CN106053678A - 一种辅助降血糖片深加工产品中4‑羟基异亮氨酸含量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及质量控制技术领域，特别涉及一种辅助降血糖片深加工产品中4‑羟基异亮氨酸含量的检测方法。该检测方法包括：将待测样品采用超声技术溶解于有机酸溶液中，放冷至室温，过滤，得到供试液；将4‑羟基异亮氨酸对照品溶液和供试液分别采用高效液相色谱‑质谱联用技术测定4‑羟基异亮氨酸，利用外标法得到4‑羟基异亮氨酸的含量。通过对本发明4‑羟基异亮氨酸的含量测定方法进行线性、精密度、重复性、稳定性、空白、检出限、定量限、回收率试验，均符合GB/T27404‑2008《实验室质量控制规范》的要求，证明含量测定方法科学有效，能对葫芦巴提取物的4‑羟基异亮氨酸含量起到质量控制的目的。

Description

一种辅助降血糖片深加工产品中4-羟基异亮氨酸含量的检测 方法

技术领域

本发明涉及质量控制技术领域，特别涉及一种辅助降血糖片深加工产品中4-羟基异亮氨酸含量的检测方法。

背景技术

糖尿病是一种以高血糖为主要特征的慢性代谢类疾病，分原发性和继发性两大类。因为体内胰岛素分泌绝对不足和相对不足，引起糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱，主要是糖分解代谢障碍，产生大量中间代谢产物，如酮体等，中间代谢产物引起许多严重的急性、慢性合并症，这些合并症严重影响糖尿病患者的生命和健康，是造成糖尿病高病死率和高致残率的主要原因。据世界卫生组织有关资料表明，其对总体健康的危害程度，已居慢性非传染性疾病的第三位。作为一种多病因的综合性疾病，糖尿病患者需要长期规范的治疗，如果控制不好，会引发多种类型并发症，包括血管病变、神经病变、肾功能衰竭、失明、截止等病变，且无法治愈。

胡芦巴(Trigonella foenum-graecum L.)是豆科胡芦巴属的一种一年生草本植物，广泛分布于亚洲、欧洲和非洲。胡芦巴种子是传统的中药材，主要的两个药理作用是抗糖尿病和降胆固醇。4-羟基异亮氨酸是存在于胡芦巴属植物中的一种非蛋白氨基酸，这种氨基酸主要存在于胡芦巴种子中，约占该种子中游离氨基酸总含量的80％。近年来，文献报道由胡芦巴种子中分离到的(2s，3R，4S)-4-羟基异亮氨酸能促进胰岛素分泌，而这种促进作用也解释了胡芦巴种子的抗糖尿病活性。

目前，有报道采用高效液相色谱法测定4-羟基异亮氨酸的含量。色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈：无水醋酸钠-四氢呋喃混合溶液(19：81)为流动相；检测波长为340nm；流速为0.6mL/min，柱温：40℃。样品处理方法为：⑴衍生化试剂：称取邻苯二甲醛0.1g，加入甲醇1mL，超声溶解，再加入2-疏基乙醇0.2mL和硼酸-氢氧化钠溶液(PH＝9.5)4mL，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，即得。⑵准确称取样品50mg(精确至0.0001g)，用40％乙醇溶解并定容至50mL，摇匀，经0.45μm微孔滤膜过滤，即得试样溶液。⑶空白溶液：用40％乙醇经0.45μm微孔滤膜过滤，即得空白溶液。测定方法为：准确吸取衍生化试剂10μL，再准确吸取空白溶液、标准品溶液和样品溶液各进样20μL，在规定的色谱条件下，进行色谱分析，记录色谱图。按外标法以峰面积计算，即得。还有报道采用HPLC-ELSD测定葫芦巴中4-羟基异亮氨酸的含量。但上述方法在检测4-羟基异亮氨酸含量的准确性方面均存在一定的问题。因此，需要提供一种能够准确检测4-羟基异亮氨酸含量的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种辅助降血糖片深加工产品中4-羟基异亮氨酸含量的检测方法。该检测方法可准确检测待测样品中4-羟基异亮氨酸的含量。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种4-羟基异亮氨酸含量的检测方法，包括：

将待测样品采用超声技术溶解于有机酸溶液中，放冷至室温，过滤，得到供试液；

将4-羟基异亮氨酸对照品溶液和供试液分别采用高效液相色谱-质谱联用技术测定4-羟基异亮氨酸，利用外标法得到4-羟基异亮氨酸的含量；

高效液相色谱的条件为：C18色谱柱；流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为乙酸铵溶液，流动相B为乙腈或甲醇；梯度洗脱；

质谱的条件为：电喷雾正离子源，扫描方式为多反应监测模式。

作为优选，有机酸为甲酸或乙酸。

在本发明提供的实施例中，有机酸为甲酸。

作为优选，溶解的时间为5～20min。

在本发明提供的实施例中，溶解的时间为10min。

作为优选，乙酸铵的浓度为5～20mmol/L，pH值为3.5。

在本发明提供的实施例中，乙酸铵的浓度为10mmol/L，pH值为3.5。

作为优选，梯度洗脱的程序为：

作为优选，流动相的流速为0.3～0.5mL/min。

在本发明提供的实施例中，流动相的流速为0.4mL/min。

作为优选，C18色谱柱为Agilent EC-C18色谱柱、Phenomenex Kinetex XB-C18色谱柱、Phenomenex Luna C18色谱柱或者其它相同性能的色谱柱。

在本发明提供的实施例中，Agilent EC-C18色谱柱的规格为：150×4.6mm，2.7μm；Phenomenex Kinetex XB-C18色谱柱的规格为：100×4.6mm，2.6μm；Phenomenex Luna C18(2)色谱柱的规格为：100×4.6mm，3μm。

作为优选，色谱柱的柱温为30～40℃。

在本发明提供的实施例中，色谱柱的柱温为40℃。

作为优选，质谱的参数如下所示：

定量离子对为148.2/74.2m/z，碰撞气能量为17.3eV；

定性离子对为148.2/130.2m/z，碰撞气能量为13.0eV；

定性离子对为148.2/102.2m/z，碰撞气能量为14.0eV；

气帘气为22.0psi，碰撞气压为7.0psi，电喷雾电压为5500V，离子源温度为600℃，雾化气为60.0psi，辅助气为20.0psi，去簇电压为15.4V，入口电压为6.8V，碰撞池入口电压CEP为8.0V，碰撞室出口电压为3.0V。

气帘气为22.0psi，碰撞气压为7.0psi，电喷雾电压为5500V，离子源温度为600℃，雾化气为60.0psi，辅助气为20.0psi，去簇电压为15.4V，入口电压为6.8V，碰撞池入口电压EP为8.0V。

在本发明提供的实施例中，待测样品为含有4-羟基异亮氨酸的辅助降血糖片。

本发明提供了一种辅助降血糖片深加工产品中4-羟基异亮氨酸含量的检测方法。该检测方法包括：将待测样品采用超声技术溶解于有机酸溶液中，放冷至室温，过滤，得到供试液；将4-羟基异亮氨酸对照品溶液和供试液分别采用高效液相色谱-质谱联用技术测定4-羟基异亮氨酸，利用外标法得到4-羟基异亮氨酸的含量；高效液相色谱的条件为：C18色谱柱；流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为乙酸铵溶液，流动相B为乙腈或甲醇；梯度洗脱；质谱的条件为：电喷雾正离子源，扫描方式为多反应监测模式。本发明具有的有益效果为：

1、本发明检测方法可准确检测待测样品中4-羟基异亮氨酸的含量；

2、通过对本发明4-羟基异亮氨酸的含量测定方法进行线性、精密度、重复性、稳定性、空白、检出限、定量限、回收率试验，均符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求，证明含量测定方法科学有效，能对葫芦巴提取物的4-羟基异亮氨酸含量起到质量控制的目的。

附图说明

图1～5分别为标准序号为STD1～STD5对照品的色谱图，示本发明检测方法的线性关系；

图6示根据标准序号为STD1～STD5对照品中4-羟基异亮氨酸的浓度绘制的标准工作曲线；

图7～12为对照品溶液重复测定6次得到的色谱图，示本发明检测方法的精密度；

图13～18为试样重复测定6次得到的色谱图，示本发明检测方法的重复性；

图19～24为对照品溶液在室温下放置0h、1h、2h、4h、8h、12h后得到的色谱图，示本发明检测方法的稳定性；

图25示空白溶液的色谱图；

图26示本发明检测方法的检出限；

图27示本发明检测方法的定量限；

图28～36为序号为1～9样品的色谱图，示本发明检测方法的回收率。

具体实施方式

本发明公开了一种辅助降血糖片深加工产品中4-羟基异亮氨酸含量的检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的辅助降血糖片深加工产品中4-羟基异亮氨酸含量的检测方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1检测方法及方法学验证

1原理：试样中的4-羟基异亮氨酸经过超声提取至溶剂中，用高效液相色谱C₁₈柱将4-羟基异亮氨酸分离，经质谱检测，并用外标法定量测定。

2仪器：安捷伦1260高效液相色谱仪-API3200质谱仪(配ESI离子源)。

3试剂试药：甲酸(色谱纯)；乙酸铵(色谱纯)；乙酸(色谱纯)；乙腈(色谱纯)；一级用水；4-羟基异亮氨酸(对照品来源：上海源叶生物科技有限公司，批号:P29F7F10167，纯度:98％)。

4分析步骤：

4.1仪器条件与参数：

4.1.1高效液相色谱仪条件：

流动相：A：10mmol/L的乙酸铵溶液，用乙酸调pH至3.5，B：乙腈，梯度洗脱(表1)；

表1梯度洗脱程序

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	90	10
1	90	10
			6	80	20
6.1	90	10
			9	90	10

流速：0.4mL/min；

柱温：40℃；

色谱柱：Agilent,EC-C18,150×4.6mm，2.7μm。

4.1.2质谱仪参数：

电喷雾正离子源(ESI⁺)；扫描方式：多反应监测模式(MRM)；质谱参数见表2、3。

表2、3中英文为质谱参数，都是特有固定值，电喷雾正离子源(ESI⁺)、电喷雾电压(SI)、雾化气(GS1)、辅助气(GS2)、气帘气(CUR)、离子源温度(TEM)、母离子(Q1)、定量定性离子对(Q3)、去簇电压(DP)、入口电压(EP)、碰撞气能量(CE)、碰撞气压(CAD)、碰撞室出口电压(CXP)。

表2质谱参数

表3质谱参数

CUR	CAD	IS	TEM	GS1	GS2	DP	EP	CEP
									22.0	7.0	5500	600	60.0	20.0	15.4	6.8	8.0

4.2对照储备液的配制：

精密称取4-羟基异亮氨酸对照品16.11mg，置于50mL棕色容量瓶中，加入0.1％甲酸溶液溶解并定容至刻度，摇匀，即得储备液。储备液放在4℃的冰箱中储存备用。

4.3标准工作曲线绘制：

精密吸取4-羟基异亮氨酸储备液1.00mL，置于200mL棕色容量瓶中，加入0.1％甲酸溶液定容至刻度，摇匀，即得工作溶液，分别精密吸取工作溶液1μL、2μL、4μL、7μL、10μL，在4.1条件下，进行分析测定，绘制标准工作曲线。

4.4试样制备：

精密称取样品约0.1g，置于100mL容量瓶中，加0.1％甲酸(甲酸可以用乙酸代替)溶液超声溶解，约10min，放冷至室温，用加0.1％甲酸溶液定容至刻度，摇匀，精密移取1.00mL样品溶液至10mL容量瓶中，用加0.1％甲酸溶液定容至刻度，摇匀，经0.45μm的水相滤膜过滤，即得供试液。精密吸取供试液4μL，在4.1条件下，进行分析测定。

4.5结果计算：

X＝C×V/M×K

式中：X—样品中4-羟基异亮氨酸的含量，％；

M—样品的质量，g；

K—单位转换系数(K＝0.0001)；

V—样品的稀释倍数，mL；

C—样品溶液中4-羟基异亮氨酸的浓度，μg/mL。

5方法学验证：

5.1线性范围确认：

5.1.1试验数据：(色谱图见附图1-5)

表4线性关系试验检测结果

5.1.2标准工作曲线图：

以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线如图6所示。

5.1.3线性试验结论：

线性评价：相关系数R为0.9999,所以用该方法测定4-羟基异亮氨酸在浓度为0.39470μg/mL至3.9470μg/mL之间呈现良好的线性，，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求(GB/T27404-2008要求相关系数R≥0.99)。

5.2精密度试验

5.2.1试验方法：

将4-羟基异亮氨酸的标准工作溶液按4.1条件重复测定6次，计算其峰面积RSD(％)。

5.2.2试验数据：(色谱图见附图7-12)

表5精密度试验检测结果

5.2.3试验结论：

4-羟基异亮氨酸重复测定6次峰面积的RSD(％)为1.0％，表明该方法有较好的精密度。

5.3重复性试验：

5.3.1试验方法：

称取6份样品，按4.4试样制备方法处理样品，检测样品含量，计算其RSD(％)。

5.3.2试验数据：(色谱图见附图13-18)

表6重复性试验检测结果

5.3.3试验结论：

6份样品4-羟基异亮氨酸含量的RSD为1.7％，表明该方法有较好的重复性，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求(GB/T27404-2008要求RSD(％)≤2.7％)。

5.4稳定性试验

5.4.1试验方法：

将4-羟基异亮氨酸标准工作溶液分别在室温下放置0h、1h、2h、4h、8h、12h后，按4.1条件测定峰面积，计算其RSD(％)。

5.4.2试验数据：(色谱图见附图19-24)

表7稳定性试验检测结果

5.4.3试验结论：

4-羟基异亮氨酸标准工作溶液分别在室温下放置0h、1h、2h、4h、8h、12h后，RSD(％)为2.4％，表明4-羟基异亮氨酸标准工作溶液在室温下12小时内的稳定性良好。

5.5空白试验

5.5.1试验方法：

不称取样品，按4.4试样制备方法处理空白溶液，按4.1色谱条件测定空白溶液，与4-羟基异亮氨酸标准工作溶液的出峰时间对比。

5.5.2试验结果见图25。

5.5.3试验结论：

空白溶液在4-羟基异亮氨酸的出峰时间处均无吸收峰，表明空白对测定结果基本无干扰。

5.6检出限与定量限试验：

分析方法的定量限和检出限由信噪比(S/N)计算。检出限图谱见图26，定量限图谱见图27。当信噪比(S/N)为3时，检出限为0.01263μg/mL；得到方法的检出限为126.3mg/kg。当信噪比(S/N)为10时，定量限为0.03158μg/mL；得到方法的定量限为315.8mg/kg。

5.7回收率试验：

5.7.1试验方法：

加标：精密称取约0.1g样品9份(已知样品的4-羟基异亮氨酸含量：1.526％)，分成3组，每组3份，各组分别精密加入4-羟基异亮氨酸的储备液2.00mL、4.00mL、6.00mL。按4.4试样制备方法处理样品。

5.7.2试验数据如下：(色谱图见附图28-36)

表8回收率试验检测结果

测得加入量＝加标样品测得量-样品测得量；

回收率(％)＝测得加入量/理论加入量。

5.7.3试验结论：

平均回收率为：98.7％，相对标准偏差(RSD)为1.0％，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求(GB/T27404-2008要求回收率为95—105％)。

6结论：

通过对4-羟基异亮氨酸的含量测定方法进行线性、精密度、重复性、稳定性、空白、检出限、定量限、回收率试验，均符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求，证明含量测定方法科学有效，能对葫芦巴提取物的4-羟基异亮氨酸含量起到质量控制的目的。

实施例2检测实例

对已知含量的4-羟基异亮氨酸标准品采用实施例1方法和现有的检测方法分别进行测定。现有检测方法参照《冯欢李新霞冯葳等.柱前衍生化HPLC测定不同产地葫芦巴中4-羟基异亮氨酸的含量.西北药学杂志.2016,31:136-138》。结果如下：

表9 4-羟基异亮氨酸含量检测结果

项目	4-羟基异亮氨酸含量(％)
		标准品理论含量	98.0
实施例1方法检测的含量	98.12
		现有方法检测的含量	97.29

由试验结果可知，采用本申请检测方法检测4-羟基异亮氨酸含量，结果更为准确。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种4-羟基异亮氨酸含量的检测方法，其特征在于，包括：

将待测样品采用超声技术溶解于有机酸溶液中，放冷至室温，过滤，得到供试液；

将4-羟基异亮氨酸对照品溶液和所述供试液分别采用高效液相色谱-质谱联用技术测定4-羟基异亮氨酸，利用外标法得到4-羟基异亮氨酸的含量；

所述高效液相色谱的条件为：C18色谱柱；流动相由流动相A和流动相B组成，所述流动相A为乙酸铵溶液，所述流动相B为乙腈或甲醇；梯度洗脱；

所述质谱的条件为：电喷雾正离子源，扫描方式为多反应监测模式。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述有机酸为甲酸或乙酸。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述溶解的时间为5～20min。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述乙酸铵的浓度为5～20mmol/L，pH值为3.5。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序为：

6.根据权利要求1至5中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.3～0.5mL/min。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述C18色谱柱为Agilent EC-C18色谱柱、Phenomenex Kinetex XB-C18色谱柱、Phenomenex Luna C18色谱柱或者其它相同性能的色谱柱。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述Agilent EC-C18色谱柱的规格为：150×4.6mm，2.7μm；所述Phenomenex Kinetex XB-C18色谱柱的规格为：100×4.6mm，2.6μm；所述Phenomenex Luna C18色谱柱的规格为：100×4.6mm，3μm。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱的柱温为30～40℃。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述质谱的参数如下所示：

定量离子对为148.2/74.2m/z，碰撞气能量为17.3eV；

定性离子对为148.2/130.2m/z，碰撞气能量为13.0eV；

定性离子对为148.2/102.2m/z，碰撞气能量为14.0eV；

气帘气为22.0psi，碰撞气压为7.0psi，电喷雾电压为5500V，离子源温度为600℃，雾化气为60.0psi，辅助气为20.0psi，去簇电压为15.4V，入口电压为6.8V，碰撞池入口电压CEP为8.0V，碰撞室出口电压为3.0V。