KR100446641B1

KR100446641B1 - 니코틴 분해음료 및 제재

Info

Publication number: KR100446641B1
Application number: KR20000020113A
Authority: KR
Inventors: 정종문
Original assignee: 주식회사 리젠 바이오텍; 정종문
Priority date: 1999-07-16
Filing date: 2000-04-17
Publication date: 2004-09-04
Also published as: KR20010014750A

Abstract

본 발명은 니코틴 분해음료 분해제재에 관한 것으로, 보다 상세하게는 니코틴 및 담배에서 나오는 여러 유독 물질들의 해를 억제하기 위하여 녹차엽, 상엽, 은행, 샐러리, 레몬 및 사과 등의 천연식품을 이용한 기능성 음료 및 제재에 관한 것이다. 본 발명의 기능성 음료 및 제재는 물에 비하여 니코틴 분해율이 2배 이상에 달하며, 인체에 무해하다.

Description

니코틴 분해음료 및 제재{A drink decomposing nicotine and a formulation decomposing the same}

[발명이 속하는 기술분야]

본 발명은 니코닌 분해음료 및 분해제재에 관한 것으로, 보다 상세하게는 니코틴 및 담배에서 나오는 여러 유독 물질들의 해를 억제하기 위하여 녹차엽, 상엽, 은행, 샐러리, 레몬 및 사과 등의 천연식품을 이용하여 제조한 기능성 음료 및 제재에 관한 것이다.

[종래기술]

흡연으로 인하여 체내로 흡수되는 강독성 물질인 니코틴은 무색 또는 연황색의 액체이며, 독성이 강하여 효과가 신속히 나타나며, 신경마디의 세포막 상에 작용하여 혈압상승, 골격근섬유 경련초래, 흥분으로 인한 구강내 마비 등을 일으킨다.

즉각적 니코틴의 위해성으로는 동공축소, 시야혼탁, 구토, 구역질, 복통, 설사, 소변조절 곤란, 후두 화상초래, 호흡곤란, 타액과 호흡기관에 분비물증가, 청색병, 심장 박동수 감소 등을 유발하며, 흡연기간이 장기화되면 니코틴이 체내에 집적되어 장기적으로 암질환, 고혈압, 구강질환 초래, 위산과다분비 촉진에 따른각종 위장질환과 동맥경화증을 비롯한 각종 순환계 질환을 일으킬 수 있다.

또한 노화촉진 등에 중요한 요인으로 작용하여 심하면 발작, 경련, 호흡마비, 근육경련 및 불필요한 혈압상승 등이 나타나게 된다. 또한 니코틴은 니코틴 유래 나이트로사민(nicotine-derived nitrosamine)에 의해서 매우 강력한 발암물질로 나타나게 되는데 매년 전세계적으로 흡연에 의해 나타나는 폐암과 폐질환 환자는 수억에 이른다.

1956년 Magee와 Barnes는 N'-NDMA(nitrosodimethylamine)이 쥐에서 매우 강력한 간암유발물질임을 증명하였고 (Magee, P. N., and Barnes, J. M. (1956) The production of malignant primary hepatic tumors in the rats by feeding dimethylnitrosamine. Br. J. Cancer 10. 114-122), 그 후 200 개 이상의 N-나이트로사민의 발암성(carcinogenic activities)이 30종 이상에서 확인되어져 왔다. 1962년 Druckrey와 Preussmann은 타바코 알칼로이드로부터 유도된 나이트로사민이 담배 연기에 존재할거라고 제시하였으며, 1964년 Boyland 등은 NNN(N'-nitrosonornicotine)이 쥐에서 폐암 유발물질(pulmonary carcinogen)이며 NAB(N'-nitrosoanabasine)은 쥐에서 식도암(esophageal tumors)을 일으킨다는 것을 보여주었다(Boyland, E., Roe, F. J. C., and Gorrod, J. W., (1964) Induction of pulmonary tumors in mice by nitrosonicotine, a possible constituent of tobacco smoke, Nature 202, 1126).

또한 Smith 등은 여러 가지 나이트로사민이 니코틴으로부터 형성되어진다는 것을 보여주었으며(Smith, P. A. S., and Loeppky, R. N. (1967) Nitrosativecleavage of tertiary amines. J. Am. Chem. Soc. 89, 1148-1152), Hecht 등은 NNK(4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone), NNA(4-(methylnitrosamino)-4-(3-pyridyl)butanal), NNN 그리고 많은 다른 산물들이 니코틴으로부터 형성되어진다는 것을 증명하였으며, NNK를 담배에서 검출하였다(Hecht, S.S., Chen, C. B., Dong, M., Ornaf, R. M., Hoffman, D., and Tso, T. C. (1977) Studies on nonvolatile nitrosamines in tobacco. Beitr. Tabakforsch. 9, 1-6). 도 1은 여러 가지 나이트로사민이 니코틴으로부터 형성되는 것을 보여준다.

이제까지 NNN, NNK, NNAL, NAT, NAB, iso-NNAN, 그리고 iso-NNAC의 일곱 개의 타바코-특이적 나이트로사민을 타바코 생산물에서 동정하였으며, NNN, NNK, NAT는 일반적으로 다른 것보다 훨씬 많은 양이 검출되어졌고, NNN, NNK, NNAL은 아주 강력한 발암물질임이 명백해졌다.

한편, 니코틴은 두 단계의 과정에 의해 70-80 %가 코티닌(cotinine)으로 대사 되어지며, 사이토크롬 P₄₅₀과 사이토솔릭 알데하이드 옥시지네이즈(cytosolic aldehyde oxygenase)가 여기에 관여한다. 니코틴의 대사는 개인에 따라 3배정도 까지 차이를 보이며, 이러한 차이는 흡연행위의 중요 결정인자가 되어 질 수 있다. 도 2는 상기 두 단계 과정을 보여준다.

70-80 %의 코티닌 중 10-15 %가 변화되지 않고 소변으로 배출되며, 나머지는 키토산(keto acid)으로 대사되고, 다시 상기 키토산의 85 %는 하이드록시 산으로 대사되어 소변으로 배출되어진다. 또한 니코틴의 4 %는 FMO(flavin-containingmonooxygenase)에 의해 니코틴-1-N-옥사이드(Nicotine-1-N-oxide)로 되며, 이것의 대부분은 그대로 소변으로 배출되어진다. 따라서 니코틴의 80-90 %는 비뇨대사로써 배출되어진다고 할 수 있다.

니코틴은 여러 가지 CYP에 의해서 코티닌으로 대사 되어지는데, 그 중에서 CYP2A6이 주요 역할을 담당하고 있다. 또한 CYP2A6은 A/J 마우스에서 NNK와 NNN의 α-수산화(hydroxylation)에 관여하여 도 3에서와 같이 DNA의 메틸화(methylation)를 유도하고, O⁶-메틸구아닌(methylguanine) (O⁶MeG)을 형성하여 GC →AT 천이 오류(transitional mispairing)를 초래하며, K-ras 광종양(proto-oncogene)의 활성(activation)에 관여한다고 보고되어졌다. 또한 사이토크롬(Cytochrome)P₄₅₀에 의한 NNK 유도성 폐 종양형성(tumorigenesis)은 도 4에서와 같이 니코틴과 코티닌 등의 경쟁적 저해제(competitive inhibitor)에 의해 NNK의 대사(metabolic) 활성화를 방해한다는 것이in vitro와in vivo상에서 증명되어져 왔다.

따라서 본 발명은 체내 흡연의 유해성을 인식하여 흡연으로 인하여 발생하는 체내 유해물질의 분해효능 증진을 위한 니코틴 분해음료 및 분해제재를 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 타바코-특이적 나이트로사민과 타바코 알칼로이드 전구물질의 구조를 나타낸 것이고,

도 2는 니코틴이 코티닌으로 변환하는 두 단계 과정을 나타낸 것이고,

도 3은 NNK 활성화의 주요단계를 나타낸 것이고,

도 4는 NNN, 니코틴 및 NNK 간의 구조적 유사성을 나타낸 것이고,

도 5는 직접혼합에 의한 니코틴의 분해능을 비교한 것이고,

도 6은 직접혼합에 의한 니코틴 분해음료의 효능지속시간 실험결과이고,

도 7은 FLCFL5 세포에 의한 니코틴 분해능을 비교한 것이고,

도 8은 FLCFL5 세포내에 침착되어 있는 니코틴 분해음료 성분에 의한 니코틴 분해능 측정결과이고,

도 9는 FLCFL5 세포에 의한 니코틴 분해음료의 효능지속시간 실험결과이고,

도 10은 제노푸스 미숙란에 의한 니코틴 분해능을 비교한 것이고,

도 11은 제노푸스 미숙란에 의한 니코틴 분해음료의 효능지속시간 실험결과이고,

도 12는 임상실험에 의한 니코틴 분해능 측정의 실험방법을 개략적으로 나타낸 것이고,

도 13은 사람 뇨에 존재하는 코티닌의 농도를 비교한 것이고,

도 14는 대조군에 대한 실험군의 니코틴 분해율의 비를 나타낸 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 50 내지 500 중량부의 녹차엽, (b) 20 내지 300 중량부의 상엽, (c) 10 내지 50 중량부의 은행을 즙으로 만든 액,(d) 10 내지 50 중량부의 샐러리를 즙으로 만든 액, (e) 1 내지 20 중량부의 레몬을 즙으로 만든 액 및 (f) 1 내지 20 중량부의 사과를 즙으로 만든 액을 포함하는 혼합액을 60 내지 95 ℃의 물에서 우려낸 것을 특징으로 하는 니코틴 분해 음료를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 기능성 음료를 건조시켜 분말로 만든 기능성 제재를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 체내 흡연의 유해성을 인식하여 이의 분해효능증진을 위한 연구를 하던 중 녹차엽, 상엽, 은행, 샐러리, 레몬 및 사과를 혼합하여 적당한 온도의 물에서 우려내는 경우에 니코틴 분해능이 뛰어난 기능성 음료가 되는 것을 발견하였으며, 상기 발견을 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 니코틴 분해음료의 구성은 다음과 같다.

본 발명의 니코틴 분해음료는 (a) 50 내지 500 중량부의 녹차엽, (b) 20 내지 300 중량부의 상엽, (c) 10 내지 50 중량부의 은행을 즙으로 만든 액, (d) 10 내지 50 중량부의 샐러리를 즙으로 만든 액, (e) 1 내지 20 중량부의 레몬을 즙으로 만든 액 및 (f) 1 내지 20 중량부의 사과를 즙으로 만든 액을 포함하는 혼합액을 60 내지 95 ℃의 물에서 우려내어 제조한다. 바람직하게는 상기 니코틴 분해 음료는 (a) 녹차엽 100 내지 200 중량부, (b) 상엽 70 내지 150 중량부, (c) 은행 15 내지 25 중량부, (d) 샐러리 15 내지 25 중량부, (e) 6 내지 10 중량부의 레몬을 즙으로 만든 액 및 (f) 6 내지 10 중량부의 사과를 즙으로 만든 액을 사용하는것이 좋다.

또한 본 발명에서 상기 혼합액을 우려내는데 사용되는 물의 양은 적절하게 조정 가능하며, 필요에 따라서 본 발명의 기능성 음료는 적은 양의 물로 상기 혼합액을 우려내어 고농도의 니코틴 분해음료를 제조한 후 상기 고농도의 니코틴 분해음료에 물을 희석하여 니코틴 분해음료를 제조할 수도 있다. 바람직하기로는 상기 혼합액을 1,000 내지 20,000 중량부의 물에서 우려내는 것이 바람직하다.

또한 상기 니코틴 분해음료는 상기 혼합액의 성분 외에 감초를 끓는 물에서 우려낸 추출액, 행인을 끓는 물에서 우려낸 추출액, 구연산, 비타민 C, 진피를 끓는 물에서 우려낸 추출액 또는 자원을 끓는 물에서 우려낸 추출액과 같은 음료에 통상적으로 첨가하는 성분들을 포함할 수 있다. 바람직하기로는 상기 첨가하는 성분들의 양은 상기 니코틴 분해음료 5,000 중량부에 대하여 4 내지 6 중량부의 감초를 끓는 물에서 우려낸 추출액, 2 내지 4 중량부의 진피를 끓는 물에서 우려낸 추출액, 0.5 내지 8 중량부의 비타민 C, 0.5 내지 8 중량부의 구연산, 0.05 내지 0.5 중량부의 자원을 끓는 물에서 우려낸 추출액를 포함하면 더욱 좋다.

또한 본 발명은 상기 니코틴 분해음료를 건조하여 제조한 니코틴 분해제재를 제공한다. 본 발명에서 상기 니코틴 분해음료를 건조하는 방법은 통상적으로 사용되는 건조방법들이 적용될 수 있으며, 바람직하기로는 상기 건조방법은 분사건조인 것이 좋다.

또한 상기 니코틴 분해제재는 분말의 형상을 띠고 있으나, 통상적으로 적용될 수 있는 방법들을 통하여 캡슐, 주사제 등의 제형으로 제조할 수 있다. 바람직하기로는 상기 니코틴 분해제재의 제형은 상기 콜레스테롤 분해제재를 PTP 포장하여 캡슐로 제조한 것이 좋다.

본 발명의 니코틴 분해음료 및 분해제재의 제조방법은 상세하게는 다음과 같다.

은행, 샐러리, 사과 및 레몬을 깨끗이 씻고, 녹즙기를 이용해 본 발명에 투입하는 하는 양에 맞추어 즙을 만들어 0 내지 7 ℃에서 보관한다. 녹차엽과 상엽을 투입하는 양에 맞추어 잘 섞은 후 부직포에 넣고 상기에서 제조된 액을 혼합한 후 골고루 차잎에 뿌려준다. 추출기 안에 상기 혼합액과 섞은 차잎을 넣고 적당량의 물을 부어 60 내지 95 ℃에서 10 내지 40 분간 열을 가하여 추출액을 우려내면 니코틴 분해음료가 된다. 상기 성분 외에 적당량의 진피를 끓는 물에서 우려낸 추출액, 감초를 즙으로 만든 액, 구연산, 비타민 C, 자원을 끓는 물에서 우려낸 추출액 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 물질을 상기 혼합액에 더욱 포함시길 수 있다.

또한 상기 니코틴 분해음료를 건조하여 니코틴 분해제재를 제조한다. 상기 건조된 니코틴 분해제재는 분말의 형상으로, 이를 PTP 포장하면 캡슐이 된다.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로서 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

[실시예 1] 니코틴 분해 음료의 제조

은행 150 g을 깨끗이 씻고, 녹즙기를 이용해 60 ml의 즙을 만들어 4 ℃에 보관하였다. 샐러리 150 g을 깨끗이 씻고, 녹즙기를 이용해 120 ml의 즙을 만들어 4℃에 보관하였다. 사과 60 g을 깨끗이 씻고, 녹즙기를 이용해 24 ml의 즙을 만들어 4 ℃에 보관하였다. 레몬 60 g을 깨끗이 씻고, 녹즙기를 이용해 24 ml의 즙을 만들어 4 ℃에 보관하였다. 상기에서 준비한 성분들을 은행즙 6 ml, 샐러리즙 12 ml, 사과즙 2.4 ml, 레몬즙 2.4 ml, 추출액 80 ml를 취하여 잘 섞어서 혼합액을 만들었다.

녹차엽 200 g과 상엽 100 g을 잘 섞은 후 부직포에 넣고 상기에서 제조한 혼합액을 골고루 차잎에 뿌려주었다. 추출기 안에 혼합액과 섞은 차잎을 넣고 물 6 L를 부어 80 ℃에서 20 분간 열을 가한 후 추출액 5 L를 우려내어 니코틴 분해음료를 제조하였다.

[실시예 2] 콜레스테롤 분해 음료의 제조

상기 실시예 1에서 상기 혼합액에 감초 60 g, 진피 30 g을 가루로 만들고 부직포에 싸서 추출기에 넣고 물 1 L를 첨가한 후 100 ℃에서 2 시간동안 충분히 우려내고 압력을 가하여 짜낸 80 ml를 첨가한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 니코틴 분해음료를 제조하였다.

[실시예 3] 콜레스테롤 분해제재의 제조

상기 실시예 1 내지 2에서 제조한 콜레스테롤 분해음료를 분사 건조하여 콜레스테롤 분해제재를 제조하였다.

[실험 1] 니코틴 분해음료의 니코틴 분해에 관한 효능검증 실험

흡연관련 질환을 연구하기 위해서는 흡연량을 정확히 측정하는 것이 매우 중요하며, 주로 흡연자의 니코틴, 코티닌, 티오시아네이트(thiocynate), 카르복시헤모글로빈(carboxyhemoglobin) 등의 측정을 통하여 흡연량을 특정하는 방법이 이용된다. 그러나 상기에서 니코틴은 반감기가 약 30분에 불과하여 24시간 정도의 반감기를 갖는 코티닌에 비하여 불안정한 문제점이 있으며, 티오시아네이트는 다이어트 등의 외부요인에 의하여 오차가 크고, 카르복시헤모글로빈은 일산화탄소에 의해 변동이 심하기 때문에 측정에서 오차영향을 대폭 줄일 수 있는 코티닌 정량법이 가장 정확한 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명의 실험에서는 코티닌 정량법을 사용하였다. 본 발명의 실험에 사용된 니코틴(-)은 시그마사에서 구입하였고, 니코틴의 농도는 1 mM로 정하여 사용하였다.

(1) 코티닌 정량법

니코틴은 약 30여분의 반감기를 갖고 있으나 코티닌의 경우 15시간 이상의 반감기를 가지고 있어 니코틴의 무독화 생성물로의 전이를 안정적으로 측정할 수 있다. 코티닌 측정을 위해서는 보통 Gas Chromatography (GC), High Performance Liquid Chromatography (HPLC), Radioimmunoassay (RIA), 또는 Direct Barbituric Acid (DBA)방법 등이 사용되어 왔다. 그러나 GC 및 HPLC 방법은 상당한 정확성을 갖는 대신 많은 수의 샘플을 측정하기 매우 불편하며, RIA는 방사성 동위원소를 사용하여야 하는 부담감으로 본 발명의 실험에서는 제외하였다. 본 실험에서는 시험관내에서의 직접혼합법 또는 니코틴의 세포내 유입후 대사가 진행되는 정도를 DBA법을 이용하였다. 그러나 이 방법은 다량의 샘플을 취급하기에 어려움이 있어, 코티닌의 양을 보다 간편하며 정확히 측정할 수 있는 Barlow 등에 의해 1987년에 개발된 방법을 변형하여 사용하였다. 구체적인 방법은 다음과 같다.

코티닌 정량법의 실시를 위하여 1.5 ml 폴리프로필렌(polypropylene) 튜브에 200 ㎕의 샘플 및 기준시료(stsndard)를 버퍼 또는 증류수에 넣었다. 이때 실험결과의 신뢰성을 기하기 위하여 한 샘플 당 3개의 튜브를 사용하였다. 측정대상시료에 100 ㎕의 4 M 염화아세테이트 버퍼(sodium acetate buffer)(pH 4.7), 40 ㎕의 1.5 M KCN, 40 ㎕의 0.4 M 클로라민(chloramine)-T, 200 ㎕의 78 mM 50 v/v%의 아세토니트릴(acetonitrile) 수용액에 용해한 바비트릭산(barbituric acid)을 순서대로 넣고 10초 동안 잘 혼합하였고, 이 혼합물을 상온(25 ℃)에서 15분간 반응시키고, 여기에 40 ㎕의 1 M 염화 메타바이설파이트(sodium metabisulphite)를 넣어 반응을 중지시켰다. 흡광도는 490 nm에서 측정하여 기준 코티닌(standard cotinine)과 비교하여 정량하였다.

(2) 직접 혼합 (direct mixing)에 의한 니코틴 분해능 측정

상기 실시예 1에서 제조한 분해음료에 니코틴을 분해하는 물질이 있는지 알아보기 위하여 물을 이용하여 자연분해되는 비율을 대조군으로 하여 본 발명의 니코틴 분해음료를 니코틴과 직접 혼합하여 니코틴 분해기능을 측정하였다. 실험방법은 에펜도르프(Eppendorf) 튜브(1.5ml)에 1 mM의 니코틴(-) 200 ㎕와 동량의 니코틴 분해음료를 잘 혼합 한 후 0, 10, 20, 30, 60, 120분 경과 후 생성된 코티닌의 양을 상기에서 기재한 코니틴 정량법을 이용하여 측정해서 도 5에 나타내었다. 이 때 측정온도는 25 ℃이었다. 또한 15 및 37 ℃에서도 상기와 같은 실험 방법을 이용하여 코티닌의 양을 측정하였다. 서로 다른 온도를 사용한 이유는 코티닌의 생성 촉진에 관여하는 과정이 순수한 화학적 반응인지 아니면, 효소 등의 생물학적촉매가 관여하는 사항을 검증하기 위한 것이었다. 온도를 달라하여 실험한 결과는 상온(25 ℃)에서 측정한 결과와 거의 동일한 결과가 나왔다. 또한 니코틴 분해음료의 효능이 얼마나 지속되어지는가를 알아보기 위하여 12시간까지 반응을 시키며 정하여진 시간마다 코티닌의 양을 측정하였으며, 결과는 도 6에 나타내었다.

도 5에서 나타나는 바와 같이 측정된 코티닌의 양이 니코틴 분해음료에서는 3.0까지 이르나, 비교예인 물을 사용한 경우에는 1.3 정도에 불과하여 본 발명의 니코틴 분해음료에 니코틴 분해물질이 존재함을 알 수 있다.

또한 도 6은 본 발명의 니코틴 분해음료가 투입 후 12시간까지는 효능이 지속됨을 보여 준다.

(3) 세포배양을 이용한 니코틴 분해능 측정

인간의 간세포(hepatocyte)에서 연유한 FLCFR5 세포를 이용하여 간에서의 니코틴 대사를 in vitro 상에서 실험하였다. 상기 세포를 75 mm 접시에 5 ml 씩 분할하고 컨플루언시(confluency)가 100 % 될 때까지 세포를 1 주일간 배양하였다. 배지는 5 % FBS가 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium) 배지를 사용하였다. 상기 방법으로 배양된 세포에 니코틴을 1 mM되게 첨가하여 10 분동안 처리해주고, 분해음료를 120 ㎕/10ml 되게 첨가하여 주었다. 상기 처리된 세포들을 상온에서 배양하여, 각각 10 분, 20 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 5 시간, 7 시간, 10 시간, 12 시간의 시간대별로 PBS(phosphate buffered saline)로 3 내지 4 차례 씻어낸 후 트립신 없이 스크레퍼를 사용하여 긁어서 수확하였다. 상기 수확한 세포를 초음파분쇄기(sonicator)(Vibra Cell-200; Newton, onn., USA)를 사용하여 강력하게 분쇄하였다. 이렇게 얻어진 시료를 가지고 상기에 기재한 코티닌 정량법에 의하여 코티닌의 양을 측정하였다.

도 7은 상기 실험의 결과를 나타낸 것으로, 본 발명의 니코틴 분해음료를 적용한 경우가 대조군의 물을 적용한 경우보다 코티닌의 생성량이 많음을 알 수 있다. 상기 결과는 니코틴 분해음료가 생체 내에서도 니코틴 분해효능이 우수함을 간접적으로 의미한다.

또한 니코틴 분해음료 성분이 세포 내에 기 흡수되어 존재할 경우, 신규 유입되는 니코틴의 중화의 효용성을 검증하기 위하여, 기능성 음료가 함유된 배지(배지 1 ml당 120 ㎕의 티코틴 분해음료가 함유됨)에 6시간 동안 FLCFR5 세포를 예비 배양하였다. 예비 배양이 완료된 후 상기 세포를 PBS로 세척한 후, 니코틴이 함유된 배지에 세포를 배양하였으며, 상기와 동일한 방법을 사용하여 세포 내의 코티닌 함량을 측정하였다.

도 8은 상기 실험의 결과는 나타내는 것으로서, 니코틴 분해음료를 미리 섭취하게 한 후 니코틴을 첨가한 세포가 니코틴 분해음료를 섭취하지 않은 세포에 비하여 코티닌 생성량이 많음을 나타낸다. 상기 결과는 본 발명의 니코틴 분해음료를 장기 복용하거나 흡연직전에 니코틴 분해음료를 음용할 경우 니코틴의 분해에 유리함을 나타낸다고 할 수 있다.

또한 세포내에서 니코틴 분해음료의 효능이 얼마나 지속되어지는가를 알아보기 위하여 12시간까지 반응을 시키며 정하여진 시간마다 코티닌의 양을 측정하였으며, 결과는 도 9에 나타내었다. 상기 도 9에서 니코틴 분해음료를 적용한 경우 코티닌의 생성량이 5 시간 이후 급격히 줄어들고, 10 시간 이후에는 대조군인 물을 적용한 적어지는 것을 볼 수 있는데, 이는 코티닌이 키토 산(keto acid) 등 다른 물질로 분해되어 측정되는 코티닌의 양이 줄어든 것으로 판단된다.

(4) 제노푸스 난모세포(Xenopus oocytes)을 이용한 니코틴 분해능 측정

흡연과 더욱 유사한 실험을 하기 위하여 주입하기 쉬운 지노퍼스 미숙란를 사용하여 직접 니코틴과 본 발명의 니코틴 분해음료를 주입하여 니코틴 분해능을 측정하였다.

지노퍼스 미숙란은 스테이지(stage) 3 내지 4에 있는 직경 1 내지 1.2 mm 정도의 것을 사용하였으며, OR2 링거 용액에 저장하고, 실험을 하였다. 미숙란의 껍질을 벗긴 후 각각의 미숙란에 대해 1 mM 농도의 니코틴을 500 ㎕씩 주입하였으며, 곧바로 분해음료 500 ㎕를 주입하였다. 주입시 니들이 막히게 되므로 분해음료는 항상 여과을 해주었다. 상기 처리된 미숙란들을 상온에서 배양하여, 각각 10 분, 20 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 5 시간, 7 시간, 10 시간, 12 시간 간격으로 멸균된 PBS 용액에서 미숙란들를 균질화하였으며, 초음파분쇄기를 사용하여 강력하게 분쇄하였다. 원심분리를 이용하여 난황을 제거하고, 상기에 기재한 코티닌 정량법에 따라 코티닌 양을 측정하였다.

도 10은 상기 실험의 결과를 나타내는 것으로서 니코틴 분해 음료는 물에 비하여 미숙란에서도 니코틴 분해능이 우수함을 알 수 있다.

또한 미숙란에서 니코틴 분해음료의 효능이 얼마나 지속되어지는가를 알아보기 위하여 12시간까지 반응을 시키며 정하여진 시간마다 코티닌의 양을 측정하였으며, 결과는 도 11에 나타내었다. 상기 도 11에서 니코틴 분해음료를 적용한 경우 코티닌의 생성량이 5 시간 이후 급격히 줄어드는 것을 볼 수 있는데, 이는 코티닌이 키토 산(keto acid) 등 다른 물질로 분해되어 측정되는 코티닌의 양이 줄어든 것으로 판단된다.

[실험 2] 임상실험에 의한 니코틴 분해능 측정

분해음료의 니코틴 분해에 관한 효능을 검증하기 위하여 시중에서 판매되는 담배 중 디스(THIS)를 선택하여 하루에 15 내지 25 개피의 담배를 피는 20대의 건장한 남자들을 상대로 임상실험을 실시하였다. 실험에 확실성을 기하기 위하여, 수회 반복 실시하여 통계 처리하였으며, 물을 마시는 대조군과 분해음료를 마시는 실험군은 다른 날에 실시하였고 몸의 상태와 실험하는 시간대를 되도록 같게 하였다. 실험은 평소처럼 흡연을 하게 하였으며, 자세한 실험방법은 도 12와 같다.

상기 실험에서 채취한 1차, 2차, 그리고 3차 뇨를 대상으로 뇨속의 니코틴 주요 대사산물인 코티닌 양을 상기에서 기재한 코티닌 정량법에 따라 측정하였다.

1차 임상실험에 대한 결과는 다음 표와 같다.

Volunteer(남)	대조군	실험군
	Cotinine conc.(μmol/ℓ)^#	코티닌 생성률^*%(니코틴 분해 증가율)	Cotinine conc.(μmol/ℓ)	코티닌 생성률^*%(니코틴 분해 증가율)
	1차뇨	2차뇨	3차뇨	2차뇨	3차뇨	1차뇨	2차뇨	3차뇨	2차뇨	3차뇨
1	박지훈(26)	10.28	7.85	0.24	76.3	2.3	42.42	15.07	22.11	35.5	52.1
2	윤광성(25)	17.24	9.07	2.94	52.6	17	6.29	19.81	20.03	314.9	318
3	남윤원(25)	10.24	19.68	7.76	192.2	75.7	45.59	33.76	15.24	74	33.4
4	정재준(20)	22.07	8.37	2.42	37.9	10.9	22.2	17.2	11.59	77.5	52.2
5	김지훈(30)	27.8	24.16	12.46	86.9	44.8	5.98	9.29	19.77	155.3	330
6	민상기(21)	90.24	83.07	42.28	92	46.8	121.89	113.76	37.33	93.3	30.6
7	박성진(21)	60.72	70.8	62.4	116.6	102.7	61.59	58.37	30.8	94.8	50
8	이역호(20)	65.98	50.55	43.46	76.6	65.8	75.89	79.76	46.2	105	60.8
9	김선식(20)	62.76	43.24	27.24	68.9	43.4	37.29	31.5	27.42	84.5	73.5
10	이해욱(21)	89.63	94.85	84.28	105.8	94	67.5	48.37	10.98	71.6	16.2
11	송선빈(21)	24.63	21.46	15.94	87.1	64.7	20.46	21.68	74.69	105.9	365
12	이성두(26)	13.2	14.76	6.63	111.8	50.2	51.46	38.98	17.42	75.7	33.8
13	김원태(26)	18.33	15.55	8.15	84.8	44.4	6.07	0.98	0.37	16.1	6
14	김현수(26)	72.94	42.4	39.85	58.1	54.6	98.24	97.24	42.5	98.9	43.3
15	안철현(25)	33.07	30.5	8.98	92.2	27.1	33.46	2.85	13.2	8.5	39.4
16	강현민(26)	120.76	55.5	57.16	45.9	47.3	25.42	31.29	33.5	123	131
17	김정훈(26)	27.6	29.46	14.8	106.7	53.6	61.03	68.03	77.89	111.5	127
평 균	45.14μM	36.54μM	25.70μM	87.78%	49.72%	46.04μM	40.46μM	29.47μM	96.82%	103.66%

# 코티닌 양은 각 뇨마다 두 번씩 측정하였다.

* 코티닌 생성률(니코틴 분해증가율) = 2차뇨(3차뇨)의 코티닌 농도×100 / 1차뇨의 코티닌 농도이다.

2차 임상실험에 대한 결과는 다음 표 2와 같다.

Volunteer number(남)	대조군	실험군
	Cotinine conc.(μmol/ℓ)^#	코티닌 생성률^*%(니코틴 분해 증가율)	Cotinine conc.(μmol/ℓ)	코티닌 생성률^*%(니코틴 분해 증가율)
	1차뇨	2차뇨	3차뇨	2차뇨	3차뇨	1차뇨	2차뇨	3차뇨	2차뇨	3차뇨
1	박지훈(26)	13.81	11.81	20.68	85.5	149.7	26.11	20.5	36.5	78.5	139.8
2	윤광성(25)	28.07	29.81	20.41	106.2	72.7	86.5	103.2	108.69	119.3	125.6
3	남윤원(25)	97.03	53.33	23.03	54.9	23.5	30.37	34.98	27.55	115.2	90.7
4	황지환(27)	39.68	15.63	4.28	39.4	10.8	27.5	20.59	12.5	74.9	45.5
5	김지훈(30)	26.8	23.59	16.68	88	62.2	19.63	17.5	20.94	89.1	106.7
6	민상기(21)	83.55	89.11	62.07	106.6	74.3	108.76	95.63	87.37	87.9	80.3
7	박성진(21)	42.07	34.98	15.59	83.1	37.1	43.76	55.37	69.33	126.5	158.4
8	이역호(20)	26.59	28.42	10.03	106.9	37.7	32.29	43.98	48.59	136.2	150.5
9	김선식(20)	51.03	46.81	12.5	91.7	24.5	88.42	50.16	50.11	56.7	56.7
10	이해욱(21)	119.9	101.07	33.5	84.3	27.9	142.06	109.72	68.63	77.2	48.3
11	송선빈(21)	11.16	11.98	2.68	107.3	24	18.76	17.03	28.29	90.8	150.8
12	이성두(26)	22.68	20.63	11.72	90.9	51.7	17.24	15.37	13.89	89.2	80.6
13	김원태(26)	34.29	13.5	3.81	39.4	11.1	27.33	15.03	6.33	54.9	23.2
14	김현수(26)	24.37	25.89	9.55	106.2	39.2	32.68	34.29	42.85	104.9	131.1
15	안철현(25)	31.42	37.16	35.98	118.3	114.5	30.29	26.63	23.98	87.9	79.2
16	강현민(26)	109.2	79.12	64.07	72.4	58.7	23.85	56.63	29.98	237.4	125.7
17	김정훈(26)	31.81	10.81	12.68	33.9	39.9	79.11	54.37	51.98	68.7	65.7
18	유용희(25)	59.42	73.98	48.29	124.5	81.3	58.76	38.16	45.98	64.9	78.3
19	오정식(25)	25.2	26.98	18.76	107.1	74.4	36.11	45.37	57.89	125.6	160.3
20	박순국(21)	113.63	95.72	22.94	84.2	20.2	106.59	99.72	22.42	93.5	21
평 균	49.58μM	41.51μM	22.46μM	86.54%	51.77%	51.80μM	47.71μM	42.69μM	98.96%	95.92

# 코티닌의 양은 각 뇨마다 두 번씩 측정하였다.

1, 2차 임상실험에 대한 결과를 표와 그래프로 나타내면 표 3과 같다.

임상실험	대조군	실험군
	코티닌 농도(μmol/ℓ)#	코티닌 생성률*%	코티닌 농도(μmol/ℓ)#	코티닌 생성률*%
	1차뇨	2차뇨	3차뇨	2차뇨	3차뇨	1차뇨	2차뇨	3차뇨	2차뇨	3차뇨
1차	45.14	36.54	25.70	87.78	49.72	46.04	40.40	29.47	96.82	103.6
2차	49.58	41.51	22.46	86.54	51.71	51.80	47.71	42.69	98.86	95.91
평균	47.36	39.02	24.08	87.16	50.71	48.92	44.05	36.08	97.89	99.78

상기 표 3을 그래프로 나타내면 도 13과 같다. 상기 그래프에서 보는 바와 같이 니코틴 분해 음료를 마신 실험군은 물을 마신 대조군에 비하여 코티닌의 농도가 높음을 알 수 있다.

도 14는 대조군에 대한 실험군의 니코틴 분해율의 비를 나타낸 것이다. 니코틴 분해율은 2차뇨와 3차뇨의 코티닌 생성률을 기초로 한 것으로, 1차, 2차, 3차뇨 채취 시 뇨 중의 잔존하는 코티닌은 모두 배출되고 니코틴의 주요 대사산물인 코티닌이 흡연으로 인해 다시 생성하는 것을 니코틴의 분해와 비례적으로 나타내었다. 그래프는 실험군(분해음료를 마신 그룹)의 니코틴 분해율을 대조군(물을 마신 그룹)의 니코틴 분해율로 나눈 값을 나타내었다. 상기 그래프에서 나타내는 바와같이 실험군의 니코틴 분해율(코티닌 생성률)은 대조군의 니코틴 분해율의 2 배에 달한다는 것을 알 수 있다.

[실험 3] 니코틴 분해제재의 니트로소모폴린(nitrosomorpholine) 생성 억제 효과

본 실험에서는 상기 실시예 3에서 실시예 2의 니코틴 분해음료를 건조하여 제조한 니코틴 분해제재를 증류수 20 ml 당 1 g씩 녹인 용액을 사용하였다. 또한 양성대조구로 니트로사민으로의 억제효과가 좋은 비타민 C를 사용하였다. 상기 니코틴 분해제재의 반응시료는 0.2 중량% (2 mg/ml)에서 3 중량% (30 mg/ml)까지 농도를 달리하여 6개로 하였으며, 양성 대조구인 비타민 C의 농도를 3.5 중량% (35 mg/ml)가 되도록 하였으며, 모폴린을 첨가하지 않은 염화 아질산염(sodium nitrite)를 200 mM되게 첨가한 것을 음성대조구로 하여 실험을 수행하였다. 각 반응에서 염화 아질산염을 첨가하지 않은 시료를 공실험으로 설정하였다.

실험방법은 다음과 같다. 각 15 ml 코닝 튜브에 공실험구와 실험구, 대조구를 표기하고 빙초산 1 ml씩 분주하였고, 2 M NaNO₂를 100 ㎕씩 공실험구를 제외한 튜브에 첨가하고, 실험군의 시료용액과 비타민 C를 각 튜브에 정해진 양에 따라 첨가하고, 증류수로 최종 볼륨이 2 ml이 되도록 하였다. 상기 튜브들을 37 ℃에서 10분 동안 반응시킨 후 모폴린 176 ㎕를 첨가하여 2 M이 되게 하였으며, 다시 37 ℃에서 30분 동안 반응시켰다. 또한 5 N NaOH를 3.8 ml 첨가하여 pH 10-12로 맞추어 반응을 종결하였으며, 상기 시료들의 모폴린의 함량을 측정하였다. 모폴린 함량의 측정방법은 다음과 같다. 1.5 ml 폴리프로필렌(polypropylene) 튜브에 500 ㎕의 샘플을 첨가하고, 250 ㎕의 4 M 염화아세테이트 버퍼(sodium acetate buffer)(pH 4.7), 100 ㎕의 1.5 M KCN, 100 ㎕의 0.4 M 클로라민(chloramine)-T, 500 ㎕의 78 mM 50 v/v%의 아세토니트릴(acetonitrile) 수용액에 용해한 바비트릭산(barbituric acid)을 순서대로 넣고 10초 동안 잘 혼합하였고, 이 혼합물을 상온(25 ℃)에서 15분간 반응시키고, 여기에 100 ㎕의 1 M 염화 메타바이설파이트(sodium metabisulphite)를 넣어 반응을 중지시켰다. 흡광도는 490 nm에서 측정하여 공실험구 및 음성대조구 등과 비교하였다. 니트로소모폴린의 생성율은 하기 식 1에 의해 나타낼 수 있다.

[식 1]

니트로소모폴린의 생성율(NMOR(%)) = (t₀- blank) - (t₃₀- blank) ÷ (t₀- blank)

상기에서 계산된 니트로소모폴린의 생성율의 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

sample	t₀- blank	t₃₀- blank	NMOR (%)
음성대조구	0.55	0.03	94.5
비타민 C (35mg/ml)	0.387	0.36	7
실험군 용액 (2mg/ml)	0.543	0.101	81.4
실험군 용액 (5mg/ml)	0.606	0.152	74.9
실험군 용액 (10mg/ml)	0.59	0.216	63.4
실험군 용액 (15mg/ml)	0.782	0.361	53.8
실험군 용액 (20mg/ml)	0.91	0.6	34.1
실험군 용액 (30mg/ml)	0.88	0.736	16.3

상기 표 4의 결과는 본 발명의 니코틴 분해제재를 사용한 실험군의 니트로소모폴린의 생성율이 분해제재의 사용량을 증가시킴에 따라 줄어드는 것을 나타내며, 양성대조구인 비타민 C를 사용한 경우와 비교하여 볼 때 거의 유사한 정도로 니트로소모폴린의 생성을 저해시키는 것으로 나타났다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 의하여 제공되는 니코틴 분해 음료 및 분해제재는 니코틴 분해효능이 물에 비하여 확실히 인정될 정도로 in vitro 및 in vivo 상에서 니코틴 분해 효능이 현저히 우수하며, 인체에 안전한 것으로 나타났다.

Claims

(a) 50 내지 500 중량부의 녹차엽;

(b) 20 내지 300 중량부의 상엽;

(c) 10 내지 50 중량부의 은행을 즙으로 만든 액;

(d) 10 내지 50 중량부의 샐러리를 즙으로 만든 액;

(e) 1 내지 20 중량부의 레몬을 즙으로 만든 액; 및

(f) 1 내지 20 중량부의 사과를 즙으로 만든 액;

을 포함하는 혼합액을 60 내지 95 ℃의 물에서 우려내어 제조한 니코틴 분해음료.
제 1항에 있어서, 상기 물은 1,000 내지 20,000 중량부인 것을 특징으로 하는 니코틴 분해음료.
제 1항에 있어서, 상기 혼합액은 감초를 끓는 물에서 우려낸 추출액, 행인을 끓는 물에서 우려낸 추출액, 구연산, 비타민 C, 진피를 끓는 물에서 우려낸 추출액, 자원을 끓는 물에서 우려낸 추출액 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 물질을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 니코틴 분해음료.
제 1 내지 3항 중 한 항을 건조하여 제조한 니코틴 분해제재.
제 4항에 있어서, 상기 니코틴 분해제재의 제형이 니코틴 분말을 PTP 포장하여 캡슐화한 것임을 특징으로 하는 니코틴 분해제재.