KR100464140B1 - 니코틴 분해용 기능성 제제 및 그의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 니코틴 분해용 기능성 제제 및 그의 제조방법에 관한 것으로 녹차엽, 상엽, 은행, 샐러리, 레몬, 사과, 진피 및 감초를 이용한 식물성 추출물을 포함한다. 본 발명의 기능성 제제는 담배로 인한 니코틴 분해를 촉진시키고, 발암물질 생성을 억제할 뿐만 아니라 항산화 효과를 나타내며, 돌연변이를 억제하고 나아가 폐암발생율을 현저히 낮춘다.
Description
[발명이 속하는 기술분야]
본 발명은 니코틴 분해용 기능성 제제 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 흡연으로 인한 니코틴 유해성을 제거하고, 흡연으로 인한 발암물질 생성을 억제할 수 있는 기능성 제제에 관한 것이다.
[종래기술]
니코틴은 흡연으로 체내에 흡수되는 강독성 물질로 무색 또는 연황색의 물질이다. 니코틴은 강한 독성을 가지며 신경마디의 세포막 상에 작용하여 혈압상승, 골격근섬유 경련초래, 흥분으로 인한 구강내 마비 등을 일으키는 것으로 알려져 있다.
즉각적인 니코틴의 위해성은 동공축소, 시야혼탁, 구토, 구역질, 복통, 설사, 소변조절 곤란, 후두 화상초래, 호흡곤란, 타액과 호흡기관에 분비물증가, 청색병, 심장박동수 감소 등이 있으며, 흡연기간이 장기화되면 니코틴이 체내에 집적되어 장기적으로 암 질환, 고혈압, 구강질환 초래, 위산과다분비 촉진에 따른 각종 위장질환과 동맥경화증을 비롯한 각종 순환계 질환을 일으킬 수 있다. 또한 니코틴은 노화촉진 등에 중요한 요인으로 작용하여 심하면 발작, 경련 및 호흡마비, 근육경련 및 불필요한 혈압상승 등을 유발한다.(Damaj, M. I., Welch, S. P. and Martin, B. R. (1996)J. Pharmacol. Exp. Thr.,277 454-461)
니코틴은 니코틴유도체(nicotine-derived nitrosamine)에 의해 매우 강력한 발암물질로 작용하여 흡연으로 인한 폐암과 폐질환 환자는 전세계적으로 매년 수억에 이른다. 1956년 메기와 바른스는 니트로소디메틸아민(N'-nitrosodimethylamine; NDMA)이 쥐에서 매우 강력한 간암유발물질임을 증명하였고(Magee, P. N., and Barnes, J. M. (1956)Br. J. Cancer,10. 114-122), 그 후 N-니트로사민중에서 발암활성을 가진 화합물이 30종 이상확인되었다(Druckrey, H., Preussmann, R., Ivankovic, S., and Schmahl, D.(1967)Z. Krebsforsch.,69, 103-201 ; Preussmann, R., and Stewart, B. W. (1984) InChemical Carcinogenesis,(Searle, C. E., Ed.) pp 643-828, American Chemical Society, Washington, DC. ; Lijinsky, W. (1992)Chemistry and Biology of N-Nitroso Compounds, Cambridge University Press, Cambridge, England.; Bogovski, P., and Bogovski, S. (1981)Int. J. Cancer,27, 471-474).
1962년 드럭크리와 프레우스만은 담배의 알칼로이드로부터 유도된 니트로사민이 담배연기에 존재한다고 보고하였으며(Druckrey, H., and Preussmann, R. (1962)Die Natur.,49, 488-499), 1964년 보일란드 등은 NNN(N'-nitrosonornicotine)이 마우스에서 폐암을 유발하고 NAB(N'-nitro soanabasine)이 쥐에서 식도암을 일으킴을 보고하였다(Boyland, E., Roe, F. J. C., and Gorrod, J. W. (1964)Nature,202, 1126 ; Boyland, E., Roe, F. J. C., and Gorrod, J. W., and Mitchley, B. C. V. (1964)Br. J. Cancer,18, 265-270).
스미스 등은 이미니움(iminium) 이온을 경유하는 3차 구조 아민의 니트로세이션을 기초로 한 고전적인 연구(Smith, P. A. S., and Loeppky, R. N. (1967)J. Am. Chem. Soc.,89, 1148-1152)로 여러 가지 니트로사민이 니코틴으로부터 형성되어진다는 것을 증명하였고(Klus, H., and Kuhn, H. (1975)Fachliche MittAustria Tabakwerke,16, 307-317 ; Hecht, S. S., Chen, C. B., Dong, M., Ornaf, R. M., Hoffmann, D., and Tso, T. C. (1977)Beitr. Tabakforsch.,9, 1-6), Hecht 등은 4-(methylnitrosamino) -1-(3-pyridyl)-1-butanone(NNK), 4-(methylnitrosamino)-4-(3-pyridyl)-bu tanal(NNA), NNN 및 다른 니트로화합물들이 니코틴으로부터 형성되어짐을 확인하였으며, NNK를 담배에서 검출하였다.(Hecht, S. S., Chen, C. B., and Hoffmann, D. (1976)Tetrahedron Lett.,8, 593-596 ; Hecht, S. S., Chen, C. B., Ornaf, R. M., Jacobs, E., Adams, J. D., and Hoffmann, D. (1978)J. Org. Chem.,43, 72-76 ; Hecht, S. S., Chen, C. B., Hirota, N., Ornaf, R. M., Tso, T. C., and Hoffmann, D. (1978)J. Natl. Cancer Inst.,60, 819-824)
도 1은 니코틴으로부터 대사되는 여러 가지 니트로사민을 나타낸 것이다. 지금까지 NNN, NNK, NNAL, NAT, NAB, iso-NNAN 및 iso-NNAC 일곱 개의 담배 특이적 니트로사민들이 담배의 산물에서 동정되었으며, 이들 중에서 NNN, NNK, NAT는 다른 것보다 많은 양이 검출되어졌고, 특히 NNN, NNK, NNAL은 아주 강력한 발암물질임이 이미 확인된 바 있다.
니코틴은 두 단계의 과정에 의해 코티닌으로 대사되어지며, 이때 사이토크롬 P450(이하 "CYP"라 함)과 사이토졸 알데하이드 옥시제네이즈가 대사에 관여한다. 여러종류의 CYP가 니코틴을 코티닌으로 대사시키고, 이 중에서 CYP 2A6이 가장 큰 역할을 한다(Cashman, J. R., Park, S. B., Yang, Z. C., Wrighton, S. A., Jacob. P. III., and Benowitz, N. L. (1992)Chem. Res. Toxicol.,5, 639-646).
도 2는 니코틴의 코티닌으로 변환되는 대사과정을 나타낸 것이다.
니코틴은 70 내지 80 % 정도 코티닌으로 변환되고, 코티닌의 10 내지 15 %가 소변으로 배출되며, 나머지는 케토산으로 대사된다. 상기 케토산의 85 %는 하이드록시산으로 대사되어 소변으로 배출되어진다. 코티닌으로 대사되지 않은 니코틴은4 %가 FMO(flavin-containing monooxygenase)에 의해 니코틴-1-N-옥사이드 (nicotine-1-N-oxide)로 변환되며, 이것의 대부분은 그대로 소변으로 배출되어진다.(Benowitz, N. L., Jacob. P. III., and Fong, I. (1994)J. Pharmacol. Exp. Ther.,268, 296-301) 따라서 니코틴은 체내에서의 산화 대사과정으로 80 내지 90 %가 뇨 대사산물로써 배출되어진다고 할 수 있다.(Kyerematen, G. A., Morgan, M. L., Chattopadhyay, B., deBethizy, J. D., and Vessel, E. S. (1990)Clin. Pharmacol. Ther.,48, 641-651 ; Caldwell, W. S., Greene, J. M., Byrd, G. D., Chang, K-M, Uhrig, M. S., deBethizy, J. D., Crooks, P. A., Bhatti, B. S., and Riggs, R. M. (1992)Chem. Res. Toxicol.,5, 280-285 ; Byrd, G. D., Chang, K-M., Greene, J. M., deBethizy, J. D. (1992)Drug. Metab. Dispos.,20, 192-197 ; Jacob. P. III., Benowitz, N. L., and Shulgin, A. J. (1988)Pharmacol. Biochem. Behav.,30, 249-253)
도 3에 도시한 바와 같이, NNK는 실험실 동물에게 프로발암물질(pro-cacinogen)이며, 간과 폐에서 주로 CYP 효소에 의해 대사된다. NNK 활성화의 주요 단계는 CYP에 의해 매개되는 α-수산화반응으로, 불안정한 대사산물인 메틸 다이오조하이드록사이드(methyl-diazohydroxide)로 변환된 후 유전물질인 DNA에 메틸 그룹(CH3group)을 주어 O6MeG를 형성시킨다. O6MeG는 NNK로 유도되는 발암에 대한 돌연변이능(promutagenic) 생물학적 지표로 사용되어 오고 있다.
따라서, CYP에 의한 NNK가 원인인 폐암발생은 니코틴 또는 코티닌과 같은CYP 효소의 기질물질에 대한 기질 경쟁적 억제제를 이용함으로써 NNK의 대사(α-hydroxylation) 활성화를 방해하여 효과적으로 억제될 수 있다는 것이 생체내, 외에서 제시된다(Brunnemann, K. D., et al. (1991)Crit Rev Toxicol.,21(4), 235-40). 도 4는 사이토크롬 P4502A6의 대사과정에 연관된 NNN, 니코틴, 및 NNK 간의 구조적 유사성을 도시한 것이다.
니코틴의 주요 대사산물인 코티닌과 그 이후의 대사산물인 케토산, 하이드록시산은 매우 빠르게 대사되어 뇨로 배출되어지며, 이러한 대사는 개인마다 차이가 있다. 코티닌, 케토산 및 하이드록시산은 흡연행위에 영향을 받는 인자일 뿐 발암인자는 아니며, 오히려 담배 특이적인 니트로사민들이 간 등에 존재하는 CYP에 의해 발암물질로 변환되는 것을 방해할 수 있는 경쟁적 억제제로써 작용한다. 따라서, 니코틴이 니코틴 유도체인 NNK, NNA, NNN으로 전환되는 것보다 코티닌으로 빠르게 대사되는 것이 담배에 대한 해를 줄이며, 궁극적으로 발암을 효율적으로 억제할 수 있다.
본 발명은 흡연으로 인한 체내 유해한 화학물질을 빠르게 분해 할 수 있는 기능성 제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 니코틴 및 니코틴 유도체와 같은 발암물질 생성을 억제할 수 있는 기능성 제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명의 니코틴에 의한 발암을 억제할 수 있는 기능성 제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 니코틴으로부터 형성되는 니트로사민을 도시한 것이고,
도 2는 니코틴이 코티닌으로 변환되는 대사과정을 나타낸 것이고,
도 3은 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone(NNK)의 대사 기작을 도시한 것이고,
도 4는 사이토크롬 P4502A6의 대사과정에 연관된 NNN (N'-nitrosonor nicotine), 니코틴, 및 NNK 간의 구조적 유사성을 도시한 것이고,
도 5는 본 발명의 기능성 제제의 직접혼합법에 의한 니코틴 분해능 측정결과를 나타낸 것이고,
도 6은 본 발명의 기능성 제제의 니코틴 분해효능을 FLCFR5 세포주로 측정하여 도시한 것이고,
도 7은 본 발명의 니코틴 분해용 기능성 제제가 기흡수된 세포내에서 기능성 제제의 니코틴 분해능을 측정한 것이고,
도 8은 본 발명의 니코틴 분해용 기능성 제제를 니코틴과 함께 제노푸스 난모세포에 주입하였을 때 기능성 제제의 니코틴 분해능을 측정한 것이고,
도 9는 본 발명의 니코틴 분해용 기능성 제제의 효능을 실험하기 위한 임상실험 방법을 도식화한 것이고,
도 10은 본 발명의 니코틴 분해용 기능성 제제를 섭취한 흡연실험자(B)와 대조군으로 물을 섭취한 흡연실험자(A)들의 뇨중 코티닌 농도 분포를 보인 것이고,
도 11은 본 발명의 니코틴 분해용 기능성 제제를 섭취한 흡연실험자와 대조군으로 물을 섭취한 흡연실험자들의 뇨중 코티닌 농도 평균값을 보인 것이고,
도 12는 기능성 제제 또는 물을 마신 후 흡연한 남자의 각 뇨 중에 포함되어져 있는 코티닌을 각개인의 비로 나타낸 값을 평균하여 그래프로 나타낸 것이고,
도 13은 기능성 제제, 가루녹차, EGCG(epigallocatechin-3-gallate), 퀘르세틴, 비타민 C 및 카테킨의 니트로소모폴린 생성억제효과를 나타낸 것이고,
도 14는 니코틴의 대사과정을 도시한 것이고,
도 15는 본 발명의 니코틴 분해용 기능성 제제, 퀘르세틴, 카테킨 및 가루녹차의 CYP 효소 활성에 대한 억제효과에 대하여 각기 비교 측정한 것이고,
도 16은 본 발명의 니코틴 분해용 기능성 제제, 퀘르세틴, 카테킨 및 가루녹차의 CYP 1A2 효소활성에 대한 억제효과를 각기 비교 측정한 것이고,
도 17은 본 발명의 니코틴 분해용 기능성 제제, EGCG, 퀘르세틴, 카테킨 및 가루녹차의 CYP 1A2 효소활성에 대한 억제효과를 비교적 높은 농도(A)와 낮은 농도(B)에서 서로 비교 측정한 것이고,
도 18은 본 발명의 니코틴 분해용 기능성 제제, 가루녹차, 퀘르세틴, 카테킨의 NNK로 의한 돌연변이능(mutagenicity)발생을 억제함을 각기 측정한 것이고,
도 19는 본 발명의 니코틴 분해용 기능성 제제, 가루녹차, 퀘르세틴, 카테킨의 벤조피렌에 의해 유발되는 돌연변이 발생을 억제함을 측정한 것이고,
도 20은 기능성 제제, 가루녹차, 퀘르세틴 및 카테킨의 DPPH(1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl)를 이용한 자유 라디칼의 포착효과를 측정하여 그래프로 나타낸 것이고,
도 21은 기능성 제제, 가루녹차, 퀘르세틴 및 카테킨의 O2 -제거효능을 SOD 키트를 이용하여 측정한 것을 그래프로 나타낸 것이고,
도 22는 본 발명의 니코틴 분해용 기능성 제제의 퀘르세틴 양을 HPLC(high perfor mance liquid chromatography)로 정량한 것이고,
도 23은 니코틴 분해용 기능성 제제의 NNK에 의해 유도되는 폐암발생에 대한 억제능 효과실험에서 나타나는 각 그룹의 A/J 마우스 체중을 실험일자별로 나타낸 그래프이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
(a) 50 내지 500 중량부의 녹차엽에서 추출한 녹차유효성분의 가루분말;
(b) 7.5 내지 75 중량부의 상엽을 끓는 물에서 우려낸 추출액;
(c) 3 내지 30 중량부의 사과를 즙으로 만든 액;
(d) 3 내지 30 중량부의 감초를 끓는 물에서 우려낸 추출액; 및
(e) 1.5 내지 15 중량부의 진피를 끓는 물에서 우려낸 추출액;
을 포함하는 혼합물을 건조하여 제조하는 것을 특징으로 하는 니코틴 분해용 기능성 제제를 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 기능성 제제 0.1 내지 0.8 중량%에 물을 혼합하여 제조하는 것을 특징으로 하는 니코틴 분해용 기능성 음료를 제공한다.
또한 본 발명은
(a) 은행, 샐러리, 사과 및 레몬을 착즙하고 여과하여 과채류 여과액을 제조하는 과채류 여과액 제조단계;
(b) 감초, 진피를 100 ℃에서 추출한 다음 상엽을 더욱 혼합하여 재추출하여 여과함으로써 한약재 농축액을 제조하는 엽류 및 한약재 농축액 제조단계; 및
(c) 상기 (a)의 과채류 여과액, 상기 (b)의 엽류 및 한약재 농축액 및 녹차 유효성분인 분말가루를 혼합하여 여과한 다음 분사건조하는 분말제조단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 니코틴 분해용 기능성 제제 제조방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 체내 니코틴 및 담배의 유해성을 인식하여 이의 분해효능증진을 위한 연구수행 중 카테킨과 EGCG를 다량 함유한 녹차, 그리고 퀘르세틴을 함유한 사과추출물에 상기 천연식품을 첨가한 경우 담배의 유해성분에 대한 분해 및 생성억제능이 뛰어난 기능성 제제가 됨을 알게 되었으며, 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 니코틴 분해용 기능성 제제는 (a) 50 내지 500 중량부의 녹차엽에서 추출한 녹차유효성분의 가루분말, (b) 7.5 내지 75 중량부의 상엽을 끓는 물에서 우려낸 추출액, (c) 3 내지 30 중량부의 사과를 즙으로 만든 액, (d) 3 내지 30 중량부의 감초를 끓는 물에서 우려낸 추출액, 및 (e) 1.5 내지 15 중량부의 진피를 끓는 물에서 우려낸 추출액을 포함하는 혼합물을 건조하여 제조하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명의 니코틴 분해용 기능성 제제는 (a) 7.5 내지 75 중량부의 은행을 즙으로 만든 액, (b) 3 내지 30 중량부의 샐러리를 즙으로 만든 액, 및 (c) 3 내지 30 중량부의 레몬을 즙으로 만든 액을 더욱 포함한 혼합물을 건조하여 제조하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 상기 니코틴 분해용 기능성 제제는 (a) 녹차엽 100 내지 200 중량부에서 추출한 녹차 유효성분의 분말가루, (b) 상엽 15 내지 30 중량부, (c) 은행 15 내지 30 중량부, (d) 샐러리 6 내지 12 중량부, (e) 레몬 6 내지 12 중량부, (f) 사과 6 내지 12 중량부 (g) 감초 6 내지 12 중량부, 및 (h) 진피 3 내지 6 중량부를 사용하는 것이 좋다.
본 발명에서 상기 니코틴 분해용 기능성 제제를 건조하는 방법은 통상적으로 사용되는 건조방법들이 적용될 수 있으며, 바람직하기로는 상기 건조방법은 분사건조인 것이 좋다.
본 발명의 기능성 제제는 단일제로 제조할 수 있으며, 1종 이상의 허용가능한 약리학적 조성물을 더욱 포함하여 복합제로 제조할 수 있다. 또한 약리학적으로 유용한 것으로 알려진 적합한 약학용 희석제를 더욱 포함할 수 있으며, 바람직한 희석제는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 및 에탄올로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택된 것이다. 하지만 상기 희석제는 이에 국한되지 않는다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 기재되어 있다. 기능성 제제의 제형은 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES 로션제(LPTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 리모나데제(LEMONADES), 방향수제(AROMATIC WATERS), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 안연고제(OPHTALMIC OINTMENTS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제(ELIXIRS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPESIONS), 전제(DECOCTIONS), 침제(INFUSIONS), 점안제(OPHTHALMIC SOLUTIONS), 정제(TABLETS), 좌제(SUPPOSITIORIES), 주사제(INJECTIONS), 주정제(SPIRITS), 카타플라스마제(CATAPLSMA), 캅셀제(CAPSULES), 크림제(CREAMS),트로키제(TROCHES), 틴크제(TINCTURES) 및 파스타제로 제조할 수 있다. 바람직하기로는 캡슐제로 포장하여 갭슐로 제조하는 것이 좋다.
본 발명의 니코틴 분해용 기능성 제제는 건강을 위한 음료나 식품의 첨가제로 이용할 수 있으며, 식품, 식품첨가제, 약제, 음료, 또는 음료첨가제로 사용되어지는 것이 바람직하며, 상기 기능성 제제를 0.1 % 내지 0.8 % 중량부로 물에 혼합하여 기능성 음료로 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 니코틴 분해용 기능성 제제 또는 기능성 음료는 니코틴의 분해를 가속화시키고, 발암성의 니트로소-화합물 형성을 억제한다. 또한 기능성 제제는 사이토크롬 P4501A2 효소의 활성을 억제하여 NNK에 의한 발암물질 형성을 저해하고, 항산화효과를 나타낼 뿐만 아니라 NNK와 벤조피렌에 의한 돌연변이능을 억제시키고, 발암을 억제한다.
본 발명의 니코틴 분해용 기능성 제제는 약 0.32 mg/mg의 카테킨과 56 ng/mg의 퀘르세틴을 함유한다.
본 발명의 니코틴 분해용 기능성 제제의 제조방법은 과채류 여과액 제조단계, 엽류 및 한약재 농축액 제조단계 및, 혼합 건조단계를 포함하는 것을 특징한다.
상기 과채류 여과액 제조단계에서는 7.5 내지 75 중량부의 은행알, 3 내지 30 중량부의 샐러리, 3 내지 30 중량부의 레몬, 3 내지 30 중량부의 사과를 깨끗하게 세척하여 분쇄한 다음 착즙하여 여과하는 단계를 포함한다. 여과는 통상적인방법으로 실시하는 것이 바람직하고, 망 또는 규조토로 여과하는 것이 더욱 바람직하다. 가장 바람직하게는 100 메쉬 망에 여과하고 규조토로 여과하는 것이 수용액 상에서 침전형성을 방지하기 위해 좋다. 또한 여과단계에서는 착즙을 하고 난 후의 슬러지에 적절한 양의 물을 넣고 교반한 후 다시 착즙을 하여 여과하는 과정을 더욱 실시하는 것이 효율적 유효성분 추출을 위해 바람직하다. 과채류 여과액은 0 내지 7 ℃에 보관한다.
상기 엽류 및 한약재 농축액 제조단계는 추출조에 400 내지 4000 중량부의 물을 넣고, 3 내지 30 중량부의 감초, 1.5 내지 15 중량부의 진피를 투입하여 온도를 100 ℃ 까지 상승시킨 후 추출하는 단계를 포함한다. 추출조에 100 내지 1000 중량부의 물을 다시 첨가하고, 7.5 내지 75 중량부의 상엽을 투입한다. 추출온도를 60 ℃ 내지 95 ℃까지 상승시켜 10 내지 40분간 추출한다. 추출액은 여과하여 농축함으로써 엽류 및 한약재 농축액을 제조한다, 상기 여과방법은 통상의 여과방법이 바람직하고, 망을 통한 여과, 하우징필터여과, 규조토 여과가 더욱 바람직하며, 가장 바람직하게는 100 메쉬 망 여과, 1 ㎛ 하우징 필터 여과, 규조토 여과가 좋다. 1차 추출액 후 남은 슬러지는 400 내지 4000 중량부의 물을 더욱 첨가하여 추출하고 여과함으로써 엽류 및 한약재 농축액을 제조하는 것이 바람직하다.
혼합 및 분말제조단계는 상기 과채류 여과액과 엽류 및 한약재 농축액에 분말가루로 된 50 내지 500 중량부의 녹차엽에서 추출한 녹차 유효성분을 넣고 균일하게 잘 혼합하고, 고속 원심분리기를 이용하여 침전물을 제거한 후 건조하는 것을 포함한다. 건조는 통상적인 방법이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 분사 건조가좋다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 니코틴 분해용 기능성 제제
과채류 여과액 제조단계
껍질을 제거한 말리지 않은 은행알 60 kg과 깨끗이 씻은 샐러리, 사과, 레몬 각각 24 kg을 분쇄기에 넣고 분쇄한 후 착즙을 하였다. 착즙한 후의 슬러지에 물 100 L를 첨가하여 30분간 교반한 다음 다시 즙을 짜내어 1차 착즙액과 합쳤다. 착즙액은 100 메쉬망에 여과한 다음 규조토 여과하여 4 ℃에 보관하였다.
엽류 및 한약재 농축액 제조단계
1.5 톤 탱크에 물 0.5 톤을 투입하고 감초 24 kg, 진피 12 kg을 첨가하여 온도를 100 ℃까지 상승시킨 후 2시간 추출하였다. 여기에 다시 0.2 톤의 물을 넣고, 상엽 60 kg을 투입하여 80 ℃까지 상승시켜 30분간 1차 추출하였다. 1차 추출액을 따로 보관하고, 추출하고 난 슬러지에 물 0.5톤을 투입하여 80 ℃까지 상승시켜 30분간 2차 추출하였다. 1차 추출액과 2차 추출액을 합쳐 100 메쉬망으로 여과하고, 1 ㎛ 하우징필터로 여과 후 다시 규조토로 여과하여 농축하였다.
혼합 및 분사 건조단계
상기 과채류 추출여과액, 엽류 및 한약재 농축액, 및 녹차엽에서 추출한 녹차 유효성분인 분말가루 100 kg을 균일하게 잘 혼합하고, 고속 원심분리기를 이용하여 침전물을 제거한 후 분사 건조 방식으로 니코틴 분해제제를 제조하였다.
실시예 2: 니코틴 분해용 기능성 음료
상기 실시예 1의 니코틴 분해용 기능성 제제 0.1 g 내지 0.8 g에 물을 100 ㎖ 혼합하여 기능성 음료를 제조하였다.
실시예 3: 직접 혼합(direct mixing)에 의한 니코틴 분해능 측정
상기 실시예 1에서 제조한 니코틴 분해용 기능성 제제에 니코틴을 분해하는 물질이 있는지 분석하기 위하여 물과 니코틴 분해용 기능성 제제에 각각 니코틴을 직접 혼합하여 니코틴 분해기능을 측정하였다.
상기 물은 대조군이다. 실험방법은 에펜도르프(Eppendorf) 튜브(1.5 ml)에 1 mM의 니코틴(nicotine(-), catalog number N3876) 200 ㎕와 200 ㎕의 기능성 제제액(0.3 %)을 잘 혼합한 후 0, 10, 20, 30, 60, 120분 경과 후 생성된 코티닌의 양을 코니틴 정량법으로 측정하여 도 5에 나타내었다. 이 때 측정온도는 25 ℃이었다.
코티닌 정량은 Barlow 등(Barlow, R. D., Stone, R. B., Wald, N. J., and Puhakainen, E. J. (1987)Clin. Chim. Acta.,165, 45-52)에 의해 1987년에 개발된 방법을 변형하여 사용하였다. 구체적인 방법은 다음과 같다.
1.5 ml 폴리프로필렌(polypropylene) 튜브에 200 ㎕의 샘플 및 기준시료(stsndard)를 완충용액 또는 증류수에 넣었다. 이때 실험결과의 신뢰성을 기하기 위하여 한 샘플 당 3개의 튜브를 사용하였다. 측정대상시료에 100 ㎕의 4 M 염화아세테이트완충액(pH 4.7), 40 ㎕의 1.5 M KCN, 40 ㎕의 0.4 M클로라민(chloramine)-T, 50 부피%의 아세토니트릴(acetonitrile) 수용액에 용해한 78 mM 바르비투르산(barbituric acid) 200 ㎕을 순서대로 넣고 10초 동안 잘 혼합하였고, 혼합물을 상온(25 ℃)에서 15분간 반응시킨 다음 40 ㎕의 1 M 염화 메타바이설파이트(sodium metabisulphite)를 넣어 반응을 중지시켰다. 흡광도는 490 nm에서 측정하여 기준 코티닌(standard cotinine)과 비교하여 정량하였다.
또한 15 및 37 ℃에서도 상기와 같은 실험 방법을 이용하여 코티닌의 양을 측정하였다. 서로 다른 온도를 사용한 이유는 코티닌의 생성 촉진에 관여하는 과정이 순수한 화학적 반응인지 아니면, 효소 등의 생물학적 촉매가 관여하는 사항을 검증하기 위한 것이었다. 온도를 달리하여 실험한 결과는 상온(25 ℃)에서 측정한 결과와 거의 동일하여 화학적 반응에 의한 것임을 알 수 있었다.
도 5는 본 발명의 니코틴 분해용 제제에 의한 니코틴의 코티닌로의 분해를 확인한 그래프로, 니코틴 분해용 기능성 제제는 코티닌 흡광도가 3.0이었으나, 대조군인 물의 경우 1.3 정도에 불과하여 본 발명의 기능성 제제의 니코틴 분해능이 우수함을 알 수 있었다. 또한 기능성 제제가 존재하지 않는 조건하에서는 니코틴의 분해물로의 전이는 10-20분 사이에서 매우 느린 것이 관찰된 반면에, 니코틴 분해용 기능성 제제의 존재 하에서는 현격한 코티닌의 생성이 관찰되었다. 이는 본 발명의 니코틴 분해용 기능성 제제가 니코틴과 시험관 상태에서 반응하여 니코틴의 분해를 가속화시킨다는 것을 나타내는 것이다.
실시예 4: 세포배양을 이용한 니코틴 분해능 측정
세포에 니코틴 및 니코틴 분해용 기능성 제제를 처리하여 니코틴 분해로 생성된 코티닌을 측정하였다. 니코틴은 약 30여분의 반감기를 갖고 있으나 코티닌의 경우 15시간 이상의 반감기를 가지고 있어 니코틴의 무독화 생성물로의 전이를 안정적으로 측정할 수 있다.
인간의 간세포(hepatocyte)에서 연유한 FLCFR5 세포 1주일간 배양하여 소량씩 분주하여 모세포(Stock cell)를 제조하였다. 정량을 위하여 분주된 간세포를 컨플루언시(confluency)가 100 % 될 때까지 1주일간 배양하고 다시 니코틴이 함유된 배지(5 % FBS가 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium), 1 mM 니코틴)에서 1일간 추가 배양하였다. 배양된 세포에 기능성 제제(0.3 %) 120 ul을 첨가하여 배양하면서 각각 10분, 20분, 30분, 60분, 120분의 시간대별로 세포를 수집하였다. 수집한 세포는 PBS (phosphate buffered saline)로 3 내지 4 차례 씻어낸 후 스크레퍼를 사용하여 긁어서 수확하였다. 원심분리를 이용하여 세포가 수거된 후, 4 ℃ PBS 100 ul를 넣고 초음파 분쇄기 (Vibra Cell-200; Newton, Conn., USA)로 단속적으로 30초간 파쇄한 후 DBA(Direct Barbituric Acid)법을 이용하여 490 nm의 파장에서 코티닌의 생성을 측정하였다. 또한 대조군으로 기능성 제제액 대신 물을 사용하여 동일하게 실시하였다.
도 6은 세포에 니코틴을 처리한 다음 본 발명의 니코틴 분해용 기능성 제제를 처리하여 니코틴 분해능을 측정한 그래프이다. 그 결과, 본 발명의 니코틴 분해용 기능성 제제를 적용한 경우가 대조군의 물을 적용한 경우보다 코티닌의 생성량이 많음을 알 수 있었다.
또한 니코틴 분해용 기능성 제제 성분이 세포내에 기 흡수되어 존재할 경우,신규 유입되는 니코틴의 분해에 대한 효용성을 검증하였다.
기능성 제제가 함유된 배지(배지 1 ml당 120 ㎕의 기능성 제제가 함유됨)에 6시간 동안 FLCFR5 세포를 예비 배양하였다. 예비 배양이 완료된 후 상기 세포를 PBS로 세척하고, 니코틴이 함유된 배지에 세포를 배양하였으며, 상기와 동일한 방법을 사용하여 세포내의 코티닌 함량을 측정하였다.
도 7은 본 발명의 니코틴 분해용 기능성 제제가 침착된 세포내에서 니코틴 분해능을 측정한 것으로, 기능성 제제액을 미리 투여한 후 니코틴을 첨가한 세포가 기능성 제제액을 섭취하지 않은 세포에 비하여 코티닌 생성량이 많으며 도 6의 기능성 제제액을 첨가한 후 측정한 코티닌 생성량과 비교하였을 때 세포내에 기 존재하는 조건하에서 니코틴의 분해와 거의 비슷한 양상을 나타내었다. 상기 결과로 미루어 본 발명의 니코틴 분해용 기능성 제제를 장기 복용하거나 흡연직전에 음용할 경우에 큰 차이를 나타내지 않을 것이라 추정된다.
도 6과 도 7의 니코틴 분해용 기능성 제제의 니코틴 분해결과가 도 5의 직접 혼합법의 경우와 같은 패턴을 보인 것은 다음의 의미로 해석할 수 있다. 니코틴 분해의 효능이 있는 성분은 세포막의 투과에 있어 용이성을 보이고, 세포내에서 안정성을 유지할 수 있다는 것이다. 물질의 안전성은 세포의 연령에 관계없이 동일한 유형을 보인다. 완전 컨플루언시의 상태로 동일하게 분획된 세포를 추가로 배양하여 세포가 60-100 % 컨플루언시에 도달한 것에서도 동일한 유형이 관찰되었다. 니코틴의 분해는 니코틴 분해용 기능성 제제가 존재할 때 두드러지게 가속화된다. 이는 니코틴 분해용 기능성 제제에 의한 니코틴 분해의 촉진 및 코티닌의 생성 촉진은 녹차를 마시는 흡연자에 있어, 비타민 C의 보충 및 카테킨에 의한 니코틴 흡착에 기인할 것이라는 일반적인 통념에 배치되는 것으로 볼 수 있다. 상기 두가지 이유라면, 녹차 추출물의 존재하에서 니코틴의 코티닌으로 전이가 촉진되는 현상을 설명할 수 없으므로, 기능성 제제의 성분 중 알려지지 않은 물질이 관여하거나, 전혀 다른 기전에 의해 니코틴에서 코티닌으로의 전이를 촉발한다는 가정을 제시할 수 있다. 흡착을 통한 카테킨에 의한 니코틴을 위시한 독성물질의 침강 가설은 세포내 자유 니코틴의 양을 줄여줄 수는 있음을 설명할 수 있다. 그러나, 니코틴 분해용 기능성 제제 성분의 존재 조건하에서 배양시간 증가에 따른 지속적인 코티닌의 양의 증대가 관찰되었다. 이 실험의 결과는 카테킨 외에 알려지지 않은 기능성 제제 성분물질이 니코틴의 분해에 효능을 발휘하고 있음을 나타내는 것이다.
실시예 5: 제노푸스 미숙란을 이용한 니코틴 분해능 측정
니코틴 또는 기능성 제제가 배양액에 투입된 시간과 실제 세포내로 침투된 시간 사이의 시차를 배제하기 위하여 제노푸스 난모세포인 미숙란에 니코틴 또는 니코틴 분해용 기능성 제제를 직접 주사하여 코티닌 생성량을 측정하였다.
미숙란은 모체에서 분리한 후 지름이 1.0 내지 1.2 mm에 해당되는 단계 IV 또는 V의 것을 선택하여 섭씨 15 ℃의 OR2 용액(Byrd, G. D., Chang, K-M., Greene, J. M., deBethizy, J. D. (1992)Drug. Metab. Dispos.,20, 192-197)에서 하루정도 배양하였다. 배양 후 미숙란은 사용하기 전에 포셉(watchmaker forcep)으로 보호막을 직접 제거하였고, 다수의 보호막이 제거된 미숙란 준비는 콜라게나제 3형(Collagenase type 3, Sigma)을 이용하여 실시하였다(Lee DH. (1998)J.Biochem. Molecular Biology,31(2), 196-200).
니코틴 1 mM과 기능성 제제액(0.3 %) 120 ul가 혼합된 혼합액 500 nl를 미숙란에 미세조작기로 주입하였다. 주입 후 미숙란은 15 ℃, 25 ℃(실온), 32 ℃에서 각각 배양하면서 배양시간별(0', 10', 20', 30', 60', 120') 미숙란을 수집하여 OR2 용액상에서 호모게네이션(dounce homogenizer)을 실시하였다. 상기 호모게네이트는 원심분리하여 난황을 제거하였고, 상층액을 취하여 코티닌 정량을 실시하였다. 또한 주사기법의 효용성을 대비하기 위하여, OR2 배양액에 세포배양실험에서 사용된 니코틴 및 기능성 제제의 농도하에서 동일한 배양시간대 동안 기능성 제제의 니코틴 분해 효능을 검증하였다.
도 8은 본 발명의 니코틴 분해용 기능성 제제를 니코틴과 함께 제노푸스 난모세포에 주입하였을 때 니코틴 분해능을 측정한 것으로, 세포에 투입한 도 6에 비하여 높은 니코틴 분해능을 나타내었다. 또한 제노푸스 난모세포의 배양온도별 반응도를 측정하였으나 온도별 차별성을 관찰되지 않았다.
실시예 6: 임상실험에 의한 니코틴 분해능 측정
(1) 코티닌 분해능 측정
니코틴 분해용 기능성 제제의 니코틴 분해에 관한 효능을 검증하기 위하여 시중에서 판매되는 담배 중 디스(THIS)를 선택하여 하루에 15 - 25개피의 담배를 피는 20대의 건장한 남자(17 - 20명)를 대상으로 임상실험을 실시하였다.
실험에 확실성을 기하기 위하여, 수회 반복 실시하여 통계처리하였으며, 물을 마시는 대조군과 기능성 제제를 마시는 실험군은 다른 날에 실시하였고, 몸의상태와 실험하는 시간대를 가능한 일치시켰다. 37명의 실험자들은 평소처럼 흡연을 하게 하였으며, 1차 뇨 채취후 물 또는 기능성 제제액 130 ml을 마시게 한 다음 흡연을 시킨다음 30분 후 2차 뇨를 채취하였다. 5분후 다시 물 또는 기능성 제제액을 130 ml 마시고, 흡연을 하게한 다음 1시간 후 3차 뇨를 채취하였다(도 9).
채취한 1차, 2차, 그리고 3차 뇨는 즉시 영하 20 ℃에 보관하고 48시간 후에 꺼내어 일괄적으로 뇨중의 니코틴 주요 대사산물인 코티닌을 정량하였다. 자세한 방법은 다음과 같다.
뇨 또는 표준시료(코티닌)를 1.5 ml 튜브에 500 ㎕ 넣었다. 실험에 신뢰성을 기하기 위하여 한 시료당 2개의 튜브를 사용하였다. 시료에 250 ㎕의 4 M 염화아세테이트 완충액(pH 4.7), 100 ㎕의 1.5 M KCN, 100 ㎕의 0.4 M 클로라민(chloramine)-T, 50 v/v%의 아세토니트릴(acetonitrile) 수용액에 용해한 78 mM의 바르비투르산(barbituric acid) 500 ㎕을 순서대로 첨가하였다. 바르비투르산을 첨가한 다음 10초간 잘 혼합하고, 혼합물을 상온(25 ℃)에서 100 rpm으로 15분 동안 반응시킨 후 1 M 소듐 메타바이설파이트 100 ㎕를 넣어 반응을 종결시켰고, 490 nm에서 흡광도를 측정하여 표준곡선과 비교하여 정량하였다.
도 10은 본 발명의 니코틴 분해용 기능성 제제를 섭취한 흡연실험자에 대한 니코틴 분해능을 측정한 것으로, (A)는 대조군으로 실험자가 물 마시고 담배를 피운 후 배출한 소변에 대하여 코티닌 정량을 실시한 것이고, (B)는 기능성 제제액을 마시고 담배를 피운 후 배출한 소변에 대하여 코티닌 정량을 실시한 것이다.
도 11은 본 발명의 니코틴 분해용 기능성 제제를 섭취한 흡연실험자에 대한니코틴 분해능을 코티닌 평균값으로 그래프화한 것으로, 대조군에 비하여 기능성 제제를 섭취한 실험군의 뇨에서 코티닌 양이 많아 기능성 제제에 의한 니코틴 분해능이 높음을 확인할 수 있었다.
도 12는 니코틴 분해용 기능성 제제 또는 물을 마신 후 흡연한 남자의 각 뇨 중에 포함되어져 있는 코티닌을 각개인의 비로 나타낸 값을 평균한 것으로, 각 개인의 2차 또는 3차 뇨를 1차뇨로 나눈 값을 전체 평균하여 기능성 제제와 물을 비교하였다.
니코틴 분해율은 2차뇨와 3차뇨의 코티닌 생성률을 기초로 한 것으로, 1차, 2차, 3차뇨 채취시 뇨중의 잔존하는 코티닌은 모두 배출되는 것으로 나타나 흡연으로 인한 니코틴이 코티닌으로 분해됨을 알 수 있었다. 또한 실험군의 니코틴 분해율(코티닌 생성률)은 대조군의 니코틴 분해율의 약 2배에 달한다는 것을 알 수 있었다. 이는 본 발명의 기능성 제제가 체내에서 니코틴에서 코티닌으로의 분해를 촉진시킴을 나타내는 것이다.
(2) 기능성제제 정제
기능성 제제을 정제로 제조하였다.
담배를 피운지 2년 이상 된 20-30대 초반의 남자 40명을 두 그룹으로 나누어 이틀동안 임상실험을 실시하였다.
먼저, 두 그룹 모두 기능성 제재를 복용하지 않고 8시간동안 한시간마다 흡연을 하고, 5번의 뇨를 채취하였다(1시간, 2시간, 3시간, 5시간, 8시간). 다음날 그룹 1은 기능성 정제를 1회 2정씩 3회 복용하고, 그룹 2는 1회 6정을 일시 복용시켜 뇨를 채취하였다.
<실험방법>
대조군(그룹 1 & 그룹 2) : 물 200 ml 섭취 + 흡연 -> 1시간 후 1차 뇨 채취, 물 200 ml 섭취 & 흡연 -> 1시간 후 2차 뇨 채취 & 흡연 -> 1시간 후 3차 뇨 채취, 물 200 ml 섭취 & 흡연 -> 1시간 후 흡연 -> 1시간 후 4차 뇨 채취, 물 200 ml 섭취 & 흡연 -> 1시간 후 흡연 -> 1시간 후 흡연 -> 1시간 후 5차 뇨 채취
그룹 1: 정제 2정 복용, 물 200 ml 섭취 + 흡연 -> 1시간 후 1차 뇨 채취, 물 200 ml 섭취 & 흡연 -> 1시간 후 2차 뇨 채취 & 흡연 -> 1시간 후 3차 뇨 채취, 정제 2정 복용, 물 200 ml 섭취 & 흡연 -> 1시간 후 흡연 -> 1시간 후 4차 뇨 채취, 정제 2정 복용, 물 200 ml 섭취 & 흡연 -> 1시간 후 흡연 -> 1시간 후 흡연 -> 1시간 후 5차 뇨 채취
그룹 2: 정제 6정 복용, 물 200 ml 섭취 + 흡연 -> 1시간 후 1차 뇨 채취, 물 200 ml 섭취 & 흡연 -> 1시간 후 2차 뇨 채취 & 흡연 -> 1시간 후 3차 뇨 채취, 물 200 ml 섭취 & 흡연 -> 1시간 후 흡연 -> 1시간 후 4차 뇨 채취, 물 200 ml 섭취 & 흡연 -> 1시간 후 흡연 -> 1시간 후 흡연 -> 1시간 후 5차 뇨 채취
채취된 뇨는 즉시 영하 20 ℃에 보관하고 48시간 후에 꺼내어 일괄적으로 뇨 중의 니코틴 주요 대사산물인 코티닌을 정량하였다.
| 1차 | 2차 | 3차 | 4차 | 5차 | ||
| 대조군 | 그룹1 코티닌 평균값(μM) | 16.46 | 10.84 | 12.59 | 13.84 | 9.98 |
| 그룹2 코티닌 평균값(μM) | 34.86 | 15.48 | 21.49 | 28.59 | 19.14 | |
| 그룹1 코티닌 평균값(μM) | 19.29 | 11.95 | 18.51 | 18.88 | 16.32 | |
| 그룹2 코티닌 평균값(μM) | 42.26 | 31.37 | 32.72 | 36.72 | 25.48 | |
| 그룹1 코티닌 증가율(%) | 17.2 | 10.2 | 47.0 | 36.4 | 63.5 | |
| 그룹2 코티닌 증가율(%) | 21.2 | 102.6 | 52.3 | 28.4 | 33.1 |
상기 표 1에서 전체 임상실험자의 소변 내 코티닌 농도는 기능성 제제를 복용하였을 때 물만 섭취하였을 때보다 약 60-100% 까지 증가하였으며, 기능성 제제를 하루에 3번 나누어 복용하였을 때 일정하게 뇨 중의 코티닌 농도가 유지되어짐을 알 수 있었다. 반면에 기능성 제제를 일시 복용한 경우 2시간째에 이미 다른 군들과는 다르게 뇨 중의 코티닌 농도를 일정하게 유지하였지만 10시간정도에 이르러서는 거의 대조군과 비슷해지는 것을 볼 수 있었다.
실시예 7: 니트로소 화합물 생성 억제효과
본 발명의 니코틴 분해용 기능성 제제가 발암성의 니트로사민 부산물의 형성 억제여부를 실험하였다.
실험은 미국특허 제 5,087,671호(polymers for scavenging nitrosating agents)를 기본 개념으로 하여 뇨 중의 니코틴 대사물질인 코티닌을 검출하는 DBA(Direct barbituric acid) 방법과 가스 크로마토그래피의 전처리 방법을 서로 응용하여 실험을 수행하였다.(Joseph, D., Lajos H., Nigel, H., Stanley, I. R., and Timothy, T. (1992)J. Chromatogr.,579, 93-98)
니트로사민 부산물은 아질산, 아질산 에스테르, 아질산 티오에스테르, 무수 아질산, 니트로실 할라이드, 니트로실 금속, 무기금속아질산 복합체(inorganic metal nitrite complexes)와 같은 니트로소화제(nitrosating agents)가 아민 또는다른 질소를 포함하는 화합물과 반응하여 형성되며, 주로 아민과 니트로소화제의 반응결과이다. 일차적인 니트로소화제는 산에서 아질산염(sodium 또는 potassium nitrite; NaNO2, KNO2)로부터 형성되어지는데, 형성되는 반응산물 니트로소화제는 질산(HNO2)이다.
(화학식 1)
실시예 1의 니코틴 분해용 기능성 제제와 함께 대조구로 EGCG, 퀘르세틴, 카테킨, 비타민 C 및 가루녹차를 시료로 사용하였다. 각 반응 시료는 2.5, 5, 10, 15, 20 mg/ml의 농도를 사용하였으며, 모폴린을 첨가하지 않은 아질산나트륨을 200 mM로 첨가한 것을 음성대조구로 하여 실험을 수행하였다. 각 반응에서 니트로소화제인 NaNO2를 첨가하지 않은 시료를 공실험으로 설정하였다.
각 반응시료를 농도별로 15 ml 코닝 튜브에 첨가하고, 공실험구와 실험구, 음성대조구를 표기하였다. 각 튜브에 빙초산 1 ml씩 분주하였고, 2 M NaNO2를 100 ㎕씩 공실험구를 제외한 튜브에 첨가하고, 증류수로 최종부피가 2 ml이 되도록 하였다. 37 ℃에서 10분 동안 반응시킨 후 모폴린 176 ㎕를 첨가하여 2 M이 되게 하였으며, 다시 37 ℃에서 30분 동안 반응시켰다. 5 N NaOH를 3.8 ml 첨가하여 pH 10 내지 12로 맞추어 반응을 종결하였으며, 상기 시료들을 DBA 방법에 따라 측정하여 공실험구(니트로소화제인 NaNO2를 첨가하지 않은 시료)와 음성대조구(모폴린을 첨가하지 않고 NaNO2만 200 mM로 첨가)등과 비교하였고, 실험결과는 도 13과 같다.
니트로소모폴린의 생성율(NMOR %)은 하기 식 1로 환산하였다.
(식 1)
NMOR(%) = [(t0- blank) - (t30- blank)] ÷ (t0- blank)
blank ; 각 반응에서 니트로소화제인 NaNO2를 첨가하지 않은 시료
t0 ; 모폴린을 첨가하지 않고 NaNO2만 200 mM로 첨가한 시료
t30 ; 각 시료들의 니트로소모폴린 생성이 정상적으로 반응한 시료
도 13은 니트로소모폴린의 생성율을 나타낸 그래프로, 퀘르세틴, 카테킨, 비타민 C, 가루노차, EGCG 및 니코틴 분해용 기능성 제제에 의한 니트로소모폴린의 생성 억제율을 나타내었다. EGCG가 가장 우수한 니트로소 화합물 형성 억제능을 나타내었고, 가루녹차와 비타민 C는 가장 낮은 니트로소 화합물 형성 억제능을 나타내었다. 본 발명의 니코틴 분해용 기능성 제제는 퀘르세틴이나 카테킨과 비슷한 수준으로 니코틴 분해제제 20 mg/ml의 농도에서 약 75 %의 모폴린으로부터 니트로모폴린의 생성억제능을 보였다. 즉 본 발명의 기능성 제제는 발암성의 니트로소-화합물 형성을 억제하는 것으로 나타났다.
실시예 8: 니코틴 분해용 기능성 제제의 사이토크롬 P
450
활성 억제능 실험
사이토크롬 P450(이하 "CYP"라 함)은 간이나 폐에서 해독작용에 관여하는 주요효소이다. 간에는 다양한 종류의 CYP가 각기 다른 기능을 가지고 있으며, 이 중 CYP 2A6, 2B6, 2C8, 2C9, 2D6, 2E1, 2F1 등은 니코틴에서 코티닌으로의 대사에 관여한다. NNK(4-methylnitrosoamino-1-3-pyridyl-1-butanone)는 실험실 동물에게 프로-발암물질(pro-carcinogen)이며, 간과 폐에서 주로 CYP 1A2, 2A6, 3A4에 의해 발암물질로 대사 된다. 니코틴의 대사과정은 도 14와 같다.
쥐(Sprague-Dawley rat)에서 Aroclor 1254(Sigma, USA)로 간의 CYP를 유도하여 간을 적출한 후 다양한 시험물질에 대하여 NNK 활성화에 관여하는 CYP의 억제능을 측정하였다. 자세한 실험방법은 다음과 같다.
7주령의 웅성 쥐(Sprague-Dawley rat)의 복강에 Aroclor 1254를 500 mg/kg 용량으로 주사하였다. 주사 5일 후 무균조작 상태에서 간을 적출하여 4 ℃에서 0.15 M KCl 용액으로 호모게나이저(homogenizer)를 사용, 균질화하였다. 균질액은 9000 g에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 수거하여 본 실험에 사용하였다. CYP 2B1/2/4의 기질인 펜톡시레소루핀(pentoxyresorufin, Sigma USA)과 CYP 1A1의 기질인 에톡시레소루핀(ethoxyresorufin, Sigma USA) 및 CYP 1A2의 기질인 메톡시레소루핀(methoxyresorufin, Sigma USA)을 이용하여 CYP의 활성도를 측정하였다. 또한 EGCG, 퀘르세틴, 카테킨, 가루녹차를 대조구로 하여 상기 실시예 1의 기능성 제제와 비교하였다. 위의 각 반응시료(억제물질)와 간에서 적출한 상등액과 각CYP의 특이적인 기질을 이용하여 CYP의 활성도 억제능을 비교하였다. 기질이 효소에 의해 분해되어 형광을 나타내면 스펙트로플루오로포토미터 (spectrofluorophotometer)로 효소 활성도를 측정(excitation at 522 nm and emission at 586 nm)하였다. 각 반응시료의 농도는 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 mg/ml이 되도록 하였으며, 간 적출액의 단백질 양은 500 ㎍/ml이 되도록 하였다. 각 기질은 원액용액을 2.5 uM로 만들어 10 ㎕를 첨가하여 최종 25 nM이 되도록 하였다. 조효소로는 β-NADPH(Sigma, USA) 5 mM의 원액을 20 ㎕를 사용하였다. 나머지는 50 mM Tris-HCl(pH 7.4) 완충용액을 이용하여 최종부피가 1 ml이 되도록 하였다. 37 ℃에서 20분 반응한 후 2 ml의 메탄올을 첨가하여 반응을 정지시켰으며, 2000 rpm에서 2분동안 원심분리하여 상등액을 RF-5301 PC 스펙트로플루로로포토미터 (SHIMADZU, Japan)로 효소 활성도를 측정(excitation at 522 nm and emission at 586 nm)하였다. 결과는 도 15와 같다.
도 15는 본 발명의 니코틴 분해용 기능성 제제가 CYP 효소 활성에 영향을 미치는지 측정한 것으로, (A)는 퀘르세틴의 CYP 억제능을 나타낸 것이고, (B)는 카테킨, (C) 는 기능성 제제, (D)는 가루녹차에 대한 CYP 억제능을 도시한 것이다. PROD는 펜톡시레소루핀 디알킬레이즈(pentoxyresoru fin dealkylase, CYP 2B1/2/4)를, EROD는 에톡시레소루핀 디알킬레이즈(ethoxyresorufin dealkylase, CYP 1A1)를, MROD는 메톡시레소루핀 디알킬레이즈(methoxyresorufin dealkylase, CYP 1A2)를 의미한다. 기능성 제제는 CYP 2B1/2/4, CYP 1A1 및 CYP 1A2의 활성을 모두 저해하였다.
도 16은 본 발명의 니코틴 분해용 기능성 제제가 CYP 1A2 효소의 활성에 미치는 억제효과를 나타낸 것으로, CYP 1A2의 활성도는 퀘르세틴 >> 기능성 제제 >> 카테킨 ≒ 가루녹차 순으로 억제되었다. 기능성 제제 1.0 mg/ml는 CYP 1A2 효소활성을 완전히 억제함을 확인할 수 있었다.
또한, 순수정제한 RECO System CYP 1A2(PanVera Co, USA)를 이용하여 기능성 제제 및 EGCG, 퀘르세틴, 카테킨, 가루녹차의 효소활성 억제능을 측정하였다.
효소 혼합액의 조성은 0.5 uM CYP1A2, 0.2 uM NADPH P450환원제, 0.5 ㎍/μL CHAPS, 0.1 ㎍/μL 리포좀(dilauroyl phosphotidylcholine, dileoyl phosphotidylcholine, dilauroyl phosphotidylcholine(1:1:1)), 3 mM 환원형 글루타치온, 50 mM HEPES/KOH (pH 7.4)이고, 완충용액은 1 M 포타슘/소듐 포스페이트(potassium/sodium phosphate)이다. 3차 멸균증류수 768 ㎕, CYP 1A2 완충용액 126.7 ㎕, 1 mM 메톡시레소루핀 5.3 ㎕를 차례대로 첨가하여 950 ㎕의 용액을 만들어, 37 ℃에서 미리 가온하였다. 완충용액과 기질혼합액 85 ㎕에 효소활성억제물질을 최종농도가 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 mg/ml이 되게 5 ㎕씩 첨가하였으며, CYP 1A2 효소혼합액 5 ㎕, 그리고 5 ㎕의 50 mM NADPH를 첨가하면서 37 ℃에서 반응을 시작하였다. 20분동안 반응을 하였고, 1 ml의 메탄올을 넣어 반응을 중지시켰다. RF-5301 PC 스펙트로플루오르포토미터(SHIMADZU, Japan)를 이용하여 효소 활성도를 측정(excitation at 522 nm and emission at 586 nm)하였다.
도 17은 순수분리 정제한 CYP 1A2 효소에 대한 기능성 제제의 활성억제효과를 측정한 것으로, EGCG >> 기능성 제제 >> 퀘르세틴 >> 가루녹차 >> 카테킨의 순으로 CYP 1A2의 활성도가 억제되었으며, 기능성 제제(■)가 0.1 mg/ml일 때 순수한 CYP 1A2 효소 활성을 완전히 억제함을 알 수 있었다.
실시예 9: 항돌연변이 효과
NNK는 담배 중에 일정농도(약 0.1-0.5 ng)가 포함되어 있으며, 담배의 니코틴이 생체내에 들어가 대사되어 형성되기도 하는 물질로 체내에서 매우 유독한 물질이다. NNK는 생체내에서 P450등의 효소에 의해 대사되어 폐암 등을 유발하는 물질이며, 또한 벤조피렌도 담배내에 소량 함유되어 있어 돌연변이원으로 작용한다.
니코틴 분해용 기능성 제제가 NNK(Chemsyn. Lab. USA)와 벤조피렌(Sigma, USA)이 유발하는 돌연변이능을 억제하는 항돌연변이 효과를 알아보기 위하여 히스티딘(Histidine) 요구성 균주인 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)TA100과 TA1535를 이용하여 엠즈실험(Ames test)으로 돌연변이 억제효능시험을 실시하였다.(Maron, D., Ames, B. N. (1983) Revised methods for the Salmonella mutagenicity test.Mutation Research,113, 173-215)
7주령의 웅성 쥐(Sprague Dawley rat)의 복강에 Aroclor 1254(Sigma, USA)를 500 mg/kg 용량으로 주사하였다. 주사 5일 후 무균조작 상태에서 간을 적출하여 4 ℃에서 0.15 M KCl 용액으로 호모게나제를 이용하여 균질화하였다. 균질액은 9000 g에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 수거하여 S-9 혼합액을 제조하여 본 실험에 사용하였다. S-9 혼합액의 조성은 10 ㎖을 기준으로 하였을 때, 5 ㎖의 0.2 M인산완충액(pH 7.4), 0.4 ㎖의 0.1 M NADP, 0.05 ㎖의 1 M 글루코스-6-인산(Glucose-6-phosphate), 0.2 ㎖의 0.4 M MgCl2, 1.65 M KCl, 3.35 ㎖의 멸균 3차증류수, 1 ㎖의 간 적출액이다. 시험물질은 EGCG, 퀘르세틴, 카테킨, 가루녹차, 그리고 기능성 제제액을 0.2 ㎛ 필터로 여과하여 사용하였다.
살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) TA100과 TA1535는 영양배지(Difco. Lab. USA)에서 12시간 배양하였다. 12시간 배양액 0.1 ㎖, 시험물질 0.1 ㎖, S-9 혼합액 0.5 ㎖, NNK (10 ㎎/㎖) 0.1 ㎖ 또는 벤조피렌(20 ㎍/㎖) 0.1 ㎖을 혼합하였다. 이 때 시험물질을 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 ㎍/plate의 농도가 되도록 처리하였다. 혼합액을 37 ℃에서 20분 방치한 후 상층아가(containing 0.05 mM histidine, 0.05 mM biotin) 2 ㎖을 섞어서 His-평판배지에 도포하였다. 이 때 각 용량의 평판배지는 3매씩으로 하였고, 37 ℃에서 48시간 배양한 후 복귀돌연변이 군락의 수를 기록하였다. 항돌연변이활성은 His+복귀돌연변이의 저해율(inhibition ratio)로 나타내었다. 돌연변이 억제효능(%)은 하기 식 2로 환산하였다.
(식 2)
돌연변이 억제효능(%) = 100 × [(a-b)/(a-c)]
a: 변이원에 의해 유도된 His+복귀돌연변이의 콜로니 수
b: 변이원과 효능시험물질로 유도된 His+복귀돌연변이의 콜로니 수
c: 자발적인 His+복귀돌연변이의 콜로니 수
도 18은 본 발명의 니코틴 분해용 기능성 제제가 NNK에 의한 돌연변이능(mutagenicity)에 억제효능을 가지는지 대하여 측정한 것으로, (A)와(B)는 기능성 제제(■), 가루녹차(●), 퀘르세틴(◆), 카테킨(▲)의 살모넬라 티피무리움 TA100에 대한 돌연변이 억제능을 나타내었고, (C)와(D)는 기능성 제제(■), 가루녹차(●), 퀘르세틴(◆), 카테킨(▲)의 살모넬라 티피무리움 TA1535에 대한 돌연변이 억제능을 나타내었다.
NNK만 처리한 살모넬라 티피무리움 TA 100의 자연발생적 복귀돌연변이의 수는 173 ±13 이었으며, 살모넬라 티피무리움 TA 1535의 자연발생적 복귀돌연변이의 수는 39 ±12 인 반면에, NNK와 함께 기능성 제제 0.5 mg/plate를 처리하였을 때 거의 살모넬라 티피무리움 콜로니를 형성하지 않아 돌연변이 억제능이 있음을 알 수 있었다.
도 19는 본 발명의 니코틴 분해용 기능성 제제 또는 시험물질에 대한 벤조피렌의 돌연변이억제능을 나타낸 것으로, 기능성 제제(도 19A, ■), 가루녹차(도 19A, ●), 퀘르세틴(도 19B, ◆), 카테킨(도 19B, ▲)의 살모넬라 티피무리움 TA100에 대한 돌연변이 억제능을 나타내었다. 이 때 각 배지에 함유된 벤조피렌의 농도는 2 ㎍/plate이다. 벤조피렌을 처리한 살모넬라 티피무리움 TA 100의 자연발생적 복귀돌연변이의 수는 128 ±9인 반면에, 본 발명의 기능성 제제는 벤조피렌에 의한 돌연변이 발생을 매우 효과적으로 억제함을 보였다.
실시예 10: 항산화 효과
자유 라디칼들이 동맥경화(Palinski, W., Rosenfeld, M. E., Yla, H. S., Gurtner, G. C., Socher, S. S., Butler, S. W., Carew, T. E., Steinberg, D., and Witztum, J. L. (1989)Proc. Natl. Acad. Sci.,86, 1372-1376), 혈관수축에 의한 국소빈혈(Hammond, B., Kontos, H. A., and Hess, M. L. (1985)Can. J. Physiol. Pharmacol.,63, 173-187), 염증(Cheeseman, K. H., and Forni, L. G. (1988)Biochem. Pharmacol., 37, 4225-4233), 발암(Weitzman, S. A., Weitberg, A. B., Clark, E. P., and Stossel, T. P. (1985)Science, 227, 1231-1233), 류마티스성 관절염(Fantone, J. C., and Ward, P. A. (1985)Human Pathol., 16, 973-978)과 같은 넓은 범위의 병을 매개한다는 다양한 증거들이 알려져 왔다. 그러므로, 자유 라디칼 포착제(scavenger)는 자유 라디칼 수준을 감소시킴으로써 효과적인 치료제로써 기대되어지고 있으며, 사람들은 안전하고 효과적인 항산화제의 개발에 초점을 맞추어 왔다.
본 실험에서는 자유 라디칼인 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)와 SOD(superoxide dismutase) 키트(Wako, Japan)를 이용한 O2 -포착(scavenging) 효과를 기능성 제제, 가루녹차, 퀘르세틴 및 카테킨에 대하여 실험하였다.
DPPH는 에탄올과 물을 2 : 1 로 섞은 용매에 녹여 농도를 2 ×10-4M로 고정시켜 사용하였다. 기능성 제제, 가루녹차, 퀘르세틴 및 카테킨은 농도가 DPPH의 1/10 또는 그 이하가 함유되도록 제조하여 1.5 ㎖ DPPH를 큐벳(cuvette)에 넣고 항산화제 용액 1.5 ㎖을 첨가하여 잘 섞어주었다. 섞는 즉시 시간을 측정하여, 시간별 흡광도(523 nm)의 변화를 측정하여 분해율을 계산하였다.
(식 3)
분해율 = (초기 DPPH의 흡광도 - 각 시료가 첨가된 후의 시간별 흡광도) / 초기 DPPH의 흡광도 ×100
크산틴(Xanthine)에 크산틴옥시다아제(xanthine oxidase)가 작용하면 O2 -가 생성된다. 생성된 O2 -는 공존하는 NO2 -TB(nitrobluetetrazolium)를 환원하여 발색반응을 나타내지만 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase; SOD)나 생성된 O2 -제거능을 가진 물질로 인해 그 발색이 저해된다. 이로써 생성된 O2 -의 제거능을 측정할 수 있다. O2 -포착효과에 대한 실험방법은 다음과 같다.
각 시료 0.1 ㎖에 0.4 mM 크산틴/ 0.1 M 인산염완충용액 (pH 8.0) 1 ㎖, 0.048 unit/㎖ 크산틴옥시다아제 1 ㎖를 첨가하고 잘 혼합한 후 37 ℃에서 20 분간 가온하고, 69 mM SDS(sodiumdodecyl sulfate) 2 ㎖를 첨가하여 효소반응을 정지시킨 후 560 nm에서 흡광도를 측정한다. 물을 대조군으로 비교하고, 효소와 시약의 공실험도 동일한 방법으로 측정한다. 자세한 방법은 다음 표 2와 같다.
| 본 검 | 맹 검 | |||
| 검체(S) | 공실험(Bl) | 검체공실험(S-Bl) | 시약공실험(Bl-Bl) | |
| 시료 | 0.1 ㎖ (시료물질) | 0.1 ㎖ (증류수) | 0.1 ㎖ (시료물질) | 0.1 ㎖ (증류수) |
| 발색액 | 1 ㎖ | 1 ㎖ | 1 ㎖ | 1 ㎖ |
| 효소액 | 1 ㎖ | 1 ㎖ | - | - |
| 공실험액 | - | - | 1 ㎖ | 1 ㎖ |
항산화 효율에 대한 계산법은 하기 식 4와 같다.
(식 4)
SOD 활성치 (저해율 %) = (EBl-EBl-Bl)-(ES-ES-Bl)/(EBl-EBl-Bl) × 100
도 20은 기능성 제제, 가루녹차, 퀘르세틴 및 카테킨의 DPPH(1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl)를 이용한 자유라디칼의 포착효과를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다. 기능성 제제액은 가루녹차에 비하여 약 4배 높은 DPPH 라디칼 제거능을 보였다.
도 21은 기능성 제제, 가루녹차, 퀘르세틴 및 카테킨의 O2 -제거효능을 SOD 키트를 이용하여 측정한 그래프이다. 산소 자유라디칼 제거능에 대한 여러 시험물질 실험에서 퀘르세틴이 가장 높은 항산화 효과를 보였지만, 기능성 제제도 정제된 카테킨의 항산화능과 거의 동일한 효능을 보여주었다.
실시예 11: 퀘르세틴 정량
퀘르세틴은 광합성 식물에서만 독특하게 발견되는 플라보노이드이다. 퀘르세틴은 정상적인 건강식이요법을 하였을 때 대략 하루에 약 25 mg정도 소비되는 것으로 추정된다.
또한, 최근에는 항암제로써 1기 임상평가에 조치를 해왔다.(Ferry, D. R.,Smith, A., Malkhandi, J., Fyfe, D. W., deTakats, P. G., Anderson, D., Baker, J., Kerr, D. J. (1996)Cancer Res.2(4):659-68) 퀘르세틴은 항암효과로써의 우수한 역할을 한다는 좋은 증거들이 많이 보고되고 있다. 퀘르세틴 10 uM 정도의 농도에서 유방암(Scambia, G., Ranelletti, F. O., Benedetti, Panici, P., Piantelli, M., Bonanno, G., De Vincenzo, R., Ferrandina, G., Pierelli, L., Capelli, A., Mancuso, S. (1991)Cancer Chemother Pharmacol.28(4):255-8), 백혈병(Larocca, L. M., Piantelli, M., Leone, G., Sica, S., Teofili, L., Panici, P. B., Scambia, G., Mancuso, S., Capelli, A., Ranelletti, F. O. (1990) Type II oestrogen binding sites in acute lymphoid and myeloid leukaemias: growth inhibitory effect of oestrogen and flavonoids.Br J Haematol.75(4):489-95), 자궁암(Scambia, G., Ranelletti, F. O., Benedetti, Panici, P., Bonanno, G., De Vincenzo, R., Piantelli, M., Mancuso, S. (1990) Synergistic antiproliferative activity of quercetin and cisplatin on ovarian cancer cell growth.Anticancer Drugs.1(1):45-8), 위암(Yoshida, M., Sakai, T., Hosokawa, N., Marui, N., Matsumoto, K., Fujioka, A., Nishino, H., Aoike, A. (1990)FEBS Lett.15;260(1):10-3), 결장암(Agullo, G., Gamet, L., Besson, C., Demigne, C., Remesy, C. (1994)Cancer Lett.25;87(1):55-63)의 세포주 증식이 억제된다는 것이 보고되어져 왔다.
본 실험에서는 니코틴 분해용 기능성 제제에 포함되어 있는 퀘르세틴을 정량하였다. 기능성 제제 또는 가루녹차 내에 함유되어있는 퀘르세틴을 추출하기 위하여 메탄올과 DMSO를 4:1로 혼합한 추출용액에 적정량 녹여 30초 동안 강하게 섞어 혼합하였다. 혼합한 용액을 10분 동안 9000 rpm에서 원심분리하고 상등액을 취하여 상등액과 동일한 양의 증류수를 넣고 섞어준 후 역상컬럼(Delta-pak C18, 300Å, Waters510)에 주입하였다. 이동상은 56 %의 0.1 M 암모니움 아세테이트(pH 5.15)와 44 %의 메탄올로 실시하였고, 유속은 0.3 mL/min로 하였다. 흡광도는 M720 흡광검출기(Yongin, Co. Korea)에서 375 nm로 측정하였다.
도 22는 니코틴 분해용 기능성 제제액내의 퀘르세틴 양을 HPLC(high performance liquid chromatography)를 이용하여 정량한 것이다. 도 22의 A의 (a)는 각각 60, 120, 160 ng의 퀘르세틴 농도에 대한 표준 피크를 나타낸 것이고, B의 (b)는 기능성 제제액에 대한 퀘르세틴 피크(피크번호 8)로, 기능성 제제는 56 ng/mg의 퀘르세틴을 함유하였다. 하지만, 도 21의 C에서 볼 수 있듯이, 가루녹차의 분말에서는 5 mg내에서까지도 퀘르세틴 피크를 검출할 수 없었다.
실시예 12: 항암효과 검증
NNK는 담배연기에서 발견되는 발암물질 중에서 다양한 실험동물에 폐암유발을 일으키는 높은 특이성을 나타낸다.(Hoffmann, D., Rivenson, A., Chung, F-L., and Hecht, S. S. (1991)Crit. Rev. Toxicol., 21, 305-311 ; International Agency for Research on cancer. (1986) Tobacco Smoking, Vol 38. Lyon, France: IARC) 또한 담배내에서 발견되는 강력한 발암성을 가진 여러 니트로사민들 중의 하나이며, 이러한 폐암발생 억제능에 대한 녹차, 특히 EGCG의 효과는 많은 논문으로 보고된 바 있다.(Wang, Z. Y., Hong, J. Y., Huang, M. T., Reuhl, K. R.,Conney, A. H., and Yang, C. S. (1992)Cancer Res.52, 1943-1947 ; Xu, Y., Ho, C. T., Amin, S. G., Han, C., and Chung, F. L. (1992)Cancer Res.52, 3875-3879 ; Chung, F. L., Wang, M., Rivenson, A., Iatropoulos, M. J., Reinhardt, J. C., Pittman, B., Ho, C. T., and Amin, S. G. (1998)Cancer Res.58, 4096-4101)
본 실험에서는 니코틴 분해용 기능성 제제와 기존에 나와 있는 녹차를 비교하여 A/J 마우스에서의 폐암발생 억제능의 효과를 알아보았다. 실험은 한국화학연구소에 의뢰하여 실시하였다.
3 주령의 A/J 마우스(Japan SLC, Inc. Japan)를 병원균이 없는 조건에서 표준상태(five mice/cage; 20 ± 5 ℃, 50 ± 15 %, 12h light-dark cycles)로 사육하였다.
NNK를 PBS에 5 mg/ml로 용해하여 준비하였고, NNK 용액을 투여하여 암을 발생시켰다. 6주령의 24마리 수컷쥐를 세 그룹으로 나누었다. N-그룹은 5마리이고 물을 투여한 군, C-그룹은 10마리이고 NNK 및 물을 투여한 군이고, T-그룹은 9마리고 NNK 및 기능성 제제를 투여한 군이다. 각 그룹들은 NNK를 투여하기 전에 3주간 음료로 물 또는 0.6 % 기능성 제제를 투여하였다. 3주 후 N-그룹을 제외하고 다른 그룹들은 10주간 3차례 NNK를 투여하였다. NNK의 단일 투여량은 34.95 mg/kg(몸무게)이다.
6주 후 동물의 몸무게를 측정하였고 이산화탄소를 주입하여 희생시켰다. 동물의 몸무게는 주당 1회 측정하였다. 동물 부검은 한국화학연구소에 의뢰하여실시하였다. 폐, 간 위를 적출하여 무게를 측정하고 10 % 중성 포르말린 완충액에 고정하였다. 각 조직은 5 um의 절편으로 준비하고 헤마톡실린-에오신으로 염색하였다. 또한 폐 조직은 3 mm 간격으로 절편을 준비하였다. 모든 조직 절편들은 현미경상에서 관찰하였다. 암 발생율은 암 발생 동물 수를 각 그룹의 동물수로 나누어 환산하였다.
도 23은 니코틴 분해용 기능성 제제의 NNK에 의해 유도되는 폐암발생에 대한 억제능 효과실험에서 나타나는 각 그룹의 A/J 마우스 체중을 나타낸 그래프이다(◇: 물, ▲NNK+물, ●NNK+기능성제제)
표 3은 기능성 제제에 의한 폐암발생 억제율을 나타낸 것이다.
| N-그룹 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |||||||||
| 폐(절편수) | N(15) | N(16) | N(15) | N(15) | N(15) | |||||||||
| 간 | N | N | N | N | N | |||||||||
| 위 | N | N | N | N | N | |||||||||
| C-그룹 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | sum | total | ||
| 폐 | 절편수 | 14 | 14 | 14 | 15 | 14 | 16 | 15 | 13 | 14 | 15 | 144 | 144 | |
| 아데노마 | 0/2 | 6/5 | 2/4 | 1/3 | 5/7 | 3/9 | 1/4 | 3/4 | 6/7 | 4/4 | 31/49 | 80 | ||
| 하이퍼플라시아 | 2/5 | 4/4 | 1/6 | 6/7 | 2/8 | 3/6 | 5/6 | 6/6 | 3/7 | 4/9 | 39/64 | 100 | ||
| 간 | N | - | N | N | - | N | N | N | - | N | ||||
| 마이크로그래뉼로마 | - | + | - | - | +++ | - | - | - | + | - | ||||
| 위 | N | N | N | N | N | N | N | N | N | N | ||||
| T-그룹 | 폐 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | sum | total | ||
| 절편수 | 14 | 14 | 14 | 14 | 15 | 14 | 14 | 15 | 12 | 126 | 126 | |||
| 아데노마 | 1/5 | 2/5 | 2/8 | 3/4 | 4/2 | 6/1 | 0/3 | 1/2 | 3/3 | 22/23 | 55 | |||
| 하이퍼플라시아 | 0/5 | 2/11 | 7/5 | 1/2 | 2/6 | 2/5 | 2/1 | 2/3 | 1/2 | 19/40 | 59 | |||
| 간 | - | - | N | - | - | N | N | N | N | |||||
| 마이크로그래뉼로마 | - | - | - | + | +++ | - | - | - | - | |||||
| 위 | N | N | N | N | N | N | N | N | N |
(N: 이상 없음, + : 매우 미약한 변화 또는 강한 생리적 변화, ++ : 약한 또는 경도의 변화, +++ : 보통 또는 중등도의 변화)
N-그룹은 자연적인 발암이 관찰되지 않았고, C-그룹은 55.6 %(80/144)의 세기관지 폐포성 종양(bronchiolo-alveolar adenomas)이 관찰되었다. 기능성 제제를 투여한 T-그룹은 폐암 발생율이 현저히 감소하였다(43.6 %, 55/126). 또한 T-그룹의 세기관지 폐포성 종양은 69.4 %에서 46.8로 억제하였다. 본 발명의 기능성 제제를 투여할 경우 C-그룹과 비교하였을 때 폐암발생을 17 % 감소시켰다.
실시예 13: 독성실험
기능성 제제의 단회 경구 투여시 독성여부를 확인하기 위하여 한국화학연구소에 의뢰하여 독성실험을 실시하였다.
1. 실험동물
종: Sprague-Dawley 쥐(BioGenomics Inc.)
Sprague-Dawley 쥐는 독성검사에 널리 사용되는 종이며, 일반적인 자료를 쉽게 확보할 수 있을 뿐만 아니라 설치류의 독성테스트에 요구되는 조건들을 만족한다.
24마리의 4주령 수컷쥐(72.2-81.3 g)를 격리시키고 SPF 조건에 사육시키고, 105.7 내지 118.7 g의 20 마리의 수컷을 실험에 이용하였다. 69.1 내지 80.3 g의 24마리의 암컷을 격리시킨 다음 97.7 내지 112.4g의 건강한 암컷을 선별하여 실험에 사용하였다.
2. 사육조건
사육실은 온도 23 ± 3 ℃, 습도 55 ± 15 %, 공기정화 10 -20 회/hr 광동150 - 300 Lux로 유지하였다. 주야 12시간을 주기로 하였다. 사육실내의 모든 것은 멸균하여 사용하였다. 실험은 미국 실험동물 인증기관(AAALAC)에서 제공한 실험실에서 행하였고 모든 과정은 동물원조 및 제공위원회(IACUC)을 따랐다.
격리 및 관찰기간동안 5마리를 스틴레스 스틸 케이지(220W x 410L x 200 H mm)에 두었다.
3. 식이
실험동물용 사료를 PMI Nutritional International, INC.에서 구입하여 사용하였다. 음료는 UV-조사된 수돗물을 제공하였다.
4. 투여량결정
기능성 제제 5000 mg/lg을 최대 투여량으로 설정하고, 보통 투여치로 2000 mg/kg, 최소량으로 800 mg/kg을 설정하였다.
| 그룹 | 성 | 동물수 | 번호 | 투여액의 부피(ml/kg) | 투여량(mg/kg) |
| 대조군(물) | 수컷 | 5 | 1-5 | 10 | 0 |
| 암컷 | 5 | 21-25 | 10 | 0 | |
| T1 | 수컷 | 5 | 6-10 | 10 | 800 |
| 암컷 | 5 | 26-30 | 10 | 800 | |
| T2 | 수컷 | 5 | 11-15 | 10 | 2000 |
| 암컷 | 5 | 31-35 | 10 | 2000 | |
| T3 | 수컷 | 5 | 16-20 | 10 | 5000 |
| 암컷 | 5 | 36-40 | 10 | 5000 |
5. 투여
기능성 제제를 멸균한 증류수에 녹여 사용하였고, 쥐는 복용전에 하룻밤동안 금식시켜 경구로 투여하였다. 투여후 3 내지 4시간 더욱 금식시켰다.
6. 관찰
의학적인 증상이나 사망률을 경구 투여후 6시간 동안 시간마다 관찰하였고, 이 이후에는 하루에 한번 14일 이상 관찰하였다.
실험동물의 몸무게는 기능성 제제를 투여하기 전에 측정하고 투여 후 1, 3, 7 및 14일에 측정하였다. 14일 후에 실험동물 모두 희생시킨 다음 각 기관과 조직을 적출하였다.
7. 결과
기능성 제제 투여후 사망한 쥐는 나타나지 않아 LD50은 5000mg/kg이상인 것으로 확인되었다. 또한 어떠한 의학적인 증상이나 부작용을 관찰 할 수 없었으며 몸무게 감소 역시 나타나지 않았다.
따라서 기능성 제제의 경구투여시 5000 mg/kg 이하에서 어떠한 독성을 나타내지 않았다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 니코틴 분해용 기능성 제제 또는 기능성 음료는 니코틴의 분해를 가속화시키고, 발암성의 니트로소-화합물 형성을 억제한다. 또한 기능성 제제는 사이토크롬 P4501A2 효소의 활성을 억제하여 NNK에 의한 발암물질 형성을 저해하고, 항산화효과를 나타낼 뿐만 아니라 NNK와 벤조피렌에 의한 돌연변이능을 억제시키고, 폐암발생율을 억제시킨다.
Claims (7)
- (a) 50 내지 500 중량부의 녹차엽 분말;(b) 7.5 내지 75 중량부의 상엽을 끓는 물에서 우려낸 추출액;(c) 3 내지 30 중량부의 사과를 즙으로 만든 액;(d) 3 내지 30 중량부의 감초를 끓는 물에서 우려낸 추출액;(e) 1.5 내지 15 중량부의 진피를 끓는 물에서 우려낸 추출액;(f) 7.5 내지 75 중량부의 은행을 즙으로 만든 액;(g) 3 내지 30 중량부의 샐러리를 즙으로 만든 액; 및(h) 3 내지 30 중량부의 레몬을 즙으로 만든 액;을 포함하는 혼합물을 건조하여 제조되며,니코틴의 코티닌으로의 분해를 촉진하고 발암성의 니트로사민 부산물 생성을 억제하며 니코틴의 발암물질로의 전환을 억제하여 항돌연변이 및 항암효과를 갖는 식품 조성물.
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 식품, 식품첨가제, 음료, 또는 음료첨가제로 사용되어지는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 캡슐 포장하는 것인 식품 조성물.
- 제 1항의 식품 조성물 0.1 내지 0.8 중량%에 물을 혼합하여 제조하는 것을 특징으로 하는 음료.
- (a) 은행, 샐러리, 사과 및 레몬을 착즙하고 여과하여 여과액을 제조하는 단계;(b) 감초, 진피를 100 ℃에서 추출한 다음 상엽을 더욱 혼합 및 재추출하여 여과함으로써 농축액을 제조하는 단계; 및(c) 상기 (a)단계에서 제조된 여과액, 상기 (b)단계에서 제조된 농축액, 및 녹차엽 분말을 혼합하여 여과한 다음 분사건조하는 분말제조단계;를 포함하는 방법을 포함하며,니코틴의 코티닌으로의 분해를 촉진하고 발암성의 니트로사민 부산물 생성을 억제하며 니코틴의 발암물질로의 전환을 억제하여 항돌연변이 및 항암효과를 갖는 식품 조성물의 제조방법.
- 삭제
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