KR101943706B1 - 유비퀴틴 활성 저해용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유비퀴틴(ubiquitin) 활성 저해용 조성물로서, 구체적으로 azo-dye가 biphenyl로 연결된 화합물 및 그 유도체가 유비퀴틴에 직접적으로 결합함으로써 유비퀴틴에 결합하는 효소 및 단백질의 활성을 방해하는 것을 특징으로 하는 유비퀴틴 활성 저해용 조성물이다.
Description
본 발명은 유비퀴틴(ubiquitin) 활성 저해용 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게는 azo-dye가 biphenyl로 연결된 화합물 및 그 유도체가 유비퀴틴에 직접적으로 결합함으로써 유비퀴틴에 결합하는 효소 및 단백질의 활성을 방해한 것을 특징으로 하는 유비퀴틴 대사 억제용 조성물에 관한 것이다.
유비퀴틴(Ubiquitin)은 76개의 아미노산으로 이루어진 인체 내 단백질의 하나로, 1975년 송아지의 이자에서 처음 발견되었으며, 우리말로 '어느 곳에나 존재한다', '모든 곳에 있다'는 것을 의미한다. 유비퀴틴은 수명이 다한 단백질에 꼬리표처럼 달라붙어 단백질 분해효소인 프로테아좀(proteasome)으로 이동한 뒤, 프로테아좀이 단백질을 분해하는 순간 떨어져 나와 다시 똑같은 역할을 되풀이한다. 즉, 유비퀴틴 활성화 효소인 E1, 유비퀴틴 결합 효소인 E2, 유비퀴틴 연결 효소인 E3 효소에 의해 기질에 유비퀴틴 단백질들이 결합하게 되고, 그 결과 유비퀴틴화된 단백질은 프로테아좀에 의해 분해되는 것이다. 유비퀴틴은 또한 세포에서 만들어진 불량 단백질 제거, 세포분열, 손상된 DNA 수리와 같은 핵심적인 생체 과정에도 관여한다.
유비퀴틴 프로테아좀 시스템 (ubiquitin proteasome system)은 세포의 성장과 분열, 세포 주기, 세포 내 신호전달, 세포 자살 등에서 중요한 조절 기작으로서, 이 조절 기작을 통하여 기질로 작용하는 단백질이 프로테아좀에 의해 분해된다. 즉, 다중 유비퀴틴 단백질 사슬이 기질에 공유 결합을 하고 이들은 20S 복합체와 조절자인 19 입자들로 이루어진 26S 프로테아좀에 의해 인식되어 분해되는 과정에 의한다.
유비퀴틴-프로테아좀 시스템은 여러 종류의 암, 신경 퇴화 질병, 신진 대사 장애, 바이러스성 질병, 심장 질환 그리고 노화 관련 질병 유발에 영향을 미치는 것으로 보고되고 프로테아좀 활성의 저해는 암세포의 자살과 암세포의 증식을 억제하는 것으로 알려져, 항암제로서 프로테아좀 저해제에 대한 관심과 개발이 크게 증가하고 있다.
나아가, 유비퀴틴은 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의한 단백질 분해뿐만 아니라, DNA-손상 수리, 면역, T 림프구 제어 및 세포 분열을 포함한 다양한 세포 신호 전달 시스템에 직접적으로 관여한다. 또한, 유비퀴틴의 상기 기능의 대부분이 단백질 유비퀴틴 복합체 형성에 관여 동안, 비고정 유비퀴틴의 다양한 형태는 세포 외 신호 전달에도 관여하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 비고정 세포 외 유비퀴틴은 CXC 케모카인 수용체 4 (CXCR4)와의 결합을 통해 세포 사멸, 세포 성장, 면역 조절의 역할을 한다. 따라서, 유비퀴틴 신호의 조절 곤란을 유도하는 유비퀴틴 시스템의 장애로 인해 다양한 질병이 발생할 수 있으며, 암, 신경 퇴행성 질환 및 면역 질환이 유비퀴틴-프로테아좀 시스템의 고장으로 연결된다.
이에, 유비퀴틴 대사 경로인 유비퀴틴화(ubiquitination) 및 탈유비퀴틴화(deubiquitination)는 좋은 치료 대상으로 여겨지고 있으며, 상기와 같은 이유로, 유비퀴틴-경로의 특정 효소를 표적으로 하는 많은 억제제 또는 활성제가 다양한 질병을 위한 약물 후보로서 개발되고 있다. 암 치료제로 미국 FDA의 승인을 받은 UPS-프로테아좀 억제제인 보르테조밉(Bortezomib)의 경우가 이러한 접근의 유효성을 검사할 수 있는 좋은 예이다. 많은 화학 물질이 UB-경로에서 효소를 대상으로 하지만, 유비스타틴(ubistatin)는 K48-결합 폴리유비퀴틴에 직접 결합함으로써 유비퀴틴과 단백질의 상호 작용을 차단하는 억제제로 확인되었다. 또한,유비스타틴은 세포주기 성분의 프로테아좀-의존성 분해를 억제하여 세포주기의 진행을 막을 수 있음을 입증하고 있다. 그러나 유비스타틴의 세포막 비투과성은 치료제 및 세포 내 프로브를 포함하는 응용분야로의 개발을 제한하고 있다. 이에, 상기 한계를 개선하는 유비퀴틴-경로 억제제의 개발이 여전히 요구되고 있다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 유비퀴틴(Ubiquitin) 활성 저해제를 개발하고자 노력한 결과, azo-dye가 biphenyl로 연결된 화합물 및 그 유도체에 유비퀴틴(Ubiquitin) 억제 활성이 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 유비퀴틴(Ubiquitin) 활성 저해용 조성물을 제공하는 것이다.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
R1 및 R18은 각각 독립적으로 H, -C1-6알킬, -NH2 또는 -C1-6알콕시이고;
R2 및 R17은 각각 독립적으로 H, OH 또는 NH2이고;
R3 및 R16은 각각 독립적으로 H 또는 NH2이고;
R4 내지 R8 및 R11 내지 R15는 각각 독립적으로 H 또는 SO3Na이고;
R9 및 R10은 각각 독립적으로 H, -C1-6알킬 또는 -C1-6알콕시이다.
본 발명의 다른 목적은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 유비퀴틴(Ubiquitin) 활성 저해용 조성물을 제공하는 것이다.
[화학식 2]
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 유비퀴틴(Ubiquitin) 활성 저해용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
R1 및 R18은 각각 독립적으로 H, -C1-6알킬, -NH2 또는 -C1-6알콕시이고;
R2 및 R17은 각각 독립적으로 H, OH 또는 NH2이고;
R3 및 R16은 각각 독립적으로 H 또는 NH2이고;
R4 내지 R8 및 R11 내지 R15는 각각 독립적으로 H 또는 SO3Na이고;
R9 및 R10은 각각 독립적으로 H, -C1-6알킬 또는 -C1-6알콕시이다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 유비퀴틴(Ubiquitin) 활성 저해용 조성물을 제공하는 것이다.
[화학식 2]
본 발명의 일 구현예로, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 3 내지 화학식 7로 표시되는 화합물들로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
[화학식 6]
[화학식 7]
본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물은 유비퀴틴(Ubiquitin)에 직접 결합할 수 있고, 이로써 유비퀴틴(Ubiquitin)이 세포막 단백질에 결합하는 것을 억제할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 k48 폴리유비퀴틴화(polyubiquitination) 및 k63 폴리유비퀴틴화(polyubiquitination)를 억제할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 E1 (ubiquitin-activating enzyme) 효소, E2 (ubiquitin-conjugating enzyme) 효소, E3 ligase 효소 또는 유비퀴틴유리효소 (deubiquitinating enzymes)의 활성을 억제할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 높은 세포막 투과성을 가질 수 있다.
한편, 본 발명은 상기 조성물을 유효성분으로 함유하는 유비퀴틴(Ubiquitin) 활성에 의해 기인하는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 질환은 암, 낭포성 섬유종, 면역질환, 퇴행성신경질환 또는 심혈관질환일 수 있다.
또한, 본 발명은 유비퀴틴(Ubiquitin) 활성에 의해 기인하는 질환의 치료를 필요로 하는 개체에 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 유비퀴틴(Ubiquitin) 활성에 의해 기인하는 질환의 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 유비퀴틴(Ubiquitin) 활성에 의해 기인하는 질환의 치료용도를 제공한다.
본 발명은 유비퀴틴(ubiquitin) 활성 저해용 조성물로서, 구체적으로 azo-dye가 biphenyl로 연결된 화합물 및 그 유도체가 유비퀴틴에 직접적으로 결합함으로써 유비퀴틴에 결합하는 효소 및 단백질의 활성을 방해하는 효과를 갖는 바, 유비퀴틴(ubiquitin) 활성에 의해 기인하는 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 제약 산업 분야에 다양하게 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 GST-Ub-HA로부터 방출된 HA를 SDS-PAGE 밴드 변화를 모니터링하여 확인하는 도이다.
도 2는 CSB6B의 유비퀴틴 변이체들에 대한 결합 친화도를 확인하는 도이다.
도 3a 내지 3c는 CSB6B의 유비퀴틴화, 탈유비퀴틴화 및 유비퀴틴-수용체 결합 활성 억제 효과를 나타내는 것으로, 도 3a는 K48-폴리유비퀴틴화 및 K63-폴리유비퀴틴화의 억제를, 도 3b는 탈유비퀴틴화 효소인 UCHL1 및 USP5의 억제를, 도 3c는 유비퀴틴-수용체 결합 활성을 억제함을 확인하는 도이다.
도 4는 CSB6B의 CXCR4에 대한 길항 작용을 확인하는 도이다.
도 5a는 본 발명의 화합물들의 구조를 나타내는 도이다.
도 5b 및 5c는 본 발명의 화합물들의 유비퀴틴과의 결합 친화도를 N-PAGE 및 면역 켄싱 분석(fluorescence quenching assay)을 통하여 확인하는 도이다.
도 5d 및 5e는 본 발명의 화합물들의 USP5 및 UCHL1 활성에 대한 IC50값을 나타내는 도이다.
도 6은 CR와의 상호작용을 알아보기 위해 15N-표지 유비퀴틴의 1H, 15N-HSQC 스펙트럼을 나타내는 도이다.
도 7은 CR와의 상호작용을 도킹 모델링(docking modeling)을 통하여 확인하는 도이다.
도 8은 CR와의 상호작용을 MD 시뮬레이션을 통하여 확인하는 도이다.
도 9는 CSB6B 및 CR의 세포막 투과성을 확인하는 도이다.
도 10은 CR이 USP4 탈유비퀴틴화를 억제하는 것을 확인하는 도이다.
도 11a 및 11b는 CR의 독소루비신(Dox)와의 병용 가능성을 확인하는 것으로, 도 11a는 K48 및 K63 폴리-유비퀴틴 특이적 항체를 사용하여 면역형광 염색에 의해 유비퀴틴화 정도를 확인하는 도이고, 도 11b는 이를 웨스턴 블롯 분석에 의하여 확인하는 도이다.
도 11c 및 11d는 CR 및/또는 Dox 처리에 의한 세포 생존능 및 카스파제 활성을 확인하는 도이다.
도 12는 인비트로(in vitro) 상에서 CR의 K48 및 K63 폴리-유비퀴틴화 결과를 확인하는 도이다.
도 2는 CSB6B의 유비퀴틴 변이체들에 대한 결합 친화도를 확인하는 도이다.
도 3a 내지 3c는 CSB6B의 유비퀴틴화, 탈유비퀴틴화 및 유비퀴틴-수용체 결합 활성 억제 효과를 나타내는 것으로, 도 3a는 K48-폴리유비퀴틴화 및 K63-폴리유비퀴틴화의 억제를, 도 3b는 탈유비퀴틴화 효소인 UCHL1 및 USP5의 억제를, 도 3c는 유비퀴틴-수용체 결합 활성을 억제함을 확인하는 도이다.
도 4는 CSB6B의 CXCR4에 대한 길항 작용을 확인하는 도이다.
도 5a는 본 발명의 화합물들의 구조를 나타내는 도이다.
도 5b 및 5c는 본 발명의 화합물들의 유비퀴틴과의 결합 친화도를 N-PAGE 및 면역 켄싱 분석(fluorescence quenching assay)을 통하여 확인하는 도이다.
도 5d 및 5e는 본 발명의 화합물들의 USP5 및 UCHL1 활성에 대한 IC50값을 나타내는 도이다.
도 6은 CR와의 상호작용을 알아보기 위해 15N-표지 유비퀴틴의 1H, 15N-HSQC 스펙트럼을 나타내는 도이다.
도 7은 CR와의 상호작용을 도킹 모델링(docking modeling)을 통하여 확인하는 도이다.
도 8은 CR와의 상호작용을 MD 시뮬레이션을 통하여 확인하는 도이다.
도 9는 CSB6B 및 CR의 세포막 투과성을 확인하는 도이다.
도 10은 CR이 USP4 탈유비퀴틴화를 억제하는 것을 확인하는 도이다.
도 11a 및 11b는 CR의 독소루비신(Dox)와의 병용 가능성을 확인하는 것으로, 도 11a는 K48 및 K63 폴리-유비퀴틴 특이적 항체를 사용하여 면역형광 염색에 의해 유비퀴틴화 정도를 확인하는 도이고, 도 11b는 이를 웨스턴 블롯 분석에 의하여 확인하는 도이다.
도 11c 및 11d는 CR 및/또는 Dox 처리에 의한 세포 생존능 및 카스파제 활성을 확인하는 도이다.
도 12는 인비트로(in vitro) 상에서 CR의 K48 및 K63 폴리-유비퀴틴화 결과를 확인하는 도이다.
본 발명자들은, azo-dye가 biphenyl로 연결된 화합물 및 그 유도체를 처리한 경우, 상기 화합물 및 유도체가 유비퀴틴(Ubiquitin)에 직접 결합하여 유비퀴틴의 활성을 억제시킬 수 있다는 점에 기반하여 상기 화합물들의 유비퀴틴과의 상호작용 및 유비퀴틴과의 결합 친화성 등을 구체적으로 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 유비퀴틴(Ubiquitin) 활성 저해용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
R1 및 R18은 각각 독립적으로 H, -C1-6알킬, -NH2 또는 -C1-6알콕시이고;
R2 및 R17은 각각 독립적으로 H, OH 또는 NH2이고;
R3 및 R16은 각각 독립적으로 H 또는 NH2이고;
R4 내지 R8 및 R11 내지 R15는 각각 독립적으로 H 또는 SO3Na이고;
R9 및 R10은 각각 독립적으로 H, -C1-6알킬 또는 C1-6알콕시이다.
본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 바람직한 예는 하기와 같다.
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
[화학식 6]
[화학식 7]
또한, 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 유비퀴틴(Ubiquitin) 활성 저해용 조성물을 제공한다.
[화학식 2]
본 발명의 일 구현예로, 상기 조성물은 유비퀴틴(Ubiquitin)에 직접 결합할 수 있고, 이로써 유비퀴틴(Ubiquitin)이 세포막 단백질에 결합하는 것을 억제할 수 있으며, K48 폴리유비퀴틴화(polyubiquitination) 및 K63 폴리유비퀴틴화(polyubiquitination)를 억제할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물은 E1 (ubiquitin-activating enzyme) 효소, E2 (ubiquitin-conjugating enzyme) 효소, E3 ligase 효소 또는 유비퀴틴유리효소 (deubiquitinating enzymes)의 활성을 억제할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 높은 세포막 투과성을 가질 수 있다.
본 발명에서 상기 "세포막 투과성"은 어떤 물질의 세포막 통과의 용이성을 의미하고, 본 발명 화학식 1 내지 7로 표시되는 화합물의 술폰산 잔기(solfonate group)의 개수에 따라 높거나 낮을 수 있으며, 개수가 많을수록 세포막 투과성은 낮아지는 경향이 있다.
본 발명에서 사용되는 "약학적으로 허용 가능한"이라는 용어는 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 또는 기타 문제점 또는 합병증 없이 이득/위험 비가 합리적이어서 대상체 (예: 인간)의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하며 건전한 의학적 판단의 범주 이내인 화합물 또는 조성물을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "염"은 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수도 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면, 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염 (예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
본 발명의 일실시예에서는, 상기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물의 유비퀴틴(Ubiquitin) 억제 활성을 확인한 결과, 상기 화합물들이 유비퀴틴과의 직접 결합을 통해 유비퀴틴 활성을 저해하는 것으로 나타났으며, 특히, 화학식 3(CSB6B) 및 화학식 6(Congo Red)으로 표시된 화합물의 경우, 우수한 유비퀴틴 저해 활성을 나타낸다는 것을 알 수 있었다(실시예 5 참조).
따라서, 본 발명에 따른 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물은 유비퀴틴에 직접 결합하고, 이에 따른 유비퀴틴-경로 저해 활성을 갖는 바, 유비퀴틴(Ubiquitin) 활성 저해가 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있다.
이에, 본 발명은 상기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 유효성분으로 함유하는 유비퀴틴(Ubiquitin) 활성에 의해 기인하는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 유비퀴틴(Ubiquitin) 활성에 의해 기인하는 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 유비퀴틴(Ubiquitin) 활성에 의해 기인하는 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서, 유비퀴틴(Ubiquitin) 활성에 의해 기인하는 질환은 암, 낭포성 섬유종, 면역질환, 퇴행성신경질환 또는 심혈관질환에서 선택되는 1종 이상일 수 있고, 특히 상기 암은 방광암, 뼈암, 혈액암, 유방암, 흑색종양, 갑상선암, 부갑상선암, 골수암, 직장암, 인후암, 후두암, 폐암, 식도암, 췌장암, 대장암, 위암, 설암, 피부암, 뇌종양, 자궁 두부 또는 경부암, 담낭암, 구강암, 결장암, 항문 부근암, 중추신경계 종양, 간암 및 대장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서 예시한 상기 질환 외에도, 당업계에 알려져 있는 유비퀴틴과 연관된 질환은 모두 본 발명의 화학식 1 또는 화학식 2 중 어느 하나의 구조를 갖는 화합물로 예방 또는 치료할 수 있는 질환에 포함되는 것으로 본다.
이에, 본 발명에 따른 조성물이 약학적 조성물의 형태로 사용되는 경우, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하고 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 이때, 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성셀룰로스, 폴리비닐피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래 의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 내지 150mg, 바람직하게는 0.01내지 100mg을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 유비퀴틴(Ubiquitin) 활성에 의해 기인하는 질환의 치료방법을 제공한다. 본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험준비 및 실험방법
1-1. 샘플 준비
His6-USP5, His6-UCHL1, GST-E2-25K, His6-MMS2, His6-유비퀴틴 및 유비퀴틴 돌연변이를 포함하는 플라스미드, 또는 GST-유비퀴틴-HA를 포함하는 플라스미드를 대장균 BL21 (DE3) 세포로 트랜스폼(transform) 시켰다. 단백질은 IPTG를 사용하여 표현하였으며, 크로마토그래피 방법으로 정제하였다. 정제된 단백질을 함유하는 분획을 SDS-PAGE로 분석하고, 모아서 5 ㎎/ml로 농축한 후 -80 ℃ 냉동고에 저장하였다. 유비퀴틴의 FITC-표지는 제조자의 지시(Life Technologies)에 따라 FluoReporter FITC 단백질 라벨링 키트(FITC1)를 사용하여 수행하였다. 15N-표지 유비퀴틴은 15NH4Cl이 보충된 M9-기반 최소 배지에서 배양된 대장균 세포로부터 제조하였다(Cambridge Isotope Laboratories Inc). NMR 실험을 위한 시료는 25 mM HEPES(PH 7.0), 150 mM 염화나트륨 및 1 mM EDTA를 함유하는 NMR 완충액으로 투석하였다.
1-2. (in vitro) 효소 활성 분석
체외 유비퀴틴화를 위하여, 50 μM 트리스(Tris)-HCl, pH 7.5, 5 mM 크레아틴 포스페이트, 8 mM MgCl2, 1 mM DTT 및 5 mM ATP가 포함된 버퍼에서 50-500 μM CSB6B 또는 CR의 존재 또는 부존재 하에서, 200-500 μM 모노 유비퀴틴에 0.1 μM UBA1, 0.1 μM E2-25K(또는 0.1 μM Mms2/UBC13 복합체), 1 유닛 크레아틴-포스포키나아제 및 1 유닛 파이로포스파타아제를 혼합하고, 37 ℃에서 각각 4 시간(K63) 또는 16 시간(K48) 동안 배양하였으며, 5X SDS 샘플링 버퍼를 첨가하면서 반응을 정지시켰다. 결과는 15 % SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색으로 분석하였고, 유비퀴틴 특정 항체로 웨스턴 블롯을 수행하였다.
USP5 및 UCHL1의 탈유비퀴틴화 분석은 50 μM 트리스(Tris)-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl 및 10 mM DTT가 포함된 버퍼에서 0-45 μM indicated 억제제의 존재 또는 부존재 하에서 0.6 μM USP5 또는 8 μM UCHL1을 5 μM GST-유비퀴틴 HA와 혼합하고, 37 ℃에서 3시간 동안 배양하였으며, 5X SDS 샘플링 버퍼를 첨가하면서 반응을 정지시켰다. 결과는 쿠마시 블루로 염색된 12.5 % SDS-PAGE에 의하여 GST-유비퀴틴 HA에서 GST-유비퀴틴으로의 이동성 변화에 의해 분석하였다. 신호 강도는 ImageJ (6)에 의해 측정하였고, GraphPad Prism version 6.0(GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com)의 기본 방정식(log inhibitor vs. normalized response with Variable slope)으로 IC50 곡선을 생성하였다.
1-3. 면역 형광 염색 및 이미지 분석
세포를 실험 24 시간 전에 SPL 4-웰 세포 배양 챔버 슬라이드에 접종하고, 지정된 시간에 대한 표시된 화합물로 처리하였다. 세포를 15 분 동안 4 % 포름알데히드로 고정한 후, 3회에 걸쳐 PBS로 세척하였다. 투과를 용이하게 한 세포를 0.5 % 트리톤-X100 및 5 % FBS를 함유하는 PBS에서 30 분 동안 배양하고, 블로킹 버퍼(PBS, 5 % FBS, 0.3 % 트리톤 X-100)로 1.5 시간 동안 블로킹하였다. 이어서, 세포를 1/200 희석 블로킹 버퍼에서 일차 항체와 함께 밤새 배양하고, 블로킹 버퍼로 5회에 걸쳐 세척(각 5분)한 후, 형광 접합-이차 항체와 함께 1/200 희석 블로킹 버퍼에서 1 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 블로킹 버퍼로 5회에 걸쳐 세척(각 5분)한 후, DAPI로 10분 동안 배양하고 PBS로 3회 세척하였다. 슬라이드는 마운팅 용액(cat# 475904, MOWIOL)의 존재하에 커버 슬립으로 덮고, 공초점 이미징을 실시하였다. 취득한 공초점 이미지는 ImageJ를 사용하여 형광 강도를 분석하였다. 특정 유비퀴틴 쇄(chain) 수준을 나타내는 형광 신호를 분석하고 DAPI의 강도로 정규화 하였다. 데이터는 통계 자료 분석을 위한 two tail t-test로 Windows 용 GraphPad Prism version 6.0을 사용하여 분석하였다.
1-4. 세포 생존능 및 카스파제(caspase) 분석
세포 생존 및 카스파제 분석은 EZ-Cytox 세포 생존 분석 키트(Daeillab Service) 및 카스파제 GloTM 3/7 분석 키트(PROMEGA)를 사용하여 수행하였다. 세포를 실험 24 시간 전에 96-웰 플레이트에 접종하고, 지정된 시간 동안 화합물의 표시된 농도로 처리하였다.
세포 생존능 분석을 위하여, 10 μl EZ-Cytox 용액을 각 웰에 첨가하고, 2 시간 동안 CO2 인큐베이터에서 인큐베이션시킨 후, Tecan Infinite 200을 이용하여 450 nm에서 OD를 측정하였다. 카스파제 분석을 위하여, 배지를 제거하고, 세포를 50 μl 카스파제 Glo 3/7 용액이 첨가된 200 μl 용해 완충액에 용해하고, 15 분 동안 배양하였다.
결과는 KOMM-Nr(Berthold Technologies)을 사용하여 발광 신호를 측정하여 관찰하였고, 브래드포드(Bradford) 분석에 의해 측정된 총 단백질 농도로 정규화하였다. 데이터는 통계 자료 분석을 위한 two tail t-test로 Windows 용 GraphPad Prism version 6.0을 사용하여 분석하였다.
1-5. 상처 치유(wound healing) 및 세포 이동(cell migration) 분석
H1299 세포는 10 % 소 태아 혈청(FBS) 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Media) 12-웰 플레이트에서 세포 생장이 100 % 달성될 때까지 5 % CO2 배양기에서 배양하였다.
상처 치유 분석은 10 μl 팁으로 스크래치를 발생시키고, CSB6B, AMD3100 또는 유비퀴틴의 존재 또는 부재 하의 무혈청 DMEM로 배지를 교체하여 수행하였으며, 복구 영역은 32 시간 후에 가시화하였다. 세포 이동 분석은 마이그레이션 분석 키트(cat# QCM512, MINIPORE)를 사용하여 수행하였으며, H1299 세포를 30 분 동안 AMD3100 또는 CSB6B 전처리 무혈청 DMEM에서 배양 한 후, 상부 챔버로 이동시켰다. 이때, 하단 챔버는 약물-함유 배지 및 유비퀴틴으로 가득 차 있었으며, 하단 챔버에서 이동된 세포는 약물 치료 24 시간 후에 계수하였다.
1-6. 통계적 분석
결과는 제어값에 의해 정규화하고 평균의 평균±표준오차로 표시하였다. 특별히 언급하지 않는 한 모든 실험은 3 회 이상 반복 하였으며, 그룹 간의 통계적 비교는 student's t-test에 의해 측정하였다. P 값이 0.05보다 작은 경우, 이들은 통계적으로 유의 한 것으로 간주하고, 그래프에 표시하였으며, 정규화 값의 통계적 유의성은 "*"(p <0.05), "**"(p <0.01) 및 "***"(p <0.001)로 표시하였다.
실시예 2. 억제제 동정(Identification of an inhibitor)
탈유비퀴틴화효소(Deubiquitinases, DUBs) 억제제를 동정하기 위하여 탈유비퀴틴화효소의 일종인 정제된 USP5를 사용하여 케미컬 라이브러리(Prestwick, natural compounds and fragments)를 스크리닝하였다. 일반적으로 DUBs의 비특이적 기질로 널리 사용되는, 글루타티온 S-전달 효소(GST)-유비퀴틴-HA로부터 방출된 HA를 SDS-PAGE의 밴드 변화를 모니터링하여 조사하였다(도 1). 라이브러리 화합물의 억제 활성은 화합물의 존재하에 밴드 소실을 확인하여 평가하였다. 상기 스크리닝으로부터 술폰산 염료 중 하나인 시카고 스카이 블루 6B (CSB6B)를 USP5의 억제제로 동정하였다.
그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, 화합물과 유비퀴틴의 결합에 관여하는 아미노산을 확인하였으며, 상기 확인된 아미노산을 돌연변이시킨 변이체를 만들어 하기의 실험을 진행하였다.
실시예 3. CSB6B의 유비퀴틴(ubiquitin)과의 결합 활성
상기 실시예 2에서 동정한 CSB6B가 USP5가 아닌 유비퀴틴에 직접 결합하여 USP5의 효소 활성을 억제함을 확인하기 위하여 결합에 관여하는 핵심 극성 잔기(charged residues)를 변이시키고, 형광 켄칭 분석(fluorescence quenching assay)을 통하여 CSB6B에 대한 돌연변이 유비퀴틴의 결합 친화도를 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, CSB6B의 유비퀴틴 변이체들에 대한 결합 친화성이 감소함을 확인하였다. Wild-type 유비퀴틴 (Kd= 12.0 ± 0.68 μM)과 비교하여, K48C 변이체는 1.9 folds (Kd = 22.66 ± 1.34 μM), H68A 변이체는 1.6 folds (Kd=18.8 ± 1.5 μM), R72A_R74C 변이체는 1.5 folds (Kd = 17.678 ± 1.54 μM) 감소함을 확인하였다.
이러한 결과는, CSB6B 결합에 있어 개별 잔기에 의한 정전 상호 작용의 기여가 실질적으로 없는 것을 의미한다.
또한, 낮은 아미노산 서열 유사성에도 불구하고, CSB6B가 유비퀴틴-유사 구조적 폴드(folds)를 갖는 SUMO(small ubiquitin-like modifiers)에도 결합하지 않음을 확인하였는데, SUMO는 상호작용 사이트인 유비퀴틴-유사 소수성 패치를 가지고 있으며, 다만, SUMO 소수성 패치는 유비퀴틴의 것과 비교하여 분자의 반대편에 위치하고, 특히, 그 형상과 미세 환경은 유비퀴틴과 동일하지 않다. 따라서, 유비퀴틴과 CSB6B의 결합은 정전기적 상호작용에 의해 보충된 적절한 소수성 상호작용에 의하여 기하학적 적합을 통하여 이루어질 수 있음을 의미하며, 이는 CSB6B가 K48 및 R72 등의 아미노산을 통하여 직접 유비퀴틴과 결합함으로써 유비퀴틴-경로 활성을 억제함을 시사하고 있다.
실시예
4:
CSB6B의
유비퀴틴화
(
ubiquitination
),
탈유비퀴틴화
(
deubiquitination
) 및
유비퀴틴
-수용체 결합(ubiquitin-receptor binding) 억제 활성
CSB6B의 유비퀴틴화, 탈유비퀴틴화 및 유비퀴틴-수용체 결합 억제 활성을 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.
먼저, 폴리유비퀴틴(polyubiquitination) 합성에 대한 저해작용을 확인하기 위하여 UBA1(E1 활성화 효소) 및 E2-25K(E2 접합 효소)를 사용하여 K48-폴리유비퀴틴사슬 합성을 CSB6B 존재하에 모니터링하였다.
그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, CSB6B가 농도-의존적으로 K48-폴리유비퀴틴화를 억제함을 확인하였다(도 3a 왼쪽). 또한, 사슬 특이적 결합 착물인 MMS2/UBC13을 함께 처리하는 경우, K63-폴리유비퀴틴 사슬의 합성도 CSB6B에 의해 억제됨을 확인하였다(도 3a 오른쪽).
다음으로, 탈유비퀴틴화(deubiquitination)을 확인하기 위하여 유비퀴틴-특이적 단백질 분해 효소(USP)에 속하는 USP5 및 유비퀴틴 C-말단 가수 분해 효소(UCH) 중 하나인 UCHL1를 포함하는 DUSs에 대한 CSB6B의 저해 활성을 GST-유비퀴틴-HA 절단을 사용하여 확인하였다.
그 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, UCHL1(11.2 ± 1.4 μM, IC50)가 유비퀴틴 C-말단 잔기를 절단하여 유비퀴틴 모노머를 생산하는 동안 USP5(6.5 ± 0.8 μM, IC50)는 폴리유비퀴틴 사슬을 가수분해함을 확인하였다. 즉, 서로 다른 기질 특이성에도 불구하고, CSB6B에 의해 두 효소가 모두 효과적으로 억제됨을 알 수 있었다.
마지막으로, 유비퀴틴-수용체(ubiquitin-receptor binding)을 확인하기 위하여 유비비퀴틴 인식 세포 표면 수용체로 알려져있는 CXC 케모카인 수용체 4(CXCR4)과의 결합 친화도를 조사하였다. 이때, 유비퀴틴이 CXCR4에 결합 또는 내부화됨을 방지하기 위하여, FITC-라벨 유비퀴틴의 세포 표면 수용체와의 상호작용은 인간 단핵구 세포(THP-1)와 관련된 형광을 측정하여 정량하였다.
그 결과, 도 3c에서 나타낸 바와 같이, 세포 표면의 FITC-유비퀴틴 결합은 CSB6B 및 AMD3100이 아닌, CXCR4 길항제에 의하여 이루어짐을 확인하였고(도 3c 왼쪽), 나아가 세포와 관련된 형광 신호는 CSB6B의 농도에 의존하여 감소함을 확인하였으며(도 3c 오른쪽), 이러한 결과는 유비퀴틴-수용체 결합의 억제를 암시하고 있다.
상기 내용을 종합한 결과, CSB6B가 유비퀴틴화(ubiquitination), 탈유비퀴틴화(deubiquitination) 및 유비퀴틴-수용체 결합(ubiquitin-receptor binding)을 포함하는 유비퀴틴 시스템의 보편적인 억제제 역할을 할 수 있음을 시사하고 있다.
실시예 5. CSB6B의 CXCR4에 대한 길항 작용 확인
CSB6B의 세포막 투과성은 CSB6B가 가진 네 개의 술폰산 잔기로 인해 매우 낮게 나타난다. 이러한 매우 낮은 투과도는 세포 내 효용(intracellular utility)은 감소시키는 반면, 같은 부류의 화합물에 세포 외 도구(extracellular tool)로서의 고유한 값을 제공할 수 있는 바, 세포 외 공간에서의 CSB6B의 효과(CSB6B가 CXCR4의 길항작용을 하는지 여부)를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.
먼저, CSB6B의 낮은 세포 투과성에 따라, 세포 외 유비퀴틴 활성을 측정하고, 세포 외 유비퀴틴에 영향을 받는 AKT의 인산화 수준, 비소세포성폐암 세포(H1299)의 이동, 및 상처 치유(wound healing)에 대한 CSB6B의 효과를 CXCR4 길항제로 알려진 AMD3100과 비교하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 유비퀴틴을 처리한 H1299 세포의 경우, AKT의 발현 및 인산화가 증가하는 것과 달리, 유비퀴틴과 함께 AMD3100(대조군) 또는 CSB6B를 처리한 경우 모두에서 대조군에 비해 AKT 발현 및 인산화가 감소함을 확인하였으며(도 4a), 마찬가지로, 세포 이동이 감소함을 확인하였다(도 4b). 또한, 유비퀴틴 처리에 의해 야기된 상처를 효과적으로 회복시킴을 확인하였다(도 4c).
이러한 결과는, CSB6B가 세포 외 유비퀴틴과의 직접 결합에 의한 CXCR4 길항제로 활용될 수 있음을 시사하고 있다.
실시예 6: CSB6B 동족체의 유비퀴틴 활성 저해 효과
6-1. 유비퀴틴-대사 활성 억제 효과
상기 실시예 1 내지 4에서 확인한 CSB6B의 유비퀴틴 억제 활성에 근거하여, 이 클래스의 화합물 내에서 유사한 분자 골격을 가진 화합물(에반스 블루(Evans Blue, EB), 콩고 레드(Congo Red, CR), 다이렉트 블루 15(Direct Blue 15, DB15), 다이렉트 블루 71(Direct Blue 71, DB71) 및 트리판 블루(Trypan Blue, TB) 등 술폰산 염료. 도 5a 참조)의 유비퀴틴에 대한 결합력은 N-PAGE에 의한 염료-결합 분석에 의하여, 유비퀴틴-대사 활성 억제 효과는 면역 켄싱 분석(fluorescence quenching assay)을 통하여 확인하였다.
그 결과, 도 5b 및 5c에 나타낸 바와 같이, 상기 6 종의 술폰산 염료 모두가 모노-유비퀴틴에 결합하는 것을 확인하였으며(도 5b), K48 및 K63 폴리-유비퀴틴 체인과의 상호작용(도 5c 왼쪽), 나아가 K63 폴리유비퀴틴 기질의 USP5에 대한 억제 활성(도 5c 오른쪽 위) 및 모노-유비퀴틴 기질인 GST-유비퀴틴-HA에 대한 억제 활성을 확인하였다(도 5c 오른쪽 아래).
또한, 하기 표 1, 도 5d 및 5e에 나타낸 바와 같이, 상기 DB15와 TB는 USP5에 대한 비교적 낮은 결합력을 보였으나, EB, CR 및 DB71의 경우 CSB6B 유사한 결합 친화력을 보였으며(도 5d), 상기 결과와 동일하게, EB, CR 및 DB71은 DB15 및 TB에 비해 모노-유비퀴틴-HA 결합에 대한 DUBs(USP5 및 UCHL1)의 활성에 있어, 비교적 낮은 IC50 값을 보였다(표 1 및 도 5e).
| Compounds | K d ( μM ) | IC 50 ( μM ) USP5 | IC 50 ( μM ) UCHL1 |
| CSB6B | 12.0 ± 0.6781 | 6.52 ± 0.786 | 11.2 ± 1.37 |
| EB | 13.0 ± 0.6887 | 9.33 ± 1.577 | 18.1 ± 2.09 |
| CR | 14.4 ± 1.2739 | 13.4 ± 2.640 | 26.9 ± 2.99 |
| DB75 | 20.0 ± 0.8352 | 13.72 ± 2.740 | 33.7 ± 4.05 |
| DB15 | 60.3 ± 2.3011 | 32.52 ± 5.00 | 89 ± 15.6 |
| TB | 78.1 ± 4.0244 | 57.71 ± 13.13 | 100.2 ± 19.1 |
6-2. 구조에 따른 활성 평가
상기 화합물들의 구조를 살펴보면, CSB6B 및 EB의 경우, 두 화합물이 각각 중앙 바이페닐기 부분의 메틸기/메톡시기를 제외하고 본질적으로 동일한 구조를 갖기 때문에 유사한 결합 친화도를 나타낸 것으로 보이며, DB15 및 TB의 경우, 결합된 술폰산의 위치가 중요함을 시사하고있으며, 특히, CR의 경우, 술폰산기의 방향이 그 숫자보다 다소 결정적임을 시사하고 있다. 이는 NMR 화학 이동 분석(도 6a), 도킹 모델링(docking modeling, 도 7) 및 MD 시뮬레이션(도 8)으로 확인하였으며, 이러한 결과는 CR에 의해 영향을 미친 잔기와 CSB6B에 의해 영향을 미친 잔기가 거의 유사하다는 것을 의미한다(도 6b). 또한 상기 두 화합물에 따르면, 다이페일(diphenyl) 및 나프틸(naphthyl) 모이어티(moiety)가 유비퀴틴의 표면 상호작용에 있어 중요한 소수성 상호작용에 관여하는 것을 시사하고 있다. 이에, 이하 Congo Red(CR)의 세포 내 유비퀴틴 억제 활성을 구체적으로 확인하였다.
실시예 7: Congo Red(CR)의 세포 내 유비퀴틴 억제 활성
7-1. 세포막 투과성
두 개의 술폰산기, 무-수산기 및 메톡시기에 의해, CR이 보다 높은 세포 투과성을 갖는 것으로 추측되는 바, 세포 내 도구로서의 CR의 효용성을 확인하기 위하여, HEK293T 세포에 12 시간 동안 5 μM CSB6B(음성 대조군) 또는 CR를 보충한 후, 극성 공초점 현미경을 사용하여 세포를 관찰하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, CSB6B의 경우 세포질이 염색되지 않은 반면, CR에서 높은 핵 주변 축적(perinuclear accumulation)을 관찰하였으며, 이는 CR이 세포 내로 침투하여 유비퀴틴과 공동 지역화(co-localize)될 수 있다는 것을 알 수 있었다.
7-2. 탈유비퀴틴화(deubiquitination) 억제 활성
상기 6-1의 세포 투과성을 바탕으로, CR이 β-카테닌 DUB인 USP4에 대한 억제 활성이 있는지 확인하기 위하여, top-flash 활성 분석 및 웨스턴 블롯 분석을 수행한 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, USP4 과발현에 의한 β-카테닌 활성의 증가는 CR의 농도-의존적인 길항작용에 의하여 감소하고, 30 μM의 CR 처리 시, 완전히 활성이 사라진 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 CR이 USP4 탈유비퀴틴화를 억제하는 것을 의미한다.
7-3. 항암 활성
일반적으로, 여러 종류의 암(Cancers)에서 유비퀴틴 및 유비퀴틴 사슬이 증가되어 있음을 확인할 수 있으며, 유비퀴틴의 억제 또는 하향 조절이 통상적인 암 치료제와 결합하여 암 치료에 사용될 수 있다는 가정 하에, 여러 메커니즘에서 DNA 손상을 일으키는 항암제인 독소루비신(Dox)과 CR의 병용 가능성을 확인하였다.
먼저, CR을 전처리 또는 비-전처리 한 H1299 세포를 5 μM 독소루비신으로 배양한 후, K48 및 K63 폴리-유비퀴틴 특이적 항체를 사용하여 면역형광 염색에 의해 유비퀴틴화 정도를 측정하였다.
그 결과, 도 11a 및 11b에 나타낸 바와 같이, CR-전처리 세포에서 유비퀴틴 향상이 관찰되지 않았으며(도 11a), 이는 웨스턴 블롯 분석에서도 확인할 수 있었다(도 11b).
다음으로, CR을 전처리 또는 비-전처리 한 H1299 세포 및 HCT116 세포를 독소루비신의 농도를 조절하여 배양하고, 세포 생존능 및 카스파제 활성을 측정하였다.
그 결과, 도 11c 및 11d에 나타낸 바와 같이, Dox의 경우 두 세포주 모두에서 1.25 내지 10 μM의 범위에서 Dox 농도에 비례하여 Dox-유도 세포 사멸을 확인하였으며(도 11c), CR-전처리 세포의 경우, Dox-유도 세포 사멸이 현저히 증가함을 확인하였다(도 11d). 나아가, 구별하여 진행된 실험에 따라 CR이 20 μM 농도까지 독성을 나타내지 않음을 확인하였으며, 이는, 상기와 같이 증가된 카스파제 활성이 CR 및 Dox의 시너지 효과에 의하여 나타난 것을 의미하며, 인비트로(in vitro) 상에서 CR의 K48 및 K63 폴리-유비퀴틴화 결과 또한 이를 뒷받침하고 있다(도 12).
상기 내용을 종합한 결과, 독소루비신(Dox) 화학 요법의 효능이 CR의 생체 내 작용에 의해 향상될 수 있고, 유비퀴틴의 인식의 중단은 암 치료에 대한 암세포의 저항을 조절하는데 중요한 의미를 가질 수 있다는 것을 시사하고 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (10)
- 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 유비퀴틴(Ubiquitin) 활성에 의해 기인하는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로,
상기 질환은 암, 낭포성 섬유종, 면역질환, 퇴행성신경질환 또는 심혈관질환이고,
상기 조성물은 k48 폴리유비퀴틴화(polyubiquitination) 및 k63 폴리유비퀴틴화(polyubiquitination)를 억제하며, E1 (ubiquitin-activating enzyme) 효소, E2 (ubiquitin- conjugating enzyme) 효소, E3 ligase 효소 및 유비퀴틴유리효소 (deubiquitinating enzymes)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물:
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
R1 및 R18은 각각 독립적으로 H, -C1-6알킬, -NH2 또는 -C1-6알콕시이고;
R2 및 R17은 각각 독립적으로 H 또는 OH 이고;
R3 및 R16은 각각 독립적으로 H 또는 NH2이고;
R4 내지 R8 및 R11 내지 R15는 각각 독립적으로 H 또는 SO3Na이고;
R9 및 R10 은 각각 독립적으로 H, -C1-6알킬 또는 C1-6알콕시이다.
- 하기 화학식 2로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 유비퀴틴(Ubiquitin) 활성에 의해 기인하는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로,
상기 질환은 암, 낭포성 섬유종, 면역질환, 퇴행성신경질환 또는 심혈관질환인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물:
[화학식 2]
- 제 1항에 있어서,
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 3 내지 화학식 5, 및 화학식 7로 표시되는 화합물들로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
[화학식 7]
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 조성물은 유비퀴틴(Ubiquitin)에 직접 결합하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제 4항에 있어서,
상기 조성물은 유비퀴틴(Ubiquitin)이 세포 막 단백질에 결합하는 것을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제 2항에 있어서,
상기 조성물은 k48 폴리유비퀴틴화(polyubiquitination) 및 k63 폴리유비퀴틴화(polyubiquitination)를 억제하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제 2항에 있어서,
상기 조성물은 E1 (ubiquitin-activating enzyme) 효소, E2 (ubiquitin-conjugating enzyme) 효소, E3 ligase 효소 및 유비퀴틴유리효소 (deubiquitinating enzymes)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 조성물은 높은 세포막 투과성을 갖는 것을 특징으로 하는, 조성물.
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