KR100757207B1 - 대추 추출물을 유효성분으로 함유하는 허혈성 뇌혈관질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

대추 추출물을 유효성분으로 함유하는 허혈성 뇌혈관질환의 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 허혈성 뇌혈관 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 상세하게는 대추 추출물을 유효성분으로 함유하는 허혈성 뇌혈관 질환에 효과적인 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 대추 추출물은 부신유래의 PC12세포주를 이용한 저산소환경에 의한 세포사 억제 실험 및 저빌을 이용한 허혈성 뇌질환 실험을 통해 PC12세포주 또는 해마조직 CA1 영역의 신경세포 손상을 효과적으로 예방하는 것을 확인함으로서, 허혈성 뇌혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
대추, 허혈성 뇌혈관질환, PC12 세포주

Description

대추 추출물을 유효성분으로 함유하는 허혈성 뇌혈관 질환의 예방 및 치료용 조성물{Composition comprising the extract of Ziziphus jujuba MILL. var spinosus for the prevention and treatment of ischemia damage disease}
도 1은 대추 추출물의 세포 보호 효과를 확인하기 위해 대추 추출물의 투여 후에 PC12 배양세포에 저산소환경을 가하여 세포사에 의해 유리되는 락테이트 디하이드로게나제의 상대량을 측정한 도이고,
도 2는 실험동물에 허혈-재관류를 실시하였을 때 정상군(A 및 B), 용매(물)투여 (C 및 D), 허혈-재관류 실시 7일 전부터 40 mg/kg (E 및 F)으로 실험동물에 경구 투여한 다음 4일 후의 해마조직을 크레실 바이올렛(cresyl violet)으로 염색하여 관찰한 도이며,
도 3은 대추 추출물을 허혈 재관류실시 7일 전부터 매일 40 mg/kg 으로 실험동물에 경구 투여한 다음 4일 후에 동물을 희생하여 크레실 바이올렛(cresyl violet)에 염색된 세포수를 정상군에 대한 상대적인 퍼센트로 나타낸 도이다.
뇌졸중(stroke)은 뇌혈관의 이상에 의해 뇌경색이나 뇌출혈에 의해 갑자기 사망에 이르게 하거나 신체적, 정신적 장애를 일으키게 하는 심각한 신경계 질환으로 악성종양 및 심장질환과 함께 성인에 있어서 중요 사망 원인의 하나이다.
뇌졸중은 크게 뇌혈관이 막히는 허혈성 뇌졸중(뇌경색)과 뇌혈관이 터지는 출혈성 뇌졸중(뇌출혈)으로 구분할 수 있으며, 허혈성 뇌졸중의 경우에서는 동맥경화나 혈전 등에 의해 우발되는 것으로 알려져 있으며, 뇌출혈의 경우는 고혈압에 의한 원발성 뇌출혈과 동정맥 기형이나 동맥류에 의한 지주막하 출혈이 중요한 원인이라고 할 수 있다.
뇌졸중에 의한 신경세포의 사멸은 크게 두가지 기전에 의한 것으로 알려져 있다. 하나는 대표적인 흥분성 신경전달물질인 글루타민산염이 혈관의 폐쇄시에 증가하여, 글루타민산염 수용체에 지속적으로 결합하여 나타나는 흥분성 세포 독성이고, 다른 하나는 혈관의 폐쇄 및 재관류 등 일련의 반응에서 유발되는 활성산소종(reactive oxygen species)에 의한 흥분성 신경세포사이다.
흥분성 아미노산인 글루타민산염 수용체는 일종의 ligand-gated ion channel로서 이 수용체는 agonist의 선택성에 따라서 NMDA (N-methyl-D-aspartate) , AMPA (α-amino-4-isoxazole-propinoic acid), 카이네이트(kainate) 등으로 구분된다 (Nakanishi S. Molecular diversity of glutamate receptors and implications for brain function. Science, 23;258(5082), pp.597-603, 1992 Oct).
이들 수용체의 과도한 흥분은 신경세포의 손상을 초래하는 반면에, non-NMDA 수용체의 과도한 흥분은 나트륨이온(Na+) 유입에 따른 신경세포의 부종(swelling)을 유발하며, 이들 중 하나인 카이네이트(kainate) 수용체가 활성화되는 경우에도 활성산소종의 생성이 급격히 증가하는 것으로 알려져 있다 (Olney JW, Rhee V, Ho OL. Kainic acid: a powerful neurotoxic analogue of glutamate. Brain Res., 13;77(3), pp.507-12, 1974 Sep).
혈관의 폐쇄-재관류시에 갑작스러운 에너지의 공급은 세포내의 대사가 급격하게 일어나 과산화수소(H2O2)의 양이 급격하게 증가하게 된다. 정상상태인 동물이나 사람에서는 이렇게 생성된 과산화수소는 구리(Cu), Zn-superoxide dismutase 등에 의해서 쉽게 분해되는 것으로 알려져 있다.
그러나 혈관의 재관류시에는 이들이 소화할 수 있는 양을 벗어나게 되며, 생체내의 철과 반응하는 하버-웨이스(Haber-Weiss reaction) 및 펜톤반응(Fenton reaction)을 유발하여, 체내에 수산기라디칼(hydroxyl radical)의 양이 급격히 증가된다. 이렇게 증가된 수산기라디칼은 반응성이 매우 높아 체내에 존재하는 비포화 물질들과 반응을 하게 되는데 가장 대표적인 것이 DNA, RNA 및 세포지질막이다. 세포지질막과의 반응은 지질 과산화(lipid peroxidation)를 유발하여, 세포의 염증반응을 매개하며, DNA에 반응하여, 8-hydroxyguanosine adduct를 형성하여, DNA 손상을 유발하는 것으로 알려져 있다.
최근 보건복지부가 권고한 사항에 따르면, 뇌졸중에 대한 임상증상을 최소하기 위해서는 뇌졸중이 발생한 3시간 이내에 병원에 가서 뇌졸중 치료를 받아야 치 료 효과를 볼 수 있으며, 이보다 늦어지면 치료 효과를 보기 힘들다고 하였다. 그러나 최근 혼자 사는 독거노인의 수가 증가하고 있는 시기에 초기 대응은 쉽지 않은 것이 현실이다. 따라서 체내에 독성이 없고, 효능이 다양한 건강기능성 식품 등의 급여를 통해 질병의 이환을 줄이는 것이 무엇보다 중요한 것으로 대두되고 있다.
대추나무(Zizyphus jujuba MILL. var. inermis (BGE.) REHD.)는 갈매나무과(Rhamnaceae)에 속한다.
과실에는 단백질, 당류, 유기산, 점액질, 비타민 A, B2, C, 미량의 칼슘, 인, 철 등이 함유되어 있고, 뿌리는 관절산통, 위통, 토혈, 월경불순, 풍진, 단독을 치료하는 효과가 있으며, 껍질은 수렴, 거담, 진해, 소염, 지혈의 효능이 있고, 이질, 장염, 만성기관지염, 시력장애, 화상, 외상출혈을 치료한다. 또한, 잎은 알카로이드 성분으로서, 대추 알카로이드(daechialkaloid)A,B,C,D,E와 대추사이클로펩타이드(daechucyclopeptide), 세릴알콜, 프로토핀, 베르베린을 함유하고 있다. (향약대사전, 신민교, 정보섭, pp. 296-297, 1989)
이에 본 발명자들은 대추 추출물이 부신유래의 PC12세포주를 이용한 저산소환경에 의한 세포사 억제 실험 및 저빌을 이용한 허혈성 뇌질환 실험을 통해 PC12세포주 또는 해마조직 CA1 영역의 신경세포 손상을 효과적으로 예방하는 것을 확인함으로서, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 대추 추출물을 유효성분으로 함유하는 허혈성 뇌혈관 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 및 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대추 추출물을 유효성분으로 함유하는 허혈성 뇌혈관 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 대추 추출물을 유효성분으로 함유하는 허혈성 뇌혈관 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 허혈성 뇌혈관 질환은 부신유래의 PC12 세포주를 이용한 저산소환경에 의한 세포사 억제 및 저빌을 이용한 허혈성 뇌질환 실험을 통해 PC12세포주 또는 해마조직 CA1 영역의 신경세포 손상의 기전을 통해서 기인함을 특징으로 한다.
본원에서 정의되는 추출물은 물, 메탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 극성용매, 바람직하게는 메탄올에 가용된 추출물을 포함한다.
또한 본원에서 정의되는 대추는 갈매나무과(Rhamnaceae)인 멧대추나무(Zizyphus jujuba MILL.), 대추나무(Zizyphus jujuba MILL. var. inermis (BGE.) REHD.) 바람직하게는 대추나무(Zizyphus jujuba MILL. var. inermis) 열매의 과육, 과피 및 씨, 보다 바람직하게는 과피를 포함한다.
상기 허혈성 뇌혈관 질환은 뇌경색, 중풍, 뇌출혈, 거미막하출혈로부터 선택된 하나 이상의 질환, 바람직하게는 뇌경색, 뇌출혈을 포함한다.
이하, 본 발명의 추출물을 수득하는 방법을 상세히 설명한다.
본 발명의 대추 추출물은, 건조된 대추의 과피, 과육 및 씨를 세절하여 건조 중량의 약 1 내지 20배, 바람직하게는 약 2 내지 6배의 물, C1 내지 C4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물 또는 메탄올로, 20 내지 150℃, 바람직하게는 70 내지 120℃ 추출온도에서 약 1시간 내지 10일, 바람직하게는 약 2시간 내지 5시간 동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등의 추출방법, 바람직하게는 냉침 추출방법을 이용하여 수득한 추출액을 여과, 감압농축 또는 건조하여 수득할 수 있다.
본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 대추 추출물을 유효성분으로 함유하는 허혈성 뇌혈관 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 대추 추출물을 0.01 ~ 99.9% 함유하는 것이 바람직하고, 0.1 ~ 90% 함유하는 것이 더욱 바람직하다.
그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.
본 발명의 대추 추출물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있 다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 허혈성 뇌혈관 질환의 예방 및 개선 효과를 나타내는 대추추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 허혈성 뇌혈관 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 허혈성 뇌혈관 질환의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 대추의 극성용매 가용추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
본 발명의 대추 추출물 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
본 발명의 상기 추출물은 허혈성 뇌혈관 질환의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 대추 추출물의 제조
1-1. 대추의 과피 추출물의 제조
2003년 10월 대전광역시 소재 한약재 시장에서 건조된 대추를 구입한후, 과피 200 g을 잘게 잘라 100% 메탄올 0.8 L를 가하여 일주일간 냉침시켰다. 상기 냉침이 끝난 메탄올 추출물은, 감압플라스크에 감압장치(aspirator)를 연결해 플라스크 내부를 감압시킨다음, 감압플라스크에 연결된 여과기에 넣고 여과하였다.
상기 여과되어진 여액을 감압농축기(BUCHI 011, SWITZERLAND)로 감압농축하여 대추 과피 추출물 16.6g을 얻어 실험예의 시료로 사용하였다.
1-2. 대추의 과육 추출물의 제조
건조된 과피를 과육으로 바꾸는 점만 제외하고 상기 실시예 1-1과 동일한 반응 공정을 수행하여 대추 과육 추출물 7.2g을 얻어 실험예의 시료로 사용하였다.
실험예 1. 대추 추출물의 신경세포 보호 효능 측정
대추 추출물의 신경세포사 예방 및 개선 효과를 확인하기 위하여 부신 유래의 PC12 세포주를 이용하여 저산소환경을 유도한 다음 세포사멸에 의해 유리되는 락테이트 디하이드로게나제 농도를 측정하는 방법 및 체중 65-75g 인 수컷 몽골리안 저빌(Mongolian gerbil, Harlan, USA)을 마취시켜 온목동맥(common carotid artery)을 노출 후 결찰하여 뇌허혈 유도를 통해 해마의 CA1영역을 확인하는 두가지 방법을 이용하여 하기와 같이 실험하였다.
1-1. 락테이트 디하이드로게나제 농도 측정을 통한 대추 추출물의 신경세포 보호 효과
상기 실시예 1-1의 대추 과피 메탄올 추출물을 농도별로 투여한 다음 PC12 세포를 저산소 챔버 (hypoxic chamber, Coy Laboratories, USA)를 이용하여, 94% N2, 5% CO2, 1% O2 환경에서 6시간 노출하여 저산소환경을 통한 신경세포손상을 유도한 후, 신경세포의 손상 유무를 확인하기 위해 배양세포에서 유리되는 락테이트 디하이드게나제(LDH) 농도를 측정하였다.
이것은 손상 및 파괴된 세포로부터 거의 분비가 완료되는 24시간 정도에서 세포배양액을 채취하여 마이크로플레이트리더로 측정하였고, 그 값을 도 1에 나타내었다. (도 1 참조)
상기 실시예 1-1에서 얻은 대추 과피 메탄올 추출물을 상기 PC12 세포주에 0.01 mg/ml, 0.05 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.5 mg/ml, 1 mg/ml, 5 mg/ml이 되도록 각각 처리 한 다음, 30분 후에 94% N2, 5% CO2, 1% O2 환경에서 6시간 노출시켰다.
PC12 세포는 37℃에서 20 내지 24시간 배양한 후 세포 배양액을 수득하였고, 배양액내의 락테이트 디하이드로게나제의 농도를 종셍 바이오테그(Zhong Sheng Biotech) 표준시약으로 한 베크만(Beckman) DU-640 흡광광도계를 이용하여 효소 역학적(enzyme dynamic) 방법(Hou et al., J. Neurosci. Res., 74, pp.123-133, 2003; Yamakawa et al., Neurol. Res., 23, pp.522-530, 2001)으로 측정하였다.
실험결과, 도 1에 나타나는 바와 같이 대추 추출물을 처리한 군에서 용매만을 처리한 다음 저산소환경을 유발한 대조군에 비하여 락테이트 디하이드로게나제의 분비율이 배양액에 대해 농도의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었고, 1 mg/ml, 5 mg/ml에서는 락테이트 디하이드로게나제의 농도가 거의 변화가 없었으며, 0.5 mg/ml이 가장 효과적인 농도임을 확인할 수 있었다.
또한 대추 추출물을 투여한 경우 PC12 세포에서의 락테이트 디하이드로게나제의 생성량이 0.5 mg/ml에서 가장 효과적인 것으로 관찰됨에 따라 본 발명의 대추 추출물을 투여하는 경우 신경세포 보호의 효과가 있음을 알 수 있었다. 즉, 용매만을 투여한 군에 비해 54%의 LDH 분비를 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
1-2. 동물실험을 통한 대추 추출물의 신경세포 보호 효능 측정
대추 추출물의 신경세포 보호 효능을 측정하기 위하여 동물 실험을 하기와 같은 공정으로 수행하였다.
실험동물은 체중 65 - 75g의 수컷 몽골리안 저빌(Mongolian gerbil, Meriones unguiculatus, Halan, USA) 40마리를 사용하였고, 오전 7시부터 오후 7시까지 빛을 가하는 일정한 명암주기 하에서 온도 23± 2℃, 상대습도 55 ± 10%에서 사육하였으며, 음식과 물은 자유로이 섭취하게 하였다.
상기 실시예 1-1에서 얻은 대추 과피 메탄올 추출물 28 mg을 증류수 2ml에 용해한 것을 허혈유발 일주일 전부터 매일 식도용 바늘을 이용하여 0.2 ㎖ 경구투여(용량은 체중 ㎏ 당 40 mg이 되도록 투여)하였다.
실험동물은 질소와 산소가 7 : 3으로 혼합된 가스에 3% 이소플루란(isoflurane , Baxtor, USA)으로 전신마취하였고, 동일한 가스에 2.5% 이소플루란으로 마취를 유지하면서 수술을 수행하였다. 목 부위의 털을 깎고 소독한 다음 절개를 하여 양쪽 온목동맥을 노출시켰고, 동맥류 클립(aneurysm clip, Staelting, USA)을 이용하여 5분 동안 결찰하여 허혈을 일으킨 후, 클립을 제거하여 재관류시켰다. 이 때 각 실험군은 검안경(ophthalmoscope)을 이용하여 망막중심동맥(central artery of retina)의 혈액 순환 유무를 관찰하여 완전한 온목동맥의 폐쇄를 확인하였다. 허혈을 유발시키는 동안 직장 내 체온계를 삽입하여 체온을 측정하였으며, 실험동물의 온도에 따라 자동으로 조절되는 온열 패드를 사용하여 체온을 정상 체온인 37 ± 0.3℃로 일정하게 유지시켰다.
실험군은 뇌허혈 유발 4일 후에 티오펜탈 소듐(thiopental sodium, 유한양행, 한국)을 체중 ㎏ 당 각각 30㎎의 용량으로 복강 내 주사하여 마취시킨 다음, 1,000㎖ 당 헤파린 1,000 IU를 함유한 4 ℃의 생리식염수를 좌심실로 주입하여 관류 세 척하였다. 관류 세척이 끝난 동물은 바로 4℃의 4% 파라포름알데하이드(in 0.1 M phosphate buffer; PB, pH 7.4)로 관류 고정을 하였다.
관류 고정이 끝난 동물을 뼈절단기를 이용하여 머리뼈공간을 열어 뇌를 적출한 다음, 동일 고정액에서 6 시간동안 후고정하였다. 후고정이 끝난 뇌는 30% 슈크로스 용액(in 0.1 M phosphate buffer)에 넣어 바닥에 가라앉을 때까지 침강 시킨 후, 슬라이드 마이크로톰(sliding microtome, Reichert-Jung, Germany)으로 조직을 30㎛ 두께로 잘라 보존액(storing solution)이 들어있는 6웰 플레이트에 넣어 사용시까지 4℃에서 보관하였다.
각 조직절편 중에서 해마부위(hippocampus)가 잘 나와 있는 조직을 선택하였고, 조직에 묻어있는 보존액을 세척하기 위해 0.01M PBS로 10분씩 3회 세척한 다음, 젤라틴 입힌 슬라이드에 도말하여 37℃에서 충분히 건조시켰으며, 크레실 바이올렛 염색을 위해 증류수에 조직을 잠시 담가 둔 후, 2% 크레실 바이올렛 아세테이트(cresyl violet acetate, Sigma, USA) 용액에 1분간 염색하였다.
조직은 흐르는 물에 충분히 세척하여 슬라이드에 묻어 있는 과량의 염료를 제거하였고, 증류수에 잠시 담근 후 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 및 100% 용액을 거쳐 탈수를 하였다.
조직에서 니슬소체(Nissle body)가 보이는 것을 확인한 후, 자일렌(Junsei, Japan)에 담가 투명화한 다음 카나다 발삼(Canada Balsam, Kanto, Japan)으로 봉입하였다.
대조군은 대추 추출물을 녹이는데 이용된 증류수를 투여한 것을 제외하고는, 수술, 조직처리, 크레실 바이올렛 염색을 동일한 방법으로 실시하였고, 정상군은 수술을 실시하지 않았으며, 조직처리, 크레실 바이올렛 염색은 동일한 방법으로 실시하였다.
각 군에 대한 유의성의 검증을 위하여 일원분산분석(one-way ANOVA test)을 수행하였으며, 데이터는 평균과 표준평균오차로 나타내었다.
각 조직들은 디지털 카메라(Axiocam, Cal Zeiss, Germany)가 부착되어 있는 악시오엠1 현미경(AxioM1 microscope, Carl Zeiss, Germany)으로 전체 해마 영역을 40배로, CA1 영역을 200배로 하여 사진 촬영하여 도 2에 나타내었다. (도 2 참조)
도 2에서 나타나는 바와 같이 A, C 및 E는 전체 해마 영역의 사진이고 B, D및 F는 해마의 CA1영역이다.
실험결과, 도 2에서는 정상군 (A,B)은 해마의 전영역에서 신경세포가 진하게 염색되는 것을 관찰할 수 있었던 반면에, 대추 추출물을 녹인 용매를 투여한 대조군(C,D)은 해마의 CA1영역에서 허혈에 의해 세포가 죽어 염색된 세포가 거의 관찰되지 않았고, 대추 추출물 40㎎/㎏을 투여한 실험군에서(E,F)는 해마의 전영역에서 세포가 진하게 염색되었으며, 대추 추출물이 신경세포사를 현저히 억제시킴을 확인할 수 있었다.
또한 대추 추출물 40㎎/㎏을 투여했을때, 보라색으로 염색된 부분을 이미지 분석기(Optimas 6.5, USA) 프로그램을 사용하여 신경세포의 상대적인 수를 도 3에 나타냈다. (도 3 참조)
실험결과, 도 3에서 나타나는 바와 같이 허혈-재관류 실시 후 대추 추출물의 투여에 따른 신경세포의 사멸 정도를 신경세포 계수로 확인한 결과, 대조군에서는 정상군에 비하여 해마의 CA1 영역세포가 약 11.3% 정도 관찰되었고, 40 mg/kg의 대추 추출물을 투여한 경우 정상군에 대해 58.4%의 세포수가 관찰되었으며, 해마의 CA1 영역의 신경세포보호 효과를 확인할 수 있었다.
하기에 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
대추 추출물 40 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
대추 추출물 40 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제 조한다.
제제예 3. 캡슐제의 제조
대추 추출물 40 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 액제의 제조
대추 추출물 40 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 5. 건강 식품의 제조
대추 추출물 1000 ㎎
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 B 10.13 ㎎
비타민 B 20.15 ㎎
비타민 B 60.5 ㎎
비타민 B 120.2 ㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 90 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 대추 추출물은 부신유래의 세포주 및 뇌허혈에 민감하다고 알려져 있는 해마조직 CA1 영역의 신경세포의 손상을 효과적으로 예방할 뿐만 아니라, 뇌허혈에 의한 신경세포사를 억제하며 인체에도 무해하여 부작용을 발생시키지 않으므로, 이를 포함하는 조성물은 뇌허혈성 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (5)

  1. 대추 추출물을 유효성분으로 함유하는 허혈성 뇌혈관 질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매에 가용한 추출물인 약학조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 허혈성 뇌혈관 질환은 뇌경색, 중풍, 뇌출혈, 거미막하출혈인 약학조성물.
  4. 대추 추출물을 유효성분으로 함유하는 허혈성 뇌혈관 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
  5. 제 4항에 있어서, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 건강기능식품.
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