CN1255049C - 用于分解烟碱的功能药剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于分解烟碱的功能药剂及其制备方法。药剂包括天然植物提取物，如：绿茶叶、桑树叶、银杏果、芹菜、柠檬、苹果、干桔皮和甘草根。本发明的功能药剂促进烟碱的分解和抑制致癌物的产生。此外，功能药剂显示出抗氧剂效果，抑制突变和显著降低肺癌的发病率。

Description

用于分解烟碱的功能药剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及用于分解烟碱的功能药剂及其制备方法，更具体地，涉及一种除去由吸烟引起的烟碱伤害和抑制由吸烟引起的致癌物产生的功能药剂。
背景技术
烟碱是无色或淡黄色有毒液体，由吸烟吸收入身体内。烟碱的毒性在于它影响神经节的细胞膜。此外，已知烟碱可引起血压的升高，骨骼肌纤维的痉挛，和由于兴奋的口麻痹。
烟碱的瞬时伤害包括瞳孔收缩、眼睛视力浑浊、呕吐、恶心、胃痛、腹泻、控制排尿困难、喉灼伤、呼吸困难、唾液和呼吸器官的分泌物增加、青紫病和脉搏变缓。当吸烟延续时，烟碱在身体内积累使得它可引起癌症、高血压、口疾病、由于过量酸消化不良的各种胃肠紊乱和各种循环疾病，如：动脉硬化。同样，烟碱是促进老化的重要因素，并且在严重情况下，它可引起痉挛、惊厥、呼吸麻痹、肌肉痉挛和不必要的高血压(Damaj，M.I.，Welch，S.P.和Martin，B.R.(1996)J.Pharmacol.Exp.Thr.，277，454-461)。
由于烟碱衍生出亚硝胺，因而烟碱是非常强的致癌物。全世界每年有数亿计的患者患上由吸烟引起的肺癌和肺疾病。在1956年，Magee和Barnes证明N’-亚硝基二甲胺(NDMA)对大鼠是非常强的肝癌诱导物(Magee，P.N.，和Barnes，J.M.(1956)Br.J.Cancer，10，114-122)，其后超过30种N-亚硝胺化合物被确认为具有致癌物活性(Druckrey，H.，Preussmann，R.，Ivankovic，S.，和Schmahl，D.(1967)Z.Krebsforsch.，69，103-201；Preussmann，R.，和Stewart，B.W.(1984)N-亚硝基致癌物，化学致癌作用(Chemical Carcinogenesis)，(Searle，C.E.主编)643-828页，美国化学会(American Chemical Society)，华盛顿特区；Lijinsky，W.(1992)N-亚硝基化合物的化学和生物学(Chemistry and Biology of N-NitrosoCompounds)，剑桥大学出版社(Cambridge University Press)，英国剑桥；Bogovski，，P.，和Bogovski，S.(1981)Int.J.Cancer，27，471-474))。
在1962年，Druckrey和Preussmann提出衍生自烟草生物碱的亚硝胺存在于烟草烟雾中(Druckrey，H.，和Pressmann，R.(1962)Die Natur.，49，488-499)。在1964年，Boyland等人证实NNN(N’-亚硝基降烟碱)使小鼠发生肺癌，NAB(N’-亚硝基新烟碱)使大鼠发生食道癌(Boyland，E.，Roe，F.J.C.，和Gorrod，J.W.(1964)Nature，202，1126；Boyland，E.，Roe，F.J.C.，和Gorrod，J.W.，和Mitchley，B.C.V.(1964)Br.J.Cancer，18，265-270)。
Smith等人在他的经典研究(Smith，P.A.S.，和Loeppky，R.N.(1967)J.Am.Chem.Soc.，89，1148-1152)中，根据通过亚胺离子的叔胺亚硝化(Klus，H.，和Kuhn，H.(1975)Fachliche MittAustria Tabakwerke，16，307-317；Hecht，S.S.，Chen，C.B.，Dong，M.，Omaf.R.M.，Hoffmann，D.，和Tso，T.C.(1977)Beitr.Tbakforsch.，9，1-6)证明各种亚硝胺是由烟碱产生。Hecht等人确认4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、4-(甲基亚硝氨基)-4-(3-吡啶基)-丁醛(NNA)、NNN和其它硝基化合物由烟碱产生，并从烟草中检测出NNK(Hecht，S.S.，Chen，C.B.和Hoffmann，D.(1976)Tetrahedron Lett.，8，593-596；Hecht，S.S.，Chen，C.B.，Omaf，R.M.，Jacobs，E.，Adams，J.D.，和Hoffmann，D.(1978)J.Org.Chem.，43，72-76；Hecht.S.S.，Chen.C.B.，Hirota，N.，Omaf. R.M.，Tso，T.C.，和Hoffmann，D.(1978)J.Natl.Cancer Inst.，60，819-824)。
图1显示烟碱代谢产生的各种亚硝胺。
到目前为止，已经从烟草产物中识别出7种烟草特异性亚硝胺，即：NNN、NNK、NNAL、NAT、NAB、异-NNAN和异-NNAC，其中NNN、NNK和NAT比其它几种以更大数量检测到。特别是NNN、NNK、和NAT已经确认为非常强的致癌物。
烟碱通过两种过程代谢为可替宁，在代谢中涉及细胞色素P450(以下称CYP)和细胞溶质醛氧化酶。烟碱由不同的CYP代谢成可替宁，其中CYP2A6具有重要的作用(Cashman，J.R.，Park，S.B.，Yahg，Z.C.，Wrighton，S.A.，Jacob.P.III.，和Benowitz，N.L.(1992)Chem.Res.Toxicol.，5，639-646)。
图2显示由烟碱到可替宁的代谢。
70-80％的烟碱转化为可替宁，其中10-15％的可替宁由尿排泄，剩余部分代谢为酮酸。85％的酮酸代谢为羟基酸并由尿排泄。不代谢为可替宁的4％烟碱由FMO(含黄素的单氧酶)转化为烟碱-1-N-氧化物，大多数由尿排泄(Benowitz，N.L.，Jacob.P.III.，和Fong，I.(1994)J.Pharmacol.Exp.Ther.，268，296-301)。因此，80-90％的烟碱通过代谢由尿排泄(Kyerematen，G.A.，Morgan，M.L.，Chattopadhyay，B.，deBethizy，J.D.，和Vessel，E.S.(1990)Clin.Pharmacol.Ther.，48，641-651；Caldwell，W.S.，Greene，J.M.，Byrd，G.D.，Chang，K-M，Uhrig，M.S.，deBethizy，J.D.，Crooks，P.A.，Bhatti，B.S.，和Riggs，R.M.(1992)Chem.Res.Toxicol.，5，280-285；Byrd，G.D.，Chang，K-M.，Greene，J.M.，deBethizY，J.D.(1992)Drug.Metab.Dispos.，20，192-197；Jacob.P.III.，Benowitz，N.L.，和Shulgin，A.J.(1988)Pharmacol.Biochem.Behav.，30，249-253)。
如图3所示，NNK是对实验室动物的前致癌物，并主要在肝和肺中由CYP酶代谢。NNK活化的主要步骤是由CYP为媒介的α-羟基化，在反应中，NNK转化为不稳定代谢物甲基-重氮氢氧化物，它向DNA提供甲基并产生O6MeG。O6MeG已经用作衍生自NNK致癌物的前诱变生物指标。
报导CYP与A/J小鼠中NNK和NNN的α-羟基化有关，诱导DNA的甲基化，形成O6-甲基鸟嘌呤(O6MeG)使得GC→AT发生转变错配，并且它活化K-ras原-癌基因(Brown，B.G.，Ching-jey，G.C.，Paul，H.A.，Chjn，K.L.，和David，J.D.(1999)Toxicol Scien.，47，33-39)。
因此，提出通过体外或体内使用抗CYP酶底物如烟碱或可替宁的底物竞争性抑制剂，有效抑制NNK通过CYP引起的肺癌，这是由于它抑制NNK代谢(α-羟基化)的活化(Brunnemann，K.D.等人(1991)Crit Rev Toxicol.，21(4)，235-40)。图4显示在NNN，烟碱和NNK之间的结构相似性，它们与细胞色素P4502A6的代谢有关。
烟碱的主要代谢物可替宁，以及其后的代谢物酮酸和羟基酸，被快速代谢并由尿排泄。此代谢因人而异。可替宁，酮酸和羟基酸是由吸烟影响的唯一因素，而不是致癌物。此外，它们用作竞争性抑制剂以抑制烟草特异性亚硝胺通过肝中存在的CYP转化成致癌物。因此，快速代谢为可替宁的烟碱可降低吸烟的伤害，与烟碱转化为衍生物如NNK、NNA和NNN相比，能更有效地抑制癌症。
发明内容
本发明的目的是提供用于快速分解由吸烟引起的有害化学物质的功能药剂。
本发明的另一个目的是提供可抑制致癌物如烟碱和烟碱衍生物产生的功能药剂。
为完成这些目的，本发明提供一种用于分解烟碱的功能药剂，通过干燥包括如下物质的组合物来制备：
(a)50-500重量份从绿茶叶提取的绿茶有效成分的粉末；
(b)7.5-75重量份桑树叶沸水浸渍提取物；
(c)3-30重量份苹果汁；
(d)3-30重量份甘草根沸水浸渍提取物；和
(e)1.5-15重量份干桔皮沸水浸渍提取物。
本发明也提供一种用于分解烟碱的功能饮料，通过将0.1-5wt％功能药剂与水混合来制备该功能饮料。
本发明也提供一种功能药剂的制备方法，包括：
(a)通过提取和过滤银杏果、芹菜、苹果和柠檬，制备果实和蔬菜滤液；
(b)在100℃下提取甘草根和干桔皮，混合桑树叶，并对其进行提取和过滤以制备叶子和草药浓缩物；和
(c)混合步骤(a)的果实和蔬菜滤液，步骤(b)的叶子和草药浓缩物及绿茶粉末，将其过滤和喷雾干燥以制备粉末。
附图说明
图1显示从烟碱产生的亚硝胺。
图2显示烟碱变成可替宁的代谢。
图3显示4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)的代谢机理。
图4显示在NNN(N’-亚硝基降烟碱)，烟碱和NNK之间的结构相似性，它们与细胞色素P4502A6的代谢有关。
图5是显示由直接混合法，本发明功能药剂对烟碱分解性的图。
图6是显示使用FLCFR5细胞株测量本发明功能药剂对烟碱分解性的图。
图7是显示在已经吸收功能药剂的细胞中，本发明功能药剂对烟碱分解性的图。
图8是显示将功能药剂和烟碱一起注入zenopus卵母细胞中时，本发明功能药剂对烟碱分解性的图。
图9是显示临床检验方法来检验本发明功能药剂对烟碱分解性的图。
图10是显示摄取本发明功能药剂的吸烟者(A)和作为对照摄取水的吸烟者(B)尿中可替宁浓度的图。
图11是显示摄取本发明功能剂的吸烟者和作为对照摄取水的吸烟者尿中平均可替宁浓度的图。
图12是在每个人饮用功能药剂或水之后，吸烟者尿中包含的烟碱的平均值。
图13是显示功能药剂、粉状绿茶、EGCG(表焙儿茶素-3-没食子酸盐)、槲皮素、维生素C和儿茶素，对于亚硝基吗啉产生的抑制效果的图。
图14是显示烟碱代谢的图。
图15是显示功能药剂、槲皮素、儿茶素和粉状绿茶对CYP酶活性的抑制效果的图。
图16是显示功能药剂、槲皮素、儿茶素和粉状绿茶对CYP 1A2酶活性的抑制效果图。
图17是显示功能药剂、EGCG、槲皮素、儿茶素和粉状绿茶，在高浓度(A)下和低浓度(B)下，对纯化的CYP 1A2酶活性的抑制效果图。
图18是显示功能药剂、槲皮素、儿茶素和粉状绿茶对NNK诱变性的抑制效果图。
图19是显示功能药剂、槲皮素、儿茶素和粉状绿茶对由苯并芘引起的诱变性的抑制效果图。
图20是显示功能药剂、粉状绿茶、槲皮素和儿茶素的自由基清除效果的图。
图21是显示通过使用SOD试剂盒，功能药剂、粉状绿茶、槲皮素和儿茶素清除O2 -效果的图。
图22是显示包含在功能药剂溶液中槲皮素含量的HPLC图。
图23是显示在使用功能药剂抑制NNK诱导肺癌的试验中，A/J小鼠体重的图。
具体实施方式
在提高体内烟碱分解性的研究期间，本发明人研究的是当把天然食品加入到包含许多儿茶素和EGCG的绿茶和包含槲皮素的苹果提取物中时，它变成优异的功能药剂以分解和抑制烟草有害成分的产生。
通过干燥组合物，制备本发明用于分解烟碱的功能药剂，组合物包括(a)50-500重量份从绿茶叶提取的绿茶有效成分的粉末；(b)7.5-75重量份桑树叶的沸水浸渍提取物；(c)3-30重量份苹果汁；(d)3-30重量份甘草根的沸水浸渍提取物；和(e)1.5-15重量份干桔皮的沸水浸渍提取物。
本发明的功能药剂进一步包含通过干燥组合物而制备的提取物，组合物包括(a)7.5-75重量份银杏果提取物；(b)3-30重量份芹菜提取物；和(c)3-30重量份柠檬提取物。
本发明用于分解烟碱的功能药剂优选包括(a)100-200重量份从绿茶叶提取的绿茶有效成分的粉末；(b)15-30重量份桑树叶；(c)15-30重量份银杏果；(d)6-12重量份芹菜；(e)6-12重量份柠檬；(f)6-12重量份苹果；(g)6-12重量份甘草根；和(h)3-6重量份干桔皮。
本发明用于分解烟碱的功能药剂的干燥方法可以是常规干燥方法，优选喷雾干燥方法。
功能药剂可单独使用或包含在多于一种药物的组合物中。包括功能药剂的组合物可包括多于一种的药物稀释剂，药物稀释剂选自盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油和乙醇，但稀释剂并不仅限于此。适当的稀释剂列于《瑞明顿的药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Science)(Mack Publishingco，Easton PA)的书面文本中。
功能药剂或包含功能药剂的组合物可通过口服或胃肠外途径用药。胃肠外给药表示通过不是口服途径的药物给药，它包括直肠、静脉内、腹膜内和肌肉内、动脉内、经皮、鼻内、吸入、眼内和皮下引入。
包含功能药剂的药物剂型可以采用任何形式来制备，如口服剂形式、可注射溶液或局部制剂。药物剂型的例子如下：膏药、颗粒、洗剂、擦剂、柠檬饮料、芳香水、粉剂、糖浆、眼软膏、液体和溶液、气雾剂、提取物、酏剂、药膏、流浸膏、乳剂、悬浮剂、煎剂、浸渍剂、片剂、栓剂、注射剂、醑剂、敷剂、胶囊、乳膏、锭剂、酊剂、糊剂和丸剂。
剂型可优选制备用于口服和注射给药，并且最优选为口服形式如片剂、胶囊、软胶囊、含水药物、颗粒等。
在制备制剂中，不添加任何赋形剂将功能药剂填入软胶囊中，或与载体混合或稀释之后，形成为适当的剂型。合适载体的例子是淀粉、水、盐水、林格溶液、葡萄糖和在先前报告中描述的任何成分(例如：《(瑞明顿的药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Science)，Mack Publishing co，EastonPA)。
本发明用于分解烟碱的功能药剂可用作健康饮料或食品添加剂，并优选用作食品、食品添加剂、药物、饮料、或饮料添加剂。也优选将0.1-5wt％功能药剂与水混合以制备功能饮料。
本发明用于分解烟碱的功能药剂或饮料促进烟碱的分解，抑制那些是致癌物的亚硝基化合物的产生。同样，功能药剂抑制细胞色素P4501A2酶活性，因而防止由NNK形成致癌物。此外，它还显示出抗氧化效果、抑制由NNK和苯并芘导致的诱变性并可降低肺癌的增殖速率。
本发明用于分解烟碱的功能药剂包括约0.32mg/mg的儿茶素和56ng/mg的槲皮素。
通过过滤果实和蔬菜，浓缩叶子和草药，将它们混合并干燥，而制备功能药剂。
通过洗涤，研磨，提取和过滤如下物质而制备果实和蔬菜滤液：7.5-75重量份银杏果，3-30重量份芹菜，3-30重量份柠檬，和3-30重量份苹果。过滤可以是常规方法，更优选使用筛网或硅藻土。最优选使用100目网和硅藻土过滤，以防止在水相中的沉淀。同样，在过滤步骤中，优选在第一次提取之后，向软泥中加入适度数量的水并再次搅拌、提取、过滤以有效提取有效成分。在0-7℃下贮存果实和蔬菜滤液。
叶子和草药浓缩物的制备是通过向提取槽中加入400-4000重量份水、3-30重量份甘草根和1.5-15重量份干桔皮，升高温度到100℃进行提取。然后，在向提取槽中加入100-1000重量份水之后，加入7.5-75重量份桑树叶。在60-95℃下进行提取10-40分钟。通过过滤和浓缩提取物而制备叶子和草本植物浓缩物。以上过滤方法优选是常规方法，更优选可以使用筛网、外壳过滤(housmg filtration)或硅藻土。最优选的方法是采用100目网，1μm外壳过滤器和硅藻土的过滤。在第一次提取之后，将400-4000重量份水进一步加入到剩余的软泥中，通过再次提取和过滤，可以制备叶子和草本植物浓缩物。
混合和粉末制备步骤包括将50-500重量份从绿茶叶提取的绿茶有效成分的粉末与以上果实和蔬菜滤液、叶子和草药浓缩物混合，通过高速离心分离机除去沉淀物并干燥。干燥可以是常规方法，优选喷雾干燥。
进一步参考以下实施例更详细解释本发明。然而，这些实施例不应当在任何意义上解释为限制本发明的范围。
实施例1
用于分解烟碱的功能药剂
果实和蔬菜滤液的制备步骤
将60kg去皮而未干燥的银杏果，24kg洗涤的芹菜，24kg苹果和24kg柠檬在研磨机中研磨之后，压榨。将100L水在压榨之后加入到软泥中，搅拌30分钟，再次压榨并与第一次压榨液混合。将压榨的液体通过100目网和硅藻土过滤，在4℃下贮存。
叶子和草药浓缩物的制备步骤
在向1.5吨罐中加入0.5吨水之后，将24kg甘草根和12kg干桔皮加入，在100℃下提取2小时。在向其中加入0.2吨水之后，将60kg桑树叶加入，首先在80℃下提取30分钟。将第一提取物单独贮存，同时将0.5吨水加入到软泥中，在80℃下另外提取30分钟。将第一和第二提取物混合，通过100目网，1μm外壳过滤器和硅藻土过滤，浓缩。
混合和喷雾干燥的步骤
将100kg从绿茶叶提取的绿茶有效成分的粉末与果实和蔬菜滤液以及叶子和草药浓缩物均匀混合，用高速离心分离机除去沉淀物之后，通过喷雾干燥制备烟碱分解药剂。
实施例2
用于分解烟碱的功能饮料
将100ml水与实施例1中的用于分解烟碱的功能药剂0.1-5g混合，制备用于分解烟碱的功能饮料。
实施例3
用于分解烟碱的功能药剂的效果试验
为证实实施例1中制备的功能药剂中是否存在可分解烟碱的物质，分别直接将水和用于分解烟碱的功能药剂与烟碱混合，测量烟碱分解性。水是对照物。
在Eppendorf管(1.5ml)中均匀混合200μl的1mM烟碱(目录号N3876，Sigma)和200μl功能药剂溶液(0.3％)。在0，10，20，30，60，和120分钟之后，产生的可替宁用可替宁定量方法定量测定并如图5所示。试验温度是25℃。
本试验使用改进的Barlow方法，该方法简单且更精确，在1987年开发(Barlow，R.D.，Stone，R.B.，Wald，N.J.，和Puhakainen，E.J.(1987)Clin.Chim.Acta.，165，45-52)。具体方法如下。
将200μl样品和标准物加入到1.5ml聚丙烯管中的缓冲溶液或蒸馏水中。为提高试验结果的可靠性，每个样品使用三个管。将100μl的4M乙酸钠缓冲溶液(pH4.7)，40μl的1.5M KCN，40μl的0.4M氯胺-T，200μl溶于50％(V/V)乙腈的78mM巴比土酸依次加入到样品中，并混合10秒。将混合物在室温(25℃)下反应15分钟，在加入40μl的1M偏亚硫酸氢钠之后停止反应。在490nm下测量吸光度，与标准可替宁相比较将样品定量化。
同样，在15和37℃下进行相同的试验。不同温度试验的原因是检查涉及可替宁产生的过程是化学反应或生物催化剂(如酶)相关的反应。不同温度试验的结果几乎与在25℃下试验的结果相同。
如图5所示，尽管加入本发明功能药剂的可替宁吸光度只有3.0，而加入水的可替宁吸光度仅为1.3。因此，确认在本发明的功能药剂中存在烟碱分解物质。此外，当没有功能药剂时，从烟碱到分解产物的转变时间非常缓慢(约10-20分钟)。相反，观察到在功能药剂下，显著产生可替宁。这显示本发明的功能药剂与试管中的烟碱反应，因而促进烟碱的分解。
实施例4
细胞培养中烟碱分解性的测量
将烟碱和功能药剂处理到细胞上，并把从烟碱产生的可替宁数量定量化。一般情况下，由烟碱、可替宁、硫氰酸酯和碳氧血红蛋白的量，测量吸烟者的吸烟量。然而，烟碱的半衰期为30分钟，它不如可替宁稳定，可替宁的半衰期为24小时。
通过培养衍生一周的人体肝细胞衍生的FLCFR5细胞并将它们分成小数量，而制备原种细胞。为定量化，将分开的肝细胞培养一周直到100％的铺满。然后，将它们进一步在包含烟碱的培养基(5％FBS加入的DMEM(Dulbecco改进的Eagle培养基)，1mM烟碱)中培养一周。将120μl功能药剂溶液(0.3％)加入到培养的细胞中并培养，然后在10，20，30，60，120分钟之后收集细胞。将收集的细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次或四次并用刮刀收集。用离心分离器收集细胞并加入100μl的PBS(4℃)之后，由超声发生器(Vibra Cell-200，Newton，Conn.，USA)间歇破碎细胞30秒，在490nm下用DBA方法测量吸光度。同样，水作对照物用相同的方法测试。
图6是显示功能药剂的烟碱分解性的图，它显示施加本功能药剂的细胞比对照产生更多的可替宁。
此外，当已经吸收了用于分解烟碱的功能药剂于细胞中时，对新引入烟碱的分解性也被证实。
将FLCFR5细胞在包含功能药剂的培养基(每1ml培养基含有120μl功能药剂)中预培养6小时。在预培养之后，将细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，在包含烟碱的培养基中培养。由相同的方法测量细胞中的可替宁数量。
图7显示已经吸收了功能药剂的细胞中功能药剂对烟碱的分解性。已经吸收功能药剂的细胞比没有吸收功能药剂的细胞产生更多的可替宁。当与图6的细胞比较时，其功能药剂是随后加入的，两种情况下产生的可替宁数量相似。这意味着在功能药剂的长期摄入和就在吸烟之前摄入之间没有显著的差异。
图6和7中烟碱分解性的结果具有与图5直接混合方法中相同的模式。这可解释如下。具有烟碱分解性的成分容易穿过细胞膜并在细胞中保持稳定性。物质稳定性具有相同的模式，而与胞龄无关。当对等分成完全铺满状态的细胞进一步培养时，观察到的相同模式是它们可达到60-100％的铺满。当存在功能药剂时，显著促进烟碱的分解。在通常观念下，对于饮用绿茶的吸烟者，由功能药剂促进烟碱分解和可替宁的产生，是由于维生素C的补充，这与由儿茶素吸收烟碱不一致。这是由于在绿茶提取物存在下，从烟碱向可替宁的加速转变不能用这些理由解释。因此，我们可提出其它假定：功能药剂的一种未知成分涉及该转变或由完全不同的机理促进从烟碱向可替宁的转变。一种儿茶素通过吸收沉淀如烟碱的毒性物质的沉淀理论，可解释细胞中游离烟碱的降低。然而，观察到在功能药剂的存在下，当培养时间增加时，可替宁的数量增加。这意味着功能药剂的一种未知成份，而不是儿茶素，影响着烟碱的分解。
实施例5
通过使用zenopus未成熟卵细胞测量烟碱分解性
为消除注入烟碱或功能药剂的时间和吸收入细胞的时间之间的间隙，将烟碱或功能药剂直接注入zenopus未成熟卵细胞(卵母细胞)中并测量烟碱分解性。
从母体分离未成熟卵细胞并选择IV或V阶段直径为1.0-1.2mm的细胞，将卵细胞在15℃下在OR2溶液中培养一天(Byrd，G.D.，Chang，K-M.，Greene，J.M.，deBethizy，J.D.(1992)Drug.Metab.Dispos.，20，192-197)。在培养之后，使用之前用镊子(钟表匠)直接除去未成熟卵细胞的保护膜，除去多个未成熟卵细胞的保护膜可通过使用III型胶原酶(Sigma)来制备(Lee DH.(1998)J.Biochem.Molecular Biology，31(2)，196-200)。
用微操作器将1mM烟碱和120μl功能药剂溶液(0.3％)的混合溶液500nl注入未成熟卵细胞中。在注入之后，将未成熟卵细胞分别在15℃，25℃(正常温度)，和32℃下培养，在0，10，20，30，60，120秒收集并在OR2溶液中进行匀浆(杜恩斯匀浆器)。由离心分离除去匀浆的卵黄，取上清液以定量化测定可替宁。此外，为排除注入方法的影响，在用于细胞培养试验的烟碱和功能药剂浓度下，在OR2介质培养物中培养相同的时间，确认功能药剂的烟碱分解性。
图8是显示当在zenopus卵母细胞中注入功能药剂和烟碱时，本发明功能药剂烟碱分解性的图。它显示比图6更高的烟碱分解性。同样，根据培养温度测量zenopus卵母细胞的反应性，但没有差异。
实施例6
临尿试验的烟碱分解性测量
为证明功能药剂的烟碱分解性，进行临床试验。在临床试验中，每天吸15-25支烟的健康二十岁男子(17-20人)作为试验对象，烟草是“THIS”(商标，市场购得)。
为保证试验，将试验重复几次并平均。在不同的日子测试饮用功能药剂的试验组和饮用水的对照组。如果可能，使在试验期间身体条件和试验时间相一致。试验对象如通常那样吸烟，试验方法如图9所示。
立即在-20℃下贮存收集的第一次，第二次和第三次尿液。在48小时之后，对尿液中烟碱的重要代谢物可替宁定量测定。详细方法如下。
将500μl的尿液或标准样品放入1.5ml管中。为保证试验结果的可靠性，每个样品使用两个管。将250μ1的4M乙酸钠缓冲溶液(pH4.7)，100μl的1.5M KCN，100μl的0.4M氯胺-T，500μl溶于50％(v/v)乙腈的78mM巴比土酸依次加入到样品中，混合10秒。将混合物在室温(25℃)，100rpm下反应15分钟，加入100μl的1M偏亚硫酸氢钠之后停止反应。在490nm下测量吸光度，与标准曲线相比较将样品定量化。
图10是显示已摄取用于分解烟碱的功能药剂的吸烟者烟碱分解性的图。(A)是对照，在试验对象饮水并吸烟之后，将尿液中的可替宁定量化。(B)是在试验对象饮用功能药剂并吸烟之后，将尿液中的可替宁定量化。从37个吸烟者收集第一次，第二次和第三次尿液。
图11是显示摄取了本发明的功能药剂的吸烟者平均可替宁浓度的图。由于摄取功能药剂的组的尿液中可替宁含量比对照组更大，从而证实功能药剂具有高的烟碱分解性。
图12是在饮用功能药剂或水之后吸烟的吸烟者每个人尿液中含有可替宁的平均值。将每人第二次或第三次尿液可替宁的值除以第一次尿液的平均值，并将功能药剂与水比较。
烟碱分解速率是基于第二次和第三次尿液中产生的可替宁。当排出第一次，第二次和第三次尿时，尿中所有的可替宁被排泄，可确认烟碱分解成可替宁。同样，试验组的烟碱分解速率(可替宁产生速率)是对照组的约两倍。这显示本发明的功能药剂促进身体内烟碱向可替宁的分解。
另外制备包括功能药剂的片剂。
将吸烟超过两年的健康四十岁男子(20-30人)分成两组并试验2天。
试验对象每小时吸烟一次，持续8小时，期间收集五次尿液。向组I的试验对象给药三次每次两片，向组II给药一次六片，收集尿液。
<试验方法>
对照(组I和组II)：饮水&吸烟→在1小时之后，第一次收集尿液，饮水&吸烟→在1小时之后，第二次收集尿液，饮水&吸烟→在1小时之后，第三次收集尿液，饮水&吸烟→在1小时之后，吸烟→在1小时之后，第四次尿收集，饮水&吸烟→在1小时之后，吸烟→在1小时之后，吸烟→在1小时之后，第五次收集尿液。
组I：服用两个片剂，饮水&吸烟→在1小时之后，第一次收集尿液，饮水&吸烟→在1小时之后，第二次尿收集尿液&吸烟→在1小时之后，第三次收集尿液，服用两个片剂，饮水&吸烟→在1小时之后，吸烟→在1小时之后，第四次收集尿液，服用两个片剂，饮水&吸烟→在1小时之后，吸烟-＞在1小时之后，吸烟-＞在1小时之后，第五次收集尿液。
组II：服用六个片剂，饮水&吸烟→在1小时之后，第一次收集尿液，饮水&吸烟→在1小时之后，第二次收集尿液&吸烟→在1小时之后，第三次收集尿液，饮水&吸烟→在1小时之后，吸烟→在1小时之后，第四次收集尿液，饮水&吸烟→在1小时之后，吸烟→在1小时之后，吸烟→在1小时之后，第五次收集尿液。
立即在-20℃下贮存收集的尿液。在48小时之后，将尿中烟碱的重要代谢物可替宁进行定量化。
  第1次   第2次   第3次   第4次   第5次
对照   组I中可替宁的平均值(μM) 16.46 10.84 12.59 13.84 9.98
  组II中可替宁的平均值(μM)   34.86   15.48   21.49   28.59   19.14
  组I中可替宁的平均值(μM)   19.29   11.95   18.51   18.88   16.32
  组II中可替宁的平均值(μM)   42.26   31.37   32.72   36.72   25.48
  组I中可替宁的增加(％)   17.2   10.2   47.0   36.4   63.5
  组II中可替宁的增加(％)   21.2   102.6   52.3   28.4   33.1
表1
当以片剂给药时，与仅饮用水相比，尿中可替宁数值增加60-100％。试验期间从组I收集的尿液中含有的可替宁保持在一个浓度，而组II尿液中的可替宁浓度，在10hr之后几乎与对照组的相同。
实施例7
功能药剂对亚硝基吗啉产生的抑制效果
此试验涉及体外试验，体外试验是关于当亚硝化剂如亚硝酸、亚硝酸酯、硫代酸酯、无水亚硝酸、亚硝酰卤、金属亚硝酰和无机金属亚硝酸盐配合物，与胺或包含其它氮的化合物反应，以形成致癌物如亚硝胺或N-亚硝基化合物时，功能药剂是否抑制以上致癌物的产生。
试验的进行是根据美国专利No.5,087,671(用于清除亚硝化剂的聚合物)和通过应用DBA(直接巴比土酸)方法，该方法用来检测尿液中的可替宁，以及气相色谱的预处理方法(Joseph，D.，Lajos H.，Nigel，H.，Stanley，I.R.，和Timothy，T.(1992)J.Chromatogr.，579，93-98)。
亚硝胺副产物主要是胺和亚硝化剂反应的结果。首先从亚硝酸盐如亚硝酸钠(NaNO2)或亚硝酸钾(KNO2)在酸中形成亚硝化剂，形成的产物是亚硝酸(HNO2)。
(化学反应式1)
Figure C0280532700201
胺或含氮化合物亚硝化剂                            亚硝胺
EGCG、槲皮素、儿茶素、维生素C和粉状绿茶用作对照组。每个试样以2.5，5，10，15，20mg/ml的浓度使用。不包含吗啉的200mM硝酸钠用作阴性对照物。每个反应中，不含有亚硝化剂NaNO2的试样作为空白。
将每个试样按照浓度加入到15ml的corning试管中，并标明空白、测试样和阴性对照。将1ml冰乙酸加入到每个试管中，将100μl的2M NaNO2加入到除空白的每个试管中，加入蒸馏水使总体积为2ml。在37℃下反应10分钟之后，加入176μl吗啉使其浓度为2M，在37℃下进一步反应30分钟。加入3.8ml的5N NaOH以设定pH10-12而停止反应。根据DBA方法，对试样进行测量，与空白组(未加入NaNO2)和阴性对照组(未加入吗啉和加入200mM NaNO2)比较。结果见图13。
如以下计算公式1测量亚硝基吗啉的产生速率(NMOR％)。
(计算公式1)
NMOR％＝[(t0-空白)-(t30-空白)]/(t0-空白)
空白；不包含亚硝化剂NaNO2的试样
t0；包含200mM的NaNO2而没有吗啉的试样
t30；在亚硝基吗啉产生中正常反应的试样。
如图13所示，本发明用于分解烟碱的功能药剂在20mg/ml浓度下，显示出和纯化的槲皮素或儿茶素一样的对从吗啉产生亚硝基吗啉有75％的抑制。即，本发明的功能药剂抑制致癌物亚硝基化合物的产生。
实施例8
用于分解烟碱的功能药剂对细胞色素P450活性抑制效果的试验
细胞色素P450(以下称为“CYP”)是在肺或肝中用来解毒的主要酶。各种CYP在肝中各有不同的功能，其中CYP2A6、2B6、2C8、2C9、2D6、2E1、2F1涉及从烟碱到可替宁代谢(Yamazaki，H.，Inui，Y.，Yun，C.H.，Guengerich，F.P.，和Shimada，T.(1992)Carcinogenesis，13，1789-1794；Code，E.，Crespi，C.，Penman，B.，Gonzalez，F.，Chang，T.，和Waxman，D.(1997)DurgMetab.Dispos.，25，985-993)。NNK是对实验室动物的前致癌物，它由CYP1A2、2A6和3A4代谢成致癌物。图14显示烟碱的代谢。
本试验在由Aroclor1254(Sigma，USA)诱导大鼠(Sprague-Dawley鼠)肝的CYP，并取出肝之后，测量各种试验材料对与NNK活化相关的CYP的抑制效果。详细的试验方法如下。
以500mg/kg的剂量，将Aroclor1254注入7周龄雄性大鼠(Sprague-Dawley鼠)的腹部。在5天之后，将肝在无菌状态下取出，用0.15M的KCl溶液在4℃下匀浆。匀浆后在9000g离心分离10分钟，分离得到上清液并用于试验。通过使用如下物质测量CYP的活性：戊氧基试卤灵(pentoxyresorufin)(Sigma，美国)，它是CYP 2B/1/2/4的底物；乙氧基试卤灵(ethoxyresorufin)(Sigma，美国)，它是CYP 1A1的底物和甲氧基试卤灵(methoxyresorufin)(Sigma，美国)，它是CYP 1A2的底物。同样，将EGCG，槲皮素，儿茶素和粉状绿茶用作对照组和实施例1的功能药剂比较。从肝取出的上清液和每种CYP的具体底物，使用以上的反应试样(抑制材料)对CYP活性的抑制效果进行比较。如果底物被酶分解并显示荧光，则用荧光分光光度计(在522nm下激发和在586nm下发射)测量酶活性。每个试样的浓度为0.1、0.5、1.0和2.0mg/ml，从肝取出的蛋白质数量固定为500μg/ml。每种底物含有2.5μM原液，在加入10μl之后最终变成25nM。20μl的5mM β-NADPH(Sigma，美国)用作辅酶。然后，加入50mM Tris-HCl(pH7.4)缓冲溶液将最终体积变成1ml。反应在37℃下进行20分钟，加入2ml甲醇之后停止，在2000rpm下离心分离2分钟。用RF-5301PC荧光分光光度计(SHIMADZU，日本)从上清液测量酶活性(在522nm下激发和在586nm下发射)。结果显示于图15。
图15是显示本发明用于分解烟碱的功能药剂是否影响CYP酶活性的图。(A)显示槲皮素的CYP抑制效果，(B)显示儿茶素的情况，(C)显示功能药剂的情况，(D)显示粉状绿茶的情况。PROD表示戊氧基试卤灵脱烷基酶(CYP 2B1/2/4)，EROD表示乙氧基试卤灵脱烷基酶(CYP 1A1)，和MROD表示甲氧基试卤灵脱烷基酶(CYP 1A2)。功能药剂抑制所有的PROD、EROD和MROD。
图16显示由本发明功能药剂对CYP 1A2酶活性的抑制效果。抑制CYP1A2的活性的顺序为槲皮素＞＞功能药剂＞＞儿茶素＝粉状绿茶。确认1.0mg/ml的功能药剂能完全抑制CYP 1A2的活性。
此外，用纯化的RECOSystem CYP 1A2(PanVera Co，美国)，测量功能药剂，EGCG，槲皮素，儿茶素和粉状绿茶的酶活性抑制效果。
酶混合物的组合物包括0.5uM CYP1A2，0.2μM NADPH P450还原酶，0.5μg/uL CHAPS，0.1μg/uL脂质体(二月桂酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰胆碱、二月桂酰基磷脂酰胆碱(1∶1∶1))，3mM还原性谷胱甘肽和50mMHEPES/KOH(pH7.4)。缓冲溶液是1M磷酸钾/磷酸钠。将768μl三级蒸馏水，126.7μl的CYP 1A2缓冲溶液，和5.3μl的1mM甲氧基试卤灵顺序加入以制备950μl溶液，在37℃下加热。将5μl酶活化抑制材料加入到85μl缓冲溶液和底物混合物中，以分别制备0.1、0.5、1.0和2.0mg/ml的最终浓度。反应在37℃下开始，同时加入5μl的CYP 1A2酶混合物和5μl的50mMNADPH。将反应保持20分钟，加入1ml甲醇停止。通过使用RF-5301PC荧光分光光度计(SHIMADZU，日本)测量酶活性。
图17是显示本发明的功能药剂对纯化的CYP 1A2酶活性抑制效果的图。抑制CYP 1A2的活性的顺序是EGCG＞＞功能药剂＞＞槲皮素＞＞粉状绿茶＞＞儿茶素。确认0.1mg/ml的功能药剂( )完全抑制纯CYP 1A2的活性。
实施例9
用于分解烟碱的功能药剂的抗突变效果
NNK(4-甲基亚硝氨基-1-3-吡啶基-1-丁酮)以确定的浓度(约0.1-0.5ng)包含在烟草中，并且当烟碱在体内代谢时也可形成。这是体内毒性非常大的物质。NNK在身体内由酶如P450代谢后诱导肺癌。同样，苯并芘以少量包含在烟草中并且是诱变剂。
为确认本发明的功能药剂是否具有抗突变的效果，能抑制由NNK(Chemsyn.Lab.美国)和苯并芘(Sigma，美国)诱导的突变，用要求组氨酸的细菌株鼠伤寒沙门氏菌TA100和TA1535，进行艾姆斯试验(Maron，D.，Ames，B.N.(1983)沙门菌诱变性试验的改进方法，突变研究(Revised methodsfor the Salmonella mutagenicity test.Mutation Research)113，173-215)。
以500mg/kg的剂量，将Aroclor1254(Sigma，美国)注入7周龄雄性大鼠(Sprague-Dawley鼠)的腹部。在5天之后，将肝脏在无菌状态下取出，用0.15M的KCl溶液在4℃下匀浆。匀浆后在9000g下离心分离10分钟，分离上清液以制备S-9混合溶液，用于试验。S-9混合物溶液的组成是5ml的0.2M磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)，0.4ml的0.1M NADP，0.05ml的1M葡萄糖-6-磷酸，0.2ml的0.4M MgCl2，1.65M KCl，3.35ml三级蒸馏水和1ml肝，得到10ml的S-9混合物溶液。试验材料是EGCG，槲皮素，儿茶素，粉状绿茶和功能药剂，它们在由0.2μm过滤器过滤之后使用。
将鼠伤寒沙门氏菌TA100和TA 1535在营养的培养基(Difco.Lab.美国)中培养12小时。将0.1ml的12小时培养溶液，0.1ml试验材料，0.5ml的S-9混合溶液，0.1ml的NNK(10mg/ml)或0.1ml苯并芘(20μg/ml)混合。将最终试验材料处理为具有2，1，0.5，0.25，0.125μg/板的浓度。在37℃下静置混合物20分钟之后，将2ml上清液琼脂(包含0.05mM组氨酸，0.05mM生物素)加入，将它们铺展到His-板培养基上。每容量的板培养基具有3个片。在37℃下培养48小时之后，记录菌落的数目，这些菌落是回收的突变体。抗突变活性指示为His+回收突变体的抑制速率。根据以下计算公式2得出突变的抑制效果。
(计算公式2)
突变的抑制效果(％)＝100×[(a-b)/(a-c)]
a：由变异原诱导的His-回收突变体的菌落数目
b：由变异原和试验材料诱导的His+回收突变体的菌落数目
c：自然His+回收突变体的菌落数目
图18显示由本发明用于分解烟碱的功能药剂对NNK诱变性抑制效果的结果。(A)和(B)显示由功能药剂(■)、粉状绿茶(●)、槲皮素(◆)和儿茶素(▲)对鼠伤寒沙门氏菌TA 100突变的抑制效果。(C)和(D)显示由功能药剂(■)、粉状绿茶(●)、槲皮素(◆)和儿茶素(▲)对鼠伤寒沙门氏菌TA1535突变的抑制效果。包含在培养基中的NNK浓度是1mg/板。
仅采用NNK处理的鼠伤寒沙门氏菌TA 100自然回收突变体的数目是173±13，鼠伤寒沙门氏菌TA1535自然回收突变体的数目是39±12。相反，当处理NNK和0.5mg/板的功能药剂时，很难形成鼠伤寒沙门氏的菌落。因此，可以确认存在对于突变的抑制效果。
图19是显示使用本发明功能药剂和试验材料，由苯并芘引起的突变的抑制效果。它显示由功能药剂(■)、粉状绿茶(●)、槲皮素(◆)和儿茶素(▲)对鼠伤寒沙门氏菌TA100突变的抑制效果。包含在培养基中的苯并芘浓度是2μg/板。用苯并芘处理的鼠伤寒沙门氏菌TA 100自然回收突变体的数目是128+9。相反，本发明的功能药剂有效抑制由苯并芘的突变产生。
实施例10
用于分解烟碱的功能药剂的抗氧化效果
尽管许多疾病的原因仍然不清楚，但是已知毒性自由基是引起许多种疾病的媒介，如动脉硬化(Palinski，W.，Rosenfeld，M.E.，Yla，H.S.，Gurtner，G.C.，Socher，S.S.，Butler，S.W.，Carew，T.E.，Steinberg，D.，和Witztum，J.L.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.，86，1372-1376)、由于血管收缩的局部贫血(Hammond，B.，Kontos，H.A.，和Hess，M.L.(1985)Can.J.Physiol.Pharmacol.，63，173-187)、炎症(Cheeseman，K.H.，和Forni，L.G.(1988)Biochem.Pharmacol.，37，4225-4233)、癌症(Weitzman，S.A.，Weitberg，A.B.，Clark，E.P.，和Stossel，T.P.(1985)Science，227，1231-1233)和关节风湿病(Fantone，J.C.，和Ward，P.A.(1985)Human Pathol.，16，973-978)。因此，自由基清除剂可期望成为通过降低自由基水平的有效的治疗法。因而，已经研究了安全、有效抗氧剂的开发。
在本试验中，通过使用DPPH(1，1-二苯基-2-苦基偕腙肼)和SOD(超氧化物歧化酶)试剂盒(Wako，日本)测试功能药剂，粉状绿茶，槲皮素和儿茶素的O2 -清除效果。
将DPPH溶于以2∶1比例混合的乙醇和水的溶剂中，设定浓度为2×10-4M。使功能药剂，粉状绿茶，槲皮素和儿茶素的浓度为DPPH的1/10或更小。将1.5ml的DPPH放入比色杯中，将1.5ml抗氧剂溶液加入并均匀混合。混合后马上测量吸光度随时间的变化(523nm)并计算分解速率。
(计算公式3)
分解速率＝(DPPH的初始吸光度-在加入每个试样之后不同时间的吸光度)/DPPH的初始吸光度×100
SOD试剂盒的原理是当黄嘌呤氧化酶对黄嘌呤起作用时，产生O2 -。产生的O2 -降低共存的NO2 -TB(四唑氮蓝)而显示成色反应。然而，超氧化物歧化酶(SOD)或除去产生O2 -的材料能抑制成色反应。通过使用此原理，可以测量对产生的O2 -的抑制效果。涉及O2 -清除效果的试验方法如下。将0.4mM黄嘌呤，0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH8.0)和0.1ml各试样加入到1ml的0.048单位/ml黄嘌呤氧化酶中。将它们均匀混合，在37℃下加热20分钟。通过加入2ml的69mM SDS(十二烷基硫酸钠)停止酶反应，在560nm下测量吸光度。水用作对照物。用相同的方法进行酶和试剂的空白试验。表2显示详细情况。
  主要试验   空白试验
样品(s) 空白(B1)   样品空白(S-B1)   试剂空白(B1-B1)
  试样   0.1ml(试样)   0.1ml(蒸馏水)   0.1ml(试样)   0.1ml(蒸馏水)
  成色溶液   1ml   1ml   1ml   1ml
  酶溶液   1ml   1ml   -   -
  空白溶液   -   -   1ml   1ml
表2
抗氧化效率的计算方法如下。
(计算公式4)
SOD活化值(抑制速率％)＝(EB1-EB1-B1)-(ES-ES-B1)/(EB1-EB1-B1)×100
图20是显示使用DPPH(1，1-二苯基-2-苦基偕腙肼)测定功能药剂、粉状绿茶、槲皮素和儿茶素，自由基清除效果的图。EGCG的DPPH自由基清除效果比功能药剂和儿茶素高两倍。然而，功能药剂的DPPH自由基清除效果比粉状绿茶高四倍。
图21是显示通过使用SOD试剂盒测定功能药剂、粉状绿茶、槲皮素和儿茶素的O2 -清除效果的图。槲皮素显示最高的抗氧化效果，功能药剂显示与纯化的儿茶素有相同效果。
实施例11
槲皮素的定量化
槲皮素是独特地从光合作用的植物发现的黄酮类化合物。当进行正常的饮食时，大约每天消耗约25mg槲皮素。
此外，近来槲皮素主要在临床中用作抗癌药物(Ferry，D.R.，Smith，A.，Malkhandi，J.，Fyfe，D.W.，deTakats，P.G.，Anderson，D.，Baker，J.，Kerr，D.J.(1996)Cancer Res.2(4)：659-68)。已报导了许多证据表明槲皮素优异地用作抗癌药物。报导槲皮素在10μM浓度下，抑制细胞株的繁殖如乳癌(Scambia，G.，Ranelletti，F.O.，Benedetti，Panici，P.，Piantelli，M.，Bonanno，G.，De Vincenzo，R.，Ferrandina，G.，Pierelli，L.，Capelli，A.，Mancuso，S.(1991)Cancer Chemother Pharmacol.28(4)：255-8)，白血病(Larocca，LM.，Piantelli，M.，Leone，G.，Sica，S.，Teofili，L.，Panici，P.B.，Scambia，G.，Mancuso，S.，Capelli，A.，Ranelletti，F.O.(1990)急性淋巴样和髓样白血病中的II型雌激素结合位置：雌激素和黄酮类化合物的生长抑制效果(Type IIoestrogen binding sites in lymphoid and myeloid leukaemias：growth inhibitoryefiect of oestrogen and flavonoids)Br J Haematol.75(4)：489-96)，子宫癌(Scambia，G.，Ranelletti，F.O.，Benedetti，Panici，P.，Bonanno，G.，DeVincenzo，R.，Piantelli，M.，Mancuso，S.(1990)槲皮素和顺氯氨铂对卵巢癌细胞生长的协同抗增生活性(Synergistic antiproliferative activity of quercetinand cisplatin on ovarian cancer cell growth)Anticancer Drug.1(1)：45-8)，胃癌(Yoshida，M.，Sakai，T.，Hosokawa，N.，Marui，N.，Matsumoto，K.，Fujioka，A.，Nishino，H.，Aoike，A.(1990)FEBS Lett.15；260(1)：10-3)，和结肠癌(Agullo，G.，Gamet，L.，Besson，C.，Demigne，C.，Remesy，C.(1994)Cancer Lett.25；87(1)：55-63)。
在本试验中，将用于分解烟碱的功能药剂中含有的槲皮素定量化。为提取包含在功能药剂或粉状绿茶中的槲皮素，将它们溶于甲醇和DMSO(4∶1)混合提取溶液中，剧烈搅拌30秒。在9000rpm下对混合的溶液进行离心分离10分钟，取出上清液。将上清液和等量的蒸馏水混合，注入反相柱(Delta-pak C18，300，Waters510)。流动相是56％的0.1M乙酸铵(pH5.15)和44％甲醇，流量是0.3mL/min。在375nm下由M720吸光度检测器(Yongin，Co.韩国)测量吸光度。
图22是显示由HPLC(高效液相色谱)定量化的，在用于分解烟碱的功能药剂中的槲皮素含量的图。图22中A的(a)显示槲皮素浓度60，120，160ng的标准峰和B的(b)显示功能药剂溶液的槲皮素峰(数目8)，因而功能药剂包含56ng/mg的槲皮素。然而，如图22的C所示，甚至在5mg的粉状绿茶中也没有检测出槲皮素峰。
实施例12
功能药剂的抗癌活性
在烟草烟雾中发现的致癌物中，NNK对诱导各种实验动物的肺癌显示出高特异性(Hoffmann，D.，Rivenson，A.，Chung，F-L.，和Hecht，S.S.(1991)Crit.Rev.Txicol.，21，305-311；国际癌症研究机构(International Agency forResearch on cancer)(1986)Tobacco Smoking，38卷，Lyon，法国：IARC)。同样，NNK是一种亚硝胺，是在烟草中发现的强致癌物。已经有许多涉及绿茶，特别是EGCG抑制肺癌产生的效果的文章(Wang，Z.Y.，Hong，J.Y.，Huang，M.T.，Reuhl，K.R.，Conney，A.H.和Yang，C.S.(1992)Cancer Res.52，1943-1947；Xu，Y.，Ho，C.T.，Amin，S.G.，Han，C.，和Chung，F.L.(1992)Cancer Res.52，3875-3879；Chung，F.L，Wang，M.，Rivenson，A.，latropoulos，M.J.，Reinhardt，J.C.，Pittman，B.，Ho，C.T.和Amin，S.G.(1998)Cancer Res.58，4096-4101)。
A/J小鼠，3周龄，购自SLC Inc.(日本)。将动物保持在特定的无病原体条件和标准条件(五个小鼠/笼；20+5℃，50±15％，12h亮-暗循环)的环境中。在PBS中制备NNK的原液(5mg/ml)。使用由Xu等人(1992)建立的模型研究功能药剂对NNK诱导的肿瘤发生的效果。
当A/J 小鼠为6周龄时，将24只雄性小鼠分成以下三组：N-组(5只动物，仅有水)，C-组(10只动物，饲以NNK和水)和T-组(9只动物，饲以NNK和功能药剂)。在动物试验中，在给予NNK之前三周，每个组是以水和0.6％功能药剂作为饮用源。在三周之后，除N-组以外，向其它组(C-组和T-组)给药每周三次，共10周。向A/J小鼠给予NNK的单一i.p.剂量(34.95mg/kg体重)。
在六周之后，将动物称重，吸入二氧化碳处死。在生物测定期间，小鼠可随意得到食物和水(或功能药剂)，将粉末进料器清洁并用新鲜饮食补充三次。对于给药期间每周记录体重一次，对于生物测定的剩余时间，每个月记录体重一次。
对所有的动物进行完全尸体解剖，完全解剖由韩国化学技术研究院(Korea Research Institute of Chemical Technology，KRICT)进行。将肺、肝和胃取出，称重，在10％中性缓冲福尔马林中固定。在固定之后，将组织修整，嵌入石蜡中，切片成5μm厚，用苏木精和曙红着色。为扩展评价，将肺在大约3mm间距下连续切片。用显微镜检查所有的截面。通过将有肿瘤的动物数目除以每组中动物数目确定肿瘤发生率。
测量每组的平均重量并示于图中。
图23是显示各组中A/J小鼠重量的图，它指示用于分解烟碱的功能药剂对NNK诱导的肺癌产生的抑制效果。
鼠菌落的筛选指示在肺肿瘤生物测定结束时，没有病毒或细菌感染。在处死时，在喂给NNK+功能药剂的小鼠肝、肺和胃上，没观察到涉及毒性的显著病理学变化。本试验中的表3显示功能药剂作为化学预防剂对肺肿瘤发生的效果。
表3显示功能药剂对肺癌产生的抑制效果。
如希望的那样，N-组小鼠没有自然肿瘤的发生。C-组的结果是在10周之后，55.6％(80/144)的小鼠带有支气管-肺泡腺瘤。当在饮水中给予0.6％功能药剂时(T-组)，显著降低肺腺瘤(43.6％，55/126)。此外，在支气管-肺泡增生的病灶中，T-组的肿瘤发生率显著地从69.4％降低到46.8％。此外，也在C-组(3个小鼠)和T-组(2个小鼠)的一些小鼠中观察到肝微肉芽瘤的发生。在两个组没有观察到胃肿瘤的发生。此结果显示在NNK处理的小鼠中，功能药剂对肺肿瘤形成的抑制效果。与C-组相比，T-组的肿瘤发生率相应于这些组中肺肿瘤形成降低了17％。
  N-组   1   2   3   4   5
  肺   N(15)   N(16)   N(15)   N(15)   N(15)
  肝   N   N   N   N   N
  胃   N   N   N   N   N
  C-组   1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   总和   总计
  肺   (14)   (14)   (14)   (15)   (14)   (16)   (15)   (13)   (14)   (15)   (144)   144
  腺瘤   0/2   6/5   2/4   1/3   5/7   3/9   1/4   3/4   6/7   4/4   31/49   80
  增生   2/5   4/4   1/6   6/7   2/8   3/6   5/6   6/6   3/7   4/9   36/64   100
  肝   N   -   N   N   -   N   N   N   -   N
  微肉芽瘤 - + - - +++ - - - + -
  胃   N   N   N   N   N   N   N   N   N   N
  T-组   2   3   4   5   6   7   8   9   10   总和   总计
  肺   (14)   (14)   (14)   (14)   (15)   (14)   (14)   (15)   (12)   (126)   126
  腺瘤   1/5   2/5   2/8   3/4   4/2   6/1   0/3   1/2   3/3   22/23   55
  增生   0/5   2/11   7/5   1/2   2/6   2/5   2/1   2/3   1/2   19/40   59
  肝   -   -   N   -   -   N   N   N   N
  微肉芽瘤 - - - + +++ - - - -
  胃   N   N   N   N   N   N   N   N   N
(N：正常，+：最小，++：适度，+++：中等)
表3
如上所述，本发明的功能药剂或饮料促进烟碱的分解和抑制致癌物—亚硝基化合物的产生。此外，功能药剂抑制细胞色素P4501A2的活性而抑制由NNK产生致癌物，并显示抗氧剂效果以及抑制由NNK和苯并芘引起的突变和肺癌的产生。
实施例13
毒性试验
1.动物
物种和品系：特定的无病原体Sprague-Dawley鼠(BioGenomics Inc.)
Sprague-Dawley鼠是毒性试验中使用最广泛的试验动物的一种。由于容易获得该鼠的基本信息，这在用该鼠来评定试验结果中是非常有益的资料。此外，大鼠已经由保证人选择以满足啮齿类物种中毒性测试的规范性要求。
使24只4周龄、重72.2-81.3g的雄鼠进行7天的检疫和在SPF条件下驯化之后，用于实验。在处理的当天，体重为105.7-118.7g的20只雄鼠用于此研究。使24只4周龄、重69.1-80.3g的雌鼠进行7天的检疫和在SPF条件下驯化之后，用于实验。在处理当天体重为97.7-112.4g的20只健康雌鼠用于此研究。
2.饲养条件
环境条件：动物室(动物护理区III中的No.2室)保持在23±3℃的温度，55±15％的相对湿度，10-20次/hr的空气通风，以及150-300勒克斯的光强度。使用12hr亮/暗循环。在动物设施中的所有人员穿着的消毒服装、软帽、口罩和手套均在121℃下高压灭菌20min。在由美国实验动物护理委任协会(American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care，AAALAC)批准的设施中进行此试验。所有的程序由我们的实验动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)批准。
在整个检疫和观察期间，5只动物饲养在不锈钢网笼(220W×41OL×200H mm)中。
3.饮食
用于实验动物的粒料购自PMJ国际营养股份有限公司(PMJ NutritionalInternational Inc)。γ-射线辐照(10.8kGy)，并随意给予。
由UV照射自控出水装置随意给水。
在韩国Daejeon区域卫生与环境研究院对水进行分析。
4.给药方法
剂量选择：由于试验项目是开发为食品添加剂，所以希望此项目的毒性非常低。因此，选择5000mg/kg用于作为极限试验剂量的最高剂量，然后以2.5的通常比例，分别选择2000和800mg/kg作为中等和低剂量。也加入对照组。
组别 性别 动物数 动物号   体积(ml/kg)   剂量(mg/kg)
对照   雄性   5   1-5   10   0
  雌性   5   21-25   10   0
T1   雄性   5   6-10   10   800
  雌性   5   26-30   10   800
T2   雄性 5 11-15 10 2000
  雌性   5   31-35   10   2000
T3   雄性   5   16-20   10   5000
  雌性   5   36-40   10   5000
表4
试验项目：在处理之前，功能药剂立即溶于消毒蒸馏水后使用，并通过由高剂量组逐步稀释来制备低剂量组的药液。载体对照鼠(the vehicle controlrats)仅供给消毒蒸馏水。
途径和处理：将鼠在给药之前禁食过夜，试验项目通过管饲法口服给药。在给药之后，将鼠继续禁食3-4小时。
给药：用管饲法以单一剂量对鼠给药，采用10m1/kg体重的剂量体积。根据处理当日的体重计算施加的体积。
5.观察、测量和检查
死亡率和临床观察：每小时检查临床体征和死亡率直到给药之后6小时，然后一天一次到第14天。
体重：在本实验项目进行之前，和在处理之后的第1，3，7，和14天测量动物的单个体重。
6.结果
死亡率和致死剂量：在试验期间，两种性别中均没有发现由于本试验项目的处理而致动物死亡。因此，预测试验项目的致死剂量在两种性别中认为是大于5000mg/kg。
临床病征：在任何剂量组中，没有观察到由于试验项目处理导致的临床病征。
总体发现：在处理之后第14天尸体解剖时，在任何剂量组中没发现处理相关的效果。
为评价由单一口服剂量的功能药剂的急性毒性，分别在0，800，2000，和5000mg/kg体重的剂量水平下，分别向5只雄性和雌性Sprague-Dawley鼠由管饲法给予功能药剂。在14天观察期间测量的参数是死亡率、临床病征、体重变化和总体发现。
在Sprague-Dawley鼠的死亡率、临床体征，、体重变化和尸体解剖发现中，没有与处理相关的效果。在最高剂量组中，在平均极限试验剂量的5000mg/kg剂量水平下进行试验项目，研究结果显示高致5000mg/kg体重的功能药剂单一口服剂量对大鼠并不引起急性毒性效果。
根据结果，得出的结论是在5000mg/kg 或以下功能药剂的单一口服剂量，对Sprague-Dawley鼠并不引起任何毒性效果，而且对于两种性别，最小致死剂量认为是大于5000mg/kg体重。

Claims (6)

1.一种用于分解烟碱的功能药剂，通过干燥包括如下物质的组合物来制备：
(a)绿茶叶提取的绿茶有效成分的粉末；
(b)桑树叶提取物，该提取物通过在水中于60℃～95℃浸渍桑树叶10～40分钟并经过滤和浓缩制备得到；
(c)通过压榨苹果制得的苹果汁；
(d)甘草根提取物，该提取物通过在水中于60℃～100℃浸渍甘草根130～160分钟并经过滤和浓缩制备得到；和
(e)桔皮提取物，该提取物通过在水中于60℃～100℃浸渍桔皮130～160分钟并经过滤和浓缩制备得到；
其中，绿茶叶提取的绿茶有效成分的粉末、桑树叶、苹果汁、甘草根和桔皮的重量份之比为50～500∶7.5～75∶3～30∶3～30∶1.5～15。
2.如权利要求1所述的用于分解烟碱的功能药剂，其中该药剂进一步含有包括如下物质的组合物：
(a)通过压榨银杏果并经过滤提取的银杏果提取物；
(b)通过压榨芹菜并经过滤提取的芹菜提取物；和
(c)通过压榨柠檬并经过滤提取的柠檬提取物；
其中，银杏果、芹菜和柠檬的重量份之比为7.5～75∶3～30∶3～30。
3.如权利要求1所述的用于分解烟碱的功能药剂，其中该药剂用作食品、食品添加剂、饮料或饮料添加剂。
4.如权利要求1所述的用于分解烟碱的功能药剂，其中该药剂是包装为胶囊形式。
5.一种用于分解烟碱的功能饮料，该饮料包含0.1-5wt％的权利要求1所述的功能药剂。
6.一种制备用于分解烟碱的功能药剂的方法，包括：
(a)通过压榨和过滤银杏果、芹菜、苹果和柠檬制备的滤液；
(b)通过在水中于100℃浸渍甘草根和干桔皮120分钟，加入桑树叶于60～95℃浸渍10～40分钟，然后过滤，由此制备提取物；和
(c)混合步骤(a)中的滤液、步骤(b)中的提取物和绿茶提取的绿茶有效成分的叶粉末，过滤并进行喷雾干燥；
其中，绿茶提取的绿茶有效成分的叶粉末、桑树叶、苹果、甘草根、桔皮和银杏果、芹菜和柠檬的重量份之比为50～500∶7.5～75∶3～30∶3～30∶1.5～15∶7.5～75∶3～30∶3～30。
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