CN1678331A - 胡芦巴种子生物活性组合物及提取该组合物的方法 - Google Patents
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Abstract
一种生物活性化合物的组合物,和用于促进和支持葡萄糖和碳水化合物的代谢和运输到骨骼肌细胞中的方法。优选地,所述生物活性化合物的组合物包括4-羟基异亮氨酸和一种或多种氨基酸,所述氨基酸选自精氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、γ-氨基丁酸和三甲基组氨酸。在本发明的一个优选实施方案中,生物活性化合物提取自胡芦巴种子。本发明也公开了一种用于从胡芦巴种子提取生物活性化合物的组合物的方法,其中所述方法包括如下步骤:(1)提供大量胡芦巴种子;(2)制备胡芦巴种子;和(3)从胡芦巴种子提取生物活性化合物的组合物,其中所述生物活性化合物包括4-羟基异亮氨酸和一种或多种氨基酸,所述氨基酸选自精氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、γ氨基丁酸和三甲基组氨酸。生物活性化合物的组合物,和用于提取该组合物的方法优选地包括在大约10%到70%之间的4-羟基异亮氨酸,和在大约20%到40%之间的氨基酸。
Description
背景
1.发明领域
本发明涉及影响新陈代谢的方法和组合物,更特别地,本发明涉及包括生物活性成分的新颖组合物,这些组合物支持新陈代谢以及糖和碳水化合物在动物和人体中的运输,这些组合物来源于胡卢巴种子(胡芦巴籽,fenugreek seeds),本发明也涉及提取该组合物的方法。
2.背景技术
胡芦巴是一种最古老的草药之一,原产于东南欧洲、北非和西亚,但也广泛种植于世界上的其它地方。胡芦巴在技术上以胡卢巴(Trigonella foenum-graecum)而命名,是豆科(family Fabaceae)的成员,通常被称为希腊草(Greek hay)。正如本技术领域的熟练技术人员所理解的那样,胡芦巴是一种豆科植物,通常长到两到三英尺高,叶子为淡绿色,开小白花。一个胡芦巴种子豆荚中有十到二十个小的、扁平的、黄褐色种子。典型地,一个植物种子在形成时具有称作外种皮的厚或坚硬的外壳,通常被称作种皮。种皮的内部含有一个植物胚和称作胚乳的营养组织,胚乳围绕着胚。随着胡芦巴种子的胚的成熟,胚会消耗胚乳。胡芦巴种子通常具有辛辣的香味,可能具有苦味,据说味道类似于芹菜。
胡芦巴长期以来在亚洲和地中海地区被用作医用草药和烹饪用添加剂。据信,胡芦巴植物的种子含有许多具有医疗用途的活性化合物,如铁、维生素A、维生素B、维生素C、磷酸盐、类黄酮、皂角苷、胡芦巴碱和其它生物碱。胡芦巴已经被用作健胃药,并且用于治疗腹部疾病。西方的科学研究已经提供了胡芦巴种子的化学分析的见解,以及从胡芦巴种子中提取4-羟基异亮氨酸,已经提示了胡芦巴的一些临床用途。
L.Fowden先生进行了胡芦巴分析的研究。他教导了从胡芦巴中分离和纯化4-羟基异亮氨酸,并且宣称4-羟基异亮氨酸是胡芦巴种子中所包括的最主要的游离的氨基酸。(参见Fowden等人,植物化学(Phytochemistry),12:1707,(1973)。)已有技术进一步的研究建议胡芦巴种子的氨基酸可能具有营养价值。(参见,Sauvaire等人,NutrRep Int,14:527(1976).)本技术领域的熟练技术人员也已经在胡芦巴种子的类固醇皂角苷配基含量的分析中教导了分光光度测定法,这些已有技术方法通常可能被用于确定脱脂胡芦巴的细分组分的成分。(参见,Baccon等人,Analyst,102:458(1977);Ribes等人,Proc Soc ExpBiol Med,182:159(1986).)另外,本技术领域的熟练技术人员已经使用氯仿从胡芦巴种子中提取氨基酸4-羟基异亮氨酸。(参见,Alcock等人,Phytochemistry,28(7):1835×1989)。)然而,已经发现氯仿是有毒的,在食品和药品行业已经建立的标准中,作为一种提取方法通常是不能接受的。
也已经从胡芦巴种子中分离出其它化合物。除主要异构体(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸之外,已经分离出少量异构体4-羟基异亮氨酸和氨基酸(赖氨酸、组氨酸和精氨酸)。后边的研究也已经确认了在胡芦巴种子中存在4-羟基异亮氨酸,是两种非对映异构体:主要的一种是(2S,3R,4S)构型,代表4-羟基异亮氨酸总含量的大约90%,次要的一种是(2R,3R,4S)构型。参见Alcock,Phytochemistry,28:1835(1989)。)
正如本技术领域的熟练技术人员所理解的那样,主要(2S,3R,4S)异构体目前是令人感兴趣的,有关实验证据显示了该主要异构体以一种葡萄糖依赖方式通过直接影响胰β细胞刺激,以微摩尔级浓度刺激葡萄糖诱导的胰岛素分泌物的能力。此外,4-羟基异亮氨酸能互相作用,并且诱导加性促胰岛素效应(即刺激或影响胰岛素的产生和活性,仅仅在存在超常葡萄糖浓度的情况下)。(参见,Sauvaire等人,Diabetes,47:206(1998)。)已有技术的研究也公开了在存在高血糖、糖尿和高脂血的情况下,对胡芦巴细分组分用途进行的临床研究,这些研究已经在大鼠、狗和人类胰组织上完成。(参见,Shani等人,ArchIntern Pharmacodyn Ther,210:27(1974);Ribes等人,Ann Nutr Metab,28:37(1984);Valette等人,Athersclerosis,50:105(1984);Madar,Nutr Rep Int,29:1267(1984)。)正如本技术领域熟练技术所理解的那样,在胡芦巴上所进行的临床研究已经将焦点集中在研究胡芦巴种子的特定细分组分上(如外种皮和胚乳),或者,可选择地,已经将焦点集中在4-羟基异亮氨酸在糖尿病或胆固醇紊乱的动物和人类中的特定作用上。
研究也已经显示4-羟基异亮氨酸的天然相似物,在作为抗糖尿病药剂时,比合成型式更有效。因此,这暗示从胡芦巴种子的提取物中所获得的4-羟基异亮氨酸的治疗效果最好。然而,用胡芦巴种子作为营养补充剂的原材料来源存在一些困难。例如,一个这样的困难或缺点是源自下述事实,即,为了获得治疗和其它营养效果,通常需要大剂量的胡芦巴种子。病人或消费者通常不愿意将这些种子加入到他们的饮食中,即使是脱脂和去苦味的种子。较高剂量的非脱脂种子可能发生轻度胃肠道不适。由于胡芦巴种子的纤维含量比较高,长期使用和高剂量可能导致一些副作用如肠胃气或腹泻。
胡芦巴种子中的纤维的结合能力可能也影响了营养物质的可利用度,特别是矿物质的可利用度。如同所理解的那样,胡芦巴种子的外用可以导致不希望的皮肤反应。所以,在本技术领域,提供一种方法用于从胡芦巴种子中得到生物活性和治疗作用的化合物将是一种进步,如此以致由于摄取该种子或者其部分所导致的不希望副作用可以被避免。
在上述提及的研究性考察中,本技术领域的技术人员开发出了从胡芦巴种子中提取4-羟基异亮氨酸的粗糙方法。这些本技术领域的现有方法和提取技术已经将注意力主要集中在获得4-羟基异亮氨酸的“高纯度”提取物(“high-purity”extract)上。例如,使用吸附色谱提取4-羟基异亮氨酸是本技术领域所已知的。然而,这些现有技术的方法倾向于仅产生少量4-羟基异亮氨酸,并且通常仅适合于小规模的实验室使用。正如先前所描述的,本技术领域的技术人员所实践的另一种提取方法使用一种有毒的有机溶剂,如氯仿,从胡芦巴种子中提取4-羟基异亮氨酸,从而可以预期到对消费者存在固有不利。因此,正如本技术领域的技术人员所容易理解的那样,需要一种安全且在商业上更可行的方法,用于从胡芦巴种子中提取4-羟基异亮氨酸和其它生物活性组分。
发明简述和目的
本发明的一个主要目的是提供从胡芦巴种子中提取和分离生物活性化合物的新颖的组合物和方法,这些生物活性化合物能促进增加葡萄糖诱导的胰岛素水平。
本发明进一步的目的是提供从胡芦巴种子中提取和分离生物活性化合物的新颖的组合物和方法,这些生物活性化合物能增强胰岛素的灵敏度。
本发明的又一个目的是提供从胡芦巴种子中提取和分离生物活性化合物的新颖的组合物和方法,这些生物活性化合物能刺激葡萄糖转运因子4的功能。
本发明另一个目的是提供从胡芦巴种子中提取和分离生物活性化合物的新颖的组合物和方法,这包括有效的步骤数,生产是经济的。
此外,本发明的目的是提供从胡芦巴种子中提取和分离生物活性化合物的新颖的组合物和方法,这能提供高潜力的提取率。
本发明进一步的目的是提供从胡芦巴种子中提取和分离生物活性化合物的新颖的组合物和方法,这能提供高数量的提取率。
本发明另一个目的是提供从胡芦巴种子中提取和分离生物活性化合物的新颖的组合物和方法,这能提供介于大约百分之十(10%)到百分之七十(70%)之间的提取纯化产率。
进一步,本发明的一个目的是提供从胡芦巴种子中提取和分离生物活性化合物的新颖的组合物和方法,这些组合物和方法能产生一组生物活性化合物,包括,但不限于,氨基酸、蛋白质和4-羟基异亮氨酸。
本发明进一步的一个目的是提供来自胡芦巴种子的生物活性化合物的新颖的组合物,包括但不限于4-羟基异亮氨酸、精氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、γ-氨基丁酸、三甲基组氨酸和乙醇胺(EtOH NH2)。
此外,本发明的一个目的是提供新颖的组合物和从胡芦巴种子提取和分离生物活性化合物的方法,这些组合物是抗高血糖的。
本发明的又一个目的是提供新颖组合物和从胡芦巴种子提取和分离生物活性化合物的方法,这些化合物能独立地刺激葡萄糖转运蛋白并且能促进葡萄糖运输到肌肉细胞中。
本发明进一步的一个目的是提供新颖的组合物,以及从胡芦巴种子提取和分离生物活性化合物的方法,这些组合物能与胰岛素互相协作工作,以刺激葡萄糖转运蛋白并且促进葡萄糖运输到肌肉中。
本发明进一步的一个目的是提供新颖的组合物,以及从胡芦巴种子提取和分离生物活性化合物的方法,这些组合物有助于葡萄糖和碳水化合物的代谢。
与前述目的一致,与本发明在此处所表达和广泛描述的相一致,本发明的一个优选实施方案包括新颖组合物和从胡芦巴种子提取生物活性化合物的方法,能促进和支持葡萄糖和碳水化合物的代谢和运输。具体而言,从胡芦巴种子中提取的生物活性化合物的组合物的一个优选实施方案或者与胰岛素互相作用,或者独立地工作,来刺激位于骨骼肌细胞上的GT-4受体。该组合物,如此分离的,通常包括氨基酸和蛋白质。在本发明的一个优选实施方案中,特定重点在于分离生物活性化合物的组合物,这些化合物包括,例如,4-羟基异亮氨酸、精氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、γ-氨基丁酸、三甲级组氨酸和乙醇胺(EtOHNH2)。
附图简述
参考下列描述和所附权利要求,同时结合附图,本发明的前述和其它目的以及特征将变得更加显而易见。需要理解的是,这些附图仅仅描述了本发明的典型实施方案,因此这些附图不能被理解为限制本发明的范围,本发明将被描述具有其它特征,并且将利用下述附图进行详细描述,其中:
图1是一个工艺流程图,举例说明了本发明用于重量管理的方法的一个优选实施方案,通过促进葡萄糖运输到肌肉细胞中,以及随后的葡萄糖代谢,包括如下步骤:提供来自胡芦巴种子的生物活性化合物的组合物,增强骨骼肌葡萄糖运输,执行重量管理;
图2是一个工艺流程图,该图举例说明了从本发明的胡芦巴种子中提取生物活性成分的方法的优选实施方案,该方法包括胡芦巴种子的处理、初步提取和二次提取步骤;
图3是一个工艺流程图,该图举例说明了本发明的胡芦巴种子的处理步骤的优选实施方案,参考图2,该步骤包括将胡芦巴种子浸泡在水中,然后碾碎所浸泡的胡芦巴种子的步骤;
图4是一个工艺流程图,该图举例说明了本发明的初步提取步骤的优选实施方案,参考图2,该步骤包括如下步骤:将处理的胡芦巴种子置于溶剂I中以获得第一种种子残余物和种子提取物,将收集的种子残余物置于溶剂II中以得到第二种种子残余物和一种浓缩提取物,进一步在真空下浓缩,冷却并且沉淀以得到粗蛋白沉淀物和上清液,用去离子水稀释该上清液;
图5是一个工艺流程图,该图举例说明了本发明的二次提取步骤的优选实施方案,参考图2,包括如下步骤,用大孔隙、非极性或弱极性阳离子交换树脂进行树脂过滤,用去离子水洗涤,用10-90%乙醇进行递增乙醇处理,收集流出物,用6当量(N)盐酸(HCl)将pH值调整到1-6.5,用0.1-1N氨溶液处理,收集流出物,在真空下浓缩,用去离子水稀释,去氨化并且干燥,从而得到含有大量氨基酸的生物活性化合物的组合物,包括在大约20%到40%之间的总蛋白和在大约10%到70%之间的4-羟基异亮氨酸;
图6是一个工艺流程图,该图举例说明了二次提取步骤的优选实施方案,参考图2,该步骤包括如下步骤:用6N HCl将pH值调整到大约1-6.5,用大孔隙、非极性或弱极性阳离子交换树脂进行树脂过滤,用去离子水洗涤,用0.05-2N氨溶液处理,收集流出物和酸性部分,在真空下浓缩酸性处理,去氨化并且干燥,从而得到含有大量氨基酸的生物活性化合物的组合物,包括大约20%到40%的总蛋白和大约10%到70%的4-羟基异亮氨酸;
图7是一个工艺流程图,该图举例说明了本发明一个方法的优选实施方案,该方法用于培养来自金黄仓鼠(金黄地鼠(Mesocricetusauratus))的胰(β)-细胞;
图8代表一个图,该图显示了用培养的金黄仓鼠胰β细胞完成的试验结果,以每毫升(mL)15毫克(mg)的浓度暴露于从胡芦巴种子提取的生物活性成分的组合物中;
图9代表一个图,该图显示了以每毫升60毫克(mg/ml)的浓度用从胡芦巴种子提取的生物活性成分的组合物进行的试验结果,该试验产生了与图8的表中所示的试验结果类似的结果;
图10代表一个图,该图显示了另一个示意性图表,举例说明了来自胡芦巴种子未去苦味提取物的生物活性化合物的组合物对葡萄糖浓度和胰岛素浓度的影响,这是依照本发明的一个优选实施方案或方法在第一个人体中完成的,该组合物以每公斤体重含有一(1)毫克4-羟基异亮氨酸使用;
图11代表一个图,该图显示了一个示意性图表,举例说明了来自胡芦巴种子未去苦味提取物的生物活性化合物的组合物对葡萄糖浓度和胰岛素浓度的影响,这是依照本发明的一个优选实施方案或方法在第二个人体中完成的,该组合物以每公斤体重含有一(1)毫克4-羟基异亮氨酸使用;
图12代表一个图,该图显示了一个示意性图表,举例说明了来自胡芦巴种子去苦味提取物的生物活性化合物的组合物对葡萄糖浓度和胰岛素浓度的影响,这是依照本发明的一个优选实施方案或方法在第一个人体中完成的,该组合物以每公斤体重含有四(4)毫克4-羟基异亮氨酸使用;
图13代表一个图,该图显示了一个示意性图表,举例说明了来自胡芦巴种子去苦味提取物的生物活性化合物的组合物对葡萄糖浓度和胰岛素浓度的影响,这是依照本发明的一个优选实施方案或方法在第二个人体中完成的,该组合物以每公斤体重含有四(4)毫克4-羟基异亮氨酸使用;
图14代表一个图,该图显示了另一个示意性图表,举例说明了来自胡芦巴种子去苦味提取物的生物活性化合物的组合物对葡萄糖浓度和胰岛素浓度的影响,这是依照本发明的一个优选实施方案或方法在第一个人体中完成的,该组合物以每公斤体重含有四(4)毫克4-羟基异亮氨酸使用;
图15代表一个图,该图显示了另一个示意性图表,举例说明了来自胡芦巴种子去苦味提取物的生物活性化合物的组合物对葡萄糖浓度和胰岛素浓度的影响,这是依照本发明的一个优选实施方案或方法在第二个人体中完成的,该组合物以每公斤体重含有四(4)毫克4-羟基异亮氨酸使用;
图16代表一个图,该图仍然显示了另一个示意性图表,举例说明了来自胡芦巴种子未去苦味提取物的生物活性化合物的组合物对葡萄糖浓度和胰岛素浓度的影响,这是依照本发明的一个优选实施方案或方法在第一个人体中完成的,该组合物以每公斤体重含有四(4)毫克4-羟基异亮氨酸使用;
图17代表一个图,该图仍然显示了另一个示意性图表,举例说明了来自胡芦巴种子未去苦味提取物的生物活性化合物的组合物对葡萄糖浓度和胰岛素浓度的影响,这是依照本发明的一个优选实施方案或方法在第二个人体中完成的,该组合物以每公斤体重含有四(4)毫克4-羟基异亮氨酸使用;
图18代表一个图,该图显示了另一个示意性图表,举例说明了来自胡芦巴种子未去苦味提取物的生物活性化合物的组合物对葡萄糖浓度和胰岛素浓度的影响,这是依照本发明的一个优选实施方案或方法在第一个人体中完成的,该组合物以每公斤体重含有四(9)毫克4-羟基异亮氨酸使用;
图19代表一个图,该图显示了另一个示意性图表,举例说明了来自胡芦巴种子未去苦味提取物的生物活性化合物的组合物对葡萄糖浓度和胰岛素浓度的影响,这是依照本发明的一个优选实施方案或方法在第三个人体中完成的,该组合物以每公斤体重含有四(9)毫克4-羟基异亮氨酸使用;
优选实施方案描述
正如此处图中通常所描述和举例说明的那样,更容易理解的是,本发明的组分可以以多种不同的构造安排和设计。当然,本技术领域的普通技术人员可以领会到,正如所描述的,在不背离本发明根本特征的情况下,此处可以对此处的细节进行各种修改。因此,正如图1到19所表示的,下述对本发明的组合物和方法进行的更详细的描述之目的不在于限制本发明的范围,该范围正如权利要求所要求的那样,这些下述内容仅仅是本发明的优选实施方案的代表。
参考附图,本发明的优选实施方案将更好理解,其中同样的数字始终代表同样的部分。
术语“糖尿病(diabetes)”,当单独使用时,通常表示糖尿病(diabetesmellitus)。糖尿病通常是碳水化合物代谢紊乱,其中糖不能被人体适当地分解和利用。碳水化合物代谢的功能紊乱通常与胰岛素的产生不充分有关。正如本技术领域熟练技术人员所理解的那样,胰岛素是由专门的胰细胞产生的,称作郎格罕氏岛(胰岛)的β细胞。胰岛素是由胰腺分泌的,在整个体内运动以调节糖代谢,更特别地,在整个体内运动以调节血流中的葡萄糖水平。特别地,胰岛素会与好几种类型的细胞表面受体相互作用。一种这样的受体家族被称作葡萄糖转运(GT)受体。本技术领域的技术人员已经鉴别出葡萄糖转运(GT)的至少七个亚型已经,指定为1-7(GT 1-7)。
许多非糖尿病患者个体可能会终生体验营养和代谢的不足,这会显著影响葡萄糖和碳水化合物的固有代谢。例如,一些个体可能逐步对胰岛素具有抗性。这些个体通常在代谢糖上有困难,但没有达到具有糖尿病的个体的水平。一种这样的情况,通常被称作“X综合症”,特征在于血液中的葡萄糖水平较高和脂肪沉积,尤其是在腹部的脂肪沉积。血液中的葡萄糖水平较高的情况有时被称作血糖过多或者高血糖症。在许多有营养和代谢不足的非糖尿病个体中,对于促进和支持葡萄糖和其它碳水化合物在体内的固有代谢是有利的。促进和支持葡萄糖和其它碳水化合物代谢可以通过使用本发明组合物来实现,该组合物与葡萄糖和其它碳水化合物代谢的调节中存在的胰岛素协同工作,或者,在可选择的方案中,通过使用本发明的组合物来实现,该组合物的效果独立于葡萄糖和其它碳水化合物代谢的调节中的胰岛素。
本发明的发明者进行的临床研究表明,从胡芦巴种子中提取的生物活性化合物的新颖组合物,该组合物含有特定浓度的4-羟基异亮氨酸和一个或多个氨基酸,有效地增强了葡萄糖到骨骼肌细胞中的转运,这是对骨骼肌细胞上存在的葡萄糖转运因子4(GT-4)的反应。已经确定,与GT-4相对的细胞行为和与胰岛素相对的细胞行为具有非常强的相关性。因此,从胡芦巴种子提取的生物活性化合物的组合物可以被用来增强葡萄糖到人体骨骼肌中的运输,这个可以得到支持的指示是本发明的一个主要中心内容。
另外,从胡芦巴种子提取的生物活性化合物的新颖组合物,该组合物含有4-羟基异亮氨酸和一组其它氨基酸,可以与葡萄糖或其它碳水化合物结合,以改变与葡萄糖或其它碳水化合物的快速施用(bolusadministration)相关的生理反应,或者产生独特的生理反应。生理反应可以包括葡萄糖在消化道中吸收的增加,胰β细胞的刺激,和葡萄糖或其它碳水化合物的增强的处理。
因此,本发明的新颖组合物和方法支持如下前提,即来自胡芦巴种子的生物活性化合物的提取物倾向于增强人体对胰岛素的响应,由此,增强葡萄糖运输到骨骼肌中可以有效地降低葡萄糖在肝脏和脂肪组织中的沉积,从而降低脂肪沉积。
本发明用于诊断和进行重量管理的方法的优选实施方案在图1中做了很好的图解说明,该优选实施方案被指定为5。如图所示,涉及使用来自胡芦巴种子的生物活性化合物的组合物的进行重量管理的方法,可以包括如下步骤:(1)进行营养和代谢不足的个体的重量管理分析6,营养和代谢不足会影响葡萄糖和碳水化合物的固有代谢;(2)通过提取来自胡芦巴种子的生物活性化合物的组合物,进行胡芦巴种子提取10;和(3)通过给予胡芦巴种子提取的组合物,增强目标个体体内的骨骼肌葡萄糖转运8。
进行重量管理6的步骤包括诊断无效胰岛素产生状态,对胰岛素的不敏感状态或目标个体的胰岛素抗性。诊断也可以包括确认肥胖或类似状态。另外,进行重量管理6的步骤,正如此处所预期的,可以进一步包括来自胡芦巴种子的生物活性化合物的一种或多种组合物的周期性使用,目标个体的锻炼习惯和饮食的建议性修正。
进行胡芦巴种子提取10的步骤包括提取来自胡芦巴种子的生物活性化合物的组合物的步骤,其中该组合物包括4-羟基异亮氨酸和一组基于确定比率的其它氨基酸。进一步,进行胡芦巴种子提取10的步骤也可以包括胡芦巴种子提取物的包装和以适合目标客户的消费的调节。例如,来自胡芦巴种子的生物活性化合物的提取物组合物可以被包装和展现为固体(即丸剂、粉末剂、片剂或胶囊剂),或者以液体、悬浮液或类似物的形式配制。提供胡芦巴种子提取物的新颖组合物也可以涉及修正或调节该提取物组合物,如当进入消费者体内时,该提取物将以有效的方式到达目标组织。在本发明的一个优选实施方案中,图2对提取胡芦巴种子的一种方法进行了很好的举例说明,该方法通常被表示为10,并且下边对该方法进行了更详细的讨论。
仍然参考图1,通过给予胡芦巴种子提取物的一种或多种新颖组合物来增强骨骼肌葡萄糖在目标个体体内转运8的步骤考虑到了摄取或者施用(例如,肠胃外地)一种形式的提取物组合物的步骤,和使该组合物到达个体的组织的步骤,以致胡芦巴种子提取物可以促进和支持葡萄糖和碳水化合物的运输和代谢。正如下边将讨论的,本发明的生物活性化合物在被施用的组合物中含有更大的浓度将产生更多的受激胰岛素生产,从而表明该新颖组合物在刺激人体产生胰岛素和该新颖组合物的产生方法的有效性。
显而易见,进行重量管理6,进行胡芦巴种子提取10和在目标个体中的增强骨骼肌葡萄糖转运8的多种其它方法可以根据本发明在此处所阐明的原则来完成,这些原则与本发明的精神和范围是一致的。因此,可以预期到,此处提供的实施例可以被看作本发明所述原则的例证,而不是限制执行这些原则的步骤的任何特定方法、技术、步骤或顺序。
图2对本发明的一个方法的优选实施方案进行了很好的举例说明,该方法用于提取来自胡芦巴种子的生物活性化合物的组合物,该生物活性化合物包括4-羟基异亮氨酸和一组其它氨基酸。优选地,用于提取来自胡芦巴种子的生物活性化合物的组合物的方法10包括如下步骤:(1)处理胡芦巴种子15;(2)进行初步提取过程20;和(3)进行二次提取过程25。当然,正如本技术领域的熟练技术人员所理解到的,该提取方法可以包括其它步骤,以更好地从胡芦巴种子中提取那些有用的生物活性化合物。
现在参考图2和3,处理胡芦巴种子15的步骤可以包括如下步骤:(1)提供胡芦巴种子40;(2)浸泡胡芦巴种子42;和(3)粉碎胡芦巴种子44。浸泡步骤通常包括将种子在水中浸泡特定的时间。也可以使用其它能提供水的制备特性的溶液。在种子已经被浸泡后,粉碎种子44的步骤有效地分离了种子的不同部分。例如,粉碎步骤44可以将的厚的或硬的外壳从种子的内部分离出来,该外壳被称作外种皮48,种子的内部被称作胚乳46。正如所预期的,胚乳46是包围着植物胚的营养组织。
现在参考图2和4,从处理步骤15产生的胚乳46和外种皮48进行初步提取过程20的步骤可以包括使用溶剂(溶剂I)进行的提取步骤50。例如,溶剂I可以包括一种化合物如己烷、环己烷、醚,或其任意组合。正如此处所预期的,提取步骤50有效地脱去了种子中的脂肪。因此,在完成初步提取步骤20之后,该产品可以被称作是“脱脂的(de-fatted)”。提取步骤50也可以包括重复加热所制备的种子和溶剂I的组合。在本发明的一个优选的实施方案中,种子和溶剂I的组合物可以被加热三(3)次,使温度达到大约摄氏(C)20度到90度之间。更优选地,种子和溶剂I的组合物可以被加热三(3)次,使温度达到大约65℃到70℃之间。所制备的种子和溶剂I的组合物可以在这些高温下维持任意长的时间段,以足以达到期望结果。在本发明的一个优选实施方案中,所制备的种子和溶剂I的组合物在高温下被维持了大约1-3小时。从而,提取步骤50典型地产生了种子提取物52和种子残余物53。
特定地参考图4,蒸馏和浓缩步骤54可以在胡芦巴种子残余物53上进行。正如所意识到的,蒸馏和浓缩步骤54可以使用多种传统方法来蒸馏和浓缩来自胡芦巴种子的提取物。例如,用第一种溶剂连续提取产生的种子残余物的蒸馏,可以通过加热种子残余物直至沸腾、保存并且冷却热蒸气来实现。蒸馏和浓缩步骤54可以产生大量56的回收溶剂I以及胡芦巴种子油、薯蓣皂苷配基、胡芦巴异黄酮、胡芦巴皂角苷和可溶性纤维,如半乳甘露聚糖或类似物。
使用溶剂(溶剂II)的提取步骤60可以在浓缩的种子提取物52上进行。溶剂II优选地包括一种溶液,该溶液包括乙醇或与乙醇具有类似化学特性的溶剂。提取步骤60中使用的乙醇浓度可以采用多个数值。例如,乙醇浓度可以在大约10%-95%之间变化。在本发明的一个优选的实施方案中,提取步骤60进一步包括重复加热种子提取物52和溶剂II的组合物的步骤。优选地,该组合物可以被加热三(3)次,使温度达到大约20℃到90℃之间。更优选地,种子提取物52和溶剂II的组合物可以被加热三(3)次,使温度达到大约65℃到70℃之间。在本发明的一个优选实施方案中,种子提取物52和溶剂II的组合物在这些高温下被维持的时间周期的范围可以很大,以足以产生期望结果。例如,种子提取物52和溶剂II的组合物可以在高温下被维持大约1-3小时。在这点上,提取步骤60典型地产生了种子残余物62和浓缩的种子提取物64。
与初步提取过程20相关的其它步骤可以包括在浓缩的种子提取物64上进行的浓缩步骤66。浓缩步骤66有效地包括使用真空来分离大量溶剂68和浓缩物70。然后,所分离的浓缩物70可以进行冷却和沉淀步骤72以产生沉淀物74,包括粗蛋白和上清液76。然后,可以对上清液76进行稀释步骤78以产生稀释的上清液80。正如所预期的,稀释步骤78可以包括加入去离子水。所加入的水量可以有所变化。例如,在本发明的稀释步骤78的一个优选实施方案中,所加入的水量可以包括大约2-10倍体积的上清液76。在稀释后,稀释的上清液80然后可以进行二次提取过程25,正如图2、5和6中所描述的。
显而易见,初步提取过程20的多种其它方法或步骤可以根据本发明在此处所述的原则进行,这些原则与本发明的精神和范围一致。因此,可以预期到,此处提供的实施例可以被看作本发明所述原则的例证,而不是限制执行这些原则的步骤的任何特定方法、技术、步骤或顺序。
参考图2和5,初步提取过程20产生的稀上清液80优选地可以进行二次提取过程25。在本发明的一个优选的实施方案中,二次提取过程25可以包括调节稀上清液80的pH值的步骤100。调节稀上清液80的pH值的步骤100可以包括使用多种溶液。为了举例的目的,不是为了限制,可以使用盐酸。pH调节溶液的成分的浓度可以有多个数值。正如所预期的,稀上清液80的pH值可以被调节为任意范围的数值,以足以提供期望结果。因此,盐酸溶液可能有助于将稀上清液80的pH值调节到在大约1-6.5之间的范围内的一个pH值。
然后,pH调节后的稀上清液80可以进行阳离子交换树脂过滤步骤104。在一个优选的实施方案中,过滤步骤104包括将pH调节后的上清液80流过树脂。阳离子交换树脂通常是大孔树脂,可以是弱极性或非极性的。然后将处理过的树脂进行洗涤步骤108,该步骤可以包括用水洗涤树脂。树脂也可以进行渐进的氨溶液处理步骤112,然后发生酸收集步骤116。渐进的氨处理步骤112可以考虑使用多种氨溶液。在一个优选的实施方案中,氨溶液包括氨水或类似物。正如所预期的,溶液成分的浓度可以有多个数值。例如,氨水的浓度可以落入在大约0.1到1N之间的范围内,优选地为大约0.3N。
渐进氨溶液处理步骤112的非酸性流出物117可以被保存起来,用于分离具有生物活性的营养物,如薯蓣皂苷配基、皂角苷、类黄酮和可溶性纤维,如半乳甘露聚糖和类似物。在酸收集步骤116之后优选地是浓缩步骤118,该步骤在酸性部分上进行。正如所预期的,浓缩步骤118可以包括使用真空。
在本发明的二次提取步骤125的一个优选实施方案中,可以引入去氨步骤120,以充分去除胡芦巴种子制备过程10之前的步骤中所加入的氨。正如本技术领域的熟练技术人员所理解的,去氨步骤120可以通过任意数量的传统方法来实现。一个这样的方法可能使用了大孔、非极性柱,如HDP 100柱。在完成去氨步骤120后,从胡芦巴种子制备提取的生物活性化合物的组合物可以被称作去苦味提取物(debitterized extract),该组合物含有4-羟基异亮氨酸和一组其它氨基酸。
在去氨后,可以用干燥步骤124来产生含有有用化合物的最终产品126。正如本技术领域的技术人员所理解的,干燥步骤124可以使用任意数量的方法,例如,喷雾干燥、冷冻干燥或真空干燥。典型地,来自制备的胡芦巴种子的生物活性化合物的组合物(例如产物成品126)包括蛋白质和氨基酸。4-羟基异亮氨酸是这样的氨基酸之一。更特别地,优选地,产物成品126包括来自胡芦巴种子的生物活性化合物的组合物,该组合物含有4-羟基异亮氨酸,比率在大约10%-70%之间;和其它蛋白质,由一组其它氨基酸构成,占比率在大约20%-40%之间。因此,来自胡芦巴种子的生物活性化合物的组合物可能含有的氨基酸比率在大约10%-90%之间。
显而易见,二次提取过程125的其它方法或步骤可以根据本发明在此处所阐明的原则来完成,这些原则与本发明的精神和范围是一致的。因此,可以预期到,此处提供的实施例可以被看作本发明所述原则的例证,而不是限制执行这些原则的步骤的任何特定方法、技术、步骤或顺序。
现在参考图6,该图所示为本发明的二次提取过程25的另一个优选实施方案。特别地,初步提取过程20所产生的稀上清液80优选地进行二次提取过程125。在本发明的一个优选的实施方案中,二次提取步骤25可以包括阳离子交换树脂过滤步骤130。过滤步骤130考虑将稀上清液80在树脂之上流过,或流经树脂。所形成的树脂优选地具有合适的构造,是大孔的,或者是弱极性或是非极性的。然后处理过的树脂进行洗涤步骤108,该步骤可能包括用水洗涤树脂。
在一个优选的实施方案中,树脂也可以进行递增乙醇处理步骤134。用乙醇处理树脂的步骤134可以包括将溶剂溶液重复地流经树脂。乙醇在溶剂中的浓度通常随着每次流过而增加。正如本技术领域的技术人员所理解的,递增乙醇处理步骤134(progressive ethanol treatment134)可以考虑使用多种合适的物质。例如,可以使用乙醇或在生物活性成分提取中具有类似应用的溶剂。
酸收集步骤138可以紧接递增乙醇处理步骤134的任意循环之后,以回收具有生物活性的营养物,如皂角苷和类黄酮。典型地,最后一次循环所收集的流出物138使用最高浓度的溶剂,并且被收集起来用于根据本发明进行进一步的处理。
流出物138也可以进行pH值调节步骤100。流出物138的pH值的调节步骤100可以包括使用多种溶液。为了举例的目的,不是为了起限制作用,可以使用盐酸。pH调节溶液的成分的浓度可以具有多个数值。正如能意识到的,所收集的流出物138的pH值可以被调节到任意范围的数值,以足以实现期望结果。因此,盐酸溶液可能有助于将流出物138的pH值调节到大约1-6.5的范围内的pH值。
然后,pH调节后的溶液进行阳离子交换树脂过滤步骤104。在一个优选的实施方案中,过滤步骤104包括使pH调节后的溶液流过或流经具有离子交换特性的阳离子交换树脂。树脂优选地是大孔的,可以是弱极性或非极性的。处理后的树脂也可以进行递增氨溶液处理步骤112,之后是酸收集步骤116。递增氨处理112可以考虑使用多种氨溶液。在一个优选的实施方案中,氨溶液包括氨水或类似物。正如所预期的,该溶液所含成分的浓度可以有多个数值。例如,氨水的浓度可以落在大约0.1-1N之间的范围内,优选地是大约0.3N。
递增氨溶液处理步骤112的非酸性流出物217可以被保存起来,用于分离具有生物活性的营养物,如薯蓣皂苷配基、皂角苷、类黄酮和可溶性纤维,例如半乳甘露聚糖和类似物。在酸收集步骤116之后是浓缩步骤118,该步骤优选地在酸性部分上进行。正如所预期的,浓缩步骤118可以包括使用真空。
在本发明的二次提取步骤125的一个优选实施方案中,可以引入去氨步骤120,以充分去除胡芦巴种子制备过程10之前的步骤中所加入的氨。正如本技术领域的熟练技术人员所理解的,去氨步骤120可以通过任意数量的传统方法来实现。一个这样的方法可能使用了大孔、非极性柱,如HDP 100柱。在完成去氨步骤120后,从胡芦巴种子制备提取的生物活性化合物的组合物可以被称作去苦味提取物(debitterized extract),该组合物含有4-羟基异亮氨酸和一组其它氨基酸。
在去氨后,可以用干燥步骤124来产生含有有用化合物的最终产物126。正如本技术领域的技术人员所理解的,干燥步骤124可以使用任意数量的方法,例如,喷雾干燥、冷冻干燥或真空干燥。典型地,来自制备的胡芦巴种子的生物活性化合物的组合物(例如产物产品126)包括蛋白质和氨基酸。4-羟基异亮氨酸是这样的氨基酸之一。更特别地,优选地产物126包括来自胡芦巴种子的生物活性化合物的组合物,该组合物所含4-羟基异亮氨酸的比率在大约10%-70%之间,和占比率在大约20%-40%之间的其它蛋白质,是由一组一种或者多种氨基酸构成。
显而易见,二次提取过程125的其它方法或步骤可以根据本发明在此处所阐明的原则来完成,这些原则与本发明的精神和范围是一致的。因此,可以预期到,此处提供的实施例可以被看作本发明所述原则的例证,而不是限制执行这些原则的步骤的任何特定方法、技术、步骤或顺序。
正如本技术领域熟练技术人员可以理解的,可以使用方法确认程序(method validation program)来量化本发明所述新颖组合物的氨基酸和蛋白质含量。使用高效液相色谱(HPLC)仪来确定4-羟基异亮氨酸和其它氨基酸在胡芦巴中所占比率。正如此处所预期的,在方法确认程序中,可以使用包括荧光检测器和可编程自动取样器的HPLC仪。色谱柱可以是Zorbax stable bond SB-C18(4.6*150mm,5μm)。此外,HPLC仪可以包括一个精确到0.1mg的分析天平、一个超声波浴、一个容量瓶、一个具有0.2μm薄膜的两升真空过滤玻璃仪器、可变容量吸移管和一个磁搅拌器及搅拌棒。
方法确认程序的试剂可以包括,例如:(1)甲醇(HPLC等级),(2)乙腈(HPLC等级),(3)三水合乙酸钠(AR等级),(4)三乙胺(AR等级),(5)冰醋酸(AR等级),(6)四氢呋喃(tetrafunan,AR等级),(7)OPA试剂(Agilent Co.Part No.5061-3335,在硼酸盐缓冲液中含有邻苯二醛和3-巯基丙酸),(8)4-羟基异亮氨酸的参比标准(来自British Agricultural Lab),和(9)去离子水。
方法确认程序准备的一个优选实施方案可以包括流动相步骤、标准制备步骤和样品制备步骤。在流动相步骤,可以使用缓冲液A、缓冲液B和过滤/排气步骤。缓冲液A可以在一个1升烧杯中制备,是将1.36g三水合乙酸钠溶解在500mL水中。可以将该组合物搅拌直至完全溶解。加入90μL三乙胺并且混和。用1%-2%乙酸溶液将pH值调节到大约7.2。然后可以加入1.5mL四氢呋喃(tetrafunan)并且混和。最终的混合物被标记为—“缓冲液A”。
缓冲液B可以根据下述方法形成。在烧杯中,将1.36g三水合乙酸钠溶解在100mL水中。将该组合物搅拌直至充分溶解。用1%-2%乙酸溶液将pH值调节到大约7.2。然后将200mL甲醇和200mL乙腈加入加入到烧杯中,并且混和良好。最终的混合物被标记为—“缓冲液B”。优选地,可以使用真空和0.2μm薄膜过滤该缓冲液,并且除去其中的气体。
在本发明的一个优选实施方案中,方法确认程序标准制备步骤包括,精确地称取大约10mg参比化合物(reference compound),并且将该化合物放置到一个50mL的容量瓶中。可以用大约30mL去离子水溶解参比化合物,并且用超声波处理大约10分钟。优选地,允许烧杯冷却到室温,然后用水将该溶液稀释到特定浓度并且充分混和。标准制备物然后可以用石蜡膜(parafilm)密封,保存在冰箱中直到需要之时。
方法确认程序样品制备步骤包括,精确地称取大约25mg提取自葫芦巴种子的生物活性化合物的组合物,将该组合物用大约30mL去离子水溶解于一个50mL的容量瓶。可以参比化合物,并且用超声波处理大约10分钟。优选地,允许烧杯冷却到室温,然后用水将该溶液稀释到特定浓度并且充分混和。在注入到HPLC仪之前,过滤样品制备物。
方法确认程序的一个优选实施方案的层析条件包括,例如,一个Zorbax stable bond SB-C18柱,柱温度为30℃,和一个EX 340nM,EM450色谱检测仪。可以使用下述梯度和注入程序:
梯度:
时间(分) | %A | %B | F(毫升/分) |
0.00 | 100 | 0 | 1.0 |
17.0 | 50 | 50 | 1.0 |
20.0 | 0 | 100 | 1.0 |
20.1 | 0 | 100 | 1.0 |
24.0 | 100 | 0 | 1.0 |
35.0 | 100 | 0 | 1.0 |
注入程序:
列 | 操作 |
1 | 从小瓶1中取出5.0μL(缓冲液) |
2 | 从小瓶1中取出1.0μL(样品) |
3 | 在空气中混和6.0μL,最大速度,6次 |
4 | 从小瓶11中取出0.0μL(洗涤小瓶) |
5 | 从小瓶3中取出1.0μL(OPA试剂) |
6 | 在空气中混和7.0μL,最大速度,6次 |
7 | 从小瓶11中取出0.0μL(洗涤小瓶) |
8 | 注入 |
方法确认程序特异性可以通过检验所确定的峰值谱来进行。该峰值可能显示了样品和参比标准的范围。对方法确认程序线性进行分析,准备4-羟基异亮氨酸标准制备物,并且如方法确认程序中所指示的进行化验。采取这样的一个线性,并且观察到了如下结果:
浓度(mg/ml) | 峰面积 | 响应(面积/浓度) |
0.09 | 1336.9 | 3.36600e-3 |
0.18 | 2654.1 | 3.39098e-3 |
0.27 | 4040.7 | 3.34101e-3 |
y-截距 | -26.56667 | 平均值=3.36600e-3 |
斜率 | 300.4222 | 标准偏差(SD)=0.024985 |
相关性 | 0.99989 | 相对标准偏差(RSD)=0.74% |
相关系数是满足的(r>0.99950),这些数据表明本发明的方法确认程序具有良好的线性。
如果期望,可以通过在一个实验样品上进行六(6)组独立实验来分析方法确认程序的精确度。进行了一个这样的精确度分析,观察到了如下结果:
4-OH-Ile精确度
LOT NO:2060052
序号 | 峰面积 | 试验结果 |
1 | 2827.8 | 35.4 |
2 | 2758.2 | 35.3 |
3 | 2997.0 | 34.9 |
4 | 2721.5 | 35.1 |
5 | 2510.6 | 34.9 |
6 | 2562.2 | 35.4 |
平均值 | -- | 35.2 |
SD | -- | 0.234 |
RSD | -- | 0.66% |
4-OH-Ile精确度
LOT NO:20020402
序号 | 峰面积 | 试验结果 |
1 | 3369.0 | 43.6 |
2 | 3214.2 | 43.9 |
3 | 3292.9 | 43.5 |
4 | 3112.6 | 43.0 |
5 | 3394.8 | 44.1 |
6 | 3305.2 | 43.7 |
平均值 | -- | 43.6 |
SD | -- | 0.378 |
RSD | -- | 0.87% |
4-OH-Ile精确度
LOT NO:FSE02G31-32
序号 | 最大面积 | 试验结果 |
1 | 3762.9 | 49.2 |
2 | 3574.1 | 48.2 |
3 | 3560.3 | 48.2 |
4 | 3599.4 | 48.3 |
5 | 3629.7 | 49.1 |
6 | 3627.1 | 49.1 |
平均值 | -- | 48.7 |
SD | -- | 0.496 |
RSD | -- | 1.00% |
从这些结果,相对标准偏差(RSD)为<3%。基于上述结果,方法确认程序对该样品提供了良好的精确度。
通过在连续几天内,用多个HPLC分析测试同一样品,进行且分析了方法确认程序的再现性。观察到了下述结果:
4-OH-Ile再现性
IOT NO:2060052
序号 | 第一天 | 第二天 | 两天内 |
1 | 35.4 | 34.5 | |
2 | 35.3 | 35.7 | |
3 | 34.9 | 36.2 | |
4 | 35.1 | 34.9 | |
5 | 34.9 | 35.6 | |
6 | 35.4 | 34.6 | |
平均值 | 35.2 | 35.2 | 35.2 |
SD | 0.234 | 0.683 | 0.489 |
RSD | 0.66% | 1.94% | 1.39% |
4-OH-Ile再现性
LOT NO:2002-0402
序号 | 第一天 | 第二天 | 两天内 |
1 | 43.6 | 44.7 | |
2 | 43.9 | 43.7 | |
3 | 43.5 | 43.9 | |
4 | 43.0 | 43.5 | |
5 | 44.1 | 43.5 | |
6 | 43.7 | 45.0 | |
平均值 | 43.6 | 44.0 | 43.8 |
SD | 0.378 | 0.644 | 0.548 |
RSD | 0.87% | 1.46% | 1.25% |
相对标准偏差(RSD)小于3%,这表明方法确认程序具有良好的再现性。
用加料和回收样品分析物与加料和回收标准分析物,进行和分析了方法确认程序的回收率和准确度。观察到了如下结果:
加酒精的样品(mg) | 加酒精(4-OHILE)(mg) | 回收(4-OH ILE)(mg) | 回收率(4-OH ILE)(%) | 平均(%) | |
FSE20600052+FSE02G31-32 | 10.8 | 5.34 | 5.23 | 98.0 | 97.9 |
22.1 | 10.92 | 10.68 | 97.8 | ||
33.9 | 16.75 | 16.41 | 98.0 | ||
FSE20600052 | 10.2 | 5.04 | 4.98 | 98.7 |
+FSE02G31-32 | 21.6 | 10.67 | 10.37 | 97.2 | |
30.8 | 15.22 | 14.84 | 97.6 |
前边所述数据表明本发明的方法确认程序具有很好的准确度。
基于方法确认程序的前述结果,对两批含有来自胡芦巴种子的生物活性化合物的组合物的制品进行了分析,其中所含的胡芦巴种子的生物活性化合物是根据本发明的胡芦巴种子制备过程10提取的,观察到了如下结果:
氨基酸 | % | % |
精氨酸 | 1.09 | 0.90 |
天冬氨酸 | 1.82 | 1.49 |
苏氨酸 | 0.41 | 0.35 |
丝氨酸 | 1.71 | 4.44 |
谷氨酸 | 3.09 | 2.47 |
脯氨酸 | 0.20 | - |
甘氨酸 | 0.94 | 0.81 |
丙氨酸 | 1.48 | 1.22 |
半胱氨酸 | 0.79 | 0.67 |
缬氨酸 | 0.46 | 0.41 |
蛋氨酸 | 0.15 | 0.20 |
异亮氨酸 | 0.21 | 0.20 |
亮氨酸 | 0.20 | 0.17 |
色氨酸 | 0.81 | 0.69 |
苯丙氨酸 | 0.73 | 0.61 |
鸟氨酸 | 0.06 | 0.04 |
赖氨酸 | 0.17 | 0.13 |
组氨酸 | 0.16 | 0.14 |
γ-氨基丁酸 | 0.34 | 0.29 |
三甲基组氨酸 | 0.12 | 0.10 |
4-羟基异亮氨酸 | 26 | 23.26 |
其它生物化合物 | % | % |
EtOH NH2(乙醇胺) | 0.54 | 0.46 |
总百分比% | 41.48 | 37.05 |
参考图7-9,这些图中的图解数据代表在金黄仓鼠的胰腺组织上完成的试验结果,参考图10-19,这些图中的图解数据代表在人类对象上完成的临床试验结果,数据表明来自胡芦巴种子的生物活性化合物的新颖组合物通过独立刺激GT-4可以有效地促进和支持葡萄糖和碳水化合物的代谢,并且也可以与胰岛素协同工作以刺激GT-4,所述来自胡芦巴种子的生物活性化合物是根据此处公开的优选方法提取的。
下述实施例将进一步详细地说明本发明的实施。本技术领域的熟练技术人员可以容易地理解,正如此处实施例所通常描述和分析的,本发明的下述方法、配方和一种独特的、高效的、生物活性胡芦巴种子提取物的组合物被看作是本发明所述原则的例证,不是限制实施这些原则的特定结构或过程。因此,正如实施例I-VI所表示的,下述对本发明所述方法、配方和组合物的优选实施方案进行的更详细描述,目的不在于限制本发明的范围,即正如权利要求所要求的范围,仅仅代表本发明的优选实施方案。
实施例I
[金黄仓鼠(Syrian golden hamster)-15mg/mL]
根据本发明的胡芦巴种子制备过程10的优选实施方案,从胡芦巴种子制备独特的、高效的生物活性提取物。更特别地,从过程10的收获物中制备浓度为15mg/mL的4-羟基异亮氨酸。该浓度被施用给一个体外细胞系:HIT-15,金黄仓鼠胰岛的胰岛β细胞,并且评价胰岛素活性在一段时间内上的浓度变化。
现在参考图7,该图说明了制备细胞培养物和评价胡芦巴提取物在来自金黄仓鼠140的培养的胰岛β细胞中的生物活性。在本发明的一个优选实施方案中,可能获得来自HIT-T15的细胞培养物142,这些细胞可以进行再培养144,方法是去除生长培养基,加入大约4mL含有大约0.05%胰蛋白酶和0.53mM EDTA的溶液,并且轻轻洗涤大约5秒钟。该溶液可以被去除,并且可以加入4mL新鲜溶液。所述细胞在大约37℃培养大约7分钟。在分离后,将所收获的细胞用本技术领域的熟练技术人员容易知道的方式计数146。一种这样的方式可以使用血细胞计数器,进行台盼蓝排斥方法(Tryptan Blue exclusion method)。接着优选地在培养基148中稀释所述收获的细胞。培养基可以包括Ham’s F-12,有时被称作Knight’s改进型或F12K。细胞稀释物可以被再次接种到一个24-孔平板中,每孔150接种1,500个细胞。然后未使用的细胞被放入到一个75cm2的烧瓶中。带孔的平板可以在培养箱152中继续大约2天。在培养箱152中继续培养所述平板结束后,培养的、来自金黄仓鼠的胰腺β细胞可以使用1-丁基-3-对甲苯磺酰基脲154和DMSO 156分别作为阳性和阴性对照组,也可以使用胡芦巴种子提取物158的浓缩物处理。
现在参考图8,该图代表使用根据预备程序140培养的金黄仓鼠的胰腺β细胞所完成的试验结果,以及在暴露给来自胡芦巴种子提取物的生物活性化合物的组合物之后进行的评价结果,所述组合物的浓度为每毫升15毫克4-羟基异亮氨酸。正如可以从曲线中看出的,在时间为零的时刻加入所述成分之后,胰岛素水平稳定增加,直到在时间为40分钟时达到峰值,然后又降到加入所述成分之前所测量的胰岛素水平。正如本技术领域的熟练技术人员所理解的,并且如图8所描述的,在实验期间,在金黄仓鼠的胰腺β细胞中测量的胰岛素活性水平表明,来自胡芦巴种子的生物活性化合物的组合物对动物体中的胰岛素水平有影响。
实施例II
[金黄仓鼠中的胡芦巴种子提取物-60mg/mL]
正如前边在实施例I中所描述的,和图7中所分析的,预备程序140被用来培养、收获和评价来自金黄仓鼠的胰腺β细胞。现在参考图9,该示意性图举例说明了该试验的结果。根据预备程序140,培养来自金黄仓鼠的胰腺β细胞,并且在暴露给来自胡芦巴种子提取物(例如,PromilinTM)的生物活性化合物的组合物之后进行评价,所述组合物的浓度为每毫升60毫克4-羟基异亮氨酸。如图所示,生物活性化合物的浓度越大,产生的受激胰岛素产生越大。正如本技术领域的熟练技术人员所能理解的,并且如图表中所描述的,在实验期间,在金黄仓鼠类的胰腺β细胞中测量的胰岛素活性水平表明,生物活性成分确实对动物体中的胰岛素水平有影响。
可以容易地理解,可以对这些试验进行设计,以适用于大量能实践本发明的实施方案,所述试验使用来自金黄仓鼠的胰腺β细胞完成,金黄仓鼠的胰腺β细胞是根据本发明的预备程序140培养的,并且在暴露于来自胡芦巴种子提取物(例如PromilinTM)的生物活性化合物的组合物的浓缩物之后进行评价,所述胡芦巴种子提取物是根据胡芦巴种子制备过程10制备的,所述实施方案与本发明的精神和范围一致。因此,本发明的目的是,此处提供的实施例可以本看作是本发明所述原则的例证,而不是限制特定结构或实施那些原则的方法。
实施例III
[人体使用未去苦味胡芦巴种子提取物-1毫克4-羟基异亮氨酸/公斤]
现在参考图10-19,用三个健康男性对象进行试验,这些男性对象没有糖尿病史或碳水化合物代谢紊乱史。该试验包括两个过程。对于第一个过程,这些对象整夜禁食。从这些对象采取血样,以测量葡萄糖和胰岛素水平,测量时间为负30分钟,0分钟,15分钟、30分钟、60分钟,120分钟,和180分钟。在时间为零时,将溶解在300mL水中的75克(g)葡萄糖溶液施用给这些对象。在Montana大学药学院,使用放射性免疫测定(RIA)测量每一血样的胰岛素含量。在图10-20以图解方式总结了血样测试的结果,这些结果作为“安慰剂部分(placebo portion)”数据点。正如本技术领域熟练技术人员所能理解的,这种类型的试验类似于在糖尿病和妊娠期糖尿病的诊断中使用的口服葡萄糖耐性实验(OGTT)。在本发明的一个优选实施方案中,第一种程序作为一种对照机制,以定量血液葡萄糖的基准水平和胰岛素活性的浓度。
完成第二种程序的条件与完成第一种程序的条件相同。唯一的区别是将来自胡芦巴种子的生物活性化合物(例如PromilinTM)的组合物施用给三个人类对象。然后,一般地参考图10-19,活性溶液含有溶解在300mL水中的75克葡萄糖,以及一剂胡芦巴提取物(例如PromilinTM),每公斤施用者体重剂量为1-9毫克4-羟基异亮氨酸。第二种程序的结果总结在图10-19中,作为“活性部分(active portion)”数据点。
在本发明的一个优选实施方案中,一种独特的、生物活性未去苦味的胡芦巴种子提取物组合物(例如PromilinTM)被施用给人类个体,所述组合物含有一组20种氨基酸,包括每公斤体重1毫克4-羟基异亮氨酸。所获得的组合物被施用给第一个人类对象。
特定地参考图10,该示意性图举例说明了第一个人类对象中的安慰剂部分和活性部分结果。活性部分含有溶解在300mL水中的75克葡萄糖,以及本发明的一个优选实施方案,包括生物活性化合物的一种独特的、高效的胡芦巴种子未去苦味的提取物(例如PromilinTM),浓度为每公斤体重1毫克4-羟基异亮氨酸。
正如在图解说明中所描述的,在实验期间所测量的第一个人类对象的胰岛素活性和葡萄糖水平表明,来自胡芦巴种子的生物活性化合物的组合物(例如PromilinTM)对人类对象中的胰岛素和葡萄糖水平有所影响。可以容易地看出,在零时刻之后,对于含有生物活性化合物的活性溶液而言,第一个人体中的胰岛素活性水平比较高,葡萄糖水平比较低。
现在参考图1,该示意图举例说明了第二个人类对象中的安慰剂部分和活性部分结果。活性部分含有溶解在300mL水中的75克葡萄糖,以及本发明的一个优选实施方案,包括来自胡芦巴种子的生物活性化合物的一种独特的、高效的胡芦巴种子未去苦味的提取物(例如PromilinTM),浓度为每公斤体重1毫克4-羟基异亮氨酸。
正如在图解说明中所描述的,在实验期间所测量的第二个人类对象的胰岛素活性和葡萄糖水平表明,生物活性化合物的组合物(例如PromilinTM)对人类对象中的胰岛素和葡萄糖水平有所影响。可以容易地看出,在零时刻之后,对于在施用了含有生物活性化合物的活性溶液之后进行的测量而言,第二个人体中的胰岛素活性水平显著地高于施用前的水平,葡萄糖水平比较低。
可以很容易地理解到,这些试验是在第一个和第二个人类对象中所进行的,以评价暴露于来自胡芦巴种子提取物的生物活性化合物的组合物的结果,所述胡芦巴种子提取物是根据胡芦巴种子处理过程制备的(例如PromilinTM),可以对这些实验进行设计或修正,以适用于大量能实践本发明的实施方案,所述实施方案与本发明的精神和范围一致。因此,本发明的目的是,此处提供的实施例可以本看作是本发明所述原则的例证,而不是限制特定结构或实施那些原则的方法。
实施例IV
[在人中使用去苦味胡芦巴种子提取物-4毫克4-羟基异亮氨酸/公斤]
正如在图12中所看到的,该示意图举例说明了第一个人类对象中的安慰剂部分和活性部分结果。活性部分含有溶解在300mL水中的75克葡萄糖,以及本发明的一个优选实施方案,包括生物活性化合物的一种独特的、高效的胡芦巴种子未去苦味的提取物(例如PromilinTM),浓度为4毫克4-羟基异亮氨酸/每公斤体重。
正如在图解说明中所描述的,在实验期间所测量的第一个人类对象的胰岛素活性和葡萄糖水平表明,来自胡芦巴种子的生物活性化合物的组合物(例如PromilinTM)对人类对象中的胰岛素和葡萄糖水平有所影响。可以容易地看出,在零时刻之后,对于在施用了含有生物活性化合物的活性溶液之后进行的测量而言,第一个人体中的胰岛素活性水平显著地高于施用前的水平,葡萄糖水平比较低。
现在参考图13,该示意图举例说明了第二个人类对象中的安慰剂部分和活性部分结果。活性部分含有溶解在300mL水中的75克葡萄糖,以及本发明的一个优选实施方案,包括生物活性化合物的一种独特的、高效的胡芦巴种子去苦味的提取物(例如PromilinTM),浓度为4毫克4-羟基异亮氨酸/每公斤体重。
正如在图解说明中所描述的,在实验期间所测量的第二个人类对象的胰岛素活性和葡萄糖水平表明,来自胡芦巴种子的生物活性化合物的组合物(例如PromilinTM)对人类对象中的胰岛素和葡萄糖水平有所影响。可以容易地看出,在零时刻之后,对于在施用了含有生物活性化合物的活性溶液之后进行的测量而言,第一个人体中的胰岛素活性水平显著地高于施用前的水平,葡萄糖水平比较低。
图14图解性地代表本发明的另一个优选实施方案,该实施方案使用了一种去苦味提取物,浓度为4毫克4-羟基异亮氨酸/公斤。正如所示,该示意图举例说明了第一个人类对象中的安慰剂部分和活性部分结果。活性部分含有溶解在300mL水中的75克葡萄糖,以及本发明的另一个优选实施方案,包括生物活性化合物的一种独特的、高效的胡芦巴种子去苦味的提取物(例如PromilinTM),浓度为四(4)毫克4-羟基异亮氨酸/每公斤体重。
正如在图解说明中所描述的,在实验期间所测量的第一个人类对象的胰岛素活性和葡萄糖水平表明,来自胡芦巴种子的生物活性化合物的组合物(例如PromilinTM)对第一个人类对象中的胰岛素和葡萄糖水平有所影响。可以容易地看出,在零时刻之后,对于含有生物活性化合物的活性溶液而言,第一个人体中的胰岛素活性水平显著地高于施用前的水平,葡萄糖水平比较低。
现在参考图15,该示意图举例说明了第二个人类对象中的安慰剂部分和活性部分结果。活性部分含有溶解在300mL水中的75克葡萄糖,以及本发明的另一个优选实施方案,包括生物活性化合物的一种独特的、高效的胡芦巴种子去苦味的提取物(例如PromilinTM),浓度为四(4)毫克4-羟基异亮氨酸/每公斤体重。
正如在图解说明中所描述的,在实验期间所测量的第二个人类对象的胰岛素活性和葡萄糖水平表明,来自胡芦巴种子的生物活性化合物的组合物(例如PromilinTM)对第二个人类对象中的胰岛素和葡萄糖水平有所影响。可以容易地看出,在零时刻之后,对于在施用了含有生物活性化合物的活性溶液之后进行的测量而言,第二个人体中的胰岛素活性水平显著地高于施用前的水平,葡萄糖水平比较低。
可以很容易地理解到,这些试验是在第一个和第二个人类对象中所进行的,以评价暴露于来自胡芦巴种子提取物的生物活性化合物的组合物的结果,所述胡芦巴种子提取物是根据胡芦巴种子制备过程制备的(例如PromilinTM),可以对这些实验进行设计或修正,以适用于大量能实践本发明的实施方案,所述实施方案与本发明的精神和范围一致。因此,本发明的目的是,此处提供的实施例可以本看作是本发明所述原则的例证,而不是限制特定结构或实施那些原则的方法。
实施例V
[在人体中使用未去苦味胡芦巴种子提取物-4毫克4-羟基异亮氨酸/公斤]
现在参考图16,该示意图举例说明了第一个人类对象中的安慰剂部分和活性部分结果。活性部分含有溶解在300mL水中的75克葡萄糖,以及本发明的一个优选实施方案,包括生物活性化合物的一种独特的、高效的胡芦巴种子未去苦味的提取物(例如PromilinTM),浓度为4毫克4-羟基异亮氨酸/每公斤体重。
正如在图解说明中所描述的,在实验期间所测量的第一个人类对象的胰岛素活性和葡萄糖水平表明,来自胡芦巴种子的生物活性化合物的组合物(例如PromilinTM)对第一个人类对象中的胰岛素和葡萄糖水平有所影响。可以容易地看出,在零时刻之后,对于含有生物活性成分的活性溶液而言,第一个人体中的胰岛素活性水平比较高,葡萄糖水平比较低。
正如在图17中所示,该示意图举例说明了第二个人类对象中的安慰剂部分和活性部分结果。活性部分含有溶解在300mL水中的75克葡萄糖,以及本发明的一个优选实施方案,包括生物活性化合物的一种独特的、高效的胡芦巴种子未去苦味的提取物(例如PromilinTM),浓度为4毫克4-羟基异亮氨酸/每公斤体重。
正如在图解说明中所描述的,在实验期间所测量的第二个人类对象的胰岛素活性和葡萄糖水平表明,来自胡芦巴种子的生物活性化合物的组合物(例如PromilinTM)对人类对象中的胰岛素和葡萄糖水平有所影响。可以容易地看出,在零时刻之后,对于在施用了含有生物活性化合物的活性溶液之后进行的测量而言,第一个人体中的胰岛素活性水平显著地高于施用前的水平,葡萄糖水平比较低。
可以很容易地理解到,这些实验是在第一个和第二个人体中所进行的,以评价暴露于来自胡芦巴种子提取物的生物活性化合物的组合物的结果,所述胡芦巴种子提取物是根据胡芦巴种子制备过程制备的(例如PromilinTM),可以对这些实验进行设计或修正,以适用于大量能实践本发明的实施方案,所述实施方案与本发明的精神和范围一致。因此,本发明的目的是,此处提供的实施例可以本看作是本发明所述原则的例证,而不是限制特定结构或实施那些原则的方法。
实施例VI
[在人体中使用去苦味胡芦巴种子提取物-9毫克4-羟基异亮氨酸/公斤]
现在参考图18,该示意图举例说明了第一个人类对象中的安慰剂部分和活性部分结果。活性部分含有溶解在300mL水中的75克葡萄糖,以及本发明的一个优选实施方案,包括生物活性化合物的一种独特的、高效的胡芦巴种子去苦味的提取物(例如PromilinTM),浓度为9毫克4-羟基异亮氨酸/每公斤体重。
正如在图解说明中所描述的,在实验期间所测量的第一个人类对象的胰岛素活性和葡萄糖水平表明,来自胡芦巴种子的生物活性化合物的组合物(例如PromilinTM)对第一个人类对象中的胰岛素和葡萄糖水平有所影响。可以容易地看出,在零时刻之后,对于含有生物活性成分的活性溶液而言,第一个人体中的胰岛素活性水平比较高,葡萄糖水平比较低。
正如在图19中所示,该示意图举例说明了第三个人类对象中的安慰剂部分和活性部分结果。活性部分含有溶解在300mL水中的75克葡萄糖,以及本发明的一个优选实施方案,包括生物活性化合物的一种独特的、高效的胡芦巴种子去苦味的提取物(例如PromilinTM),浓度为9毫克4-羟基异亮氨酸/每公斤体重。
正如在图解说明中所描述的,在实验期间所测量的第三个人类对象的胰岛素活性和葡萄糖水平表明,来自胡芦巴种子的生物活性化合物的组合物(例如PromilinTM)对人类对象中的胰岛素和葡萄糖水平有所影响。可以容易地看出,在零时刻之后,对于在施用了含有生物活性化合物的活性溶液之后进行的测量而言,第三个人体中的胰岛素活性水平显著地高于施用前的水平,葡萄糖水平比较低。
可以很容易地理解到,这些实验是在第一个和第三个人体中所进行的,以评价暴露于来自胡芦巴种子提取物的生物活性化合物的组合物的结果,所述胡芦巴种子提取物是根据胡芦巴种子制备过程制备的(例如PromilinTM),可以对这些实验进行设计或修正,以适用于大量能实践本发明的实施方案,所述实施方案与本发明的精神和范围一致。因此,本发明的目的是,此处提供的实施例可以本看作是本发明所述原则的例证,而不是限制特定结构或实施那些原则的方法。
可以进一步理解到,本发明的来自胡芦巴种子的生物活性化合物的组合物的施用方式可以是口服、肠道外注射、舌下施用、局部施用、透皮施用、肌内注射或吸入施用,而且所述组合物也可以含有赋形剂,所述赋形剂根据所采用的剂量形式选择。而且,施用给个体的提取物组合物的剂量可以在几个考虑因素的基础上变化,但不背离本发明的精神和范围,因此,该剂量给将依赖于将要处理的目标个体的特定情况。
从上述讨论,将可以理解到,本发明提供了新颖的组合物,以及提取和分离来自胡芦巴种子的生物活性化合物的方法,所述胡芦巴种子能有助于增加葡萄糖诱导的胰岛素水平,增强胰岛素敏感度,刺激葡萄糖转运因子4的功能。在优选的设计中,提取和分离来自胡芦巴种子的生物活性化合物的新颖方法产生了一种高效的且高质量的提取物产量,该方法的生产比较经济和有效。
与现有技术不同,本发明提供了新颖的组合物,以及提取和分离来自胡芦巴种子的生物活性化合物的方法,包括但不限于,4-羟基异亮氨酸、精氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、γ-氨基丁酸、三甲基组氨酸和EtOHNH2(乙醇胺)。这些从胡芦巴种子提取的新颖的组合物能独立地刺激葡萄糖转运蛋白并且能促进葡萄糖运输到肌肉中,或者可选择地,可以与胰岛素协同工作,刺激葡萄糖转运蛋白,并且促进葡萄糖运输到肌肉中。
在不背离本发明的精神或主要特征的情况下,本发明可以以其它特定形式实施。在所有方面,所描述的实施方案仅作为例证来考虑,而不是起限制性作用。因此,本发明的范围由所附权利要求来表示,而不是由前述描述来表示。在与权利要求等同的意思和范围内所进行的的变化都包括在本发明的范围内。
Claims (62)
1.生物活性化合物的组合物,用于支持葡萄糖和碳水化合物的代谢以及运输到骨骼肌细胞中,所述组合物包括4-羟基异亮氨酸和一种或多种氨基酸,所述氨基酸选自精氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、γ-氨基丁酸和三甲基组氨酸。
2.如权利要求1所述的组合物,其中所述生物活性化合物是从胡芦巴种子(trigonella foenum graecum)提取的。
3.如权利要求1所述的组合物,其中所述生物活性化合物包括大约10%到90%的氨基酸和化学盐(chemical salts),酐,或其异构体。
4.如权利要求1所述的组合物,其中所述生物活性化合物包括大约10%到70%的4-羟基异亮氨酸,和大约20%到40%的氨基酸和化学盐,酐,或其异构体。
5.生物活性化合物的组合物,用于支持葡萄糖和碳水化合物的代谢和运输进骨骼肌中,所述组合物包括4-羟基异亮氨酸、精氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、γ-氨基丁酸和三甲基组氨酸。
6.如权利要求5所述的组合物,其中所述生物活性化合物是从胡芦巴种子(trigonella foenum graecum)提取的。
7.如权利要求5所述的组合物,其中所述生物活性化合物包括大约10%到90%的氨基酸和化学盐,酐或它们的异构体。
8.如权利要求5所述的组合物,其中所述生物活性化合物包括大约10%到70%的4-羟基异亮氨酸,和大约20%到40%的氨基酸和化学盐,酐或其异构体。
9.一种用于支持葡萄糖和碳水化合物的代谢和运输进骨骼肌细胞中的方法,是通过施用在治疗上有效量的组合物,所述组合物是从胡芦巴种子提取的生物活性化合物的组合物。
10.如权利要求9所述的方法,进一步包括增加葡萄糖诱导的胰岛素水平的步骤。
11.如权利要求9所述的方法,进一步包括增强胰岛素敏感度的步骤。
12.如权利要求9所述的方法,进一步包括刺激葡萄糖转运因子4的活性的步骤。
13.如权利要求9所述的方法,其中所述生物活性化合物的组合物是从胡芦巴种子(trigonella foenum graecum)提取的。
14.如权利要求9所述的方法,所述方法进一步包括施用生物活性化合物的组合物的步骤,施用方式选自口服、肠道外给药、舌下施用、局部施用、透皮施用、肌内注射和吸入施用。
15.如权利要求9所述的方法,其中所施用的在治疗上有效量的生物活性化合物的组合物的量是每公斤体重在大约1毫克到9毫克之间。
16.如权利要求9所述的方法,其中所施用的在治疗上有效量的生物活性化合物的组合物的量是每公斤体重在大约1毫克到4毫克之间。
17.如权利要求9所述的方法,其中所施用的在治疗上有效量的生物活性化合物的组合物的量是每公斤体重是大约4毫克。
18.如权利要求9所述的方法,其中生物活性化合物的组合物包括4-羟基异亮氨酸,和一种或多种选自如下化合物的氨基酸:精氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、γ-氨基丁酸和三甲基组氨酸。
19.如权利要求9所述的方法,其中生物活性化合物的组合物包括4-羟基异亮氨酸、精氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、γ-氨基丁酸和三甲基组氨酸。
20.如权利要求9所述的组合物,其中所述生物活性化合物包括大约10%到90%的氨基酸和化学盐,酐或其异构体。
21.如权利要求9所述的组合物,其中所述生物活性化合物包括大约10%到70%的4-羟基异亮氨酸,和大约20%到40%的氨基酸和化学盐,酐或其异构体。
22.一种用于进行重量管理的方法,是通过施用在治疗上有效量的提取自胡芦巴种子的生物活性化合物的组合物。
23.如权利要求22所述的方法,进一步包括包括增加葡萄糖诱导的胰岛素水平的步骤。
24.如权利要求22所述的方法,进一步包括增强胰岛素敏感度的步骤。
25.如权利要求22所述的方法,进一步包括刺激葡萄糖转运因子4的活性的步骤。
26.如权利要求22所述的方法,其中所述生物活性化合物的组合物是从胡芦巴种子(trigonella foenum graecum)提取的。
27.如权利要求22所述的方法,进一步包括施用生物活性化合物的组合物的步骤,施用方式选自口服、肠道外给药、舌下施用、局部施用、透皮施用、肌内注射和吸入施用。
28.如权利要求22所述的方法,其中所施用的在治疗上有效量的生物活性化合物的组合物的量是每公斤体重在大约1毫克到9毫克之间。
29.如权利要求22所述的方法,其中所施用的在治疗上有效量的生物活性化合物的组合物的量是每公斤体重在大约1毫克到4毫克之间。
30.如权利要求22所述的方法,其中所施用的在治疗上有效量的生物活性化合物的组合物的量是每公斤体重是大约4毫克。
31.如权利要求22所述的方法,其中生物活性化合物的组合物包括4-羟基异亮氨酸,和一种或多种选自如下化合物的氨基酸:精氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、γ-氨基丁酸和三甲基组氨酸。
32.如权利要求22所述的方法,其中生物活性化合物的组合物包括4-羟基异亮氨酸、精氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、γ-氨基丁酸和三甲基组氨酸。
33.如权利要求22所述的组合物,其中所述生物活性化合物包括大约10%到90%的氨基酸和化学盐,酐或其异构体。
34.如权利要求22所述的组合物,其中所述生物活性化合物包括大约10%到70%的4-羟基异亮氨酸,和大约20%到40%的氨基酸和化学盐,酐或其异构体。
35.一种用于从胡芦巴种子提取生物活性化合物的组合物的方法,所述方法包括如下步骤:
提供大量胡芦巴种子;
处理胡芦巴种子;和
从胡芦巴种子提取生物活性化合物的组合物,其中所述生物活性化合物包括4-羟基异亮氨酸、精氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、γ-氨基丁酸和三甲基组氨酸。
36.如权利要求35所述的组合物,其中所述生物活性化合物包括大约10%到90%的氨基酸和化学盐,酐或其异构体。
37.如权利要求35所述的组合物,其中所述生物活性化合物包括大约10%到70%的4-羟基异亮氨酸,和大约20%到40%的氨基酸和化学盐,酐或其异构体。
38.所述生物活性化合物包括4-羟基异亮氨酸、精氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、γ-氨基丁酸和三甲基组氨酸。
39.如权利要求35所述的方法,其中处理胡芦巴种子的步骤进一步包括:
将胡芦巴种子浸泡在水中;和
粉碎胡芦巴种子。
40.如权利要求35所述的方法,其中所述提取步骤进一步包括进行一个初步提取过程和一个二次提取过程的步骤。
41.如权利要求40所述的方法,其中所述初步提取过程包括如下步骤:
使用第一种溶剂对所处理的种子提取物进行一次或多次提取,使用的温度条件是在20℃到90℃之间,时间期间为大约1到3小时,以产生一种种子残余物和一种种子提取物;
使用分馏柱蒸馏该种子残余物,是通过加热种子残余物直至沸腾,并且捕获和冷却从其中得到的热蒸气;
在真空下浓缩所蒸馏的种子残余物,以便分离胡芦巴种子油和第一种溶剂;
使用第二种溶剂对种子提取物进行一次或多次提取,使用的温度条件是在20℃到90℃之间,时间期间为大约1到3小时,以便产生第二种种子残余物和一种浓缩的种子提取物;
在真空下对所浓缩的种子残余物进行进一步的浓缩,以便从第二种溶剂中分离第二种浓缩的种子提取物;
将第二种浓缩的种子提取物冷却到室温;
将第二种浓缩的种子提取物沉淀为粗蛋白和一种上清液;和
用去离子水将上清液稀释为上清液体积的大约2到10倍体积。
42.如权利要求41所述的方法,其中用第二种溶剂进行三次提取。
43.如权利要求41所述的方法,其中第一种溶剂包括有机溶剂。
44.如权利要求43所述的方法,其中有机溶剂选自己烷、环己烷和醚。
45.如权利要求41所述的方法,其中第二种溶剂包括含水酒精混合物。
46.如权利要求45所述的方法,其中所述含水酒精混合物是大约10%-95%之间的乙醇。
47.如权利要求41所述的方法,其中第二种提取过程包括如下步骤:
通过用酸进行稀释将上清液的pH浓度调整到大约1到6.5之间,得到pH调节后的上清液;
通过阳离子交换树脂过滤pH调节后的上清液,以去除过量的阳离子;
洗涤阳离子交换树脂,以便从树脂结合的pH调节后的上清液中去除污染物;
用氨溶液处理树脂结合的pH调节后的上清液;
从阳离子交换树脂中收集二次提取产物的酸性流出物和非酸性流出物;
在真空下浓缩酸性流出物以分离污染物;
从二次提取产物中去除残余的氨溶液;和
干燥二次提取产物,以便得到4-羟基异亮氨酸和一种或多种氨基酸。
48.如权利要求47所述的方法,其中所述pH调节步骤包括1N盐酸。
49.如权利要求47所述的方法,其中阳离子交换树脂过滤步骤进一步包括:引导pH调节后的溶液通过具有离子交换特性的阳离子交换树脂的步骤。
50.如权利要求47所述的方法,其中所述洗涤步骤进一步包括:引导水通过具有离子交换特性的阳离子交换树脂的步骤。
51.如权利要求47所述的方法,其中所述氨溶液处理步骤进一步包括:使递增浓缩的氨溶液通过阳离子交换树脂的步骤。
52.如权利要求41所述的方法,其中二次提取过程包括如下步骤:
通过阳离子交换树脂过滤上清液,以去除过量的阳离子;
洗涤阳离子交换树脂,以便从树脂结合的上清液中去除污染物;
用乙醇处理对树脂结合的上清液进行处理;
收集二次提取产物的酸性流出物;
通过用酸进行稀释,将二次提取产物酸性流出物的pH值调整到大约1-6.5之间;
用阳离子交换树脂对pH调节后的二次提取产物进行二次过滤;
用氨溶液处理树脂结合的pH调节后的二次提取产物;
收集二次提取产物的酸性流出物和非酸性流出物;
在真空下浓缩酸性流出物,以便分离污染物;
从二次提取产物中去除残余的氨溶液;和
干燥二次提取产物,得到4-羟基异亮氨酸和一种或多种氨基酸。
53.如权利要求52所述的方法,其中阳离子交换树脂过滤步骤进一步包括:引导pH调节后的上清液通过阳离子交换树脂的步骤。
54.如权利要求52所述的方法,其中所述洗涤步骤进一步包括:引导水通过阳离子交换树脂的步骤。
55.如权利要求52所述的方法,其中所述乙醇处理步骤进一步包括:使递增浓度的乙醇溶液通过阳离子交换树脂的步骤。
56.如权利要求52所述的方法,其中乙醇处理步骤包括具有与乙醇类似的化学特性的溶剂。
57.如权利要求52所述的方法,其中所述pH调节步骤包括6N盐酸。
58.如权利要求52所述的方法,其中所述氨溶液处理步骤进一步包括:使递增浓度的氨溶液通过阳离子交换树脂的步骤。
59.如权利要求52所述的方法,其中所述氨溶液包括氨水。
60.如权利要求59所述的方法,其中所述氨水浓度包括大约0.1N到大约1N。
61.如权利要求59所述的方法,其中所述氨水浓度包括0.3N。
62.如权利要求52所述的方法,其中所述干燥步骤选自喷雾干燥、冷冻干燥和真空干燥。
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