KR20040005434A - 신경세포 보호 활성을 갖는 오디의 조추출물을 함유한조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신경세포보호 활성을 갖는 오디 (Morus albaL.)의 추출물을 유효성분으로 하는 약학 조성물 및 건강 보조 식품을 제공하는 것으로, 본 발명의 오디 추출물이 신경세포 보호 및 허혈성 뇌졸중 등 신경계 질환을 유의성 있게 억제시키는 작용효과를 가짐으로써 허혈성 뇌졸중 등의 신경계 질환의 예방 및 치료제로서 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 신경세포 보호 활성을 갖는 생약 조추출물을 함유한 허혈성 뇌졸중 치료 조성물에 관한 것이다.
뇌졸중은 크게 2가지로 나누는데, 뇌조직으로 가는 혈액 공급의 감소 혹은 차단으로 뇌조직의 허혈상태로 발생하는 허혈성 뇌졸중 (ischemic stroke)과 혈관이 터져 뇌조직으로 출혈을 일으키는 출혈성 뇌졸중 (hemorrhagic stroke)으로 구분하고 있으며, 허혈성 뇌졸중이 전체 뇌졸중 환자의 약 80% 정도를 차지하므로 허혈성 뇌졸중이 심각한 질환이라고 할 수 있다.
뇌졸중으로 발생하는 뇌신경세포의 손상의 원인은 과도한 흥분성 신경 전달 물질의 유리, 자유 라디칼(free radical)의 생성, 단백질 합성의 저해, 유전자 발현 이상 및 면역반응의 활성화 등으로 설명될 수 있으며, 또한 최근 신경계가 비면역성 기관(immune privileged organ)이라는 기존의 학설과는 달리, 다발성 경화증(multiple sclerosis), 외상(trauma), 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease), 뇌허혈 및 각종 뇌손상 등의 신경 질환의 원인으로 중추신경계 내에서의 염증반응을 신경퇴행을 야기하는 주요 원인 중의 하나로 보고하고 있다. 이런 뇌신경세포 손상기전의 복잡성 등으로 아직까지 뇌졸중으로 발생하는 뇌신경세포의 손상을 보호해 줄 수 있는 치료제가 개발되어 있지 못한 실정이다. 따라서 뇌허혈로 인한 신경계의 손상을 보호할 수 있는 물질의 개발은 작용 목표가 다양할 수밖에 없고, 그 평가 방법 또한 시험관내 시험(in vitro test)에서 생체내 시험(in vivo test)까지 다양하게 연구되고 있으나, 생약이 가지는 특수성 등으로 인하여 시험관 내에서는 효과가 있었으나 생체 내에서 효과가 없는 경우가 매우 많은 실정이다.
이러한 이유로 인해, 천연물을 이용한 뇌허혈과 같은 뇌손상 보호 작용을 가지는 물질의 개발은 반드시 시험관내 시험 및 생체내 시험이 동시에 진행되어야 할것이다.
중추신경계 내에서 신경퇴행을 야기하는 주요 원인중의 하나로 염증반응이 보고되고 있어, 뇌허혈 후의 염증 반응은 새로운 뇌허혈 치료제의 목표가 될 것으로 보이며, 이러한 치료제는 세포 독성 물질들의 유리에 관여하는 효소들을 억제하거나, 호중구(neutrophil)의 침착을 억제하는 약물들로 구성될 것으로 사료된다.
또한, 뇌조직으로 침투된 호중구(neutrophil)에서 산화 질소(NO)를 유리할 수 있는 iNOS(inducible nitric oxide synthase)가 유도되며, 유도된 iNOS로부터 NO가 유리되어 뇌세포 손상을 초래한다고 알려져 있으며, 글루타메이트에 의한 NMDA 수용체의 활성화에 의한 신경독성 또한 NO를 경유한 것이라고 보고되어 있어 iNOS 발현 억제 등과 관련된 뇌신경 보호제의 개발이 기대되고 있다.
아울러 뇌허혈에서 시클로옥시게나아제-2 (COX-2)의 억제는 PGE2의 생성 억제 및 이로 인한 글루타메이트의 유리억제로 뇌신경세포 보호작용을 가진다고 보고되고 있고, 관절염이나 통증을 호소하는 많은 사람들이 이미 COX-2 억제제들을 복용하고 있기 때문에 이러한 환자들에 있어서 뇌졸중 발병률 등의 역학적 조사가 이루어진다면 향후 뇌졸중의 예방 및 치료제의 개발에 새로운 목표가 될 수 있을 것으로 보고되고 있어 관심을 모으고 있다(Iadecola, C. et al.;P.N.A.S.,30,pp1294-1299, 2001).
한편, 오디 (桑子)는 뽕나무과 (Moraceae)에 속하는 뽕나무 (Morus albaL)및 동속 근연식물의 성숙한 열매로서 한방에서 상심, 상실, 오심, 흑심 등으로 지칭된다.
오디는 취화과 (聚花果)로 작은 수과 (瘦果)가 많이 모여 이루어진 장원형으로 길이 1 내지 2 ㎝, 지름 0.5 내지 0.8 ㎝이며 황갈색, 갈홍색 또는 암자색을 띠고 짧은 줄기가 있다. 작은 수과 (瘦果)는 난원형으로 조금 납작한 편이며, 길이는 약 2 ㎜, 너비는 약 1 ㎜ 이고 육질의 화편 (花片) 4개가 둘러싸고 있다. 주치 (主治)는 보혈자음 (補血滋陰), 생진윤조 (生津潤燥), 현훈이명 (眩暈耳鳴), 심계실면 (心悸失眠), 수발조백 (鬚髮早白) 등을 치료하는 효능을 가진다고 알려져 있다 (강경수 외,본초학, 영림출판사, 서울, 1999, 오디항 참조).
한편, 육 등에 의하면 오디는 이명, 소갈 등이 있을 때, 계혈등 (鷄血藤), 흑두의 (黑豆衣) 등이 배합된 상심탕을 복용하도록 하고 있다(육창수 외,한약의 약리, 성분, 임상응용, 계축문화사, 1998, 상심 항 참조).
현재 뽕나무 유래 산물 중 생리활성에 대한 연구는 주로 상백피로부터 추출되는 당단백물인 모란 A (moran A)가 분리되었으며 혈당강하 물질로 보고되었다 (Hikino et al.;Planta Medica, 51,pp159-160). 또한, 아사노(Asano) 등은 뽕잎으로부터 질소 함유 단당류 물질을 분리하여 이들의 글루코시다제의 활성 억제도를 검색하여 보고한 바 있다(Asano et al.;Carbohydrates Research, 259,pp243-256). 이와 비교할 때 상삼자의 생리활성에 대한 연구는 매우 미흡한 실정이다. 현대 의학적 연구 결과는 오디의 혈당강하 작용에 대한 보고가 있을 뿐이다(Kim et al.;J. seri. sci.,38(2), 1996). 또한 일부 연구자들에 의하여 오디의 주요 성분이 시아니딘 3-O-β-글루코피라노즈 계열의 화합물임이 보고되고 있는데 최근이러한 시아니딘 계열의 화합물이 퇴행성 뇌질환에 대한 방어 효과가 보고되고 있다.
그러나 상기 문헌 어디에도 오디가 허혈성 뇌졸중 등의 신경계 질환에 사용된다는 교시나 개시된 바 없다.
현재 허혈성 뇌졸중 등의 신경계 질환의 발생 초기에 효과가 있는 서양 약물들이 아직 개발되어 있지 않으므로, 본 발명에서는 허혈성 뇌졸중과 같은 중추신경계질환에 대한 오디의 치료 효과와 치료 기전을 약리학적으로 관찰하여, 허혈성 뇌졸중의 치료에 가능성이 있는지를 중점적으로 연구하였다.
연구 결과, 본 발명에 따른 오디의 추출물이 신경세포 보호 효과 및 허혈성 뇌졸중 등 신경계 질환의 치료 효과가 있다는 사실을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 신경세포 보호 효과 및 허혈성 뇌졸중 등 신경계 질환의 예방 및 치료 효과를 나타내는 약학조성물 및 건강보조식품을 제공한다.
도 1 은 오디 물 추출물을 용량별로 중뇌대동맥폐색모델(MCAo)에 투여시, 뇌조직의 손상부피를 비교한 도이고,
도 2 는 스프라그-도올리 래트의 뇌절편에서의 오디추출물에 의한 ATP 함량 증가효과를 나타낸 도이며,
도 3 는 오디추출물을 농도별로 BV-2세포에 처리했을 때, 리포폴리사카라이드로 유도한 산화질소(NO)에 대한 생성 억제 효과를 나타낸 도이다.
상기 목적에 따라, 본 발명은 오디의 조추출물을 포함하는 신경세포 보호 및 허혈성 뇌졸중 등 신경계 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 조추출물은 극성 용매, 즉 물, 메탄올, 에탄올 등의 저급 알코올 및이들의 혼합용매로 추출된 추출물을 의미한다.
본 발명의 신경세포 보호 및 허혈성 뇌졸중 등 신경계 질환 예방 및 치료용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.5 내지 50 중량%로 포함한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 오디 추출물은, 냉동 건조된 오디 무게(㎏)의 약 1 내지 15배, 바람직하게는 약 2배 내지 5배 부피(ℓ)의 증류수, 메탄올 등의 저급 알코올 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1: 10의 혼합비를 갖는 혼합용매로 20 내지 100 ℃, 바람직하게는 70 내지 100 ℃의 추출 온도에서 약 0.5시간 내지 2일, 바람직하게는 1 시간 내지 1일 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 1회 내지 5회, 바람직하게는 2회 내지 3회 반복하여 수득할 수 있다.
본 발명은 상기 추출공정에서 얻어지는 물 추출물, 저급 알코올 추출물 및 이들의 혼합용매에서 얻어지는 추출물들을 포함하는 허혈성 뇌졸중 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 물 추출물, 저급 알코올 추출물 또는 이들의 혼합용매에 의한 추출물을 컬럼크로마토그래피를 통해 극성 용매로 유출시켜 추가의 정제형태의 정제물을 분획하여 수득할 수 있다.
오디의 추출물의 허혈성 뇌졸중 등 신경계 질환의 예방 및 치료효과를 관찰하기 위하여 오디 극성 용매 가용 추출물을 뇌허혈 동물 모델인 중뇌대동맥폐색(Middle Cerebral Artery occlusion: MCAo) 실험모델에 적용하여 실험한 결과, 뇌조직 손상 억제에 유의성 있는 실험결과를 나타내었다.
또한, 허혈성 뇌졸중의 병리현상 중의 하나로 산화적 스트레스로 인한 자유 라디칼의 생성으로 뇌의 세포사가 일어나는 것으로 알려져 있는데, 이런 병리현상에 대한 오디 추출물의 항산화 작용을 알아보기 위하여, 활성 지표로서 자유 라디칼의 일종인 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)을 이용한 라디칼 소거법을 이용하였으며, 오디 추출물에 항산화 활성이 있음을 확인하였다.
최근 밝혀진 바에 의하면, 중추신경계에 존재하는 소신경교세포를 염증 유발인자들이 활성화하여 염증 반응을 유도하게 되면, 활성화된 소신경교세포는 여러 가지 신경독성을 가진 화합물을 생산하여 직접, 간접적으로 신경손상 및 뇌허혈을 초래한다고 보고되었다(Marty, S et al.;Neuroscience, 45, pp529-539, 1991). 그래서 본 발명에서는 소신경교세포계 BV-2 세포주(Weill Medical College of Cornell University, 미국)를 선택하여 배양한 후, 리포폴리사카라이드(LPS)로 자극하여 오디 추출물 처리 후, 일차적인 염증지표인 산화질소(NO)양을 측정한 결과, 뇌 손상시에 오디 추출물의 염증방어 효과를 확인하였고, 오디 추출물의 염증매체로 인한 COX-2의 활성 억제 효과를 트롬복산B2(TXB2) 정량으로 관찰한 결과, COX-2 활성 억제가 뛰어나, 염증으로 인한 뇌허혈 및 뇌신경질환에 효과가 있음을 확인하였다.
본 발명의 오디 추출물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 추출물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 100 ㎎/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 그 추출물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 상기와 같은 제형으로 뇌세포 보호 및 뇌졸증의 예방 및 치료를 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 오디 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.
본 발명의 오디 추출물 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
본 발명의 상기 추출물은 뇌세포 보호 및 뇌졸중의 예방을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 식품 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 0.1 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명은 다음의 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명되나, 본 발명이 이에 의해 제한되지는 않는다.
실시예 1. 오디의 물 추출물 제조
냉동 건조된 오디(농업과학기술원 잠사곤충부) 1.0 ㎏을 정선하여 세절한 후에, 증류수 2 ℓ를 가하여 환류 추출기의 끓는 물에서 2시간동안 전탕하는 것을 2회 반복하여 얻은 추출액을 여과지(Whatman사, 미국)로 여과한 다음 이를 감압농축기(Eyela사, model FD-5N, 일본)로 감압농축하고 냉동 건조하여 185.5 g의 오디 추출물을 얻고 이를 시료로 사용하였다.
실시예 2. 오디의 메탄올 추출물 제조.
냉동 건조된 오디(농업과학기술원 잠사곤충부) 1.0 ㎏을 정선하여 세절한 후에, 메탄올(85%) 2 ℓ를 넣고 상온에서 1시간 동안 2회 초음파 추출하여 얻은 추출액을 여과지(Whatman사, 미국)로 여과한 다음 이를 감압농축기(Eyela사, model FD-5N, 일본)로 감압농축하고 냉동 건조하여 140.8 g의 건조된 오디 추출물을 얻어 시료로 사용하였다.
실시예 3. 오디의 활성 분획물 제조
감압 농축하여 얻은 물 추출물의 활성을 증가시키기 위하여 HP-20(Dianion사)을 이용하여 오픈 컬럼크로마토그래피를 수행하였다. 즉 HP-20으로 충진된 컬럼에 오디 추출물을 점적한 후에 100% 물로 유출시킨 후, 100% 메탄올로 동일한 방식으로 유출시켜 100% 물 유출액과 100% 메탄올 유출액 두 가지 분획물을 제조하였다.
참고예. 중뇌동맥폐색모델 (MCAo)
우선 중뇌동맥폐색(MCAo) 실험모델(Nagasawa H. 및 Kogure K.;Stroke, 20(8), pp1037-43, 1989)은 탐침으로 중뇌동맥으로 들어가는 혈류을 폐색하여 국소적으로 뇌허혈을 일으킨 다음, 재관류시키는 모델로서 사람의 뇌허혈과 가장 유사한 모델이기 때문에 뇌허혈 치료 약물개발에 있어 가장 적합한 모델로 알려져 있다.
체중 150 g 내외의 4주령의 스프라그-도올리(Sprague-Dawley) 수컷 흰쥐를 구입(바이오지노믹스사, 서울)하여 사료와 물을 충분히 공급하면서 체중 300g이 될 때까지 실험환경에 적응시켰다.
70% N2O와 30% O2가 섞인 혼합가스에 5%의 이소플루레인(isoflurane)을 섞어쥐를 흡입 마취시켰고, 실험 중에는 1%의 이소플루레인으로 유지하였다.
수술대에 고정된 쥐는 마취된 상태에서 실험이 진행되었다. 목 부위 중앙을 피부절개 하였고, 오른쪽 총경동맥(common carotid artery;CCA)과 외경동맥 (external carotid artery;ECA)을 주위조직과 신경들로부터 조심스럽게 분리시켰다. 실로 총경동맥(CCA)과 외경동맥(ECA)을 결찰한 뒤 내경동맥(internal carotid artery;ICA)과 익돌근구개동맥(pterygopalatine artery)을 같은 방법으로 주위 조직과 분리시킨 후 실로 고정하였다. 분기(bifurcation)에 가까운 내경동맥(ICA)을 가위로 일부 절개하여 혈관에 구멍을 내고 탐침을 삽입했다. 탐침은 4-0 나일론실을 23 ㎜ 길이로 만든 뒤 실리콘 성분인 폴리실록산(Polysiloxan)이 활성액에 의해 굳는 동안 실에 덧입혀 혈관과의 접착력를 높였다. 10 ㎜ 정도 코팅된 탐침을 내경동맥을 통해 20 ㎜내외로 삽입하면 저항이 느껴지는데 이때 실로 내경동맥을 결찰하여 탐침을 고정하였고 동시에 피가 역류되는 것을 막았다. 피부절개부위를 다시 봉합한 후 마취상태에서 자연 회복시켰다. 삽입된 탐침은 중뇌동맥(MCA)을 막으므로 이때부터 국소부위 허혈이 유발되고 1시간 30분 후에 같은 방법으로 마취하여 탐침을 후퇴시켜 재관류시켰다. 재관류 후 24시간 뒤에 경추 탈골시켜 뇌를 적출하여 조직을 관찰하였다.
실험을 진행하는 동안 온도 조절 전열기를 사용하여 쥐의 체온이 37 ± 0.5 ℃를 유지하였다.
허혈 유발 24시간 후 경추 탈골하여 뇌를 꺼냈다. 정수리점(Bregma)을 기준으로 +5.2, +3.2, +1.2, -0.8, -2.8, -4.8, -6.8, -8.8 ㎜ 부분을 절개하여 양쪽끝조직은 버리고 7조각의 두께 2 ㎜인 뇌절편들을 얻었다. 식염수에 희석하여 만든 2%의 트리페닐테트라졸리움클로라이드(2, 3, 5-triphenyltetrazolium-chloride: TTC)를 9 웰 플레이트에 적당량 담은 후, 7개의 뇌절편을 넣고 37 ℃에서 30분간 염색하였다. 30분 염색 후 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 약 3시간 동안 고정시켰다. 염색된 조직들은 접사렌즈가 부착된 디지털 카메라(OLYMPUS사, c2500L model, 미국)로 각각 촬영하여 컴퓨터로 옮겼다. OPTIMAS 프로그램(Media Cybernetics사, 6.51 Version)에서 제공되는 부피 측정법으로 뇌의 조직손상부 부피를 계산하였다. 부종(edema)을 제외한 우반구(right hemisphere)의 정확한 손상조직(infarct)의 부피를 측정하기 위해 하기와 같은 수학식 1 및 2로 실제 조직손상부위를 손상 받지 않은 좌반구 전체의 비율로 계산하였다.
본 발명의 오디 추출물의 허혈성 뇌졸중 억제 활성을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
실험예 1. 오디 물 추출물의 허혈성 뇌졸중 억제효과
참고예의 중뇌동맥폐색모델에 오디의 물 추출물을 투여하여 오디 추출물의 용량 의존성을 시험 분석하여 뇌졸중 억제효과를 확인하였다.
참고예의 중뇌동맥폐색모델에서 재관류를 시작하기 약 5 분전에 오디의 물 추출물을 두 가지 방법으로 투여하였다. 첫 번째로, 오디 물 추출물을 100 ㎎/㎏으로 경구투여하고 재관류 시킨 후, 약 2시간 후에 다시 오디의 물 추출물을 100 ㎎/㎏의 용량으로 투여하였고, 두 번째로는 200 ㎎/㎏의 용량으로 1회 투여하였다. 참고예의 방법에 따라 뇌조직 손상 정도(%)를 측정하여 수학식 2로 계산 후 그 결과는 표 1에 나타내었고, 도 1에 수학식 1로 계산한 뇌 조직 손상부피(㎣)를 비교하였다.
실험예 2. 오디 메탄올 추출물의 허혈성 뇌졸중 억제 효과
참고예의 중뇌동맥폐색모델에서 재관류를 시작하기 약 5 분전에 오디의 메탄올 추출물을 150 ㎎/㎏으로 투여하는 것 이외에는 실험예 1과 동일하게 시험 및 분석하여 허혈성 뇌졸중 억제 효과를 관찰하여, 그 결과를 표 1에 나타내었다.
실험예 1 및 2에 대하여 뇌허혈증에 효능이 있다고 알려져 있는 시그마알드리치사(Sigma Aldrich Co.)의 에브셀렌(Ebselen, E3520) 및 바이칼레인(Baicalein,46511-9)을 양성 대조군으로 사용하였다.
표 1의 실험 결과로부터 알 수 있듯이 오디 물 추출물 및 메탄올 추출물은 양성 대조군으로 사용한 단일 화합물인 에브셀렌 및 바이칼레인과 거의 유사한 수준의 뇌조직 손상을 나타냄으로써 뇌허혈 억제 효과를 나타냄을 확인하였다.
그 룹 | 조직 손상 부피비 (%) |
에브셀렌 (30 ㎎/㎏ x 1 회) | 45.2% |
바이칼레인(50 ㎎/㎏ x 2 회) | 41.1% |
오디 물 추출물(100 ㎎/㎏ x 2 회) | 37.0% |
오디 물 추출물(200 ㎎/㎏ x 1 회) | 34.5% |
오디 메탄올 추출물(150 ㎎/㎏ X 1회) | 30.1% |
실험예 3. 오디 추출물의 허혈 억제 효과
180 내지 200 g 정도의 스프라그-도올리 래트(중앙실험동물사, 서울)로부터 하기와 같은 미야카와(Miyakawa et al.;Yamazata Med., 3, pp13-26, 1985) 방법으로 뇌절편을 얻었다. 95% 산소로 평형시킨 인공 뇌척수액(ACSF, 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 23 mM NaHCO3, 10 mM glucose)에서 전 과정이 15분을 넘지 않도록 래트를 경추 탈골하여, 절단된 뇌로부터 해마 (hippocampus) 조직 절편을 얻고 이를 맥클웨인(Macllwain) 조직칼로 400 ㎛로 자른 후, 95% O2, 5% CO2로 평형화시킨 인공 뇌척수액(ACSF)에 옮기고, 1시간 동안 상온에 방치하여 뇌절편이 기능적으로 회복되도록 하였다.
포도당을 제거하고 95% N2, 5% CO2로 평형시킨 뇌척수액(ACSF)에 해마 조직 절편 6개를 옮기고 저산소 챔버(Forma Scientific사, USA)에서 무산소 상태로 만들어 실험적 허혈상태를 만들었다.
20분간 저산소 상태를 만들어 준 후, PCN 완충용액(12 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM NaHCO3)을 180 ㎕를 넣고 초음파 막파쇄기 (Brunson사, USA)로 조직을 파괴하였다. 중화 완충용액 120 ㎕을 첨가한 후, 원심분리(12000 rpm, 7 minutes, Beckman사)하고 상층액을 e-튜브에 옮긴 후. 루미노미터(luminomiter, Lumat Lb 9051, Berthold USA)를 사용하여 ATP 함량을 측정하였다.
허혈을 유도한 해마 조직에 1, 10, 50, 100 ㎕/㎖의 오디 추출물을 처리한 후 ATP 농도를 측정한 결과, 도 2에서 보여지는 바와 같이 1 ㎕/㎖과 같은 저농도의 오디 추출물을 처리한 경우에 허혈로 인하여 감소된 ATP 함량을 증가시키는 효과를 확인하였다.
실험예 4. 오디 추출물의 자유 라디칼(free radical) 소거 효과
뇌신경세포 손상의 원인 중 하나인 자유 라디칼 생성에 대한 오디 물 추출물의 효과를 DPPH 활성소거능력을 측정하여 항산화력을 확인하였다.
DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, 1.5 X 10-4M) 메탄올 용액에 오디 물추출물(1 ㎎/㎖)을 희석하여 넣은 후 격렬하게 흔들었다. 공기 중에 30분 동안 방치한 후 520 nm에서 흡광도를 측정하여 남아있는 DPPH의 양을 정량하였다.
실험방법은 이미 여러 문헌에 나와 있는 알려진 방법을 사용하였으며(Vivot, E. et al.;J. Ethnopharmacology, 76,pp65-71, 2001), DPPH 활성소거능력이 클수록 항산화력이 크게 된다. 오디 물 추출물의 DPPH 소거활성도를 오디 추출물을 처리하지 않은 대조군에 대한 백분율로 표시하였고 그 결과는 다음 표 2에 나타내었다. 오디 물 추출물은 에브셀렌보다는 훨씬 높으며 바이칼레인과는 비슷한 수준의 DPPH 소거 활성을 나타내어 항산화능력도 탁월한 수준임을 알 수 있었다.
그룹 (1 ㎎/㎖) | 효과 (%) |
에브셀렌 | 5.4% |
바이칼레인 | 92.2% |
오디 물 추출물 | 70.4% |
실험예 5. 오디 추출물의 NO 생성 억제 효과
뇌허혈의 병인으로 소신경세포의 염증반응설이 보고되고 있는데, 뇌손상시에 오디추출물의 염증방어 효과를 관찰하기 위하여, 소신경교세포계 BV-2 세포주(Weill Medical College of Cornell University, 미국)를 선택하여 배양한 후 LPS로 자극을 준 다음, 일차적인 염증지표인 NO양을 측정하여 염증억제정도를 확인하였다.
BV-2 세포에 10 ㎍/㎖ 내지 1000 ㎍/㎖의 농도의 리포폴리사카라이드(LPS, Difco사)와 함께 오디 추출물을 세 농도(1㎍/㎖, 5㎍/㎖, 10㎍/㎖)로 처리한 후,20시간 후에 상층액을 수집하였다. 수집된 상층액 50 ㎕를 96 웰 플레이트에 넣고 그리스 (Griess) 반응액 50 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 10분간 실온에 방치하고 난 뒤, 배지로 유리되어 나온 아질산염의 양을 측정(Choi, J. J. 및 Kim, W. K.,J.;Neurosci. Res., 54 ,pp870-875, 1998)하기 위해 플레이트리더(Molecular device사, USA)로 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 소디움나이트라이트(NaNO2)를 표준으로 삼아 농도를 계산하였다.
BV-2 세포에 LPS 100 ng/㎖을 처리하여 NO의 양이 유의적으로 증가한 세포에 1, 5, 10 ㎍/㎖의 오디 추출물을 처리한 결과, 일차적인 염증지표인 NO 생성량을 감소됨을 확인할 수 있었다(도 3 참조).
실험예 6. 오디 추출물의 염증 억제 효과
뇌허혈의 원인이라고 보고되고 있는 소신경교세포의 염증반응에 대한 오디추출물의 항염증작용을 검색하기 위하여 시클로옥시게나아제-2(Cyclooxygenase-2, COX-2)의 활성 억제도를 측정하였다.
COX-2의 발현이 각종 염증 매체에 의하여 증강되기 때문에 COX-2에 대한 선택적인 길항역할을 구명하고자 하였다. COX-2는 LPS 및 사이토카인 등에 의하여 활성화된 세포에서 선택적으로 발현이 증가되는 것으로 알려져 있다. 이를 위하여 쥐의 폐의 대식세포(alveolar macrophage)를 LPS로 활성화시켜 COX-2의 발현을 선택적으로 증가시킨 후 트롬복산B2(ThromboxaneB2, TXB2)를 정량함으로써 COX-2의 활성에 미치는 영향을 평가했다.
스프라그-도올리 래트를 공기 중 박테리아(airborne bacteria)에 대한 노출을 최소화한 후, 래트 폐의 대식세포(Alveolar macrophages)를 챈들러의 제법 (Chandler, D. B and Fulmer, J. D.;J. of Immunol.,139, pp893-898, 1987)으로 세정된 기관지 폐포(bronchoalveolar lavage)를 포집하였다.
세포 생존도를 트립판블루 염료 제거법(trypanblue dye exclusion)에 의하여 측정하여, 90% 이상 생존한 세포를 세포배양배지(RPMI 1640,Gibco BRL사)에 희석시킨 후, 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)에 부착시켰다. COX-2의 억제작용을 검색하기 위하여 배양배지에 Cox I을 선택적으로 억제하기 위한 아스피린(500μM, Sigma사), LPS(10 ㎍/㎖, Difco사) 및 혈청(fetal calf serum)을 넣고, 각각 나부메톤(Nabumethone, 한독약품)과 오디추출물을 10ppm의 농도로 첨가하여 세포를 16시간 배양하였다. 배지를 제거하고 30μM의 아라키돈산(arachidonic acid, Sigma사)를 포함한 새로운 배지에서 10분간 배양시킨 후, 각 웰의 배지를 전량 취하여 -20℃에 보관한 다음, 생성된 TXB2를 측정하기 위한 방사성면역시험법(Radio-Immuno Assay)용 시료로 사용했다. 또한 단백질량은 BSA를 표준물질로 하여 결정하였다. TXB2를 측정하기 위하여 항혈청을 가해 시료 중의 TXB2와 가해준3H-TXB2가 항혈청에 대해 경쟁적으로 결합하도록 한 후, 차콜덱스트란(charcoal dextran)을 가하여 유리된 TXB2를 침전시켜 제거하고,3H-TXB2와 항혈청과의 결합형에 신틸레이션혼합액(scincillation cocktail)을 가하여 방사능을 측정하였다. 표준검량곡선을 이용하여 각 시료에 함유된 TXB2를 구하고 단백질 ㎎ 당 TXBS2의 생성량으로 환산하여 COX-2의 활성을 측정하였다(Fu, J. Y. et al.,J. Biol. Chem., 265,pp16737-16740, 1990).
오디추출물에 대한 대조약물로 항염증제의 표준품으로 사용되고 있는 나부메톤(한독약품)을 선정하여 10 ppm에서 처리하여 얻은 COX-2 활성을 1이라 기준으로 했을 때, 오디추출물은 같은 농도에서 0.55 정도의 활성을 나타내어 결과적으로 COX-2 활성을 억제함을 알 수 있었다(표 3 참조). 이러한 결과는 오디의 전체추출물 수준에서 단일물질인 나부메톤과 역가를 비교한 것으로, 오디 추출물의 COX-2 억제효과가 매우 뛰어나므로, 신경세포의 염증으로 발생할 수 있는 뇌허혈 및 뇌신경계 질환에 효과적임을 확인할 수 있었다.
시료(10ppm) | 활성억제(%) |
오디추출물 | 55±2.3 |
나부메톤 | 100±0.1 |
실험예 7. 급성독성 시험
마우스(20±5 g, 중앙실험동물)와 래트(235±10 g, 중앙실험동물)를 사용하여 오디 추출물의 급성독성 시험을 실시하였다. ICR계 마우스와 스프라그-도올리래트를 각각 10마리씩 4군으로 나누어 본 발명의 오디 추출물을 각각 250, 500 및 1000 ㎎/㎏의 용량으로 경구 투여한 후 2주간 독성여부를 관찰한 결과, 3군 모두에서 사망한 예가 한 마리도 없었고 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다.
급성독성 시험 결과, 오디 물 추출물의 경우 LD50이 1000 ㎎/㎏ 이상이었으며, 오디 메탄올 추출물 역시 LD50이 1000 ㎎/㎏ 이상이었다. 또한 그 투여 가능 용량인 2000 ㎎/㎏에서 사망 예를 전혀 관찰할 수 없었으며, 체중 증가, 사료 섭취량 등에서 전혀 유의한 이상을 발견할 수 없었다. 따라서 오디 추출물의 경우 안전한 약물임을 알 수 있었다.
본 발명의 오디 추출물은 아래와 같은 제형으로 투여할 수 있으며 아래의 제제 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 제한되는 것은 아니다.
제제예 1. 산제의 제조
약전 제제총칙중 산제의 제조방법에 따라 하기의 성분 함량으로 제조한다.
1) 1포중
오디 추출물(건조분말) ................... 300 밀리그램
유 당 ................................... 100 밀리그램
탈 크 ................................... 10 밀리그램
2) 1포중
오디의 수가용성 분획 ..................... 300 밀리그램
유 당 .................................... 100 밀리그램
탈 크 .................................... 10 밀리그램
제제예 2. 정제의 제조
약전 제제총칙중 정제의 제조방법에 따라 하기의 성분 함량으로 제조한다.
1) 1정중
오디 추출물(건조분말) ...................... 300 밀리그램
옥수수전분 ................................. 100 밀리그램
유 당 ...................................... 100 밀리그램
스테아린산 마그네슘 ......................... 2 밀리그램
2) 1정중
오디의 수가용성 분획 ............................ 300 밀리그램
옥수수전분 ...................................... 100 밀리그램
유당 ............................................ 100 밀리그램
스테아린산 마그네슘 ............................. 2 밀리그램
제제예 3. 캅셀제의 제조
약전 제제 총칙중 캅셀제의 제조방법에 따라 하기의 성분 함량으로 제조한다.
1) 1캅셀중
오디 추출물 (건조분말) .......................... 300 밀리그램
옥수수전분 ...................................... 100 밀리그램
유당 ............................................ 100 밀리그램
스테아린산 마그네슘 .............................. 2 밀리그램
2) 1캅셀중
오디의 수가용성 분획 ............................. 300 밀리그램
옥수수전분 ....................................... 100 밀리그램
유당 ............................................. 100 밀리그램
스테아린산 마그네슘 ............................... 2 밀리그램
제제예4. 주사제의 제조
약전 제제총칙중 주사제의 제조방법에 따라 하기의 성분 함량으로 제조한다.
1) 1 앰플중 (2 ㎖)
오디 추출물 (건조분말) ........................... 300 밀리그램
주사용 멸균 증류수 ................................ 적량
pH 조절제 ......................................... 적량
2) 1 앰플중 (2 ㎖)
오디의 수가용성 분 ............................... 300 밀리그램
주사용 멸균 증류수 ............................... 적량
pH 조절제 ........................................ 적량
제제예5. 액제의 제조
약전 제제총칙중 액제제의 제조방법에 따라 하기의 성분 함량으로 제조한다.
1) 100 ㎖ 중
오디 추출물 (건조분말) .................... 1 그램
이성화당 .................................. 10그램
만니톨 .................................... 5 그램
정제수 ..................................... 적량
2) 100 ㎖ 중
오디의 수가용성 분획 ...................... 300 밀리그램
이성화당 .................................. 10 그램
만니톨 ..................................... 5 그램
정제수 ..................................... 적량
또한 하기와 같은 방법으로 건강음료를 제조한다.
오디 추출물 건조분말 0.1~80%, 설탕 5~10%, 구연산 0.05~0.3%, 캬라멜 0.005~0.02%, 비타민C 0.1~1%의 첨가물을 혼합하고 여기에 79~94%의 정제수를 섞어서 시럽을 만들고, 상기 시럽을 85~98 ℃ 에서 20~180초간 살균하여 냉각수와 1 : 4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5~0.82%를 주입하여서 되는 특수 가공 처리된 오디 건조추출물을 함유하는 탄산음료를 제조하였다.
액상과당 (0.5%), 올리고당 (2%), 설탕 (2%), 식염 (0.5%), 물 (75%)와 같은 부재료와 오디 추출물 건조분말을 균질하게 배합하여 순간살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
본 발명에 따른 신경세포 보호 및 허혈성 뇌졸중 등 신경계 질환의 예방 및 치료 효과를 갖는 오디 추출물 및 극성 용매 가용성 추출물을 함유한 약학적 제제는 재래로부터 널리 사용되어온 생약으로 독성의 문제가 전혀 없으며, 신경세포 보호 활성이 우수하여 허혈성 뇌졸중 등 신경계 질환의 예방 및 치료 효과에 효과적으로 사용될 수 있다.
Claims (10)
- 오디 (Morus albaL.)의 조추출물을 유효성분으로 하고 통상의 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 이루어진 신경세포 보호 및 신경계 질환 치료 및 예방용 약학적 조성물.
- 오디 (Morus albaL.)의 조추출물을 유효성분으로 하고 통상의 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 이루어진 염증성 질환 치료 및 예방용 약학적 조성물.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 오디 추출물이 물, 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매와 같은 극성용매로 추출하여 얻은 것임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 3항에 있어서, 저급 알코올이 메탄올인 조성물.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 오디 추출물은 냉침추출, 초음파추출, 환류추출로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법으로 얻어진 조성물.
- 제 5항에 있어서, 오디 추출물을 감압 농축시킨 후 컬럼크로마토그래피를 통하여 물 또는 저급알코올로 유출시켜 얻어진 분획물을 포함하는 조성물.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 신경계 질환이 허혈성 뇌졸중인 조성물.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.5 ~ 50%로 포함하는 조성물.
- 오디 추출물 및 식품학적으로 허용가능한 식품보조 첨가제를 포함하는, 신경세포 보호 및 허혈성 뇌졸중 치료 및 예방 효과를 나타내는 건강보조식품.
- 제 9항에 있어서, 건강음료인 건강보조식품.
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