CN1509181A - 含有细辛根提取物的用于保护脑细胞和增强记忆的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了细辛根(Asiasari Radix)提取物的几个部分能够诱导针对AMPA(α－氨基－3－羟基－5－甲基－4－异噁唑丙酸)诱导的脑细胞损伤的神经保护，以及刺激记忆。

Description

含有细辛根提取物的用于保护脑细胞和增强记忆的组合物
技术领域
本发明涉及包含细辛根(Asiasari Radix)提取物的用于保护脑细胞和增强记忆的组合物。
背景技术
与脑细胞损伤有关的主要因子之一是谷氨酸盐。谷氨酸盐通过与四种类型的受体结合而发挥其作用，所述四种受体包括NMDA受体、AMPA受体、Kainate(红藻氨酸盐)受体和1S，3R-ACPD受体[CraigCR，Stitzel RE，Modem Pharmacology with clinical applications，293-302，1997]。当发生脑缺血时，脑细胞的氧供给减少，然后厌氧糖酵解增加。因此，细胞中ATP含量降低，而细胞外钾离子浓度增高。最后，发生神经元细胞膜去极化，以及随后的兴奋性氨基酸释放，这导致由NMDA受体、AMPA受体和Kainate受体激活引起的神经元损伤。兴奋性神经递质介导的兴奋毒性导致细胞紧张，从而在诸如阿尔茨海默氏病、帕金森病、脑卒中和肌萎缩侧索硬化等神经变性疾病的发病机制中起重要作用[Haloween，B.，J.Neurochem.59，1609-1623，1992；Coyle，J.T.和Puttfarcken，P.，Science 262，689-695.1993；Olanow，C.W.，Trends.Neurosci.16，439-444，1993]。
中枢神经系统中的神经变性疾病常常伴有认知和记忆减退。尤其在有大量老年人口的现代社会，痴呆是一个严重的问题。痴呆通常由多种环境因素如遗传、衰老、脑损伤、吸烟和饮酒以及其它复杂因素引起。痴呆患者的海马严重受损，这与脑中乙酰胆碱水平的降低密切相关。
乙酰胆碱酯酶抑制剂在临床上用于阿尔茨海默氏病以提高乙酰胆碱水平。最近，已经进行了大量的研究来寻找神经保护的方法，如使用NMDA拮抗剂、AMPA拮抗剂、GABA激动剂、降低细胞内钙的药物、氧化氮抑制剂、自由基清除剂、钠通道阻滞剂、谷氨酸盐释放抑制剂、酸中毒、低温以及钾通道活化剂[Gagliardi RJ，Neuroprotection，excitatotoxicity and NMDA antagonists，Arq.Neuro-Psiquiatr.58，2000]。
已经开发了Dozocyilpin(MK 801)、selfotel、cerestat和右美沙芬(dextrometorfan)作为NMDA拮抗剂。然而，已知这些药物在低剂量即引起改变的感官知觉、病理性心境恶劣、眼震和低血压；而在更高剂量导致心理的不利活动，如激动、偏执和幻觉。此外，开发了NBQX作为AMPA拮抗剂。然而，它引起严重的肾毒性，因而在临床应用中不是最理想的。因此，需要开发来自天然产品来源的原料的无毒性的神经保护药物。
最近，已经发现AMPA受体在阿尔茨海默氏病的发展中起重要作用。由AMPA受体激活引起的神经元细胞损伤选择性地发生于前脑基底胆碱能神经元(BFCNs)这一事实表明可以通过使用AMPA受体拮抗剂来尝试开发抗阿尔茨海默氏病的方法[Weiss，J.H.等人，Basal forebrain cholinergic neurons are selectively vulnerable toAMPA/kainate receptor-mediated neurotoxicity.Neuroscience 60，659-664，1994]。
神经胶质细胞对神经元细胞生存而言是必需的。在中枢神经系统的发育中，神经胶质细胞控制神经元细胞的精确运动和生长，而发育成熟后，它们在神经元细胞的内环境稳定和突触可塑性中起作用。另外，神经胶质细胞含有受体和神经递质，它们能够启动对神经元细胞的生存和凋亡而言是必需的神经元信号转导。因此，保护神经胶质细胞不受外部损伤最终关系到神经元细胞的可塑性、内环境稳定及生存。
外周组织中的胰岛素受体主要参与葡萄糖代谢，而其在中枢神经系统中的作用似乎与葡萄糖代谢无关，而是与其它神经元活性如记忆有关。事实上，胰岛素受体广泛分布于脑的不同区域，在海马中大量存在。因此，海马是脑中胰岛素作用的重要靶。最近，很多证据显示了脑胰岛素或胰岛素受体在记忆形成中的作用。已经发现，神经元胰岛素受体的实验损伤与阿尔茨海默脑导致类似的代谢异常[Hoyer，S.，Muller，D，Plaschke，K.Desensitization of brain insulin receptor.Effecton glucose/energy and related metabolism.J.Neural Transm[Suppl]44，259-268，1994]。
已经提出了有趣的假说，即偶发性阿尔茨海默氏病可能是脑型的非胰岛素依赖型糖尿病(Hoyer，S.Is sporadic Alzheimer disease thebrain type of non-insulin dependent diabetes mellitus？A challenginghypothesis.J.Neural Transm.105，415-422，1998)。已经提出，在被动回避任务中，脑室内胰岛素增强记忆[Park，C.P.，Seeley，R.J.，Craft，S.和Woods S.C.(2000)Intracerebroventricular insulin enhancesmemory in a passive avoidance task.Physiol.Behav.68，509-514]。已知，在偶发性阿尔茨海默氏病中，胰岛素受体密度和酪氨酸激酶活性明显降低[Frolich，L.，Blum-degen，D.，Bemstein，H.G.，Engelsberger，S.，Humrich，J.，Laufer，S.，Muschner，D.，Thalheimer，A.，Turk，A.，Hoyer，S.，Zochling，R.，Boissl，K.W.，Jellinger，K.和Piederer，P.Brain insulin and insulin receptors in aging and sporadic Alzheimer’sdisease.J.Neural Transm.105，423-438，1998]。有趣的是，已证明海马胰岛素受体的酪氨酸磷酸化在空间记忆形成中起关键作用[Zhao，W.，Chen，H.，Xu，H.，Moore，E.，Meiri，N.，Quon，M.J.，Alkon，D.L(1999)Brain insulin receptors and spatial memory.J.Biol.Chem.274，34893-34902，1999]。总之，除胆碱酯酶抑制剂外，胰岛素受体激活剂也可以用于增强记忆。
最近，已经发现胰岛素受体的重要下游信号介质ERK(细胞外信号调节激酶或MAPK)I和II与记忆和学习有关[Thiels，E，Klann，E.Extracellular signal-regulated kinase，synaptic plasticity，and memory.Rev.Neurosci.12，327-345，200 1；Sweat J.D.The neuronal MAP kinasecascade：a biochemical signal integration system subserving synapticplasticity and memory.J.Neurochem.76，1-10，2001]。还已经证明，进行回避学习的大鼠表现出大鼠海马中活性形式的ERK I和II的明显和特异的增多[Cammarota，M.，Bevilaqua，L R.M.，Ardenghi，P.，Paratcha，G.，de Stein，M.L，Izquierdo，I.，Medina，J.H.Learning-associated activation of nuclear MAPK，CREB and Elk-l，alongwith Fos production，in the rat hippocampus after a one-trial avoidancelearning：abolition by NMDA receptor blockade.Mol.Brain Res.76，36-46，2000]。
总之，除胆碱酯酶抑制剂外，胰岛素受体和ERK I/II激活剂也可以用于增强记忆和学习。
附图说明
参考附图，本发明的这些及其它特征将变得更加清楚：
图1显示细辛根(AR)提取物部分1阻断AMPA诱导的大鼠皮质切片去极化。数据用平均标准偏差(n＝5)表示。*：与对照比较p＜0.05；
图2显示AR提取物部分4阻断AMPA诱导的大鼠皮质切片去极化。数据用平均标准偏差(n＝5)表示。**：与对照比较p＜0.01；
图3显示在分化的PC12细胞中，AR提取物部分1对AMPA诱导的神经元细胞损伤具有抑制作用。数据用平均标准偏差(n＝5)表示。***：与对照比较p＜0.001；
图4显示在分化的PC12细胞中，AR提取物部分2、3、4和5对AMPA诱导的神经元细损伤的作用。数据用平均标准偏差(n＝5)表示。***：与对照比较p＜0.001；
图5显示在C6神经胶质细胞中，AR提取物部分1对AMPA诱导的细胞损伤具有抑制作用。数据用平均标准偏差(n＝5)表示。在Duncan多重极差检验p＜0.05的水平，无共同字母的条带间有差异；
图6显示在C6神经胶质细胞中，AR提取物部分1、2、3、4和5对Zncl2诱导的神经胶质细胞损伤具有抑制作用。数据用平均标准偏差(n＝5)表示。*：与对照比较p＜0.05，***：与对照比较p＜0.001；
图7显示在NaNO2测定中，AR提取物部分1具有增强的记忆。数据用平均标准偏差(n＝8)表示。**：与对照比较p＜0.01；
图8显示在NaNO2测定中，AR提取物部分2、3、4和5对记忆的作用。数据用平均标准偏差(n＝8)表示。*：与对照比较p＜0.05，**：与对照比较p＜0.01；
图9显示在NaNO2测定中，AR提取物部分2经口服给药引起明显的记忆增强。数据用平均标准偏差(n＝8)表示。*：与对照比较p＜0.05；
图10显示在8臂放射状迷宫测定中，AR提取物部分1、2和4刺激记忆增强。数据用平均标准偏差(n＝10)表示。*：与对照比较p＜0.05，**：与对照比较p＜0.01；
图11显示在被动回避实验中，AR提取物部分1、2和4刺激记忆增强。数据用平均标准偏差(n＝10)表示。*：与对照比较p＜0.05；
图12显示AR提取物部分1、2和4刺激大鼠海马蛋白的酪氨酸磷酸化；
图13显示在大鼠海马中，由AR提取物部分1、2和4引起的胰岛素受体的酪氨酸磷酸化；
图14显示在大鼠海马中，AR提取物部分1、2和4激活ERK I和ERK II；
图15显示在大鼠海马中，AR提取物部分1、2和4抑制胆碱酯酶活性。
发明内容
本发明的发明人进行了多年的研究，为由于环境因素如各种压力、饮酒、吸烟等引起脑损伤的现代人寻找具有记忆增强活性的神经保护药物。在研究大量天然产物的基础上，发现细辛根提取物具有明显的神经保护作用及记忆增强活性。
在这方面，本发明涉及含有细辛根提取物的用于保护脑细胞和增强记忆的组合物。本发明的组合物的特征在于它含有组合物总重量0.5～50％(重量)的细辛根提取物。
细辛根是Asarum sieboldii F.MAEKAWA，汉城细辛(Asarumsieboldii var.seoulense Nakai)、细辛(Asarum sieboldii Miq.)、Asarumheterotropoides Schmidt、辽细辛(Asarum heterotropoides var.mandshuricum Kitagawa)，或Asiasarum heterotropoides F.MAEKAWAvar.seoulensis F.MAEKAWA的干燥全植物、根茎或根。它是多年生植物。它向一侧突出的根茎相对较短，并且其含有许多节和直径约1mm的细根。它的形状象凹凸不平的弯曲的线绳。它具有直径为3～5mm的多结的根茎，并且呈黄褐色。根茎含有许多长度为5～20cm的根。它是淡褐色的，并且长而纤细。其表面具有很浅的垂直的褶层。
它含有精油，如甲基丁香油酚、细辛酮、桉树脑、黄樟油精、柠檬油精、优
Figure A0280985800091
蒿萜酮；酰胺，如N-异丁基2，4，8，10-十二碳四烯酰胺、墙草碱；以及木脂素类，如芝麻素和(-)细辛素(Zhou RH，ResourceScience of Chinese Medicinal Materials.pp.202-211.Beijing：Chinamedical & Pharmaceutical Sciences press，1993)。细辛根中还存在几种生物碱，包括hygenamine。已报道细辛根提取物发挥降低体温、解痉、抗组胺和强心作用。它用作局部麻醉剂、阵痛药、退热药、止咳药、祛痰药和利尿药(Zhu，Y.Chinese Materia Medica：Chemistry，Pharmacology and Application，pp.66-69.Beijing：People's HealthPublisher，1998)。然而，并不知道细辛根提取物是否对神经保护和记忆有任何作用。
本发明的细辛根提取物如下获得：用具有1个碳原子至4个碳原子的低级醇，如甲醇或乙醇或有机溶剂如丙酮、氯仿、二氯甲烷、乙醚或乙酸乙酯，或低级醇和有机溶剂的组合在5℃至80℃，理想地在30℃至55℃下提取细辛根，提取时间为15分钟至48小时，优选30分钟至12小时。可以通过减压蒸发将所获得的提取物制成散剂。
另外，本发明的细辛根提取物可以通过下述方法(Harbome J.B.Phytochemical methods：A guide to modern techniques of plant analysis.3rd Edt.pp 6-7，1998)进一步分级分离。
通过下述顺序提取和分级分离程序制备本发明的细辛根提取物：
将通过上述方法获得的细辛根提取物溶于甲醇∶水混合溶剂，调节至pH 2-4，然后用等体积氯仿提取；
用NH4OH将不溶于氯仿的部分调节至pH 9-12，然后用等体积氯仿∶甲醇混合溶剂提取；以及
随后用甲醇提取不溶于氯仿∶甲醇混合溶剂的部分，得到细辛根提取物。
氯仿∶甲醇混合溶剂的理想比例是1∶0.1～1。当用氯仿∶甲醇混合溶剂进一步分级分离上述不溶于氯仿的部分时，可溶于氯仿∶甲醇混合溶剂的部分含有大部分的生物碱，而不溶于氯仿∶甲醇混合溶剂的部分含有四元生物碱(quatemary alkaloid)和N-氧化物。
包含细辛根提取物的组合物可以含有适当的载体、赋形剂和稀释剂，如乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、钙、磷酸盐、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁或矿物油。
本发明的组合物可以用作口服配方，如散剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂；外用制剂；以及栓剂。另外，它可以用作无菌注射剂。可以以每日0.1mg/kg至500mg/kg的剂量给予本发明的细辛根提取物。剂量可以一次给予，或者可以分次给予。然而，实际的给药剂量应该考虑到各种相关的因素，如要治疗的疾病的种类、给药途径、患者年龄、性别和体重，以及疾病的状况等。因此，以上所提及的剂量不以任何方式限制本发明的范围。
本发明的包含细辛根提取物的组合物可以广泛用作用于神经保护和增强记忆的药品、食品和饮料。可以将细辛根提取物加入食品中，如各种食品、饮料、香口胶、茶、维生素复合物和保健食品等。
另外，本发明涉及用于增强记忆的含有细辛根提取物的氯仿部分的组合物，所述细辛根提取物的氯仿部分是通过以下顺序分级分离程序获得的：
用具有1个碳原子至4个碳原子的低级醇，如甲醇或乙醇，或者用有机溶剂，如丙酮、氯仿、二氯甲烷、乙醚或乙酸乙酯提取细辛根；
和
将所得的细辛根提取物溶于甲醇∶水混合溶剂，用酸调节至pH2-4，然后用等体积氯仿提取，获得细辛根提取物的氯仿部分。
甲醇∶水混合溶剂的理想比例是1∶0.2～1.5，该部分含有萜类化合物和酚类化合物。
本发明的用于增强记忆的组合物的特征是上述部分的含量为组合物总重量的0.5～50％(重量)。
与上述的用于保护脑细胞和增强记忆的含有细辛根提取物的组合物相同，本发明的用于增强记忆的组合物可以含有适当的载体、赋形剂和稀释剂。另外，可以按照常规方法将其制成各种配方，并广泛用作用于增强记忆的药品、食品和饮料。
本发明的其它修饰和改进可能对本领域普通技术人员也是清楚的。因此，本文中描述和例示的部分的特定组合仅仅代表本发明的某些实施方案，而不是为了限制在本发明的实质和范围之内的其它设计。
具体实施方案
通过以下实施例详细阐述本发明，但本发明并不限于这些实施例。
实施例：细辛根提取物的制备
将细辛根(250g)切成小片，并使用索格利特抽提器，用70％甲醇(750ml)提取3小时，三次。然后过滤，将所得甲醇提取物用旋转蒸发仪浓缩并用冷冻干燥机干燥(部分1)。为了用其它有机溶剂分级分离，将10g部分1再悬浮于200ml MeOH-H2O(4∶1)中，然后用2MH2SO4将其调节至pH3。然后，用等体积的CHCl3提取3次，并用旋转蒸发仪浓缩，接着冷冻干燥(部分2)。
用NH4OH将可溶于水而不溶于CHCl3的部分调节至pH10，并用等体积的CHCl3-MeOH(3∶1)提取两次。将可溶于CHCl3-MeOH(3∶1)的部分浓缩并冷冻干燥(部分3)。将可溶于水而不溶于CHCl3-MeOH(3∶1)的部分与等体积的MeOH混合，并提取三次。将可溶于MeOH的部分浓缩并冷冻干燥(部分4)。将不溶于MeOH的部分浓缩并冷冻干燥(部分5)。
实验1：油脂间隙记录测定(Grease-gap recording assay)
1)实验方法
准备大鼠皮质楔形块，置于二隔室脑浴中，如Harrison和Simmonds描述的方法(British J.Pharmacol.84，381-391，1985)进行实验。从雄性威斯塔鼠(200g)的脑制备大鼠大脑皮层的‘契形物’。将动物断头，迅速取脑置于冷冻的充氧(95％O2/5％CO2)的人工脑脊液(ACSF)中，该人工脑脊液含有(mM)：NaCl 122，NaHCO3 25，KCl3.1，KH2PO4 0.4，CaCl2 1.3，MgSO4 1.4，D-葡萄糖10，(pH7.4)。取500-600μm冠状切片，然后将它们置于室温充氧的ACSF中，用剃须刀片对半切开。形成楔形组织块，含有脑皮质和胼脂体的背侧皮质面约1.5mm宽，而腹侧面约1mm宽。将楔形块进一步在ACSF中于室温下温育2小时。
将皮质楔形块置于二隔室浴中，并放置加过润滑脂(高真空硅脂)的屏障，以使二个隔室之间形成高电阻封闭。将充氧的ACSF以2ml/min的速度分别注入二个隔室中，持续至少1小时。将细辛根(AR)提取物(部分1、2、3或4)灌注10分钟后施加AMPA(40μM)2分钟：将AR提取物和AMPA施加于皮质隔室。二个隔室之间的直流电压通过Ag/AgCl电极监测。利用McLab软件放大并分析信号。
2)实验结果
认为由AMPA引起的神经元细胞去极化是神经元细胞损伤引起的刺激的指标。AMPA处理(40μM)2分钟导致去极化增加达0.79mV。当AR提取物(部分1)(10μg/ml)预温育10分钟并接着AMPA处理2分钟时，AMPA诱导的去极化增加显著降低(图1A)。与对照相比，AR提取物的部分1的平均抑制作用为约54％(图1B)。结果提示，AR提取物(部分1)对AMPA诱导的神经元损伤具有明显的神经保护作用。
在细辛根的甲醇提取物的多个部分中，部分4对AMPA诱导的去极化具有显著的抑制作用：它对AMPA诱导的神经元损伤的保护为约92％(图2)。另一方面，部分2和3在抑制AMPA诱导的去极化方面无效(数据未显示)。
由于部分4含有不溶于氯仿以及氯仿∶甲醇的成分，所以它不含可溶于诸如氯仿的有机溶剂的萜类化合物、酚类化合物和芝麻素。因此，提示部分4的神经保护作用是由芝麻素、萜类化合物和酚类化合物等以外的成分带来的。
实验2：细胞活力测定(MTT测定)
1)实验方法
MTT测定是用比色计测量线粒体氧化还原的方法，其主要用于检测线粒体氧化还原势或细胞活力(Mosmann T.，J Immunol.Methods，1983)。
在含10％胎牛血清的DMEM培养基中于37℃、含5％CO2的加湿空气中培养PC 12细胞和C6神经胶质细胞。通过添加神经生长因子(100ng/ml)来诱导PC 12细胞分化成神经元细胞。每48小时添加新鲜的NGF，在NGF处理7天后进行实验。
以1×105个细胞/孔的密度将细胞置于96孔板中。用AMPA(40μM)预温育细胞，接着添加AR部分(10g/ml)，温育24小时。在PBS(磷酸盐缓冲盐水)中制备MTT试剂(Sigma，USA)(5 mg/ml)并过滤。用MTT(终浓度0.5mg/ml)处理细胞，于37℃下温育3小时。通过分解四唑鎓环，含有活性线粒体的细胞形成深蓝色的甲_。移除培养基，并在100μl DMSO和10μl索楞逊甘氨酸缓冲液(0.1 M甘氨酸，0.1 M NaCl，pH 10.5)的存在下使细胞溶解。用分光光度计在570nm测量吸光度。实验组与对照组的吸光度的比值以％细胞活力表示。
2)实验结果
在分化的神经元PC12细胞中，与对照相比，AMPA(40μM)引起细胞活力降低约50％，而AR提取物(部分1；10μg/ml)预处理使AMPA导致的细胞活力降低恢复90％以上(图3)。当测试部分2、3、4或5对细胞活力的保护作用时，在分化的PC12细胞中，部分4对AMPA诱导的神经元损伤的保护几乎达到对照水平，提示其具有导致神经保护的活性成分(图4)。
在C6神经胶质细胞中，与对照相比，AMPA引起细胞活力降低约35％，而AR提取物(部分1)预处理使AMPA诱导的细胞活力降低恢复约10％(图5)。由于原始AR提取物对AMPA诱导的神经胶质细胞损伤的保护作用相对较弱，我们尝试用ZnCl2(100μM)诱导C6神经胶质细胞中的氧化损伤(图6)。当用部分1、2、3、4或5预处理时，与对照相比，部分1100％地阻断Zn诱导的神经胶质细胞损伤，而部分4对损伤的抑制为58％。
实验3：记忆测定
1.NaNO2测定
已经提出，NaNO2引起的脑内氧化代谢缺乏和与学习和记忆相关的胆碱能神经传递之间密切相关。因此，认为生存时间的延长是记忆增强的指标[Schindler等人，Drug Develop.Res.4：567-576，1984]。
1)实验方法
将细辛根提取物(部分1；100mg/kg，i.p.)给予雄性小鼠。60分钟后，注射NaNO2(250 mg/kg，s.c.)，并记录呼吸停止时间。
通过测量和比较对照与治疗组生存时间的延长来分析记忆增强效果。
还将部分1的细分部分(部分2、3、4和5)给予雄性小鼠(100mg/kg，i.p.)，并如上所述进行NaNO2记忆测定。
2)实验结果
与对照相比，原始的细辛根甲醇提取物(部分1)给药(100mg/kg，i.p.)引起生存时间增加25％，表明它增强记忆(图7)。当测试部分2、3、4和5时，部分4引起生存时间增加约25％，而部分2引起在所测试的多个部分中最强的记忆增强作用(增强50％)(图8)。随后，进一步测试部分2是否口服给药也导致与腹膜内给药相似的作用。将部分2口服给予(10mg/kg)，60分钟后给予NaNO2。部分2给药(10mg/kg，p.o.)引起记忆增强约50％(图9)。
2.8臂放射状迷宫实验
为了进一步证实部分1、2和4具有记忆增强活性，按照Ikonen和Riekkinen描述的方法[European J Pharmacol.382，151-156，1999]进行8臂放射状迷宫实验。
1)实验方法
8臂放射状迷宫的中心部分直径为20cm。它的臂长25cm，高15cm，宽6cm。简要的说，两天的预训练(每天5分钟)允许小鼠探察投放有饵料的放射状臂迷宫。在实验阶段，以半随机方式在四个臂中投饵，对每只小鼠为独特的投饵臂组合。每次从一个臂返回中心后，将门关闭5秒。训练持续到所有的饵料都被消耗或者15分钟过去。实验包括两个记忆功能参数：1)定位记忆错误(reference memoryerror)，进入未投饵的臂；2)操作记忆错误(working memory error)，在一次实验中重复进入已进入过的臂中[Gamoh等人，Clinical andexperimental Pharmacology and Physiology 28，266-270，2001]。部分1、2和4(10mg/kg/天，p.o.)给药，每日一次，共五天，然后进行8臂放射状迷宫实验。
2)实验结果
与对照相比，部分1、2和4分别以38％、50％和50％降低定位记忆错误，而与对照相比，部分1、2和4分别以48％、63％和74％降低操作记忆错误(图10)。与对照相比，部分1、2和4分别以55％、61％和58％减少获取全部饵料所用时间。
3.被动回避实验
1)实验方法
实验基本上按照Jarvik和Kopp描述的步入法(step-throughmethod)[Jarvik，M.E.和Kopp，R.An improved one-trial passiveavoidance learning situation.Psychol.Rep.21，221-224，1967]进行。实验中使用Gemini回避系统(SD Instruments)。该装置由二隔室丙烯酸盒组成，一个明室与一个暗室由一个自动闸门连接。将小鼠放在明室中300秒。然后，打开闸门。小鼠一进入暗室就受到惩罚性电击(0.3mA，1秒)。在训练实验和24小时后的保持实验中测定进入暗室的等待时间。在保持阶段中所允许的最大进入等待时间是500秒。
2)实验结果
在训练阶段，AR提取物的各部分之间无明显差异。然而，在保持阶段，与对照相比，部分1、部分2或部分4给药分别将步入时间延长8.1倍、2.2倍和2.7倍(图11)。
实验4：海马蛋白酪氨酸磷酸化
1)实验方法
1.海马溶解产物的制备
将雄性Sprague Dawley鼠断头并于4℃分离海马。按照经一些修改的以前描述的方法[Zhao，W.，Chen，H.，Xu，H.，Moore，E.，Meiri，N.，Quon，M.J.，Alkon，D.L.，Insulin receptors and spatialmemory.J.Biol.Chem.274，34893-34902，1999]制备海马匀浆。将分离的海马回再悬浮于缓冲液A中，缓冲液A含有50 mM Tris HCl，pH 7.4，1mM EDTA，1mM EGTA，150mM NaCl，1％Triton X-100，0.5mM PMSF，1mM Na3VO4，1μg/ml亮抑酶肽和抑肽酶，用Potter-Elvehjem匀浆器进行匀浆化。然后将溶解产物在10000xg下旋转离心10分钟，对上清液进行蛋白质测定并保存于70℃。
2.免疫沉淀
按照以前描述的方法[Kim S.J.，Kahn，C.R.Insulin stimulatesphosphorylation of c-Jun，c-Fos and Fos-related proteins in culturedadipocytes.J.Biol.Chem.269，11 887-11892，1994]进行免疫沉淀。
在4℃下，将适量的来自海马溶解产物的蛋白与胰岛素受体抗体一起温育1小时，然后添加蛋白A琼脂糖凝胶，通过离心使免疫复合物沉淀。依次用1ml缓冲液A(0.01M Tris，pH 7.4，1M NaCl，1％Nonidet P-40)、缓冲液B(0.01M Tris，pH 7.4，0.1M NaCl，0.01M EDTA，1％Nonidet P-40，0.3％SDS)和缓冲液C(0.01M Tris，pH7.4和1％Nonidet P-40)洗涤团粒。将最终的团粒用含100 mM二硫苏糖醇的Laemmli缓冲液溶解，煮沸5分钟，在微型离心机中离心，对上清液进行SDS-PAGE并用抗pTyr抗体进行蛋白质印迹分析。
3.蛋白质印迹分析
将适量的海马蛋白施加于SDS聚丙烯酰胺凝胶。按照Towbin等人描述的方法[Towbin H.，Staehelin，J.，Gordon，J.Electric transfer ofproteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets：procedure andsome applications.Proc.Natl.Acad.Aci.USA 76，4350-4354，1979]，于100 V(恒定)下，从凝胶向硝酸纤维滤纸进行蛋白质电转移1小时。将滤纸用含有0.1％Tween 20和3％牛血清白蛋白的PBS中于23℃预温育1小时，并用含有0.1％Tween 20的PBS洗涤3次，每次10分钟。以pTyr抗体作为探针于23℃进行蛋白质印迹1小时。然后将印迹与HRP缀合的抗兔IgG一起温育30分钟，并用含有Tween 20的PBS洗涤五次，每次10分钟。用ECL(NEN)进行固定的特异性抗原的检测。
3)实验结果
由于已经提出海马中胰岛素受体的酪氨酸磷酸化在空间记忆中起重要作用，因此我们已经测试了是否AR提取物对海马蛋白的酪氨酸磷酸化有作用。分子量大小为～180kDa、130kDa、95kDa、55kDa和42kDa的许多蛋白的酪氨酸磷酸化(图12)。我们进一步测试了是否AR提取物引起胰岛素受体的酪氨酸磷酸化。在基础条件下，未检测到胰岛素受体磷酸化，而其受到部分1和部分2的显著的刺激：部分1的作用高于部分2的(图13)。另外，AR提取物的部分1、2和4显著刺激ERK1(44 kDa)和ERK2(42 kDa)(图14)。
另外，AR提取物的部分1、2和4显著地刺激ERK1(44 kDa)和ERK2(42 kDa)(图14)；由于DRK I和II的活化是记忆和学习所必需的，所以这些结果表明这些部分在记忆和学习增强中起重要作用。
实验5：体外胆碱酯酶测定
1)实验方法
给雄性SD鼠口服载体或AR提取物的部分。90分钟后将大鼠断头，迅速取脑，分割海马和纹状体，称重并如上所述匀浆化。按照Ellman等人描述的方法[Ellman，G.L.，Courtney，K.D.，Andres，V.，Featherstone，R.M.A new and rapid colorimetric determination Ofacetylcholinesterase activity.Biochem.Pharmacol.7，88-95.1961]测定胆碱酯酶活性。简要的说，将3ml缓冲液I(100mM磷酸盐，pH8.0)、0.2ml 75mM的碘化乙酰硫胆碱(acetylthiocholine iodide)和0.1ml缓冲的埃尔曼(Ellman's)试剂(DTNB 10mM，NaHCO3 15mM)混合，并于25℃温育10分钟。然后，加入20μl酶样品，以30秒间隔测量吸光度。通过与载体对照组的酶活性进行比较而计算百分抑制。
2)实验结果
考虑到已经证明胆碱酯酶抑制提高认知功能，我们测试了是否AR提取物对海马胆碱酯酶活性具有抑制作用。与对照相比，部分1、2或4给药分别引起海马胆碱酯酶活性的39％、24％或12％的抑制(图15)。
实验6：口服毒性实验
1)实验方法
将ICR小鼠(20g)饲养1周，饲养室条件：50％相对湿度、150-300Lux、控制温度(23℃)、12小时明/暗循环、自由获取标准的鉴定合格的啮齿动物食品和自来水。将25只小鼠分成5组。
将细辛根提取物(部分1)溶于0.1％Tween 80，并分别以100mg/kg、1000mg/kg、3000mg/kg、5000mg/kg、10000mg/kg的剂量口服给予5组小鼠。在接下来的7天中，观察全身症状的变化和死亡。在第7天，处死全部小鼠，检查内脏。
2)实验结果
细辛根提取物给药未引起全身症状和内脏外观的任何改变。细辛根的部分1的LD50为3400mg/kg。
制备例1.片剂
按照下述成分通过常规生产方法配方片剂。
1-1.片剂成分
细辛根甲醇提取物              500.0mg
乳糖                          500.0mg
滑石                          5.0mg
硬脂酸镁                      1.0mg
1-2.片剂成分
细辛根甲醇提取物的氯仿部分    50.0mg
乳糖                          50.0mg
滑石                          0.5mg
硬脂酸镁                      0.1mg
1-3.片剂成分
细辛根甲醇提取物甲醇部分      50.0mg
乳糖                          50.0mg
滑石                          0.5mg
硬脂酸镁                      0.1mg
制备例2.胶囊剂
按照下述成分通过下述方法制备胶囊剂。将细辛根提取物筛分并与赋形剂混合，填入明胶胶囊中。
2-1.胶囊成分
细辛根甲醇提取物               500.0mg
淀粉1500                       10.0mg
硬脂酸镁BP                     100.0mg
2-2.胶囊成分
细辛根甲醇提取物的氯仿部分     50.0mg
淀粉1500                       1.0mg
硬脂酸镁BP                     10.0mg
2-3.胶囊成分
细辛根甲醇提取物的甲醇部分     50.0mg
淀粉1500                       1.0mg
硬脂酸镁BP                     10.0mg
制备例3.糖浆剂
按照下述成分通过下述方法制备糖浆剂。首先，将糖溶于净化水中，并添加对羟基苯甲酸盐(paraoxybenzoate)、对羟基苯甲酸丙酯(paraoxypropylbenzoate)和细辛根提取物。将所得混合物于60℃溶解并使之冷却。最后，加入净化水至最终体积达150ml。
3-1.胶囊成分
细辛根甲醇提取物            5.0g
糖                          95.1g
对羟基苯甲酸盐              80.0mg
对羟基苯甲酸丙酯            16.0mg
净化水                      加至150ml
3-2.胶囊成分
细辛根甲醇提取物氯仿部分    50.0mg
糖                          95.1g
对羟基苯甲酸盐              80.0mg
对羟基苯甲酸丙酯            16.0mg
净化水                      加至150ml
3-3.胶囊成分
细辛根甲醇提取物的甲醇部分          50.0mg
糖                                  95.1g
对羟基苯甲酸盐                      80.0mg
对羟基苯甲酸丙酯                    16.0mg
净化水                              加至150ml
制备例4.溶液剂
通过溶液剂的常规方法配方将下述成分，并将溶液置于棕色瓶中。
4-1.溶液成分
细辛根甲醇提取物                    500.0mg
Isoglucose                          20.0g
抗氧化剂                            5.0mg
对羟基苯甲酸甲酯                    2.0mg
(methylparabenzoic acid)
蒸馏水                              加至100.0ml
4-2.溶液成分
细辛根甲醇提取物的氯仿部分          500.0mg
Isoglucose                          20.0g
抗氧化剂                            5.0mg
对羟基苯甲酸甲酯                    2.0mg
蒸馏水                              加至100.0ml
4-3.溶液成分
细辛根甲醇提取物的甲醇部分          500.0mg
Isoglucose                          20.0g
抗氧化剂                            5.0mg
对羟基苯甲酸甲酯                    2.0mg
蒸馏水                              加至100.0ml
制备例5.散剂
按照下述方法配方散剂：通过生产散剂的常规方法混合下述成分，装入纸袋中，并完全密封。
5-1.散剂成分
细辛根甲醇提取物                   50.0mg
乳糖                               100.0mg
滑石                               5.0mg
5-2.散剂成分
细辛根甲醇提取物的氯仿部分         50.0mg
乳糖                               100.0mg
滑石                               5.0mg
5-3.散剂成分
细辛根甲醇提取物的甲醇部分         50.0mg
乳糖                               100.0mg
滑石                               5.0mg
制备例6.注射剂
按照下述成分通过下述注射剂的常规生产方法制备注射剂。将制备的注射剂装入2ml容积的安瓿中并灭菌。
6-1.注射剂成分
细辛根甲醇提取物                   50.0mg
抗氧化剂                           1.0mg
Tween 80                           1.0mg
注射用蒸馏水                       加至2.0ml
6-2.注射剂成分
细辛根甲醇提取物的氯仿部分         50.0mg
抗氧化剂                           1.0mg
Tween 80                           1.0mg
注射用蒸馏水                       加至2.0ml
6-3.注射剂成分
细辛根甲醇提取物的甲醇部分         50.0mg
抗氧化剂                           1.0mg
Tween 80                           1.0mg
注射用蒸馏水                       加至2.0ml
工业实用性
含有细辛根提取物的组合物不仅对脑细胞损伤所致的神经变性疾病产生预防和治疗作用，而且还产生增强记忆的作用。其可以用作药物和/或保健食品，通过保护脑细胞而用于预防和治疗现代人的神经变性疾病，这些现代人具有由于各种压力、饮酒、吸烟等引起的脑损伤，其还用于增强记忆。

Claims (19)

1.含有细辛根提取物的用于保护脑细胞和增强记忆的组合物。
2.权利要求1的组合物，其中细辛根提取物的含量为组合物总重量的0.5～50％(重量)。
3.权利要求1的组合物，其中用含有约1个碳原子至约4个碳原子的低级醇提取细辛根提取物。
4.权利要求3的组合物，其中低级醇选自甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯，以及它们的组合。
5.权利要求1的组合物，其中该组合物进一步包含载体、赋形剂和稀释剂。
6.权利要求1的组合物，其中将组合物配方成口服制剂。
7.权利要求6的组合物，其中口服制剂是散剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、糖浆剂和气雾剂。
8.权利要求1的组合物，其中将组合物配方成外用剂型。
9.权利要求1的组合物，其中将组合物配方成栓剂。
10.权利要求1的组合物，其中将组合物配方成无菌注射剂。
11.权利要求1的组合物，其中所述细辛根提取物是通过以下顺序分级分离程序获得的：
将按照权利要求3所述方法得到的细辛根提取物溶于甲醇∶水混合溶剂中，用酸调节至pH2-4，并用适宜体积的氯仿提取；
然后用NH4OH将不溶于氯仿的部分调节至pH9-12，并用适宜体积的氯仿∶甲醇混合溶剂提取；和
用甲醇进一步提取并分级分离其中不溶于氯仿∶甲醇的部分，得到可溶于甲醇的细辛根提取物。
12.用于增强记忆的含有细辛根提取物的氯仿部分的组合物，所述细辛根提取物的氯仿部分是通过以下顺序分级分离程序获得的：
用具有1个碳原子至4个碳原子的低级醇，如甲醇或乙醇，或者用有机溶剂，如丙酮、氯仿、二氯甲烷、乙醚或乙酸乙酯提取细辛根；和
将所得的细辛根提取物溶于甲醇∶水混合溶剂中，用酸调节至PH2-4，然后用适宜体积的氯仿提取，获得细辛根提取物的氯仿部分。
13.权利要求12的用于增强记忆的组合物，其中所述部分的含量为组合物总重量的0.5～50％(重量)。
14.权利要求12的用于增强记忆的组合物，其中所述组合物还含有载体、赋形剂和稀释剂。
15.权利要求12的用于增强记忆的组合物，其中将所述组合物配方成口服制剂，包括散剂、片剂、胶囊、混悬剂、糖浆剂和气雾剂；外用剂型；栓剂；和无菌注射剂。
16.包含权利要求1的组合物的食品。
17.包含权利要求1的组合物的饮料。
18.包含权利要求12的组合物的食品。
19.包含权利要求12的组合物的饮料。
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