapeutického použitia takých zlúčenín
Doterajší stav techniky
Alzheimerova choroba (AD) je neurodegenerativne ochorenie charakterizované stratou pamäte a inými kognitívnymi deficitmi. McKhann et al., Neurology 34. 939 (1984). Je najčastejšou príčinou demencie v Spojených štátoch amerických. AD môže postihnúť už jedinca vo veku 40 - 50 rokov V súčasnosti nie je - vzhľadom na to, že prítomnosť ochorenia je zle diagnostikovateľná bez nebezpečnej biopsie mozgu - doba nástupu ochorenia známa Prevalencia AD sa zvyšuje s vekom a vo veku 85 - 90 rokov je postihnutých asi 40 - 50 % populácie. Evans et al , JAMA 262' 2551 (1989), Katzman, Neurology 43.13 (1993)
Podľa definície je AD definitívne diagnostikovaná pri vyšetrení mozgového tkaniva, obvykle pri pitve Khachaturian, Árch Neurology 34' 939 (1984) Neui'opatologicky je toto ochorenie charakterizované prítomnosťou neuritických plakov (NP), neurofibrilárnych sietí (NFT) a stratou neurónov, spolu s mnohými ďalšími nálezmi Mann, Mech. Ageing Dev 31' 213 (1985) Rezy mozgovým tkanivom obetí Alzheimerovej choioby vykazujú prítomnosť amyloidu vo forme proteínových extracelulárnych jadier neuritických plakov, ktoré sú charakteristickým lysom AD
T
Amyloidové jadrá n eu ľi t i c k γ c Ii plakov sú zložené z proteínu nazývaného β-amyloid (Αβ), ktorý je uspoi iadaný predovšetkým do štruktúry β-zloženého listu Mori et al , Journal of Biologieal Chemistry 267' 17082 (1992), Kirschner et al., I’NAS S3 503 (1986) Neuritické plaky sú skorým a nemenným aspektom ochorenia. Mann et al , J. Neurol. Sci 89: 169; Mann, Mech. Ageing Dev. 31: 213 (1985); Terry et al , J. Neuropathol Exp. Neurol 46’ 262 (1987).
K počiatočnej depozícii Αβ pravdepodobne dochádza dlho pred tým, než sa objavia klinické príznaky V súčasnosti doporučované minimálne mikroskopické kritérium na diagnózu AD je založené na počte neuritických plakov nájdených v mozgu Khachaturian, Árch. Neurol., vyššie (1985) Na nešťastie je hodnotenie počtu neuritických plakov uskutočniteľné až po smrti
Neuritické plaky obsahujúce amyloid sú prevažujúcim rysom vybraných oblastí mozgu pri AD, rovnako ako pri Downovom syndróme a u jedincov homozygotných pre apolipoproteínovú E4 alelu, u ktorých je značná pravdepodobnosť vzniku AD. Corder et al., Science 261: 921 (1993); Divry, P , J Neurol Psych. 27. 643-657 (1927); Wisniewsky et al. v Zimmerman, H M (ed ) Progress in neuropathology (Grúne and Stratton, N.Y. 1973), str. 1-26 Mozgový amyloid je možné ľahko preukázať farbením mozgových rezov tioťlavínom S alebo Kongo červeňou Puchtler et al., J. Histochem Cytochem. 10' 35 (1962) Farbenie kongo červeňou je charakterizované dichroickým charakterom, ktorý má žlto-zelenú polarizačnú farbu Dichroická väzba je dôsledkom štruktúry β-zloženého listu amyloidových proteínov Glenner, G, N. Eng. J. Med 302 1283 (1980) Detailný prehľad biochémie a histochémie amyloidu je uvedený v Glenner, N Eng J Med 302 133 3 (1980)
V súčasnosti je diagnostika Al) uskutočnená väčšinou pomocou hodnotenia klinických kntéiii, biopsie mozgu a post-mortálneho štúdia tkanív Snahy výskumníkov vo vývoji metód diagnostiky Alzheimerovej choroby in vivo zahrnujú (I) genetické testovanie, (2) imunotesty a (3) zobrazovacie techniky
Dôkaz, že abnormality v metabolizme A β sú nevyhnutné a dostatočné pre vznik AD. je založený na objave bodových mutácií v Αβ prekurzorovom proteine v niekoľkých vzácnych rodinách s autozomálne dominantnou formou AD. Hardy, Níilure (ienctics I 233 (1992), llaidy ct al , Science 256 184 (1992) Tieto mutácie sa vyskytujú blízko N- a C-terminálnych štiepiacich miest nutných pre tvoibu Αβ z piekurzorového proteínu St. George-Hyslop et al , Science 235; 8S> (| 9X7), Kang et al , Náture 325 733 (1987); í’otter WO 92/17152 Genetická analýza veľkého počtu AD rodín však preukázala, že AD je geneticky heterogénna Si Geoige-llyslop ct al , Náture 347. 194 (1990) Vazba markerov na ehiomozóm 2 1 je preukázaná iba u niekoľkých rodín s AD so skorým nástupom a nie je preukázaná u žiadnych rodín s AD s neskorým nástupom ochorenia. Novšie bol identifikovaný gén na chromozóme 14, ktorého produkt predpokladane obsahuje mnoho transmembránových domén a napodobňuje integrálny membránový proteín. Sherrington et al , Náture 375. 754-760 (1995). Tento gén môže byť zodpovedný až za 70 % autozomálne dominantnej AD so skorým nástupom Piedbežné dáta naznačujú, že táto mutácia na chromozóme 14 spôsobuje zvýšenie produkcie Λβ Scheuner et al , Soc. Neurosci Abstr 2 1 1500 (1995). Mutácia veľmi podobného génu bola identifikovaná na chromozóme 1 vo Volga Germán rodinách s AD so skorým nástupom Levy-Lahad et al , Science 269: 973-977 (1995)
Skrining genotypu apolipoproteínu E bol navrhnutý ako cieľ na diagnostiku AD Scott, Náture 366. 502 (1993), Roses, Ann Neurol 38 6-14 (1995) Avšak, táto technika má určité nedostatky, pretože alela apolipoproteínu E je iba rizikovým faktorom AD, nie však markerom ochorenia Nie je prítomná u mnohých pacientov s AD a je prítomná u mnohých starých jedincov bez demencie. Bird, Ann Neurol. 38. 2-4 (1995)
Imunologické testy boli vyvinuté na detekciu prítomnosti tieurocliemickveh maikerov u pacientov s AD a na detekciu amyloidového proteínu asociovaného s AD v mozgovomiechovom moku Warner, Anál Chem 59 I2O3A (1987), WO č 92/17 152, ľotler, Glenner et al , IJ S Patent č 4666829 Bolo preukázané, že tieto metodv nedetegujú Al) u všetkých pacientov, predovšetkým nie v skorých štádiách ochorenia, a tieto metódy sú relatívne invazivne a vyžadujú punkciu mozgovomiecliového moku ľiež boli uskutočnené pokusy o vývoj nm4 noklonálnych protilátok ako sond na zobrazenie Αβ. Majocha et al., J. Nucl Med. 33: 2184 (1992); Majocha et al , WO 89/06242 a Majocha et al., U S Patent č 523 1000 Hlavnou nevýhodou týchto protilátkových sond je obtiažny prechod týchto veľkých molekúl hematoencefalickou bariérou. Použitie protilátok na in vivo diagnostiku AD vyžaduje značné abnormality hematoencefalickej bariéry umožňujúce prechod do mozgu. Neexistujú presvedčivé dôkazy o tom, že u AD existujú také abnormality hematoencefalickej bariéry. Kalaria, Cerebrovascular and Brain Metabolism Reviews 4: 226 (1992).
Αβ protilátky sú tiež nevýhodné na použitie v diagnostike AD, pretože sa obvykle viažu na depozity Αβ neobsahujúce Αβ štruktúry β-listu (nefibrilárne) mimo neuritických plakov. Yamaguchi et al., Acta Neuropathol 77. 314 (1989) Tieto depozity môžu byť iným typom lézií, ktoré nie sú nevyhnutne nutne zapojené v procese demencie pri AD Táto skutočnosť bola podporená objavmi depozít nefíbrilárneho amyloidu u kognitívne normálnych kontrol a starých psov. Moran et al., Medicína Clinica 98: 19 (1992); Shimada et al., Journal of Veterinary Medical Science 54. 137 (1992); Ishihara et al., Brain Res. 548: 196 (1991); Giaccone et al., Neurosci. Lett. 1 14 178 (1990). Aj vtedy, pokiaľ sú depozity nefíbrilárneho amyloidu predchodcami neuritických plakov, môžu byť kľúčovou patologickou udalosťou pri AD procese, ktorý mení jasne benigné depozity nefíbrilárneho amyloidu na neuritické plaky s okolnou degeneráciou. Preto je potrebná sonda, ktorá je špecifická pre depozity fíbrilárneho Αβ a NFT ako viacej špecifický marker pre patofyziológiu AD, než sú protilátky, ktoré sa viažu tiež na depozity nefíbrilárneho amyloidu
Nedávno bol rádioaktívne značený Αβ peptid použitý na značenie difúznych, kompaktných a neuritických plakov v rezoch z mozgu od pacientov s AD Avšak, tieto peptidy majú všetky nevýhody protilátok. Konkrétne, peptidy za normálnych okolností neprechádzajú hematoencefalickou bariérou v množstvách nevyhnutných na zobrazenie
Kongo červeň môže byť použitá na diagnostiku amyloidu in vivo v parenchýmových tkanivách iných než mozgové tkanivo. Avšak, Kongo červeň nie je pravdepodobne vhodná na in vivo diagnostiku depozít Αβ v mozgu, pretože iba
0,03% podanej dávky jódom značenej Kongo červene sa dostane do mozgového parenchýmu Tubis et al , J Amer. Pharm. Assn 49: 422 (1960). Rádioaktívnym jódom značené bisdiazobenzidínové zlúčeniny príbuzné Kongo červeni, ako je Benzo Orange R a Direct Blue 4, boli navrhnuté ako použiteľné zlúčeniny pre in vitro a in vivo detekciu prítomnosti a lokalizáciu depozít amyloidu v orgáne pacienta. Quay et al., U S patenty č. 5039511 a 4933 156. Avšak, rovnako ako Kongo červeň, všetky tieto zlúčeniny navrhnuté Quayom obsahujú silne acidické skupiny kyseliny sulfónovej, ktoré významne obmedzujú vstup týchto zlúčenín do mozgu a tak značne sťažujú dosiahnutie detegovateľného množstva alebo množstva dostatočného na zobrazenie v mozgovom parenchýme.
Nemožnosť hodnotenia depozít amyloidu pri AD pred smrťou značne obmedzuje štúdium tejto devastujúcej choroby. Spôsob kvanifíkácie depozít amyloidu pred smrťou je potrebný ako diagnostický prostriedok pri diagnostike miernych alebo klinicky nejasných prípadov, tak ako aj prostriedok na sledovanie účinnosti terapie zameranej na prevenciu depozícií Αβ. Preto je nanajvýš dôležité získanie bezpečnej a špecifickej metódy na diagnostiku AD za života pomocou zobrazenia amyloidu v mozgovom parenchýme in vivo. Aj napriek rôznym pokusom, ktoré boli uskutočnené v diagnostike AD in vivo, neexistujú v súčasnosti sondy pre mozgový amyloid použiteľné za života jedinca. Žiadna metóda nevyužila sondu s vysokou afinitou pre amyloid, ktorá by mala nízku toxicitu, ktorá by prekonávala hematoencefalickú bariéru a ktorá by sa účinnejšie viazala na AD oblasti mozgu, ako na oblasti normálneho mozgu, a tak by identifikovala AD depozity amyloidu v mozgu pred smrťou pacienta Žiadna in vivo metóda na diagnostiku AD nespĺňala tieto kritériá.
Veľmi nové dáta naznačujú, že zlúčeniny viažuce sa na amyloid majú terapeutický potenciál u AD a u diabetes mellitus typu II. Ako bolo uvedené vyššie, existujú dve široké kategórie plakov v mozgu pacientov s AD, difúzne a neuritické (klasické). Zdá sa, že difúzne plaky neindukujú morfologické reakcie, ako sú reaktívne astrocyty, dystrofické neurity, mikroglie, strata synapsií a plná aktivácia komplementu, ktorá je zisťovaná v neuritických plakoch. Joachim et al , Am. J Pathol. 135 309 (1989), Masliah et al , loc. cit 137' 1293 (1990), Lue and Rogers, Dementia 3 308 (1992) Tieto morfologické reakcie všetky naznačujú, že v oblastiach susediacich s depozitmi fibrilárneho Αβ neuritických plakov prebiehajú neurotoxické procesy a degenerácie buniek Αβ-indukovaná neurotoxicita a degenerácia buniek bola opísaná na mnohých typoch buniek in vitro Yankner et al , Science 250 279 (1990); Rolier et al , BBRC 174. 572 (1991); Frantsehy el al , Proc Natl Acad Sci 88 83362 (1991), Shearman et al , loc cit 91 1470 (1994) Tiež bolo opísané, že agregácia Αβ peptidu je nutná pre neurotoxicitu in vitro Yankner. Neuiobiol Aging. 13: 615 (1992). Odlišnosti v stave agregácie Αβ v difúznych a neuritických plakocli môžu vysvetliť chýbanie neurotoxickej reakcie v okolí difúznych plakov. Lorenzo and Yankner, Proc Natl. Acad Sci. 91: 12243 (1994) Nedávno tri laboratóriá uviedli výsledky, ktoré naznačujú, že Kongo červeň inhibuje Αβ-indukovanú neurotoxicitu a degeneráciu buniek in vitro. Burgevin et al., NeuroReport 5' 2429 (1994); Lorenzo and Yankner, Proc. Natl. Acad. Sci 91’ 12243 (1994); Pollack et al , Neuroscicnce Letters 184 113 (1995), Pollack et al , Neuroscience Letters 197: 211 (1995). Zdá sa, že mechanizmus zahrnuje ako inhibíciu tvorby fibril, tak prevenciu neurotoxického pôsobenia vytvorených fibril Lorenzo and Yankner, Proc. Natl Acad Sci. 91: 12243 (1994) Zdá sa, že Kongo červeň tiež chráni bunky pankreatických ostrovčekov pred toxicitou amylínu. Lorenzo and Yankner, Proc. Natl. Acad, Sci 91 12243 (1994) Amylin je fibrilärny peptid podobný Αβ, ktorý sa akumuluje v pankrease pri diabetes mellitus 2 typu
WO 96/34853 (Klunk a spol ) opisuje konkrétne azo-, vinylové a alkinylové zlúčeniny, viažuce sa na amyloid Ukázalo sa, že deriváty chryzamínu G (Chrysamine G) podľa WO 96/34853 sú použiteľné na diagnostiku Alzheimerovej choroby v dôsledku schopnosti špecificky viazať depozity amyloidu
V odbore je známe, že niektoré azo-farbivá môžu byť karcinogénne Morgan et al , Environmental Health Perspectives, IO2(supp ) 2: 63-78 (1994) Zdá sa, že táto potenciálna karcinogénna jc založená na skutočnosti, žc azo-farbivá su v značnej miere metabolizovane na voľné pôvodné aminy baktériami v čreve. Ccrniglia et al , Biochem Biophv'· Res Comin 107 1224-1229 (1982) V prípade benzidinovýcb farbív (a mnohých iných substituovaných benzidmov) |c karΊ cinogénom práve voľný amín Tieto skutočnosti majú malý vplyv pre štúdie zobia/.ovaniíi amyloidu, v ktorých sú extrémne malé množstvá rádioaktívne značeného ľaibiva s vysokou špecifickou aktivitou injikované priamo do krvného riečišťa V tomto prípade bude podané množstvo zanedbateľné a farbivo bude obchádzať črevné baktérie
V prípade terapeutického použitia majú tieto skutočnosti zásadný význam. Uvoľňovanie známeho karcinogénu z terapeutickej zlúčeniny je neprijateľné Druhý problém súvisiaci s metabolizmom diazo-farbiv je to, že značné množstvo podaného lieku je metabolizovane čievnými baktériami pred absorpciou Táto znížená biologická dostupnosť je nevýhodou aj vtedy, pokiaľ sú uvoľňované metabolity neškodné
Preto existuje potreba zlúčenín s väzbou na amyloid, ktoré sú podobné Kongo červeni, ale ktoré vstupujú do mozgu (Kongo červeň nevstupuje) Také zlúčeniny môžu byť použité na prevenciu degenerácie buniek spojenej s tvorbou fibríl a preto na liečbu patologických stavov pri ochoreniach spojených s amyloidom, ako je AD alebo Downov syndróm, a na liečbu toxických vplyvov na ostrovčeky slinivky brušnej pri diabetes mellitus 2 typu.
Ďalej existuje potreba zlúčenín s väzbou na amyloid, ktoré sú netoxické a biologicky dostupné a preto môžu byť použité ako terapeutické činidlá.
P o d si a i a vynálezu
Predmetom predkladaného vynálezu ie teda bezpečná, špecifická metóda na diagnostiku AD za života pacienta pomocou in vivo zobrazenia amyloidu v mozgovom parenchýme. Iným predmetom predkladaného vynálezu je spôsob na identifikáciu depozit amyloidu v mozgu za života pacienta s použitím sondy s vysokou afinitou pre amyloid, kioiá má nízku toxicitu, môže prechádzať hemaioenceľaIickou bariérou a rozlišuic AD mozog od normálneho mozgu Iným predmetom predkladaného vynálezu jľ spôsob liečby AD, ktorý bráni ukladaniu alebo toxicite Αβ Iným predmetom predkladaného vynálezu jc spôsob na farbe8 nie a detekciu depozit amyloidu v biopsiách alebo tkanivových rezoch zhotovených pn pitve. Iným predmetom predkladaného vynálezu je spôsob na kvantifikáciu depozit amyloidu v homogenátoch biopsii alebo tkanivových rezov zhotovených pri pitve
Na splnenie týchto a iných predmetov preto vynález v jednom aspekte obsahuje zlúčeninu, ktorá sa viaže na amyloid, majúcu vzorec I, alebo jej netoxickú soľ rozpustnú vo vode (I)
Ro R1R1 Ro χ p / 1 J / 2 *7 A?
Q—zQz
R2 RxRi R^
o— zQz—Čz-zOz—c ri-Q-r:
Q—O-y^-zOz—q R2 R2 alebo R2 ,R2 R2 R2
O—zQz· ;~y_^~zCz —Q R2 R2 kde je jeden zo skupiny zahrnujúcej C=C, CR’=CR’, CR’2-CR’2,
C^C-OC, CR’ = CR’- CR’ = CR’, C=C- CR’= CR’ alebo CR’2- CR’2- CR’2- CR’2 (kde každý R’ je nezávisle H alebo nižší alkyl),
X je C(R”)2 (kde každý R” je nezávisle H, F, Cl, Br, 1, nižší alkyl, (CH2)„OR’, kde n = 1,2 alebo 3, CF.,, CH2-CH2F, O-CH2-CH2F, CH2-CH2-CH2F, O-CH2-CH2-CH2F, CN, (C-O)-R’, N(R’)2, NO2i (C=O)N(R’)2 O(CO)R\ OR’, SR’, COOR’, RPh, CR’^CR’-Rpí,, CR’2- CR’2-R|>|, (kde Rpi, predstavuje nesubstituovanú alebo substituovanú fenylovú skupinu, v ktorej sú substituenty vybrané z akýchkoľvek nefenylových substituentov definovaných pre R”, tri-alkylcínu, tetrazolu alebo oxadiazolu vzorca alebo
R' \
kde R’ je II alebo nižši alkyl) alebo X ie CR’ CR’, N=N, C=O. O, \'R’ (kde R’ je H alebo nižší alkyl), S alebo SO2, každý R| a R? je je nezávisle H, F, Cl, Br, I, nižši alkyl, (CH2)„OR’, kde n = 1, 2 alebo 3, CF.,, CH2-CH2F, O-CH2-CH2F, CH2-CH2-CH ,F, O-CH2-CH2-CH2F, CN, (C=O)-R’, N(R’)2, NO2, (C=O)N(R’)2 O(CO)R’, OR’, SR’, COOR’, trialkyleín, Rpii, CR’=CR’-R|.h, CR’2- CR’2-Rľi, (kde Rpi, predstavuje nesubstituovanú alebo substituovanú fenylovú skupinu, v ktorej sú substituenty vybrané z akýchkoľvek neťenylových substituentov definovaných pre Ri a R2, tetrazolu alebo oxadiazolu vzorca
R’ \
alebo
N (kde R’ je H alebo nižší alkyl), alebo triazénu vzorca
N
Rg (kde Rs a R9 sú nižší alkyl), alebo alebo každý Q |e nezávisle vybraný z jednej z nasledujúcich ši 1 ukiuľ
ΙΑ, IB, IC, ID, IE, IF a IG, kde
ΙΛ ma nasledujúcu štruktum
ΙΟ (ΙΑ) kde každý z R?, Rj, Rj, Rr, alebo (uvedený vyššie).
IB má nasledujúcu štruklúi u
ko ako Rj (uvedený vyššie),
Ric je nezávisle definovaný rovnaIC má nasledujúcu štruktúru' (ic)
kde každý z R|7, R|g, R|9, R2() alebo R2i je nezávisle definovaný rovnako ako R! (uvedený vyššie),
ID má nasledujúcu štruktúru (ID)
alebo
I I kde k;i/dv z K .... K2i alebo l<2q je nezávisle definovaný rovnako ako K, (uvedený \ VŠŠIĽ ) .1
/ piedstavuje heterocyklický kruh jedného z nasledujúcich šiestich vzorcov.
\ / c=c \ / c=c fl fl-fl \ / \ / “Λ \ / ,c=c * n ·
IE má nasledujúcu štruktúru:
alebo r27'
kde k.izdv z R..<. K_,f. alebo IG·» je nezávisle definovaný rovnako ako R, (uvedený wš.Šie) a
pi eilst a vn,e helcrocyklický kmh luilného z n a s I ccl u | ú ci ch šiestich vzoiľov \ / c=c
H0-4s /° \=c/
ΛΧ 0=k 11 ' H—H \ / ,C=C \ / ,c=c θ=< Jo \ /
C=C
A/.
o
IF má nasledujúcu struk túru $30
(IF)
N R
B alebo
kde presne jeden z R28, R29. R.ui, R?i alebo R?2 je väzba definovaná pre vzoiec 1 a každý ďalší z R2r, Rio. R?», R?i alebo R-,2 je nezávisle definovaný rovnako ako R| (uvedený vyššie);
Kí má nasledujúcu štruktúru (IG)
J kde presne jeden z R... R;i R-.<, R R -.7, R™ alebo R.;·» je va/.ba d e 11 nov,ma pre vzoici i a ka/dy ďalší /. R·.;, R-.j R.-.s, Ku,. R;?, R., alebo R·,., je nezávisle def’movanx rovnako ako R, (uvedený vvššie).
Iným predmetom pi odkladaného vynálezu je zlúčenina, klom sa viaže na amyloid, majúca vzoiec I, ako bol definovaný vyššie, alebo jej netoxická soľ lozpustná vo vode. v ktoiei |e aspoň jeden zo substituentov R1-R7 a Rm-R-.u vyhnutý zo skupiny sk I a d a 1 ú c c j sa z 1 ’’ I, l2'l, 7f’Br, 75Br, lsľ, 'Ί7. 1 1, CH2-CII2lí!F, O-CH2-CH.-,sF, Clh-Cllj-IÍfF, O-CH2-CH2-CH2-IXF a substitueiuov obsahujúcich uhlík, ako su uvedené pre vzorec I, kde aspoň jeden uhlík je C alebo ’C
Iným predmetom predkladaného vynálezu je zlúčenina, ktoiá sa viaže na amyloid, majúca vzorec I, ako bol definovaný vyššie, alebo jej netoxická soľ rozpustná vo vode, ktorá sa viaže na Αβ s disociačnou konštantou (Κρ) medzi 0,0001 a 10,0 μ M pn meraní väzby na syntetický Αβ peptid alebo väzby na mozgové tkanivo pri Alzheimerovej chorobe.
Iným predmetom predkladaného vynálezu je spôsob syntézy zlúčeniny, ktorá sa viaže na amyloid, majúcej vzorec I, ako bol definovaný vyššie, alebo jej netoxickej soli rozpustnei vo vode, v ktorej je aspoň jeden zo substituentov RiR7 a Rin-R.19 vybraný zo skupiny skladajúcej sa z 13,I. Ι2Ί, 7f’Br, 7'Br, ti!F alebo UF, kde uvedený spôsob obsahuje stupeň reakcie zlúčeniny, ktoiá sa viaže na aniyluid, map’icej vz.niuc I. ako bol definovaný vyššie, alebo |ej netoxickej soli rozpustnej vo vode, v ktoiej je a-.poň jeden zo substituentov R1-R7 a Rm-R-,.) trialkylcin, s lialogenaenym činidlom obsahujúcim 1 ’’11, l2'l. 7f’Bi, ’lii, is|·' alebo ľ>r
FŠte iným predmetom predkladaného vynálezu je farmaceutický piostriedok pi e in vivo zobiazenic depo/ii amvloidu. ktorý obsahipe (a) zlúčeninu, ktoiá sa viaže 11a amyloid, mapicu vzoiei 1. ako bol definovaný vvššie, alebo jej netoxickú soľ lozpustnú vo vode, v klo 1 e 1 je aspoň jeden zo substituentov R1-R7 a Rm-R·.·. vyhraný zo skupiny s k I a d a 111 c e 1 sa z 1'11, Ι2Ί, 7í’Bi, 7,Br. 'SF, 'Ί7, a sub14 stituentov obsahujúcich uhlík, ako sú uvedené pre vzorec 1, kde aspoň jeden uhlík je C alebo l3C, a (b) farmaceutický prijateľný nosič
Ešte iným predmetom predkladaného vynálezu je spôsob pre in vivo detekciu depozít amyloidu u jedinca, ktorý obsahuje kroky, (a) podanie detegovateľného množstva farmaceutického prostriedku, a (b) detekciu väzby zlúčeniny na depozity amyloidu u uvedeného jedinca. Predmetom predkladaného vynálezu je tiež spôsob pre in vivo detekciu depozít amyloidu u jedinca, kde sú depozity amyloidu umiestnené v mozgu subjektu Tento spôsob podľa predkladaného vynálezu môže byť použitý u jedincov, u ktorých existuje podozrenie na ochorenie spojené s amyloidózou alebo syndróm vybraný zo skupiny zahrnujúcej Alzheimerovu chorobu, Downov syndróm a u homozygótov pre alelu apolipoproteínu E4
Iným predmetom predkladaného vynálezu sú farmaceutické prostriedky a spôsoby na prevenciu degenerácie buniek a toxicity spojenej s tvorbou fibríl u stavov spojených s amyloidózou, ako je AD a diabetes mellitus 2. typu. Také farmaceutické prostriedky obsahujú alkylové, alkenylové a alkinylové deriváty Chryzamínu G a farmaceutický prijateľný nosič Také zlúčeniny by mali byť netoxické
Iným predmetom predkladaného vynálezu je použitie sond ako farbív na vizualizáciu a detekciu depozit amyloidu v bioptických alebo pitevných vzorkách.
Iným predmetom predkladaného vynálezu je použitie rádioaktívne značených sond na kvantifikáciu depozít amyloidu v bioptických alebo pitevných vzorkách
Iným predmetom predkladaného vynálezu je spôsob na odlíšenie oblastí mozgu postihnutých Alzheimerovou chorobou od normálnych oblastí mozgu
Ďalšie predmety, vlastnosti a výhody predkladaného vynálezu budú zrejmé z nasledujúceho podrobného opisu Je treba si uvedomiť, že podrobný opis a konkrétne príklady ukazujúce výhodné uskutočnenia predkladaného vynálezu, sú uvedené iba pre ilustráciu, pretože odborníkom v odbore budú po preštudovaní podrobného opisu zrejmé rôzne zmeny a modifikácie spadajúce do lozsahu predkladaného vynálezu
í) in.> oh i ,i / k 11 v n a pripojených vý k i csiAch
Obr IA ilustruje chemickú štruktúru chryzamínu G a niekoľkých analógov chiyzamínu G, ktoré boli syntetizované a testované, vrátane 3-jód- derivátu (31('G), 3-jód-dimetoxy- derivátu (3-ICG(()me)2), dimetylesterového derivátu (CG(COOMe)2), ťenolového derivátu, kyseliny salicylovej (SA) a n i I í no vélio deiívátu ( I/2CG), Kongo červene, 3,3’-dijód-derivátu (3,3’-l2CG), 3,3’-dibrómderivátu (3,3’-Br2CG), 3,3’-dichlór-derivátu (3,3’-CI2CG), 3-bróm- derivátu (3v
BrCG) a derivátu kyseliny 5-fluórsalicylovej ((5-FSA)CG) Cisla na obrázku ukazuju K, (v μΜ) každej zlúčeniny pre inhibíciu väzby ['JC]Chryzamínu G na syntetický peptid, Αβ( 10-43).
Obr. IB ilustruje chemickú štruktúru chryzamínu G a niekoľkých analógov chrvzaminu G, ktoré boli syntetizované a testované, vrátane derivátu kyseliny 3.3’-dikarboxylovej (3,3’-(C00H)ľCG), derivátu chryzamínu G s kyselinou 2,2’disulťónovou (2,2’-(SO;02CG), derivátu kyseliny 3-bróm,3-izopropylsalicylovej (3-Br-(3-iPrSA)CG), derivátu kyseliny 3-izopropylsalicylovej ((3-iPrSA)C.G),
2,4-diľenolového derivátu (2,4-difenol), derivátu kyseliny γ-rezorcylovej ((6()HSA)CG), 3,3’,5,5’-tetrametylbenzidínového derivátu (3,3’5,5’-(CHj)4CG), 3.3’-dimetylového derivátu (3,3’-(CI h)2CG), 2,2’-dimetylovélio derivátu (2,2’((Ί h).>(’G).benzizoxazolového derivátu (CG benzizoxazol) a 3-karboxyalkinového derivátu (3-(COOH)-C3C) Čísla na obrázku ukazujú K, (v μΜ) každej zlúčeniny pre inhibíciu väzby | IJC]Chryzaminu (i na syntetický peptid, Λ|ί( 10-43)
Obr 2A-2K ilustrujú chemické štruktúry alkenylovýcli derivátov cliryzaminu G <i alkenyl-tľialkvlcinových deiiválov analógov chryzamínu G, predovšetkým hctci ocvklických analogov Všimnite o. že tieto stiuktúiv predstavujú iba pninvu.ii molekuly, ktoiá |e symetiicka podľa väzby znázornenej vlnovkou hore vpiavo s tou výnimkou, že t ri a I k y I gí n o vá skupina môže byť iba na jednej sírane bifenylovej skupiny Trialkylcínovc deiiváty sú stabilnú medzipiodukty a bezprostredné prekurzory na prípravu halogénovaných rádioaktívnych derivátov s vysokou špecifickou aktivitou. Ilcterocyklické analógv pi odstavu jú alternatívne prostí iedky umiestnenia slabo acidických skupín v rovnakej štrukturálnej pozícii ako stredne acidické skupiny karboxylovej kyseliny v clnyzamíne G. Tieto trialkylcinove prekurzorové zlúčeniny su uvedené vo svojej protónovanej forme, pretože odborníkom v odbore bude jasné, že ich deprotónované formy a tautomery su tiež zahrnuté v týchto výkiesoch
\) alkenylovv derivát chryzaminu G
2B) alkenvl-t rialkyleínový derivát chiyzamínu G.
2C) alkenyl-trialkyleínový derivát 3-hydroxy-1,2-benzizoxazolového analôgu
2D) alkenyl-trialkyleínový derivát ftalimidového alebo izoindol-1,3(2H)diónového analôgu.
2F) alkenyl-trialkyleínový derivát ftalhydrazidového alebo 2,3-benzodiazín1,4(2H,3H)-diónového analógii.
2Γ) alkenyl-trialkyleínový derivát 2,3-benzoxazín-1,4(3H)-dióiiového analôgu.
2G) alkenyl-ti ialkylcínový derivát (2H) 1,3-benzoxazín-2,4(3 H)-diónového analógii
211) alkenvl-t rialkyleínový derivát (311 )2-benzazín-1,3(211 )-diónového analógii
21) alkenvl-t i ialkylcínový derivát 1,8-naftalimidového analôgu
21) alkenyl-trialkyleínový derivát tctrazolového analôgu
2K) alkenyl-t i ialkylcínový derivát oxadiazolového analógii
Obr 3 Krivky vytesnenia [C|chryzamínu (ί z väzby na Αβ( 10-43) pomoi ou niekoľkých štrukturálnych analógov chryzaminu (i Použité skratky sú rovnaké aku na obi 1 Obi 3A) chr'./.amín (i (piázdnc Ii ojuholničky). (5-FSA)CG (plne kosoštvorce), 3,3’-(COOI l).,CG (plné štvorčeky), 2,2’-(SO',)2GH (plné kolieska) Obr 3B) chryzamín (í (pi.izdnc trojuholníčky), Kongo červeň (prázdne kolieska), anilinový derivát (piazdm- obrátené trojuholníčky), fenolový derivát (prázdne štvorčeky), kyselina saliixlová (X) Krivky, ktoré ukazujú vyššiu väzbu pi i vyšších koncentráciách, odrážajú tvorbu miciel Bedaux, F ct al . Pharm Weekblad 98 189(1963)
Obr 4A je Scatchardov graf väzby chryzamínu G na Αβ( 10-43). Krivka predstavuje nelineárnu úpravu metódou najmenších štvorcov pre model s dvoma nezávislými miestami väzby. Priamky predstavujú jednotlivé zložky
Obr 4B je Scatchardova analýza väzby [14C]CG na typické vzorky kontrolného (kosoštvorce) a AD mozgu (štvorčeky). Prerušovaná línia má rovnaký sklon ako AD línia a je uvedená pre porovnanie s kontrolnou krivkou Táto vzorka AD mozgu má zväčšenie -18 NP/x200, Ku 0,35 μΜ a Bnl:is 790 fmol/pg proteínu. Kontrola má Ku 0,48 μΜ a B111JX 614 fmol^ig proteínu
Obr. 5 je graf znázorňujúci linearitu väzbového testu vo vzťahu ku koncentrácii peptidu V typickom teste bolo použité približne 0,9 μg Αβ( 1 0-43).
Obr 6A je graf ukazujúci závislosť asociácie chryzamínu G a Αβ(10-43) od času.
Obr. 6B je grafické znázornenie určenia asociačnej rýchlostnej konštanty (k,)
Obr 60 je graf závislosti disoeiácie chryzamínu G z Αβ( 10-43) od času
Obi 7 je grafické znázornenie molekulárneho modelu interakcií medzi clirvzaminom G a Αβ
Obr SA je graf i I u st r u j ú <. i koreláciu medzi množstvom naviazaného |1 'C leliryzaminu G a počtom neuril ických plakov (NP) vo vzorkách mozgu s AD
Obr 8B jc graf ilustrujúci koreláciu medzi množstvom naviazaného |11C | e b i v z.a mi nu G a počtom neuroľihi ilárnych sieti (NFT) vo vzorkách mozgu s
IS
Al) Na obr. SA ι 8B predstavuje os-x priemerný počet NP alebo NFT na pole pi i zväčšení 200x 11a rezoch farbených podľa Bielschowskeho získaných buď z hornej/st rednej frontálnej (n=IO) alebo z hornej tcmporálnej kôiy mozgovej (n-10) Plné symbolv a hrubé čiarv predstavujú mozgy bez amyloidovej angiopalie. prázdne symboly a prerušované línie ukazujú mozgy s amyloidovou angiop.itiou Os-y predstavuje celkovú, absolútnu väzbu f l4C]ehryzamínu G (fmol/pg piotemu) v homogenatoch vzoriek mozgu susedných ku vzorkám použitým na farbenie Bolo použité približne 75 pg proteínu a 150 nm |1JCjchryzaminu G
Obr 9A, 9B a 9C. Na obr. 9A je uvedená vazba chryzamínu G na rôzne oblasti mozgu v AD mozgu majúce viac než 20 Nps/x200 zosilnenie, ktoré sa nazývajú AD mozgy s vysokým obsahom plakov Na obr. 9B je uvedená vazba chryzamínu G na rôzne oblasti mozgu v AD mozgu majúce menej než 20 Nps/x200 zosilnenie, ktoré sa nazývajú AD mozgy s nízkym obsahom plakov. Uvedené dáta predstavujú pomer väzby [l4C]chryzamínu G v označených oblastiach mozgu k väzbe [l4C]chryzamíiui G v mozočku (CB) rovnakého mozgu. Horizontálne stĺpce predstavujú priemer a chybové stĺpce predstavujú štandardnú odchýlku pre kontrolu (kolieska) a AD mozog (kosoštvorce na obr 9A a 9B). Mozgové oblasti zahrnujú frontálny pol (FP), hlavu caudata (C.AU), hornú/stiednú frontálnu (SMF), hornú temporálnu (ST), dolnú parietálnu (1P) a okcipitálnu (OC) kôru mozgovú Hviezdička označuje signifikantný rozdiel vzhľadom ku kontrole (* p < 0,05; ** p *- 0,001) Dve vzorky mozgu od pacienta s Downovým syndrómom sú ukázané na obr 9C Kosoštvorčeky na obr. 9C predstavujú mozog od 23-ročného pacienta s Downovým syndrómom ešte bez príznakov AD Trojuholníčky na obr. 9G predstavujú 5 1-ročného pacienta s Downovým syndrómom, u ktorého došlo k lozvoju AD, ako je tomu u väčšiny pacientov s Downovým syndrómom okolo veku 40 rokov
Obi. 10 je graf ilustrujúci tkanivové koncentrácie chryzaminu G u myši, ktoivm bola podaná injekcia | l4C]chiyzamínu (ί do laterálnej chvostovej vény a ktoré boli utratené v uvedenom čase Prázdne symboly a tenké čiary predstavujú absolútnu 1 adionktivilu v jednotkách cpm/g tkaniva (ľava os) Plné symboly a hrubé čiary predstavujú pomer rádioaktivity v mozgu k i ádioaktivite v obličkách (horný graf) alebo krvi (stredný giaf) Pomery sú uvedené na pravej osi
Obr. I 1 Horná časť’ Rez z dolného temporálnebo laloku AD mozgu farbený 1,4-bis(2-(3-karboxy-4-hydro\yľenyl)eten-1 -yl)-benzénom technikou, ktorú opísal Stokes and Trickey, J Clin Pathol. 26: 241-242 (1973) Je vidieť veľké množstvo neuritických plakov. neuroľibrilárnu sieť a početné neurofilné vlákna Cerebrovaskulárny amyloid je tiež intenzívne sfarbený (nie je uvedené) Mikrofotografia bola získaná pomocou fluorescenčnej mikroskopie. Dolná časť Rez mozgom transgénnej myši (Tg(HuAPPG95 SWE)2576; Hsiao et al , Science, 274 99-102 (1996)) farbený podobne 1,4-bis(2-(3-karboxy-4-hydroxyfenyl)eten-1yl)-benzénom, na ktorom sú vidieť intenzívne sfarbené plaky
Obr 12 je stĺpcový graf ukazujúci vplyv zvyšujúcej sa koncentrácie Αβ(25-35) v prítomnosti a za absencie chryzamínu G na bunkovú redukčnú aktivitu buniek krysieho feochromoeytómu (PC-12), kde táto aktivita je meraná redukciou 3-[4,5-dimetyltiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazóliumbromidu, MTT Produkt redukcie MTT absorbuje svetlo vlnovej dĺžky 560 nm a táto absorbancia je uvedená na zvislej osi. Vplyv Αβ(25-35) samotného je tiež uvedený v šrafovaných stĺpcoch a ukazuje zníženie v MTT redukcii závislej od dávky. Signifikantnc rozdiely od kontrol (bez Αβ(25-3 5), bez chryzamínu G) sú uvedené v šrafovaných stĺpcoch Protektívny vplyv 20 μΜ chryzamínu G je ukázaný v prázdnych stĺpcoch Signifikantné rozdiely medzi MTT redukciou v prítomnosti a za absencie chryzamínu G sú uvedené v prázdnych stĺpcoch.
Obr 13 je stĺpcový graf ukazujúci protektívny vplyv zvyšujúcej sa koncentrácie chryzamínu G na Ap(2^-35)-indukovanú bunkovú redukčnú aktivitu buniek kiysieho leochromocytoinu (PC-1 2), kde táto aktivita je meraná redukciou 3 -14,5 - d i mut y 11 ia zo 1-2 - yl ] - 2,5 - il i fenyltetrazóliumbromidu, MTT Produkt ieclukcie MTT absorbuje svetlo vlnovej dĺžky 560 nm a tato absorbancia je uvedená na zvislej osi Vplyv chryzamínu G za absencie Αβ(25-35) je uvedený v šrafovaných stĺpcoch Neboli pozoiované signifikant né rozdiely medzi kontrolou (bez Λβ(25-35), bez chryzamínu (i) a akýmikoľvek koncentráciami chryzamínu
G za absencie Αβ(25-35). Redukcia MTT za prítomnosti 1 μΜ Αβ(25-35) a zvyšujúcich sa koncentrácií chryzamínu G je uvedená ako prázdne stĺpce Signifikantné rozdiely medzi MTT redukciou za prítomnosti a za absencie Αβ(25-35) pri každej koncentrácii chryzamínu G sú uvedené v šrafovaných stĺpcoch. Signifikantné rozdiely medzi MTT redukciou medzi Αβ(25-35) kontrolou (bez chryzamínu G) a Αβ(25-35) plus zvyšujúce sa koncentrácie chryzamínu G sú uvedené čierno v prázdnych stĺpcoch.
Obr. 14 je porovnanie vplyvov chryzamínu G a inaktívnych fenolových derivátov na toxicitu indukovanú Αβ(25-35) 1 μΜ Αβ(25-35) bol prítomný vo všetkých pokusoch s výnimkou kontroly Chryzamín G mal protektívny účinok pri koncentráciách 0,1 a 1 μΜ, zatiaľ Čo fenolové deriváty nemali žiadny protektívny účinok a snáď aj zvyšovali toxicitu Αβ.
Predkladaný vynález využíva schopnosti alkylových, alkenylových a alkinylových derivátov chryzamínu G a ich rádioaktívne značených derivátov prekonávať hematoencefalickú bariéru in vivo a viazať sa na Αβ prítomný v plakoch, na Αβ prítomný v cerebrovaskulárnom amyloide a na amyloid skladajúci sa z proteínov prítomných v NFT. Chryzamín G je derivát Kongo červene, od ktorej sa líši hlavne tým, že skupiny kyseliny sulfónovej prítomné v Kongo červeni sú nahradené v chryzamíne G skupinami kyseliny karboxylovej (obr. 1) Táto štrukturálna zmena umožňuje chryzamínu G lepší vstup do mozgu než má Kongo červeň a veľké makromolekuly ako sú protilátky Tubis et al , J. Am Pharmaceut. Assn. 49: 422 (1960) Tiež je chryzamín G viac špecifický marker pre AD patofyziológiu než sú protilátky, pretože protilátky sa viažu tiež na nefibrilárne Αβ depozity najasného patofyziologického významu
Alkylové, alkenylové a alkinylové deriváty chryzamínu G podľa predkladaného vynálezu majú každú z nasledujúcich charakteristík (1) špecificky sa viažu na syntetický Αβ in vitro; (2) viažu sa na fibrilárne depozity štruktúry βlistu v mozgových rezoch, (3) majú schopnosť prekonávať nepoškodenú hematoencefalickú bariéru in vivo
Spôsob podľa predkladaného vynálezu určuje prítomnosť a umiestnenie depozit amyloidu v orgáne alebo oblasti tela, výhodne v mozgu, pacienta Spôsob podľa predkladaného vynálezu obsahuje podanie detegovateľného množstva farmaceutického prostriedku obsahujúceho zlúčeninu vzorca I, ako bola definovaná vyššie, kloiá sa nazýva detegovateľná zlúčenina, alebo jej farmaceutický pniateľnú soľ rozpustnú vo vode, pacientovi Detegovateľné množstvo znamená. že podané množstvo detegovateľnej zlúčeniny je dostatočné na umožnenie detekcie väzby zlúčeniny na amyloid IJčinné zobrazovacie množstvo znamená, že podané množstvo detegovateľnej zlúčeniny je dostatočné na umožnenie zobrazenia väzby zlúčeniny na amyloid
Vynález využíva sondy pre amyloid, ktoré boli spolu s neinvazívnymi neuro-zobrazovacími technikami ako je magnetická rezonančná spektroskopia (MRS) alebo magnetická rezonancia (MRI) alebo zobrazovanie pomocou gama žiarenia, ako je napríklad pozitrónová emisná tomografia (PET) alebo počítačová tomografia pomocou emisie jedného fotónu (SPECT), použité na kvantifikáciu depozít amyloidu in vivo Termín in vivo zobrazenie označuje akúkoľvek techniku, ktorá umožňuje detekciu značenej zlúčeniny vzorca 1, ako bola definovaná vyššie, podľa predkladaného vynálezu Pri gama zobrazení je žiarenie endlované z vyšetrovaného orgánu alebo oblasti merané a vyjadrené buď ako celková väzba alebo ako pomer, v ktorom ie celková väzba v jednom tkanive normalizovaná na (napríklad delená) celkovou väzbou v inom tkanive rovnakého subjektu počas rovnakého postupu in vivo zobrazenia. Celková väzba in vivo je definovaná ako celkový signál detegovaný v tkanive pri in vivo zobrazení bez potreby korekcie pomocou druhej injekcie rovnakého množstva značenej zlúčeniny s veľkým nadbytkom neznačenej, ale inak chemicky rovnakej, zlúčeniny. Subjektom je cicavec, výhodne človek a najlepšie človek, u ktorého je podozrenie na demenciu
ΙΊ i in vivo zobrazení je t\p dostupného detekčného prístroja hlavným faktorom ovplyvňujúcim výber značiaceho činidla Napríklad rádioaktívne izotopy a '’F sú predovšetkým vhodné na in vivo zobrazenie v metódach podľa predkladaného vvnálezu. Typ použitého pristroja určí výber radionuklidu alebo sta22 bilného izotopu Napríklad, vybraný ládionuklid musí mať laký typ rozpadu, ktolý je dctegovatcľný daným typom pristroja Ďalej je tieha brať do úvahy polčas rozpadu rádionuklidu Polčas rozp.idu by mal byť dostatočne dlhý na detekciu v dobe maximálneho vychytávania v cieľovej oblasti, ale mal by byť natoľko krátky, aby nespôsoboval dlhodobé škodlivé ožiarenie pacienta Rádioaktívne značené zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu môžu byť detegované s použitím gama kamery, ktorá deteguje emilované gama žiarenie vybranej vlnovej dĺžky. Medzi techniky gama zobrazenia patri napríklad SPECT a PET. Na detekciu pomocou SPECT nebude výhodne wbiané rádioaktívne činidlo emitovať častice, ale bude emitovať veľké množstvo fotónov v rozsahu 140 - 200 keV Na detekciu pomocou PET bude rádioaktívnym činidlom rádionuklid emitujúci pozitróny, ako je napríklad |QF, ktoré budú anihilovať za vzniku dvoch 51 1 keV gama lúčov, ktoré budú detegované PET kamerou.
V predkladanom vynáleze sú pripravené zlúčeniny/sondy, ktoré sa viažu na amyloid, ktoré sú použiteľné na in vivo zobrazenie a kvantifikáciu depozit amyloidu Tieto zlúčeniny sú použité spoločne s neinvazívnymi neuro-zobrazovacimi technikami ako je magnetická rezonančná spektroskopia (MRS) alebo magnetická rezonancia (MRI), pozitrônová emisná tomografia (PET) alebo počítačová tomografia pomocou emisie jedného fotónu (SPECT) V predkladanom vynáleze môžu byť pre MRS/MR1 alkylové, alkenylové a alkinylové deriváty chryzamínu G značené '’F alebo l?C značenú s použitím všeobecných techník organickej chémie, ktoiú sú v odbore známe Viď napríklad March, .1 ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY REACTIONS, MECHANISM AND STRUCTIJRE, 3 vydanie, 19S5, ktorej obsah je tu uvedený ako odkaz Alkylové, alkenylové a alkinylové deriváty chryzamínu G môžu byť tiež pre PET techniky rádioaktívne značené Ι!Ί~, ”C, 7Br alebo 76Br s použitím techník dobre známych v odbore, ktoré sú opísané vo ľowler, J and Wolľ. A v POSITRON EMISSION TOMOGRAP11Y AND AIJTORADIOGRAPIIY (Phelps, M , Mazziota, J , and Schelbert, H , vvd ) 391-450 (Raven Press, NA, 1 9X6), ktorej obsah je tu uvedený ako odkaz Alkylové, alkenylové a alkinylové deriváty chryzamínu (i môžu byť pre SPECT techniky rádioaktívne značené '“'I s použitím akejkoľvek z. techník dohre známýeh v odbore Viď napríklad Kulkami, Int. J Rad Appl and Inst (Part B) 18’
647 (1991), ktorého obsah je tu uvedený ako odkaz Ďalej, alkylové, alkenylové a alkinvlové deriváty chryzamínu (i môžu byť tiež značené akýmkoľvek vhodným i áilioi/oiopom |odu, ako je napríklad '“'l. l2Sl alebo l2'l s použitím jodácie diazoi i/.o\aneho amino-deriválu priamo diazóniumjodidom, viď Greenbaum, F. Am ,1 Pliaim 108 17 ( I 936), alebo konverziou nestabilného diazotizovaného amínu na stabilný triazčn, alebo konverziou nerádioaktívného halogénovaného prekurzora na stabilný trialkyleínový derivát, ktorý môže byť potom premenený na jódovú zlúčeninu pomocou niekoľkých techník, ktoré sú dobre známe v odbore Viď Satyamurthy and Barrio, J Org. Chem. 48' 4394 (1983), Goodman et al., J Org Chem 49 2322 (1984), a Mathis et al., J. Labcll. Comp and Radiopharm 1994, 905; Chumpiadit et al., J Med Chem. 34 877 (1991), Zluiang et al., J. Med Chem. 37. 1406 (1994); Cluinipradit et al., J. Med. Chem. 37; 4245 (1994) Napríklad stabilný triazénový alebo trialkyleínový derivát alkylových, alkenylových alebo alkinylových derivátov chryzamínu G reaguje s halogenačným činidlom obsahujúcim ‘'Ί, l25I, l2'l, 76Br, 75Br, *F alebo l9F. Preto sú stabilné tiiazénové alebo 11 i a 1 k y 1 cí no vé dciiváty chryzamínu G a jeho analógov novými prekurzormi použiteľnými pre syntézu mnohých rádioaktívne značených zlúčenín podľa predkladaného vynálezu Preto sú tieto triazénové alebo trialkylcínové deriváty jedným uskutočnením predkladaného vynálezu
Alkylové, alkenylové a alkinylové deriváty chryzamínu G môžu byť tiež rádioaktívne značené známymi kovovými rádioaktívnymi značiacimi činidlami, ako je Technécium-99m (99mTc). Modifikácia substituentov na vloženie ligandov, kioié sa viažu na také ióny kovov, môže byť odborníkom v odbore rádioaktívneho značenia uskutočnená bez zbytočných pokusov Alkylové, alkenylové a alkinylovc deriváty chryzamínu G značené kovom môžu byť potom použité na detekciu depozit amyloidu
Spôsoby podľa predkladaného vynálezu môžu využívať izotopy detegovaleľné nukleárnou magnetickou rezonančnou spektroskopiou na účely in vivo zobrazenia a spekt i osk opie Medzi pivkv pi edovšetkým vhodné na použitie v magnetickej rezonančnej spektroskopii patria 1 ’ľ a L'C
Vhodné rádioizotopy na použitie v spôsoboch podľa predkladaného vynálezu zahrnujú beta-žiariče, gama-žiariče, pozitrónové-žiariče a rôntgenové žiariče Medzi tieto rádioizotopy patria l3Il, l23l, l8F, C, 75Br a 76Br. Vhodné stabilné izotopy na použitie v magnetickej rezonancii (MRI) alebo spektroskopii (MRS) podľa predkladaného vynálezu zahrnujú l9F a l3C Medzi rádioizotopy vhodné na in vitro kvantifikáciu amyloidu v homogenátoch bioptického alebo nekroptického tkaniva patria 125I, 14C a 3H Výhodnými rádioaktívnymi zobrazovacími činidlami sú ’*F na in vivo zobrazenie pomocou PET, 1231 na zobrazenie pomocou SPECT, 19F pre MRS/MR1 a ’H alebo 14C pre štúdie in vitro Avšak, akákoľvek bežná technika na vizualizáciu diagnostických sond môže byť použitá v spôsoboch podľa predkladaného vynálezu
Spôsob by mal byť použitý na diagnostiku AD v miernom alebo klinicky nejasnom štádiu. Táto technika by tiež mala umožniť longitudinálne štúdie depozít amyloidu u ľudskej populácie s vysokým rizikom vzniku depozít amyloidu, ako sú jedinci s Downovým syndrómom, familiárni AD a homozygóti pre alelu apolipoproteínu E4. Corder et al., Science 261 921 (1993). Spôsob umožňujúci sledovať depozity amyloidu v čase môže určiť, či sa tieto depozity vyskytujú dlho pred demenciou, alebo či tieto depozity nesúvisia s demenciou. Tento spôsob môže byť použitý na sledovanie účinnosti terapie zameranej na prevenciu depozít amyloidu.
Všeobecne sa bude dávka detegovateľne značeného alkylového, alkenylového alebo alkinylového derivátu chryzamínu G veľmi líšiť podľa rôznych okolností ako je vek, stav, pohlavie a rozsah ochorenia u pacienta, podľa kontraindikácií, pokiaľ sú nejaké, podľa súčasnej terapie a iných premenných, a bude upravená ošetrujúcim lekárom. Dávka môže byť v rozsahu od 0,001 mg/kg do 1 000 mg/kg, výhodne je 0,1 mg/kg až 100 mg/kg.
Podanie zlúčeniny môže byť lokálne alebo systémové a môže byť uskutočnené intravenózne, intraarteriálne, intratekálne (prostredníctvom mozgovomiechového moku) a podobnými spôsobmi Podanie môže byť tiež intradermálne alebo intrakavitárne, podľa vyšetrovanej oblasti tela Po uplynutí dostatočne dlhej doby pre naviazanie zlúčeniny na amyloid, napríklad po 30 minútach až 48 hodi25 nách, je vyšetrovaná oblasť vyšelien.i bežnou zobrazovacou technikou, ako je MRS/MRI, SPECT, plošná scintigraľia, PET a alebo novými vyšetrovacími technikami Presný protokol sa bude líšiť podľa faktorov špecifických pre pacienta, ako boli uvedené vyššie, a podľa \yšetrovanej oblasti, spôsobu podania a použitého typu značiaceho činidla, určenie konkrétnych postupov bude pre odborníka rutinnou záležitosťou Pre znbiazovanie mozgu je výhodne merané množstvo (celková alebo špecifická väzba) naviazaného rádioaktívne značeného chryzaminu G alebo derivátu alebo analógu ehivzamínu G a je porovnávané (ako pomer) s množstvom značeného chryzamínu G alebo derivátu chryzamínu G naviazaného na inozoček pacienta Pomer sa potom porovnáva s rovnakým pomerom pre normálny mozog rovnakého veku
Farmaceutické prostriedky podľa predkladaného vynálezu sú výhodne podané vo forme injekčných prípravkov Obvyklý prostriedok na tento účel obsahuje farmaceutický prijateľný nosič Prostriedok môže napríklad obsahovať približne 10 mg ľudského sérového albumínu a približne 0,5 až 500 ^ig značeného alkylového, alkenylového alebo alkinylového derivátu chryzamínu G na ml fosfátového pufra obsahujúceho NaCI Medzi ďalšie farmaceutický prijateľné nosiče patria vodné roztoky, netoxické prísady, vrátane solí, konzervačných činidiel, pufrov a podobne, ako je uvedene napríklad v REMINGTON’S PHARMACEIJT1CAL SCIENCES, 15 vydanie, Eastoir Mack Publishing Co., str 1405-1412 a 1461-1487 (1975) a THE NATIONAL FORMULARY XIV , 14 vydanie, Washington. American Pharmaceutical Association (1975), ktorých obsah je tu uvedenv ako odkaz
Príklady nevodných rozpúšťadiel sú propylénglykol, polyetylénglykol, rastlinný olci a i nj i k o va t eľn é organické estery ako je etyloleát Medzi vodné nosiče patrí voda. alkoholové/vodné lozloky, salinické roztoky, parenterálne vehikulá ako je chlorid sodný, Ringcrova dexlróza atď Medzi intravenózne vehikulá patria tekutiny a nutričné roztok} Medzi konzervačné činidlá patria antimikrobialne činidlá, antioxidačné činidlá, chelačné činidlá a inertné plyny pH a presná koncentrácia rôznych zložiek farmaceutického prostriedku sú upravené podľa všeobecných znalostí Viď Goodman and Gilman’s THE PFI ARM ACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICS (7 vydanie)
Predovšetkým výhodnými farmaceutickými prostriedkami podľa piedkladanélio vynálezu sú tie prostriedky, ktoré sú okrem schopnosti špecifickej väzby na amvloid in vivo a schopnosti piekonávať hematoencefalickú bariéru tiež netoxické pri vhodných dávkach a ktoré majú dostatočné trvanie účinku
Molekulárne modelovanie
Molekulárne modelovanie bolo uskutočnené na počítačovom grafickom svstenie Evans and Sutherland PS-330, s použitím počítačového modelovacieho programu MacroModel (verzia 2 5 dostupná od C.StilI, Columbia University) na generovanie Αβ peptidových reťazcov v konformácii anti-paralelných β-listov. Kirsehner et al , Proc. Natl. Acad Sci USA 83: 503 (1986) Amyloidové peptidy boli použité bez ďalších úprav štruktúry Αβ peptidy boli usporiadané tak, že jednotlivé reťazce boli od seba 4,76 A, čo je vzdialenosť charakteristická pre fibrily β-listu. Kirsehner, vyššie. Chryzamín G bol energeticky minimalizovaný a bol umiestnený vzhľadom k modelu ťibríl tak, aby bol maximalizovaný kontakt s lyzinom 16 Αβ( 10-43) a hydrofóbnym regiónom fenylalanínu 19 a 20
Charakterizácia špecifickej väzby na Αβ syntetický peptid. afinita, kinetika a maximum väzby
Charakteristiky väzby chry/aminu G a derivátov cluyzamínu G sú najprv analyzované s použitím syntetického peptidu označeného Αβ( 10-43) Peptid 1043 bol vybraný preto, že bolo preukázané, že tento peptid je modelovým systémom obsahujúcim všetky charaktei istické štrukturálne rysy Αβ peptidov. Hilbich et al , J Mol Biol 2 18 149 (1991) Aminokyselinový fragment 10-43 Αβ bol syntetizovaný s použitím 9-fluoi enylmetylehlorofoi miátu (FMOC) v Peptide Synthesis Facilitv of tlie University of Pittsburgh Peptid bol charakterizovaný liniol nost non spekt i omel i iou či hlavná zložka mala MK 3600 g/mol (výpočcl 359<S) Peptid bol ďalej prečistený technikou podľa Hilbicli ei al , ktorá sa, v stručnosti, skladá zo sekvenčnei vylučovacej chromatografie na Biogel PIO kolóne (2 x ISO cm, 200-400 niesli, Bioiad, Riclimond, CA) v 70% kyseline mravčej, po ktorej nasleduje druhá elúua v Biogel P4 kolóne (2 x ISO cm, 200-400 niesli) v IM kyseline octovej Hilbicl: et al , .1 Mol Biol 2IS 149 (1991) Peptul sa lynľilizoval a uskladnil sa pi i -SO ”C do použitia v testoch väzby
Aminokyselinová sekvencia pre Λβ( 10-43) je nasledujúca
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Tyr Glu Val His His Gin Lys Leu Val Phe Phe Ala
22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33
Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala íle íle Gly
34 35 36 37 38 39 40 41 42 43
Leu Met Val Gly Gly Val Val íle Ala Thr
Testy väzby na syntetický Αβ( 10-43)
Testy väzby boli uskutočnené v skúmavkách z borosilikátového skla veľkosti 12 x 75 mm Rôzne koncentrácie nerádioaktívnych derivátov chryzaminu G boli pridané v 10% etanole/vode Etanol bol nevyhnutný na prevenciu tvorby miciel, ktorá sa vyskytuje u týchto denvátov diazo-farbív, pretože micely sú zaibviavané filtrom aj za absencie peptidu Do vyššie uvedeného roztoku sa pridalo 25 pl 0,36 mg/ml suspenzie Λβ( 10-43) v ll2O a ďalej sa pridal 10% etanol do objemu 950 pl Po inkubácii počas 10 minút pri teplote okolia sa pridalo 50 pl f1 C Jchryzaininu (ϊ v 40% etanole čo viedlo k dosiahnutiu konečnei koncennacie |1JC] cli ry za m i nu (i 100-1 25 nM, podľa použitého piipravku |' ( |c.bi yzaniínu (i Väzbová zmes s.i inkubovala počas 30 minút pii teplote okolia Naviazana a volila radioak 11\il a sa separovali vákuovou filtráciou cez
Whatman GF/B filtre s použitím Brandel M-24R Celí Harvester (Gaithersburg, MD), po ktorej nasledovali dva 3 ml výplachy 10% etanolom pri teplote okolia Filtre boli uvedené do rovnováhy cez noc v 4 ml Cytoscint®-ES scintilačnom činidle (ICN Biomedicals, lnc., Irvine, CA) v 7,0 ml plastových scintilačných skúmavkách pred odčítaním. V tomto a vo všetkých ostatných testoch väzby boli inkubácie uskutočnené najmenej trojmo a výsledky sú uvedené ako priemer ± štandardná odchýlka.
Kinetické štúdie
Kinetické štúdie väzby [14C]chryzamínu G ba Αβ(10-43) boli uskutočnené v skúmavkách z borosilikátového skla veľkosti 13 x 100 mm s použitím filtračného testu opísaného vyššie. Pre kinetiku asociácie bolo 25 μΐ 0,36 mg/ml Αβ(10-43) umiestnené v 475 μΐ 10% etanolu a do roztoku sa pridalo 4,5 ml [14C]chryzamínu G v čase 0. Zmes sa rýchlo premiešala a väzbová reakcia sa ukončila vákuovou filtráciou cez Whatman GF/B filtre s použitím Brandel M-24R Celí Harvester (Gaithersburg, MD), po ktorej nasledovali dva 3 ml výplachy 10% etanolom pri teplote okolia v čase 5, 10, 20, 30, 45, 60, 75, 135, 240 a 300 sekúnd; naviazaná rádioaktivita sa určila spôsobom uvedeným vyššie.
Pre kinetiku disociácie bolo 25 μΐ 0,36 mg/ml Αβ(10-43) umiestnené v 475 μΐ 10% etanolu a do roztoku sa pridalo 25 μΐ 2,5 μΜ [14C]chryzamínu G v 40% etanole. Táto zmes sa rýchlo premiešala a inkubovala sa počas 30 minút pri teplote okolia. Zmes sa riedila 4,5 ml 10 μΜ nerádioaktívneho chryzamínu G v 10% etanole v čase 0, rýchlo sa premiešala a disociácia sa ukončila filtráciou opísanou vyššie v čase 0,5, 1,5, 3, 5 a 15 minút a naviazaná rádioaktivita sa určila spôsobom uvedeným vyššie
Charakterizácia špecifickej väzby na mozog postihnutý Alzheimerovou chorobou
Vazba eln\ziiniinu (i na honu-gjnály AD mozgu a normálneho mozgu
Mozgové nekropsie boli získané od Ncuropathology Core of tlie Alzheiincr’s Discasc Research Center oľ the University of Pittsburgh Kontroly boli definované ako vzorky nesplňujúce neuropatologické kritériá pre AD (dostatočný počet NP alebo NFTj podľa štandardov uvedených v publikovanej NIA conference report Khachatunan, Árch. Neurol 42: 1097 (1985). Boli študované vzorky od ôsmich kontrol (vek 58-75 rokov), jedenástich AD (vek 61-84 tokov) a dvoch Downových syndrómov (vek 23 a 51 rokov) Bolo študovaných šesť AD mozgov s vysokým počtom plakov (> 20 NPS/x200 zväčšenie) a pať AD mozgov s nízkym počtom plakov (< 20 NPS/x200 zväčšenie) Dve kontroly boli klinicky dementné, ale nemali NP ani NFT a boli diagnostikované ako demencia bez zvláštnej histológie. Knopman, Dementia 4: 132 (1993) Iná kontrola mala demeneiu a olivopontocerebellárnu alrofiu Ostatné kontroly nemali klinické am histologické známky neurologického ochorenia. Nekroptické vzorky boli ihneď zmrazene na -70 C a boli uskladnené pri tejto teplote do homogenizácie. Počet NP a NFT bol odčítaný v rezoch z piatich separovaných, ale susedných poli (pri zväčšení 200x) medzi kortikálnymi vrstvami 2 a 4 v kôre v prechode medzi hornými a strednými frontálnymi závitmi horným temporálnym izokortexom všetkých študovaných mozgov. Bolo uskutočnené kvalitatívne hodnotenie prítomnosti amyloidovei angiopatie v hoi nej/strednej frontálnej kôre Na identifikáciu NP a NFT bola použitá Bielchowskeho metóda impregnácie striebrom a farbenie Kongo červeňou bolo použité na identifikáciu mozgovej amyloidovej angiopatie Podrobnosti tohto postupu boli publikované predtým Moosy et al , Árch Neurol. 45. 251 (1988). Vzorky použité pre väzbu CG na hornú/strednú frontálnu kôru alebo hornú temporálnu kôru holi na makroskopickom reze susednom ku vzorkám použitým na stanovenie N ľ alebo NFT.
Približne 100 mg tkaniva zo spojenia hornej a strednej frontálnej kôry, hornei temporálnej kôry, frontálneho pólu, hlavy caudata, dolnej parietálnej kôry, okcipitálnej kôry alebo mozočku holo homogenizované na Polytron® tkanivovom homogenizačnom pristroii (P'ľ 10/35, Brinkman Instruments Inc, Westbury, NY) počas 30 sekúnd pri nastavení 6 v 10% etanole pri koncentrácii 1030 mg mozgu/ml Z každého mozgu neboli dostupné všetky oblasti. Alikvoty 25I 50 iii tkaniva (približne 25-300 ug proteínu podľa techniky opísanej Lowry ct al .1 Biol Chem 193 265 (195 1)) boli inkubované v skúmavkách z borosilikátového skla veľkosti 12 x 75 mm pri teplote okolia s 10-750 nM [l4C]CG (26.S Ci/mol) v konečnom objeme 1,0 ml 10% etanolu počas 30 minút pri teplote okolia Štandardné štúdie využívali piibližne 150 pg proteínu a 75 nM [l4C]CG pre štúdie cerebellárnelio pomeru a približne 75 pg proteínu a 150 nM [l4C]CG pie korelačné štúdie s NP, NFT a amyloidovou angiopatiou Etanol bol nevyhnutný na prevenciu tvorby miciel, ktorá sa vyskytuje u týchto derivátov diazofarbiv, pretože micely sú zachytávané filtrom i za absencie peptidu. Naviazaná a voľná rádioaktivita sa separovali vákuovou filtráciou cez Whatman GF/B filtre s použitím Brandel M-24R Celí Harvester (Gaithersburg, MD), po ktorej nasledovali dva 3 ml výplachy 10% etanolom pri teplote okolia Filtre boli uvedené do rovnováhy cez noc v 4 ml Cytoscint®-ES scintilačnom činidle (ICN Biomedicals, Inc , Irvine, CA) v 7,0 ml plastových sci nt i lačných skúmavkách pred odčítaním. Saturovateľná (špecifická) väzba bola definovaná ako celková vazba mínus reziduálna (nesaturovateľná) vazba za prítomnosti 20 μΜ neznačeného CG Vo všetkých testoch väzby boli inkubácie uskutočnené najmenej trojmo a výsledky sú uvedené ako priemer ± štandardná odchýlka, pokiaľ nie je uvedené inak. Výsledky boli uvedené buď v absolútnych číslach v fmol [l4]CG naviazaného na pg proteínu v danej oblasti mozgu, alebo ako pomer frnol/pg proteínu v tejto oblasti mozgu ku fmol/pg proteínu v mozočku rovnakého mozgu
Delenie medzi oktanol/vodu
Približne 75 μΜ roztoky chrvzamínu G alebo jeho analógov boli pripravené v 5,0 ml l-okianolu Pridalo sa 5 ml fosfátom pufrovancho salinického roztoku (0 15 M NaCI. 5 mM fosforečnan draselný, pH 7,4) a vrstvy sa zmiešali rychlvm premiešaním Zmes sa polom cenírilúgova'.a pri 1000 g na uľahčenie wlvoienia dvoch čírych fáz. Vistw holi separované s použitím deliaceho lievika a 600 pl každej vrstvy bolo riedené 100 pl etanolu a potom bola meraná absor31 bancia pri 389 nm pre chryzamín G alebo λ„,;,χ pre každý analóg Koncentrácie boli stanovené po korekcii pre rozdiely molárnej absorptivity v dvoch rozpúšťadlách a deliaci koeficient bol vyjadrený ako koncentrácia v oktanolovej vrstve deleno koncentrácia vo vodnej vrstve. Pokusy boli uskutočnené trojmo
Zobrazenie väzby chryzaminu G na depozity amyloidu v mozgu postihnutom Alzheimerovou chorobou
Pre vizuálnu demonštráciu väzby CG derivátu na tkanivo boli 8 mikrónové parafínové rezy AD mozgu s ťažkými depozitmi cerebrovaskulárneho amyloidu farbené 1,4-bis(2-(3-karboxy-4-hydroxyfenyl)eten-1-yl)-benzénom s použitím modifikovanej techniky opísanej Stokes and Trickey, J. Clin Pathol. 26 241242 (1973) so substitúciou 1 mM 1,4-bis(2-(3-karboxy-4-hydroxyfenyl)eten-1yl)-benzénu za Kongo červeň, ale postup bol inak rovnaký. Nafarbené rezy boli vyšetrované s použitím fluorescenčnej mikroskopie
Stanovenie schopnosti zlúčeniny prekonávať hematoencefalickú bariéru
Štúdie na myšiach: Samiciam Swiss-Webster myší bolo injekčné podané do laterálnej chvostovej vény približne 0,03 μθ/β [l4C]chryzamínu G v 0,9% roztoku NaCl. Myšiam boli zlomené väzy v časoch 15 minút, 35 minút, 1 hodina, 4 hodiny a 24 hodín po injekcii Rýchlo sa odobrala krv z karotíd, mozog, pečeň a obličky a rýchlo sa tieto orgány zvážili a homogenizovali sa v destilovanej/deionizovanej H2O s použitím skleneného homogenizátora. Bol odvážený alikvot do 18,0 ml plastovej scintilačnej skúmavky (Beckman Poly-Q-Vial) a po pridaní 10,0 ml scintilačnej zmesi (Cytoscint®-ES (ICN)) a uvedení do rovnováhy cez noc bolo uskutočnené meranie. Obsah [,4C]chryzamínu G v tkanive bol vyjadrený v cpm/mg tkaniva
Pokusy, v ktorých bola rádioaktivita extrahovaná z tkaniva, boli uskutočnené rovnakým spôsobom s tou výnimkou, že bolo injekčné podané 0,05 pCi/g |1 '(Jchryzaininu G a myši boli uiialené po 60 minútach Potom bol odobratý mozog a peceň a bola uskutočnen.i extrakcia postupom podľa Folcha Folch ct al , J Biol Chem 226 447 (I95“1) V oboch tkanivách bolo viac než 95% extrahovanej rádioaktivity obsiahnuť· v organickej vrstve Organická vrstva bola odparená do sucha, bola resuspendovaná v minimálnom množstve 10% metanolu/90% ACN a bola injekciou vnesená do kolóny z oxidu kremičitého (Prep Nová Pak HR Silica, 7,8 x 300 mm, Waters, Milford, MA) a bola eluovaná izokraticky rovnakým rozpúšťadlom. Za týchto podmienok je 99% rádioaktivity eluované s rozpúšťadlom, zatiaľ čo väčšina lipidov je zadržovaná dlhšie, takže frakcia eluovaná v rozpúšťadle je vhodná pre injekciu do C4 kolóny s reverznou fázou, ktorá je opísaná vyššie Celá frakcia v rozpúšťadle sa odoberie, suší sa a resuspenduje sa v 10% ACN/90% fosforečnane sodnom (5 mM, pH 6) a injekčné sa vnesie spolu s autentickým nerádioaktívnx m chryzamínom G do C4 kolóny Frakcie eluované v jednej minúte sa odobeiú a merajú sa po pridaní 10 ml Cytoscint®-ES.
V ešte inom uskutočnení sa vynález týka farmaceutického prostriedku a spôsobu na prevenciu degenerácie buniek a toxicity spojenej s tvorbou fibril, ku ktorej dochádza u niektorých ochoiení spojených s amyloidózou, ako je Alzlieimerova choroba, Downov syndróm, a diabetes mellitus 2 typu, hereditárna mozgová hemoragická amyloidóza (Holandsko), amyloid A (reaktívny), sekundárna amyloidóza, familiárna stredomorská horúčka, familiárna amyloidová neťropatia s urtikáriou a hluchotou (Muckle-wells syndróm), amyloid lambda Lreťazcov alebo amyloid kappa L reťazcov (idiopatický, spojený s myelómom alebo makroglobulinémioti), A beta 2\1 (chronická bemodialýza), ATTR (familiárna amyloidová polyncuropatia (Portugalsko, Japonsko, Švédsko), familiárna amyloidova kardiomyopatia (Dánsko), izolovaný kardiálny amyloid, systémová senilná amyloidóza, A1APP alebo amylin-inzulinóm, alriálny natriuretický faktor (izolovaný alriálny amyloid), prokalcitonin (medulárny karcinóm štítnej žľazy), gelsolin (ľamiliarna amyloidóza (I insko)), cystatín C (hereditárna mozgová liemoiagia s amyloidózou (Polárne oblasti)), AApo-A-I (familiárna amyloidová polyneiiropa- tia - lowa), AApo-A-ll (akcelerované starnutie u myši), amyloid asociovaný s ľibimogénom a Asor alebo Pr P-27 (skiapia, Creutzfeld-Jacobova choroba, Gcrtsmann-Straussler-Schcinker syndróm, hovädzia spongiformná enΛ *»
J J cef'alitida) alebo ku ktorej dochádza u jedincov, ktorí sú homozygotni pre apolipoproteinovú E4 alelu Tento spôsob obsahuje podanie farmaceutického prostriedku obsahujúceho chryzamín (ί, alebo jeden z vyššie uvedených derivátov chrv/.aminu G subjektu, u ktorého je podozrenie, že má také ochorenie spojené s amvloidozou, alebo že ma značne riziko vzniku takého ochorenia
Pretože niektoré diazo-zlúčeniny môžu byť karcinogénne, zahrnujú terapeutické zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu iba netoxické, nekarcinogénne zlúčeniny Predkladaný vynález teda rieši problémy spojené s potenciálnou karcinogénnou tak, že využíva iba alkylové, alkenylové alebo alkinylové zlúčeniny, ktoré neobsahujú skupiny, ktoré by mohli byť metabolizované na karcinogénne benzidinové zlúčeniny
Akékoľvek potenciálne problémy spojené s nižšou biologickou dostupnosťou sú tiež vyriešené použitím alkylových, alkenylových a alkinylových derivátov azo-zlúčenín Tieto zlúčeniny nie sú substrátom pre redukciu bakteriálnymi alebo cicavčími azo-reduktázami
Okiem toho sú zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu určené pre terapeutické použitie výhodnejšie ako existujúce zlúčeniny, pretože obsahujú 1,4bis(2-(3-karboxy-4-hydroxyfenyl)eten-1-yl)-benzénovú väzbu, ktorá nie je substrátom pre bakteriálne azo-reduktázy v čreve.
In vitro štúdie ukázali, že Αβ neurotoxicita vyžaduje tvorbu fibríl a že je inhibovaná Kongo červeňou. Presnejšie, bolo preukázané, že Kongo červeň viažuca sa na amyloidové ťibrily inhibuje neurotoxicitu fibrilárneho Αβ tým, že inhibuje tvorbu ťibril alebo väzbu už vytvorených fibríl. Lorenzo et al , Proc. Natl. Acad. Sci USA 91 12243-12247 (1994) Bolo tiež preukázané, že Kongo červeň inhibuje toxicitu amylínu spojeného s diabetom, čo je iným typom amyloidových fibríl, na bunky ostrovčekov pankreasu Lorenzo et al , vyššie Viď tiež Burgevin et al , NeuroKeport 5 5459 (1994), Pollack et al , J Neurosci. Letters 1X4 I I t -1 16 (1995), Pollack et a!. Neuroscience Letters 197’ 211 (1995) ľieio (lán naznačujú, že zlúčeninv viažuce sa na amyloid, ako sú alkylové, alkenylové a alkinylové denváty ch ry za m i n li (i, ktoré sa podobajú Kongo červeni, ale na rozdiel od nej dobre vstupujú do mozgu, by mali byť efektívne v prevencii bunkovej degenerácie a toxicity spojenej s tvorbou ľibríl u ochorení spojených s tvorbou amyloidu
V príklade 8 a na obrázkoch 12 a 13 je ukázané, že chryzamín G má účinkv veľmi podobné účinkom opisanvm pre Kongo červeň v tom, že má protektívny vplyv u krysieho feochromocytómu, ktorý je závislý od dávky. Preto je tento m vitro test prostriedkom na selekciu zlúčenín použiteľných vo farmaceutických prostriedkoch na prevenciu bunkovej degenerácie a toxicity spojenej s tvorbou fibril
Zlúčeniny ako je chryzamín G a jeho vyššie opísané deriváty sú testované podľa predkladaného vynálezu na in vivo účinnosť v prevencii tvorby amyloidových fibril alebo s ňou spojenej degenerácie buniek, ako je meraná tvorbou dystrofických neuritov, stratou synapsií, tvorbou neurofibrilárnej siete a gliózou na zvieracích modeloch, ako je senilný zvierací model pre mozgovú amyloidózu, Wisniewsky et al., J. Neuropathology and Exp. Neurol 32: 566 (1973), myší model familiárnej stredomorskej horúčky (Neurochem , Inc., Kingston, Ontario, Canada) a transgénny myší model neuropatológie Alzheimerovho typu (Games et al , Náture 373: 532-527 (1995), Hsiao et al.. Science 274' 99-102 (1996). V modeli familiárnej stredomorskej horúčky sa u zvierat vyvíja systémová amyloidóza V in vivo teste podľa predkladaného vynálezu sú porovnávané sériové nekropsie od zvierat liečených a neliečených zlúčeninou podľa predkladaného vynálezu a je hodnotená inhibícia tvorby amyloidu. Vo zvieracích modeloch pre tvorbu mozgového amyloidu je okiem sériového sledovania tvorby amyloidu tiež v sériových nekropsiách od zvierat liečených a neliečených zlúčeninou podľa predkladaného vynálezu hodnotená prítomnosť neurodegenerácie spojenej s amyloidom, ako je meraná tvorbou dystroťických neuritov, stratou synapsií, tvorbou neurofibrilárnej siete a gliózou
V spôsoboch podľa predkladaného vynálezu je farmaceutický prostriedok obsahujúci chryzamín G alebo jeho deriváty podaný subjektu, u ktorého sa predpokladá tvorba amyloidu alebo amyloidových fibril, degenerácia buniek a toxicita Vo výhodných uskutočneniach je takým subjektom človek, u ktorého je ri35 ziko vzniku mozgového amyloidu, vrátane nedemcntnej populácie vysokého veku a pacientov majúcich ochorenie spojené s tvorbou amyloidu a diabetes mellitus 2 typu Termín prevencia zahrnuje zmiernenie degenerácie buniek a toxicity spojenej s tvorbou fibril. Zmiernením je mienená prevencia závažnejších foriem degenerácie buniek a toxicity u pacientov, u ktorých sa už prejavili príznaky toxicity, ako je napríklad demencia
Farmaceutický prostriedok na prevenciu degenerácie buniek a toxicity spojenej s tvorbou fibríl pri ochoreniach spojených s amyloidózou obsahuje chryzamín G alebo jeho derivát opísaný vyššie a farmaceutický prijateľný nosič. V jednom uskutočnení taký farmaceutický prostriedok obsahuje sérový albumín, chryzamín G alebo derivát chryzamínu G a fosfátový pufer obsahujúci NaCl. Medzi ďalšie farmaceutický prijateľné nosiče patria vodné roztoky, netoxické prísady, vrátane soli, konzervačných činidiel, pufrov a podobne, ako sú opísané, napríklad, REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 15. vydanie, Easton. Mack Publishing Co., str. 1405-1412 a 1461-1487 (1975) a THE NATIONAL FORMULARY XIV., 14 vydanie, Washington: American Pharinaceutical Association (1975), a UNITED STATES PHARMACOPEIA XVIII. 18. vydanie, Washington: American Phai maceutical Association (1995), ktorých obsah je tu uvedený ako odkaz.
Príklady nevodných rozpúšťadiel sú propylénglykol, polyetylénglykol, rastlinný olej a injikovateľné organické estery ako je etyloleát. Medzi vodné nosiče patrí voda, alkoholové/vodné roztoky, salinické roztoky, parenterálne vehikulá ako je chlorid sodný, Ringerova dextróza atď. Medzi intravenózne vehikulá patria tekutiny a nutrične roztoky Medzi konzervačné činidlá patria antimikrobialne činidlá, antioxidačné činidlá, chelačné činidlá a inertné plyny. pH a presná koncentrácia rôznych zložiek farmaceutického prostriedku sú upravené podľa všeobecných znalostí Viď Goodman and Gilman’s THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICS (7. vydanie)
V spôsoboch podľa predkladaného vynálezu môže byť taký farmaceutický prostriedok podaný orálne, vo forme kvapalnej alebo pevnej, alebo môže byť podaný injekčné intravenózne alebo intramuskulárne, vo forme suspenzie alebo roztoku Termínom farmaceutický účinné množstvo je mienené také množstvo, ktoré bráni degenerácii buniek a toxicite spojenej s tvorbou fibríl. Také množstvo sa bude líšiť podľa veku, hmotnosti a stavu pacienta a bude upravené odborníkom v odbore podľa známych protokolov. V jednom uskutočnení je dávka od 0,1 do 100 mg/kg a deň, alebo je táto dávka rozdelená do menších dávok, ktoré sú podané dvakrát až štyrikrát za deň. Taký režim podávania môže pokračovať denne počas života pacienta Alternatívne môže byť farmaceutický prostriedok podávaný intramuskulárne v dávkach 0,1 až 100 mg/kg každých 1-6 týždňov.
V ešte inom uskutočnení sa predkladaný vynález týka spôsobu na detekciu amyloidových depozít v bioptických alebo nekroptických vzorkách tkaniva Spôsob obsahuje inkubáciu tkaniva fixovaného formalínom s roztokom zlúčeniny vzorca I, ako je opísaná vyššie. Výhodne je roztokom 25 - 100% etanol (v ktorom je zvyšná časť voda) nasýtený zlúčeninou vzorca I Po inkubácii zlúčenina farbí alebo značí depozity amyloidu v tkanive a farbené alebo značené depozity môžu byť detegované alebo vizualizované akoukoľvek štandardnou technikou. Medzi také detekčné prostriedky patria mikroskopické techniky ako je mikroskopia svetelná, fluorescenčná mikroskopia, laserová-konfokálna mikroskopia a polarizačná mikroskopia
V ešte inom uskutočnení sa predkladaný vynález týka spôsobu na kvantifikáciu množstva amyloidu v bioptickej alebo nekroptickej vzorke tkaniva. Tento spôsob obsahuje inkubáciu značeného alkylového, alkenylového alebo alkinylového derivátu chryzaminu G, výhodne zlúčeniny vzorca I, alebo jej netoxickej soli rozpustnej vo vode, s homogenátom bioptickej alebo nekroptickej vzorky. Tkanivo je získané a homogenizované s použitím známych techník Výhodne je zlúčenina značená rádioaktívnym značiacim činidlom, hoci iné značiace zlúčeniny, ako sú enzýmy, chemiluminiscenčné činidlá a imunofluorescenčné zlúčeniny sú tiež v odbore známe. Výhodným rádioaktívnym značiacim činidlom je 125I, l4C alebo 3H, výhodným značiacim substituentom vzorca 1 je aspoň jeden z R1-R7, R10-R27 Tkanivo obsahujúce depozity amyloidu sa bude viazať na alkylové, alkenylové alebo alkinylové deriváty chryzaminu G Naviazané tkanivo sa potom oddelí od nenaviazanélio tkaniva pomocou techník v odbore známych, ako je napríklad filtrácia Naviazané tkanivo môže byť potom kvantifikované akoukoľvek technikou známou v odbore Viď príklad 3 Jednotky rádioaktívne značeného derivátu chryzamínu G naviazaného na tkanivo sú potom premenené na pg amyloidu na 100 mg tkaniva pomocou porovnania so štandardnou krivkou určenou inkubáciou známych množstiev amyloidu s rádioaktívne značeným derivátom chryzamínu G
V ešte inom uskutočnení sa predkladaný vynález týka spôsobu na odlíšenie mozgu postihnutého Alzheimerovou chorobou od normálneho mozgu, kde uvedený spôsob obsahuje získanie tkaniva z (i) mozočku a (ii) inej oblasti rovnakého mozgu od normálnych jedincov a od jedincov s podozrením na Alzheimerovu chorobu Viď príklad 3. Sú vyrobené homogenáty takých tkanív a tie sú potom inkubované s alkylovým, alkenylovým alebo alkinylovým derivátom chryzamínu G. Pre každý typ tkaniva (napríklad mozoček, non-mozoček, normálne, abnormálne) je potom vypočítané množstvo tkaniva, ktoré sa viaže na alkylový, alkenylový alebo alkinylový derivát chryzamínu G a je vypočítaný pomer pre väzbu na tkanivo iné než mozočkové ku tkanivu mozočkovému pre normálne tkanivo a pre tkanivo od pacientov s podozrením na Alzheimerovu chorobu. Tieto pomery sú potom porovnávané. Pokiaľ je pomer z mozgu pacienta s podozrením na Alzheimerovu chorobu o 90% vyšší než pomer pre normálny mozog, tak je stanovená diagnóza Alzheimerovej choroby
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad I Syntéza chryzamínu G a telio derivátov
Syntéza chryzamínu G
Syntéza chryzamínu G (t j 4.4'-bis(3-karboxy-4-hydroxyfenylazo)bifenylu) vyžaduje nasledujúce reakčné stupne Tieto reakčné stupne sú ďalej označované ako všeobecný postup syntézy cliryzamínu G Benzidín 21ICI (28,9 mg, 0,11 inmol. Sigma Chemical Company. S T l.oms. MO) sa pridá do 1,5 ml I 1 DMSO deslilovana/deiomzovaná H (í v 5() cc skúmavke s okrúhlym dnom Každý z reakčných stupňov sa uskutočni pn 0 C, pokiaľ nie je uvedené inak Pridá sa 29 μΐ koncentrovanej HC.I, čo vedie po premiešaní ku vzniku číreho roztoku Do roztoku benzidínu sa po kvapkách pridá roztok 15,5 mg (0,22 mmol) NaNO2 v 300 μΙ 1:1 DMSO/H2O, čo vedie ku vzniku zmesi s pH približne 2-3 Táto reakčná zmes sa mieša počas 45 minút a potom sa do tejto tetra-azotizovanej zmesi po kvapkách počas 10 minút pndá 24,8 mg (0,18 mmol) metylsalicylátu (Aldrich) rozpusteného v 2,0 ml 1 (>0% DMSO obsahujúceho 250 mg/ml Na2CO? v suspenzii, za udržovania pH približne 10,5 Výsledná zmes sa mieša počas 1 hodiny pri 0 nC a potom cez noc pri teplote okolia.
Po tejto dobe sa pH upraví na približne 7 a zmes sa extrahuje troma 50 ml dielmi chloroformu Kombinované chloroformové extrakty sa premyjú troma 50 ml dielmi H2O a potom sa vysušia za získania dimetylesteru chryzamínu G (t j 4,4,-bis(3-metoxykaľboyl-4-hydrox\'fenylazo)bifenylu), ktorý sa ďalej prečistí rekryštalizáciou z chlorofornui/hexánu Ester sa potom hydrolyzuje rozpustením v približne 100 ml 1 Ί zmesi etanolu/ll2O obsahujúcej štyri ekvivalenty NaOH a zahrieva sa pri teplote spätného toku počas 3 hodín. Po odparení etanolu sa uskutoční lyofílizácia H2O za získania tetra-sodnej soli chryzamínu G. Chryzamín G vo forme voľnej kyseliny sa pripraví rozpustením tetra-sodnej soli v H2O, jedným premytím chloroformom na odstránenie nehydrolyzovaného dimetylesteru, znížením pH na približne 2 a extrakciou s troma 50 ml dielmi etylacetátu Kombinované etylacetátové extrakty sa premyjú troma 50 ml objemami H2O a vysušia sa.
Za týchto podmienok nie je piitomný žiadny metylsalicylát, kyselina salicvlová ani benzidín a je prítomné iba stopové množstvo mono-substituovaného produktu, 4-hydioxy-4'-(3-karboxv-4-liydroxyfenylazo)bifenyki, podľa HPLC s icvcrznou fázou využívajúcou C4 I,olonu (Vydac 2 14-TP5I0) s použitím systému rozpúšťadiel pufer obsahujúci fosforečnan sodný (5 mM, pH 6) acetonitril (ACN) 90 10, izokralicky počas 10 minút a potom zvýšenie na 50% ACN na ďalších 20 minút pri prietoku 3,5 ml/min Výtoková frakcia z kolóny je monitorová39 na ριι 290 a 365 nm s použitím detektora s duálnou vlnovou dĺžkou, diódovým usporiadaním (Perkin ISlnter 235C) Za týchto podmienok eluuje chryzamín G v I 7 6 m i n ú t e štiuktúra chryzaminu G a jeho derivátov bola potvrdená protónovou NMR pri 500 MHz v DMSO-dr, s TMS ako vnútorným štandardom. Pikové hodnoty pre tetra-sodnú soľ chryzamínu G boli nasledujúce, SA označuje protóny v určitých pozíciách kruhu na skupine kyseliny salicylovej a BZ označuje protóny na benzidinovej skupine SA-3, dublet .1 - S,73 Hz pri 6,75 ppm; SA-4, dublet dubletov J = 8,73 a 2,72 Hz pri 7,82 ppm, BZ-2/6, dublet J = 8,44 Hz pri 7,91 ppm; BZ3/5, dublet J = 8,44 Hz pri 7,95 ppm, a SA-6, dublet J = 2,72 Hz pri 8,28 ppm. UV/viditeľné spektrum v 40% etanole malo Xm.nx pri 389 nm. Molárna absorptivita chryzamínu G bola stanovená výpočtom koncentrácie chryzamínu G v porovnaní s pikovými plochami s vnútorným štandardom pri NMR a potom ihneď uskutočnením UV/viditeľného spektra alikvotmi NMR vzorky riedenej v 40% etanole Molárna absorptivita v 40% etanole pri 389 nm bola 5,5 x 104 AU/(cm.M).
fl4C]chryzamin G bol syntetizovaný modifikáciou vyššie uvedeného postupu. Tetra-azotácia benzidínu bola uskutočnená spôsobom opísaným vyššie s tou výnimkou, že bola uskutočnená v 100% H2O Do 50 pCi kryštalickej kyseliny salicylovej-karboxy-l4C (Sigma) v 0,S ml kónickej sklenenej skúmavke bolo pridané 25 μΙ 2,5 M Na2CO-, v H2O. Do kónickej skúmavky bolo pridané 60 μΙ tetra-azot izovanej benzidinovej zmesi, uskutočnilo sa miešanie a zmes sa uchovávala pri 0 °C počas 1 hodiny Na zabránenie tvorby mono-substituovaného benzidínového vedľajšieho produktu sa do reakčnej zmesi pridalo 12,5 μΙ 250 mM nerádioaktívnej kyseliny salicylovei (Sigma) v 2,5 M Na2COj a reakčná zmes sa počas jednej hodiny ponechala pri 0 C' Skúmavka sa potom inkubovala cez noc pri teplote okolia Celá zmes sa rozpustila v minimálnom množstve 35% ACN a infikovala sa do C4 kolóny, ako bola opísaná vyššie Pík zodpovedajúci štandardu chryzaminu G bol odobratý a Ivoľilizovaný Špecifická aktivita 26,8 Ci/mol bola vypočítaná stanovením absorbancie pi i 389 nm a potom stanovením rádioaktivity v alikvote rovnakej vzniky [ l4C]chryzamín G bol uskladnený v 40% etanole. Keď bol prečistený (IJC]chryzamín G znovu injikovaný do C4 kolóny a bol eluovaný izokraticky s 21% ACN pri 3,5 ml/min, tak bolo >98% rádioaktivity eluovaiic súčasne s autentickým ehryzarnínom G v 10,4 minúte Veľa derivátov chryzamínu G bolo syntetizovaných s použitím tohto postupu všeobecnej syntézy chryzamínu G; výnimky sú uvedené ďalej Štruktúry derivátov boli potvrdené NMR Obr. 1 ukazuje chemickú štruktúru chryzamínu G a niekoľkých jeho derivátov
Podobným postupom bol syntetizovaný [’Hjchryzamín G. 3,3'[ ’lljbcnzidin bol komerčne pripravený American Radiolabelled Chemicals, Inc., (St Louis), reakciou zmesi 0,7 mg 3,3'-dijódbenzidínu, 1 mg paládiového katalyzátora na živočíšnom uhlí, 200 pl Ν,Ν-diizopropyletylaminu a 500 pl THF s 8,26 Ci tríciového plynu bez nosiča pri teplote okolia počas 3 hodín. Presný výťažok a špecifická aktivita nie sú uvedené. 3,3'-['H]benzidin eluoval súčasne so skutočným benzidinom a neobsahoval mono-jódové nečistoty Pretože komerčne získaný materiál obsahoval určitý reziduálny Ν,Ν-diizopropyletylamin, ktorý interferoval s diazotáciou, bol 3,3'-[Ή ] benzi d í n prečistený elúciou z Vydac C4 kolóny s lineárnym gradientom 100% voda (pH = 6,0) až 100% 0,01 N HCI (pH = 2,2) v 10 minúte (4,0 ml/min). Pri tomto postupe eluoval 3,3'-['Hjbenzidín v približne 9,5 minútach bez Ν,Ν-diizopropyletylamínu a v rozpúšťadle, ktoré mohlo byť bez modifikácie použité v diazotizačnej reakcii Diazotácia v objeme niekoľko stoviek pl so 100-násobným nadbytkom nitrilu sodného, po ktorej nasledovala reakcia so 100-násobným nadbytkom kyseliny salicylovej v NaCO.i viedla k získaniu triciovaného derivátu chryzamínu G (4,4'-bis(3-karboxy-4hydroxyfenylazo)-3,3'-['H]bifenylii), ktorý bol prečistený pomocou HPLC spôsobom uvedeným vyššie, za získania špecifickej aktivity 3 5 Ci/mmol.
Syntéza alkenylových (CH=CH) derivátov chryzamínu G
4,-ľ-hiľenyldikarboxylová kyselina (Aldrich) sa premení redukciou s LiAll'h na 4,4l-bis(hydroxymetyl)bifenyl, ktorý je potom premenený na 4-4'b i s( j od met vl )bi t eny 1 reakciou s Nal a BF,-eterátom v ACN. Jódo-zlúčenina sa zahrieva pri 90 C počas 1 hodiny s nadbytkom trietylfosfitu za vzniku tetraetyl-1,4'-biľenyldimctylfosfonátu Pri podobnej icakcii 1,4-naflaléndikarboxyIovej kyseliny (Aldrich) alebo 9, l O-antracén-dikarboxylovej kyseliny (Aldrich) vznikne príslušný tetraetyl-fosľonát Po rekrvštalizácii z hexánu sa ľosfonát rozpusti v
l)MK a reaguje s desaťnásobným nadbytkom metoxidu sodného a potom s 2 ekvivalentami kyseliny 5-formylsalicvlovej v DMF Po miešaní pri teplote okolia počas 24 hodín sa reakčná zmes vnesie do vody. Okyslenie vody na pH 5,0 s použitím HCI spôsobí vyzrážanie fluorescenčného produktu, 4,4'-bis(2-(3-karboxy4-hydroxyfenyl)eten-1-yl)-bifenylu. ktorý môže byť potom selektívne extrahovaný do etylacetátu z akéhokoľvek mono-substituovaného vedľajšieho produktu. Pri podobnej reakcii tetraetyl-p-xylyléndifosfonátu (TCI America) s kyselinou 5formylsalicylovou alebo jej derivátom sa získa 4,4'-bis(2-(3-karboxy-4hydroxyľenyl)elen-1 -yl)-benzén 1,4-bis(2-(3-karboxy-4-hydroxyfenyl)eten-1-yl)naftalén alebo 9,10-bis(2-(3-karboxy-4-hydroxyfenyl)eten-1-yl)-antracén sa získa podobne reakciou vhodného fosfonátu s kyselinou 5-formylsalicylovou Iné deriváty sa získajú pri použití iných kongenerov kyseliny formylsalicylovej, kyselín formylbenzoových alebo hydroxy- alebo metoxybenzaldehydov.
Pokiaľ sú požadované iné než vyššie uvedené substituenty skeletu, tak je vhodná dikarboxylová kyselina (ako je napríklad kyselina 2-brómtereftalová (Aldrich)) redukovaná na diol, premenená na jodid a potom na tetraetyldifosfonát, s použitím spôsobu uvedeného vyššie. Pokiaľ sú požadované vedľajšie skupiny iné než kyselina salicylová, tak jc vhodný fenol (ktorý obvykle tiež obsahuje acidickú skupinu) najprv jódovaný v orto alebo para pozícii (podľa prítomnosti iných substituentov) fenolu a potní je formylovaný na jóde s použitím bežných postupov.
Syntéza butadienylových (Cl l~CH-CH=CH) derivátov cluyzamínu G
Tetraetylester kyseliny p-xylyléndiťosfónovej (TCI America, Portland. OK) |c rozpustený v suchom DMSO a reaguje s l()-násobným nadbytkom tbutoxidu draselného (Aldrich) a potom s dvoma ek vi valentami 342 ineto\ykarbonyl-4-metoxycinnamaldchydu (ktorý je pripravený z metylesteru kyseliny 5-jód-2-metoxybenzoovej a akroleinu s použitím štandardných postupov) v suchom DMSO Po miešaní pri teplote okolia počas 24 hodín sa reakčná zmes vnesie do vody Okyslenie vody 11a pH 5,0 s použitím HCI spôsobí vyzrážanie Π1101 esccnčného produktu, 1,4-br.(-l-(3-karboxy-4-metoxyfenyl)-1,3-butándiénI-vl)-benzčnu, ktorý môže byť potom selektívne extrahovaný do etylacetátu z akéhokoľvek mono-substituovaného vedľajšieho produktu Po odštiepení metoxy-skupiny s použitím nadbytku tioetoxidu sodného v refluxujúcoín DMF sa získa derivát kyseliny salicylovej. Podobná reakcia iných kombinácii fosfonátových substituentov skeletu s vhodnými cinnamaldehydovými derivátmi, ako sú opísané vyššie, vedie k získaniu požadovaných materiálov
Syntéza alkylom substituovaných alkenylových (CR'=CR') derivátov chryzamínu G
4,4'-bifenyldikarboxylová kyselina (Aldrich) alebo 1,4-benzéndikarboxvlová kyselina (Aldrich) sa najprv premení redukciou s L1AIH4 na bis(hvdroxymetyl) zlúčeninu, ktorá je potom premenená na dikarboxaldehyd reakciou s BaMnOjv etylacetáte Tento dialdehyd reaguje s R'MgX (kde R'je nižší alkyl a X je Br alebo 1) v Grignardovej reakcii za vzniku HOCR'H-Ph-PhCR'H-OH alebo HOCR'H-Ph-CR'H-OH Alkylom substituovaná bis(hydroxymetyl) zlúčenina sa potom premení na alkyl-substituovanú bis(jódmetyl) zlúčeninu reakciou s Nal a BFj-eterátom v ACN. Jódo-zlúčenina sa zahrieva pri 90 C počas 1 hodiny s nadbytkom trietylfosfitu za vzniku alkylom-substituovaného letí actyl-dimeiylfosfonátu Pri podobnej reakcii 1,4naf'taléndikarboxylovej kyseliny (Aldľich) alebo 9,10-anlracén-dikarboxylovej kyseliny (Aldrich) vznikne príslušný alkylom substituovaný tetraetyldimetylfosfonát
Polom môžu byť syntetizované alkylom substituované alkenylové zlúčeniny tioch skupín, konkrétne AR-CR’^f’R'-Q, AR-CR'=CH-Q a alebo AR-CH = CR'() (kde R' je nižší alkyl a Q je definovaný pre vzorec I) Zlúčenina AR-CR'=CR'43
Q môže byť pripravená reakciou íilkvlom-substituovaného tetraetyldimetylfosfonátn s vhodným arylketónom ako je kyselina 5-acetylsalicylová (Crcscent Chemicals C o , Inc , Hjauppage NY) Zlúčenina AR-CR'=CH-Q môže byť pripravená reakciou alkylom-substituovaného tetraetyldimetylfosfonátu s vhodným aldehydom ako je kyselina 5-formylsalicvlová (Aldrich). Zlúčenina AR-C.H=CR'-Q môže bvť piipravcná reakciou alkylom-substituovaného tetraetyldimetylfosfonátu s vhodným arylketónom ako je kyselina 5-acetylsalicylová (Crescent Chemicals Co , Inc , Hjauppage NY) Reakčné podmienky sú rovnaké ako podmienky použité pie prípravu alkenylových (C'll-CH) derivátov opísané vyššie.
Syntéza alkinylových (CsC) derivátov chryzamínu G
Kyselina 5-jódsalicylová (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, Wl) sa premení na metylester reakciou s metanolom, trimetylortoformiátom a kyselinou sírovou. Takto získaný metylester kyseliny 5-jódsalicylovej reaguje s (trimetylsilyl)acetylénom (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, Wl) za prítomnosti paládia Trimetylsilylová skupina sa odstráni a dva ekvivalenty vzniknutého metylesteru kyseliny 5-acetylénsalicylovej reagujú s 4,4'-dibrómbifenylom (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, Wl) za prítomnosti paládia, ako bolo uvedené vyššie Výsledný alkinylový analóg chryzamínu G, 4,4'-bis(2-(3 metoxykarbonyl-4-hydroxyfenyl)acetylen-1-yl)-bifenyl sa pripraví hydrolýzou esteru, ako je opísané vyššie
Alternatívna syntéza alkinylových (CsC) a vinylových (CH=CH) derivátov c h ry za m i n u G
Kyselina 5-brómsalicylová (Alilrich Chemical Company, Milwaukee, Wl) sa premení na metylester/metyléter reakciou s metyljodidom za prítomnosti
K.>CO., ako je opísané vyššie Takto získaný metylester kyseliny 2-metoxy-5brónibenzoovej reaguje s (trimetylsilvljacetylénom (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, Wl) za prítomnosti paládia Trimetylsilylová skupina sa odstráni a dva ekvivalenty vzniknutého metylcsteru kyseliny 2-mctoxy-5-acetylenbenzoovej icagujú so 4,4'-dibrómbifenylom í Aldrich Chemical Company, Milwaukee, Wl) za prítomnosti paládia, ako bolo uvedené vyššie Výsledný alkinylový analóg chryzamínu G, 4,4'-bis(2-(3-karboxy-4-metoxyfenyl)acetylen-1-y I )-bi fenyl sa pripraví liydrolýzou esteru, ako je opísaná vyššie. Tento alkinylový analóg sa redukuje bežnými metódami za získania vinylového analógu chryzamínu G.
Iná alternatívna syntéza alkenylových derivátov využíva buď Suzukiho, alebo Steelovu reakciu, ktoré využívajú borové alebo cínové deriváty metylesteru kyseliny 2-metoxy-5-acetylénbenzoovej (alebo iných hydroxy-kyselinových derivátov, ako sú opísané vyššie) pre naviazanie 1,4-dijódbenzénu, 4,4'dijódbifenylu alebo iných di-jódových alebo dibrómových substituentov skeletu V niektorých prípadoch je výhodné pripraviť borové alebo cínové deriváty 1,4diacetylenylbenzénu (alebo 4,4'-diacetylenylbifenylu) a naviazať tieto deriváty na kyselinu 5-jôdsalicylovú (alebo na iné jód-hydroxy kyseliny)
Syntéza dialkinylových (CsC-C^C) derivátov chryzamínu G
Kyselina 5-jódsalicylová (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI) sa premení na metylester reakciou s metanolom, trimetylortoformiátom a kyselinou sírovou Takto získaný metylester kyseliny 5-jódsalicylovej reaguje s (trimetylsilyl)acetylénom (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI) za prítomnosti paládia. Trimetylsilylová skupina sa odstráni a dva ekvivalenty vzniknutého metylesteru kyseliny 5-acetylénsalicylovej reagujú so 4,4'-bis(2bi ómacetylen-1-ylbenzénom (syntetizovaným z trimetylsilylacetylénu a 1,4dijódbenzénu) za piitomnosti paládia. ako bolo uvedené vyššie. Výsledný dialkinvlovv analóg chryzamínu G, 4,4'-l·is(4-(3-metoxykarbonyl-4-hydroxyfenyl)-1,3butadiin-1-yl)-benzén sa pripraví hydiolýzou esteru, ako je opísaná vyššie.
Syntéza alkén-alkinylových (C^-C-CsC) derivátov chryzamínu G
Podobne ako pri syntéze alkenylových a alkinylových derivátov opísanej vvššie sú Suzukibo alebo Steelove reakcie použité pre naviazanie kovalkcnylových derivátov benzénu, biľenylu alebo iných skeletových skupín 11a metylester kyseliny 2-metoxy-5-( 2-|ôdacetylen-1-yl)-benzoovej (alebo na iný vhodný derivát hvdroxy-kyseliny) alebo - alternatívne - môže byť 5-kovalkenylový derivát metylesteru kyseliny 2-metoxybenzoovej naviazaný na 1,4bis(2-jódacetylen-1 -yl)-benzén (alebo 4,4'-bis(2-jódacetylen-1 -yl)-bifenyl)
Syntéza alkylových (CH2-CH2) alebo dialkylových (CH2-CH2-CH2-CH2) derivátov chryzamínu G
Alkenylové, alkinylové, dialkenylové, dialkinylové alebo alkén-alkinylové deriváty opísané vyššie sú hydrogenované štandardnými technikami s použitím vodíka a platinového alebo paládiového katalyzátora.
Syntéza di-fluór-alkenylovýeh derivátov chryzamínu G
5-fluór derivát, 1,4-bis(2-(2-hydroxy-3-karboxy-5-fluórfenyl)eten-1 -yl)bcnzén, je syntetizovaný substitúciou kyseliny 3-formyl-5-fluórsalicylovej za kyselinu 5-formyl-salicylovú. [l8F]aryl fluoridové deriváty chryzamínu G môžu byť piipiavené substitúciou l8F-značených prekurzorov ako je [18F]LiBF4, v Schiemannovej reakcii, prostredníctvom triazénového rozkladu s Cs [18F], alebo pomocou nukleofilnej substitúcie lxF-za-X, kde X = tozyl, triflát, NO2, +N(CH',b alebo halogén - Viď Fowler, J and Wolf, A , v POSITRON EMISSION TOMOGRAPHY AND AUTORADIOGR APHY (Phelps, M , Mazziota, J. and Schelbert, H , vyd.) 391-450 (Raven Piess, NY, 1986) a Kilbourn, M., Fluorine-I8 labelmg of radiopharmaceuticals (Nail Acad Press, Washington, D C.) (1990).
Syntéza aromatických fluóralkyl- alebo fluóralkoxy- derivátov
Aromatické fluóralkylove deriváty sú syntetizované s použitím metódy, ktorú opísal Bisliop et al , J Med Chem 34' 1612 (1991), v ktorej Claisenovo preskupenie vhodných O-alyl éterov tvorí aromatický alylový derivát, ktorý môže byť ďalej funkcionalizovaný za získania fluóretylových alebo fluórpropylových derivátov. Alternatívne môže byť aromatický jodid ľahko premenený na aromatický alkín skladajúci sa z dvoch až piatich atómov uhlíka, s použitím väzbovej metódy využívajúcej paládmm, ktorú opísal Sonogashira et al., Tetrahedron Lcltcrs, 4467-4470 (1975) Po následnej derivatizácii alkínu sa získa fluóralkvlový derivát Fluóralkoxv-dei iváty môžu byť pripravené metódou, ktorú opisal Chumpradit et al., J. Med. Chem 36’ 21 (1993), v ktorej alkylácia vhodného fenolu s vhodným 1 -bróm-(alcbo jód alebo sulfonyloxy) - omeyafluóralkánom vedie k získaniu zodpovedajúceho fluóralkoxy-derivátu.
Rádiofluorácia aromatických alkylsulfonyloxy- a alkoxysulfonyloxy- derivátov
Rádiofluorácia vedúca k získaniu aromatických [18 F]fl uóral ky 1- a llsF]ťluóralkoxy- derivátov je uskutočnená postupom, ktorý opísal Mathis et al., Nucl. Med. Biol. 19. 571 (1992), v ktorom sú aromatické alkyl- alebo alkoxysulfonyloxy- (napríklad alkoxytozylát) deriváty substituované [l8F]fluoridom za získania aromatických [1 “F j tl u ó ra I k y I - alebo [,liF]fluóralkoxy- zlúčenín
Rádiojodácia a rádiobromácia pomocou trialkyleínu
Syntéza t ri a I kylcí n o vých derivátov
Všeobecná štruktúra t n al k y 1 ci n o vých derivátov chryzamínu G je uvedená na obr 2B Všeobecne bude t r i a 1 k y I c i n o vá skupina substituovaná v 3-pozicii na jednej strane bifenylovej skupiny, ale iné pozície, vrátane kyseliny salicylovej alebo lieterocyklickej skupiny, sú liež potenciálnym cieľom substitúcie Tieto t lial ky lei no vé deriváty sú stabilné bezprostredné prekurzory na prípravu rádio47 jódovaných a rádiobrómovaných zlúčenín, ktoré majú byť použité u ľudí. Presnejšie sa tieto 11 ial kylci nové deriváty používajú na prípravu halogénovaných rádioaktívnych zlúčenín, ktoré sú použiteľné na zobrazenie amyloidu in vivo
Všeobecné postupy pre syntézu trialkylcínových derivátov
Trialkylcinové deriváty sú pripravené z vhodných arylhalogenidov, [(Cr.Hs^PjjPdfO), a hexaalkyldicínu, s použitím postupu, ktorý publikovali Kosugi, M et al , Chem. Lett 1981, 829; Heck, R Pute and Appl. Chem. 1978, 691, Echavarren, A., and Stille, J., J. Am. Chem. Soc 1987, 5478, Mitchell, T., J Organometallic Chem. 1986, 1, a Stille, J., R. Pure and Appl. Chem. 1985, 1771 Tieto deriváty môžu byť tiež získané s použitím n-BuLi a trialkyleín chloridu v postupe opísanom v Mathis et al., J. Labell Comp. and Radiopharm 1994, 905
Syntéza 3-triaIkylcínových derivátov 4,4'-bis(3-metoxykarbonyl-4hydroxyfenylazo)-bifenylu
3-bróm- alebo 3-jód-4,4'-bi s(3-met oxy karbonyl-4-hy d roxy fenyl azo)bifenyl alebo jeho dimetyléter sú pripravené syntézou 3-bróm- alebo 3jódbenzidínu (viď vyššie), tetraazotizáciou a väzbou na metylsalicylát, ako je uvedené pre syntézu chryzamínu (i. a metyláciou fenolu ako je opísaná vyššie, pokiaľ je požadovaná metoxy-zlúčenina I mmol fenolického esteru alebo metoxy-esleru, [(Cr,H5)1 P]?Pd(0) (0,1 až 0,2 mmol), hexabutyldicín alebo hexametyldicín (1,25 mmol) a dioxán (25 ml) sa pod atmosférou argónu zahrievajú pri 70 C počas 16 hodín. Reakčná zmes sa ochladí a rozpúšťadlo sa odparí. Trialkylcínhalogenid sa odstráni vodným K F Organický materiál sa extrahuje etylacetátom, súši sa cez síran horečnatý, ľiltiuje sa a rozpúšťadlo sa odparí za ledukovanélio tlaku Zvyšok sa prečisti na silikagéli za získania 3-trialkylcín-4,4'-bis(3metoxykarbonyl-4-hydroxyfenylazo)-bifenylu
Rádiojodácia alebo rádiobromácia trialkylcínových derivátov
Tributyl- alebo trimetylcinové deriváty sú rádiojódované pomocou Na| ,2'l] alebo N a f12' I ] alebo rádiobrómovanč pomocou Na[75Br] alebo Na[7í,Br] s použitím publikovaných postupov, ako napríklad Mathis et al , J. Labcll Comp and Radiopharm 1994, 905, f’humpradit el al., J Med Chem 34’ 877 (1991), Zhuang et al , J. Med Chem 37 1406 (1994); Chumpradit el al , J.
Med Chem. 37’ 4245 (1994). Všeobecne, 0,5 mg trialkylcínovej zlúčeniny, 0,2 ml bezvodého acetonitrilu, 10 μΙ 2M H5PO4, 2-100 μΙ roztoku Na[l25I] alebo Na[12’I) (alebo Na[75Br] alebo Na[7ftBr]) s vysokou špecifickou aktivitou (>2000 Ci/mmol) v NaOH pri pH 9-12 a dichlóramín-T (DCT) (20 μΙ 2,5 mg/ml DCT v acetonitrilu) sa umiestni v 1 ml Reacti-Vial. Skúmavka sa uzavrie a zmes sa mieša pri teplote okolia v tme Reakcia sa sleduje HPLC a po 30 minútach sa utlmi s 50 μΙ 2M Na2S2O3. Výsledný materiál sa prečistí s použitím štandardných chromatografických techník. Mathis et al , J. Labell Comp. and Radiopharm. 1994, 905 Podobne sa analogickým postupom pripravia 1SF deriváty s nízkou špecifickou aktivitou.
Všeobecné postupy na prípravu nerádioaktívnych 1, Br, Cl, F a -SH derivátov
Všeobecne, 3- alebo 4-amino deriváty kyseliny 5-formylsalicylovej, alebo zodpovedajúce deriváty heterocyklických analógov kyseliny salicylovej uvedené na obr. 2, sa premenia na zodpovedajúce diazo-zlúčeniny reakciou s nitritom sodným a HCl alebo H2SO4. Jódové deriváty sú pripravené priamo prípravou diazoniumjodidu, ktorý je potom premenený na aryljodid, alebo cez triazénové deriváty Viď napríklad Greenbaum, F Am. J Pharm. 108' 17 (1936), Satyaiiiurthy and Barrio, J Org. Chem 4S 4394 (1983), Goodman et al , J Org ('lieni 49 2322 (1984) Arylbroniidy a chloridy sú pripravené z diazo-zlúčenín leakciou s C u C l alebo CuBr podľa Sandmeyerovej reakcie alebo prostredníctvom iiiu/čnu. rovnakí) ako jódové deriváty Aryllluoridy sú pripravené reakciou diazóniových zlúčenín s NaBF4, 11BF, alebo NII.1BF4 v Schiciiiannovej reakcii, alebo prostredníctvom triazénovej dekompozície, rovnako ako jódové deriváty. Aryltioly sú pripravené z diazóniových zlúčenín reakciou s nukleofilnými činidlami obsahujúcimi síru, ako je HS', EtO-CSS' a S2 2 Alternatívne môžu byť aryltioly pripravené nahradením arylhalogenidov nukleofilnými činidlami obsahujúcimi síru Tieto reakcie sú opísané v March, J., ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY: REACTIONS, MECHANISMS AND STRIJCTURE (3. vydanie, 1985)
Všeobecné postupy na prípravu rádioaktívnych C, F a Tc derivátov
Okrem vyššie uvedených postupov je podľa postupov uvedených v literatúre uskutočnené rádioaktívne značenie vysokou špecifickou aktivitou 'Tc pre SPECT alebo inými rádionuklidmi emitujúcimi pozitróny, ako je HC, li!F, 75Br a 7ftBr. Niektoré možné postupy sú opísané ďalej, ale existujú iné dobre známe postupy. ktoré sú opísané vo Fowler, J. and Wolf, A. v POS1TRON EMISSION TOMOGRAPHY AND AUTORADIOGRAPHY (Phelps, M., Mazziota, J., and Schelbert, H., vyd.) 391-450 (Raven Press, NA, 1986), Coenen, H. et al., Radiochimica Acta 34. 47 (1983) a Kulkarni, Int. J. Rad. Appl. and Inst. (Part B) 18 647 (1991) ktorých obsah je tu uvedený ako odkaz.
99n,Tc deriváty sú pripravené tvorbou komplexov s aryltiolmi. Rádioaktívne značenie llC môže byť ľahko uskutočnené pomocou N-metylácie, 0mctylácie, ako sú opísané vyššie, za substitúcie [''Cjmetyljodidu, ['’CJalkylácie alebo f11 Cjkarboxylácie vhodného alkylovcho, alkenylového alebo alkinylovélio analógii chryzaminu G [l8F]aryl fluoridové deriváty chryzaminu G môžu byť pripravené substitúciou '*F-značených prekurzorov ako je [I!íF]LíBF,i, v Schiemannovej reakcii opísanej vyššie, prostredníctvom triazénového rozkladu s Cs [Ι!Ί:], alebo pomocou nukleofilnej substitúcie ,sF-za-X, kde X = tozyl, triflát, NO>, N(CH;)j alebo halogén Rádiobromácia s použitím 75Br alebo 7r’Br môže byť uskutočnená pomocou elektroľiInej (Br+) alebo nukleofilnej (Br-) substitučnej techniky analogicky k rádiojodácii, viď Coenen, H , vyššie
Syntéza 3-hydroxy-1,2-benzizoxazolových derivátov a príbuzných derivátov (viď obr 2C)
Metyl ester kyseliny 2,6-dihvdroxybenzoovej (γ-rezorcylovej) (TCI Ameiica, l’oitland, OR) sa premení 11a hydroxámovú kyselinu s použitím hydroxylaminhydiochloridu postupom, ktorý opísal Boshagen (Chem Ber. 100. 954-960, 1967) Kyselina hydroxámová sa premení na zodpovedajúci 3-hydroxy-1,2benzizoxazol s použitím SOCI2 a potom trietylamínu, tiež postupom, ktorý opísal Boshagen (Cliern Ber. 100' 954-960, 1967). Táto zlúčenina sa potom premení na formylový derivát a naviaže sa na vhodný tetraetyldifosfonát (ktorý môže byť v niektorých prípadoch brómovaný) postupom, ktorý je opísaný vyššie pre syntézu alkenylových derivátov Brómové deriváty môžu byť potom premenené na t ri al ky I c í 110 vé a jódové deriváty postupom opísaným vyššie.
Alternatívne je kyselina 5-forntylsalicylová naviazaná na vhodný tetraetyldifosfonát obvyklým spôsobom a výsledný 4,4'-bis(2-(3-karboxy-4liydroxyfenyl)eten-1-yl)-benzén je premenený najprv na dimetylester a potom na hydroxámovú kyselinu a nakoniec na benzizoxazol postupom, ktorý opísal Boshagen, ako je uvedený vyššie. Tretí typ 3-hydroxy-1,2-benzizoxazolu je syntetizovaný z niekoľkých izomerických dihydroxybenzéndikarboxylových kyselín vrátane kyseliny 4,6-dihydroxy-1,3-benzčndikarboxylovej, kyseliny 3,6dihydroxyftalovej a kyseliny 2,5-dihydroxytereftalovej (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wl) Po formylácii a naviazaní na vhodný tetraetyldifosfonát s použitím štandardných technik, po Čom nasleduje konverzia na dimetylestery, sú dihydroxy/diestery premenené na dihydroxy/dihydroxámové kyseliny reakciou s hydroxylamínom s použitím postupu, ktorý opísal Boshagen, ako je uvedený vyššie Konverzia na dvojitý benzizoxazol je uskutočnená reakciou s SOCI2 a trieivki 1111 nimi op.tť s použitím postupu, ktorý opísal Boshagen, ako je uvedený vyššie
Syntéza ftalimidovčbo alebo izoindol-1,3(2H)-diónovébo derivátu (viď obr 2D)
3-hydroxyftalimid pripravený z anhydridu kyseliny 3-hydroxyftalovej (Aldrich Chemical Company, Milwaukce, Wl) je premenený na formylový derivát a naviaže sa na vhodný tetraetyldíľosťonát (ktorý môže byť v niektorých prípadoch brómovaný) postupom, ktorý je opísaný vyššie pre syntézu alkenylových derivátov Brómové deriváty môžu byť potom premenené na trialkyleínové a jódové deriváty postupom opísaným vyššie
Syntéza ftalhydrazidového alebo 2,3-benzodiazin-1,4(2H,3H)-diónového derivátu (viď obr 2E)
3-hydroxyftalhydrazid pripravený z reakcie anhydridu kyseliny 3hydroxyftalovej (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, Wl) s hydrazínom je premenený na formylový derivát a naviaže sa na vhodný tetraetyldifosfonát (ktorý môže byť v niektorých prípadoch brómovaný) postupom, ktorý je opísaný vyššie pre syntézu alkenylových derivátov. Brómové deriváty môžu byť potom premenené na trialkyleínové a jódové deriváty postupom opísaným vyššie.
Syntéza 2,3-benzoxazín-1,4-(3 H)-diónového derivátu (viď obr. 2F)
Anhydrid kyseliny 3-hydroxyftalovej (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, Wl) je premenený na 2,3-benzoxazín s použitím hydroxylamínu. Benzoxazínový derivát je potom premenený na formylový derivát a naviaže sa na vhodný tetraetyldifosfonát (ktorý môže byť v niektorých prípadoch brómovaný) postupom, ktorý je opísaný vyššie pre syntézu alkenylových derivátov. Brómové deriváty môžu byť potom premenené na trialkyleínové a jódové deriváty postupom opísaným vyššie.
Syntéza (2H) 1,3-benzoxazín-2,4(3H)-diónového derivátu (viď obr. 2G)
Tálo zlúčenina je syntetizovaná postupom podl'a Efľcnberger et al., Chem Ber 105' 1926-1942, 1972. Stručne, 4-hydroxybenzaldehyd (Aldrich) sa naviaže na vhodný tetraetyldifosfonát rovnakým postupom, ako bol postup použitý pre deriváty kyseliny formylsalicylovej Tento adukt je potom premenený na karbamát reakciou s etoxykarbonylizokyanatanom (O=C=N-CO-O-Et) za prítomnosti trietylamínu Tento substituovaný karbamát (alebo fenylester kyseliny Nctoxykarbonyl-karbamovej) je premenený na benzoxazindión zahrievaním v difenvlétei i Renzoxazíndión je potom premenený na trialkylcínové a jódové deriváty postupom opísaným vyššie
Syntéza (3H)2-benzazín-l ,3(3H)-diónového derivátu (viď obr. 2H)
Kyselina 3-liydroxyfenyloctová (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI) sa formyluje, premení sa na amid a potom sa naviaže na vhodný tetraetyldifosfonát rovnakým postupom, ako bol postup použitý pre deriváty kyseliny formylsalicylovej. Tento adukt je potom premenený na etylester kyseliny N-(3hydroxyfenylacetoxy)-karbamovej reakciou s etylchlórformiátom. Tento substituovaný karbamát je premenený na benzoxazindión zahrievaním v difenyléteri. Benzoxazindión je potom premenený na trialkylcínové a jódové deriváty postupom opísaným vyššie.
Syntéza 1,8-naftalimidového derivátu (viď obr. 21)
4-amino-1,8-naftalimid je premenený na formylový derivát a naviaže sa na vhodný tetraetyldifosfonát (ktorý môže byť v niektorých prípadoch brómovaný) postupom, ktorý je opísaný vyššie pre syntézu alkenylových derivátov. Brómové deriváty môžu byť potom premenené na trialkylcínové a jódové deriváty postupom opísaným vyššie.
Syntéza let iazolových a oxadiazolových derivátov (viď obr. 2J a 2K)
2-kvanfenol tAtdiicli Chemical Company, Milwaukec, Wl) sa premení 11a tetrazol reakciou s azidom sodným alebo hlinitým postupom, ktoiy opísal Holland and Pereira, J. Med. Chem 10 149 (1967) a Holland U S patent č 3448 107 Stručne, 2-kyánfenolový alebo alkenylkyánfenolový derivát chryzamínu G (pripravený naviazaním 4-ľormyl-2-kyánfenolu na vhodný tetraetyldiťosfonát) (1 mmol) v 40 ml DMF reaguje s azidom sodným (10 mmol) a t ri ety I a in í n hy drochloridom (10 mmol) pod atmosférou argónu. Zmes sa mieša pri 120 C počas 2 hodín a potom sa zmes ochladí a spracuje sa spôsobom analogickým so spôsobom opísaným vyššie pre chryzamín (i.
Oxadiazoly sú syntetizované reakciou tetrazolov pripravených vyššie s anhydridom kyseliny (ako je anhydrid kyseliny octovej). Alternatívny spôsob opisuje Bamford et al., J. Med Chem. 38' 3502 (1995). V tomto postupe reagujú hydrazidalkenylové deriváty chryzamínu G alebo kyseliny salicylovej (získané reakciou príslušných esterov s hydrazínom) s metylizotiokyanatanom za prítomnosti dicyklohexylkarbodiimidu
Syntéza derivátov chryzamínu G na použitie pre kontroly
Anilínový derivát je syntetizovaný substitúciou dvou ekvivalentov anilínu (Fislier Chemical Company, Fair Lawn, NJ) za každý ekvivalent benzidínu. Derivát kyseliny 2,2'-disulfónovej je syntetizovaný substitúciou kyseliny benzidín2,2'-disulfónovej (Pfaltz and Bauer, Inc , Waterbury, CT) za benzidín Fenolový derivát je syntetizovaný substitúciou jedného ekvivalentu fenolu za každý ekvivalent kyseliny salicylovej Kongo červeň (Aldrich čistoty) je získaná komerčne.
Príklad 2’ Chryzamín G a deriváty chryzamínu G sa špecificky viažu na Αβ
Vazba 11a syntetický Λβ( 10-43)
Chryzamin G sa dobre viaže 11a syntetický Αβί 10-43) peptid in vitro. Obr 4z\ ukazuje Scatchardovu analýzu vazbv chryzamínu G na Αβ( 10-43) Zložka s vyššou afinitou má K|> 0,257 μΜ a B,„.1X 3, IX nmol chiyzamínu G/mg Αβ( 10-43) Zložka s nižšou afinitou je týmito dá t a mi horšie definovaná, ale zdá sa, že má K|, 4,01 μΜ a Bmax IX,7 nmol chryzamínu G/mg Αβ(10-43) Zložka s nízkou afinitou predstavuje väzbu chryzamínu G pi i vysokých koncentráciách na odlišné miesto s nízkou afinitou, nie však väzbu na nečistoty prípravku Množstvo chryzamínu G injikované in vivo je tak nízke, že neexistuje väzba na zložku s nízkou afinitou Pri veľmi nízkych koncentráciách je pomer vysokoafinitnej k nízkoafinitnej väzbe veľmi vysoký
Vazba chryzamínu G je lineárna pri použitých koncentráciách peptidu, ako ukazuje obr. 5.
Kinetika väzby
Štúdie kinetiky ukázali veľmi rýchlu asociáciu (obr. 6A), v podstate dokončenú po 1 minúte, pri [chryzamin G] =112 μΜ s t|/2 8,9 ± 1.8 sec a o niečo menej rýchlu disociáciu (obr. 6C), tr2 = 55 ± 9,4 sec (disociačná rýchlostná konštanta (K.|) = 1,26 x 10’2 sec’1) Obr. 6B ukazuje transformáciu dát asociačnej kinetiky podľa metódy, ktorú opísali Bennett and Yamamura. Bennett, J.P. and Yamamura, H I. v NEUROTKANSMITTER RECEPTOR BINDING (N.Y Raven Press 1985), str 61-89 Lineárna časť asociačnej krivky na obr 6A je transformovaná do priamky na obr 6B, kde je graficky znázornený ln[Bu(|/(ei|-B,)] v závislosti od času, kde Beq je množstvo chryzamínu G viazané v rovnovážnom stave (4 min ) a B, je množstvo naviazané v čase t Sklon tejto priamky je rovný a ki = (k.,i,.tl,c,i - k.|) /[chryzamin G], kde k.! je disociačná rýchlostná konštanta určená z dát uvedených na obr 6C Krivka na obr. 6C je u i čená i ovnicou , -k-1 \[»e kde A, je množstvo chryzaminu G, ktorý zostáva naviazaný v čase t, Ao je množstvo naviazaného chryzamínu G v čase 0, t je čas v minútach a k.i je disociačná rýchlostná konštanta. Z tejto analýzy bola vypočítaná hodnota asociačnej rýchlostnei konštanty (k|) 3,75 x I 0J M'1 s'1 a potom Kn = k.|/ki = 0,34 μΜ, čo je v dobiom súlade so Scatchardovou analýzou
Deriváty chryzamínu G môžu inhibovať väzbu chryzamínu G na Αβ
Hodnoty K, pre inhibiciu väzby [l4C] chryzaminu G na Αβ( 10-43) pomocou analógov chryzamínu G sú uvedené pod chemickými vzorcami na obr. 1 a niekoľko kriviek inhibície je medené na obr. 3. K, je definovaná ako ICso/( I +[L]/KP, kde [L] je koncentrácia [l4C] chryzamínu G v teste (0,100 až 0,125 μΜ) a Kp je 0,26 μΜ, čo je Kp chryzamínu G určená Scatchardovou analýzou vyššie Chryzamín G sám dáva K, 0,37 ± 0,04 μΜ, čo je hodnota, ktorá veľmi dobre zodpovedá Scatchardovej analýze a analýzam kinetiky. Kongo červeň má K, 2,82 ± 0,84 μΜ Difluórový derivát chryzamínu G, (5-FSA)CG, (obr. I). má tretinovú účinnosť v porovnaní s chryzamínom G samotným (K, = 1,16 ± 0,19 μΜ). Aktivita difluórového derivátu chryzamínu G naznačuje, že 1SF difluórové deriváty chryzamínu G sú použiteľné pre PET zobrazenie a že 19F difluórové deriváty chryzamínu G sú použiteľné pre MRS/MRI zobrazenie
3-ICG je o niečo účinnejší než chryzamín G Aktivita 3-1CG derivátu naznačuje, že 12’l difluórový derivát chryzamínu G je použiteľný pre SPECT zobrazenie. Metylácia fenolu 3-ICG znižuje afinitu o faktor 10 pre 3-ICG(OMe)2. Metylácia karboxylátovej skupiny spôsobuje ešte väčšie (asi 200-násobné) zníženie afinity pre CG(COOMe)2 IJplné odstránenie kyseliny, aké je napríklad u fenolového derivátu, celkom zruší väzbovú afinitu.
Tieto výsledky naznačujú, že kyselinová skupina analógu chryzamínu G má hlavnú úlohu vo väzbe na Αβ a ďalej naznačujú, že fenolová skupina má uľahčujúcu úlohu Účinky fenolu môžu byť sprostredkované vodíkovou väzbou na kyselinu, ktorá môže stabilizoval štrukturálnu orientáciu kyselinovej skupiny
Prítomnosť fenolu v orto pozícii môže tiež meniť distribúciu náboja kyseliny ako piostrednictvom vodíkovej väzby, lak prostredníctvom zmien v distribúcii náboja ai omatického systému ako celku. Alternatívne sa môže fenol priamo zúčastniť väzby na amyloid prostredníctvom dvoj výbežkovej väzby ako fenolu, tak kyseliny na ainyloidové väzbové miesto Pridaním druhého fenolu v orto pozícii vzhľadom ku karboxylatu v deriváte kyseliny i ezorcylovej, (ó-OHSA)CG, vzniká zlúčenina s najvyššou afinitou v tejto sérii, s K, 0,094 ± 0,02 μΜ
Zdá sa, že zvyšujúca sa lipofilnosť bifenylového skeletu o niečo zvyšuje afinitu Di-halogénové deriváty, 3,3'-I2CG, 3,3'-Cl2CG, a 3,3'-Br2C.G, majú všetky veľmi podobné hodnoty K,, ktoré sú približne polovičné vzhľadom ku chryzamínu G
Deformácia torzného uhla medzi fenylovými kruhmi bifenylovej skupiny spôsobená substitúciou v 2-pozicii značne znižuje afinitu Toto je demonštrované inaktivitou derivátu chryzaminu G s kyselinou 2,2'-disulfônovou, 2,2'(SO-,)>C.G Pretože 3,3'-dikarboxylový derivát, 3,3'-(C.OOH)2CG, má iba 7-krát nižšiu aktivitu ako chryzamín G, tak je nepravdepodobné, že ďalšie acidické skupiny sú jedinou príčinou straty aktivity kyseliny 2,2'-disulfónovej. 2,2'derivát je jedinečný tým, že objemné sulfonátové skupiny v 2-pozicii vytlačujú bifenylovú skupinu z planarity. Molekulárne modelovacie štúdie ukázali, že torzný uhol medzi dvoma bifenyl benzénovými kruhmi v deriváte kyseliny 2,2'disulfónovej je 83°. Tento uhol je približne 35-40° v chryzamíne G a vo všetkých ostatných aktívnych derivátoch
V pokuse o využitie významu dvojvýbežkového charakteru funkčných skupín chi)/amínu G bola študovaná vazba anilinového derivátu, ktorý predstavuje jednu polovicu molekuly chryzaminu G (obr I) Približne stanovenie energie väzby môže byť vypočítané z rovnice
AG = -RT In Keq kde AG je energia väzbovej reakcie, R ie molárna plynová konštanta (8,3 144 1 ,Ι/(ηιοΙ·Κ )), T je teplota v K a K.., je rovnovážna konštanta pre reakciu (sonda) - (peptid) = (sonda»peptid) a KĽ(| = 1 /Ku ~ 1/K,. Pri použití hodnoty 0,26 μΜ pre K|> chryzamínu G je energia väzby približne 38 KJ/mol Pokiaľ sa anilínový derivát viaže s približne jednou polovicou tejto energie, potom je predpokladaná väzbová energia približne 19 K.l/mol. Pri K, 73 μΜ pre anilínový derivát je energia väzby 23 KJ/mol, čo piijatel'ne zodpovedá piedpoklad.inej hodnote Význam hydroľóbneho regiónu chiyzamínu G a anilinovélio derivátu je demonštrovaný úplným chýbaním väzbovej aktivity kyseliny salicylovej samotnej.
Afinita chryzamínu G pre Αβ sa zdá byť niekoľkrát vyššia než afinita kongo červene pre tento peptid Väzba je reverzibilná s disociačnou konštantou približne 250-400 nM, pri meraní Scatchardovou analýzou, kinetickými metódami alebo inhibíciou väzby. Vzhľadom k nekryštalickému, zle rozpustnému charakteru amyloidových fibril nebola štruktúra komplexov kongo červene alebo chryzamínu G s amyloidom nikdy presne definovaná presnými štrukturálnymi technikami ako je róntgenová kryštalografia alebo mnohorozmerná NMR. Boli navrhnuté modely interakcií kongo červene s amyloidom Cooper, Lab Invest., 31. 232 (1974); Rombanyi, Virchows Árch , 3 54’ 209 (1971). Táto práca naznačuje, že kongo červeň sa neviaže na jedinú molekulu amyloidového peptidu, ale že sa viaže na niekoľko molekúl Αβ οι ientovaných do štruktúry vlákna beta-listu Klunk et al., J. Histochem Cytochem. 37. 1273 (1989).
Obr. 7 ukazuje schému tohto modelu, vytvorenú pomocou MacroModel 2.5, v ktorom chryzamín G pokrýva 5 peptidových reťazcov v usporiadaní antiparalelnébo beta-listu. Peptidy sú použité bez ďalších štrukturálnych úprav Peptidy sú usporiadané tak, že alternujúce reťazce sú od seba vzdialené 4,76 A, čo je charakteristické pre fibrily beta-listu. Alternujúce peptidové reťazce sú nakreslené čierno a bielo. Chryzamín (ί (čierny) má minimalizovanú energiu a je tak uložený vo vzťahu k modelu fibrily, aby bol maximalizovaný kontakt s lyzínom 16 (svetlo šedé ovály na hornom obrázku) a bydroľóbnym regiónom fenylalanínov 19/20 (dolná časť) Dva pohľady na rovnaký model sú z uhlov približne 91) od seba Biele šípky ukazujú smei pohľadu druhého obrázku
Vzdialenosť 19,1 A medzi skupinami karboxylovej kyseliny chryzaminu G dobre zodpovedá vzdialenosti 19,0 A medzi 5 reťazcami (4 x 4,76 A medzi susednými reťazcami, Kirschner et al , Proc. Natl. Acad Sci. USA 83 503 (1986)). Pokiaľ natívna štruktúra Λβ obsahuje vlásenkové sľučky, ako naznačili llilbich et al , (Hilbich et al , J Mol Biol. 218. 149 (1991)), potom by mali reťazce 1 a 2, 3 a 4. 5 a 6 atď tvoiiť polovice rovnakej molekuly, ale model by inak mal byť rovnaký. Tiež |c dôležité si povšimnúť nutnosť pozitívne nabitých aminokyselinových zvyškov v tomto modeli, ako je lyzin-16 v Αβ. Predchádzajúce práce ukázali, že väzba Kongo červene dobre koreluje s počtom aminokyselín s pozitívnym nábojom vo vzorke amyloidových fibríl. Klunk et al., J Histochem. Cytochem 37 1273 (1989) Dvojvýbežkový charakter modelu uvedeného na obr 7 a význam hydrofóbnych interakcii je podporený znížením afinity jednovýbežkovélio anilínového analógii chryzaminu G a inaktivitou kyseliny salicylovej, lovnako ako zvýšenou účinnosťou lipofilnejších zlúčenín majúcich dva halogény na benzidinovej skupine (viď obr I). Význam skoro planárnej bifenylovej skupiny je podporovaný inaktivitou derivátu kyseliny 2,2'-disulfónovej.
Príklad 3. Chryzamín G rozlišuje mozog postihnutý Alzheimerovou chorobou od normálneho mozgu
Charakterizácia väzby chryzaminu G na AD mozog
Bola uskutočnená Scatchardova analýza väzby chryzaminu G a derivátov chryzaminu G na vzorky AD mozgu s cieľom poznať zvýšenú väzbu chryzaminu G na AD mozog (Obr 4B, tabuľka I) V použitých podmienkach vykazovali kontrolné AD mozgy jednu väzbovú zložku Kn v AD mozgu bola o 16% nižšia než v kontrolnom mozgu, ale rozdiel nebol štatisticky významný (p = 0,29) Bn)JX bola v AD mozgu o 36% vyššia než. B,11JX v kontrolnom mozgu, ale rozdiel opäť nedosiahol štatistickú významnosť (p = 0,09) Preto sa zdá, že zvýšená väzba v AD mozgu jc spôsobená hlavne piitomnosťou väčšieho množstva rovnakej väzbovej zložky, aka existuje v kontrolnom mozgu, a nie prítomnosťou inej zložky
Ί abuľka I Porovnanie parametrov väzby v AD a kontrolných mozgoch
Κι, (μΜ) B„llis (pmol/pg proteínu)
k o n 11 o 1 a (n = ň) 0,47 .r 0,049 0,576 ± 0,092
AD (n = 5) 0,39 ± 0,048 0,784 ± 0,061
Väzba CG na AD mozog sigmťikantne koreluje s počtom NP v asociačných kôrach mozgových. Obr. 8A ukazuje koreláciu väzby [,4C]CG s počtom NP v hornej/strednej frontálnej a hornej temporálnej kôre AD mozgu. Korelácia s NP bola štatisticky významná, či už boli použité kontroly (r = 0,69; p = 0,001) alebo či už boli posudzované AD mozgy samotné (r = 0,59; p = 0,007). Obr. 8B ukazuje podobné korelácie pre počet NFT. Rovnako ako pre NP boli korelácie s NFT štatisticky významné, či už boli použité kontroly (r = 0,60; p = 0,001) aleho či už boli posudzované AD mozgy samotné (r = 0,50; p = 0,026). Korelácia s NF'I nie je prekvapujúca, pretože CG je derivát Kongo červene, ktorá farbí NFT Počet NP signifikantne koreloval s počtom NFT (r = 0,82; p = 0,0001).
Pre mozgy použité v tejto štúdii boli dostupné iba kvalitatívne dáta týkajúce sa prítomnosti alebo absencie amyloidovej angiopatie, takže nemohla byť uskutočnená podobná korelácia medzi väzbou CG a množstvom cerebrovaskulárneho amyloidu. Nezdá sa, že by prítomnosť amyloidovej angiopatie bola súčasnou premennou v korelácii medzi väzbou CG a počtom NP. Obr. 8A ukazuje zlepšenú koreláciu CG väzby s počtom NP v mozgoch bez amyloidovej angiopatie (r = 0,79; p = 0,01) v porovnaní s mozgami s depozitmi cerebrovaskulárneho amyloidu (r = 0,49; p = 0,15). Podobné zlepšenie nebolo zistené pre koreláciu s počtom NFT.
Ku pre väzbu [14C] chryzaniinu G na AD mozog je podobná ako Kn pre väzbu |t.| chryzamínu G na syntetický Αβ in vitiu, čo naznačuje, že vazba v mozgových homogenátoch môže tiež predstavovať interakciu s Αβ Korelácia väzby chryzamínu G s NFT môže naznačovať, žc chryzamín G sa tiež v mozgových homogenátoch viaže na tieto štruktúry Alternatívne, pretože počet NFT tesne koreluje s počtom NP, môže byť korelácia väzby [14C] chryzamínu G na NFT iba epifenoménom väzby chryzamínu G na NP.
Použiteľné tu uvedené deriváty alebo analógy chryzamínu G majú väzbové afinity, ktoré sú najmenej v rozmedzí 0,01 až 10,0 μΜ Kd, pri meraní pomocou väzby buď na syntetický Αβ peptid, alebo na mozgové tkanivo pri Alzheimerovej chorobe; zlúčeniny s vyššou afinitou, ktoré majú väzbové afinity v rozmedzí od 0,0001 do 0,01 μΜ, sú tiež použiteľné v spôsoboch podľa predkladaného vynálezu
Vzhľadom k vyššie uvedeným skutočnostiam nemusí byť väzba chryzamínu G špecifická pre Αβ. Miesto toho môže väzba chryzamínu G odrážať celkový obsah amyloidu v mozgu, ktorý sa skladá z agregovaných depozít Αβ v neuritických plakoch a cerebrovaskulárneho amyloidu Depozity fosforylovaného tau proteínu v NFT môžu tiež prispievať k väzbe chryzamínu G. Goedert, M. et al., PNAS 85: 4051 (1988). NFT sú tiež zložené z antiparalelných fibríl štruktúry beta-listu, ktoré majú kvarternú štruktúru podobnú vláknam Αβ. Kirschner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 503 (1986).
Celková a relatívna väzba chryzamínu G odlišuje AD mozog od normálneho mozgu
Väzbové testy in vitro, ako sú napríklad testy tu opísané, sú v odbore používané ako modely pre skríning zlúčenín pre in vivo väzbu a na predpovedanie úspešnosti v následných štúdiách in vivo zobrazenia. Viď Young, A. et al , Receptor Assays: In Vitro and In Vivo v POS1TRON EMISSION TOMOGRAPHY AND AUTORADIOGRAPHY (Phelps, M , Mazziota, J., a Schelbert, H , vyd ) str 73-111 (1986). Značený chryzamín G a deriváty chryzamínu G podľa predkladaného vynálezu môžu byť použité vo väzbových testoch in vitro, ktoré sú opisané vyššie a ďalej, na kvantifikáciu depozít amyloidu v bioptických alebo nekroptických vzorkách
Saturovateľná (špecifická) vazba [IJC] chryzamínu G boli pozorovaná ako pie homogenály AD mozgu, tak pre homogenáty kontrolného mozgu a tvorila 60 - 80% celkovej väzby v AD mozgu Nesaturovateľná vazba bola veľmi podobná v AD mozgu a kontrolnom mozgu Ako saturovateľná, tak celková väzba bola vyššie v AD mozgu než v kontrolnom mozgu. Aj napriek nižšej senzitivite získanej pri použití celkovej väzby je tento parameter viac prediktívny v úspechu v in vivo štúdiách, ktoré sú konečným cieľom predkladaného vynálezu Tiež pre rozšírenie na m vivo štúdie je výhodné, aby bola väzba chryzamínu G na kortikálne oblasti normalizovaná vzhľadom k oblastiam mozgu, v ktorých je väzba chryzamínu G veľmi podobná v AD aj kontrolnom mozgu Toto umožňuje vypustenie nutnosti počítať absolútne množstvo väzby, ktoré je in vivo ťažko uskutočniteľné. Vyšetrovali sme väzbu v mozočku ako potenciálnej kontrolnej oblasti, pretože klasické NP sa v tejto oblasti vyskytujú mimoriadne vzácne (Joachim et al., Am. J. Pathol. 135. 309 (1989)).
Priemerné množstvo väzby [ 14C] chryzamínu G na kontrolný mozoček je skoro rovnaké ako množstvo väzby na AD mozoček (tabuľka 2), čo podporuje použitie mozočku ako vnútornej kontroly. Preto mozočkový pomer (CBR) presne odráža absolútne množstvo naviazaného [l4C] chryzamínu G a má tú výhodu, že poskytuje vnútornú kontrolu pre každý mozog Väzba je vyššia v AD mozgu, či už je vyjadrená v absolútnych číslach vo fmol/gg proteínu (tabuľka 2), alebo ako pomer k väzbe na mozoček rovnakého mozgu (tabuľka 3). CBR je senzitívnejšie meranie a vykazuje medzi mozgami menšiu variabilitu. Použitie celkovej väzby <i CBR značne uľahčuje použitie týchto ex vivo výsledkov v in vivo štúdiách Preto sú výsledky uvedené ďalej vyjadrené v týchto hodnotách, kedykoľvek je to možné
Tabuľka 2. porovnanie celkovej väzby v AD a kontrolnom mozgu *
Oblasť mozgu kontrola (CBR) AD (CBR) P
Frontálny pol 0,S7 + 0 04 (n=6) 1,87 ± 0,25 (n-1 0) p < 0,004
Horná/stredná frontálna 0,73 ± 0,02 (n=R) 1,84 ± 0,18 (n= 1 1) p < 0,001
Horná temporálna 0,86 ± 0,08 (n=8) 1,63 ±0,17 (n=l 1) p < 0,002
Hlava kaudata 0,95 ± 0,04 (n=4) 1,76 ± 0,3 1 (n=7) p < 0,04
Dolná parietálna 0,90 ± 0,08 (n = 8) 1,93 ± 0,20 (n=l 1) p < 0,001
Okcipitálna 0,77 ±0.13 (n=8) 1,44 ± 0,20 (n=l 1) p < 0,02
* Kombinácia AD mozgov s nízkym a vysokým obsahom plakov
Tabuľka 3. porovnanie celkovej väzby v AD a kontrolnom mozgu ako pomer k väzbe na mozoček*
Oblasť mozgu kontrola (ťmol/pg proteínu) AD (fmol/pg proteínu) P
Mozoček 75 ± 13 (n=8) 73 ± 9 (n= 1 I) p = 0,91
Frontálny pól 58 ± 8 (n=6) 124 ± 16 (n= 1 0) p < 0,006
Horná/stredná frontálna 54 ± 10 (n=8) 130 ± 21 (n=l 1) p < 0,005
Horná temporálna 66 ± 17 (n=8) 121 ± 14 (n=l 1) p < 0,002
Hlava kaudata 73 ± 1 1 (n=4) 123 ± 22 (n=7) p < 0,14
Dolná parietálna 76 ± 13 (n=8) 137 ± 19 (n=11) p < 0,03
Okcipitálna 64 ± 16 (n=8) 95 ± 12 (n=l 1) P < 0,1 5
* CBR pre každý mozog sa ziska delením absolútnej hodnoty väzby [14C] chryzamínu G v tejto vzorke absolútnou hodnotou väzby [14C] chryzamínu G na vzorku mozočku rovnakého mozgu Hodnoty v tabuľke sú priemerné CBR z každej oblasti mozgu (1 SEM) Je uvedená kombinácia AD mozgov s nízkym a vysokým obsahom plakov
Obr 9A a 9B ukazujú väzbu |I4C] cluyzamínu G na šesť oblastí mozgu normalizovanú na väzbu na mozoček lovnakého mozgu Vazba chryzamínu G na oblasti AD mozgu majúce viac než 20 NP pri zväčšení 200x, t.j. na AD mozog s vysokým obsahom plakov, je uvedená na obr 9A Väzba chryzamínu G na oblasti AD mozgu majúce menej než 20 NP pri zväčšení 200x, t.j. na AD mozog s nízkym obsahom plakov, je uvedená na obr. 9B Vo všetkých oblastiach mozgu je väzba na AD mozog štatisticky významne vyššia než väzba na kontrolný mozog (viď tabuľka 3). V hornej/strednej kôre mozgovej neexistuje presah medzi kontrolou a akoukoľvek AD vzorkou. Vo všetkých mozgových oblastiach okrem okcipitálnej kôry mozgovej neexistuje presah medzi kontrolou a AD vzorkou majúcou viac než 20 NP pri zväčšení 200x. V mozgových oblastiach s najmenšou depozíciou klasických NP, ako je okcipitálna kôra mozgová (a mozoček), bol pozorovaný najväčší presah hodnôt pre AD a kontrolu.
Obr. 9C ukazuje dáta od pacientov s Downovým syndrómom U všetkých pacientov s Downovým syndrómom vznikajú v štvrtej dekáde veku depozity Αβ a u mnohých z nich dochádza k rozvoju AD. Wisniewsky et al., Neurology 35’ 957 (1985); Schapiro et al., Neurobiol. Aging 13: 723 (1992). U oboch týchto pacientov bola väzba [14C] chryzamínu G vyššia ako u kontrol. Pretože mladší pacient (veku 23 rokov) mal depozity amyloidu, ale nebol klinicky dementný, tak obr. 9C naznačuje, že chryzamín G môže detegovať odlišnosti od kontrol u nedementných pacientov, u ktorých sa neskôr rozvinie AD, dlho pred tým, než sú klinicky jasné príznaky demencie.
Zlúčeniny a spôsoby podľa predkladaného vynálezu poskytujú dve použiteľné merania na rozlíšenie AD mozgu od normálneho mozgu: (1) celkovú väzbu chryzamínu G (tabuľka 2), alebo (2) pomer väzby chryzamínu G v danej oblasti mozgu k väzbe chryzamínu G na mozoček rovnakého mozgu (tabuľka 3) Tieto merania majú dve hlavné výhody pre in vivo kvantifikáciu AD neuritických plakov Po prvé, tým, že je poskytnutý prostriedok na meranie celkovej väzby na Αβ, skôr než na meranie špecifickej väzby na Αβ, môže byť spôsobom podľa predkladaného vynálezu uskutočnená kvantifikácia depozít Αβ bez nutnosti vystavenia subjektu druhej injekcii rádioaktívneho materiálu na meranie nešpecifickej väzby. Vzhľadom na to sú dáta vyjadrené iba ako celková väzba Vo všet64 kých uskutočnených pokusoch boli dáta špecifickej väzby pre AD a kontrolný mozog ešte viac odlišné.
Po druhé, rozdiely vo vychytávaní derivátov chryzamínu G v mozgu budú ovplyvňovať absolútnu koncentráciu chryzamínu G v mozgu. Budú preto nutné určité mechanizmy na započítanie takých variácií medzi jedincami Každý pacient môže byť svojou vlastnou kontrolou, pokiaľ sa nájde oblasť mozgu, ktorá má málo depozít Αβ (t.j. pokusná čistá oblasť). Pretože sa klasické NP mimoriadne vzácne nachádzajú v mozočku (Joachim et al., Am. J. Pathol. 135. 309 (1989)), bola väzba chryzamínu G na mozoček použitá ako kontrola pre každý študovaný mozog. Výsledky boli vyjadrené ako pomer väzby chryzamínu G v danej oblasti mozgu k väzbe chryzamínu G na mozoček rovnakého mozgu (obr. 9 a tabuľka 3).
Pre in vivo kvantifikáciu amyloidu pri AD je treba brať do úvahy vplyv mozgovej atrofie. Preto musí byť pri použití chryzamínu G a derivátov chryzamínu G ako sond pre in vivo kvantifikáciu amyloidu mozgová atrofia korigovaná podľa merania objemu uskutočneného MRI. Merania objemu pomocou MRI uskutočnené v spôsoboch podľa predkladaného vynálezu sú analogické k bežným vyšetreniam. Viď Pearlson, G. and Marsh, L., MAGNETIC RESONANCE IMAGING IN PSYCHIATRY v Annual Review of Psychiatry (zväzok 12), Oldham, J. et al., vyd., str. 347-381 (1993). Preto bude spôsob na určenie celkovej rádioaktivity na objem mozgu využívať nasledujúcu rovnicu:
celkový SPECT alebo PET signál z oblasti mozgu A objem mozgu určený MRI (s vylúčením CSF) v oblasti mozgu A
Pri označení tohto merania ako signál/objem pre mozgovú oblasť A alebo S/VA môže byť mozočkový pomer vyjadrený ako:
S/Va
Pomer A = S/VcB kde S/Vti, je signál/objem v mozočku rovnakého jedinca počas rovnakého zobrazovacieho vyšetrenia Tento pomer z akejkoľvek mozgovej oblasti inej ako mozoček, od pacienta, u ktorého je podozrenie na AD alebo iný patologický stav charakterizovaný depozitmi amyloidu môže byť porovnávaný s normálnymi hodnotami analogického pomeru pre rovnaké oblasti mozgu v skupine normálnych kontrolných subjektov zodpovedajúceho veku Pomer väzby na oblasti s najväčším množstvom depozít neuritickýcb plakov k väzbe na mozoček môže byť použitý ako parameter na odlíšenie pacientov s Alzheimerovou chorobou od kontrolných pacientov
Príklad 4' Koeficienty delenia medzi oktanol-vodu pre chryzamín G, deriváty chryzamínu G a kongo červeň
Koeficient delenia medzi oktanol-vodu meria relatívnu lipofilnosť zlúčeniny U zlúčenín s vyššou lipofilnosťou je pravdepodobné, že budú lepšie prekonávať hematoencefalickú bariéru. Viď Goodman and Gilman’s THE PHARMACOLOGICAL BAS1S FOR THERAPEUTICS (7. vydanie). Koeficient delenia medzi oktanol-vodu je pre chryzamín G 60,22 ± 3,97 a pre kongo červeň je 0,665 ± 0,037 (p < 0,001) Toto ukazuje, že chryzamín G je približne 90-krát lipofilnejší než kongo červeň a preto je teoreticky pravdepodobnejšie, že bude prekonávať hematoencefalickú bariéru. Koeficient delenia medzi oktanol-vodu je pre 3-jóda 3,3'-dijód- deriváty chryzamínu G (obr 1) 72,53 ± 0,74 a 1 12,9 ± 7,3, v príslušnom poradí Tieto koeficienty delenia medzi oktanol-vodu ukazujú, že tieto deriváty, ktoré sú nerádioaktívnymi analógmi niektorých rádioaktívne značených derivátov chryzamínu G použitých pre in vivo štúdie, sú až I 70-krát I i po fi 1 nej šie než kongo červeň a až dvakrát IipoťiInejšie než chryzamín G Tieto koeficienty naznačujú, že tieto deriváty budú vstupovať do mozgu lepšie než kongo červeň a tiež lepšie než chryzamín G
Príklad 5 Schopnosť chryzamínu G a derivátov chryzamínu (i prekonávať hematoencelalickú bariéru a metabolizmus chryzamínu G
Použitie sond pre amyloid na diagnostiku AD in vivo vyžaduje, aby boli tieto sondy schopné prekonávať hematoencefalickú bariéru a aby sa dostali do kontaktu s depozitmi amyloidu.
Schopnosť chryzamínu G prekonávať hematoencefalickú bariéru bola študovaná na S wiss-Webster myšiach Po i.v injekcii bol pomer mozog/krv meraný v 15 minúte vyšší než 101 a v 35 minúte dosiahol 20.1 (obr 10). Rádioaktivita v mozgu zostávala počas tohto obdobia relatívne konštantná, ale znižovala sa v krvi a zvyšovala sa v pečeni Pomer mozog/obličky bol najvyšší v 15 minúte (počas vyšetrovanej doby) a dosiahol hodnotu 0,5. Pri extrakcii mozgu a pečene v 60 minúte po i.v. injekcii [14C]chryzamínu G bolo >95% spätne získanej rádioaktivity eluované súčasne s chryzamínom G pri HPLC s reverznou fázou, čo ukazuje, že nedošlo počas tohto obdobia k žiadnemu významnému metabolizmu chryzamínu G
Chryzamín G sa dostáva do mozgu normálnych myši a pomer mozog/krv je vysoký. Rádioaktivita v mozgu zostáva relatívne konštantná počas prvých 30 minút, zatiaľ čo v krvi sa znižuje a v pečeni sa zvyšuje. Tieto dáta naznačujú, že vysoký pomer mozog/krv je skôr dôsledkom účinného odstraňovania chryzamínu G z krvi pečeňou, než ďalšej akumulácie v mozgu. Bolo zistené, že v 60 minúte je v podstate všetka rádioaktivita zistená v mozgu a pečeni nezmenený chryzamin G Kongo červeň neprekonáva hematoencefalickú bariéru dobre. Tubis et al , J Ainer. Pharm Assn 49 422 (1960) Vačšina kongo červene je vychytávaná v pečeni a slezine a pomer mozog/obličky zistený u morčiat je približne 0,07. Tubis et al., vyššie. Chryzamín G je tiež vychytávaný v pečeni, ale viac prechádza do mozgu.
Testy na zvieratách in vivo sú ďalším základom na určenie dávky, účinnosti prechodu cez hematoencefalickú bariéru a väzbovej schopnosti Pre tento účel jc predovšetkým výhodný model transgénnej myši, ktorý opísal Games et al , Náture 373: 532-527 (1995) alebo Hsiao et al . Science 274 99-102 (1996) a senilný zvierací model pre mozgovú amyloidózu, t j. zvieratá ako sú transgénne myši alebo psi alebo opice vysokého veku, o ktorých je známe, že u nich dochádza k vzniku rôzneho počtu mozgových neuritických plakov Alzheimerov67 ho typu, viď Wisniewsky et al , .1 Ncuropatol and Exp. Neurol 32 566 (1973), Selkoe et al , Science 235. S7í (lllS7, sú testované na väzbu a účinnosť detekcie Tento in vivo test vyžaduje kontrolné bioptické alebo nekroptické sledovanie na potvrdenie a kvantifikáciu piítomnosti amyloidových depozít
Iné vhodné zvieracie modely na použitie v testovaní spôsobov a zlúčenín podľa predkladaného vynálezu sú vytvorené transgénnou technikou Napríklad, Quon et al.. Náture 352’ 239-24 1 (1991) použil inhibičnú doménu promótora krysej neurón-špecifickej enolázy na prípravu transgénnych myší. Viď tiež Wirak et al., Science 253' 323-325 (1991) Ešte iné modely boli pripravené intrakraniálnym podaním β/Α4 peptidu piiamo zvieratám (Tate et al., Bull. Clin Neurosci. 56. 131-139 (1991).
Je treba si uvedomiť, že žiadny z in vivo zvieracích modelov nemôže byť považovaný za mimoriadne dobrý model pre AD neuropatológiu. Namiesto toho tieto modely viac zodpovedajú ukladaniu amyloidu počas normálneho starnutia Toto platí predovšetkým pre modely cicavcov vysokého veku. Všetky tieto modely vykazujú prevahu difúznych plakov, ako bola opísaná vyššie pre model starých psov. Zatiaľ čo v týchto modeloch existuje nejaký cerebrovaskulárny amyloid, je v nich iba malé množstvo neuritických plakov, s výnimkou modelu transgénnych myší (Games et al., a Hsiao et al.). Iné modely transgénnych myši často obsahujú iba difúzne plaky. Preto, aj keď môžu byť tieto modely užitočné pre štúdium distribúcie sond v mozgu, je tu iba malá pravdepodobnosť, že budú vykazovať rovnaké kvantitatívne odlišnosti, aké sú predpokladané pre AD mozgy na základe in vitro štúdií väzby cluyzamínu G na AD mozgy, ktoré boli uvedené vyššie
Hodnotenie schopnosti alkyloxých, alkenylových alebo a I k i ny I o vých derivátov chryzaminu G prekonávať hcniÍitoencefalickú bariéru u človeka
Vhodne rádioaktívne značený derivát chryzaminu G so špecifickou aktivitou približne 500 Ci/mol alebo vyššou je injikovaný intravenózne v dávke približne 10 mCi normálnym jedincom ;i jedincom so suspektnou AD a je uskutoč68 nené sledovanie pomocou SPECT alebo PET zobrazenia na analyzovanie detegovateľnosti derivátu v mozgu v porovnaní s inými orgánmi a na definovanie časového priebehu detegovateľnosti v mozgu. Dávka, ktorá môže byť spoľahlivo detegovaná, je označená ako zobrazovacia účinná dávka.
Hodnotenie alkylových, alkenylových a alkinylových derivátov chryzamínu G v rozlíšení AD a kontrol zodpovedajúcich veku u človeka
Zobrazovacia účinná dávka vhodne rádioaktívne značeného derivátu chryzamínu G je injekčné podaná jedincovi, u ktorého sa predpokladajú depozity amyloidu v mozgu spôsobené patologickým stavom ako je AD. Po dobe 15 minút až 24 hodín je detegovaný rádioaktívny signál z mozgu pomocou PET alebo SPECT. Rádioaktivita je simultánne detegovaná vo všetkých oblastiach mozgu pokrytých detektorom. Táto plocha bude nastavená tak, aby pokrývala väčšinu mozočku, hornej temporálnej kôry mozgovej, strednej/hornej frontálnej kôry mozgovej, a vmedzerených oblasti mozgu. Pred štúdiou je uskutočnené MRI vyšetrenie, takže môže byť vo vybraných oblastiach uskutočnená korekcia pre mozgovú atrofiu, spôsobom uvedeným v príklade 3. Vypočítajú sa premenné S/VA, S/Vcb a PomerA (viď príklad 3) a porovnajú sa s analogickými normatívnymi pomermi získanými predtým od normálnych kontrolných jedincov zodpovedajúceho veku.
Príklad 6: Histologická lokalizácia väzby alkenylového derivátu chryzamínu G na amyloid
Horná časť obr. 11 ukazuje ľudský AD mozog farbený 1,4-bis(2-(3karboxy-4-hydroxyfenyl)eten-1-yl)benzénom Metóda farbenia bola metóda podľa Stokes and Trickey, J. Clin. Pathol. 36. 241-242 (1973), so substitúciou 1,4bis(2-(3-karboxy-4-hydroxyfenyl)eten-1-yl)benzénu za kongo červeň. Toto farbenie je oveľa intenzívnejšie ako farbenie chryzamínom G, kongo červeňou alebo tioflavínom S Ľahko môže byť identifikované množstvo amyloidových plakov a
Μ iiuui ofilných vlákien, rovnako ako neu roťi b ri I á r na sieť. Dolné fotografie na obr. I I ukazujú rez mozgom transgénnej myši (Tg( Hu APP695.SWE) 2576, Hsiao et al , Science, 274 99-102 (1996)) farbený 1,4-bis(2-(3-karboxy-4liydi oxyfenyl)eten-1-yl)-benzénom Denzné amyloidové plaky sú intenzívne sfarbené Cerebrovaskulárny amyloid sa tiež intenzívne farbí ako v myšom, tak v ľudskom mozgu (dáta nie sú uvedené)
Príklad 7. Hodnotenie toxicity alkylových, alkenylových a alkinylových derivátov chryzamínu G
Pri dávkach 10 a 100 mg/kg nerádioaktivneho chryzamínu G podaných intraperitoneálne neboli u myší počas 72 hodín pozorované žiadne zmeny chovania ani toxicita. Dávky [l4C]chryzamínu G boli v rádoch 1 mg/kg.
Zdá sa, že chryzamín G má malú akútnu toxicitu, podľa pokusov uskutočnených na stanovenie LDsn. Aj pri maximálnom objeme, ktorý môže byť myšiam injikovaný bez škodlivých účinkov samotného objemu (približne 0,025 ml/g), nasýteného roztoku chryzamínu G injikovaného myšiam (100 mg/kg) neboli počas 72 hodín (najdlhšie testované obdobie) pozorované zmeny chovania Dávky nutné na detekciu rádioaktívne značených derivátov pomocou SPECT alebo PET budú o rád nižšie než tieto dávky
Kongo červeň môže byť bezpečne injikovaná človeku v dávkach oveľa vyšších, ako sú dávky použité pre rádioaktívne značené deriváty chryzamínu G. LD5„ pre kongo červeň bola pre myši stanovená na 190 mg/kg (Tubis et al., J. Amer Pharm. Assoc. 49: 422 (1960)), čo je podobné ako LD50 >100 mg/kg, ktorá bola stanovená pre chryzamín G Preto majú tieto dve chemicky podobné zlúčeniny podobne nízku toxicitu u myší
Iné alkylové, alkenylové alebo alkinylové deriváty chryzamínu G môžu byť podobne testované na toxicitu u myši a iných cicavcov pomocou injekcie rôznych koncentrácii a sledovania rôznvch známok toxicity u zvierat, s použitím dobre známych techník. Viď Goodman and Gilman’s THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICS (7. vydanie)
Príklad 8· Hodrrotenie schopnosti chryzamínu G chrániť pred toxicitou spôsobenou Λβ(25-3 5)
Chránenie PC-1 2 buniek pred toxicitou indukovanou Αβ(25-35)
Bunky krysieho feochromocytómu (PC-12) boli kultivované v RPMI 1640 médiu s 10% fetálnym hovädzím sérom. Približne 5000 exponenciálne rastúcich buniek bolo umiestnených v 96-jamkových platniach v objeme 100 μΙ média a uskutočnila sa inkubácia pri 37 C cez noc. Αβ(25-35), ktorý bol vopred agregovaný pri 37 °C počas 7 dní, bol pre-inkubovaný s chryzamínom G (CG) alebo príbuznou zlúčeninou vo vodnom roztoku pred pridaním 20 μΐ na dosiahnutie uvedených konečných koncentrácií (0,0 1 - 10 μΜ Αβ(25-35) a 0,03 - 20 μΜ CG). Bunky boli inkubované počas 24 hodín pred pridaním 13,3 μΐ 5 mg/ml MTT (3,(4,5-dimetyltiazol-2-yl)2,5-difenyltetrazóliumbromid) v sterilnom fosfátom pufrovanom salinickom roztoku Po 4,5 hodinách pri 37 °C sa pridalo 100 μΐ extrakčného pufra (20% hmotn./obj SDS v 50% DMF/vode, pH upravené na 4,7 pomocou 2,5% 80% kyseliny octovej a 2,5% IN HCI) a platne sa inkubovali cez noc Hansen et al., J. Immunol. Methods I 19- 203 (1989) Vývoj farby bol meraný pri 560 nm Maximálna životaschopnosť bola definovaná ako absorbancia kontrolných jamiek, do ktorých bolo pridané iba 20 μΙ destilovanej, deionizovanej H,O Maximálna toxicita bola definovaná jamkami, v ktorých boli bunky lýzované pridaním 0,1% (konečná konentrácia) Triton-X-1 00.
Inkubácia PC 12 buniek s Αβ(25-35) viedla ku zníženiu schopnosti týchto buniek redukovať MTT, ktoré bolo závislé od koncentrácie (obr. 12). Obr 12 ukazuje vplyv zvyšujúcich sa koncentrácií Αβ(25-35) za prítomnosti alebo neprítomnosti chryzamínu G na bunkovú redukčnú aktivitu PC 12 buniek, ako je meraná redukciou MTT Absorpcia produktu redukcie MTT pri 560 nm je uvedená v giafc na zvislej osi Vplyv Αβ(25-35) samotného je ukázaný v plných stĺpcoch a ukazuie zníženie redukcie MTT závislé od dávky Štatisticky významné rozdiely od kontrol (bez Αβ, bez chryzaminu G) sú ukázané číslami v plných stĺpcoch ľroteklivny vplyv 20 μΜ chryzaminu (i je ukázaný v piázdnycb stĺpcoch Signifikantné rozdiely medzi MTT redukciou za prítomnosti a za absencie chryzaminu G su uvedené číslami v prázdnych stĺpcoch.
Obr 13 ukazuje protektívny vplyv zvyšujúcej sa koncentrácie chryzaminu G na Αβ(25-35)-indukovanú bunkovú redukčnú aktivitu PC-12 buniek. Vplyv chryzaminu G za absencie Αβ(25-35) je uvedený v šrafovaných stĺpcoch. Neboli pozorované signifikantné rozdiely medzi kontrolou (bez Αβ(25-35), bez chryzamínu G) a akýmikoľvek koncentráciami chryzaminu G za absencie Αβ(25-35). Redukcia MTT za prítomnosti I pM Αβ(25-35) a zvyšujúcich sa koncentrácií chryzaminu G je uvedená v prázdnych stĺpcoch. Signifikantné rozdiely medzi MTT redukciou za prítomnosti a za absencie Αβ(25-35) pri každej koncentrácii chryzaminu G sú uvedené číslami v šrafovaných stĺpcoch Signifikantné rozdiely medzi MTT redukciou medzi Αβ(25-35) kontrolou (bez chryzaminu G) a Αβ(2535) plus zvyšujúce sa koncentrácie chryzaminu G sú uvedené číslami v prázdnych stĺpcoch
Ako bolo opísané skôr, kongo červeň chráni pred toxicitou indukovanou Αβ pri koncentráciách vyšších než 2 pM, s dosiahnutím kompletnej ochrany pri 20 μΜ Burgevin et al , NeuroReport 5: 2429 (1994); Lorenzo and Yankner, Proc. Natl. Acad Sci. 9Γ 12243 (1994); Pollack et al., Neuroscience Letters 184’ 1 13 (1995); Pollack et al., Neuroscience Letters 197' 21 1 (1995). Chryzamín G má protektívny účinok, ktorý je závislý ako na koncentrácii Αβ(25-35) (obr. 12), tak na koncentrácii chryzaminu G (obr. 13). Protektívny účinok chryzaminu G je zreteľný pri 0,2 pM, čo je koncentrácia veľmi blízka Ki chryzaminu (i pre väzbu na syntetický Αβ, 0,37 pM (obr. I) Chryzamín G sa zdá byť účinnejší než kongo červeň a vykazuje účinnosť v rozmedzí od 0,1 do 1,0 pM Toto zodpovedá hodnotám Ki pre väzbu na syntetický Αβ, ktoré sú 0,37 pM pre chryzamín G a 2,8 pM pre kongo červeň (obr I)
V inom pokuse (obr. 14) bol hodnotený vplyv chryzamínu G a fenolového derivátu (viď obr. 1), ktorý sa neviaže na Αβ, na bunky inkubované s 1 μΜ Αβ(25-35). Chryzamín G vykazoval protektívne účinky pri 0,1 a 1 μΜ, ale fenolový derivát nevykazoval žiadne protektívne účinky a snáď zvyšoval toxicitu Αβ
Tieto výsledky naznačujú, že lipofilný derivát kongo červene, chryzamín G, bráni cytotoxicite indukovanej Αβ v bunkovej kultúre v koncentráciách veľmi podobných koncentráciám, pri ktorých sa viaže na Αβ Táto ochrana vykazuje štrukturálnu špecificitu, pretože fenolový derivát, ktorý sa neviaže na syntetický Αβ, tiež nebráni cytotoxicite indukovanej Αβ. Pretože chryzamín G preniká dobre do mozgu, sú tieto výsledky dôkazom, že chryzamín G a deriváty chryzamínu G viažuce sa na Αβ majú terapeutický potenciál pri liečbe AD.
Mechanizmus ochranného účinku chryzamínu G je doposiaľ neznámy. Existujú dve všeobecné možnosti. Po prvé môže chryzamín G interferovať s agregáciou Αβ. Po druhé môže chryzamín G interferovať s účinkami (priamymi alebo nepriamymi) Αβ na cieľové bunky. Kongo červeň neinhibuje agregáciu AB, rovnako ako nebráni toxickým účinkom agregovaného Αβ. Lorenzo and Yankner, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 12243 (1994). Interferencia s agregáciou je vo vyššie uvedenom pokuse nepravdepodobná, pretože Αβ bol pre-agregovaný pred inkubáciou s chryzamínom G. Preto môže byť inhibícia agregácie preukázaná ako významný terapeutický účinok chryzamínu G, ale nie je pravdepodobné, že by vysvetľovala ochranné účinky chryzamínu G pred pre-agregovaným Αβ. Model väzby chryzamínu G na Αβ opísaný na obr. 7 ukazuje, ako môže chryzamín G potiahnuť povrch Αβ. Toto môže zmeniť rozpoznávanie fibrilárnych depozít receptormi bunkového povrchu a inými makromolekulami, ako sú proteíny komplementu, a interferovať s toxickými vplyvmi Αβ, ktoré môžu byť sprostredkované týmito makromolekulami. Je pravdepodobné, že chryzamín G a kongo červeň majú mnohopočetné účinky, ako pred, tak po agregácii Αβ. Toto je výhodné z terapeutického hľadiska, pretože je pravdepodobné, že pacienti budú v období, keď sa u nich budú vytvárať Αβ agregáty, rovnako tak ako budú mať depozity amyloidu

Claims (21)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Zlúčenina, ktorá sa viaže na amyloid, majúca vzorec I, alebo jej netoxická soľ rozpustná vo vode fV každý Ri a R2 je nezávisle vybraný zo skupiny zahrnujúcej H, F, Cl, Br, I, nižší alkyl, (CH2)nOR’, kde n = 1, 2 alebo 3, CF3) CH2-CH2F, O-CH2-CH2F, CH2-CH2-CH2F, O-CH2-CH2-CH2F, CN, (C=O)-R’, N(R’)2, NO2, (C=O)N(R’)2, O(CO)R’, OR’, SR’, COOR’, Rph, CR’=CR’-Rph, CR’2- CR’2Rph, kde Rpi, predstavuje nesubstituovanú alebo substituovanú fenylovú skupinu, v ktorej sú substituenty vybrané z ktoréhokoľvek z nefenylových substituentov definovaných pre Ri a R2, trialkylcín, tetrazol a oxadiazol vzorca kde R’ je H alebo nižší alkyl, alebo triazén vzorca
    R»
    I kde Rg a R9 sú nižší alkyl, alebo
    O /N^ZN kde ? J je vybraný zo skupiny zahrnujúcej CR’2-CR’2, C=C-C=C, CR’=CR CR’=CR’, C=C-CR’=CR’ a CR’z-CR’z-CR’z-CR’í, kde každý R’ je nezávisle H alebo nižší alkyl, ak je mostíková skupina vybraná zo súboru zahrnujúceho:
    alebo kde
    Z’“' z
    z £ je vybraný zo skupiny zahrnujúcej C=C a CR’=CR’, kde každé R’ nezávisle predstavuje H alebo nižší alkyl, ak je mostíková skupina vybraná zo súboru zahrnujúceho
    Q— ZC2—Q k Ra alebo kde je vybraný zo skupiny zahrnujúcej C^C a CR’=CR’, kde každé R’ nezávisle predstavuje H alebo nižší alkyl, ak je mostíková skupina vybraná zo súboru zahrnujúceho:
    iba ak je aspoň jedno z ďalej definovaných R1-R39 vybrané zo skupiny zahrnujúcej (CH2)„OR’, kde n = 1, 2 alebo 3, Rph, CR’=CR’-RP,„ CR’2-CR’2-Rph, kde Rph predstavuje substituovanú alebo nesubstituovanú fenylovú skupinu so substituentami vybranými z ktoréhokoľvek z nefenylových substituentov definovaných pre Ri a R2, alebo ak neobsahuje ďalej definovaný Q funkčnú skupinu karboxylovej kyseliny alebo typu kyseliny, ako je hydroxy, tetrazol, oxadiazol alebo NO2, kde X je C(R”)2, kde každý R” je nezávisle H, F, Cl, Br, I, nižší alkyl, (CH2)„0R’, kde n = 1, 2 alebo 3, CF3, CH2-CH2F, O-CH2-CH2F, CH2-CH2-CH2F, O-CH2CH2-CH2F, CN, (C=O)-R’, N(R’)2, NOz, (C=O)N(R’)2, O(CO)R’, OR’, SR’, COOR’, RPh, CR’=CR’-RPh, CR’2- CR’2-Rph, kde Rph predstavuje nesubstituovanú alebo substituovanú fenylovú skupinu, v ktorej sú substituenty vybrané z ktoréhokoľvek z nefenylových substituentov definovaných pre R”, tetrazol alebo oxadiazol vzorca:
    alebo .0 kde R’ je H alebo nižší alkyl, alebo X je CR’=CR’, N=N, C=0, O, NR’, kde R’ je H alebo nižší alkyl, S alebo SO2;
    každý Q je nezávisle vybraný z jednej z nasledujúcich štruktúr:
    ΙΑ, IB, IC, ID, IE, IF a IG, kde:
    kde každý z R3, R4, R5, Re alebo R7 je nezávisle definovaný rovnako ako vyššie uvedený Ri s tou výnimkou, že ak je mostíková skupina.
    a Z. O 2 je CH2-CH2, potom aspoň jeden z R1-R4 alebo R6-R7 nie je H, alebo ak je mostíková skupina:
    a z^-/z je CH=CH, potom R3 nie je CN, R5 nie je CH3 a aspoň jeden z Ri alebo R2 nie je H alebo CH3, pokiaľ:
    aspoň jeden z R1-R7 nie je N(R’)2 (kde R’ predstavuje H alebo nižší alkyl), s podmienkou, že R5 nie je N(CH3)2 alebo N(CH2CH3)2, ak R1-R4, Re a R7 sú všetky H a s podmienkou, že R5 nie je N(CH3)2, ak R3 je CH3, OCH3 alebo COOCH3 a Ri, R2, R4, Re, R7 sú všetky H, alebo ak je mostíková skupina:
    o— r2 a je CH2-CH2, potom aspoň jeden z R1-R4, Rď alebo R7 nie je H, ak je Rs H, COOC2H5 alebo CH20H;
    alebo ak je mostíková skupina a je CH-CH, potom aspoň jeden z R4 alebo Re nie je H, CH3 alebo
    CN;
    alebo ak je mostíková skupina a ZQZ je CH=CH, potom aspoň jeden z R1-R4, Re alebo R7 nie je H, ak R5 je COOH alebo COOCH3;
    alebo ak je mostíková skupina
    Rz B-2 a ζζ^Ζ je CH=CH, potom aspoň jeden z R1-R4, Re alebo R7 nie je H, ak oba R5 sú N(CH3)2;
    alebo ak je mostíková skupina a zQz je CH=CH, potom aspoň jeden z R2 nie je H alebo Cl, pokiaľ aspoň jeden z R2-R7 nie je N(R’)2 (kde R’ predstavuje H alebo nižší alkyl), s podmienkou, že Rs nie je N(CH3)2 a R2, R3, R4, Re a R7 sú všetky H a s podmienkou, že Rs nie je N(CH3)2, ak R3 je CH3 a zvyšné R sú H;
    alebo ak je CH=CH a presne dva R2 sú OCH3, potom žiadny z Rs nie je H, CH3 alebo COOR’ (kde R’ predstavuje H alebo nižší alkyl);
    alebo ak je CH=CH, žiadny Rs nie je OCH3,
    R2 je CH3 a
    R4 alebo Re je CONH2, potom
    IB má nasledujúcu štruktúru:
    kde každý z Rio, Rn, R12, R13, R14, Ru alebo Rie je nezávisle definovaný rovnako ako vyššie uvedený Ri s výnimkou, že ak je mostíková skupina:
    a ZQz nie je H;
    je CH=CH a R2 je CH3, potom aspoň jeden z Ri alebo R3-Ri6 kde každý z R17, R|g, R19, R2o alebo R2J je nezávisle definovaný rovnako ako vyššie uvedený Rj;
    ID má nasledujúcu štruktúru kde každý z R22, R2' alebo R24 je nezávisle definovaný rovnako ako vyššie u vedený R| a \ 7 predstavuje heterocyklický kruh jedného z nasledujúcich šiestich vzorcov:
    KO*
    W °=x >=° ' 8-B
    c=c tr
    I Γ. má nasledujúcu štruktúru (IE) Rjjj alebo kde každý z R25, R26 alebo R27 je nezávisle definovaný rovnako ako vyššie uvedený R| a predstavuje heterocyklický kruh jedného z nasledujúcich šiestich vzorcov
    HC \ / C=sC
    ΛΚ « - M v/ \ »ô-° Λχ
    W
    U
    IF má nasledujúcu štruktúru.
    UF) kde presne jeden z R2g, R29, R30, R31 alebo R32 je z^ z väzba definovaná pre vyššie uvedený vzorec I a každý ďalší z R2g, R29. R30, R31 alebo R32 je nezávisle definovaný rovnako ako vyššie uvedený Ri,
    IG má nasledujúcu štruktúru;
    kde presne jeden z R33, R34, R35, R36, R37, R38 alebo R39 je väzba definovaná pre vyššie uvedený vzorec I a každý ďalší z R33, R34, R35, R36, R37, R38 alebo R39 je nezávisle definovaný rovnako ako vyššie uvedený Ri.
  2. 2. Zlúčenina podľa nároku 1, v ktorej je aspoň jeden zo substituentov Ri-R7 a Rio-R39 vybraný zo skupiny skladajúcej sa zo 131I, 123I, 76Br, 75Br, 18F, l25I, CH2-CH2-18F, o-ch2-ch2-18f, ch2-ch2-ch2-18f, o-ch2-ch2-ch2-18f, 19f, 125I a uhlíkatého substituenta definovaného pre vzorec I, kde aspoň jeden uhlík je 1 *C alebo 13C.
  3. 3. Zlúčenina podľa nároku 1, ktorá sa viaže na Αβ s disociačnou konštantou (Kd) medzi 0,0001 a 10,0 μΜ, pri meraní väzby na syntetický Αβ peptid alebo väzby na mozgové tkanivo pri Alzheimerovej chorobe
  4. 4. Spôsob syntézy zlúčeniny podľa nároku 1, v ktorej je aspoň jeden zo substituentov Ri-R7 a Rio-R39 vybraný zo skupiny skladajúcej sa zo I31l, l25I, 12jI, 76Br, 7SBr, l8F a 19F, vyznačujúci sa tým, že obsahuje stupeň značenia zlúčeniny podľa nároku 1, v ktorej je aspoň jeden zo substituentov R|-R7 a R|0R39 trialkylcín alebo triazén, reakciou zlúčeniny podľa nároku 1 s látkou obsahujúcou 13Ί, Ι25Ι, 1231, 76Βγ, 75Br, l8F alebo ,9F
  5. 5. Farmaceutický prostriedok na in vivo zobrazenie depozít amyloidu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje (a) zlúčeninu podľa nároku 2 a (b) farmaceutický prijateľný nosič.
  6. 6. Spôsob in vivo detekcie depozít amyloidu u jedinca, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kroky:
    (a) podanie detegovateľného množstva farmaceutického prostriedku podľa nároku 5, a (b) detekciu väzby uvedenej zlúčeniny na depozity amyloidu u uvedeného jedinca.
  7. 7. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že uvedené depozity amyloidu sú umiestnené v mozgu jedinca.
  8. 8. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že u uvedeného jedinca existuje podozrenie na ochorenie alebo syndróm vybraný zo skupiny skladajúcej sa z Alzheimerovej choroby, familiárnej Alzheimerovej choroby, Downovho syndrómu a homozygotnosti pre alelu apolipoproteínu E4.
  9. 9 Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že uvedená detekčná technika je vybraná zo skupiny zahrnujúcej gama zobrazenie, magnetickú rezonanciu a magnetickú rezonančnú spektroskopiu.
  10. 10. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že uvedenou gama zobrazovacou technikou je PET alebo SPECT
    I I Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že uvedený farmaceutický prostriedok je podaný intravenóznou injekciou
  11. 12 Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že pomer (i) väzby uvedenej zlúčeniny na oblasť mozgu inú než mozoček k (ii) väzbe uvedenej zlúčeniny na mozoček je porovnávaný s uvedeným pomerom pre normálnych jedincov
    Spôsob inhibicie degenerácie buniek a toxicity spojenej s tvorbou fibríl pri stavoch spojených s amyloidózou, vyznačujúci sa tým, že obsahuje krok podania farmaceutický účinného množstva chryzamínu G alebo jeho derivátu jedincovi, ktorý má také ochorenie, alebo u ktorého je podozrenie na také ochorenie
  12. 14 Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že uvedený derivát chryzamínu G je zlúčenina viažuca sa na amyloid vzorca I alebo jej netoxická soľ rozpustná vo vode:
    *3 kde každý Rj a R2 je nezávisle vybraný zo skupiny zahrnujúcej H, F, Cl, Br, I, nižší alkyl, (CH2)„OR’, kde n = 1,2 alebo 3, CF3, CH2-CH2F, O-CH2-CH2F, CH2-CH2-CH2F, O-CH2-CH2-CH2F, CN, (C=O)-R’, N(R’)2, no2, (C=O)N(R’)2, O(CO)R’, OR’, SR’, COOR’, Rph, CR’=CR’-Rph, CR’2- CR’2RPh, kde Rph predstavuje nesubstituovanú alebo substituovanú fenylovú skupinu, v ktorej sú substituenty vybrané z ktoréhokoľvek z nefenylových substituentov definovaných pre Ri a R2, trialkyleín, tetrazol a oxadiazol vzorca.
    kde R’ je H alebo nižší alkyl, alebo triazén vzorca:
    R« /V kde Rg a R9 sú nižší alkyl, alebo kde x-'-S t
    je vybraný zo skupiny zahrnujúcej CR’2-CR’2, C-C-C^C, CR’=CR’-CR’=CR’, C=C-CR’=CR’ a CR’2-CR’2-CR’2-CR’2, kde každý R’ je nezávisle H alebo nižší alkyl, ak je mostíková skupina vybraná zo súboru zahrnujúceho- zQzt-q
    Rj R2 alebo kde ? ,z je vybraný zo skupinv zahrnujúcej C=C. a CR’=CR’, kde každé R’ nezávisle predstavuje H alebo nižší alkyl, ak je mostíková skupina vybraná zo súboru zahrnujúceho.
    /'n Ŕj Rí alebo kde z Z je vybraný zo skupiny zahrnujúcej C=C a CR’=CR’, kde každé R’ nezávisle predstavuje H alebo nižší alkyl, ak je mostíková skupina vybraná zo suboru zahrnujúceho _Λ •-x-z4· V iba ak je aspoň jedno z ďalej definovaných R1-R39 vybrané zo skupiny zahrnujúcej (CH2)„OR’, kde n = 1, 2 alebo 3, Rpi,, CR’=CR’-Rpi,, CR’2-CR’2-RPh, kde Rph predstavuje substituovanú alebo nesubstituovanú fenylovú skupinu so substituentami vybranými z ktoréhokoľvek z nefenylových substituentov definovaných pre Ri a R2; alebo ak neobsahuje ďalej definovaný Q funkčnú skupinu karboxylovej kyseliny alebo typu kyseliny, ako je hydroxy, tetrazol, oxadiazol alebo NO2, kde X je C(R”)2, kde každý R” je nezávisle H, F, Cl, Br, I, nižší alkyl, (CH2)nOR’, kde n = 1, 2 alebo 3, CF3, CH2-CH2F, O-CH2-CH2F, CH2-CH2-CH2F, O-CH2CH2-CH2F, CN, (C=O)-R\ N(R’)2, NO2, (C=O)N(R’)2, O(CO)R’, OR’, SR’, COOR’, Rph, CR’=CR’-Rph, CR’2- CR’2-RPh, kde Rph predstavuje nesubstituovanú alebo substituovanú fenylovú skupinu, v ktorej sú substítuenty vybrané z ktoréhokoľvek z nefenylových substituentov definovaných pre R”, tetrazol alebo oxadiazol vzorca:
    kde R’ je H alebo nižší alkyl, alebo X je CR’=CR’, N=N, C=O, O, NR’, kde R’ je H alebo nižší alkyl, S alebo SO2, každý Q je nezávisle vybraný z jednej z nasledujúcich štruktúr
    ΙΑ, IB, IC, ID, IE, IF a IG, kde:
    IA má nasledujúcu štruktúru:
    (ΙΑ) kde každý z R3, R4, Rs, Re alebo R? je nezávisle definovaný rovnako ako vyššie uvedený Ri s tou výnimkou, že ak je mostíková skupina:
    Z—Q a je CH2-CH2, potom aspoň jeden z R1-R4 alebo R6-R7 nie je H, alebo ak je mostíková skupina
    R, RjRl R
    R-ι Ri Ro a je CH=CH, potom R3 nie je CN, Rs nie je CH3 a aspoň jeden z Ri alebo R2 nie je H alebo CH3, pokiaľ:
    aspoň jeden z R1-R7 nie je N(R’)2 (kde R’ predstavuje H alebo nižší alkyl), s podmienkou, že Rs nie je N(CH3)2 alebo N(CH2CH3)2, ak R1-R4, Rň a R7 sú všetky H a s podmienkou, že Rs nie je N(CH3)2, ak R3 je CH3, OCH3 alebo COOCH3 a Ri, R2, R4, Ró, R7 sú všetky H, alebo ak je mostíková skupina:
    *2 a 2QZ je CH2-CH2, potom aspoň jeden z R|-R4, R,, alebo R7 nie je H, ak jc Rj II, COOC2H5 alebo CH.OH;
    alebo ak je mostíková skupina
    Rj /θχ. ^2 zQz—Q a Ζζ^Ζ je CH=CH, potom aspoň jeden z R4 alebo Rô nie je H, CH? alebo CN, alebo ak je mostíková skupina a Z^^Z je CH=CH, potom aspoň jeden z R1-R4, Rô alebo R7 nie je H, ak Rs jc COOH alebo COOCH',, alebo ak je mostíková skupina a Z^Z je CH=CH, potom aspoň jeden z R1-R4, Rô alebo R7 nie je H, ak oba R5 sú N(CH3)2;
    alebo ak je mostíková skupina
    R; RZ a ZtyjZ je CH=CH, potom aspoň jeden z R2 nie je H alebo Cl, pokiaľ:
    aspoň jeden z R2-R7 nie je N(R’)2 (kde R’ predstavuje H alebo nižší alkyl), s podmienkou, že R5 nie je N(CH3)2 a R2, R3, R4, Re a R7 sú všetky H a s podmienkou, že Rs nie je N(CH3)2, ak R3 je CH3 a zvyšné R sú H;
    alebo ak 2^2 je CH=CH a presne dva R2 sú OCH3, potom žiadny z R5 nie je H, CH3 alebo COOR’ (kde R’ predstavuje H alebo nižší alkyl);
    alebo ak Ζζ^Ζ je CH=CH, R2 je CH3 a R4 alebo Re je CONH2, potom žiadny Rs nie je OCH3;
    IB má nasledujúcu štruktúru:
    kde každý z Ri0, Rn, Ri2, Ri3, R14, R15 alebo Ri6 je nezávisle definovaný rovnako ako vyššie uvedený Ri s výnimkou, že ak je mostíková skupina a Z'^'z je CH-C.H a R2 je C.lh, polom aspoň jeden z Rt alebo R',-R|fl nie je II.
    IC iná nasledujúcu štruktúru
    CC) kde každý z R17, Ris, R19, R20 alebo R2i je nezávisle definovaný rovnako ako vyššie uvedený Ri;
    ID má nasledujúcu štruktúru kde každý z R22, R23 alebo R24 je nezávisle definovaný rovnako ako vyššie uvedený R| a predstavuje heterocyklický kruh jedného z nasledujúcich šiestich vzorcov:
    HO' \ / :--0=\ /1° m
    0=^ }=0
    IE má nasledujúcu štruktúru kde každý z R2j, R26 alebo R27 je nezávisle definovaný rovnako ako vyššie u vedený Ri a \_/ predstavuje beterocyklický ki uli jedného z nasledujúcich šiestich vzorcov;
    \ / c—c
    HO nt c=K _/ g_° κ_ς
    IF má nasledujúcu štruktúru N R»
    Ax «F)
    Rji /\/ Rjj n alebo kde presne jeden z R2«, R2o. R-.o, R?i alebo R32 je O väzba definovaná pre vyššie uvedený vzorec 1 a každý ďalší z R2S, R29. R?», R?i alebo R32 je nezávisle definovaný rovnako ako vyššie uvedený Ri;
    kde presne jeden z R?.;, R',4. R.s, R,ft, R-,?, Ríx alebo R™ je z__ϊ vazba definovaná pre vyššie uvedený vzorec I a každý ďalší z R35, R',4. R?«, R.v, R57, R-.s alebo Roj jc nezávisle definovaný rovnako ako vyššie uvedený R|
  13. 15 Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že uvedené ochorenie spojené s amyloidózou je vybrané zo skupiny zahrnujúcej Alzheimerovu chorobu, Downov syndróm, diabetes mellitus 2. typu, hereditárnu mozgovú hemoragickú amyloidózu (holandskú), amyloid A (reaktívny), sekundárnu amyloidózu, familiárnu stredomorskú horúčku, familiárnu amyloidovú nefropatiu s urtikáriou a hluchotou (Muckle-wells syndróm), A beta 2M (chronická hemodialýza) amyloidového lambda L-reťazca alebo kappa L-reťazca (idiopatický, spojený s myclómom alebo makroglobulinémiou), ATTR (familiárnu amyloidovú polyneuropatiu (portugalskú, japonskú, švédsku), familiárnu amyloidovú kardiomyopatiu (dánsku), izolovaný kardiálny amyloid (systémové senilné amyloidózy), AIAPP alebo amylín-inzulinóm, atriálny 11atriuretický faktor (izolovaný atriálny amyloid), prokalcitonín (medulárny karcinóm štítnej žľazy), gelsolin (familiárnu amyloidózu (fínsku)), cystatin C (hereditárnu mozgovú hemoragiu s amyloidózou (islandskou)), AApo-A-1 (familiárnu amyloidovú polyneuropatiu - lowa), AApo-A-Il (akcelerované starnutie u myší), amyloid asociovaný s ťibrinogénom a Asor alebo Pr P-27 (skrapie, Creutzfeld-Jacobovu chorobu, Gertsmann-Straussler-Scheinker syndióm, hovädziu spongiťoimini cncefalilídu) alebo jedincov, ktorí sú I10inozygolní pre apolipoproteínovú F.4 alelu a stavy spojené s homozygotnosfou pre apolipoproteínovú E t alelu
  14. 16 Farmaceutický prostriedok na prevenciu degenerácie buniek a toxicity spojenej s tvorbou fibríl pri stavoch spojených s amyloidózou, vyznačujúci sa tým, že obsahuje derivát cluyzaminu G podľa nároku 1 a farmaceutický prijateľný nosič
  15. 17. Spôsob detekcie depozít amyloidu v bioptických alebo nekroptických vzorkách tkaniva od človeka alebo zvieraťa, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kroky:
    (a) inkubáciu tkaniva fixovaného vo formalíne s roztokom zlúčeniny podľa nároku 1 za účelom označenia depozít, a (b) detekciu značených depozít.
  16. 18. Spôsob podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že uvedený roztok sa skladá z 25 až 100% etanolu (kde zostávajúca časť je voda) nasýteného zlúčeninou podľa nároku 1.
  17. 19. Spôsob podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že uvedená detekcia je uskutočnená mikroskopickou technikou vybranou zo skupiny skladajúcej sa zo svetelnej, fluorescenčnej, laserovej-konfokálnej mikroskopie a mikroskopie s priečnou polarizáciou.
  18. 20. Spôsob kvantifikácie množstva amyloidu v bioptickom alebo nekroptickom tkanive, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kroky:
    (a) inkubácie rádioaktívne značeného derivátu chryzamínu G s homogenátom bioptického alebo nekroptického tkaniva;
    (b) separovania rádioaktívne značeného derivátu chryzamínu G naviazaného na tkanivo od derivátu nenaviazaného na tkanivo, (c) kvantifikácie rádioaktívne značeného derivátu chryzamínu G naviazaného na tkanivo; a (d) prevodu jednotiek rádioaktívne značeného derivátu chryzamínu G naviazaného na tkanivo na jednotky mikrogramov amyloidu na 100 mg tkaniva pomocou porovnania so štandardom.
  19. 21. Spôsob podľa nároku 20, vyznačujúci sa tým, že uvedený rádioaktívne značený derivát chryzamínu G je zlúčenina viažuca sa na amyloid majúca vzorec 1 alebo jej netoxická soľ rozpustná vo vode:
    každý Ri a R2 je nezávisle vybraný zo skupiny zahrnujúcej H, F, Cl, Br, I, nižší alkyl, (CH2)nOR’, kde n = 1,2 alebo 3, CF3, CH2-CH2F, O-CH2-CH2F, CH2-CH2-CH2F, O-CH2-CH2-CH2F, CN, (C=O)-R’, N(R’)2, NO2, (C=O)N(R’)2, O(CO)R’, OR’, SR’, COOR’, Rph, CR’=CR’-Rph, CR’2- CR'2RPh, kde Rpi, predstavuje nesubstituovanú alebo substituovanú fenylovú skupinu, v ktorej sú substituenty vybrané z ktoréhokoľvek z nefenylových substituentov definovaných pre R| a R2, trialkylcín, tetrazol a oxadiazol vzorca
    Α-
    Ν-'N alebo
    N-N
    R kde R’ je H alebo nižší alkyl, alebo triazén vzorca:
    kde Rg a R9 sú nižší alkyl, kde /-'x
    Z l je vybraný zo skupiny zahrnujúcej CR’2-CR’2> C=C-C^C, CR’=CR’CR’=CR’, C^C-CR’=CR’ a CR’2-CR’2-CR’2-CR’2> kde každý R’ je nezávisle H alebo nižší alkyl, ak je mostíková skupina vybraná zo súboru zahrnujúce- alebo kde
    Z Z je vybraný zo skupiny zahrnujúcej C=C a CR’=CR’, kde každé R’ nezávisle predstavuje H alebo nižší alkyl, ak je mostíková skupina vybraná zo súboru zahrnujúceho:
    Z—Q
    Q— ZCZBa R?
    Bi alebo kde je vybraný zo skupiny zahrnujúcej C=C a CR’=CR’, kde každé R’ nezávisle predstavuje H alebo nižší alkyl, ak je mostíková skupina vybraná zo súboru zahrnujúceho:
    R
    Z—O iba ak je aspoň jedno z ďalej definovaných R1-R39 vybrané zo skupiny zahrnujúcej (CH2)nOR’, kde n = I, 2 alebo 3, Rph, CR’=CR’-RPh, CR’2-CR’2-RPh, kde Rph predstavuje substituovanú alebo nesubstituovanú fenylovú skupinu so substituentami vybranými z ktoréhokoľvek z nefenylových substituentov definovaných pre Rj a R2, alebo ak neobsahuje ďalej definovaný Q funkčnú skupinu karboxylovej kyseliny alebo typu kyseliny, ako je hydroxy, tetrazol, oxadiazol alebo NO2, kde X je C(R”)2, kde každý R” je nez«i\'i>le H, F, Cl, Br, 1, nižší alkyl, (CH2)„OR\ kde n = 1,2 alebo 3, CF3, CH2-CH2F, O-CH2-CH2F, CH2-CH2-CH2F, O-CH2C.H2-CH2F, CN, (C=O)-R\ N(R’)2, NO2, (C=O)N(R’)2, O(CO)R’, OR’, SR’, COOR’, Rph, CR’=CR’-Rph, CR’2- CR’2-Rph, kde Rpi, predstavuje nesubstituovanú alebo substituovanú fenvlovú skupinu, v ktorej sú substituenty vybrané z ktoréhokoľvek z nefenylových substituentov definovaných pre R”, tetrazol alebo oxadiazol vzotca
    R· alebo
    N-n kde R’ je H alebo nižší alkyl, alebo X je CR’=CR’, N=N, C=O, O, NR’, kde R’ je H alebo nižší alkyl, S alebo SO2, každý Q je nezávisle vybraný z jednej z nasledujúcich štruktúr:
    IA, IB, IC, ID, IE, IF a IG, kde:
    IA má nasledujúcu štruktúru:
    (U) kde každý z R3, R4, R5, R6 alebo R7 je nezávisle definovaný rovnako ako vyššie uvedený Ri s tou výnimkou, že ak je mostíková skupina a je CH2-CH2, potom aspoň jeden z R1-R4 alebo R6-R7 nie je H, alebo ak je mostíková skupina:
    a 1—Λ je CH=CH, potom R? nie je CN, R5 nie je CH3 a aspoň jeden z Ri alebo R2 nie je H alebo CH3, pokiaľ:
    aspoň jeden z R1-R7 nie je N(R’)2 (kde R’ predstavuje H alebo nižší alkyl),
    100 s podmienkou, že R3 nie je N(f'H,)2 alebo N(CH2CH?)2, ak R|-R4, Rň a R7 sú všetky H a s podmienkou, že R3 nie je N(fll?)2, ak R? je CH.?, OCH.? alebo COOCH? a Ri, R2, R4, Rg, R7 sú všetky H, alebo ak je mostíková skupina « o je CH2-CH2, potom aspoň jeden z Ri-R4, Rň alebo R7 nie je H, ak je Rj H, COOC2H5 alebo CH2OH;
    alebo ak je mostíková skupina a Cí je CH=CH, potom aspoň jeden z R4 alebo Rf, nie je H, CH.? alebo
    CN;
    alebo ak je mostíková skupina a 2(2^2 je CH=CH, potom aspoň jeden z R|-R4, R6 alebo R7 nie je H, ak R5 je COOH alebo COOCH?;
    101 alebo ak je mostíková skupina a zQz je CH=CH, potom aspoň jeden z R1-R4, Rŕ alebo R7 nie je H, ak oba R5 sú N(CH3)2;
    alebo ak je mostíková skupina a je CH=CH, potom aspoň jeden z R2 nie je H alebo Cl, pokiaľ:
    aspoň jeden z R2-R7 nie je N(R’)2 (kde R’ predstavuje H alebo nižší alkyl), s podmienkou, že R5 nie je N(CH3)2 a R2, R3, R4, Re a R7 sú všetky H a s podmienkou, že Rs nie je N(CH3)2, ak R3 je CH3 a zvyšné R sú H;
    alebo ak je CH=CH a presne dva R2 sú OCH3, potom žiadny z R5 nie je H, CH3 alebo COOR’ (kde R’ predstavuje H alebo nižší alkyl);
    alebo ak je CH=CH, R2 je CH3 a R4 alebo R6 je CONH2, potom žiadny R5 nie je OCH3;
    IB má nasledujúcu štruktúru:
    alebo
    102 kde každý z R m, Rh, Rí2, Rh, Ku, Ris alebo R|f, je nezávisle definovaný rovnako ako vyššie uvedený R| s výnimkou, že ak je mostíková skupina:
    ^2 *1*1 *2 a O j e C H C H a R 2 j e C. H 3, p o t o m aspoň jeden z R j alebo R.»** R16 nie je H;
    vyššie uvedený R(,
    ID má nasledujúcu štruktúru' alebo
    103 kde každý z R22, R23 alebo R24 je nezávisle definovaný rovnako ako vyššie u vedený R| a \_/ predstavuje lieterocyklický kruh jedného z nasledujúcich šiestich vzorcov:
    \
    KO' \ / c=c 0==\ \ /
    IE má nasledujúcu štruktúru kde každý z R2>, R26 alebo R27 je nezávisle definovaný rovnako ako vyššie u vedený R| a
    104 predstavuje heterocyklický kruh jedného z nasledujúcich šiestich vzorcov.
    HO' \ / c=c \
    N c=c ς=ς )=0 0=^ \ /
    -Sr —e )Ύ< ..Ύ^ο
    IF má nasledujúcu štruktúru:
    (ŕ) kde presne jeden z R28, R29, R30, R31 alebo R32 je 2^ f pre vyššie uvedený vzorec 1 a každý ďalší z R28, R29, R3o, nezávisle definovaný rovnako ako vyššie uvedený Ri;
    väzba definovaná R3i alebo R32 je
    IG má nasledujúcu štruktúru.
    105 kde presne jeden z R33, R34, R35, R36, R37, R38 alebo R39 je ? väzba definovaná pre vyššie uvedený vzorec I a každý ďalší z R33, R34, R3S, R36, R37, R38 alebo R39 je nezávisle definovaný rovnako ako vyššie uvedený Ri
  20. 22. Spôsob podľa nároku 21, vyznačujúci sa tým, že aspoň jeden zo substituentov R1-R7 a R10-R39 je značený rádioaktívnym činidlom vybraným zo skupiny skladajúcej sa zo 125I, 3H a uhlíkatého substituenta definovaného pre vzorec 1, kde aspoň jeden uhlík je 14C.
  21. 23 Spôsob odlíšenia mozgu postihnutého Alzheimerovou chorobou od normálneho mozgu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kroky.
    (a) získania tkaniva z (i) mozočku a (ii) inej oblasti rovnakého mozgu od normálnych jedincov a od jedincov s podozrením na Alzheimerovu chorobu:
    106 (b) inkubácie uvedených tkanív s rádioaktívne značeným derivátom chryzamínu G tak, že sa amyloid v uvedených tkanivách naviaže na uvedený rádioaktívne značený derivát chryzamínu G;
    (c) kvantifikácie množstva amyloidu naviazaného na uvedený rádioaktívne značený derivát chryzamínu G spôsobom podľa nároku 20;
    (d) výpočtu pomeru množstva amyloidu v oblasti mozgu inej ako mozoček k množstvu amyloidu v mozočku;
    (e) porovnania uvedeného pomeru pre množstvo amyloidu v uvedenom tkanive od normálneho jedinca s pomerom pre množstvo amyloidu v tkanive pre jedinca s Alzheimerovou chorobou alebo s podozrením na Alzheimerovu chorobu; a (f) stanovenia prítomnosti Alzheimerovej choroby, pokiaľ je uvedený pomer pre mozgy jedincov s Alzheimerovou chorobou alebo s podozrením na Alzheimerovu chorobu o 90% vyšší než pomer získaný pre mozgy normálnych jedincov.
SK1440-99A 1997-04-18 1998-04-20 Alkyl, alkenyl and alkynyl chrysamine g derivatives for the antemortem diagnosis of alzheimer's disease and i(in vivo) imaging and prevention of amyloid deposition SK144099A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/837,494 US6168776B1 (en) 1994-07-19 1997-04-18 Alkyl, alkenyl and alkynyl Chrysamine G derivatives for the antemortem diagnosis of Alzheimer's disease and in vivo imaging and prevention of amyloid deposition
PCT/US1998/007889 WO1998047969A1 (en) 1997-04-18 1998-04-20 Alkyl, alkenyl and alkynyl chrysamine g derivatives for the antemortem diagnosis of alzheimer's disease and in vivo imaging and prevention of amyloid deposition

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK144099A3 true SK144099A3 (en) 2000-07-11

Family

ID=25274617

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1440-99A SK144099A3 (en) 1997-04-18 1998-04-20 Alkyl, alkenyl and alkynyl chrysamine g derivatives for the antemortem diagnosis of alzheimer's disease and i(in vivo) imaging and prevention of amyloid deposition

Country Status (19)

Country Link
US (3) US6168776B1 (sk)
EP (1) EP0977815A1 (sk)
JP (1) JP2002500634A (sk)
KR (1) KR20010006552A (sk)
CN (1) CN1261906A (sk)
AR (1) AR012845A1 (sk)
AU (1) AU7136998A (sk)
BR (1) BR9809580A (sk)
CA (1) CA2286607A1 (sk)
EE (1) EE9900503A (sk)
HU (1) HUP0003804A3 (sk)
IL (1) IL132426A0 (sk)
NO (1) NO995088L (sk)
NZ (1) NZ500714A (sk)
PL (1) PL336321A1 (sk)
SK (1) SK144099A3 (sk)
TR (1) TR199903115T2 (sk)
WO (1) WO1998047969A1 (sk)
ZA (1) ZA983301B (sk)

Families Citing this family (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6417178B1 (en) * 1994-07-19 2002-07-09 University Of Pittsburgh Amyloid binding nitrogen-linked compounds for the antemortem diagnosis of alzheimer's disease, in vivo imaging and prevention of amyloid deposits
IL150374A0 (en) * 1999-12-23 2002-12-01 Neurochem Inc Compounds and methods for modulating cerebral amyloid angiopathy
US7640062B2 (en) 2000-05-08 2009-12-29 Brainsgate Ltd. Methods and systems for management of alzheimer's disease
US6849249B2 (en) 2001-04-27 2005-02-01 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Ocular diagnosis of Alzheimer's Disease
EP2151187A1 (en) * 2000-08-21 2010-02-10 The General Hospital Corporation Methods for diagnosing a neurodegenerative condition
US7297326B2 (en) * 2000-08-21 2007-11-20 The General Hospital Corporation Ocular diagnosis of Alzheimer's disease
US7270800B2 (en) 2000-08-24 2007-09-18 University Of Pittsburgh Thioflavin derivatives for use in antemortem diagnosis of Alzheimer's disease and in vivo imaging and prevention of amyloid deposition
AU2001286702B2 (en) * 2000-08-24 2008-03-13 University Of Pittsburgh Thioflavin derivatives and their use in diagnosis and theraphy of alzheimer's disease
US6589504B1 (en) 2000-09-22 2003-07-08 Pharmacia & Upjohn Company Compounds and methods for diagnosing and treating amyloid-related conditions
DE60128138T2 (de) * 2000-11-02 2008-01-03 Cornell Research Foundation, Inc. In vivo multiphoton diagnostische detektion und bilddarstellung einer neurodegenerativen erkrankung
US6379650B1 (en) 2001-03-19 2002-04-30 Wesley Scott Ashton Technetium 99m-N2S2-congo red complexes utilizing diamide dithiolate ligand systems for radioimaging
AU2002258915B2 (en) * 2001-04-23 2007-11-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Amyloid plaque aggregation inhibitors and diagnostic imaging agents
US20030211459A1 (en) * 2001-10-25 2003-11-13 The General Hospital Corporation Drug development by rapid neuroimaging of neural cells
US7407778B2 (en) 2002-02-07 2008-08-05 Pettegrew Jay W Compounds, compositions and methods for treating neuropsychiatric disorders
US7700074B2 (en) * 2002-02-07 2010-04-20 Pettegrew Jay W Method and system for diagnosis of neuropsychiatric disorders including chronic alcoholism
NZ536054A (en) * 2002-04-09 2009-10-30 Scripps Research Inst Motif-grafted hybrid polypeptides and uses thereof
US7684859B2 (en) 2002-04-25 2010-03-23 Brainsgate Ltd. Stimulation of the OTIC ganglion for treating medical conditions
TW200413009A (en) * 2002-10-04 2004-08-01 Univ Pennsylvania Biphenyls and fluorenes as imaging agents in alzheimer's disease
EP2210892A3 (en) * 2002-10-04 2010-10-27 Prana Biotechnology Limited Neurologically-active compounds
AU2003283786A1 (en) 2002-11-14 2004-06-03 Brainsgate Ltd. Surgical tools and techniques for stimulation
CN1774267A (zh) * 2003-01-22 2006-05-17 综合医院有限公司 与淀粉样物质结合的金属螯合剂
GB0307855D0 (en) * 2003-04-04 2003-05-14 Novartis Ag Organic compounds
WO2004100998A2 (en) 2003-05-07 2004-11-25 General Electric Company Compositions and methods for non-invasive imaging of soluble beta-amyloid
US20040223912A1 (en) * 2003-05-07 2004-11-11 Montalto Michael Christopher Compositions and methods for non-invasive imaging of soluble beta-amyloid
US20070053831A1 (en) * 2003-05-20 2007-03-08 Barrio Jorge R Methods for binding agents to b-amyloid plaques
US20060257842A1 (en) * 2003-05-29 2006-11-16 Pettegrew Jay W Cryopreservation media and molecules
US7815894B2 (en) * 2003-05-29 2010-10-19 Jay W. Pettegrew Compounds, compositions and methods for medical imaging of neuropsychiatric disorders
US20060035242A1 (en) * 2004-08-13 2006-02-16 Michelitsch Melissa D Prion-specific peptide reagents
US20050214222A1 (en) * 2004-02-13 2005-09-29 Mckinnon Stuart J In vivo imaging of amyloid plaques in glaucoma using intravenous injectable dyes
US9233245B2 (en) 2004-02-20 2016-01-12 Brainsgate Ltd. SPG stimulation
US8055347B2 (en) 2005-08-19 2011-11-08 Brainsgate Ltd. Stimulation for treating brain events and other conditions
US8010189B2 (en) * 2004-02-20 2011-08-30 Brainsgate Ltd. SPG stimulation for treating complications of subarachnoid hemorrhage
GB0405193D0 (en) * 2004-03-08 2004-04-21 Medical Res Council Compounds
US8093273B2 (en) * 2004-10-20 2012-01-10 Resverlogix Corp. Flavanoids and isoflavanoids for the prevention and treatment of cardiovascular diseases
WO2006076683A2 (en) * 2005-01-13 2006-07-20 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Isolation and detection of pathogenic prions
WO2007002540A2 (en) * 2005-06-24 2007-01-04 Kung Hank F Radiolabeled-pegylation of ligands for use as imaging agents
EP2314295B1 (en) * 2005-07-29 2015-01-28 Resverlogix, Inc Pharmaceutical compositions for the prevention and treatment of complex diseases and their delivery by insertable medical devices
US20070224593A1 (en) * 2005-10-18 2007-09-27 Goldstein Lee E Diagnosis of transmissible spongiform encephalopathy
RU2008126463A (ru) * 2005-12-01 2010-01-10 Юнивесити оф Питсбэг-оф зе Комонвэлс Систем оф Хайэ Эдюкэйшн (US) Связывающие амилоид бензотиазоловые соединения (варианты), фармацевтическая композиция на их основе, способ детекции отложений амилоида (варианты), способ отличения пораженного болезнью альцгеймера мозга от нормального, способ измерения количества амилоида, способ избирательного связывания с амилоидными бляшками (варианты) и способ выявления продромальной стадии заболевания, связанного с отложениями амилоида с их помощью
ES2617061T3 (es) 2006-04-11 2017-06-15 Cognoptix, Inc Procesamiento de imágenes oculares
ES2437997T3 (es) 2006-04-14 2014-01-15 Prana Biotechnology Limited Método de tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad (AMD)
WO2008118122A2 (en) * 2006-05-08 2008-10-02 Molecular Neuroimaging, Llc Compounds and amyloid probes thereof for therapeutic and imaging uses
WO2007139777A2 (en) * 2006-05-26 2007-12-06 Merck & Co., Inc. Methods for the diagnosis and prognosis of alzheimer's disease using csf protein profiling
US7745222B2 (en) * 2006-10-13 2010-06-29 General Electric Company Amyloid binding assays
US7858663B1 (en) * 2007-10-31 2010-12-28 Pisgah Laboratories, Inc. Physical and chemical properties of thyroid hormone organic acid addition salts
US7910579B2 (en) 2006-12-25 2011-03-22 Tohoku University Benzoxazole derivatives
DK2118074T3 (en) 2007-02-01 2014-03-10 Resverlogix Corp Compounds for the prevention and treatment of cardiovascular diseases
AU2008254428A1 (en) * 2007-05-21 2008-11-27 Neuroptix Corporation Ophthalmic formulations of Amyloid-beta contrast agents and methods of use thereof
JP5172229B2 (ja) * 2007-07-04 2013-03-27 住友化学株式会社 アゾ化合物又はその塩
EP2198040B1 (en) * 2007-08-31 2018-08-15 Case Western Reserve University In vivo imaging of myelin
US7860569B2 (en) 2007-10-18 2010-12-28 Brainsgate, Ltd. Long-term SPG stimulation therapy for prevention of vascular dementia
JP5501339B2 (ja) 2008-03-21 2014-05-21 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション アルツハイマー病及び関連疾患の検出及び治療のための化合物及び組成物
AU2009243060A1 (en) * 2008-04-30 2009-11-05 Novartis Ag. Assay for pathogenic conformers
WO2009146388A1 (en) 2008-05-28 2009-12-03 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Voxel-based methods for assessing subjects using positron emission tomography
JP5602728B2 (ja) 2008-06-26 2014-10-08 レスバーロジックス コーポレイション キナゾリノン誘導体の製造方法
US8952021B2 (en) 2009-01-08 2015-02-10 Resverlogix Corp. Compounds for the prevention and treatment of cardiovascular disease
US9925282B2 (en) 2009-01-29 2018-03-27 The General Hospital Corporation Cromolyn derivatives and related methods of imaging and treatment
KR101709492B1 (ko) 2009-03-18 2017-02-23 리스버로직스 코퍼레이션 신규한 소염제
CU23844B1 (es) 2009-04-17 2012-10-15 Ct De Neurociencias De Cuba Procedimiento de obtención de nuevos derivados de naftaleno para el diagnóstico in vivo de la enfermedad de alzheimer
SI2421533T1 (sl) 2009-04-22 2019-01-31 Resverlogix Corp. Nova protivnetna sredstva
US8455836B2 (en) * 2009-10-28 2013-06-04 Roy Stockdale Sensor system for constantly monitoring an irradiance level of a UV lamp and for being operated by power from a sensor thereof
US9555130B2 (en) * 2010-02-25 2017-01-31 Case Western Reserve University Compositions and methods for in vivo imaging of myelin in the peripheral nervous system
KR101905436B1 (ko) 2010-08-16 2018-10-08 코그놉틱스, 인코포레이티드 아밀로이드 단백질을 검출하기 위한 시스템 및 방법
JP5992049B2 (ja) 2011-11-01 2016-09-14 レスバーロジックス コーポレイション 置換されたキナゾリノンのための経口速放性製剤
US10058530B2 (en) 2012-10-25 2018-08-28 The General Hospital Corporation Combination therapies for the treatment of Alzheimer's disease and related disorders
US9855276B2 (en) 2012-10-25 2018-01-02 The General Hospital Corporation Combination therapies for the treatment of Alzheimer's disease and related disorders
US9073878B2 (en) 2012-11-21 2015-07-07 Zenith Epigenetics Corp. Cyclic amines as bromodomain inhibitors
WO2014080291A2 (en) 2012-11-21 2014-05-30 Rvx Therapeutics Inc. Biaryl derivatives as bromodomain inhibitors
US9271978B2 (en) 2012-12-21 2016-03-01 Zenith Epigenetics Corp. Heterocyclic compounds as bromodomain inhibitors
CU20130027A7 (es) 2013-02-28 2014-10-30 Ct De Neurociencias De Cuba Chaperoninas químicas como nuevos moduladores moleculares de la beta agregación proteica presente en las enfermedades conformacionales
US10525005B2 (en) 2013-05-23 2020-01-07 The General Hospital Corporation Cromolyn compositions and methods thereof
CN110305095A (zh) 2013-10-22 2019-10-08 综合医院公司 色甘酸衍生物以及成像和治疗的相关方法
TW201609183A (zh) 2013-10-31 2016-03-16 康諾普堤克斯公司 眼用調配物之製備方法及其用途
EP2878335B1 (en) 2013-11-10 2018-01-03 Brainsgate Ltd. Implant and delivery system for neural stimulator
CN107530356A (zh) 2015-03-13 2018-01-02 雷斯韦洛吉克斯公司 用于治疗补体相关疾病之组合物及治疗方法
EP3093043B1 (en) 2015-05-13 2018-11-14 Brainsgate Ltd. Implant and delivery system for neural stimulator
KR101943706B1 (ko) * 2016-08-25 2019-01-29 성균관대학교산학협력단 유비퀴틴 활성 저해용 조성물
AU2017321782B2 (en) 2016-08-31 2022-03-10 The General Hospital Corporation Macrophages/microglia in neuro-inflammation associated with neurodegenerative diseases
MX2020000577A (es) 2017-07-20 2020-09-10 Aztherapies Inc Formulaciones en polvo de cromolina sodica e ibuprofeno.
EP3817739A4 (en) 2018-07-02 2022-04-13 The General Hospital Corporation SODIUM CROMOGLYCATE AND ?-LACTOSE POWDER FORMULATIONS

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US401024A (en) 1889-04-09 Benfabriken
US394841A (en) 1888-12-18 Carl duisberg
US329638A (en) 1885-11-03 Fabriken
US622961A (en) 1899-04-11 Ivan levinstein and carl mensching
US1979534A (en) 1931-10-15 1934-11-06 Farastan Company Disazo compound for therapeutic use
CH554848A (de) 1967-10-03 1974-10-15 Ciba Geigy Ag Verfahren zur herstellung neuer stilben-derivate.
CH566420B5 (en) 1967-10-03 1975-09-15 Ciba Geigy Ag Bis-stilbene compds for use as optical brighteners
CH540958A (de) 1970-07-23 1973-08-31 Ciba Geigy Ag Verwendung von Styrylverbindungen als optische Aufhellmittel für organische Materialien ausserhalb der Textilindustrie
DE2039993A1 (de) 1970-08-12 1972-02-17 Basf Ag Optische Aufheller der Bisstyrylbenzolreihe
CH574950A5 (sk) 1972-06-30 1976-04-30 Ciba Geigy Ag
US4016156A (en) 1972-06-30 1977-04-05 Ciba-Geigy Corporation Distyryl compounds
DE2364396A1 (de) 1973-12-22 1975-07-10 Basf Ag Neue bisstyrylarylverbindungen
LU75628A1 (sk) 1976-08-19 1978-04-13
US5039511A (en) 1987-04-08 1991-08-13 Salutar, Inc. Amyloidosis and alzheimer's disease diagnostic assay and reagents therefor
JPS63290858A (ja) 1987-04-08 1988-11-28 サルター・インコーポレーテツド アミロイド症及びアルツハイマー病の診断分析法及びそのための試薬
US4933156A (en) 1987-04-08 1990-06-12 Salutar, Inc. Amyloidosis and Alzheimer's disease diagnostic assay and reagents therefor
US5008099A (en) 1987-04-08 1991-04-16 Salutar, Inc. Amyloidosis and Alzheimer's disease diagnostic assay and reagents therefor
US5231000A (en) 1987-10-08 1993-07-27 The Mclean Hospital Antibodies to A4 amyloid peptide
JP2641529B2 (ja) * 1988-10-26 1997-08-13 三菱化学株式会社 新規有機高分子
AU654013B2 (en) 1991-03-13 1994-10-20 Regents Of The University Of Minnesota 2-hydroxy-3(4-iodophenyl)-1-(4-phenylpiperidinyl) propane
US5297562A (en) 1991-04-01 1994-03-29 President And Fellows Of Harvard College Method for detecting and treating Alzheimer's disease
US5434050A (en) 1991-08-13 1995-07-18 Regents Of The University Of Minnesota Labelled β-amyloid peptide and methods of screening for Alzheimer's disease
US5276059A (en) 1992-07-10 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibition of diseases associated with amyloid formation
NZ307369A (en) 1995-05-01 1999-11-29 Univ Pittsburgh Azocompounds for the antemortem diagnosis of alzheimer's disease and in vivo imaging and prevention of amyloid deposition

Also Published As

Publication number Publication date
CN1261906A (zh) 2000-08-02
IL132426A0 (en) 2001-03-19
HUP0003804A2 (hu) 2001-06-28
JP2002500634A (ja) 2002-01-08
PL336321A1 (en) 2000-06-19
US6114175A (en) 2000-09-05
EP0977815A1 (en) 2000-02-09
TR199903115T2 (xx) 2000-05-22
CA2286607A1 (en) 1998-10-29
EE9900503A (et) 2000-06-15
AR012845A1 (es) 2000-11-22
HUP0003804A3 (en) 2002-09-30
US6168776B1 (en) 2001-01-02
BR9809580A (pt) 2001-06-19
MX9909557A (es) 2002-12-13
ZA983301B (en) 1999-10-20
NO995088L (no) 1999-12-17
NO995088D0 (no) 1999-10-18
KR20010006552A (ko) 2001-01-26
US6133259A (en) 2000-10-17
WO1998047969A1 (en) 1998-10-29
AU7136998A (en) 1998-11-13
NZ500714A (en) 2001-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK144099A3 (en) Alkyl, alkenyl and alkynyl chrysamine g derivatives for the antemortem diagnosis of alzheimer&#39;s disease and i(in vivo) imaging and prevention of amyloid deposition
US6417178B1 (en) Amyloid binding nitrogen-linked compounds for the antemortem diagnosis of alzheimer&#39;s disease, in vivo imaging and prevention of amyloid deposits
US7351401B2 (en) Thioflavin derivatives for use in the antemortem diagnosis of Alzheimers disease and in vivo imaging and prevention of amyloid deposition
AU2001286702A1 (en) Thioflavin derivatives and their use in diagnosis and theraphy of alzheimer&#39;s disease
AU712552B2 (en) Azo compounds for the antemortem diagnosis of alzheimer&#39;s disease and in vivo imaging and prevention of amyloid deposition
CZ370099A3 (cs) Alkylové, alkenylové a alkinylové deriváty chrysaminu G pro diagnostiku Alzheimerovy nemoci a in vivo zobrazení a prevenci deposit amyloidu
CZ20001685A3 (cs) Sloučeniny pro diagnózu Alzheimerovy nemoci a in vivo zobrazení a prevenci deposit amyloidu
MXPA99009557A (en) Alkyl, alkenyl and alkynyl chrysamine g derivatives for the antemortem diagnosis of alzheimer&#39;s disease and (in vivo) imaging and prevention
MXPA00004371A (en) Compounds for the antemortem diagnosis of alzheimer&#39;s disease and i(in vivo) imaging and prevention of amyloid deposition