CN1565473A - 茄属植物的水溶性萃取物、其制备方法及其药学组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种源自茄属植物的水溶性萃取物，其基本上是由至少60％－90％的澳洲茄碱及茄边碱所构成。本发明也提供一种用于制备一种茄属植物的水溶性萃取物的方法，其中涉及酸水解、碱沉淀以及使用氯仿、醇与水等溶剂的分离步骤，而由该方法所制得的水溶性萃取物可在不加入任何其它溶剂和/或助溶剂下被直接溶于纯水或中性pH值的水中而形成一种黄色澄清透明的水溶液，且溶解度可达2～20mg/ml或以上。本发明也提供一种药学组合物，其包含有上述茄属植物的水溶性萃取物作为一用以抑制肿瘤/癌细胞(特别是肝癌细胞、肺癌细胞与乳癌细胞)的生长的活性组份。

Description

茄属植物的水溶性萃取物、其制备方法 及其药学组合物

                           技术领域

本发明涉及一种茄属植物(plant of Solanum genus)的水溶性萃取物暨其制备方法，以及包含有该水溶性萃取物的药学组合物。

                           背景技术

癌症是目前全世界人类最主要的死亡原因之一，而肺癌、肝癌以及乳癌则为人类最主要的癌症。虽然癌症的形成机制仍未被完全了解，据信，癌症的发生可归因于细胞分裂失去控制〔Chen，P.L.等，(1990)，Science，250，1576-1580；Finlay，C.A.等，(1989)，Cell，57，1083-1093；以及Baker，S.J.等，(1990)Science，249，912-915〕。

通常，人类或动物体内的细胞生长与分化会受到体内生长激素的严格控制。当细胞蓄积内生性或外源性因素导致的基因变异时，该细胞将产生错误的讯息传递，并导致该细胞在失去控制下分裂生长，而逐渐形成癌细胞(Kerr，J.F.R.(1971)J.Pathol.，105，13-20)。

现今世界各国的研究人员皆致力于癌症的研究，但目前在癌症治疗上所达成的成果仍不尽理想，这除了患者本身个人因素以外，抗癌药的严重副作用以及癌细胞的抗药性等问题是在临床治疗上的所碰到的最大困扰。鉴于目前临床上使用的西药药物尚无法有效改善癌症的治疗，有些研究人员透过研究癌症的发生机制，而尝试从传统中药(traditional Chinese medicines，TCM)或草本植物(herbs)中来寻找可用于治疗或消除癌症的症状的活性组份。

细胞程序死亡(Apoptosis)被认为是动物细胞的一种自然调控细胞生长的机制〔Martin，S.J.and Green，D.R.(1995)，Crit.Rev.Oncol.Hemat.，18，137-153〕，其在许多细胞的自然性死亡调节(例如，动物成长过程的组织自然萎缩与吸收)中扮演一重要角色。此外，当人类细胞受到伤害而无法修补时，自然细胞程序死亡亦会被启动以避免产生癌细胞。

细胞程序死亡的主要特征有：细胞凋亡小体(apoptotic bodies)的形成、染色质凝聚以及DNA的片段化〔Arends，M.J.and Wyllie，A.H.(1991)Int.Rev.Exp.Pathol.，32，223-254；Dive，C.等，(1992)Biochim.Biophys.Acta 1133，275-285；以及Darzynkiewicz，Z.等，(1992)Cytometry，13，795-808〕。在细胞程序死亡过程中，死亡细胞的碎片会被周围细胞及吞噬细胞经由吞噬作用而迅速地吸收，而不会有发炎反应产生〔Sarraf，F.E.and Bowen，I.D.(1988)Cell Tissue Res.21，45-49〕。此外，利用流式细胞分析仪来测定细胞周期的变化时，会出现Sub-G1波〔Alzerreca，A.and Hart，G.(1982)Toxicology Lett.12，151-155；以及Lin，C.N.等，(1986)J.Taiwan Pharm.Assoc.38，166〕，因此Sub-G1波被认为是细胞进行细胞程序死亡的典型标记。

有文献报导，当细胞产生变化而其细胞程序死亡机制失控时，该细胞会形成癌细胞〔Carson，D.A.and Ribeiro，J.M.(1993)Lancet 341，1251-1254；以及Kaufmann，S.H.(1989)Cancer Res.49，5870-5878〕。因此，近年来细胞程序死亡已成为肿瘤学研究的目标。此外，亦有文献报导，有些抗癌药物会引起癌细胞进行细胞程序死亡〔Wyllie，A.H.等，(1980)Int.Rev.Cytol.68，251-306；Wyllie，A.H.等，(1984)JPathol.142，67-77；Barry，M.A.等，(1990)Biochem.Pharmacol.，40，2353-2362；以及Hickman，J.A.(1992)Cancer Metast.Rev.，11，121-139〕，因此，细胞程序死亡也成为全球研究抗癌药物的重要方向的一。

传统中药(TCM)或草药(herbal medicines)被应用于疾病的治疗已有一段相当长的历史，而目前也有不少研究人员尝试从传统中药与草药当中寻找出有用的抗癌药物。但是，传统中药与草药的使用大多仍以传统经验为主，而未必有充分的科学化证据来支持。此外，传统中药或草药因有效成份的萃取方法、剂量控制与品质监控还未被科学化，而使得投药后所产生的疗效难达一致。再者，传统中药或草药的有效成份大多为非水溶性，而非水溶性物质在被口服投药或被注射至动物体内时，可能会有吸收上的困难而无法显出疗效。这些是限制传统中药与草药的应用与发展的主要原因。

目前世界上可被当做药用的植物众多，已知有许多种从植物材料萃取而得的蛋白质抑制剂可用于抗癌治疗。在这些具有抗癌潜力的蛋白质抑制剂中，已发现由茄科植物体所得到的类固醇生物碱(steroidal alkaloids)具有作为抗癌药物的潜力。

已知黄水茄〔拉丁学名：Solanum incanum L.，同义名：Solanum incanum Ruiz.& Pav.、Solanum coagulans Forsskal；英文名：bitter apple〕含有类固醇性糖基生物碱(steroidal glycoalkaloid)〔Kuo，K.W.等，(2000)，Biochemical Pharmacology，60(12)：1865-73〕。此外，据报导，有不少同属于茄科的植物亦含有类固醇性糖基生物碱，这包括，例如，印度茄(Solanum indicum)、龙葵(拉丁学名：Solanum nigrum；汉语拼音：Long kui；英文名：black nightshade)〔Hu，K.等，(1999)，Planta Medica，65(1)：35-8〕、冬珊瑚(拉丁学名：Solanum capsicastrum；英文名：false jerusalemcherry)、黄果茄Solanum xanthocarpum)、瓜茄(Solanum melongena)〔Blankemeyer，J.T.等，(1998)，Food & Chemical Toxicology，36(5)：383-9〕、黄刺茄(Solanumcoagulans)、马铃薯(Solanum tuberosum)〔Friedman，M.等，(1996)，Journal of Nutrition，126(4)：989-99)、撒旦茄(Solanum sodomeum)(于澳洲又被称为apple of Sodom)、陀螺茄(Solanum turburosum)、刺茄(Solanum aculeastrum)〔Wanyonyi，A.W.等，(2002)，Phytochemistry，59(1)：79-84〕、石松茄(Solanum lycocarpum)〔Peters，V.M.等，(2001)，Contraception，63(1)：53-5〕、喀什亚茄(Solanum khasianum)〔Putalun，W.等，(2000)，Biological & Pharmaceutical Bulletin，23(1)：72-5〕、水茄(Solanumsuaveolens)(Ripperger，H.等，(1997)，Phytochemistry，46(7)：1279-82〕、裂叶茄(Solanum uporo)〔Ripperger，H.等，(1997)，Phytochemistry，44，(4)：731-4)〕、莴茄(Solanum abutiloides)〔Tian，R.H.，et al(1997)，Phytochemistry，44(4)：723-6〕、西洋茄(Solanum coccineum)〔Lorey，S.等，(1996)，Phytochemistry，41(6)：1633-5〕、蹄状茄(Solanum unguiculatum)〔Sarg，T.M.等，(1995)，Pharmacy World & Science，17(6)：191-4〕、韧茄(Solanum robustum)〔Ripperger，H.(1995)，Phytochemistry 39(6)：1475-7〕、蛇状茄(Solanum anguivi)〔Ripperger，H.等，(1994)，Phytochemistry，37(6)：1725-7〕、小叶茄(Solanum platanifolium)〔Puri，R.等，(1994)，Journal of NaturalProducts 57(5)：587-96〕、美洲茄(Solanum mammosum)〔Alzerreca，A.等，(1982)，Toxicology Letters，12(2-3)：151-5〕等等。

目前已知，从这些茄科植物得到的类固醇生物碱包含有，例如，茄边碱(solamargine)、澳洲茄碱(solasonine)、喀什亚素(khasianine)以及澳洲茄胺(solasodine)等成份〔Chataing，B.等，(1998)，Planta Medica 64，31-36；以及Weissenberg，M.等，(1998)，Phytochemistry 47，203-209〕。澳洲茄碱与茄边碱的化学结构如下所示：

另外，已有研究发现，从不同植物来源萃取而得的茄边碱具有抑制下列生物体的生长的作用：寄生虫，如枯西氏锥虫(Trypanosoma cruzi)；昆虫，如赤拟谷盗虫(Tribolium castaneum，英文名为red flour beetle)、烟草天蛾(Manduca sexta，英文名为tobacco hornworm)；霉菌，如霉迪卡霉素(Phoma medicaginis)、根束霉素(Rhizoctomia solani)；以及软体动物，如利马螺(Lymnaea cubensis)、淡水蜗牛(Biomphalaria glabrata)〔Chataing，B.等，(1998)，Planta Medica，64，31-36；Fewell，A.M.等，(1994)，Phytochemistry，37，1007-1011；Lin，C.N.等，(1990)，J.Nat.Prod.，53，513-516〕。

另外，Chun-Nan Lin等人曾报导，从黄水茄(Solanum incanum)的果实可萃取出茄边碱，经鉴定此化合物的化学结构归属于类固醇性生物碱糖，且此化合物经生物活性测定而被发现对于CCl₄-诱发的肝损害会展示出肝保护作用，且会抑制JTC-26与人类PLC/PRF/5肝肿瘤细胞的生长〔Chun-Nan Lin等(1986)，J.NaturalProd.，53，513-516〕。

Shu-Hui Hsu等人进一步研究茄边碱的细胞毒性作用机制，发现茄边碱会通过细胞程序死亡来提高细胞(诸如人类肝癌细胞Hep3B以及正常皮肤成纤维细胞)的死亡。特别地，已知肿瘤坏死因子受体I(TNF receptor I)涉及到细胞程序死亡的过程，而茄边碱被发现会使该受体产生过度的基因表现(Shu-Hui Hsu等，(1996)，Biochem.Biophys.Res.Comm.，229，1-5)。

Katsuya Fukuhara与Isao Kubo于Phytochemistry，30(2)：685-687，1991中报导：在室温下以甲醇来萃取的黄水茄的成熟果实，继而于减压下移除溶剂并将残余物冷冻干燥，而得到一深棕色萃取物；接而将该萃取物散浮于含有1％甲醇的水中，在移除不溶于水的部分之后，以n-己烷、氯仿、乙酸乙酯以及水来进行分配分离(partitioning)，而得到具有生物活性的水层。该具有生物活性的水层接而予以进行旋转室型逆流层析(rotation locular countercurrent chromatography)与微滴式逆流层析(droplet countercurrent chromatography)，而可得到茄边碱、澳洲茄碱这两种主要化合物。

Ke Hu等于(1999)，Planta Medica 65，35-38中揭示，使用整株的龙葵(Solanumnigrum)，以75％EtOH来作回流处理，并于真空下移除掉溶剂，所得棕色残余物接而以石油醚来作去脂处理，由此所得的萃取物被散浮于水中并以macroresin管柱来作层析，于60％EtOH洗提物中含有活性化合物。该60％EtOH洗提物以水予以分配分离并以n-BuOH来萃取，所得n-BuOH萃取物被引至使用CHCl₃-MeOH-H₂O的硅胶管柱层析以及使用MeOH-H₂O(60∶40)的Sephadex LH-20管柱层析，而得到β₂-茄边碱(β₂-solamargine)、茄边碱与脱半乳糖提果皂(degalactotigonin)。此篇论文没有教示如何从龙葵来获取可直接溶于水的有生物活性的萃取物。

EP 0 020 029 A1揭示，先以一稀酸水溶液(2％或3％乙酸)来萃取Solanumsodomeum(于澳洲又被称为apple of Sodom)植物材料以获得一个第一酸萃取物(水溶液部分)，将该第一酸萃取物与固体残余物分开后再以该稀酸水溶液来萃取固体残余物而得到一个第二酸萃取物(水溶液部分)，在合并该第一酸萃取物与该第二酸萃取物后予以加入碱而得到沉淀物。该沉淀物被溶于沸腾的乙醇之后，再将乙醇移除而得到呈细致粉末的萃取物，并将该萃取物称为BEC 001。该BEC 001萃取物经进一步分离纯化处理可得到多种糖基生物碱(glycoalkaloids)，其中包含茄边碱、澳洲茄碱以及澳洲茄胺的单-与二-糖。

虽然EP 0 020 029 A1提到，可使用水作为BEC 001萃取物的载剂(carrier)，于该案的实施例中，BEC 001萃取物主要是被配成二甲基亚砜(DMSO)溶液，或是配于石腊、锌油膏(zinc ointment)、锌乳霜(zinc cream)与西托马可高(cetomacrogol，一种介面活性剂)内。

再者，根据US 5,958,770的揭示，澳洲茄胺糖(solasodine glycosides)被使用于活体外细胞毒性实验中，而且是先被溶于DMSO内，继而予以稀释成一个5％DMSO溶液来用。此外，被应用于实验当中的澳洲茄胺糖是呈一混合物〔BEC，包含有茄边碱(33％)、澳洲茄碱(33％)连同二-糖与单-糖(34％)〕，或是呈分离组份〔茄边碱、澳洲茄碱、二-糖与单-糖的一混合物，以及澳洲茄胺的糖配基(theaglycones of solasodine)〕。

上述所提到的类固醇生物碱为非水溶性，因此，上述专利前案或文献所揭示的传统方法在作萃取时常以醇蒸馏法来进行，而被萃取出的成份通常会以有机溶剂二甲亚砜来溶解以后再予以分析。由于非水溶性物质不太适合于被直接注射至动物体内，于口服投药时亦可能难为消化道所吸收而无法显出疗效，而使其在药物应用与发展上受到限制。

申请人于试验发现，茄边碱和/或澳洲茄碱的干燥粉末若未经DMSO先处理，绝无法溶解，甚至经由DMSO处理后亦无法完全溶解，尤其以EP 0 020 029 A1所揭示的方法萃取而得的类固醇生物碱并无法溶解于蒸馏水中。再者，茄边碱或澳洲茄碱一旦先以DMSO溶解以后，再加水则可溶解，但茄边碱或澳洲茄碱的浓度如果过高(超过5mg/ml)时，茄边碱或澳洲茄碱仍会结晶析出。另外，DMSO(1％以上)本身对于细胞即有很强的毒杀作用，因此DMSO的浓度必须控制在5％以下。这些事实清楚地显示出，想利用DMSO此一有机溶剂来溶解从茄科植物萃取出的类固醇生物碱时仍有限制存在。

基于以上所述，目前这些类固醇生物碱产物在实际产品的供给上，仅限于化学制剂公司少量且单一批次的生产，而缺乏有效方法来大规模地从茄科植物体萃取出可直接溶于水的类固醇生物碱产物以供商业利用，因而限制此等类固醇生物碱要应用于药剂制造上的发展。

                           发明内容

于是，为了大量生成可供产业应用的且源自于茄属植物的水溶性类固醇生物碱，在第一个方面，本发明提供一种茄属植物的水溶性萃取物，其基本上是由至少60％-90％的澳洲茄碱及茄边碱所构成。该水溶性萃取物可在不加入任何其他溶剂和/或助溶剂下被直接溶于纯水或中性pH值的水中而形成一个黄色澄清透明的水溶液，且溶解度可达2～20mg/ml或以上。

在第二个方面，本发明提供一种药学组合物，其包含有上述水溶性萃取物以作为用以抑制肿瘤/癌细胞(特别是肝癌细胞、肺癌细胞与乳癌细胞)的生长的活性组份。

在第三个方面，本发明提供一种用于制备一种茄属植物的水溶性萃取物的方法，其包含下列步骤：

(a)令一种属于一茄属植物的植物材料进行一个使用一pH值为3～5的酸性水溶液的萃取处理，藉此而得到一个水溶液；

(b)以一碱将得自于步骤(a)的水溶液的pH值调整至pH8～10，藉此，有一沉淀物被形成；

(c)以水清洗得自于步骤(b)的沉淀物，继而予以干燥，藉此而得到一干燥产物；

(d)将得自步骤(c)的干燥产物混合以氯仿，继而加入一适量的100％的醇，藉此而得到一氯仿-醇混合物；

(e)将得自于步骤(d)的氯仿-醇混合物混合以一具一预定的水：醇比值的水/醇溶液，藉此，一具有一以氯仿为主的层以及一非以氯仿为主的层的混合物被形成；

(f)将步骤(e)所形成的混合物内以氯仿为主的层移除，继而加入一适量的水；以及

(g)从步骤(f)所形成的混合物得到一上清液，继而予以干燥，藉此，所形成的干燥产物可被直接溶于水中而形成一个黄色澄清透明的水溶液。

本发明的上述以及其他目的、特征与优点在参照以下的详细说明与较佳实施例和随文检附的附图后会变为明显可知。

                               附图说明

下面结合附图及实施例对本发明进行详细说明，附图中：

图1显示使用从黄水茄萃取而得的水溶性萃取物(25mg)来进行高压液相层析(HPLC)的结果；

图2显示使用从黄水茄萃取而得的水溶性萃取物(25mg)与澳洲茄碱(5mg)的HPLC分析结果；

图3显示使用从黄水茄萃取而得的水溶性萃取物(25mg)与茄边碱(5mg)的HPLC分析结果；

图4显示使用从龙葵萃取而得的水溶性萃取物(25mg)来进行HPLC的结果；

图5显示使用从龙葵萃取而得的水溶性萃取物(25mg)与澳洲茄碱(10mg)的HPLC分析结果；

图6显示使用从龙葵萃取而得的水溶性萃取物(25mg)与茄边碱(10mg)的HPLC分析结果；

图7至图12显示使用不同数量的黄水茄水溶性萃取物来进行HPLC的结果；

图13显示依据图7至图12的结果而估算出的黄水茄水溶性萃取物主成份的标准检量线；

图14至图18显示依据本发明的黄水茄水溶性萃取物在不同的pH值下进行HPLC的结果；

图19显示依据本发明的黄水茄水溶性萃取物以及依据EP 0 020 029 A1所揭示的方法而制得的黄水茄萃取物的粒径分析比较结果；

图20与图21分别显示，取相等重量(50mg)的依据EP 0 020 029 A1所揭示的方法而制得的黄水茄萃取物以及依据本发明的黄水茄水溶性萃取物，用纯水予以溶解后来进行HPLC的结果；

图22至图24分别显示依据本发明的黄水茄水溶性萃取物在不同剂量下对于人类肝癌、肺癌及乳癌细胞的生长抑制效用；

图25显示以基因芯片来分析依据本发明的黄水茄水溶性萃取物对于肺癌细胞的基因调控机制的自动放射显影结果，其中肺癌细胞在以该黄水茄水溶性萃取物(100μg/ml)予以处理2小时以后取出RNA，再以[³²P]-dCTP来进行反转录而制得被标记的cDNA，继而以基因芯片来作杂交检测并以X-光软片来作自动放射显影；

图26显示人类肝癌细胞(A行)、肺癌细胞(B行)及乳癌细胞(C行)在以依据本发明的黄水茄水溶性萃取物予以处理时所产生的形态变化；

图27、图28以及图29分别显示背部移植有人类肺癌细胞的裸鼠，在不予投药依据本发明的黄水茄水溶性萃取物、经由喂食来投药依据本发明的黄水茄水溶性萃取物以及经由腹腔注射来投药依据本发明的黄水茄水溶性萃取物下所观察到的结果，其中各图中所示的每一条曲线各代表一只试验裸鼠的结果；以及

图30显示从本发明的黄水茄水溶性萃取物所得到的澳洲茄碱与茄边碱对于人类肺癌细胞的生长抑制效用。

                       具体实施方式

本发明提供一种萃取自茄属植物的水溶性萃取物，其含有能直接溶于水中并形成一澄清透明的水溶液的类固醇生物碱，因而适合用于药剂与制剂的制造。

特别地，本发明提供一种茄属植物的水溶性萃取物，其基本上是由至少60％-90％的澳洲茄碱及茄边碱所构成。该水溶性萃取物可在不加入任何其他溶剂和/或助溶剂下被直接溶于纯水或中性pH值的水中而形成一个黄色澄清透明的水溶液，且溶解度可达2～20mg/ml或以上。

本发明亦提供一种用于制备该水溶性萃取物的方法，其包含下列步骤：

(a)令一种属于一茄属植物的植物材料进行一个使用一pH值为3～5的酸性水溶液的萃取处理，藉此而得到一个水溶液；

(b)以一碱将得自于步骤(a)的水溶液的pH值调整至pH8～10，藉此，有一沉淀物被形成；

(c)以水清洗得自于步骤(b)的沉淀物，继而予以干燥，藉此而得到一干燥产物；

(d)将得自步骤(c)的干燥产物混合以氯仿，继而加入一适量的100％的醇，藉此而得到一氯仿-醇混合物；

(e)将得自于步骤(d)的氯仿-醇混合物混合以一具一预定的水：醇比值的水/醇溶液，藉此，一具有一以氯仿为主的层以及一非以氯仿为主的层的混合物被形成；

(f)将步骤(e)所形成的混合物内以氯仿为主的层移除，继而加入一适量的水；以及

(g)从步骤(f)所形成的混合物得到一上清液，继而予以干燥，藉此，所形成的干燥产物可被直接溶于水中而形成一个黄色澄清透明的水溶液。

较佳地，使用于该方法步骤(a)中的茄属(Solanum)植物的植物材料先经过切碎处理。

较佳地，使用于该方法步骤(a)中的植物材料是该茄属植物的果实、根、茎、叶当中的至少一者。在本发明的一个较佳具体例中，使用于该方法步骤(a)中的植物材料是该茄属植物的果实。在本发明的另一个较佳具体例中，使用于该方法步骤(a)中的植物材料是整株的该茄属植物。

较佳地，该水溶性萃取物是由一选自于下列所构成的群组中的茄属植物萃取而得：黄水茄(Solanum incanum L.)、印度茄(Solanum indicum)、龙葵(Solanumnigrum)、冬珊瑚(Solanum capsicastrum)、黄果茄(Solanum xanthocarpum)、瓜茄(Solanum melongena)、黄刺茄(Solanum coagulans)、马铃薯(Solanumtunigrum)、撒旦茄(Solanum sodomeum)、陀螺茄(Solanum turburosum)、刺茄(Solanum aculeastrum)、石松茄(Solanum lycocarpum)、喀什亚茄(Solanumkhasianum)、水茄(Solanum suaveolens)、裂叶茄(Solanum uporo)、莴茄(Solanumabutiloides)、西洋茄(Solanum coccineum)、蹄状茄(Solanum unguiculatum)、韧茄(Solanum robustum)、蛇状茄(Solanum anguivi)、小叶茄(Solanum platanifolium)以及美洲茄(Solanum mammosum)。

在本发明的一个较佳具体例中，该水溶性萃取物是由黄水茄萃取而得。在本发明的另一个较佳具体例中，该水溶性萃取物是由龙葵萃取而得。

较佳地，得自于该方法的步骤(a)的该水溶液是藉由在该萃取处理后进行离心或过滤而被获得。

较佳地，于该方法的步骤(a)的萃取处理中所用的酸性水溶液是一含有甲酸、乙酸或盐酸的水性溶液。

较佳地，于该方法的步骤(b)中所用的碱是一含有选自于下列群组中的化合物的碱性水溶液：碱金属的氢氧化物以及氢氧化铵。在本发明的一个较佳具体例中，该碱性水溶液含有氢氧化铵。在本发明的另一个较佳具体例中，该碱性水溶液含有氢氧化钠。

较佳地，得自于该方法的步骤(b)的该沉淀物是藉由在pH值调整后进行离心或过滤而被获得。

较佳地，在该方法的步骤(c)中所进行的干燥处理是选自于一由下列所构成的群组：冷冻干燥处理、喷雾干燥处理、蒸发处理、加热干燥处理，以及此等的一组合。在一较佳具体例中，本发明是以冷冻干燥来进行该干燥处理，这是欲以一低温方式来提高活性组份的安定性与活性。

较佳地，在该方法的步骤(c)中，得自于步骤(b)的沉淀物以水清洗而后予以离心，以去除过量的碱，继而加入蒸馏水，而后再进行该干燥处理。

在该方法的步骤(d)中，对氯仿与醇的用量并无特别要求，只要能将得自步骤(c)的干燥产物溶解即可。在本发明的一较佳具体例中，在该方法的步骤(d)中，醇的使用量不多于氯仿的使用量。

较佳地，使用于该方法步骤(d)与(e)中的醇是选自于一由下列所构成的群组：甲醇、乙醇、丙醇以及此等的组合。在本发明的一个较佳具体例中，使用于该方法步骤(d)与(e)中的醇是甲醇。

较佳地，使用于该方法步骤(e)中的该水/醇溶液具有一水含量不低于所具的醇含量。更佳地，该水/醇溶液的水：醇比值为1∶1。

较佳地，在该方法的步骤(f)中，移除步骤(e)所形成的混合物内的以氯仿为主的层是藉由离心或过滤来进行。

较佳地，在该方法的步骤(g)中，该上清液是藉由将步骤(f)所形成的混合物予以离心或过滤而被获得。

较佳地，在该方法的步骤(g)中所进行的干燥处理是选自于一由下列所构成的群组：冷冻干燥处理、喷雾干燥处理、蒸发处理、减压浓缩、加热干燥处理，以及此等的一组合。在一较佳具体例中，在该方法的步骤(g)中所进行的干燥处理包括减压浓缩与冷冻干燥处理。

如有需要，可以将步骤(g)所得到的干燥产物再次溶于水内，继而予以离心之后，再予以干燥。

本发明所得到的萃取物能直接被溶解于一般食用水或无菌水内，并形成一个黄色澄清透明的溶液。因此，本发明所得到的萃取物是一种真正的水溶性萃取物。

由本案方法所制得的水溶性萃取物基本上是由至少60％-90％的澳洲茄碱及茄边碱所构成。另外，申请人发现到有些因素可能会影响本案方法所得到的水溶性萃取物内的澳洲茄碱与茄边碱的含量与比例。这些因素包括：被用来进行萃取的茄属植物的物种以及使用部位，所用的醇与所用的碱。

例如，使用黄水茄的成熟果实制得的水溶性萃取物，当以HPLC分析时，茄边碱的含量高于澳洲茄碱的含量。另外，当与33％NH₄OH碱性溶液相比较，使用10M NaOH碱性溶液来进行步骤(b)时，所得到的水溶性萃取物内茄边碱的含量会低于澳洲茄碱的含量。再者，当与甲醇相较，使用乙醇来进行本案方法时所得到的水溶性萃取物内，澳洲茄碱与茄边碱的含量会降低，约仅为使用甲醇时的50％。另外，以龙葵来作萃取时，其未成熟果(青绿色)所得到的萃取物内，澳洲茄碱与茄边碱的含量较高，而成熟果实(黑紫色)及其他部位则较少。而且，由龙葵所得到的萃取物内，澳洲茄碱与茄边碱的含量比例不同于从黄水茄所萃取者。因此，熟习此项技术人士可视所需来选用茄属植物的物种与使用部位以及其他操作条件加以修饰之后来生成符合所需的水溶性萃取物。

在本发明的一个较佳具体例中，在步骤(a)中使用一含有乙酸的水性溶液来进行萃取处理，在步骤(b)中使用一含有氢氧化铵的碱性水溶液以使一沉淀物被形成，并且在步骤(d)与(e)中所使用的醇是甲醇。

较佳地，该水溶性萃取物有75％以上是由澳洲茄碱及茄边碱所构成。

较佳地，该水溶性萃取物具有一澳洲茄碱相对于茄边碱的比值是介于0.3∶1.0～1.0∶0.6之间，或者该水溶性萃取物具有一澳洲茄碱相对于茄边碱的比值是介于0.4∶1.0～0.9∶1.0之间。在本发明的一个较佳具体例中，该水溶性萃取物具有一澳洲茄碱相对于茄边碱的比值约为0.7∶1.0。

较佳地，该水溶性萃取物为呈具有纳米级粒径的水溶性颗粒的形式。更佳地，该水溶性萃取物为呈具有一小于1μm的粒径的水溶性颗粒的形式。

依据本发明的水溶性萃取物已被于证实具有抑制肿瘤/癌细胞(特别是肝肿瘤、肺癌与乳癌的癌细胞)的生长的效用，而从本发明的水溶性萃取物所得到的澳洲茄碱与茄边碱亦同样被证实可以抑制肿瘤/癌细胞的生长。因此，本发明亦预期依据本发明的水溶性萃取物还有由其所得到的澳洲茄碱与茄边碱在制备抗肿瘤或抗癌组合物上的应用。

因此，本发明亦提供一药学组合物，其包含一依据本发明的水溶性萃取物，或是由该水溶性萃取物所得到的澳洲茄碱与茄边碱。从该水溶性萃取物进一步纯化而得到的澳洲茄碱以及茄边碱同样地可被直接地溶于水内。

选择性地，本发明的药学组合物可以额外地包含一被广泛地使用于药物制造技术的药学上可接受的载剂。例如，该药学上可接受的载剂可包含一或多种的下列试剂：水、生理盐水、缓冲溶液、分解剂、黏结剂、赋形剂、润滑剂、吸收延迟剂等。

本发明的药学组合物可以呈一合适的剂量形式被非经肠道地或口服地投药。合适的剂量形式包括：无菌的水溶液或分散体，无菌的粉末、锭剂、胶囊、乳霜、油膏等等。较佳地，依据本发明的药学组合物被制造成适于注射用的形式，例如水性注射液、粉末针剂(powder injection)、注射用冻干产品(lyophilization product for injection)等形式。

选择性地，本发明的药学组合物可被单独地投药，或是组合以一个额外的抗肿瘤/抗癌剂〔譬如丝裂霉素、阿霉素、放线菌素、二氯二胺铂(cis-platin)等〕来投药。

依据本发明的药学组合物的投药剂量与投药次数会视下列因素而变化：要被治疗的疾病的严重性，投药途径，以及要被治疗的个体的体重、年龄、身体状况与反应。一般而言，依据本发明的药学组合物的每日投药剂量通常是2至6mg/Kg体重，呈单一剂量或是分成数个剂量的形式，且可被口服地或非经肠道地投药。

本发明将参照下面的实施例来作更详细的说明，该等实施例被提供是为达例示说明的目的，而不意欲用来限制本发明的范围。

实施例1.水溶性萃取物的制备

称取500克的黄水茄成熟果实，在加入1000ml的纯水后进行绞碎，并对所形成的水性混合物予以逐滴地加入99.5％的乙酸，以将所形成的水性混合物的pH值调整至4.0，然后室温下振摇萃取历时12小时。之后，将水性混合物离心而得到一上清液，予以逐滴地加入33％NH₄OH碱性水溶以将上清液的pH值调整至9.0，此时会有沉淀物析出。于4,500rpm(Beckman Coulter，Avanti J-25，JA-14 Rotor)下进行离心而得到一沉淀物，以水清洗并再于4,500rpm下离心，以去除残留的碱性溶液。将所得到的沉淀物悬浮于蒸馏水中，予以冷冻干燥(Virtis，Freezemobile 12ES)后可得5g的干燥粉末。此处所得到的干燥粉末仅能悬浮于水溶液中，而不能或是仅能微量地直接溶于水。

为制备能直接溶于水的萃取物，将上面所得到的干燥粉末称取2克，以50ml试剂级的氯仿予以溶解，继而加入40ml的100％甲醇并予以振摇以形成一均匀悬浮溶液。接着，藉由离心(4,500rpm)或过滤后而取得一上清液，予以加入70ml的甲醇∶水(1∶1)并予以混合振摇。所形成的混合物在12,000rpm下予以离心历时10分钟，取上清液再予以添加120ml的蒸馏水并混合振摇，此时上清液将稍变混浊，再于12,000rpm下进行离心历时10分钟以去除被析出的沉淀物。所得到的上清液于55℃下进行减压浓缩以去除甲醇，继而予以冷冻干燥，而得到干燥粉末。

于此阶段所得到的干燥粉末可直接以蒸馏水溶解，并形成一澄清透明的淡黄色溶液。若溶液仍有些许未完全溶解的沉淀时，可再令其于12,000rpm下离心历时10分钟以移除沉淀物，得到的上清液不需经减压浓缩，可直接冷冻干燥即可得到水溶性干燥粉末。

一般而言，每500克的黄水茄果实可萃取得约800mg的水溶性干燥粉末。当以HPLC分析时，该水溶性干燥粉末内所含主要成份是茄边碱与及澳洲茄碱，其中茄边碱所占比例高于澳洲茄碱(参见下面实施例2与图1)。

关于上述的制备过程，可以另择地将果实直接置于3％或5％的1000ml乙酸水溶液内并进行切碎。另外，所形成的水性混合物可于50℃下进行振摇历时5小时，或于80℃下进行振摇历时2小时，以替代于室温下振摇该水性混合液历时12小时的步骤。此外，可另择地使用氢氧化钠水溶液来替代上述所用的NH₄OH水溶液。

实施例2.水溶性萃取物的成份鉴定

为了确认依据本发明所获得的水溶性萃取物内含有何种主要成份，以高压液相层析(HPLC)来进行成份分析。

实验方法：

于此实施例中，使用的高压液相层析仪(HPLC)为Agilent Technologyies(Waldbronn，Germany)，1100机型；使用的管柱为LiChroCART 250-4 Lichropher100RP-18e(5μM)，长度：250mm×4mm；流动相：60％乙腈/40％二次蒸馏水(pH＝2.8)；流速被控制为1ml/min。另外，于实验中所用的澳洲茄碱及茄边碱的标准品是由高雄医学大学药学系的林忠男教授所慷慨提供，且该二标准品是根据Gan，K.H.，Lin，C.N.和Won，S.J.(1993)，Journal of Natural Products56，15-21中所揭示的纯化方法而被制得。

依据实施例1所示的制备方法，以黄水茄以及龙葵的果实而分别制得水溶性萃取物，取适当量溶于纯水后，配合下面条件来进行HPLC分析：

1.以黄水茄水溶性萃取物(25μg)、黄水茄水溶性萃取物(25μg)+澳洲茄碱(5μg)以及黄水茄水溶性萃取物(25μg)+茄边碱(5μg)来进行HPLC；

2.以龙葵水溶性萃取物(25μg)、龙葵水溶性萃取物(25μg)+澳洲茄碱(10μg)以及龙葵水溶性萃取物(25μg)+茄边碱(10μg)来进行HPLC；以及

3.取50μg、40μg、30μg、20μg、10μg以及5μg的黄水茄水溶性萃取物来进行HPLC分析。

结果：

图1显示黄水茄果实的水溶性萃取物的HPLC结果，而对照图2与图3，从滞留期间来判断，可知图1中最先出现的波峰应是澳洲茄碱，而第二个波峰应是茄边碱，而且茄边碱的含量要高于澳洲茄碱的含量。

参见图4至图6，从HPLC分析结果可见，龙葵果实的水溶性萃取物同样会出现两个对应于澳洲茄碱与茄边碱的波峰。但是，与黄水茄果实的水溶性萃取物有所不同的是，在龙葵果实的水溶性萃取物内，澳洲茄碱的含量要高于茄边碱的含量。

此外，从图1至图3以及图4至图6可见，根据本发明所得到的水溶性萃取物不含有澳洲茄胺，而显然不同于EP 0 020 029 A1所得到的萃取物。

图7至图12显示以不同数量(75mg、50mg、40mg、30mg、20mg、10mg)的黄水茄水溶性萃取物来进行HPLC分析的结果，可发现黄水茄水溶性萃取物当中所含两种主要成份的峰值会随着水溶性萃取物的使用剂量而呈现一规则性消长。

至于澳洲茄碱及茄边碱的含量比例，可依据所得到的HPLC洗提图形，藉由电脑软件(Agilent ChemStation Integrator Algorithm)来作自动积分估算，其中所示波形若有稍微尖锐或圆柱时，可能是受植物果实的成熟度与季节因素所影响。申请人曾以黄水茄水溶性萃取物来进行26次的估算，而得到澳洲茄碱相对于茄边碱的比值约在0.3∶1.0～1.0∶1.0之间，且大多数的比值是落在0.4∶1.0～0.9∶1.0之间。

申请人从所得实验结果发现，本发明所得到的水溶性萃取物有至少60％至95％(较佳为75％以上)是由澳洲茄碱及茄边碱这两种主要成份所构成。

同时在HPLC分析时，申请人也发现澳洲茄碱及茄边碱这两种主成份的含量与比例会随着所使用的剂量高低而呈线性消长关系。图13显示取7次不同剂量的黄水茄水溶性萃取物，各进行HPLC分析3次，并以所含两种主要成份的峰值积分面积来计算平均值±标准偏差，并以线性回归所绘制出的检量线。图13所示的结果清楚显示，澳洲茄碱及茄边碱这两种主要成份会随着剂量高低而呈线性消长关系。因此，澳洲茄碱及茄边碱这两种主要成份应可作为依据本发明的水溶性萃取物的品质控制指标成分。

另外，可利用上述HPLC条件而从本发明的水溶性萃取物分离出经进一步纯化的可直接溶于水的茄边碱与澳洲茄碱。

实施例3.pH值对于水溶性萃取物的洗提影响

实验方法：

为了解pH值对于本发明的水溶性萃取物的洗提影响，使用相同于实施例2的HPLC仪器，以及使用依据实施例1所示的制备方法而制得的黄水茄的水溶性萃取物(40μg)，并配合下面条件来进行HPLC分析：

1.使用的管柱为LiChroCART 250-4 Lichropher 100RP-18e(5μM)，长度：250mm×4mm；以及

2.流动相：60％乙腈/40％二次蒸馏水，并将pH值分别设为pH 2.3、pH 2.5、pH 2.8、pH 3.0、与pH 3.2。

结果：

图14至图18显示黄水茄的水溶性萃取物在不同pH值下进行HPLC分析的结果。由这些图可看出，该等水溶性萃取物的主成份会随着移动相pH值升高而延长其滞留时间，而虽然最后两个主成份的洗提图形(elution profiles)会稍微改变，但基本上还是维持两个主成份的图形。

实施例3.水溶性萃取物的粒径比较分析

本实施例进一步比较依据本发明所制备的黄水茄水溶性萃取物以及依据EP 0 020 029 A1的实施例2所揭示的方法而制得的黄水茄萃取物在粒径上的差异。

实验方法：

将50mg的依据本发明所制备的黄水茄水溶性萃取物以及50mg的依据EP 0 020 029 A1的实施例2所揭示的方法而制得的黄水茄萃取物各自溶于50毫升的蒸馏水中，并利用一粒径分析仪(Beckman Coulter LS 230，CoulterCorporation，Miami，USA)来进行粒径分析。

结果

参见图19，申请人根据EP 0 020 029 A1的实施例2所揭示的方法而制得的黄水茄萃取物，其颗粒平均大小为238.2μm，而颗粒分布是在1.8μm至1500μm之间，且有许多沉淀物会出现于水溶液中而无法与水相溶(参见图19的上方)。相对地，依据本发明所制备的黄水茄水溶性萃取物，其颗粒平均大小为0.418μm，而颗粒分布是在0.28μm至0.65μm之间，并可完全地溶解于水内(参见图19的下方)。

实施例4.水溶性萃取物的溶解度比较

本实施例进一步比较，依据本发明所制备的黄水茄水溶性萃取物以及依据EP 0 020 029 A1的实施例2所揭示的方法而制得的黄水茄萃取物在水中的溶解度的差异。

实验方法

将5mg的依据本发明所制备的黄水茄水溶性萃取物以及5 mg的依据EP 0020 029 A1实施例2所揭示的方法而制得的黄水茄萃取物各自溶于2ml的蒸馏水中，在12,000rpm下进行离心以取得上清液，然后各取出20μl并依据上述实施例2中所述方法来进行HPLC分析。

结果：

图20与图21分别显示，依据EP 0 020 029 A1的实施例2所揭示的方法而制得的黄水茄萃取物(图20)以及依据本发明所制备的黄水茄水溶性萃取物(图21)在水中的溶解度。由这两个图可看出，依据本发明所制备的黄水茄水溶性萃取物在水中显示具有明显较佳的溶解度。

以上实施例与图式的结果清楚显示，依据本发明所获得的茄属植物的水溶性萃取物，相较于先前技术所制得的萃取物，确实可溶于水中且形成一澄清透明的水溶液。这或有可能是因为依据本发明所获得的茄属植物的水溶性萃取物可以呈具有纳米级粒径(特别是小于1μm)的水溶性颗粒的形式。由此可预期，依据本发明所获得的茄属植物的水溶性萃取物适合供应用于制造含有类固醇生物碱的药剂，特别是用于癌症治疗的制剂。

因此，为证实依据本发明所获得的茄属植物的水溶性萃取物的生物活性，于下面以依据实施例l所制备的黄水茄水溶性萃取物来进行药理试验。

药理试验1.活体外抗癌活性分析

为测定依据本发明所获得的茄属植物的水溶性萃取物是否具有抗癌活性，申请人选用人类最主要的癌症细胞作为试验对象，其中包含：肝癌细胞(Hep3B)、肺癌细胞(H441)及乳癌细胞(MCF-7)，其中肝癌细胞(Hep3B)与肺癌(H441)细胞是购自于美国典型培养物保藏中心〔ATCC，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108 USA〕，而乳癌细胞(MCF-7)是购自于食品工业发展研究所(台湾省300新竹市食品路331号)。

实验方法：

肝癌细胞被培养于杜贝可氏改良的依格氏培养基(Dulbecco′s ModifiedEagle′s medium，DMEM)内，而肺癌细胞及乳癌细胞被培养于RPMI-1640培养基内，且上述培养基内添加有10％胎牛血清以及40mg/L庆大霉素。

对于癌细胞的毒性测试是使用一种四唑盐分析法(tetrazolium salt assay，MTS)(Mosmann.T.，1983，Immmunol.Meth.，65，55-63)，其是依据制造商的操作程序(Cell Titer 96TM AQ(Promega，Madison，USA))来进行细胞可活性的比色测定(colomertric determination of cell viability)。

将定量的细胞(1×10⁴细胞/孔)培养在96-孔培养皿内，并在37℃、5％CO₂培养箱中至少培养16小时以上。接着，将不同剂量的黄水茄水溶性萃取物溶于无菌的注射用水中，再分别予以添加至各孔的癌细胞培养液中。待作用12小时后，每孔予以加入20μl的MTS溶液并容许反应3小时。反应完成后，使用酶联免疫免疫分析仪(ELISA reader 312e，Bio-TEK)并于波长490nm下测定各孔的吸光值。所有试验数据是以3次实验的平均值±标准偏差来表示。

结果：

图22、图23以及图24分别显示依据本发明的黄水茄水溶性萃取物对于肝癌细胞(Hep3B)、肺癌细胞(H441)以及乳癌(MCF-7)的抑制效用。结果显示，依据本发明的黄水茄水溶性萃取物能有效地抑制这三种癌细胞的生长。

药理试验2.以基因芯片来分析依据本发明的黄水茄水溶性萃取物对于肺癌细胞的基因调控机制

为了解依据本发明的黄水茄水溶性萃取物对于癌细胞基因的作用机制，以提供癌症治疗上一有用研发方向，并能有助于致癌因子研究以及发展一有效抗癌药物，本实验进一步利用基因芯片技术来分析依据本发明的水溶性萃取物对于癌细胞基因的调控情形。

在此实验中，申请人使用一种商业上可购得的基因阵列(SuperArray Inc.，Bethesda，MD，USA)来分析依据本发明的水溶性萃取物对于肺癌细胞(H441)的基因调控情形。

首先，将经过本发明的黄水茄水溶性萃取物(100μg/ml)作用两小时的肺癌细胞(实验组)以及未经萃取物处理的对照组，分别萃取出RNA，并经由使用[³²P]-dCTP来进行反转录而制得被标记的cDNAs。所获得的经标记的cDNAs可作为标记探针，并被用于与位在该基因阵列(SuperArray Inc.，Bethesda，MD，USA)上的基因进行杂交反应。反应后的基因阵列以X-光软片来进行自动放射显影。

结果：

参见图25所示，当肺癌细胞以本发明的黄水茄水溶性萃取物予以作用两小时后，与促进癌细胞死亡相关的″肿瘤坏死因子受体I(Tumor necrosis factorreceptor I)″以及″肿瘤坏死因子受体相关因子-1(TNF receptor-associated factor-1，TRAF-1)″的基因表现被明显增高，而防止细胞死亡的″细胞凋亡蛋白质2的抑制剂(Inhibitor of apoptosis protein 2，IAP-2)″以及″细胞凋亡抑制剂4(Apoptosisinhibitor 4，API-4)″等基因的表现则受到该萃取物的作用而降低。由这些结果看来，本发明的黄水茄水溶性萃取物能显著地启动肺癌细胞的瘤坏死因子受体I(TNFR-I)以及肿瘤坏死因子受体相关因子-1(TRAF-1)的基因表现。

药理试验3.本发明的黄水茄水溶性萃取物对于癌细胞的细胞周期的影响

本实验利用流式细胞分析仪(Flow cytometry，″FACScan″，Becton DickinsonCorp.)来分析癌细胞在本发明的黄水茄水溶性萃取物作用之前、之后的细胞周期变化。

实验方法：

首先，将1×10⁶癌细胞培养于35mm培养皿中历时16小时，之后，予以加入本发明的黄水茄水溶性萃取物(30μg/ml)，各实验组的作用时间分别为0、1、3、5、8小时。待各实验组达其作用时间后，再各别地以一倍浓度的胰蛋白酶将细胞打下(上清液与培养液须一并收集)，再将打下的细胞置于15ml离心管中，在1000rpm下进行离心历时5分钟后，倒掉上清液。在加入约300μl的1×PBS混合均匀后，取300μl置于微离心管内，加入700μl无水乙醇将细胞固定。被酒精固定后的细胞被置于4℃冰箱内历时30分钟以上，之后，于4℃下以1200rpm转速来进行离心历时5分钟。离心完后，吸取上清液并轻混合均匀。对该上清液予以加入445μl的1×PBS使细胞混合均匀后，再加入5μl的核糖核酸酶(RNase，10mg/ml)以将RNA破坏分解。接着加入50μl的10％Triton-X100将细胞打洞，之后将细胞置于37℃培养箱内反应历时1小时，然后予以离心。吸取上清液并加入495μl的PBS，混合均匀后，再加入5μl的碘化丙锭(propidium iodide，5mg/ml)来进行DNA染色，并于4℃的避光环境下进行反应历时15-30分钟，再以过滤膜过滤并进行分析。

细胞周期的测定：

使用流式细胞仪(Beckman-Coulter FACScan)，将上述附着于过滤膜上的细胞均匀悬浮于1×PBS溶液中，并使用一为100个细胞/秒的速率将细胞导入至流式细胞仪中，每次分析10,000个细胞。让细胞被穿过半径为75μm的小孔，而产生与体积同比例的电流脉冲讯号。细胞以氩离子的雷射光束488nm激发而发出萤光。所得资料配合Winmdi软体来分析细胞内的DNA含量多寡并观察细胞周期。

结果：

表1显示肝癌细胞(Hep3B)、肺癌细胞(H441)以及乳癌(MCF-7)在经过本发明的黄水茄水溶性萃取物作用后所发生的细胞周期变化，其中Sub-G1波增高的特征代表癌细胞受到该水溶性萃取物作用而进行细胞凋亡。

从表1可见，在1小时内各种癌细胞的细胞周期的Sub-G1波有显著增加，而使用高剂量的萃取物时更会使癌细胞因胞膜破裂而死，同时随着萃取物作用时间增加而更强。这些结果显示，本发明所提供的黄水茄水溶性萃取物确实可以启动这三种癌细胞的细胞凋亡作用机制。

表1.本发明的黄水茄水溶性萃取物对于肝癌细胞(Hep3B)、肺癌细胞(H441)以及乳癌(MCF-7)的细胞周期的影响

            Sub-G1              G0/G1             S                  G2/M

时间(hr)    平均值±S.D    ％   平均值±S.D ％    平均值±S.D ％     平均值±S.D％

肝癌细胞

0           5.5±0.2       100  58.8±0.3   100   17.4±0.3   100    18.0±0.5  100

1           38.3±0.6      246  31.9±0.9   64    15.1±0.1   87     14.6±0.4  81

3           69.5±0.4      446  15.4±0.3   31    9.9±0.2    57     5.6±0.2   31

5           90.7±0.7      581  4.3±0.3    9     3.6±0.7    21     1.5±0.2   8

8           99.1±0.1      635  0.6±0.1    1     0.3±0.0    2      0.1±0.0   1

肺癌细胞

0           9.4±0.2       100  43.3±0.3   100   7.1±0.1    100    40.8±0.1  100

1           46.5±1.7      441  23.6±0.4   54    11.8±0.1   168    18.5±1.2  45

3           61.8±0.7      660  13.1±1.4   30    9.8±0.7    139    15.0±0.7  36

5           96.6±0.2      1030 2.3±0.1    5     0.8±0.0    11     0.4±0.0   1

8           97.2±0.6      1037 1.9±0.4    4     0.4±0.4    6      0.4±0.5   1

乳癌细胞

0           2.9±0.6       100  66.8±1.2   100   13.1±0.6   100   18.2±0.4  100

1           12.0±0.8      441  71.2±0.4   107   6.4±0.6    49     10.7±1.0  59

3           77.1±0.4      2633 18.7±1.0   27    2.4±0.3    18     1.3±0.2   7

5           92.0±0.3      3141 6.8±0.3    10    0.8±0.0    6      0.4±0.0   2

8           97.1±0.4      3313 2.5±0.3    4     0.2±0.0    2      0.2±0.1   1

药理试验4.本发明的黄水茄水溶性萃取物对于癌细胞的细胞形态的影响

为研究癌细胞在受到本发明的黄水茄水溶性萃取物作用后所产生的细胞形态变化，本实验进一步以光学显微镜来观察被苏木精染色的癌细胞的形态变化。

实验方法：

首先，将经过本发明的黄水茄水溶性萃取物(30μg/ml)作用历时1、3、5、8小时的肝癌、肺癌及乳癌细胞，取出适当的细胞数，使用细胞切片离心机Cytospin以800rpm的转速将细胞离心历时10分钟以作成细胞切片。接着，以4％的低聚甲醛予以作用历时30分钟以使细胞固定。细胞切片以苏木精来进行细胞核染色，再以稀释的酒精由70％、80％、90％、95％至100％的无水乙醇来退除过剩的染料。接着将细胞切片置于二甲苯内以进行脱水处理，并以盖玻片与封片胶将玻片封盖，并以光学显微镜(Olympus CX-40)于400倍放大倍率下来观察并照相记录细胞形态的变化。

结果：

图26显示，在以本发明的黄水茄水溶性萃取物(30g/ml)作用前以及作用历时1、3、5、8小时后，三种人类癌细胞的形态学变化，其中A行是肝癌细胞(Hep3B)、B行是肺癌细胞(H441)以及C行是乳癌细胞(MCF-7)。对照组为未经萃取物作处理的细胞，而箭头所指代表典型的细胞形态学变化。

从图26可见，经本发明的黄水茄水溶性萃取物作用的三种癌细胞，在1小时即可观察到细胞核缩小、染色质凝聚以及细胞凋亡小体的产生，同时随著作用时间的增长，该等癌细胞的形态变化愈为明显，最后细胞膜破裂。

由于Sub-G1波、染色质凝聚以及细胞凋亡小体的产生均是细胞凋亡的典型特征，本药理试验与上面药理试验3的结果清楚显示依据本发明的水溶性萃取物能启动癌细胞进行细胞凋亡的机制，而使癌细胞死亡。

药理试验5.本发明的黄水茄水溶性萃取物的活体内动物模型试验

为确认依据本发明的水溶性萃取物能否于活体内产生抗癌效用，本实施例进一步以裸鼠来进行活体内动物模型试验。

实验方法：

首先，以皮下注射的方式将人类肺癌细胞H441(2×10⁷个细胞)植入至裸鼠(BABL/c-nu-nu，8周大，体重约20-25g)的背部内，待肿瘤形成且开始生长(约需10天)后，将形成有肿瘤的裸鼠随机分组(每一组约有6-7只裸鼠)。

对于注射组的裸鼠，使用0.8mm的注射针以每天一次腹腔注射已溶于水内的220μg的水溶性萃取物，连续注射3天再停药4天，每隔二天纪录裸鼠体重，并以测微器(micrometer)来量测裸鼠背部的肿瘤大小变化，再继续进行下一个疗程，并持续观察二个月以上。肿瘤大小的计算方式：肿瘤尺寸＝长度×宽度×(高度/2)。

对于口服组，采用喂食器对每只裸鼠以口服投予溶于水内的水溶性萃取物(600μg)，每天喂食一次，连续喂食5天后再停药2天。采相同于注射组的方式来记录裸鼠体重以及量测肿瘤大小。持续喂食并观察二个月以上。肿瘤大小的计算方式与注射组相同。

结果：

图27、图28以及图29分别显示背部移植有人类肺癌细胞的裸鼠，在不予投药依据本发明的黄水茄水溶性萃取、以喂食来投药依据本发明的黄水茄水溶性萃取物以及以腹腔注射来投药依据本发明的黄水茄水溶性萃取物所观察到的结果，其中图27代表对照组(6只裸鼠)、图28代表口服实验组(7只裸鼠)以及图29代表注射实验组(7只裸鼠)的肿瘤变化情形。

从图27、图28以及图29所示的结果可看出，未予以投药依据本发明的黄水茄水溶性萃取物的对照组裸鼠体内肿瘤成长速度快速，于1个月约可成长为原来大小的6倍；被口服投予依据本发明的黄水茄水溶性萃取物的裸鼠体内的肿瘤则大部分缩小或消失，有少数虽稍微成长，但成长速度远低于对照组；而被腹腔内注射以依据本发明的黄水茄水溶性萃取物的裸鼠体内的肿瘤则完全缩小或消失。这些结果显示，以口服或腹腔内注射方式来投药依据本发明的水溶性萃取物均可有效地使被转植在裸鼠体内的肿瘤生长减缓、尺寸缩小甚而消除，而且腹腔内注射投药的效果较口服效果更佳。

药理试验6.从本发明的黄水茄水溶性萃取物进一步纯化而得的澳洲茄碱与茄边碱的活体外抗癌试验

本实验进一步研究，利用HPLC而从本发明的黄水茄水溶性萃取物得到的经纯化的澳洲茄碱与茄边碱的生物活性。

实验方法：

参照上述实施例2中所述HPLC方法，可从根据本发明的黄水茄水溶性萃取物中进一步分离纯化出澳洲茄碱与茄边碱这两个化合物，而且它们同样地可被直接地溶于水中。

参照药理试验1，依据四唑盐分析法来进行细胞毒性测试。以不同剂量的从本发明的黄水茄水溶性萃取物所得到的经纯化的澳洲茄碱以及茄边碱来分别处理人类肺癌细胞(H441)历时12小时，而后依据制造商的操作程序〔CellTiter 96 TM AQ(Promega，Madison，USA)〕来进行细胞可活性的比色测定。实验数据是以3次实验的平均值±标准偏差来表示。

结果：

图30显示从本发明的黄水茄水溶性萃取物所纯化出的澳洲茄碱与茄边碱对于人类肺癌细胞的生长抑制效用。从图30所示结果可见，从本发明的黄水茄水溶性萃取物所纯化出的澳洲茄碱及茄边碱分别具有显著的抗癌活性。

综合以上的实验结果，申请人已成功地得到茄属植物的水溶性萃取物，同时建立该水溶性萃取物于萃取过程中的科学化分析条件并找出主要成份，而能有效地做到品质管控。此外，依据本发明的水溶性萃取物被证实具有抑制癌细胞的生长以及启动癌细胞的自然细胞凋亡机制的活性，而充分显示依据本发明的水溶性萃取物在抑制癌细胞的生长与癌细胞的检测上的发展。

于本说明书中被引述的所有专利和文献以其整体被并入本案作为参考资料。若有所冲突时，本案详细说明(包含界定在内)将占上风。

Claims (59)

1.一种茄属植物的水溶性萃取物，其特征在于：

所述水溶性萃取物基本上是由至少60％-90％的澳洲茄碱以及茄边碱所构成。

2.如权利要求1所述的水溶性萃取物，其特征在于：

所述水溶性萃取物是由一选自于下列所构成的群组中的茄属植物萃取而得：黄水茄、印度茄、龙葵、冬珊瑚、黄果茄、瓜茄、黄刺茄、马铃薯、撒旦茄、陀螺茄、刺茄、石松茄、喀什亚茄、水茄、裂叶茄、莴茄、西洋茄、蹄状茄、韧茄、蛇状茄、小叶茄、美洲茄以及它们的组合。

3.如权利要求2所述的水溶性萃取物，其特征在于：

所述水溶性萃取物是由黄水茄萃取而得。

4.如权利要求2所述的水溶性萃取物，其特征在于：

所述水溶性萃取物是由龙葵萃取而得。

5.如权利要求1所述的水溶性萃取物，其特征在于：

所述水溶性萃取物是采用包含下列步骤的方法制得：

(a)令一种属于一茄属植物的植物材料进行一个使用一pH值为3～5的酸性水溶液的萃取处理，藉此而得到一个水溶液；

(b)以一碱将得自于步骤(a)的水溶液的pH值调整至pH8～10，形成一沉淀物；

(c)以水清洗得自于步骤(b)的沉淀物，继而予以干燥，得到一干燥产物；

(d)将得自步骤(c)的干燥产物混合以氯仿，继而加入一适量的100％的醇，得到一氯仿-醇混合物；

(e)将得自于步骤(d)的氯仿-醇混合物混合以一具一预定的水∶醇比值的水/醇溶液，形成具有以氯仿为主的层以及非以氯仿为主的层的混合物；

(f)将步骤(e)所形成的混合物内以氯仿为主的层移除，继而加入一适量的水；以及

(g)从步骤(f)所形成的混合物得到一上清液，继而予以干燥，藉此，所形成的干燥产物可直接溶于水中而形成一个黄色澄清透明的水溶液。

6.如权利要求5所述的水溶性萃取物，其特征在于：

用于所述方法步骤(a)中的植物材料是该茄属植物的果实、根、茎、叶当中的至少一者。

7.如权利要求6所述的水溶性萃取物，其特征在于：

用于所述方法步骤(a)中的植物材料是该茄属植物的果实。

8.如权利要求6所述的水溶性萃取物，其特征在于：

用于该方法步骤(a)中的植物材料是整株的该茄属植物。

9.如权利要求5所述的水溶性萃取物，其特征在于：

用于该方法步骤(a)中的茄属植物的植物材料先经过切碎处理。

10.如权利要求5所述的水溶性萃取物，其特征在于：

得自于该方法步骤(a)的该水溶液是藉由在该萃取处理后进行离心而获得。

11.如权利要求5所述的水溶性萃取物，其特征在于：

在该方法步骤(a)的萃取处理中所用的酸性水溶液是一含有甲酸、乙酸或盐酸的水性溶液。

12.如权利要求5所述的水溶性萃取物，其特征在于：

在该方法的步骤(b)中所用的碱是一含有选自于下列群组中的化合物的碱性水溶液：碱金属的氢氧化物以及氢氧化铵。

13.如权利要求12所述的水溶性萃取物，其特征在于：

在该方法的步骤(b)中所用的碱是一含有氢氧化铵的碱性水溶液。

14.如权利要求12所述的水溶性萃取物，其特征在于：

在该方法的步骤(b)中所用的碱是一含有氢氧化钠的碱性水溶液。

15.如权利要求5所述的水溶性萃取物，其特征在于：

在该方法的步骤(b)中，该沉淀物是藉由在pH值调整后进行离心而获得。

16.如权利要求5所述的水溶性萃取物，其特征在于：

在该方法的步骤(c)中所进行的干燥处理是选自于一由下列所构成的群组：冷冻干燥处理、喷雾干燥处理、蒸发处理、加热干燥处理，以及此等的一组合。

17.如权利要求5所述的水溶性萃取物，其特征在于：

在该方法的步骤(c)中，得自于步骤(b)的沉淀物在以水清洗后被加入水，接而被冷冻干燥以得到该干燥产物。

18.如权利要求5所述的水溶性萃取物，其特征在于：

用于该方法步骤(d)与步骤(e)中的醇是选自于一由下列所构成的群组：甲醇、乙醇、丙醇以及此等的组合。

19.如权利要求5所述的水溶性萃取物，其特征在于：

在该方法的步骤(f)中，移除步骤(e)所形成的混合物内的以氯仿为主的层是藉由离心来进行。

20.如权利要求5所述的水溶性萃取物，其特征在于：

在该方法的步骤(g)中所进行的干燥处理是选自于一由下列所构成的群组：冷冻干燥处理、喷雾干燥处理、蒸发处理、加热干燥处理，以及此等的一组合。

21.如权利要求1所述的水溶性萃取物，其特征在于：

该水溶性萃取物是呈具有一纳米级粒径的水溶性颗粒的形式。

22.如权利要求20所述的水溶性萃取物，其特征在于：

该水溶性萃取物是呈具有一小于1μm的粒径的水溶性颗粒的形式。

23.如权利要求1所述的水溶性萃取物，其特征在于：

该水溶性萃取物是由75％以上的澳洲茄碱及茄边碱所构成。

24.如权利要求1所述的水溶性萃取物，其特征在于：

该水溶性萃取物具有一澳洲茄碱相对于茄边碱的比值为介于0.3∶1.0～1.0∶0.6之间。

25.如权利要求1所述的水溶性萃取物，其特征在于：

该水溶性萃取物具有一澳洲茄碱相对于茄边碱的比值为介于0.4∶1.0～0.9∶1.0之间。

26.如权利要求1所述的水溶性萃取物，其特征在于：

该水溶性萃取物具有一澳洲茄碱相对于茄边碱的比值约为0.7∶1.0。

27.如权利要求1所述的水溶性萃取物，其特征在于：

该水溶性萃取物具有一水溶解度为2～20mg/ml或以上。

28.如权利要求1至27中任一项所述的水溶性萃取物，其特征在于：

该水溶性萃取物可用于制备一种能够抑制肿瘤/癌细胞的生长的药物。

29.一种药学组合物，其特征在于：

该药学组合物包含有一如权利要求1至27中任一项所述的水溶性萃取物，以及选择性地一药学上可接受的载剂。

30.一种用于抑制肿瘤/癌细胞的生长的药学组合物，其特征在于：

该药学组合物包含有一如权利要求1至27中任一项所述的水溶性萃取物，以及选择性地一药学上可接受的载剂。

31.一种用于制备一种茄属植物的水溶性萃取物的方法，其特征在于该方法包含下列步骤：

(a)令一种属于一茄属植物的植物材料进行一个使用一pH值为3～5的酸性水溶液的萃取处理，得到一个水溶液；

(b)以一碱将得自于步骤(a)的水溶液的pH值调整至pH8～10，形成沉淀物被形成；

(c)以水清洗得自于步骤(b)的沉淀物，继而予以干燥，得到一干燥产物；

(d)将得自步骤(c)的干燥产物混合以氯仿，继而加入一适量的100％的醇，得到一氯仿-醇混合物；

(e)将得自于步骤(d)的氯仿-醇混合物混合以一具一预定的水∶醇比值的水/醇溶液，形成一具有以氯仿为主的层以及非以氯仿为主的层的混合物；

(f)将步骤(e)所形成的混合物内以氯仿为主的层移除，继而加入一适量的水；以及

(g)从步骤(f)所形成的混合物得到一上清液，继而予以干燥，藉此，所形成的干燥产物可被直接溶于水中而形成一个黄色澄清透明的水溶液。

32.如权利要求31所述的方法，其特征在于：

用于所述步骤(a)中的该茄属植物的植物材料先经过切碎处理。

33.如权利要求31所述的方法，其特征在于：

用于所述步骤(a)中的植物材料是该茄属植物的果实、根、茎、叶当中的至少一者。

34.如权利要求31所述的方法，其特征在于：

用于所述步骤(a)中的植物材料是该茄属植物的果实。

35.如权利要求31所述的方法，其特征在于：

用于所述步骤(a)中的植物材料是整株的该茄属植物。

36.如权利要求31所述的方法，其特征在于：

用于所述步骤(a)中的植物材料是属于一选自于由下列所构成的群组中的茄属植物：黄水茄、印度茄、龙葵、冬珊瑚、黄果茄、瓜茄、黄刺茄、马铃薯、撒旦茄、陀螺茄、刺茄、石松茄、喀什亚茄、水茄、裂叶茄、莴茄、西洋茄、蹄状茄、韧茄、蛇状茄、小叶茄、美洲茄以及此等的组合。。

37.如权利要求36所述的方法，其特征在于：

用于所述步骤(a)中的该茄属植物的植物材料是黄水茄。

38.如权利要求36所述的方法，其特征在于：

用于所述步骤(a)中的该茄属植物的植物材料是龙葵。

39.如权利要求31所述的方法，其特征在于：

得自于所述步骤(a)的该水溶液是藉由在该萃取处理后进行离心而被获得。

40.如权利要求31所述的方法，其特征在于：

在步骤(a)的萃取处理中所用的酸性水溶液是一含有甲酸、乙酸或盐酸的水性溶液。

41.如权利要求31所述的方法，其特征在于：

在所述步骤(b)中所用的碱是一含有选自于下列群组中的化合物的碱性水溶液：碱金属的氢氧化物以及氢氧化铵。

42.如权利要求41所述的方法，其特征在于：

在所述步骤(b)中所用的碱是一含有氢氧化铵的碱性水溶液。

43.如权利要求41所述的方法，其特征在于：

在所述步骤(b)中所用的碱是一含有氢氧化钠的碱性水溶液。

44.如权利要求31所述的方法，其特征在于：

得自于步骤(b)的该沉淀物是藉由在pH值调整后进行离心而被获得。

45.如权利要求31所述的方法，其特征在于：

在所述步骤(c)中所进行的干燥处理是选自于一由下列所构成的群组：冷冻干燥处理、喷雾干燥处理、蒸发处理、加热干燥处理，以及此等的一组合。

46.如权利要求31所述的方法，其特征在于：

在所述步骤(c)中，得自于步骤(b)的沉淀物在以水清洗后被加入水内，接而被冷冻干燥而得到该干燥产物。

47.如权利要求31所述的方法，其特征在于：

用于步骤(d)与步骤(e)中的醇是选自于下列所构成的群组：甲醇、乙醇、丙醇以及此等的组合。

48.如权利要求31所述的方法，其特征在于：

在所述步骤(f)中，移除步骤(e)所形成的混合物内的以氯仿为主的层是藉由离心来进行。

49.如权利要求31所述的方法，其特征在于：

在所述步骤(g)中所进行的干燥处理是选自于一由下列所构成的群组：冷冻干燥处理、喷雾干燥处理、蒸发处理、加热干燥处理，以及此等的一组合。

50.如权利要求31所述的方法，其特征在于：

由所述方法所得到的水溶性萃取物是呈具有一纳米级粒径的水溶性颗粒的形式。

51.如权利要求50所述的方法，其特征在于：

由所述方法所得到的水溶性萃取物是呈具有一小于1μm的粒径的水溶性颗粒的形式。

52.如权利要求31所述的方法，其特征在于：

由所述方法所得到的水溶性萃取物基本上是由至少60％-90％的澳洲茄碱以及茄边碱所构成。

53.如权利要求52所述的方法，其特征在于：

由所述方法所得到的水溶性萃取物是由75％以上的澳洲茄碱及茄边碱所构成。

54.如权利要求31所述的方法，其特征在于：

由所述方法所得到的水溶性萃取物具有一澳洲茄碱相对于茄边碱的比值为介于0.3∶1.0～1.0∶0.6之间。

55.如权利要求31所述的方法，其特征在于：

由所述方法所得到的水溶性萃取物具有一澳洲茄碱相对于茄边碱的比值为介于0.4∶1.0～0.9∶1.0之间。

56.如权利要求31所述的方法，其特征在于：

由所述方法所得到的水溶性萃取物具有一澳洲茄碱相对于茄边碱的比值约为0.7∶1.0。

57.如权利要求31所述的方法，其特征在于：

由所述方法所得到的水溶性萃取物具有一水溶解度为2～20mg/ml或以上。

58.一种药学组合物，其特征在于：

该药学组合物包含有一根据权利要求31至57中任一项所述的方法所制得的水溶性萃取物，以及选择性地一药学上可接受的载剂。

59.一种用以抑制肿瘤/癌细胞的生长的药学组合物，其特征在于：

该药学组合物包含有一根据权利要求31至57中任一项所述的方法所制得的水溶性萃取物，以及选择性地一药学上可接受的载剂。

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