CN1251680C - 胞嘧啶衍生物用于制备治疗肿瘤的药物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具下式的化合物及其可药用盐在制备用于治疗宿主动物癌症的药物中的用途，其中R选自H，F，Cl，-CH3，-C(H)＝CH2，-C＝CH，或-C≡N，Br，-NO2，并且R1和R2选自氢，烷基，酰基，单磷酸酯，二磷酸酯和三磷酸酯基。

Description

胞嘧啶衍生物用于制备治疗肿瘤的药物的用途
本发明是申请日为1995年9月5日的中国专利申请95195621.3的分案申请，原案申请的发明名称为“胞嘧啶衍生物在制备用于治疗肿瘤的药物中用途。”
发明领域
本发明涉及药物化学领域，并尤其涉及(-)-(2s，4s)-1-(2-羟甲基-1，3-二氧戊环-4-基)胞嘧啶(也称(-)-OddC)或其衍生物，及其治疗动物包括人类癌症的应用。
发明背景
肿瘤是细胞生长的无序紊乱增殖。肿瘤如果具有侵袭力和迁移性，那么它是恶性的或癌性的。侵袭力是把肿瘤进入周围组织的趋势，它突破划分组织界线的基底膜，从而进入体循环系统。迁移是指肿瘤迁移到身体的其它部位并离开最初出现的部位，建立增殖区域的趋势。
癌症是美国目前导致死亡的第二病因。已诊断美国有8,000,000以上的人患有癌症，预计在1994年将有1,208,000名新患者。在这个国家，每年有500,000名以上的人死于癌症。
癌症还没有在分子水平上完全弄清楚，已知细胞暴露到致癌物如某些病毒，某些化学物质或射线中，就会导致DNA改变，由此灭治“抑制”基因或激活“致癌基因”。抑制基因是生长有规律的基因，当它发生突变时，不再控制细胞生长。致癌基因最初是正常基因(称作前致癌基因)，由于突变或改变表达顺序变成转化基因。转化基因的产生引起不适宜的细胞生长。由于基因突变，使20多种不同的正常的细胞基因变成致癌基因。转化细胞在很多方面不同于正常细胞，它包括细胞形态学，细胞-细胞间的相互作用，膜的组分，细胞骨架结构，蛋白质分泌，基因表达和死亡率(转化细胞可以无限期地生长)。
身体中的各种细胞都可以转化成良性的或恶性的肿瘤细胞。最常见的肿瘤部位是肺，其次为结肠直肠，乳腺，前列腺，膀胱，胰腺和卵巢。其它常见的癌包括白血病，中枢神经系统的癌，包括脑癌，黑素瘤，淋巴瘤，红白血病，子宫癌，和头部、颈部癌。
目前，主要用外科手术，放射治疗和化疗三种方法中的一种或三种方法联合起来治疗癌症。外科手术涉及要除掉大量生病的组织。尽管有时外科手术可有效地除掉某些部位如乳腺，结肠和皮肤的肿瘤，但它不能用于治疗其它部位如脊柱的肿瘤，也不能治疗播散性肿瘤疾病如白血病。
化疗涉及破坏细胞复制或细胞代谢。通常用于治疗白血病及乳腺癌，肺癌和睾丸癌。
通常有五大类用于治疗癌症的化疗剂：天然产物及其衍生物：蒽环类化合物(anthracycline)；烷在化剂；抗增殖剂(也称抗代谢物)；和激素。化疗剂通常称作抗肿瘤药。
烷基化剂是通过将鸟嘌呤烷基化及交联和与DNA中的其它碱交联，抑制细胞分裂发挥作用的。典型的烷基化剂包括氮芥，吖丙啶化合物，烷基硫酸盐，顺铂和各种亚硝基脲。这些化合物的缺点是它们不仅攻击恶性肿瘤细胞，而且也攻击天然存在的分裂细胞，如骨髓，皮肤，胃肠粘膜和胎儿组织细胞。
抗代谢物是典型的可逆或不可逆性酶抑制剂，或其它干扰核酸复制，翻译或转录的化合物。
已证明几种合成的核苷具有抗癌活性。公知的具有强抗癌活性的核苷衍生物是5-氟尿嘧啶。5-氟尿嘧啶已用于在临床上治疗恶性肿瘤，例如包括癌，肉瘤，皮肤癌，肖化器官癌和乳腺癌。然而，5-氟尿嘧啶引起各种不良反应如恶心，脱发，腹泻，口炎，白血病性血小板减少症，厌食，色素沉着和水肿。在美国专利号4,336,381和在日本专利公开号50-50383，50-50384，50-64281，51-146482和53-84981中描述了具有抗癌活性的5-氟尿嘧啶的衍生物。
美国专利号4,000,137中披露了肌苷，腺苷或胞苷与甲醇或乙醇的过氧化产物具有抗淋巴细胞白血病的活性。
胞嘧啶阿拉伯糖苷(也称阿糖胞苷，araC)是脱氧胞苷的核苷类似物，它在1950年首次合成并在1963年应用于临床医学中。它是通常治疗急性脊髓性白血病的重要药物。它也具有抗急性淋巴细胞性白血病的活性，并且很少用于慢性髓细胞性白血病和非何杰金淋巴瘤。araC的主要作用是抑制核DNA合成，见5Handschumacher，R.和Cheng.Y.，“嘌呤和嘧啶抗代谢物”，Cancer Medicine，XV-1章，第3版，由J.Holland等编辑，Lea和Febigol出版。
5-氮杂胞苷是胞苷类似物，它主要用于治疗急性脊细胞性白血病和脊髓发育不良综合症。
2-氟腺苷-5’-磷酸(Fludara，也称FaraA)是治疗慢性淋巴细胞性白血病最有效的药物之一。该化合物通过抑DNA合成发挥作用。用F-araA治疗细胞与细胞在GI/S期分界期和在S期的蓄积有关；因此，它是细胞循环S期特异性药物，混入活性代谢物F-ara ATP可延缓DNA链的延长。F-araA也是有效的核糖核苷酸还原酶抑制剂，所述核糖核苷酸还原酶是形成dATP的关键酶。
2-氯脱氧腺苷用于治疗低级B细胞肿瘤如慢性淋巴细胞性白血病，非何杰金淋巴瘤，和毛状细胞性白血病。其活性范围与Fludara类似。该化合物抑制DNA在生长期细胞中合成并抑制DNA在静止期细胞中修复。
尽管已确定了大量化疗药物并且通常它们已用于治疗癌症，但仍需要寻找新的、有效的并且对健康细胞显示较低毒性的药物。
因此，本发明的目的是提供具有抗肿瘤并尤其具有抗癌活性的化合物。
本发明的另一目的是提供治疗癌症的药用组合物。
本发明再一目的是提供治疗癌症的方法。
发明概述
本发明披露了用于治疗人和其它宿主动物肿瘤，尤其是癌症的方法和组合物，它包括给予有效量的(-)-(2S，4S)-1-(2-羟甲基-1，3-二氧戊环-4-基)胞嘧啶(也称(-)-OddC，L-OddC或(-)-L-OddC)及其可药用衍生物包括5’或N4烷基化或酰化衍生物，或其可药用盐，可有可无的药用载体。
在另一实例中，本文所公开的化合物可用于治疗涉及细胞异常或不需要增殖的疾病，特别是肿瘤或癌症外的其它疾病。其实例包括皮肤病如表皮角化病(包括鱼鳞癣)，皮肤角化病，扁平苔藓和牛皮癣，疣包括生殖器疣，和水疱，以及任何能够用氨甲喋呤治疗的、异常的或不需要细胞增殖。本文所公开的活性化合物也可以用于诱导或促进流产。
在优选实例中，提供(-)-(2S，4S)-1-(2-羟甲基-1，3-二氧戊环-4-基)胞嘧啶作为指定对映体(L-对映体)并且基本上不含其相应的对映体(即，以富含对映体包括对映体纯品的形式存在)
已确信，(-)-(2S，4S)-1-(2-羟甲基-1，3-二氧戊环-4-基)胞嘧啶是表现抗肿瘤活性的“L”-核苷的第一个实例。(-)-(2S，4S)-1-(2-羟甲基-1，3-二氧戊环-4-基)胞嘧啶具有式I结构。
已发现，(-)-(2S，4S)-1-(2-羟甲基-1，3-二氧戊环-4-基)胞嘧啶表现出明显的抗癌细胞活性并表现出对宿主健康细胞较低的毒性。能够用该化合物治疗的、非限定性癌症的实例包括肺癌，结肠直肠癌，乳腺癌，前列腺癌，膀胱癌，鼻咽癌，胰腺癌，卵巢癌，白血病，淋巴瘤，头部和颈部癌，中枢神经系统癌(包括脑癌)，宫颈癌，黑素瘤和肝细胞癌。
在另一实例中，公开了用于治疗人和其它宿主动物肿瘤，尤其是癌或其它异常的或不需要的细胞增殖的方法和组合物，它包括给予有效量的下式L-OddC衍生物或其可药用衍生物，可有可无的药用载体，优选富含对映体形式：
Figure C0311067000072
其中R为H，F，Cl，-CH3，-C(H)＝CH2，-Br，-NO2，-C＝CH，或-C＝N并且R1为氢，烷基，酰基，单磷酸酯基，二磷酸酯基，或三磷酸酯基。
在另一实施方式中，本发明涉及下式化合物或其可药用盐在制备用于治疗宿主动物癌症的药物中的用途
Figure C0311067000081
其中R选自H，F，Cl，-CH3，-C(H)＝CH2，-C＝CH，或-C≡N，Br，-NO2，并且R1和R2选自氢，烷基，酰基，单磷酸酯，二磷酸酯和三磷酸酯基。
在一个优选的实施方式中，R为氟，并且R1和R2为氢。
在另一个优选的实施方式中，R为H或F。
更具体讲，本发明涉及下式的β-L-对映体在制备用于治疗宿主动物肿瘤的药物中用途，
Figure C0311067000082
其中R1和R2选自氢，酰基和C1-C18烷基，该对映体含至少95％的β-L-对映体。在上述通式中，R1和R2优选为氢，所述烷基选自甲基，乙基，丙基，丁基，戊基，己基，异丙基，异丁基，仲丁基，叔丁基和异戊基；所述酰基为-C(O)R，其中R为C1-C5烷基，苯基或苄基。
尽管本发明优选实例中所使用的是非天然存在构型(L-构型)的活性化合物或其衍生物或其盐，但本文所公开的化合物或其衍生物或其盐可以天然存在的构型(D-构型)或外消旋混合物形式给予。
为增加治疗功效，可以将本文所公开的，治疗肿瘤的任何化合物与其它抗肿瘤药物联合或交替给予。其实例包括天然产物及其衍生物；蒽环类化合物；烷基化剂；抗增殖剂(也称抗代谢物)；和激素。特别地，所述药物包括但不限于氮芥，吖丙啶化合物，烷基硫酸酯，顺铂，亚硝酸脲，5-氟尿嘧啶，胞嘧啶阿拉伯糖苷，5-氮杂胞苷，2-氟腺苷-5’-磷酸，2-氯脱氧腺苷，它莫西芬，放线菌素，安吖啶，争光霉素，卡铂，卡氮芥，环磷酰胺，环孢菌素，柔红霉素，阿霉素，白细胞介素，罗氮芥，巯基嘌呤，氨甲喋呤，丝裂霉素，硫鸟嘌呤，长春碱，生长因子包括GCSF，GMCSF，和血小板生长因子；阿霉素，WP-16，羟基脲，依托泊甙；α，β和S干扰素和长春新碱。给予有效量这些药物的方法是容易确定的，或者例如，见The Physician’s Desk Reference，由MedicalEconomics Date Productior Company最新编辑，出版，和Martindale，The Extra Pharmucopoeia，由The Pharmuceutical Press最新编辑，肿瘤生长百分数-天数曲线。在第1，2，3，4，和5天处理鼠。在图中，用(●)表示对照(未给予(-)-OddC)的数据，用(--▲--)表示给予(-)-OddC的数据。
图3显示用(-)-OddC处理的P388白血病鼠的存活率。该图绘制的是存活百分数-处理天数曲线。在第1，2，3，4和5天处理鼠。在图中，用(●)表示对照(未给予(-)-OddC)的存活率，用(--▲--)表示以25mg/kg，每天两次给予(-)-OddC鼠的存活率，用(O)表示以50mg/kg，每天一次给予(-)-OddC鼠的存活率。
图4是某些癌细胞系对(-)-OddC的相对敏感性图，由GI50表示。向右延伸的条形图表示该细胞系对(-)-OddC的敏感性超过全部试验细胞系的平均敏感性。由于条形图刻度是对数值，所以条形图右侧的2个单位是指该细胞系获得GI50时所需化合物的浓度为全部细胞系所需平均浓度的百分之一，因此，通常该细胞系是对(-)-OddC敏感的。相应地，向左伸展的条形图表示该敏感性小于平均敏感性。
图5是用(●)-OddC抑制人肿瘤生长的图。将3-6周大NCr裸鼠的每个肋腹皮下注射2×106HepG2或DU-145细胞。当肿瘤处于生长旺盛期时开始治疗。在0-4天，每天两次给予药物并在指定时间测定肿瘤大小。曲线A和B分别显示药物对HepG2肿瘤和DU-145肿瘤的作用(-O-对照；-●-AraC 25mg/kg，i.p.；-□-(-)-OddC，25mg/kg，P.O.；-■-(-)-OddC，25mg/kg，i.p.)。图A中的每个数据点代表10个肿瘤的平均值±SD，图B中的每个数据点代表6个肿瘤的平均值±SD。
详细说明本发明
本文所公开的发明是治疗人或其它宿主动物肿瘤，尤其是癌症的方法和组合物，它包括给予有效量的(-)-(2S，4S)-1-(2-羟甲基-1，3-二氧戊环-4-基)胞嘧啶，本文进一步定义的该化合物的衍生物，它包括5-取代的或5’或4烷基化的或酰化的衍生物，或其生理上适宜的盐，及可有可无的药用载体。
(-)-(2S，4S)-1-(2-羟甲基-1，3-二氧戊环-4-基)胞嘧啶称作“L”-核苷。由于二氧戊环上的2和5位碳是手征性的，所以它们的非氢取代基(分别为CH2OH和胞嘧啶碱)可以是顺式的(在同一侧)或反式的(在相反的两侧)。因此，通过下列构型来表示四个光学异构体(当在水平面上的二氧戊环部分面向东时，3-位上的氧在前面)：顺式(两个取代基都“向上”，它符合天然存在的核苷，称作“D”-核苷)，顺式(两个取代基都“向下”，它是非天然存在的构型，称作“L”-核苷)，反式(C2取代基“向上”并且C5取代基“向下”)，反式(C2取代基“向下”并且C5取代基“向上”)。已确信，(-)-(2S，4S)-1-(2-羟甲基-1，3-二氧戊环-4-基)胞嘧啶或其衍生物是表现抗肿瘤活性的“L”-核苷的第-个实例。根据天然不存在“L”核苷构型的事实，这是令人意外的。
本文所使用的术语“高含对映体”指至少包含大约95％并优选大约97％，98％，99％或100％核苷单-对映体的核苷组合物。在优选实例中，提供(-)-(2S，4S)-1-(2-羟甲基-1，3-二氧戊环-4-基)胞嘧啶或其衍生物或盐的核苷组合物，它基本上包含一种对映体，即指定对映体(L-对映体)并且基本上不含其相应的D-对映体(即，以富含对映体包括对映体纯品形式存在)。
活性化合物可以以任何衍生物的形式给予，其中，当将所述衍生物给予接受体时，该衍生物直接或间接提供母体(-)-L-OddC化合物或本文所定义的其它5一取代衍生物，或者其本身具有活性的化合物。非限定性实例为(-)-OddC的可药用盐(或者称作“生理上适宜的盐”)，上述5-衍生物，和活性化合物的5’和N4酰化或烷基化衍生物(或者称作“具有生理活性的衍生物”)。在一个实例中，酰基是羧酸酯(-C(O)R)，其中，酯基的非羰基部分选自直链，支链烷基或环烷基(典型地为C1-C18，并且更典型地为C1-C5)烷芳基，芳烷基，烷氧基烷基包括甲氧基甲基，芳烷基包括苄基，烷基或C1-C4烷氧基；磺酸酯如烷基或芳烷基磺酰基包括甲磺酰基，单，二或三磷酸酯，三苯甲游基或单甲氧基三苯甲游基，取代的苄基，三烃基甲硅烷基(例如，二甲基-叔丁基甲硅烷基)或二苯基甲基甲硅烷基。最优选酯基中的芳基包含苯基。
L-O-ddc的可药用衍生物的特例包括但不限制于：
Figure C0311067000121
其中R为F，Cl，-CH3，-C(H)＝CH2，-C＝CH哉-C≡N，-Br，-NO2，并且R1和R2独立地选自氢，烷基和酰基，特别包括但不限制于甲基，乙基，丙基，丁基，戊基，己基，异丙基，异丁基，仲丁基，叔丁基，异戊基，戊基，叔戊基，3-甲基丁酰基，琥珀酸，3-氯苯甲酸盐，环戊基，环己基，苯甲酰基，乙酰基，新戊酰基，甲磺酸盐，丙酰基，丁酰基，戊酰基，己酸基，辛酸基，癸酸基，月桂酸基，肉豆
Figure C0311067000122
酸基，棕榈酸基，硬脂酸基，油酸基和氨基酸包括但不限制于丙氨酰基，缬氨酰基，亮氨酰基，异亮氨酰基，脯氨酰基，苯丙氨酰基，色氨酰基，半胱氨酰基，酪氨酰基，天冬酰胺酰基，谷氨酰胺酰基，天冬氨酰基，谷氨酰基，赖氨酰基，精氨酰基，细氨酰基。在优选实例中，提供的衍生物为L-对映体并且基本上不含其相应的对映体(即，以富含对映体包括对映体纯品的形式存在)。
所提供的L-OddC或其衍生物可以为其可药用盐的形式。本文所使用的术语可药用盐或配合物指L-OddC或其衍生物的盐或配合物，它保留所需要的母体化合物的生物活性，并且如果有的话，也表现极小的不需要的毒理作用。这些盐的非限定性实例为(a)与无机酸(例如，盐酸，氢溴酸，硫酸，磷酸，硝酸等等)形成的酸加成盐，和与有机酸如乙酸，草酸，酒石酸，琥珀酸，苹果酸，抗坏血酸，苯甲酸，鞣酸，棕榈酸(Pamoicacid)，藻酸，聚谷氨酸，萘磺酸，萘二磺酸，和聚半乳糖醛酸形成的盐；(b)与多价金属阳离子如锌，钙，铋，钡，镁，铝，铜，钴，镍，锅，钠，钾等等形成的碱加成盐，或与由N，N-二苄基乙二胺，铵，或乙二胺形成的有机阳离子形成的碱加成盐；或(c)、(a)和(b)的混合物；例如鞣酸锌盐等等。
对活性化合物的修饰，特别是在N4和5’-O位的修饰可影响活性物的溶解性，生物利用度和代谢速度，因此可控制活性物的释放。进一步，该修饰可影响化合物的抗癌活性，在某些情况下可增加母体化合物的活性。通过制备衍生物并按照本文所描述的方法或本领域技术人员已知的其它方法测定其抗癌活性，可以很容易地进行这方面评价。
简要讲，本发明包含下列部分：
(a)(-)-(2S，4S)-1-(2-羟甲基-1，3-二氧戊环-4-基)胞嘧啶及其衍生物和盐；
(b)(+)-(2S，4S)-1-(2-羟甲基-1，3-二氧戊环-4-基)胞嘧啶及其衍生物和盐；
(c)(-/+)-(2S，4S)-1-(2-羟甲基-1，3-二氧戊环-4-基)胞嘧啶及其衍生物和盐；
(d)(-)-(2S，4S)-1-(2-羟甲基-1，3-二氧戊环-4-基)胞嘧啶及其衍生物和盐，或其(+)-对映体或外消旋混合物，和用于临床治疗，例如治疗或预防肿瘤包括癌性肿瘤的可药用衍生物和其盐；
(e)利用(-)-(2S，4S)-1-(2-羟甲基-1，3-二氧戊环-4-基)胞嘧啶及其可药用衍生物和盐，或其(+)-对映体或外消旋混合物，及其可药用衍生物和盐来生产用于治疗肿瘤包括癌性肿瘤的药物；
(f)药物制剂，它包含(-)-(2S，4S)-1-(2-羟甲基-1，3-二氧戊环-4-基)胞嘧啶及其可药用衍生物和盐，或其(+)-对映体或外消旋混合物，或其可药用衍生物或盐，和可药用载体；
(g)制备(2S，4S)-1-(2-羟甲基-1，3，-二氧戊环-4基)胞嘧啶的方法，它包括：
(i)将保护或未保护的胞嘧啶与式A  1，3-二氧戊环反应
其中R1a为氢或羟基保护基，包括酰基，并且L为离去基团；并除掉或不除掉任何羟基保护基，
(ii)将式B化合物
Figure C0311067000142
(其中R1a如上定义)与将尿嘧啶环4-位上的氧基转化为氨基的试剂反应；除掉任何存在的保护基，得到需要的产物。
(h)制备(2S，4S)-1-(2-羟甲基-1，3-二氧戊环-4-基)胞嘧啶的(-)或(+)对映体的方法，它包括，让化合物或其(-)和(+)对映体混合物形式的衍生物(例如5’-酯)处于反应条件中或与具有分离对映体作用的试剂(例如适宜的酶)反应并且如果需要，将得到的衍生物转化为母体化合物，或者，可以让混合物通过手征性液体层析柱，该柱将这种类型的对映体分离。
(i)制备(2S，4S)-1-(2-羟甲基-1，3-二氧戊环-4-基)胞嘧啶的方法，它包括利用不使产物外消旋的Lewis酸，如三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸盐(triflat)，将保护的下式1，3-二氧戊环：
Figure C0311067000143
与保护的在5-位上取代或未取代的胞嘧啶碱反应。
就方法g)中的(i)而言，羟基保护基包括下列保护基：酰基(例如乙酰基)，芳基酰基(例如苯甲酰基或取代的苯甲酰基)，三苯甲游基或单甲氧基三苯甲游基，苄基或取代的苄基，三取代的甲硅烷基包括三烃基甲硅烷基(例如二甲基-叔丁基甲硅烷基)或二苯基甲基甲硅烷基。胞嘧啶化合物可以用三取代的甲硅烷基保护或不保护。保护基可以用常规方法除掉。离去基团是核苷领域中那些已知的、有代表性的离去基团，例如卤素如氯，氟，甲苯磺酰基，甲磺酰基，三氟甲磺酸盐，或溴，烷氧基如甲氧基或乙氧基，或酰基如乙酰基或苯甲酰基。
在方法g)的(i)中，可在Lewis酸如SnCl4，氯化钛，或三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸盐存在下，在有机溶剂(例如，1，2-二氯乙烷或乙腈)中进行反应。
通过将式C化合物
Figure C0311067000151
(其中R1a如上定义)与还原剂，例如氢化锂铝反应，然后用适宜的常规试剂对获得所需中间体处理例如用于酰化的羧酸酐如乙酸酐，用于卤代的氯化剂或溴化剂，或烷基化试剂，可以得到式A化合物(其中L代表酰基，例如乙酰基)。
通过在升高的温度下，将式D化合物
Figure C0311067000152
与HOCH2CO2H反应，可以制备式C化合物。
通过具有式CH2＝CH-CH2-OR结构的烯丙醚或酯的臭氧分解或具有式ROCH2-CH＝CH-CH2OR结构的2-丁-1，3-二醇的二醚或二酯的臭氧分解，可以制备式E化合物，其中R为保护基，如烷基，甲硅烷基，或酰基。
就方法g)中的ii)而言，可以用1，2，4-三唑和4-氯苯基二氯磷酸盐一起处理式C化合物，形成相应的4-(1，2，4-三唑基)化合物，然后，例如通过与甲醇反应，将其转化为需要的4-氨基(胞苷)化合物。
例如，通过用与方法g)i)中所描述方法的类似的方法将适宜的(保护或未保护的)碱与式A化合物反应，可以制备式B和C的初始物。尿嘧啶和胞嘧啶可购于Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI53233，USA。
通过与适宜的酯化剂，例如酰基卤或酸酐反应，可以将L-OddC或其衍生物转化为可药用酯。用常规方法，例如通过用适宜的碱处理，可以将L-OddC或其可药用衍生物转化为可药用盐。例如通过水解，可以将酯或盐转化为母体。
在另一实例中，本文所公开的化合物可用于治疗疾病，特别是那些涉及异常的或不需要的细胞增殖的，不同于肿瘤或癌症的疾病。其实例包括皮肤病，如表皮角化病(包括鱼鳞病，皮肤角化病，扁平苔癣和牛皮癣)，疣包括生殖器疣，和水疱，以及任何能够用氨甲喋呤治疗的、异常的细胞增殖。本文所公开的活性化合物也可以用于诱导或促进流产。
因此，本发明也包括用于临床治疗，例如治疗或预防异常的或不需要的细胞增殖的(-)-(2S，4S)-1-(2-羟甲基-1，3-二氧戊环-4-基)胞嘧啶及其衍生物的盐，或其(+)-对映体或外消旋混合物，及其可药用衍生物和盐；以及利用(-)-(2S，4S)-1-(2-羟甲基-1，3-二氧戊环-4-基)胞嘧啶及其可药用衍生物和盐，或其(+)-对映体或外消旋混合物，及其可药用衍生物和盐来生产用于治疗异常的或不需要的细胞增殖的药物。
II.制备活性化合物
如上所述，按照1992年10月29日出版的PCT国际公开号WO92/18517中所公开的方法，用反应路线I中所公开的方法和下文所提供的工作实例1-7，或用本领域技术人员已知的其它方法可以制备(-)-L-OddC及其衍生物。可利用这些方法或其它已知的方法来制备作为实例的L-OddC的衍生物。
Figure C0311067000171
反应路线1：(-)-OddC的合成
实施例1  制备6-脱水-L-葡萄糖
在第一步中，通过用酸，例如0.5N HCl处理葡萄糖，从葡萄糖开始制备6-脱水-L-葡萄糖，产率60％(Evans，M.E.，等， Carbohydr. Res(1973)， 28，359)。与前面的方法(Jeong，LS.等人， Tetrahedron Lett.(1992)，33，595和Beach，J.W.等， J.Org.Chem，(1992年出版))不同，该方法无需选择性保护，通过用NaIO4氧化，再用NaBH4还原，将(2)直接转化为二氧戊环三醇(3)，在不分离下，将其转化为异亚丙基衍生物(4)。苯甲酰化得到(5)，脱保护得到(6)，将二醇(6)氧化得到酸(7)。在无水THF中，用Pb(OAC)4将(7)氧化脱羧酸得到乙酸盐(8)，即产率较高的主要中间体。在TMSOTf存在下，将乙酸盐与所需要的嘧啶(例如甲硅烷基化的胸腺嘧啶和N-乙酰化的胞嘧啶)缩合，得到α，β-混合物，将其在硅胶柱上分离，得到单一的异构体(9和10)。用甲醇化的氨脱苯甲酰基，得到需要的(-)-OddC(11)。
实施例2  制备(-)-1，6-脱水-α-L-古洛吡喃糖(2)
将L-葡萄糖(1)(33g，0.127mol)和0.5N HCl(330ml，0.165mol)的混合物回流20小时。将混合物冷却并用树脂(Dowex-2，HCO3-形式)中和至pH6，此过程伴随气泡产生。通过用10％HCl水，甲醇，水和饱和NaHCO3溶液洗涤将树脂再循环。将反应混合物过滤并用水(500ml)洗涤树脂。将合并的滤液浓缩至干并真空干燥过夜。将残渣在柱上(5cm高，硅胶，目，CHCl3-CH3OH，10∶1)纯化，得到淡黄色固体，在无水乙醇中重结晶得到无色固体(2)[Rf＝0.43(CHCl3-CH3OH，5∶1)，7.3g，35.52％]。将得到的L-葡萄糖(Rf＝0.07，11g)再循环，得到(2)(5g，总产率60％)：mp142.5-145℃；
1H NMR(DMSO-d6)δ3.22-3.68(m，4H，H-2，-3，-4 and -6a)，3.83(d，J6b，6a＝7.25Hz，1H，Hb-6)，4.22(pseudo t，J5，6a＝4.61and 4.18Hz，H，H-5)，4.46(d，J2-OH，2＝6.59Hz，1H，2-OH，可与D2O交换)，4.62(d，J3-OH，3＝5.28Hz，1H，3-OH，可与D2O交换)，5.07(d，J4-OH，4＝4.84Hz，1H，4-OH，可与D2O交换)，5.20(d，J1，2＝2.19Hz，1H，H-1).[α]D 25-50.011(c，1.61，CH3OH).
实施例3制备(-)-(1’S，2S，4S)-4-(1，2，-二羟乙基-1，2-O-异亚丙基)-2-羟甲基)-二氧戊环(4)
将NaIO4(22.36g，0.1mol)的水(300ml)溶液，经10分钟滴加到冷却至0℃的(2)(11.3g，0.07mol)的甲醇(350ml)溶液中。将混合物机械搅拌15分钟。将NaBH4(7.91g，0.21mol)加到该混合物中并在0℃下将该反应混合物搅拌10分钟。将白色固体滤出并用甲醇(300ml)洗涤。将合并的滤液用0.5N HCl(～200ml)中和并浓缩至干。将残渣真空干燥。利用机械搅拌器，将糖浆状残渣与甲醇-丙酮(1∶5，1200ml)一起研制(5小时)并滤出白色固体(第一个)。将滤液浓缩至干并将残渣溶解在丙酮(500ml)中，然后加入对甲苯磺酸(6.63g，0.035mol)。搅拌6小时后，将混合物用三乙胺中和，滤出固体(第二个)并将滤液浓缩至干。将残渣溶解在乙酸乙酯(350ml)中并用水(50ml×2)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，并蒸发得到粗品(4)(3.6g)的淡黄色糖浆。将水层浓缩至干并真空干燥。将得到的固体(第1个和第2个)与干燥的水层物合并并通过在10％甲醇-丙酮(900ml)和对甲苯磺酸(16g，0.084mol)中搅拌1小时再循环，得到粗品(4)(5.6g)。通过在无水硅胶柱(CH3OH-CHCl3，1％-5％)上纯化，得到(4)[Rf＝0.82(CHCl3-CH3OH，10∶1)8.8g，61.84％]的无色油状物。
1H NMR(DMSO-d6)δ1.26 and 1.32(2Xs，2X3H，异亚丙基)，3.41(dd，JCH2OH，OH＝6.04Hz，JCH2OH，2＝3.96Hz，2H，CH2OH)，3.56-4.16(m，6H，H-4，-5，-1′and -2′)，4.82(t，JOH，CH2＝6.0Hz，1H，CH2OH，可与D2O交换)，4.85(t，J2OH，CH2OH＝3.96Hz，1H，H-2).[α]D 25-12.48(C，1.11，CHCl3)，C9H16O5元素分析，计算值：C，52.93；H，7.90。
实测值：C，52.95；H，7.86。
实施例4  制备(+)-(1’S，2S，4S)-4-(1，2-二羟甲基-1，2-O-异亚丙基)-2-(O-苯甲酰氧基甲基)-二氧戊环(5)
在0℃下，将苯甲酰氯(6.5ml，0.056mol)滴加到(4)(8.5g，0.042mol)在吡啶-CH2Cl2(1∶2，120ml)的溶液中并将温度升至室温。搅拌2小时后，用甲醇(10ml)将反应骤冷并将混合物真空浓缩至干。将残渣溶解在CH2Cl2(300ml)中并用水(100ml×2)，盐水洗涤，干燥(MgSO4)过滤，蒸发，得到淡黄色糖浆，将其通过硅胶柱层析(EtOAc-己烷，4％-30％)来纯化，得到(5)[Rf＝0.45(己烷-EtOAc，3∶17，10.7g，83.4％]的无色油状物。
1H NMR(CDCl3)δ1.35 and 1.44(2Xs，2X3H，异亚丙基)3.3-4.35(m 6H，H-4，-5，-1′and-2′)，4.44(d，J＝3.96Hz，2H，CH2-OBz)，5.29(t，J＝3.74Hz，1H，H-2)，7.3-7.64，8.02-8.18(m，3H，2H，-OBz).[α]D 25+10.73(c，1.75，CH3OH).
C16H20O6元素分析，计算值：C，62.33；H，6.54。
实测值：C，62.39；H，6.54。
实施例5：制备(+)-(1’S，2S，4S)-4-(1，2-二羟乙基)-2-(O-苯甲酰氧基甲基)-二氧戊环(6)
在室温下，将(5)(5.7g，0.018mol)和对甲苯磺酸(1.05g，0.0055ml)在甲醇(70ml)中的混合物搅拌2小时。因为反应尚未结束，所以将溶剂蒸发至原体积的一半并再加入甲醇(50ml)和对甲苯磺酸(0.7g，3.68mmol)。再搅拌1小时后，将反应混合物用三乙胺中和并将溶剂蒸发至干。
将残渣通过硅胶柱层析(己烷-EtOAc，10％-33％)纯化，得到(6)[Rf＝0.15(己烷-EtOAc，1∶1)，4.92g，99.2％]的无色糖浆。
1H NMR (DMSO-d6))δ3.43(m，2H，H-2′)，3.67-4.1(m，4H，H-4，-5and-1′)，4.32(d，J＝3.73Hz，2H，CH2-OBz)，4.60(t，J＝5.72Hz，2′-OH，可与D2O交换)，5.23(t，J＝3.96Hz，1H，H-2)，7.45-7.7，7.93-8.04(m，3H，2H，-OBz)，[α]D 25+9.16(c，1.01，CHCl3).
C13H16O6的元素分析，计算值：C，58.20；H，6.01。
实测值：C，58.02；H，6.04。
实施例6：制备(-)-(2S，4S)和(2S，4R)-4-乙酰氧基-2-(O-苯甲酰氧基甲基)-二氧戊环(8)
将NaIO4(10.18g，0.048mol)在水(120ml)中的溶液加到(6)(3.04g，0.011mol)在CCl4∶CH3CN(1∶1，160ml)的溶液中，然而加入RuO2水合物(0.02g)。将反应混合物搅拌5小时后，通过在硅藻土上过滤除掉固体并将滤液蒸发至1/3体积。将残渣溶解在CH2Cl2(100ml)中并用CH2Cl2(100ml×2)提取水层。用盐水(50ml)洗涤合并的有机层，干燥(MgSO4)，过滤，蒸发至干并真空干燥16小时，得到粗品(1)(2.6g，91％)。
在N2环境下，向粗品(7)(2.6g，0.01mol)在无水THF(60ml)的溶液中加入Pb(OAC)4(5.48g，0.0124mol)和吡啶(0.83ml，0.0103mol)。在N2下，将混合物搅拌45分钟并通过过滤除掉固体。用乙酸乙酯(60ml)洗涤固体并将合并的有机层蒸发至干。将残渣通过硅胶柱层析(己烷-EtOAc，2∶1)纯化，得到(8)[Rf＝0.73和0.79(己烷-EtOAc，2∶1)，1.9g，69.34％]的无色油状物。
1H NMR(CDCl3)δ1.998，2.11(2Xs，3H，-OAc)，3.93-4.33(m，2H，H-5)，4.43，4.48(2Xd，J＝3.73，3.74Hz，2H，CH2OBz)，5.46，5.55(2Xt，J＝4.18，3.63Hz，1H，H-2)，6.42(m，1H，H-4)，7.33-759，8.00-8.15(m，3H，2H，-OBz).[α]D 25-12.53(c，1.11，CHCl3).
C13H14O6的元素分析，计算值：C，58.64；H，5.30。
实测值，C，58.78；H，5.34、
实施例7：制备(-)-(2S，4S)-1-[2-(苯甲酰基)-1，3-二氧戊环-4-基]胞嘧啶(9)和(+)-(2S，4R)-1-[2-(苯甲酰氧基)-1，3-二氧戊环-4-基]胞嘧啶(10)
在氮环境下，将N4-乙酰基胞嘧啶(1.24g，7.52mmol)在无水二氯甲烷(20ml)，六甲基二硅氮烷(15ml)和硫酸铵(cat.量)中的混物合回流4小时。将得到的澄清溶液冷却至室温。向该甲硅烷基化的乙酰胞嘧啶中加入(8)(1.0g，3.76mmol)在无水二氯乙烷(10ml)和TMSOTf(1.46ml，7.55mmol)中的溶液。加入饱和NaHCO3(10ml)并将混合物再搅拌15分钟，然而通过硅藻土板过滤。将滤液蒸发并将固体溶解在EtoAc中，并用水和盐水洗涤，干燥，过滤并蒸发，得到粗品产物。将该粗品在二氧化硅柱(5％CH3OH/CHCl3)上纯化，得到(9)纯α，β混合物(0.40g，30％)及(13)和(14)的α，β混合物(0.48g，40％)。为了分离，将(14)的混合物再乙酰化，通过长的二氧化硅柱(3％CH3OH/CHCl3)分离合并的α，β混合物，得到(9)(0.414g，30.7％)和(10)(0.481g，35.6％)的泡沫状物。将这些泡沫状物与CH3OH一起研制，得到白色固体。9：UV(CH3OH)λmax298nm；元素分析(C17H17N3O8)C，H，N。10：UV(CH3OH)λmax298nm。
实施例8：制备(-)-(2S，4S)-1-(2-羟甲基-1，3-二氧戊环-4-基)胞嘧啶(11)
在室温下，将(9)(0.29g，0.82％)在CH3OH/NH3(50ml，在0℃下饱和)中的溶液搅拌10小时。将溶剂蒸发并将粗品在制备型二氧化硅板上(20％CH3OH/CHCl3)纯化，得到油状物。将该油状物在CH2Cl2/己烷中结晶，得到(11)(0.136g，77.7％)的白色固体。UVλmax278.Onm(ε11967)(PH2)，270.0nm(ε774)(PH7)，269.0nm(ε8379)(PH11)；元素分析(C8H11N3O4)C，H，N。
II.药用组合物
通过单独或与其它已知抗癌剂或药物一起给予有效量的(-)-OddC或其衍生物或可药用盐，及可有可无的药用载体或稀释剂，可以治疗患肿瘤，尤其是人，马，犬，牛和其它动物，尤其是哺乳动物的癌症。该治疗方法也可以与其它常规癌症治疗方法如放射性治疗或外科手术联合使用。
这些化合物可通过任何适宜的途径给予，例如，通过口服，非肠道，静脉内，真皮内，皮下或表皮，以液体，霜，凝胶，或固体形式或气雾剂形式给药。
以足够释放出对病人所患疾病治疗效有效量而不给治疗病人带来严重毒副作用的量的活性化合物包含在可药用载体或稀释剂中。就本文所提到的所有疾病而言，优选的化合物剂量为每天每公斤体重受试者大约10ng-300mg，优选01-100mg，通常更优选0.5-25mg。典型的局部给药剂量为0.01-3％wt/wt(在适宜的载体中)。
通常，以适宜的单位剂量形式给予化合物，所述剂量形式包括但不限制于每单位剂量形式含1-3000mg，优选5-500mg活性组分。口服剂量一般为25-250mg。
优选地，给予活性组分来获得活性化合物的峰血浆浓度，其值大约为0.00001-30mM，优选大约为0.1-30μm。例如，这可以通过静脉注射活性组分的溶液或制剂，可有可无的盐水或水性溶媒，或者可以通过给予活性组分的药团来获得。
药物组合物中的活性化合物的浓度将依赖于药物的吸收，分布，灭活和排泄速率以及本领域技术人员已知的其它因素。已发现，剂量值也随着疾病严重程度的减轻而改变。进一步应该知道，就任何特定的治疗对象而言，特定的剂量方案应该根据个体需要和具体的疗程或监督给予组合物的人的职业判断，随时间变化进行调节，并且本文所提出的浓度范围仅作为实例说明并不限定所公开组合物的范围或应用。活性组分可以一次给予，或者可以分成许多较小的剂量，在不同间隔的时间给予。
口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用载体。它们可以包封在明胶胶囊中或压成片剂。为了口服给药治疗，可以将活性化合物或其前体药物衍生物与赋形剂混合并以片剂，锭剂或胶囊剂的形式使用。也可以包含在药学上可配伍的粘合剂和/或佐剂物质，作为组合物中的一部分。
片剂，丸剂，胶囊剂，锭剂等等可以包含任何下列组分或性质类似的化合物：粘合剂如微晶纤维素，西黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖；分散剂如藻酸，Primogel，或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；润滑剂(glidant)如胶态二氧化硅；增甜剂如蔗糖或糖精；或矫味剂如薄荷，水杨酸甲酯或橙子矫味剂。当剂量单位形式为胶囊剂时，除上述种类的物质外，它可以包含液体载体如脂油。另外，剂量单位形式可以包含各种其它能够改变剂量单位物理形态的物质，例如糖，紫胶，或肠包衣剂。
活性化合物或其可药用盐可以以酏剂，悬浮剂，糖浆剂，糯米纸囊剂，口香糖等组分的形式给予。除上述活性化合物外，糖浆剂可包含增甜剂蔗糖和某些防腐剂，染料和着色剂以及矫味剂。
也可以将活性化合物或其可药用盐与其它不削弱所需作用的活性物质，或与补充所需作用的物质，如其它抗癌药，抗生素，抗真菌药，消炎药，或抗病毒化合物混合。
用于非肠道，真皮内，皮下或局部给药的溶液或悬浮液可包含下列组分：灭菌的稀释剂如注射用水，盐水溶液，固定油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂如苯甲醇或对羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐，构椽酸盐或磷酸盐和调节张力的试剂如氯化钠或葡萄糖。非肠道给药的制剂可包封在由玻璃或塑料制成的安瓿，可处理注射器或多剂量小瓶中。
如果通过静脉注射给药，优选的载体是生理盐水或磷酸盐缓冲的盐水(PBS)。
在一个实例中，将活性化合物与保护化合物以防快速从体内消除的载体一起配制成制剂，如控释制剂，包括植入物和微胶囊包封的释放系统。可以使用可生物降解的，生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯，聚酐，聚乙醇酸(Polyglyeolic acid)，胶原蛋白，聚原酸酯，和聚乳酸。对于本领域技术人员来说，制备这些制剂的方法是明显的。
脂质体悬浮液也可以是药用载体。这些可以按照本领域技术人员已知的方法，例如，在美国专利4,522,811中所描述的方法(本文全文引入供参考)制备。例如，可以通过将适宜的脂类(如硬脂酰磷脂酰乙醇胺，硬脂酰磷脂酰胆碱，花生四烯酰(arachadoyl)磷脂酰胆碱，和胆固醇)溶解在无机溶剂中，然后将溶剂蒸发，在容器表面上留下所需脂类的薄膜来制备脂质体制剂。将活性化合物的水溶液加入到该容器中。用于将容器旋转起来，由此将脂类物质从容器壁上游离下来并将脂类聚集体分散，形成脂质体悬浮液。
III.生物活性
大量的生物测定法已被应用，并且本领域技术人员利用这些生物测定法来测定化合物的抗癌活性。这些方法中的任一方法都可用于评估本文所公开的化合物的活性。
一种常用的测定活性的方法是利用国家癌症协会(“NCI”)试验小组的癌细胞系。这些试验可在体外评估特定化合物的抗癌活性并提供体内应用试验化合物时的预测数据。其它测定包括体内评估化合物对植入或移植到裸鼠上的人或鼠肿瘤细胞的作用。测定(-)-OddC在体内抗P388白血病细胞系和C38结肠癌细胞系的抗癌活性。实施例9和10提供试验详细内容和这些试验的结果。
实施例9利用(-)-O-ddc体内处理白血病P388细胞
将106个白血病P388细胞植入由Southern Research Institute，Alabama获得的BDF1鼠的腹膜内(iP)。肿瘤细胞植入后第一天开始，每天两次腹膜内给予(-)-OddC，共5天。通过使用该方法，发现75mg/kg的剂量对受试鼠来说是有毒性的。
图3和表1显示这些研究的结果。在图3中，(●)代表对照组(未治疗的动物)的数据，(--△--)代表以25mg/kg剂量，每天两次给药鼠的存活率，并且(O)代表以50mg/kg剂量，每天一次给予(-)-OddC鼠的存活率。在用(-)-OddC，以25mg/kg剂量治疗的六只鼠中，有一只长期生存者，并且其余五只鼠的寿命增加103％。
                                                                      表1
  组   剂量a(mg/kg)   途径   平均存活时间(天)(days)   ILSb(％) 死亡时间(天) 治愈数c/总数
  对照-OddC   --25×2×5   --ip   13.327   --103   11，12，1313，13，1818，20，22，25，33，45   0/61/6
接种物：在0天时，将106个P388细胞接种到每只鼠的腹膜内。
a：在第1-5天时，每天两次治疗
b：在对照组以上增加的寿命百分数
c：存活者的寿命等于或大于45天
实施例10用(-)-OddC体内处理结肠38肿瘤细胞
将结肠38肿瘤细胞植入BDF1鼠的皮下。将(-)-OddC以25mg/kg的剂量，每天两次给予受试鼠，共5天。如图2所示，结肠肿瘤细胞的生长受到抑制。在图2中，(●)代表对照组动物的数据，并且(▲)代表用(-)-OddC治疗鼠的数据。
实施例11(-)-OddC的体外试验
在NCI’S癌症检查方案中评估(-)-OddC。该试验测定在各种(-)-OddC浓度下，(-)-OddC对各种癌细胞系的抑制作用。在表2中阐述了试验用细胞系。
表2也提供浓度值，在该浓度下，观察试验用细胞系中GI50和TGI。GI50，TGI和LC50是代表浓度的数值，在该浓度下，下文所定义的PG(生长抑制百分数)分别为+50，0和-50。这些数值可通过内插法，由每个细胞系的剂量反应曲线确定，所述曲线是由PG对(-)-OddC浓度的对数(log10)来绘制的。
PG是测得的(-)-OddC对细胞系的作用并且可按照下列两式中的一个计算：
如果(平均OD试验-平均ODto)≥0，那么
PG＝100×(平均OD试验-平均ODto)/(平均OD对照-平均ODto)
如果(平均OD试验-平均ODto)＜0，那么
PG＝100×(平均OD试验-平均ODto)/(平均ODto)其中：
平均ODto＝在将细胞暴露到试验化合物前测得的SRB产生颜色的光学密度平均值。
平均OD试验＝在将细胞暴露到试验化合物后48小时测得的SRB产生颜色的光学密度平均值。
平均OD对照＝在未将细胞暴露到试验化合物后48小时测得的SRB产生颜色的光学密度平均值。
在表2中，前两列描述的是类型(例如白血病)和用(-)-OddC处理的细胞系(例如CCRF-CEM)。第3列指示log10GI50并且第4列指示log10TGT。如果不能通过插入法得到这些反应参数，那么每个反应参数值都是最高的试验浓度并且位于“＞”符号前。例如，如果在给予某特定细胞系的(-)-OddC所有浓度下，所有的PG都超过+50，那么该参数不能通过插入法获得。
                                                           表2
  类型   细胞系   Log10GI50   Log10TGI
  白血病   CCRF-CEM   -6.64   ＞-4.00
  RL-60(TB)   -6.28   ＞-4.00
  K-562   -4.59   ＞-4.00
  BSOLT-4   -6.66   -4.39
  RPMI-2.26   -4.03   ＞-4.00
  SR   -5.95   ＞-4.00
  非小细胞肺癌   A549/ATCC   -6.01   ＞-4.00
  BKVX   ＞-4.00   ＞-4.00
  HOP-62   -6.23   -4.71
  NCI-H23   -4.92   ＞-4.00
  NCI-H322M   ＞-4.00   ＞-4.00
  NCI-H460   -4.32   ＞-4.00
  NCI-H522   -6.06   ＞-4.00
  结肠癌   COLO205   -4.03   ＞-4.00
  HCT-116   -5.23   ＞-4.00
  HCT-15   -5.39   ＞-4.00
  HT29   ＞-4.00   ＞-4.00
  K2112   ＞-4.00   ＞-4.00
  CNS癌   SP-268   -5.18   ＞-4.00
  SP-295   -6.24   ＞-4.00
  SNB-19   -5.71   ＞-4.00
  U251   -4.91   ＞-4.00
  黑素瘤   LOX D6VI   -6.39   ＞-4.00
  MALME-3M   -4.51   ＞-4.00
  M14   -6.27   -5.07
  SK-MEL-28   -4.31   ＞-4.00
  SK-MEL-5   -4.91   ＞-4.00
  类型   细胞系   LOG10GI50   LOG10TGI
  UACC-257   ＞-4.00   ＞-4.00
  UACC-62   -5.53   ＞4.00
  卵巢癌   OROV1   -4.03   ＞-4.00
  OVCAR-3   -4.44   ＞-4.00
  OVCAR-4   ＞-4.00   ＞-4.00
  OVCAR-5   -4.41   ＞-4.00
  OVCAR-8   -5.82   ＞-4.00
  SK-OV-3   -5.35   ＞-4.00
  肾癌   785-4   -5.36   ＞-4.00
  ACHN   -6.46   ＞-4.00
  CAKI-1   -6.65   -4.87
  RXF-393   -6.17   ＞-4.00
  SN12C   -6.27   ＞-4.00
  TK-30   ＞-4.00   ＞-4.00
  UO-31   -5.60   ＞-4.00
  前列腺癌   PC-3   -6.29   ＞-4.00
  DU-145   -6.97   ＞-4.00
  乳腺癌   MCF7   -5.95   ＞-4.00
  MCF7/ADR-RES   -4.97   ＞-4.00
  MDA-MB-231/ATCC   ＞-4.00   ＞-4.00
  HS578T   ＞-4.00   ＞-4.00
  MDA-MB-435   -4.62   ＞-4.00
  MDA-N   -4.33   ＞-4.00
  BT-549   -4.59   ＞-4.00
  T-47D   ＞-4.00   ＞-4.00
图4是显示(-)-OddC对特定细胞系相对选择性的图。向右伸展以条形图代表该细胞系对(-)-OddC的敏感性超过所有试验细胞系的平均敏感性。因为条形图的刻度是对数值，所以条形图右侧2个单位是指该细胞系显示GI50时所需化合物的浓度为全部细胞系所需平均浓度的百分之一，因此，通常该细胞系是对(-)-OddC敏感的。相应地，向左伸展的条形图表示其敏感性低于平均值。从表2中，可以很容易地确定这些细胞系，其浓度对数值(log10)在“＞”的前面。
由图4中可见，每种类型的试验癌细胞中至少有一个细胞系是对(-)-OddC敏感的。某些前列腺癌细胞系，白血病细胞系和结肠癌细胞系表现出对(-)-OddC特别敏感。
实施例12  比较(-)-OddC和AraC
如本发明先有技术中所讨论的，胞嘧啶阿拉伯糖苷(也称阿糖胞苷，arac)是用于治疗急性脊髓细胞性白血病的脱氧胞苷的核苷类似物。它也具有抗急性淋巴细胞性白血病的活性，并且很少用于治疗慢性髓细胞样白血病和非何杰金淋巴瘤。araC的主要作用是抑制核DNA合成。比较(-)-OddC和Arac对肿瘤细胞的毒性是重要的。
将对数生长期的细胞以5000个细胞/ml/孔的密度放在24-孔板中。将药物以不同剂量加到细胞中并将培养基保持培养三代的时间。然后进行亚甲蓝测定和/或直接计数细胞数目。亚甲蓝是染料，它以化学计量方式与存活细胞的蛋白质结合并且可用于间接估测细胞数(Finlay，1984)。通过插入法测定IC50值。所显示的每个值都是5个试验的平均值±标准差，其中每个数据点都重复两次。
在全部试验的肿瘤细胞系中，(-)-OddC的细胞毒性较Arac大。在KB鼻咽癌细胞系中和在两种前列腺癌系DU-145和PC-3中，(-)-OddC明显比AraC更有效。HepG2细胞来源于肝细胞癌并且2.2.15系来源于HepG2细胞，其中HepG2细胞是由复制的肝炎B病毒基因组转染的。CEM细胞来源于急性成淋巴细胞性白血病。由(-)-OddC脱氨基形成的化合物(-)-OddU在任何试验细胞系中都是无毒的。酶研究表明，与AraC不同，AraC因其对脱氨基的敏感性，临床功效大大减小，而(-)-OddC不是脱氨酶的底物。
已确定，(-)-OddC可以在体内磷酸化成单-，二-和三-磷酸核苷酸。这表明，(-)-OddC在磷酸化形式下表现细胞毒性，因为不能使化合物磷酸化的细胞对该化合物是不敏感的。第一个磷酸化酶是人脱氧胞苷激酶。体外酶研究表明，(-)-OddC可以通过该酶磷酸化。
与AraC不同，(-)-OddC不能通过胞苷脱氨酶脱氨基。在固体肿瘤组织中含胞苷脱氨酶可能是在固体肿瘤中缺乏AraC活性的关键因素。这可能部分地说明为什么(-)-OddC在抗裸鼠中HepG2细胞时是活性的，而AraC是无活性的。也解释了为什么(-)-OddC具有与arac不同的抗肿瘤活性谱。因此，在胃肠道中存在胞苷脱氨酶在arac不能口服摄入中发挥重要作用。
                                                    (-)-OddC的生化研究
                                            AraC，(-)-OddC and(-)-OddU的体外细胞毒性
细胞系 AraC   ID50(μM)(-)-OddC (-)-OddU
  KBDU-145PC-3HepG22.2.15CEM   0.152±.0100.170±.0350.200±.0780.125±.0130.145±.0070.030±.010   0.048±.0210.024±.0200.056±.0390.110±.0500.110±.0110.025±.030   ＞30＞30＞30＞30＞30＞30
实施例12  体内研究
3-6周大NCr裸鼠(Taconic免疫缺陷鼠)的每个肋腹皮下植入2×106个HepG2或DU-145细胞并让肿瘤生长。当肿瘤为100-250mg时开始治疗，其中肿瘤的大小通过两脚规测定并按照下式计算：
肿瘤重量(mg)＝长(mm)×宽(mm2)÷2
在0-4天，按指定剂量给予药物，每隔几天测定一次肿瘤大小。如Bell等人在Cancer(phila)36：2437-2440(1975)中所述绘制肿瘤生长曲线，并在图5(a)和5(b)中说明。
通过体重的改变来评估毒性。
尽管Arac的体外毒性与(L)-OddC类似，但在该动物模型中，Arac是无效的。肿瘤提取物的酶分析表明，这并非由于增加dCD活性或减小dCK活性，而可能是肝脏中大量Arac代谢，导致dCD水平增高的结果。与Arac不同，(L)-OddC在HepG2和DU-145异种移植物中是有效的。腹膜内或口服给药治疗HepG2肿瘤后，通过计算得知其净细胞杀伤数(log10)分别为0.67和0.87。DU-145肿瘤的大小变小，到第15天时，肿瘤消退一半。在最后一次治疗后大约25天，肿瘤再次出现，而在第47天后，其生长再次停止。在第60天，将动物处死，并取出肿瘤。肿瘤显示坏死的形态，几乎没有细胞能够将锥虫蓝排除在外。另外，在该组织中不能检测到酶的活性。由动物的重量减小可见所给予的Arac和(L)-OddC剂量的毒性是相同的，并且最初的毒性试验表明，25mg/Kg，每天两次可能是连续5天治疗的最大耐受剂量。以间歇的方式给药可能是优选的给药方式。
本文所显示的体外和体内数据表明，(L)-OddC具有明显的抗癌活性并且在很多方面可能优越于目前常用的脱氧胞苷类似物。它不仅是第一个已显示具有抗癌活性的L-核苷类似物，而且也是第一个能够抑制肿瘤生长的，理想的链终止剂。尽管其非天然立体化学不能抑制(L)-OddC被代谢酶激活或被并入DNA中，但它可能是保护该化合物不被dCD降解的因素。(L)-OddC也是在通常对核苷类似物治疗无反应的固体肿瘤中唯一具有活性的化合物。通常用于临床评估固体肿瘤治疗的药物2’，2’-二氟脱氧胞苷(gemcitibine)仍然容易受到dCD(16)的灭活。由于dCD水平升高的机理是细胞对dcyd类似物如AraC(17)具有抵抗力，因此，(L)-OddC可用于治疗已对这些药物无反应的病人。
IV.在低聚核苷酸和反意义技术中应用(-)-OddC
通常，反意义技术是指通过某种方法来调节基因表达，其中，将合成的低聚核苷酸杂交到互补核酸序列来抑制转录或复制(如果靶序列为DNA)，抑制翻译(如果靶序列为RNA)或抑制加工(如果靶序列为前-RNA)。利用该技术可调节各种细胞活性。简单的实例为通过反意义低聚核苷酸与mRNA的结合来抑制蛋白质的生物合成。在另一实例中，将合成的低聚核苷酸杂交到在双股DNA中的特定基因序列上，形成抑制该基因序列表达的三股配合物(三股螺旋)。反意义低聚核苷酸也可用于通过抑制天然阻遏物的生物合成来间接激活基因表达或通过还原转录末端来直接激活基因表达。反意义低聚核苷酸治疗(AOT)可用于抑制致病基因的表达，其中所述致病基因包括那些与良性或恶性肿瘤细胞无限制生长有关的基因或那些与病毒，包括HIV和HPV复制有关的基团。
低聚核苷酸抗核酸酶的稳定性是体内应用的重要因素。已知3’-核酸外切酶的活性可导致血清中大多数未修饰反意义低聚核苷酸的降解。Vlassov，V.V.，Yakubov，L.A.，“反意义核酸治疗癌症和AIDS的前景”，1991，243-266，Wiley-Liss，Inc.，New York；Nucleic Acid Res.1993，21，145。
在低聚核苷酸的3’-末端，用(-)-OddC或其衍生物取代该核苷酸可以使低聚核苷酸稳定，以抵抗由3’-核酸外切酶引起的降解。或者或另外，可以用(-)-OddC或其衍生物来取代体内核苷酸来抑制由核酸内切酶引起的低聚核苷酸的降解。
根据本公开，本领域任一普通技术人员都可利用(-)-OddC或其衍生物来使大量低聚核苷酸稳定，以抵抗由外切酶或内切酶引起的降解，其中所述低聚核苷酸包括在反意义低聚核苷酸治疗中所使用的核苷酸。所有这些实例都包括在本发明范围内。实施例13提供的是利用(-)-OddC来抑制3’-核酸外切酶活性的一个非限定性实例。
实施例13  由(-)-OddC来抑制3’-核酸外切酶活性
通过序列凝胶测定法来测定来自人H9(淋巴细胞性白血病的T型细胞)的人胞质核酸外切酶活性。简单地说，用具有下列序列20或23个碱的DNA引物来制备3’-终端底物：
3’-CAATTTTGAATTTCCTTAACTGCC-5’
24                         1在由HIV-1RT催化的标准初始反应(standing start reaction)中，将引物在5’-端用[γ-32p]ATP标记，然后退火到互补RNA模板上并在3’-端用dTTP(20mer)dCTP(23mer)或(-)-OddC CTP(23ml)终止。在这些条件下，用dTMP(A)终止20mer，用dCMP(B)或(-)-OddCCMP(C)终止23mer。这些信号股DNA底物用于测定其对胞质中核酸外切酶的敏感性。在10μl含50mM Tris-Hct，pH8.0，1mM MgCl2，1mM二硫苏糖醇，0.1mg/ml牛血清白蛋白，0.18μci/ml 3’-终端底物和2μl核酸外切酶(0.03单位)的反应物中进行测定。将反应物在37℃下孵育指定时间并通过加入4μl 98％甲酰胺，10mM EDTA和0.025％溴酚蓝终止。让样品在100℃下变性5分钟，然后在冰上迅速冷却。将未反应的物质和反应产物在15％聚丙烯酰胺/尿素序列凝胶上分离并通过放射性自显影仪显影。在3’-端具有(-)-OddC的低聚核苷酸对3’-核酸外切酶的抵抗力至少比其它低聚核苷酸大5倍。
对于本领域技术人员来说，根据前面详细描述的本发明说明书，在治疗癌症过程中，修饰或改变本发明是显而易见的事。这些修饰和改变应属于权利要求范围内。

Claims (20)

1.下式化合物或其可药用盐在制备用于治疗宿主动物癌症的药物中用途
Figure C031106700002C1
其中R选自H，F，Cl，-CH3，-C(H)＝CH2，-C＝CH，或-C≡N，Br，-NO2，并且R1和R2选自氢，烷基，酰基，单磷酸酯，磷酸酯和三磷酸酯基。
2.权利要求1的用途，其中R为氟，并且R1和R2为氢。
3.权利要求1或2的用途，其中宿主动物为人。
4.权利要求1或2的用途，其中R为H或F。
5.权利要求1的用途，其中癌症为白血病。
6.权利要求1的用途，其中癌症为结肠癌。
7.权利要求1的用途，其中癌症为膀胱癌。
8.权利要求1的用途，其中癌症为肝细胞癌。
9.权利要求1的用途，其中癌症为乳腺癌。
10.权利要求1的用途，其中癌症是肺癌。
11.权利要求1的用途，其中癌症是鼻咽癌。
12.权利要求1的用途，其中癌症是胰腺癌。
13.权利要求1的用途，其中癌症是卵巢癌。
14.权利要求1的用途，其中癌症是淋巴瘤。
15.权利要求1的用途，其中癌症是前列腺癌。
16.权利要求1或2的用途，其中药物适用于口服给药。
17.权利要求1或2的用途，其中药物为胶囊形式。
18.权利要求1或2的用途，其中药物为片剂形式。
19.权利要求1或2的用途，其中药物通过非肠道给药。
20.权利要求1的用途，其中所述化合物为(-)-(2S，4S)-1-(2-羟甲基-1，3-二氧戊环-4-基)胞嘧啶及其可药用盐，或其(+)-对映体或外消旋的混合物及其可药用盐。
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