KR20030081514A

KR20030081514A - 세신추출물을 함유하는 뇌세포 보호 및 기억력 증진용조성물

Info

Publication number: KR20030081514A
Application number: KR1020037011842A
Authority: KR
Inventors: 김성진
Original assignee: 김성진
Priority date: 2001-03-13
Filing date: 2002-03-12
Publication date: 2003-10-17
Also published as: CA2440675A1; US6737087B2; US20040247716A1; US7078065B2; EP1368047A4; WO2002072124A1; US20020182278A1; KR100538476B1; AU2002239113B2; JP2004525125A; EP1368047A1; CN1509181A; JP4145659B2

Abstract

본 발명은 세신추출물의 분획들이 기억을 자극할 뿐만아니라 AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid)에 의하여 유발되는 뇌세포 손상에 대하여 신경보호를 유발하는 능력을 갖는 것을 개시한다.

Description

세신추출물을 함유하는 뇌세포 보호 및 기억력 증진용 조성물{Composition containing asiasari radix extracts for protecting brain cells and improving memory}

뇌세포의 손상에 관여 하는 중요한 인자중의 하나는 아미노산인 글루타메이트이다. 글루타메이트는 주로 4가지의 수용체 즉, NMDA수용체, AMPA수용체, 카이네이트(Kainate) 수용체 및 1S,3R-ACPD 수용체에 결합하여 작용을 나타낸다[Craig CR, Stitzel RE, Modern Pharmacology with clinical applications, 293-302, 1997]. 뇌허혈과 같은 자극이 있을 경우 뇌세포에 산소공급이 줄어들게 되고, 결과 혐기성 해당작용이 증가하며, 조직내의 에너지원인 ATP가 줄어들어 이온펌프의 작용이 감소하게 되고, 세포외의 포타슘이온의 양이 증가하여 신경세포막의 탈분극이 유도된다. 이렇게 되면 흥분성 아미노산이 분비되어 NMDA, AMPA, 카이네이트 수용체의 활성화로 인하여 뇌손상이 일어나게 된다.

흥분성 신경 전달물질에 의한 흥분성 독성(excitotoxicity)은 세포 스트레스를 유발하여, 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸증 및 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis) 등의 퇴행성 신경질환(neurodegenerative disorders)과 같은 병리학적 상태를 유발하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 [Haloween, B., J. Neurochem. 59, 1609-1623, 1992; Coyle, J. T. 및 Puttfarcken, P., Science 262, 689-695. 1993; Olanow, C. W., Trends Neurosci. 16, 439-444, 1993]. 중추신경계의 퇴행성 신경질환(neurodegenerative disorders)은 때로 기억과 인지기능의 저하를 수반한다. 특히, 치매는 현대와 같은 고령화 사회의 중대한 문제로서 그 원인으로 유전, 노화, 뇌손상, 흡연 및 음주와 같은 환경적 요인 및 기타 복합인자들을 들 수 있다. 주로 해마(hippocampus)가 많이 손상되며, 이는 일반적으로 뇌의 아세틸콜린 함량의 감소와 밀접한 관련성이 있다.

현재, 뇌의 아세틸콜린 양을 증가시키기 위하여 아세틸콜린 에스테라제 억제제(acetylcholine esterase inhibitor)들이 알츠하이머성 치매의 치료에 널리 사용되고 있는 실정이다. 이외에도, 이러한 뇌손상을 억제하기 위한 많은 연구가 이루어지고 있으며[Gagliardi RJ, Neuroprotection, excitotoxicity and NMDA antagonists, Arq. Neuro-Psiquiatr. 58, 2000], 예를 들어, NMDA 길항제, AMPA 길항제, GABA 효능제, 세포내 칼슘감소제, 산화질소(nitric oxide) 억제제, 유리 라디칼 제거제(free radical scavenger), 나트륨 채널 억제제, 글루타메이트 유리 억제제, 산성화(acidosis), 저체온법(hypothermia), 칼륨 채널 활성제(potassium channel activators)등의 개발이 시도되고 있다.

그러나, NMDA 길항제로 도조사일핀(dozocyilpin) (MK 801), 셀포텔(selfotel), 세레스테이트(cerestat), 덱스트로메톨판(dextrometorfan) 등이개발되었으나, 이 약물들은 저용량으로 투여시, 지각인지의 변화, 불쾌감, 안구진탕증(nystagmus), 저혈압 등을 유발하며, 고용량으로 투여시 흥분, 집착(paranoia), 환각과 같은 정신적인 부작용을 나타낸다. 또한, MPA 길항제로 NBQX가 개발되었으나, 심각한 신장독성의 발현으로 의약품으로서의 실용가능성이 아주 낮다. 따라서, 독성이 없는 뇌보호제의 개발이 시급한 실정이다.

최근의 연구에 의하면, AMPA 수용체의 활성화에 의한 신경세포 손상은 특히, 알츠하이머병과 관련된 전뇌 기저 콜린성 뉴런(basal forebrain cholinergic neurons: BFCNs)에 선택적으로 발생함으로써, AMPA 수용체는 알츠하이머병의 발생에 아주 중요한 역활을 할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이는 즉, AMPA 길항제를 이용하여 알츠하이머병 치료제 개발을 시도할 수 있음을 제시하고 있다[Weiss, J. H., et al., Basal forebrain cholinergic neurons are selectively vulnerable to AMPA/kainate receptor-mediated neurotoxicity. Neuroscience 60, 659-664, 1994].

아교세포는 신경세포의 생존에 결정적인 역활을 하고 있다. 발달과정의 중추신경계에서는 신경세포의 정확한 이동과 증식을 지배하고, 발달후에는 신경세포의 항상성과 시냅스 유연성(synaptic pasticity)을 유지하는데 관여하고 있다. 또한 아교세포는 신경세포의 생존과 사멸에 필수적인 신경세포의 신호전달과정을 개시할 수 있는 수용체와 신경전달 물질들을 함유하고 있다. 따라서 아교세포를 외부의 손상으로부터 보호하는 것은 결국 신경세포의 유연성, 항상성 및 생존과 연관된다 하겠다.

말초 조직에서 인슐린 수용체는 주로 글로코즈 대사에 참여하지만 중추신경계(CNS)에서의 역할은 글로코즈 대사가 아니라 기억과 같은 다른 신경 활동에 관한 것으로 나타났다. 사실, 인슐린 수용체는 뇌의 다른 지역들에서 폭 넓은 작용을 하고 있으며 해마에 다량으로 존재한다. 그러므로, 해마는 뇌에서 인슐린 활동의 중요한 작용부위이다. 최근에, 기억 형성에서 뇌 인슐린 또는 인슐린 수용체의 역할에 관하여 많은 증거가 제시되고 있다. 신경 인슐린 수용체에 대한 실험적인 손상 및 알츠하이머 뇌 모두에서 유사한 대사 이상증이 유발된 것이 알려졌다[Hoyer, S., Muller, D, Plaschke, K. Desensitization of brain insulin receptor. Effect on glucose/energy and related metabolism. J. Neural Transm [Suppl] 44, 259-268, 1994].

산발성 알츠하이머 질환은 뇌 타입의 비인슐린 의존성 당뇨병이 될 수 있다는 흥미로운 가설이 제안되었다(Hoyer, S. Is sporadic Alzheimer disease the brain type of non-insulin dependent diabetes mellitus? A challenging hypothesis. J. Neural Transm. 105, 415-422, 1998). 뇌실(intracerebroventricular) 인슐린은 수동 회피 실험에서 기억을 증진시킨다는 것이 제안되었다[Park, C. P., Seeley, R. J., Craft, S. and Woods S. C. (2000) Intracerebroventricular insulin enhances memory in a passive avoidance task. Physiol. Behav. 68, 509-514]. 알츠하이머형 노인치매(SDAT) 및 산발성 알츠하이머 질병에서 인슐린 수용체 밀도 및 티로신 키나아제 활성은 현저하게 감소되는 것으로 알려져있다[Frolich, L., Blum-degen, D., Bernstein, H. G., Engelsberger,S., Humrich, J., Laufer, S., Muschner, D., Thalheimer, A., Turk, A., Hoyer, S., Zochling, R., Boissl, K. W., Jellinger, K., and Piederer, P. Brain insulin and insulin receptors in aging and sporadic Alzheimer's disease. J. Neural Transm. 105, 423-438, 1998]. 흥미롭게도, 해마 인슐린 수용체의 티로신 인산화는 공간 기억 형성에서 필수적인 역할을 하는 것으로 나타났다[Zhao, W., Chen, H., Xu, H., Moore, E., Meiri, N., Quon, M. J., Alkon, D. L. (1999) Brain insulin receptors and spatial memory. J. Biol. Chem. 274, 34893-34902, 1999]. 요약하면, 인슐린 수용체 활성제는 콜린에스터라제 억제제와 같이 기억 증진용으로 사용될 수 있다.

최근에, 인슐린 수용체의 중요한 하류 신호 매개물질(downstream signaling mediators)인 ERK(Extracellular signal-Regulated Kinase or MAPK) I 및 II는 기억과 학습에 관련되어 있음이 발견되었다[Thiels, E, Klann, E. Extracellular signal-regulated kinase, synaptic plasticity, and memory. Rev. Neurosci. 12, 327-345, 2001; Sweat J. D. The neuronal MAP kinase cascade: a biochemical signal integration system subserving synaptic plasticity and memory. J. Neurochem. 76, 1-10, 2001]. 회피 학습을 받은 쥐들에게서 쥐 해마의 ERK I 및 II의 활성화된 형태가 현저하고 명백하게 증가되는 것이 또한 증명되었다[Cammarota, M., Bevilaqua, L. R. M., Ardenghi, P., Paratcha, G., de Stein, M. L., Izquierdo, I., Medina, J. H. Learning-associated activation of nuclear MAPK, CREB and Elk-1, along with Fos production, in the rat hippocampus after aone-trial avoidance learning: abolition by NMDA receptor blockade. Mol. Brain Res. 76, 36-46, 2000].

요약하면, 인슐린 수용체 및 ERK I 및 II 활성제들은 콜린에스터라아제 억제제와 같이 기억력과 학습 증진용으로 사용될 수 있다.

본 발명은 세신추출물을 포함하는 뇌세포 보호 및 기억력 증진용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 특징은 하기의 도면들을 참고하는 것에 의해 더 명백하게 될 것이다.

도 1은 쥐의 대뇌피질 절편에서 세신추출물(분획 1)의 AMPA에 의한 신경세포 탈분극 억제효과를 나타낸다. 나타낸 값은 평균±표준편차(n=5)이며, 대조군에 대한 유의성은 *: P<0.05 이다.

도 2는 쥐의 대뇌피질 절편에서 세신추출물(분획 4)의 AMPA에 의한 신경세포 탈분극 억제효과를 나타낸다. 나타낸 값은 평균±표준편차(n=5)이며, 대조군에 대한 유의성은 **: P<0.01 이다.

도 3은 분화된 PC12 세포에서 세신추출물(분획 1)의 AMPA에 의한 신경세포 손상에 대한 억제효과를 나타낸다. 나타낸 값은 평균±표준편차(n=5)이며, 대조군에 대한 유의성은 ***: P<0.001 이다.

도 4는 분화된 PC12 세포에서 세신추출물(분획 2, 분획 3, 분획 4 및 분획 5)의 AMPA에 의한 신경세포 손상에 대한 억제효과를 나타낸다. 나타낸 값은 평균±표준편차(n=5)이며, 대조군에 대한 유의성은 ***: P<0.001 이다.

도 5는 C6 아교세포에서 세신추출물(분획 1)의 AMPA에 의한 세포손상에 대한억제효과를 나타낸다. 나타낸 값은 평균±표준편차(n=5)이며, 동일한 글자를 나타내지 않는 것은 던칸 다중 범위 시험(Duncan's multiple range test)에 의하여 P<0.05에서 서로 다름을 나타낸다.

도 6는 C6 아교세포에서 세신추출물(분획 1, 분획 2, 분획 3, 분획 4 및 분획 5)의 ZnCl₂에 의하여 유도된 아교세포 손상에 대한 억제효과를 나타낸다. 나타낸 값은 평균±표준편차(n=5)이며, 대조군에 대한 유의성은 *: P<0.05, ***: P<0.001 이다.

도 7은 NaNO₂시험에서 세신추출물(분획 1)의 기억력 증진 효과를 나타낸다. 나타낸 값은 평균±표준편차(n=8)이며, 대조군에 대한 유의성은 **: P<0.01 이다.

도 8은 NaNO₂시험에서 세신추출물(분획 2, 분획 3, 분획 4 및 분획 5)의 기억력 증진효과를 나타낸다. 나타낸 값은 평균±표준편차(n=8)이며, 대조군에 대한 유의성은 *: P<0.05, **: P<0.01 이다.

도 9는 NaNO₂시험에서 경구투여시 세신추출물(분획 2)의 기억력 증진효과(NaNO₂시험)를 나타낸다. 나타낸 값은 평균±표준편차(n=8)이며, 대조군에 대한 유의성은 *: P<0.05 이다.

도 10은 8방향 방사 미로시험에서 경구투여시 세신추출물(분획 1, 분획 2 및 분획 4)의 기억력 증진효과를 나타낸다. 나타낸 값은 평균±표준편차(n=10)이며, 대조군에 대한 유의성은 *: P<0.05, **: P<0.01 이다.

도 11은 수동 회피 시험에서 기억력 증진을 자극하는 세신추출물(분획 1, 분획 2 및 분획 4)를 나타낸다. 나타낸 값은 평균±표준편차(n=10)이며, 대조군에 대한 유의성은 *: P<0.05 이다.

도 12는 쥐의 해마 단백질에서 티로신 인산화를 자극하는 세신추출물(분획 1, 분획 2 및 분획 4)를 나타낸다.

도 13은 쥐의 해마에서 세신추출물(분획 1, 분획 2 및 분획 4)에 의한 인슐린 수용체의 티로신 인산화를 나타낸다.

도 14는 쥐의 해마에서 ERK Ⅰ및 ERK Ⅱ를 활성화하는 세신추출물(분획 1, 분획 2 및 분획 4)를 나타낸다.

도 15는 쥐의 해마에서 콜린에스터라아제 활성을 억제하는 세신추출물(분획 1, 분획 2 및 분획 4)를 나타낸다.

본 발명의 발명자들은, 각종 스트레스, 음주, 흡연 등 환경적 요인으로 인하여 뇌 손상을 받고 있는 현대인들의 뇌세포 보호와 기억력 증진에 효과가 있는 물질에 대한 오랜 연구 결과, 세신 추출물이 뇌세포 보호작용과 더불어 기억력 증진에 우수한 효과를 나타내는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 뇌세포 보호 및 기억력 증진용 조성물은, 조성물 총중량에 대하여 세신추출물을 0.5~ 50 중량%로 포함하는 것을 특징으로 한다.

세신(Asiasari Radix)은 족두리풀(Asarum sieboldii F. MAEKAWA, Asarum sieboldii var. seoulense Nakai, Asarum sieboldii Miq.), 민족두리풀(Asarum heterotropoides Schmidt, Asarum heterotropoides var. mandshuricum Kitagawa, Asiasarum heterotropoides F. MAEKAWA var. seoulensis F. MAEKAWA)의 건조된 전체 식물, 근경 또는 뿌리이다. 다년생 초본으로 옆으로 뻗어나가는 근경은 비교적 짧고, 마디가 많고 지름이 1mm 내외의 잔뿌리를 달고 있다. 고르지 않게 구부러진 노끈 모양으로서 지름 3~ 5mm인 황갈색의 마디진 근경에 길이 5~ 20cm 내외의 뿌리가 많이 달려 있는데 색깔은 담갈색이고 길고 가늘며 아주 얕은 세로 주름이 있다.

그 추출물은 메틸유게놀(methyleugenol), 아사릴케톤(asaryketone), 시네올(cineol), 사프롤(safrole), 리모넨(limonene), 유카반(eucarvone) 등의 정유; N-이소부틸 2,4,8,10-도데카테트라엔아미드, 펠리토린(pellitorin) 등의 산아미드(acid amide); (-) 아사리닌(asarinin), 세사민 (sesamin) 등의 리그난(Zhou RH, Resource Science of Chinese Medicinal Materials. pp.202-211. Beijing: China medical & Pharmaceutical Sciences press, 1993); 히겐아민(higenamine: 강심성분)을 포함하는 몇몇 알카로이드; 등을 함유하며, 체온 강하, 진경, 항 히스타민작용, 강심작용을 나타내어, 국소마취, 진통, 해열, 진해, 거담 및 이뇨 목적으로 응용되고 있다(Zhu Y, Chinese Materia Medica: Chemistry, Pharmacology and Application, pp66-69. Beijing: People'S Health Publisher, 1998). 그러나, 지금까지 세신추출물이 뇌세포 보호 및 기억력 증진 효과가 있다는 보고는 없었다.

본 발명의 세신추출물은, 세신을 메탄올, 에탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알콜; 아세톤, 클로로포름, 메틸렌 클로라이드, 에테르, 에틸아세테이트 등의 유기용매; 또는 상기 저급알콜과 상기 유기용매의 혼합물을 가하고 5 내지 80℃, 바람직하게는 30 내지 55℃에서 15분 내지 48시간, 바람직하게는 30분 내지 12시간 동안 추출함으로써 제조되는 것을 특징으로 한다. 또한, 얻어진 추출물을 감압건조시켜 분말형태로 만들 수도 있다.

또한, 본 발명의 세신추출물은 다음의 방법으로 더욱 분획할 수 있다(Harborne J.B. Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis. 3rd Edt. pp 6-7, 1998).

본 발명의 세신추출물은 다음의 연속적인 추출 및 분획 공정에 의하여 제조된다.

상기 기재된 방법에 의해 세신으로부터 추출한 추출물을 메탄올:물 혼합용매에 녹이고, 산으로 pH 2~ 4로 조절하여 동량의 클로로포름으로 추출한 후; 클로로포름에 용해되지 않는 분획부를 수산화암모늄으로 pH 9~ 12로 조절하여 동량의 클로로포름:메탄올 혼합용매로 추출하고; 이중 클로로포름:메탄올 혼합용매에 용해되지 않는 분획부를 메탄올로 더 추출하여 분획함으로서 본 발명의 세신추출물을 얻는다.

이때 클로로포름:메탄올 혼합용매의 혼합비는 1:0.1~ 1의 범위로 하는 것이 바람직하다. 상기 클로로포름에 용해되지 않은 분획부 중 클로로포름:메탄올 혼합용매로 추출시 용해된 분획부에는 대부분의 알칼로이드(alkaloids) 들이 함유되어 있으며, 클로로포름:메탄올 혼합용매에 용해되지 않는 분획부에는 4급알칼로이드(quaternary alkaloids) 및 N-0xide들이 함유되어 있다.

본 발명의 세신추출물을 포함하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 세신추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘, 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에 따른 세신추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제제; 외용제; 좌제; 및 멸균 주사제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 세신추출물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 500 mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 세신 추출물 및 분획물의 투여량은 질환의 종류 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 세신추출물을 포함하는 조성물은 상기와 같은 제형으로 뇌세포 보호 및 기억력 증진을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 세신 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이다.

또한, 본 발명은 세신을 메탄올, 에탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알콜 또는 아세톤, 클로로포름, 메틸렌 클로라이드, 에테르, 에틸아세테이트 등의 유기용매의 추출용매로 추출하고, 이로부터 얻어진 세신추출물을 메탄올:물 혼합용매에 녹인 후 산으로 pH 2~4로 조절하고, 동량의 클로로포름으로 더 추출함으로써 얻어진 클로로포름 분획물을 포함하는 기억력 증진용 조성물에 관한 것이다.

이때, 메탄올:물 혼합용매의 혼합비는 1:0.2~ 1.5의 범위인 것이 바람직하며, 이 분획물에는 테르페노이드(terpenoids) 및 페놀성(phenolic) 물질들이 함유된다.

본 발명의 기억력 증진용 조성물은, 상기 분획물을 조성물 총중량에 대하여 0.5~50 중량%로 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 세신추출물을 포함하는 뇌세포 보호 및 기억력 증진용 조성물과 동일하게, 본 발명의 기억력 증진용 조성물은 따른 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있으며, 또한 통상의 방법에 따라 여러 형태로 제형화되어 기억력 증진을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다.

본 발명의 추가적인 변형 및 개선은 이 기술분야의 당업자들에게 자명할 수 있다. 따라서 이하에 기술되고 설명된 부분의 특별한 조합은 단지 본 발명의 어떤 실시형태를 나타내기 위한 것이며, 본 발명의 취지 및 범위 내의 선택적인 발명을 한정하기 위한 것이 아니다.

본 발명은 다음의 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명되나, 본 발명이 이들에 의해 제한되지는 않는다.

실시예 : 세신 추출물 제조

세신 250g을 세절하여 속실렛 장치(Soxhlet apparatus)를 이용하여 70% 메탄올 (750 ㎖)로 3시간 동안 3회 추출하였다. 추출물을 여과한 후, 회전진공농축기(rotary evaporator)를 이용하여 감압 농축하고, 동결건조하였다(분획 1). 동결건조한 메탄올 추출물 10g을 다른 유기용매로 분획하기 위하여, 200 ㎖의 메탄올: 물 (4:1)에 녹인 후 2M 황산으로 pH 3으로 조절하여 동량의 클로로포름으로 3회 추출하였다. 클로로포름층은 회전증발기를 사용하여 갑압농축 및 동결건조하고(분획 2),

수용성이고 클로로포름에 불용성 분획은 수산화암모늄(NH₄OH)으로 pH 10으로 조절한 후 동량의 클로로포름:메탄올 (3:1)로 2회 추출하였다. 클로로포름:메탄올(3:1)에 녹는 층을 감압농축 및 동결건조하였다(분획 3). 수용성이고 CH₃Cl-MeOH(3:1)에 불용성인 분획은 동량의 메탄올로 3회 추출하고, 메탄올에 용해되는 분획(분획 4)과 메탄올에 불용성 분획(분획 5)을 각각 감압농축 및 동결건조하여 시료로 사용하였다.

실험예 1. 그리스 갭 분석시험(Grease Gap recording assay)

1) 실험방법

쥐의 대뇌피질의 "웨지(Wedges)"를 제조하여 두 구획의 브레인 배스(two compartment brain bath)에 장치한 후, 하리선과 시몬드(Harrison and Simmonds)에 의해 기술된대로 시험을 시행하였다(British J. Pharmacol. 84, 381-391, 1985). 쥐 대뇌피질의 "웨지"는 웅성의 위스타(Wistar) 쥐(200g)의 뇌로부터 준비하였다. 쥐의 목을 자르고 뇌를 신속하게 NaCl 122 mM, NaHCO₃25 mM, KCl 3.1 mM, KH₂PO₄0.4 mM, CaCl₂1.3 mM, MgSO₄1.4 mM, D-glucose 10 mM을(pH 7.4) 함유하는 냉각 산화(95% O₂/5% CO₂) 인공 뇌척수 액(artificial cerebrospinal fluid, ACSF)으로 옮겼다. 500~600 μm 두께의 관상 절편(coronal section)을 취하여 실온의 산화된 ACSF에 놓고 면도칼로 반으로 잘랐다. 대뇌피질과 뇌량(corpus callosum)을 포함하는 배측(dorsal) 피질 면의 폭이 약 1.5 mm 이고 앞면(ventral surface)의 폭이 약 1 mm인 조직의 웨지를 형성하였다. 이 웨지를 상온의 ACSF에서 2시간 더 배양하였다.

피질 웨지들을 두 구획의 배스(two compartment bath)에 위치시키고 두 구획들 사이에 높은 저항력을 갖는 밀봉이 형성되도록 위치된 장벽에 고압 실리콘 그리스(high vacuum silicone grease)를 발랐다. 산화된 ACSF를 두 구획을 통하여 각각 1분당 2 ㎖의 속도로 적어도 1 시간 동안 관류시켰다. 세신추출물 10 ㎍/ml(분획 1, 2, 3 및 4)을 AMPA(40 μM)를 2분 동안 적용하기 전에 10분 동안 피질구획에 관류시켜 적용하였다. 두 구획사이의 d.c.전위를 Ag/AgCl 전극을 통하여 측정하고,이를 증폭한 후 맥랩 스프트웨어(McLab software)로 분석하였다.

2) 실험결과

AMPA에 의한 신경세포의 탈분극(depolarization)은 신경세포의 손상에 의한 자극의 척도로 간주되어지고 있다. 실험결과, 도 1A에서 나타난 바와 같이, AMPA 40 μM을 2분 동안 처리한 경우 0.79 mV의 탈분극이 증가되는 반면, 세신추출물(분획 1)(10 ㎍/㎖)을 전처리하고 AMPA를 2분 동안 처리한 경우, AMPA에 의하여 유발된 탈분극 정도가 현저히 줄어들었음을 알 수 있다(도 1). 또한, 도 1B에서 나타난 바와 같이, 세신추출물의 분획 1에 의한 평균 억제효과는 대조군에 비하여 약 54% 정도였다. 따라서, 세신추출물 분획 1은 AMPA에 의한 신경손상을 보호하는 효과가 현저함을 알 수 있다.

특히, 세신의 메탄올 추출 분획들(분획 2, 3 및 4)에 대한 실험에 있어서, 분획 2와 분획 3은 AMPA에 의한 탈분극에 큰 영향을 미치지 않았으나, 도 2에 나타난 바와 같이, 분획 4는 AMPA에 의하여 유발된 신경 손상에 대하여 92% 정도의 현저한 억제효과를 유발하여 세신 추출물 분획들 중 가장 강력한 신경손상보호 효과를 유발하였다.

분획 4는 클로로포름 및 클로로포름:메탄올에 녹지 않는 성분들을 함유하고 있으므로, 클로로포름과 같은 유기용매에 녹는 특성을 가지는 테르페노이드(terpenoids), 페놀성(phenolic) 물질 및 세사민(sesamin)과 같은 성분들을 제외한, 세신추출물 중의 기타 다른 성분들에 의하여 신경보호작용이 유발됨을 알 수 있다.

실험예 2. 세포 생존율 시험 (MTT assay)

1) 실험방법

MTT 시험은 미토콘드리아 산화를 비색계로 측정하는 방법으로 미토콘드리아 산화환원전위나 세포 생존을 알아보는데 주로 이용된다.(Mosmann et al., 1983)

PC 12 세포들과 C6 아교세포들을 37℃, 5%의 가습된 CO₂분위기에서 10%의 소태아혈청으로 DMEM 배지에서 배양하였다. PC 12 세포들을 신경 성장 인자(NGF)(100 ng/ml)의 첨가에 의하여 신경세포로 분화를 유도하였다. 신선한 NGF를 48 시간 마다 첨가하고, NGF를 7일 동안 처리한 후에 실험을 수행하였다.

세포들을 1×10⁵세포/웰의 밀도로 96 웰플레이트에 분양하였다. 세포들을 AMPA(40 μM)로 미리 배양하고 세신 추출물 분획들(10 ㎍/ml)을 24 시간 동안 가하였다. MTT 시약(Sigma, USA)을 PBS (phosphate buffered saline)에 녹여 여과하였다. 그 세포들을 MTT(최종 0.5 ㎎/㎖의 농도)로 처리하고, 37 ℃에서 3시간 배양하였다. 활동하는 미토콘드리아를 함유하는 세포들은 테트라졸리움 고리(tetrazolium ring)를 분해하여 짙은 청색의 포르마잔(formazan)을 형성한다. 그 배지를 제거하고 그 세포들을 100 ㎕ DMSO와 10 ㎕ 소렌손 글리신 완충액(Sorenson glycine buffer, 0.1M glycine, 0.1M NaCl, pH 10.5)의 존재하에 용해하였다. 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군의 흡광도에 대한 실험군의 흡광정도를 %세포 생존율로 나타내었다.

2) 실험결과

실험결과 도 3에서와 같이, NGF 처리로 신경세포로 분화를 유도시킨 PC 12 세포에 AMPA (40 μM)을 투여할 경우 대조군에 비하여 거의 50% 정도의 세포가 죽게되는 반면, 세신추출물(분획 1; 10 μg/㎖)을 전처리 할 경우 세포의 생존율을 90% 이상으로 회복시키고 있다. 또한, 도 4에서와 같이 실시예 1에서의 분획 2, 분획 3, 분획 4, 분획 5를 시험한 결과, 분획 4가 분화된 PC 12 세포들에서 거의 대조군 수준으로 AMPA에의한 신경세포 손상을 억제하였다.

반면, 도 5에서와 같이 아교세포인 C6 아교세포(C6 glial cell)의 경우, AMPA (40 μM)을 처리하면 대조군과 비교하여 약 35%의 세포가 죽게되는 반면, 세신 추출물(분획 1)을 전처리할 경우 세포의 생존율이 약 10% 회복되고 있다. 위의 세신추출물 분회들은 AMPA에 의해 유도된 아교세포 손상에 대하여 상대적으로 약한 보호효과를 가지고 있기 때문에 ZnCl₂(100 μM)을 처리하여 C6 아교세포에 산화적인 손상을 유도하였다. 분획 1, 분획 2, 분획 3, 분획 4 및 분획 5를 전처리하여 시험한 결과, 도 6에서와 같이 분획 1은 ZnCl₂에 의한 산화적 손상을 100% 방어하여 대조군의 상태와 유사하게 세포의 생존율을 유지시켜 주었으며, 분획 4는 ZnCl₂에 의한 산화적 손상을 58% 방어하였다.

실험예 3. 기억 시험 (NaNO ₂ assay)

1. NaNO ₂ 기억 시험

NaNO₂에 의한 뇌의 산화적대사 결핍과 기억 및 학습과 관련있는 콜린성 신경전도는 서로 밀접한 관련이 있다고 알려져 있다[Schindler등, Drug Develop. Res. 4: 567-576, 1984]. 따라서, 약물 처리후 NaNO₂에의한 사망유발 시간의 지연이 나타난다면 그것은 그 약물의 기억력 증가효과를 나타내는 척도의 하나로 간주될 수 있다.

1) 실험방법

웅성 마우스에 세신추출물(분획 1; 100 mg/kg, i.p.)로 투여하고, 60분 후에 NaNO₂를 250 mg/kg, s.c.로 주사하고 호흡이 정지할 때까지의 시간을 측정하였다.

대조군과 실험군의 생존시간 연장을 측정하고 비교하여 기억향상효과를 평가하였다.

또한, 메탄올 추출물(분획1)을 다른 유기용매를 이용하여 더 분획하여 제조한 분획 2, 분획 3, 분획 4, 분획 5를 100 mg/kg, i.p.로 마우스에 투여하고, 상기한 방법의 NaNO₂기억시험을 시행하였다.

2) 실험결과

실험결과 도 7에서 나타난 바와같이, NaNO₂에 의한 뇌대사 장애로 인한 사망유도 시간에 비하여, 세신추출물(분획 1) (100 mg/kg, i.p.)을 전처리한 경우 25%의 생존시간의 증가를 유발하므로써 세신에 의한 기억력 증가효과를 나타내었다.

또한, 분획 2, 3, 4 및 5를 실험한 결과, 도 8에서 나타난 바와 같이, 분획 4는 최초의 메탄올 추출물인 분획 1과 동일한 기억력 증진효과(25% 증가)를 보였으며, 분획 2는 가장 강력한 기억력 증진효과(50% 증가)를 나타내었다. 더욱이, 상기 분획들이 경구투여로 효과가 있는지를 실험하기 위하여, 분획 2를 10 mg/kg용량으로 경구로 투여하고, 60분 후 NaNO₂를 투여하고 호흡이 멈추어 질 때 까지의 시간을 측정한 결과, 대조군에 비하여 50%의 기억력 증진효과를 유발하였다(도 9).

2. 8방향 방사 미로(8 arm radial maze) 기억시험

NaNO₂기억시험에서 현저한 기억력 증진효과를 보인 분획 1, 분획 2 및 분획 4를 이용하여, 직접적인 기억력 증진 효과유무를 밝히기 위하여 8방향 방사 미로(8 arm radial maze) 기억시험을 시행하였다[Ikonen S, Riekkinen Jr. P, Effects of apamin on memory processing of hippocampal-lesioned mice. European Journal of Pharmacol. 382, 151-156, 1999).

1) 실험방법

중앙부위는 직경 20cm이며, 길이 25cm, 높이 15cm, 폭 6cm의 arm 8개로 구성된 미로를 사용하였다. 시험을 시작하기 전 2일간 매일 5분씩 먹이가 놓여진 방사 arm 미로에서 마우스를 연습시켰다. 시험기간 중에는 세미랜덤(semi-random) 방식으로 8개의 arm 중 4개에만 먹이를 두었으며, 각 마우스마다 다른 조합으로 먹이가 놓여진 arm을 4개씩 지정하였다. 각각 arm으로부터 중앙에 돌아온 후에 문을 5초동안 닫았다. 시험은 4개의 먹이 모두가 먹히거나 15분까지만 측정하였다. 시험은 기억 기능의 두 매개변수를 포함하였다:

1) 참조기억오류(reference memory error)는 먹이를 두지 않은 arm을 가는 경우로 정의하며,

2) 실행기억오류(working memory error)는 전에 들렸던 arm을 다시 가는 경우를 정의하였다(Gamoh et al., Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 28, 266-270, 2001).

분획 1, 2 및 4 를 각각 매일 1회씩 10 mg/kg을 5일간 경구투여 한 후, 기억시험을 실시하였다.

2) 실험결과

도 10에서 보는 바와 같이, 참조기억오류는 분획 1, 분획 2 및 분획 4를 투여한 경우 대조군에 비하여 각각 38%, 50% 및 50% 감소되었으며, 실행기억오류는 분획 1, 분획 2 및 분획 4를 투여한 경우 대조군에 비하여 각각 48%, 63% 및 74% 감소하였다. 그리고 먹이를 모두 먹는데 걸리는 시간을 측정한 결과, 분획 1, 분획2 및 분획 4를 투여한 경우 대조군에 비하여 각각 55%, 61% 및 58% 감소시켰다.

3. 수동 회피 시험(Passive Avoidance Test)

1) 실험방법

이 실험을 기본적으로 Jarvik 및 Kopp에 기술된 단계 통과 방법에 따라 수행하였다[Jarvik, M. E. and Kopp, R. An improved one-trial passive avoidance learning situation. Psychol. Rep. 21, 221-224, 1967]. 제미니 회피 시스템(SD Instruments)를 실험을 위해 사용하였다. 이 장치는 자동 길러틴 도어(guillotine door)에 의하여 어두운 구획으로 연결된 밝은 구획을 가지는 두 구획의 아크릴 박스로 이루어진다. 쥐들을 300초 동안 밝은 박스에 두었다가 이어서, 길러틴 도어를 열었다. 쥐들은, 어두운 구획으로 들어가자 마자, 고통을 주는 전기적 쇼크(0.3 mA, 1 초)를 받았다. 어두운 구획으로 들어가기 위한 대기 시간을 훈련 시험 및 24 시간 후의 기억 시험에서 측정하였다. 기억 시험에서 허용된 최대 진입 대기 시간은 500 초 였다.

2) 실험결과

훈련 기간에서 세신추출물의 분획들 사이에 중대한 차이가 없었다. 그러나, 기억 기간에서 분획 1, 분획 2 또는 분획 4의 투여는 대조군과 비교하여 각각 8.1 배, 2.2 배, 2.7 배의 단계 통과시간의 증가를 유발하였다(도 11).

실험예 4. 해마 단백질(hippocampal proteins)의 티로신 인산화

1) 실험방법

1. 해마 용해질의 제조

웅성 스프라그 도레이(Sprague Dawley) 쥐들의 목을 자르고 해마를 4℃ 상태로 분리하였다. 해마 균질화는 이전에 기술된 것을 약간 변형하여 준비하였다[Zhao, W., Chen, H., Xu, H., Moore, E., Meiri, N., Quon, M. J.,Alkon, D. L., Insulin receptors and spatial memory. J. Biol. Chem. 274, 34893-34902, 1999]. 분리된 해마를 50 mM 트리스 HCl, pH 7.4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl, 1% 트리톤 X-100, 0.5 mM PMSF, 1 mM Na₃VO₄, 로펩틴(leupeptin) 및 아프로티닌 1㎍/ml를 함유하는 완충액 A로 다시 현탁시키고 포터-엘베젬(Potter-Elvehjem) 균질화기를 사용하여 균질화 하였다. 그 용해질을 10,000 ×g로 10분 동안 회전시키고 상등액을 단백질 분석하고 70℃에서 보관하였다.

2. 면역침전(Immunoprecipitation)

면역침전을 이전에 기술된 것 처럼 수행하였다[Kim S. J., Kahn, C. R. Insulin stimulates phosphorylation of c-Jun, c-Fos and Fos-related proteins in cultured adipocytes. J. Biol. Chem. 269, 11887-11892, 1994].

해마 용해질로부터 동량의 단백질을 4℃에서 1시간동안 인슐린 수용체 항체로 배양하고 단백질 A-세팔로스를 첨가하고 그 면역 복합체를 원심분리기로 침전시켰다. 그 펠렛들을 연속적으로 완충액 A(0.01M 트리스, pH 7.4, 1M NaCl, 1% Nonidet P-40), 완충액 B (0.01M 트리스, pH 7.4, 0.1M NaCl, 0.01M EDTA, 1% Nonidet P-40, 0.3% SDS) 및 완충액 C (0.01M 트리스, pH 7.4 및 1% Nonidet P-40) 1 ml로 세척하였다. 마지막 펠렛들을 디티오트레이톨 100 mM을 함유하는 레밀리(Laemmli) 완충액으로 가용화하고, 5분 동안 끓이고, 마이크로원심분리기로 원심분리하여, 그 상등액을 항-pTyr 항체로 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏(Western blot) 분석을 하였다.

3. 웨스턴 블랏 분석(Western blot analysis)

해마 단백질의 동일한 양을 SDS 폴리아크릴아마이드겔에 적용하였다. 겔로부터 니트로셀룰로오스 페이퍼(Schleicher & Schuell)로의 전기이동을 토빈 등에 의하여 기술된 것 처럼 100 V(정전압)로 1시간 동안 수행하였다[Towbin H., Staehelin, J., Gordon, J. Electric transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Aci. USA 76, 4350-4354, 1979]. 그 필터 페이퍼들을 0.1% 트윈 20 및 3% 소혈청알부민을 함유하는 PBS로 23℃에서 1시간 동안 미리 배양하고 0.1% 트윈 20을 함유하는 PBS로 각각 10분 동안 3회 세척하였다. 그 블랏(blot)을 pTyr 항체를 사용하여 23℃에서 1시간 동안 탐침으로 조사하였다. 그리고 나서 블랏을 HRP 접합 항 토끼 IgG로 30분 동안 배양하고 트윈 20을 함유하는 PBS로 각각 10분 동안 5회 세척하였다. 고정된 특정한 항원의 검출을 ECL(NEN)로 수행하였다.

3) 실험 결과

해마에서 인슐린 수용체의 티로신 인산화는 공간 기억에서 중요한 역할을 하는 것으로 제안되었기 때문에, 본 발명자들은 세신추출물이 해마 단백질의 티로신 인산화에 어떠한 영향을 미치는지를 시험하였다. ~180 kDa, 130 kDa, 95 kDa, 55 kDa 및 42 kDa의 분자 크기를 갖는 많은 단백질들의 티로신 인산화(도 12). 우리는 더나아가서 인슐린 수용체가 세신추출물에 의해서 티로신 인산화되었는지를 시험하였다. 인슐린 수용체 인산화는 기본적인 조건하에서는 검출되지 않았지만 분획 1및 분획 2에 의하여 현저하게 자극되었다: 분획 1의 영향은 분획 2의 영향 보다 컸다(도 13). 또한, 세신추출물의 분획 1, 2 및 4는 ERK Ｉ(44 kDa) 및 ERK Ⅱ(42 kDa)를 현저하게 자극하였다(도 14).

이들 결과는 인슐린 수용체 및 ERK Ｉ 및 Ⅱ의 활성화는 기억력과 학습에 필수적이기 때문에 세신추출물의 분획들이 기억력과 학습의 증진에 중요한 역할을 하는 것을 제안한다.

실험예 5. 생체 밖의 콜린에스터라아제 분석(Ex vivo Cholinesterase assay)

1) 실험방법

웅성 SD 쥐들에게 기제(Vehicle) 또는 세신추출물 분획들을 경구투여 하였다. 쥐들은 90분 후에 목을 절단하고, 뇌를 신속하게 적출하고, 해마와 선조체(corpora striata)를 자유롭게 절단하고, 상기에 기재된 것처럼 무게를 측정하고 균질화하였다. 콜린에스터라아제 활성을 엘먼 등에 의하여 기술된 대로 측정하였다[Ellman, G. L., Courtney, K. D., Andres, V., Featherstone, R. M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem. Pharmacol. 7, 88-95.1961]. 간단하게, 완충액 Ⅰ(100 mM 인산, pH 8.0) 3 ml, 75 mM의 아세틸티오콜린 요오드 0.2 ml 및 완충된 엘먼 시약(DTNB 10 mM, NaHCO₃15 mM) 0.1 ml를 혼합하고 25℃에서 10분 동안 배양하였다. 이어서, 20 ㎕의 효소 샘플을 첨가하고 흡광도을 30초 간격으로 측정하였다. 퍼센트 억제율을 기제대조군의 효소 활성과 비교하여 계산하였다.

2) 실험결과

콜린에스터라제 억제가 인지 기능을 향상시키는 것을 나타냄을 고려하여, 본 발명자들은 세신추출물이 해마 콜린에스터라제 활성에 대하여 어떤 억제 효과를 가질수 있는지를 시험하였다. 세신추출물 분획 1, 2 또는 4의 투여는 대조군과 비교하여 각각 39%, 24% 및 12%의 해마 콜린에스터라제 활성의 억제를 유발하였다(도 15).

실험예 6. 세신추출물의 경구독성시험

1) 실험방법

20 g 정도의 ICR 마우스 25마리를 온도 23 ℃, 상대습도 50%, 조도 150~300룩스(Lux)의 동물실에서 명암 주기를 12 시간으로하고 표준 보증 설치류 음식 및 수돗물에 접근이 자유로운 상태에서 1주일간 사육한 후 각 5마리씩 5군으로 나누어 실험하였다.

실시예에서 얻은 세신 추출물(분획 1)을 0.1 % 트윈(Tween) 80에 녹인 후, 5 그룹의 마우스에 각각 100, 1000, 3000, 5000 및 10000 mg/kg의 용량으로 경구 투여하였다. 투여 후 7일간 일반 증상의 변화 및 사망 동물의 유무를 관찰 하였다. 그리고 투여 7일째 마우스를 치사시켜 해부하고 내부 장기를 검사하였다.

2) 실험결과

세신 추출물 투여로 인하여 일반증상 및 내부장기의 외형에서 이상 소견은관찰되지 않았으며, 세신 추출물(분획 1)의 LD₅₀값은 3,400 mg/kg으로 나타났다.

제제예 1. 정제

하기의 조성에 따라, 통상의 정제 제조방법으로 각각 제제화하였다.

1-1. 정제 조성물

세신의 메탄올 추출물 500.0 mg

유당 500.0 mg

탈크 5.0 mg

마그네슘 스테아레이트 1.0 mg

1-2. 정제 조성물

세신의 메탄올 추출물의 클로로포름 분획 50.0 mg

유당 50.0 mg

탈크 0.5 mg

마그네슘 스테아레이트 0.1 mg

1-3. 정제 조성물

세신의 메탄올 추출물의 메탄올 분획 50.0 mg

유당 50.0 mg

탈크 0.5 mg

마그네슘 스테아레이트 0.1 mg

제제예 2. 캡슐제

하기의 조성에 따라, 다음과 같은 방법으로 캡슐제를 제조하였다.

세신추출물을 체질하여 부형제와 혼합한 후, 젤라틴 캡슐중에 충전하여 캡슐을 제조하였다.

2-1. 캡슐제 조성물

세신의 메탄올 추출물 500.0 ㎎

전분 1500 10.0 ㎎

스테아르산마그네슘 BP 100.0 ㎎

2-2. 캡슐제 조성물

세신의 메탄올 추출물의 클로로포름 분획 50.0 ㎎

전분 1500 1.0 ㎎

스테아르산마그네슘 BP 10.0 ㎎

2-3. 캡슐제 조성물

세신의 메탄올 추출물의 메탄올 분획 50.0 ㎎

전분 1500 1.0 ㎎

스테아르산마그네슘 BP 10.0 ㎎

제제예 3. 시럽제

하기의 조성에 따라, 다음과 같은 방법으로 시럽제를 제조하였다.

먼저 정제수에 백당을 용해시켰다. 파라옥시벤조에이트, 파라옥시프로필벤조에이트 및 세신추출물을 가하여 60℃에서 용해시킨 후 냉각하고, 정제수를 가하여 150 ㎖로 만들었다.

3-1. 시럽제 조성물

세신의 메탄올 추출물 5.0 g

백당 95.1 g

파라옥시벤조에이트 80.0 ㎎

파라옥시프로필벤조에이트 16.0 ㎎

정제수 to 150 ㎖

3-2. 시럽제 조성물

세신의 메탄올 추출물의 클로로포름 분획 50.0 g

백당 95.1 g

파라옥시벤조에이트 80.0 ㎎

파라옥시프로필벤조에이트 16.0 ㎎

정제수 to 150 ㎖

3-3. 시럽제 조성물

세신의 메탄올 추출물의 메탄올 분획 50.0 g

백당 95.1 g

파라옥시벤조에이트 80.0 ㎎

파라옥시프로필벤조에이트 16.0 ㎎

정제수 to 150 ㎖

제제예 4. 액제

하기의 성분을 통상의 액제 제제방법으로 제제화하고, 갈색병에 충전하여 액제를 제조하였다.

4-1. 액제 조성물

세신의 메탄올 추출물 500.0 mg

이성화당 20.0 g

산화방제제 5.0 mg

메틸 파라벤조산 2.0 mg

정제수 to 100.0 ㎖

4-2. 액제 조성물

세신의 메탄올 추출물의 클로로포름 분획 500.0 mg

이성화당 20.0 g

산화방지제 5.0 mg

메틸 파라벤조산 2.0 mg

정제수 to 100.0 ㎖

4-3. 액제 조성물

세신의 메탄올 추출물의 메탄올 분획 500.0 mg

이성화당 20.0 g

산화방지제 5.0 mg

메틸 파라벤조산 2.0 mg

정제수 to 100.0 ㎖

제제예 5. 산제

하기의 성분을 통상의 산제의 제조방법으로 혼합하고, 봉지에 넣어 밀봉한 후 산제를 제조하였다.

5-1. 산제 조성물

세신의 메탄올 추출물 50.0 mg

유당 100.0 mg

탈크 5.0 mg

5-2. 산제 조성물

세신의 메탄올 추출물의 클로로포름 분획 50.0 mg

유당 100.0 mg

탈크 5.0 mg

5-3. 산제 조성물

세신의 메탄올 추출물의 메탄올 분획 50.0 mg

유당 100.0 mg

탈크 5.0 mg

제제예 6. 주사제

하기의 성분을 통상의 주사제의 제조방법으로 2.0 ㎖의 용량의 앰플에 충전하고, 멸균시켜 주사제를 제조하였다.

6-1. 주사제 조성물

세신의 메탄올 추출물 50.0 mg

산화방제제 1.0 mg

트윈 80 1.0 mg

주사용 증류수 to 2.0 ㎖

6-2. 주사제 조성물

세신의 메탄올 추출물의 클로로포름 분획 50.0 mg

산화방제제 1.0 mg

트윈 80 1.0 mg

주사용 증류수 to 2.0 ㎖

6-3. 주사제 조성물

세신의 메탄올 추출물의 메탄올 분획 50.0 mg

산화방제제 1.0 mg

트윈 80 1.0 mg

주사용 증류수 to 2.0 ㎖

세신 추출물을 포함하는 조성물은, 세신추출물의 뇌세포 보호기능으로 인해 뇌세포 손상으로 발생되는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료 효과 뿐 아니라, 기억력 향상 유발 효과를 나타내며, 기억력 향상용 뿐만아니라, 각종 스트레스, 음주, 흡연 등으로 인하여 뇌 손상을 받고 있는 현대인들의 뇌세포 보호를 통하여, 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 제제 또는 건강 식품으로 사용될 수 있다.

Claims

세신추출물을 포함하는 뇌세포 보호 및 기억력 증진용 조성물.
제 1항에 있어서, 세신추출물의 함량이 전체 조성물에 대하여 0.5~ 50 중량%인 조성물.
제 1항에 있어서, 세신추출물이 탄소수 1 내지 4의 저급알콜로 추출된 것인 조성물.
제 3항에 있어서, 저급알콜이 메탄올, 에탄올, 아세톤, 클로로포름, 메틸렌 클로라이드, 에테르, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제 1항에 있어서, 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함하는 조성물.
제 1항에 있어서, 경구제제로 제형화된 조성물.
제 6항에 있어서, 경구제제가 산제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 시럽 및 에어로졸인 조성물
제 1항에 있어서, 좌제로 제형화된 조성물.
제 1항에 있어서, 외용제로 제형화된 조성물.
제 1항에 있어서, 멸균 주사제로 제형화된 조성물.
제 1항에 있어서, 세신추출물이 다음의 연속적인 분획절차에 의하여 얻어지는 조성물:

세신추출물이 제 3항에 따른 방법으로 얻어진 세신추출물을 메탄올:물 혼합용매에 녹이고, 산으로 pH 2~4로 조절하여 동량의 클로로포름으로 추출하고;

클로로포름에 용해되지 않는 분획을 수산화암모늄으로 pH 9~12로 조절하여 동량의 클로로포름:메탄올 혼합용매로 추출하고;

이 중 클로로포름:메탄올 혼합용매에 용해되지 않는 분획을 메탄올로 더 추출, 분획함으로써 메탄올에 용해되는 세신추출물을 얻는다.
다음의 연속적인 분획 절차에 의하여 얻어지는 세신추출물의 클로로포름 분획을 함유하는 기억력 증진용 조성물:

세신을 메탄올, 에탄올 같은 탄소수 1 내지 4의 저급알콜 또는 아세톤, 클로로포름, 메틸렌 클로라이드, 에테르, 에틸아세테이트 같은 유기용매로 추출하고;

이로부터 얻어진 세신추출물을 메탄올:물 혼합용매에 녹인 후 산으로 pH 2~4로 조절하고, 동량의 클로로포름으로 더 추출하여 세신추출물의 클로로포름 분획을 얻는다.
제 12항에 있어서, 분획의 함량이 조성물 총중량에 대하여 0.5~ 50 중량%인 기억력 증진용 조성물.
제 12항에 있어서, 담체, 부형제 및 희석제를 더 함유하는 기억력 증진용 조성물.
제 12항에 있어서, 산제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 시럽, 에어로졸을 포함하는 경구제제, 외용제, 좌제 및 멸균 주사제로 제형화되는 것인 기억력 증진용 조성물.
제 1항의 조성물을 포함하는 식품.
제 1항의 조성물을 포함하는 음료.
제 12항의 조성물을 포함하는 식품.
제 12항의 조성물을 포함하는 음료.