ES2219666T3

ES2219666T3 - Compuestos y metodos para el tratamiento del cancer.

Info

Publication number: ES2219666T3
Application number: ES95933071T
Authority: ES
Inventors: Chung K. Chu; Yung-Chi Cheng
Original assignee: Yale University; University of Georgia Research Foundation Inc UGARF
Current assignee: Yale University; University of Georgia Research Foundation Inc UGARF
Priority date: 1994-09-06
Filing date: 1995-09-05
Publication date: 2004-12-01
Anticipated expiration: 2015-09-05
Also published as: IL115156A; JP3979662B2; KR970705393A; WO1996007413A1; ZA957483B; PL318971A1; AP9700939A0; ATE267015T1; CA2199117A1; SK284564B6; NO971015L; CZ297873B6; BG101284A; NO313268B1; CN1448142A; KR100374477B1; SK28197A3; CN1111409C; JPH10506385A; DE69533066D1

Abstract

(-)-(2S,4S)-1-(2-HIDROXIMETIL-1,3-DIOXOLAN-4-IL)CITOSINA (TAMBIEN CONOCIDO COMO L-ODDC) O SU DERIVADO Y SU USO PARA TRATAR TUMORES, INCLUYENDO EL CANCER, U OTRA PROLIFERACION CELULAR ANORMAL O INDESEADA, EN ANIMALES, INCLUYENDO SERES HUMANOS.

Description

Compuestos y métodos para el tratamiento del cáncer.

Campo de la invención

Esta invención está en el área de la química médica, y en particular es la (-)-(2S,4S)-1-(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il)citosina (también denominada (-)-OddC) o su derivado, y su uso para tratar el cáncer en animales, incluyendo seres humanos.

Antecedentes de la invención

Un tumor es una proliferación irregular y desorganizada del crecimiento celular. Un tumor es maligno o canceroso si tiene las propiedades de invasividad y metástasis. La invasividad se refiere a la tendencia de un tumor a entrar en los tejidos que lo rodean, atravesando las láminas basales que definen los límites de los tejidos, entrando de este modo con frecuencia en el sistema circulatorio del cuerpo. La metástasis se refiere a la tendencia de un tumor a migrar a otras zonas del cuerpo y establecer zonas de proliferación lejos del sitio donde aparece inicialmente.

El cáncer ahora es la segunda causa principal de muerte en Estados Unidos. Se ha diagnosticado cáncer a alrededor de 8.000.000 de personas en Estados Unidos, y se esperan 1.208.00 nuevos diagnósticos en 1994. Mueren alrededor de 500.000 personas anualmente de esta enfermedad en este país.

El cáncer no se entiende completamente a nivel molecular. Se sabe que la exposición de una célula a un carcinógeno tal como ciertos virus, ciertos productos químicos, o radiación, conduce a la alteración del ADN que inactiva un gen "supresor" o activa un "oncogén". Los genes supresores son genes reguladores del crecimiento, los cuales cuando mutan, ya no pueden controlar el crecimiento celular. Los oncogenes, inicialmente son genes normales (denominados pro-oncogenes) que por mutación o contexto de expresión alterado se convierten en genes transformantes. Los productos de los genes transformantes producen crecimiento celular inadecuado. Más de veinte genes celulares normales diferentes se pueden convertir en oncogenes por alteración genética. Las células transformadas difieren de las células normales de muchas formas, incluyendo la morfología celular, interacciones célula-célula, contenido de la membrana, estructura del citoesqueleto, secreción de proteínas, expresión génica y mortalidad (las células transformadas pueden crecer indefinidamente).

Todos los diferentes tipos de células del cuerpo se pueden transformar en células de tumor benigno o maligno. El sitio de tumor más frecuente es el pulmón, seguido de colon-recto, pecho, próstata, vejiga, páncreas, y después ovario. Otros tipos de cáncer extendidos incluyen leucemia, cánceres del sistema nervioso central, incluyendo cáncer de cerebro, melanoma, linfoma, eritroleucemia, cáncer uterino, y cáncer de cabeza y cuello.

El cáncer ahora se trata principalmente con una o una combinación de tres tipos de terapias: cirugía, radiación, y quimioterapia. La cirugía implica la eliminación del bulto del tejido enfermo. Aunque la cirugía a veces es eficaz para eliminar tumores localizados en ciertos sitios, por ejemplo, en el pecho, colon, y piel, no se puede usar en el tratamiento de tumores localizados en otras zonas, tales como la columna vertebral, ni en el tratamiento de estados neoplásicos difundidos tales como la leucemia.

La quimioterapia implica la alteración de la replicación celular o metabolismo celular. Se usa con más frecuencia en el tratamiento de la leucemia, así como del cáncer de pecho, pulmón y testicular.

Hay cinco clases principales de agentes quimioterapéuticos que se usan actualmente para el tratamiento del cáncer: productos naturales y sus derivados; antraciclinas; agentes alquilantes; antiproliferativos (también llamados antimetabolitos) y agentes hormonales. Los agentes quimioterapéuticos se denominan con frecuencia agentes antineoplásicos.

Se cree que los agentes alquilantes actúan por alquilación y reticulación de la guanina y posiblemente de otras bases en el ADN, parando la división celular. Entre los agentes alquilantes típicos se incluyen mostazas nitrogenadas, compuestos de etilenimina, sulfatos de alquilo, cisplatino, y diferentes nitrosoureas. Una desventaja de estos compuestos es que no sólo atacan a las células malignas, si no también a otras células que se dividen de forma natural, tales como las de la médula ósea, piel, mucosa gastrointestinal, y tejido fetal.

Los antimetabolitos típicamente son inhibidores de enzimas reversibles o irreversibles, o compuestos que interfieren de otra forma con la replicación, traducción o transcripción de ácidos nucleicos.

Se han identificado varios nucleósidos sintéticos que presentan actividad anticancerígena. Un derivado de nucleósido conocido con fuerte actividad anticancerígena es el 5-fluorouracilo. El 5-fluorouracilo se ha usado clínicamente en el tratamiento de tumores malignos, incluyendo, por ejemplo, carcinomas, sarcomas, cáncer de piel, cáncer de los órganos digestivos, y cáncer de pecho. Sin embargo, el 5-fluorouracilo produce graves reacciones adversas tales como náuseas, alopecia, diarrea, estomatitis, trombocitopenia leucocítica, anorexia, pigmentación y edema. Se han descrito derivados de 5-fluorouracilo con actividad anticancerígena en la patente de EE.UU. 4.336.381, y en las publicaciones de patente Japonesa nº 50-50383, 50-50384, 50-64281, 51-146482, y 53-84981.

La patente de EE.UU. nº 4.000.137 describe que el producto de oxidación con peroxidato de la inosina, adenosina o citidina con metanol o etanol, tiene actividad frente a la leucemia linfocítica.

El arabinósido de citosina (también denominado Citarabina, AraC y Citosar) es un nucleósido análogo de la desoxicitidina, que fue sintetizado por primera vez en 1950, e introducido en medicina clínica en 1963. Actualmente es un importante fármaco en el tratamiento de la leucemia mieloide aguda. También es activo frente a la leucemia linfocítica aguda, y en menor grado, es útil en la leucemia mielocítica crónica y linfoma no Hodgkin. La acción principal de AraC es la inhibición de la síntesis de ADN nuclear. Handschumacher, R. and Cheng, Y., "Purine and Pyrimidine Antimetabolites", Cancer Medicine, Chapter XV-1, 3rd Edition, Edited by J. Holland, et al., Lea and Febigol, publishers.

La 5-azacitidina es un análogo de citidina que se usa principalmente en el tratamiento de la leucemia mielocítica y síndrome mielodisplásico.

El 5'-fosfato de 2-fluoroadenosina (Fludara, también denominado FaraA) es uno de los agentes más activos en el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica. El compuesto actúa inhibiendo la síntesis de ADN. El tratamiento de células con F-araA se asocia con la acumulación de células en el límite de la fase G1/S y en la fase S; es decir, es un fármaco específico de la fase S del ciclo celular. La incorporación del metabolito activo, F-araATP, retarda la elongación de la cadena de ADN. El F-araA también es un potente inhibidor de la ribonucleótido-reductasa, la enzima clave responsable de la formación de dATP.

La 2-clorodesoxiadenosina es útil en el tratamiento de neoplasmas de células B de nivel bajo tales como leucemia linfocítica crónica, linfoma no Hodgkin, y leucemia de células peludas. El espectro de actividad es similar al de Fludara. El compuesto inhibe la síntesis de ADN en células en crecimiento e inhibe la reparación del ADN en células en reposo.

Aunque se han identificado una serie de agentes quimioterapéuticos y se usan actualmente para el tratamiento del cáncer, se buscan nuevos agentes que sean eficaces y que presenten baja toxicidad frente a las células sanas.

Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar compuestos que presentan actividad antitumoral, y en particular, anticancerígena.

Otro objetivo de la presente invención, es proporcionar composiciones farmacéuticas para el tratamiento del cáncer.

Sumario de la invención

Se describe el uso de una composición para fabricar un medicamento para tratar tumores, y en particular, cáncer, en seres humanos y otros animales hospedantes, que incluye administrar una cantidad eficaz de (-)-(2S,4S)-1-(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il)citosina (también denominada (-)-OddC, L-OddC, o (-)-L-OddC), uno de sus derivados farmacéuticamente aceptables, incluyendo un derivado 5' o N^{4}-alquilado o acilado, o una de sus sales farmacéuticamente aceptable, opcionalmente en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En una realización preferida, se proporciona la (-)-(2S,4S)-1-(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il)citosina como el enantiómero indicado (el enantiómero L) y sustancialmente en ausencia de su correspondiente enantiómero (es decir, en una forma enantioméricamente enriquecida, incluyendo enantioméricamente pura).

Se cree que la (-)-(2S,4S)-1-(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il)citosina es el primer ejemplo de un nucleósido "L" que presenta actividad antitumoral. La (-)-(2S,4S)-1-(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il)citosina tiene la estructura ilustrada en la Fórmula I.

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Se ha descubierto que la (-)-(2S,4S)-1-(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il)citosina presenta actividad significativa frente a células de cáncer y presenta baja toxicidad frente a células sanas en el hospedante. Entre los ejemplos no limitantes de cánceres que se pueden tratar con este compuesto se incluyen, cáncer de pulmón, colorrectal, pecho, próstata, vejiga, nasofaríngeo, páncreas, ovario, leucemia, linfoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer del sistema nervioso central (incluyendo cáncer cerebral), carcinoma cervical, melanoma, y cáncer hepatocelular.

En una realización alternativa, se describe una composición para fabricar un medicamento para tratar tumores, y en particular cáncer, en seres humanos y otros animales hospedantes, que incluye administrar una cantidad eficaz de un derivado de L-OddC de fórmula:

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en la que R es F, Cl, -CH_{3}, -C(H)=CH_{2}, -Br, -NO_{2}, -C=CH o -C\equivN, y R^{1} es hidrógeno, alquilo, acilo, monofosfato, difosfato o trifosfato, o uno de sus derivados farmacéuticamente aceptable, opcionalmente en un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente en una forma enantioméricamente enriquecida.

Aunque la realización preferida de esta invención es el uso de los compuestos activos o sus derivados o sus sales en su configuración no natural (la configuración L), los compuestos descritos en la presente memoria o sus derivados o sales se pueden administrar alternativamente en la configuración natural (configuración D) o como una mezcla racémica.

Cualquiera de los compuestos descritos en la presente memoria para usar en el tratamiento de tumores, se puede administrar combinado o alternándolo con otros agentes farmacéuticos antitumorales para aumentar la eficacia de la terapia. Entre los ejemplos se incluyen productos naturales y sus derivados; antraciclinas; agentes alquilantes; antiproliferativos (también llamados antimetabolitos); y agentes hormonales. Específicamente, los agentes incluyen, pero no se limitan, mostazas nitrogenadas, compuestos de etilenimina, sulfatos de alquilo, cisplatino, nitrosoureas, 5-fluoroacilo, citosina-arabinósido, 5-azacitidina, 5'-fosfato de 2-fluoroadenosina, 2-clorodesoxiadenosina, tamoxifeno, actinomicina, amsacrina, bleomicina, carboplatino, carmustina, ciclofosfamida, ciclosporina, daunorrubicina, doxirrubicina, interleuquina, lomustina, mercaptopurina, metotrexato, mitomicina, tioguanina, vinblastina, factores de crecimiento, incluyendo GCSF, GMCSF, y factores de crecimiento de plaquetas; adriamicina, WP-16, hidroxiurea, etopósido; interferones \alpha, \beta y \varsigma, y vincristina. Los métodos para administrar cantidades eficaces de estos agentes se determinan fácilmente, o están descritos, por ejemplo, en The Physician's Desk Reference, última edición, publicado por Medical Economics Data Production Company, y Martindales, The Extra Pharmacopoeia, última edición, publicado por The Pharmaceutical Press. Estos métodos se pueden modificar rutinariamente para optimizar la eficacia de la terapia de combinación y alternación.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 indica la DI_{50} de la (-)-OddC y una combinación de (-)-OddC y THU (tetrahidrouridina, un inhibidor de la citidina-desaminasa) en células de cáncer de colon. La gráfica representa la inhibición del crecimiento como porcentaje de crecimiento del testigo frente a la concentración (\muM). En la gráfica, los datos para la (-)-OddC sola se representan por (\bullet), y los datos para (-)-OddC + THU se representan por (- -\blacktriangle- -).

La Figura 2 es una gráfica del peso del crecimiento del tumor para carcinoma de ratón (Colon 38) tratado dos veces al día con (-)-OddC, con una cantidad de dosificación de 25 mg/kg dos veces al día. La gráfica representa el crecimiento del tumor como un porcentaje del peso del tumor original frente a los días. El tratamiento de los ratones se produjo los días 1, 2, 3, 4 y 5. En la gráfica, los datos para el testigo (sin administración de (-)-OddC) se representan por (\bullet), y los datos para la (-)-OddC se representan por (- -\blacktriangle- -).

La Figura 3 indica la tasa de supervivencia de ratones con leucemia P388 que han sido tratados con (-)-OddC. La gráfica representa el porcentaje de supervivencia frente a los días tratados. El tratamiento de los ratones se produjo los días 1, 2, 3, 4 y 5. En la gráfica, la tasa de supervivencia del testigo (sin administración de (-)-OddC) se representa por (\bullet), la tasa de supervivencia de aquellos a los que se administraron 25 mg/kg dos veces al día de (-)-OddC se representa por (- -\triangle- -), y la tasa de supervivencia de los ratones a los que se administraron 50 mg/kg una vez al día de (-)-OddC se representa por (O).

La Figura 4 es una representación de la sensibilidad relativa de algunas líneas celulares de cáncer a la (-)-OddC basándose en la IC50. Las barras que se extienden a la derecha representan la sensibilidad mayor de la línea celular a la (-)-OddC respecto a la sensibilidad media de todas las líneas celulares ensayadas. Puesto que la escala de la barra es logarítmica, una barra de 2 unidades a la derecha implica que el compuesto alcanza la IC50 para la línea celular con una concentración que es la centésima de la concentración media necesaria para las líneas celulares en conjunto, y por lo tanto la línea celular es excepcionalmente sensible a la (-)-OddC. Las barras que se extienden a la izquierda implican correspondientemente menos sensibilidad que la media.

La Figura 5 es una gráfica de la inhibición del crecimiento de tumor humano por la (-)-OddC (\bullet). Se inocularon
2 x 10^{6} células Hepg2 o DU-145 a ratones NCr sin sistema inmune de tres a seis semanas de edad, por vía subcutánea en cada costado. El tratamiento se inició cuando los tumores estaban en un estado de crecimiento avanzado. Se administraron fármacos dos veces al día, los días 0 a 4, y se midieron los tamaños de los tumores los días indicados. Las curvas en A y B muestran los efectos del fármaco en tumores Hepg2 y tumores DU-145 respectivamente (-O- testigo; -\bullet- AraC, 25 mg/kg, i.p.; -\boxempty-(-)-OddC, 25 mg/kg, p.o.; -\blacksquare-(-)-OddC, 25 mg/kg, i.p.). Cada punto de datos representa la media \pm SD de 10 tumores en la gráfica A y seis tumores en la gráfica B.

Descripción detallada de la invención

La invención como se describe en la presente memoria es el uso de composiciones para tratar tumores, y en particular, cáncer, en seres humanos u otros animales hospedantes, que incluye el uso de una cantidad eficaz de (-)-(2S,4S)-1-(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il)citosina, un derivado del compuesto como se define a continuación en la presente memoria, incluyendo un derivado 5-sustituido o 5' o N^{4}-alquilado o acilado, o una de sus sales fisiológicamente aceptable, opcionalmente en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La (-)-(2S,4S)-1-(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il)citosina se denomina un nucleósido "L". Puesto que los carbonos 2 y 5 del anillo de dioxolano son quirales, sus sustituyentes no hidrógenos (CH_{2}OH y la base citosina, respectivamente) pueden estar en cis (en el mismo lado) o trans (en lados opuestos) con respecto al sistema de anillo de dioxolano. Por lo tanto, los cuatro isómeros ópticos están representados por las siguientes configuraciones (cuando se orienta el resto dioxolano en un plano horizontal tal que el oxígeno en la posición 3 está delante): cis (con ambos grupos "hacia arriba", que corresponde a la configuración de los nucleósidos naturales, denominada un nucleósido "D"), cis (con ambos grupos "hacia abajo", que es la configuración no natural, denominada nucleósido "L"), trans (con el sustituyente de C2 "hacia arriba" y el sustituyente de C5 "hacia abajo") y trans (con el sustituyente de C2 "hacia abajo" y el sustituyente de C5 "hacia arriba"). Se cree que la (-)-(2S,4S)-1-(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il)citosina o su derivado es el primer ejemplo de un nucleósido "L" que presenta actividad antitumoral. Esto es sorprendente, a la luz del hecho de que la configuración de nucleósido "L" no se encuentra en la naturaleza.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "enantioméricamente enriquecido" se refiere a una composición de nucleósido que incluye al menos aproximadamente 95%, y preferiblemente aproximadamente 97%, 98%, 99% o 100% de un solo enantiómero de ese nucleósido. En una realización preferida, la (-)-(2S,4S)-1-(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il)citosina o su derivado o sal, se proporcionan en una composición de nucleósido que consta esencialmente de un enantiómero, es decir, el enantiómero indicado (el enantiómero L), y sustancialmente en ausencia de su correspondiente enantiómero D (es decir, en forma enantioméricamente enriquecida, incluyendo enantioméricamente pura).

El compuesto activo se puede usar en forma de cualquier derivado que por administración al receptor sea capaz de proporcionar directa o indirectamente, el compuesto (-)-L-OddC padre o un derivado 5-sustituido como se ha definido en la presente memoria, o que él mismo presente actividad. Son ejemplos las sales farmacéuticamente aceptables (alternativamente denominadas "sales fisiológicamente aceptables") de (-)-OddC, los derivados en 5 como se han ilustrado antes, y los derivados 5' y N^{4}-acilados o alquilados del compuesto activo (alternativamente denominados "derivados fisiológicamente activos"). En una realización, el grupo acilo es un éster de ácido carboxílico (-C(O)R) en el que el resto no carbonilo del grupo éster se selecciona de alquilo lineal, ramificado o cíclico (típicamente C_{1} a C_{18}, y más típicamente C_{1} a C_{5}), alcarilo, aralquilo, alcoxialquilo incluyendo metoximetilo, aralquilo incluyendo bencilo, alquilo o alcoxi C_{1} a C_{4}; ésteres sulfonato tales como alquil- o aralquil-sulfonilo incluyendo metanosulfonilo, éster de mono, di o trifosfato, tritilo o monometoxitritilo, bencilo sustituido, trialquilsililo (por ejemplo, dimetil-t-butilsililo) o difenilmetilsililo. Los grupos arilo en los ésteres comprenden óptimamente un grupo
fenilo.

Entre los ejemplos específicos de derivados farmacéuticamente aceptables de L-OddC se incluyen:

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en los que R es F, Cl, -CH_{3}, -C(H)=CH_{2}, -C=CH, o -C\equivN, -Br, -NO_{2}, y R_{1} y R_{2} se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo y acilo, incluyendo específicamente metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, t-butilo, isopentilo, amilo, t-pentilo, 3-metilbutirilo, hidrógeno-succinato, 3-clorobenzoato, ciclopentilo, ciclohexilo, benzoilo, acetilo, pivaloilo, mesilato, propionilo, butirilo, valerilo, caproico, caprílico, cáprico, láurico, mirístico, palmítico, esteárico, oleico, y aminoácidos que incluyen, alanilo, valinilo, leucinilo, isoleucinilo, prolinilo, fenilalaninilo, triptofanilo, metioninilo, glicinilo, serinilo, treoninilo, cisteinilo, tirosinilo, asparaginilo, glutaminilo, aspartoilo, glutaoilo, lisinilo, argininilo, e histidinilo. En una realización preferida, el derivado se proporciona como el enantiómero L y sustancialmente en ausencia de su correspondiente enantiómero (es decir, enantioméricamente enriquecido, incluyendo la forma enantioméricamente pura).

La L-OddC o su derivado se pueden proporcionar en forma de sales farmacéuticamente aceptables. Tal como se usa en la presente memoria, la expresión sales o complejos farmacéuticamente aceptables se refiere a sales o complejos de L-OddC o sus derivados que retienen la actividad biológica deseada del compuesto padre y presentan mínimos efectos toxicológicos indeseados, si presentan alguno. Ejemplos de dichas sales son (a) sales de adición de ácido formadas con ácidos inorgánicos (por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico, y sales formadas con ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzoico, ácido tánico, ácido pamoico, ácido algínico, poli(ácido glutámico), ácidos naftalenosulfónicos, ácidos naftalenodisulfónicos, y poli(ácido galacturónico); (b) sales de adición de base formadas con cationes de metales polivalentes tales como cinc, calcio, bismuto, bario, magnesio, aluminio, cobre, cobalto, níquel, cadmio, sodio, potasio, o con un catión orgánico formado a partir de N,N-dibenciletilen-diamina, amonio o etilendiamina; o (c) combinaciones de (a) y (b); por ejemplo, una sal de tanato de
cinc.

Las modificaciones del compuesto activo, específicamente en las posiciones N^{4} y 5'-O, pueden afectar a la solubilidad, biodisponibilidad y velocidad de metabolismo de la especie activa, proporcionando así control del suministro de la especie activa. Además, las modificaciones pueden afectar a la actividad anticancerígena del compuesto, aumentando en algunos casos la actividad frente al compuesto padre. Esto se puede evaluar fácilmente preparando el derivado y ensayando su actividad anticancerígena de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria, u otros métodos conocidos por los expertos en la técnica.

En resumen, la presente invención incluye las siguientes características:

El uso de compuestos como se definen en la fórmula, incluyendo la (-)-(2S,4S)-1-(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il)citosina y sus derivados y sales farmacéuticamente aceptables, o el enantiómero (+) o su mezcla racémica, y sus sales farmacéuticamente aceptables, para fabricar un medicamento para tratar un tumor, incluyendo un tumor canceroso.

II. Preparación de los compuestos activos

La (-)-L-OddC y sus derivados se pueden preparar como se ha descrito antes, de acuerdo con el método descrito con detalle en la Publicación Internacional PCT Nº WO 92/18517, publicado el 29 de Octubre, 1992, por el método descrito en el Esquema 1 y los ejemplos de trabajo 1-7 proporcionados a continuación, o por cualquier otro método conocido por los expertos en la técnica. Estos métodos, u otros métodos conocidos se pueden adaptar para preparar los derivados de L-OddC ejemplificados.

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(Esquema pasa a página siguiente)

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Esquema 1

Síntesis de (-)-OddC

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Ejemplo 1 Preparación de 6-Anhidro-L-gulosa

Se preparó la 6-anhidro-L-gulosa en una etapa a partir de la L-gulosa, por tratamiento de la L-gulosa con un ácido, por ejemplo, HCl 0,5 N, con 60% de rendimiento (Evans, M.E., et al., Carbohydr. Res. (1973), 28, 359). Sin protección selectiva, como se ha hecho antes (Jeong, L. S. et al., Tetrahedron Lett. (1992, 33, 595 y Beach, J.W. et al., J. Org. Chem. (1992, en prensa), (2) se convirtió directamente en el dioxolano-triol (3) por oxidación con NaIO_{4}, seguido de reducción con NaBH_{4}, el cual sin aislar, se convirtió en el derivado de ispropilideno (4). La benzoilación a (5), desprotección a (6) y oxidación del diol (6) dieron el ácido (7). La descarboxilación oxidativa de (7) con Pb(OAc)_{4}
en THF seco dio el acetato (8), producto intermedio clave, con buen rendimiento. El acetato se condensó con las pirimidinas deseadas (por ejemplo, timina sililada y N-acetilcitosina) en presencia de TMSOTf, para dar una mezcla \alpha y \beta, que se separó en una columna de gel de sílice para obtener los isómeros individuales (9 y 10). La desbenzoilación con amoniaco en metanol dio la (-)-OddC (11) deseada.

Ejemplo 2 Preparación de (-)-1,6-Anhidro-\alpha-L-gulopiranosa (2)

Una mezcla de L-gulosa (1) (33 g, 0,127 moles) y HCl 0,5 N (330 ml, 0,165 moles) se refluyó durante 20 horas. La mezcla se enfrió y neutralizó a pH 6 con una resina (Dowex-2, forma de HCO_{3}) con burbujeo de aire. La resina se recicló por lavado con HCl al 10%, agua, metanol, y agua con solución saturada de NaHCO_{3}. La mezcla de reacción se filtró y la resina se lavó con agua (500 ml). Los filtrados combinados se concentraron a sequedad y se secaron a vacío toda la noche. El residuo se purificó en una columna (5 cm de profundidad, gel de sílice, CHCl_{3}-CH_{3}OH, 10:1) para dar un sólido ligeramente amarillo, que se recristalizó en alcohol absoluto para dar un sólido incoloro (2) [R_{f} = 0,43 (CHCl_{3}-CH_{3}OH, 5:1), 7,3g, 35,52%]. La L-gulosa (R_{f} = 0,07, 11 g) obtenida se recicló para dar el producto (2) (5 g, rendimiento total 60%): p.f. 142,5-145ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}) \delta 3,22-3,68 (m, 4H, H -2, -3, -4 y -6a), 3,83 (d, J_{6b, 6a} = 7,25 Hz, 1H, H_{b}-6), 4,22 (seudo t, J_{5,6a} = 4,61 y 4,18 Hz, H, H-5), 4,46 (d, J_{2-OH,2} = 6,59 Hz, 1H, 2-OH, intercambiable con D_{2}O), 4,62 (d, J_{3-OH,3} = 5,28 Hz, 1H, 3-OH, intercambiable con D_{2}O), 5,07 (d, J_{4-OH,4} = 4,84 Hz, 1H, 4-OH, intercambiable con D_{2}O), 5,20 (d, J_{1,2} = 2,19 Hz, 1H, H-1). [\alpha]_{D}^{25} - 50,011 (c, 1,61, CH_{3}OH).

Ejemplo 3 Preparación de (-)-(1'S,2S,4S)-4-(1,2-Dihidroxietil-1,2-O-isopropiliden)-2- (hidroximetil)-dioxolano (4)

Una solución de NaIO_{4} (22,36 g, 0,1 moles) en agua (300 ml) se añadió gota a gota en 10 minutos a una solución del producto (2) (11,2 g, 0,07 moles) en metanol (350 ml) enfriado a 0ºC. La mezcla se agitó mecánicamente durante 15 minutos. Se añadió NaBH_{4} (7,91 g, 0,21 moles) a esta mezcla, y la mezcla de reacción se agitó durante 10 minutos a 0ºC. El sólido blanco se filtró y el sólido se lavó con metanol (300 ml). Los filtrados combinados se neutralizaron con HCl 0,5 N (\sim200 ml) y se concentraron a sequedad. El residuo se secó a vacío toda la noche. El residuo de tipo jarabe se trituró con metanol-acetona (1:5, 1200 ml) usando un agitador mecánico (5 horas) y el sólido blanco (1º) se filtró. El filtrado se concentró a sequedad y el residuo se disolvió en acetona (500 ml) seguido de ácido p-toluenosulfónico (6,63 g, 0,035 moles). Después de agitar durante 6 horas, la mezcla se neutralizó con trietilamina, el sólido (2º) se filtró y el filtrado se concentró a sequedad. El residuo se disolvió en acetato de etilo (350 ml) y se lavó con agua
(50 ml x 2), se secó (MgSO_{4}), se filtró y evaporó para dar el producto (4) bruto (3,6 g) en forma de un jarabe amarillento. La capa acuosa se concentró a sequedad y se secó a vacío. El sólido obtenido (1º y 2º) se combinó con la capa acuosa secada y se recicló por agitación durante 1 hora en metanol-acetona al 10% (900 ml) y ácido p-toluenosulfónico (16 g, 0,084 moles) para dar el producto (4) bruto (5,6 g). El producto (4) bruto se purificó por una columna seca de gel de sílice (CH_{3}OH-CHCl_{3}, 1%-5%) para dar el producto (4) [R_{f} = 0,82 (CHCl_{3}-CH_{3}OH, 10:1) 8,8 g, 61,84%] en forma de un aceite incoloro. RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}) \delta 1,26 y 1,32 (2 X s, 2 X 3 H, isopropilideno), 3,41 (dd, J_{CH2OH,OH} = 6,04 Hz, J_{CH2OH,2} = 3,96 Hz, 2H, CH_{2}OH), 3,56-4,16 (m, 6H, H-4, -5, -1' y -2'), 4,82 (t, J_{OH,CH2} = 6,0 Hz, 1H, CH_{2}OH, intercambiable con D_{2}O), 4,85 (t, J_{2OH,CH2OH} = 3,96 Hz, 1H, H-2). [\alpha]_{D}^{25}-12,48 (c, 1,11, CHCl_{3}). Análisis calculado para C_{9}H_{16}O_{5}: C, 52,93; H, 7,90. Encontrado: C, 52,95; H, 7,86.

Ejemplo 4 Preparación de (+)-(1'S,2S,4S)-4-(1,2-Dihidroximetil-1,2-O-isopropiliden)-2- (O-benzoiloximetil)-dioxolano (5)

Se añadió cloruro de benzoilo (6,5 ml, 0,056 moles) gota a gota a una solución del producto (4) (8,5 g, 0,042 moles) en piridina-CH_{2}Cl_{2} (1:2, 120 ml) a 0ºC y la temperatura se elevó a temperatura ambiente. Después de agitar durante 2 horas, la reacción se hidrolizó con metanol (10 ml) y la mezcla se concentró a sequedad a vacío. El residuo se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (300 ml) y se lavó con agua (100 ml x 2), salmuera, se secó (MgSO_{4}), se filtró, se evaporó para dar un jarabe amarillento que se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (EtOAc-Hexano 4%-30%), para dar el producto (5) [R_{f} = 0,45 (Hexano-EtOAc, 3:1) 10,7 g, 83,4%] en forma de una aceite incoloro. RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 1,35 y 1,44 (2 X s, 2 X 3H, isopropilideno) 3,3-4,35 (m, 6H, H-4, -5, -1' y -2'), 4,44 (d, J = 3,96 Hz, 2H, CH_{2}-OBz), 5,29 (t, J = 3,74 Hz, 1H, H-2), 7,3-7,64, 8,02-8,18 (m, 3H, 2H, -OBz). [\alpha]_{D}^{25}+10,73 (c, 1,75, CH_{3}OH). Análisis calculado para C_{16}H_{20}O_{6}: C, 62,33; H, 6,54. Encontrado: C,62,39; H, 6,54.

Ejemplo 5 Preparación de (+)-(1'S,2S,4S)-4-(1,2-dihidroxietil)-2-(O-benzoiloximetil)- dioxolano (6)

Una mezcla del producto (5) (5,7 g, 0,018 moles) y ácido p-toluenosulfónico (1,05 g, 0,0055 moles) en metanol (70 ml), se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La reacción no se había completado, por lo que el disolvente se evaporó a la mitad del volumen original y se añadieron metanol (50 ml) y ácido p-toluenosulfónico (0,7 g, 3,68 mmoles) adicionales. Después de agitar durante una hora más, la mezcla de reacción se neutralizó con trietilamina y el disolvente se evaporó a sequedad.

El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (Hexano-EtOAc 10%-33%) para dar el producto (6) [R_{f} = 0,15 (Hexano-EtOAc, 1:1) 4,92 g, 99,2%] en forma de un jarabe incoloro. RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}) \delta 3,43 (m, 2H, H-2'), 3,67-4,1 (m, 4H, H-4, -5 y -1'), 4,32 (d, J = 3,73 Hz, 2H, CH_{2}-OBz), 4,60 (t, J = 5,72 Hz,
2'-OH, intercambiable con D_{2}O), 5,23 (t, J = 3,96 Hz, 1H, H-2), 7,45-7,7, 7,93-8,04 (m, 3H, 2H, -OBz). [\alpha]_{D}^{25} + 9,16 (c, 1,01, CHCl_{3}). Análisis calculado para C_{13}H_{16}O_{6}: C, 58,20; H, 6,01. Encontrado: C, 58,02; H, 6,04.

Ejemplo 6 Preparación de (-)-(2S,4S) y (2S,4R)-4-Acetoxi-2-(O-benzoiloximetil)-dioxolano (8)

Una solución de NaIO_{4} (10,18 g, 0,048 moles) en agua (120 ml) se añadió a una solución del producto (6) (3,04 g, 0,011 moles) en CCl_{4}:CH_{3}CN (1:1, 160 ml), seguido de hidrato de RuO_{2} (0,02 g). Después de agitar la mezcla de reacción durante 5 horas, el sólido se separó por filtración sobre celita y el filtrado se evaporó a 1/3 del volumen. El residuo se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (100 ml) y la capa de agua se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (100 ml x 2). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (50 ml), se secaron (MgSO_{4}), se filtraron, se evaporaron a sequedad y secaron a vacío durante 16 horas para dar el producto (7) bruto (2,6 g, 91%).

A una solución del producto (7) bruto (2,6, 0,01 moles) en THF seco (60 ml), se añadieron Pb(OAc)_{4} (5,48 g, 0,0124 moles) y piridina (0,83 ml, 0,0103 moles) en atmósfera de N_{2}. La mezcla se agitó durante 45 minutos en atmósfera de N_{2} y el sólido se separó por filtración. El sólido se lavó con acetato de etilo (60 ml) y las capas orgánicas combinadas se evaporaron a sequedad. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice (Hexano-EtOAc 2:1) para dar el producto (8) [R_{f} = 0,73 y 0,79 (Hexano-EtOAc, 2:1) 1,9 g, 69,34%] en forma de un aceite incoloro. RMN ^{1}H
(CDCl_{3}) \delta 1,998, 2,11 (2X s, 3H, -OAc), 3,93-4,33 (m, 2H, H-5), 4,43, 4,48 (2 X d, J = 3,73, 3,74 Hz, 2H, CH_{2}OBz), 5,46, 5,55 (2 X t, J = 4,18, 3,63 Hz, 1H, H-2), 6,42 (m, 1H, H-4), 7,33-7,59, 8,00-8,15 (m, 3H, 2H, -OBz). [\alpha]_{D}^{25}-12,53 (c, 1,11, CHCl_{3}). Análisis calculado para C_{13}H_{14}O_{6}; C, 58,64; H, 5,30. Encontrado C, 58,78; H, 5,34.

Ejemplo 7 Preparación de (-)-(2S,4S)-1-[2-(benzoil)-1,3-dioxolan-4-il]citosina (9) y (+)-(2S,4R)-1-[2-(benciloxi)-1,3-dioxolan-4-il]citosina (10)

Una mezcla de N^{4}-acetilcitosina (1,24 g, 7,52 mmol) en dicloroetano seco (20 ml), hexametildisilazano (15 ml), y sulfato amónico (cantidad catalítica) se refluyó durante 4 horas en atmósfera de nitrógeno. La solución transparente resultante se enfrió a temperatura ambiente. A esta acetilcitosina sililada se añadió una solución del producto (8) (1,0 g, 3,76 mmoles) en diclorometano seco (10 ml) y TMSOTf (1,46 ml, 7,55 mmoles). La mezcla se agitó durante 6 horas. Se añadió solución saturada de NaHCO_{3}(10 ml) y la mezcla se agitó durante otros 15 minutos y se filtró por una almohadilla de celita. El filtrado se evaporó y el sólido se disolvió en EtOAc y se lavó con agua y salmuera, se secó, filtró y evaporó para dar el producto bruto. Este producto se purificó en una columna de sílice (CH_{3}OH/CHCl_{3} al 5%) para dar una mezcla pura de los productos \alpha y \beta (9) y (10) (0,40 g, 30%), y la mezcla de los productos \alpha y \beta (13) y (14) (0,48 g, 40%). La mezcla del producto (14) se volvió a acetilar para la separación, la mezcla de \alpha y \beta combinada se separó por una columna de sílice larga (CH_{3}OH/CHCl_{3} al 3%) para dar el producto (9) (0,414 g, 30,7%) y (10) (0,481 g, 35,6%) en forma de espumas. Estas espumas se trituraron con CH_{3}OH para obtener sólidos blancos. Producto 9: UV (CH_{3}OH) \lambda máx 298 nm; Análisis (C_{17}H_{17}N_{3}O_{8}) C, H, N. Producto 10: UV (CH_{3}OH) \lambda máx 298 nm.

Ejemplo 8 Preparación de (-)-(2S,4S)-1-(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il)citosina (11)

Una solución del producto (9) (0,29 g, 0,827) en CH_{3}OH/NH_{3}(50 ml, saturado a 0ºC) se agitó a temperatura ambiente durante 10 horas. El disolvente se evaporó y el producto (11) bruto se purificó en placas de sílice preparativas (CH_{3}OH/CHCl_{3} al 20%) para dar un aceite. Éste se cristalizó en CH_{2}Cl_{2}/hexano para dar el producto (11) (0,136 g, 77,7%) en forma de un sólido blanco. UV \lambda máx 278,0 nm (\varepsilon 11967) (pH 2), 270,0 nm (\varepsilon 774) (pH 7), 269,0 nm (\varepsilon 8379) (pH 11); Análisis (C_{8}H_{11}N_{3}O_{4}) C, H, N.

II. Composiciones farmacéuticas

Se pueden tratar seres humanos, animales equinos, caninos, bovinos y otros animales, y en particular, mamíferos que padecen tumores, y en particular, cáncer, por administración al paciente de una cantidad eficaz de (-)-OddC o su derivado o una de sus sales farmacéuticamente aceptable, opcionalmente en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, solo o combinado con otros agentes anticancerígenos o farmacéuticos conocidos. Este tratamiento también se puede administrar junto con otras terapias del cáncer convencionales tales como tratamiento con radiación o cirugía.

Estos compuestos se pueden administrar por cualquier vía adecuada, por ejemplo, por vía oral, parenteral, intravenosa, intradérmica, subcutánea o tópica, en forma líquida, de crema, gel o sólida, o en forma de aerosol.

El compuesto activo está incluido en el vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable en una cantidad suficiente para suministrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz para la indicación deseada, sin producir efectos tóxicos graves en el paciente tratado. Una dosis preferida del compuesto para todos los estados mencionados en la presente memoria, está en el intervalo de aproximadamente 10 ng/kg a 300 mg/kg, preferiblemente de 0,1 a 100 mg/kg por día, más generalmente de 0,5 a aproximadamente 25 mg por kilogramo de peso corporal del receptor por día. Una dosificación tópica típica estará en el intervalo de 0,01 - 3% en peso/peso en un vehículo adecuado.

El compuesto se administra convenientemente en cualquier forma de dosificación unitaria adecuada, incluyendo pero sin limitar, una que contiene de 1 a 3000 mg, preferiblemente 5 a 500 mg de ingrediente activo por forma de dosificación unitaria. Normalmente es conveniente una dosificación oral de 25-250 mg.

El ingrediente activo preferiblemente se administra para lograr concentraciones máximas en el plasma del compuesto activo de aproximadamente 0,00001 - 30 mM, preferiblemente aproximadamente 0,1 - 30 \muM. Esto se puede lograr, por ejemplo, por inyección intravenosa de una solución o formulación del ingrediente activo, opcionalmente en solución salina, o un medio acuoso, o administrando el ingrediente activo en forma de un bolo.

La concentración de compuesto activo en la composición del fármaco dependerá de la absorción, distribución, inactivación, y velocidades de excreción del fármaco, así como de otros factores conocidos por los expertos en la técnica. También hay que indicar que los valores de dosificación variarán con la gravedad del estado que se va a aliviar. Hay que entender además, que para cualquier sujeto particular, se deben ajustar los regímenes de dosificación específicos con el tiempo, de acuerdo con la necesidad individual y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de concentración establecidos en la presente memoria son sólo de ejemplo y no se pretende que limiten el alcance o práctica de la composición reivindicada. El ingrediente activo se puede administrar en una vez, o se puede dividir en una serie de dosis menores para administrar en distintos intervalos de tiempo.

Las composiciones orales en general incluirán un diluyente inerte o un vehículo comestible. Se pueden encerrar en cápsulas de gelatina o comprimir en comprimidos. Para propósitos de administración oral terapéutica, el compuesto activo o su derivado profármaco se puede incorporar con excipientes y usar en forma de comprimidos, trociscos, o cápsulas. Se pueden incluir agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles, y/o materiales adyuvantes como parte de la composición.

Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares, pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente dispersante tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato magnésico o Sterotes; un agente deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente se sabor tal como menta, salicilato de metilo, o sabor de naranja. Cuando la forma unitaria de dosificación es una cápsula, puede contener, además del material del tipo anterior, un vehículo líquido tal como un aceite graso. Además, las formas unitarias de dosificación pueden contener otros materiales diferentes que modifican la forma física de la unidad de dosificación, por ejemplo, revestimientos de azúcar, laca o agentes entéricos.

El compuesto activo o su sal farmacéuticamente aceptable se puede administrar como un componente de un elixir, suspensión, jarabe, oblea, chicle o similar. Un jarabe puede contener, además de los compuestos activos, sacarosa como un agente edulcorante y ciertos conservantes, tintes y colorantes y aromas.

El compuesto activo o sus sales farmacéuticamente aceptables también se pueden mezclar con otros materiales activos que no perjudican a la acción deseada, o con materiales que complementan la acción deseada, tales como otros agentes anticancerígenos, compuestos antibióticos, antifúngicos, antiinflamatorios o antivíricos.

Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica, subcutánea o tópica, pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabén; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para ajustar la tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa. La preparación parenteral se puede encerrar en ampollas, jeringuillas desechables, o viales de múltiples dosis de vidrio o plástico.

Si se administra por vía intravenosa, los vehículos preferidos son solución salina fisiológica o solución salina tamponada con fosfato (PBS).

En una realización, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegerán al compuesto frente a la rápida eliminación del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes o sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como acetato de vinilo-etileno, polianhídridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres, y poli(ácido láctico). Los métodos para preparar dichas formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica.

Las suspensiones de liposomas también pueden ser vehículos farmacéuticamente aceptables. Éstas se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la Patente de EE.UU. nº 4.522.811 (que se incorpora en la presente memoria como referencia en su totalidad). Por ejemplo, las formulaciones de liposomas se pueden preparar disolviendo el(los) lípido(s) adecuado(s) (tales como estearoil-fosfatidil-etanolamina, estearoil-fosfatidil-colina, araquidoil-fosfatidil-colina, y colesterol) en un disolvente inorgánico que después se evapora, dejando detrás una fina película de lípido seco en la superficie del recipiente. Después se introduce una solución acuosa del compuesto activo en el recipiente. Después el recipiente se da vueltas con la mano para liberar el material lipídico de los lados del recipiente y dispersar los agregados lipídicos, formando así la suspensión de liposomas.

III. Actividad biológica

Se han usado una gran variedad de ensayos biológicos y son aceptados por los expertosen la técnica para evaluar la actividad anticancerígena de los compuestos. Se puede usar cualquiera de esos métodos para evaluar la actividad de los compuestos descritos en la presente memoria.

Un método común para evaluar la actividad es usando los paneles de ensayo de líneas celulares de cáncer del National Cancer Institute's ("NCI"). Estos ensayos evalúan la actividad anticancerígena in vitro de compuestos particulares, y proporcionan datos de predicción con respecto al uso de los compuestos ensayados, in vivo. Otros ensayos incluyen evaluaciones in vivo del efecto del compuesto en células tumorales humanas o de ratón implantadas o injertadas en un ratón sin sistema inmune. Se ensayó la actividad anticancerígena de la (-)-OddC in vivo frente a la línea celular de leucemia P388 y la línea celular de cáncer de colon C38. Los Ejemplos 9 y 10 proporcionan los detalles experimentales y resultados de estos ensayos.

Ejemplo 9 Tratamiento in vivo de células de leucemia P388 con (-)-O-ddC

Se implantaron por vía i.p. 10^{6} células de leucemia P388 en ratones BDF1 obtenidos del Southern Research Institute, Alabama. Se administró (-)-OddC por vía i.p. dos veces al día durante cinco días, empezando un día después de la implantación de las células tumorales. Usando este protocolo, se mostró que 75 mg/kg/dosis era tóxico para los ratones.

La Figura 3 y la Tabla 1 muestran los resultados de estos estudios. En la Figura 3, (\bullet) representa los datos para el testigo (animales no tratados), (- -\triangle- -) representa la tasa de supervivencia de aquellos a los que se administraron 25 mg/kg dos veces al día de (-)-OddC, y (o) representa la tasa de supervivencia de los ratones a los que se administraron 50 mg/kg una vez al día de (-)-OddC. De los seis ratones tratados con 25/mg/kg/dosis de (-)-OddC, hay un superviviente a largo plazo, y la duración de vida de los cinco ratones restantes aumento 103%.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Ejemplo 10 Tratamiento in vivo de células de tumor de colon 38 con (-)-OddC

Se implantaron células tumorales de colon 38 por vía sc a ratones BDF1. Se administró (-)-OddC a los ratones dos veces al día durante cinco días, con una dosificación de 25 mg/kg/dosis. El crecimiento de las células tumorales de colon se retrasó como se muestran en la Figura 2. En la Figura 2, (\bullet) representa los datos de los animales testigo, y (\blacktriangle) representa los datos para los ratones tratados con (-)-OddC.

Ejemplo 11 Ensayo in vitro de (-)-OddC

Se evaluó la (-)-OddC en el programa de cribado de cáncer del NCI. El ensayo mide la inhibición de diferentes líneas celulares de cáncer con diferentes concentraciones de (-)-OddC. Las líneas celulares que se ensayaron se exponen en la Tabla 2. La Tabla 2 también proporciona la concentración a la que se observó la IC50 y ITC en las líneas celulares ensayadas. IC50, ITC y CL50 son valores que representan las concentraciones a las que el PC (porcentaje de inhibición del crecimiento), definido a continuación, es +50, 0 y -50, respectivamente. Estos valores se determinaron por interpolación a partir de las curvas de respuesta a la dosis establecidas para cada línea celular, representadas gráficamente como función del PC frente a log_{10} de la concentración de (-)-OddC.

El PC es el efecto medido de la (-)-OddC en una línea celular y se calculó de acuerdo con una de las siguientes expresiones:

Si (DO_{ensayo} media - DO_{t \ cero} media) \geq 0, entonces

PC = 100 x (DO_{ensayo} media - DO_{t \ cero} media)/(DO_{testigo} media - DO_{t \ cero} media)

Si (DO_{ensayo} media - DO_{t \ cero} media) < 0, entonces

PC = 100 x (DO_{ensayo} media - DO_{t \ cero} media)/(DO_{t \ cero} media)

Donde:

DO_{t \ cero} media = La media de las mediciones de densidad óptica del color obtenido de SRB justo antes de la exposición de las células al compuesto de ensayo.

DO_{ensayo} media = La media de las mediciones de la densidad óptica del color obtenido de SRB después de 48 horas de exposición de las células al compuesto de ensayo.

DO_{testigo} media = La media de las mediciones de densidad óptica del color obtenido de SRB después de 48 horas sin exposición de las células al compuesto de ensayo.

En la Tabla 2, las dos primeras columnas describen el subpanel (por ejemplo, leucemia) y la línea celular (por ejemplo, CCRF-CEM) que se trataron con (-)-OddC. La columna 3 indica el log_{10} al que se produce la IC50 y la columna 4 indica el log_{10} al que se produce la ITC. Si estos parámetros de respuesta no se podían obtener por interpolación, el valor dado para cada parámetro de respuesta es la concentración más alta ensayada y está precedida por un signo ">". Por ejemplo, si todos los PC de todas las concentraciones de (-)-OddC dadas en una línea celular particular supera +50, entonces este parámetro no se puede obtener por interpolación.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2

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La Figura 4 es una gráfica que presenta la selectividad relativa de la (-)-OddC para una línea celular particular. Las barras que se extienden a la derecha representan la mayor sensibilidad de la línea celular a la (-)-OddC respecto a la sensibilidad media de todas las líneas celulares ensayadas. Puesto que la escala de la barra es logarítmica, una barra de 2 unidades a la derecha implica que el compuesto alcanza una IC50 para la línea celular con una concentración que es la centésima de la concentración media necesaria para las líneas celulares en conjunto, y por lo tanto la línea celular es excepcionalmente sensible a la (-)-OddC. Las barras que se extienden a la izquierda implican correspondientemente menos sensibilidad que la media. Estas líneas celulares se pueden determinar fácilmente a partir de la Tabla 2, puesto que el log_{10} de la concentración irá precedido por un ">".

Se puede observar en la Figura 4 que al menos una línea celular de cada tipo de célula de cáncer ensayada presenta sensibilidad a la (-)-OddC. Algunas líneas celulares de cáncer de próstata, líneas celulares de leucemia y líneas celulares de colon muestran una extremada sensibilidad a la (-)-OddC.

Ejemplo 12 Comparación de la (-)-OddC y AraC

Como se discute en los antecedentes de la invención, el arabinósido de citosina (también denominado Citarabina, AraC y Citosar) es un nucleósido análogo a la desoxicitidina usado en el tratamiento de leucemia mieloide aguda. También es activo frente a la leucemia linfocítica aguda, y en menor grado, es útil en leucemia mielocítica crónica y linfoma no Hodgkin. La acción principal del AraC es la inhibición de la síntesis de ADN nuclear. Era interesante comparar la toxicidad en las células tumorales de (-)-OddC y AraC.

Se cultivaron en placa células en la fase logarítmica de crecimiento con una densidad de 5000 células/ml/pocillo en placas de 24 pocillos. Se añadieron fármacos a las células con diferentes dosificaciones y los cultivos se mantuvieron durante un periodo de tres generaciones. Al final de este tiempo, se llevaron a cabo ensayos con azul de metileno y/o se contaron directamente el número de células. El azul de metileno es un colorante que se une de una forma estequiométrica a proteínas de células viables y se puede usar para cuantificar indirectamente el número de células (Finlay, 1984). Los valores de la CI_{50} se determinaron por interpolación de los datos representados gráficamente. Cada valor mostrado es la media \pm desviación típica de cinco experimentos, con cada punto de datos hecho por
duplicado.

En todas las líneas celulares tumorales ensayadas, (-)-OddC era más citotóxica que AraC. La (-)-OddC era significativamente más eficaz que AraC en la línea celular de carcinoma nasofaríngeo KB y en las dos líneas celulares de carcinoma de próstata DU-145 y PC-3. Las células HepG2 se producen en carcinoma hepatocelular y la línea 2.2.15 se obtiene de células HepG2 que se transfectaron con una copia del genoma del virus de la hepatitis B. Las células CEM se obtienen de leucemia linfoblástica aguda. (-)-OddU, el compuesto que se formaría por desaminación de la (-)-OddC no era tóxico en ninguna de las líneas celulares ensayadas. Los estudios enzimáticos indican que, a diferencia del AraC cuya eficacia clínica disminuye mucho por su susceptibilidad a la desaminación, la (-)-OddC no es un sustrato para la desaminasa.

Se ha determinado que la (-)-OddC puede ser fosforilada a mono-, di- o tri-fosfato de nucleótido in vivo. Parece que la (-)-OddC presenta su toxicidad celular en una forma fosforilada, porque las células que no son capaces de fosforilar el compuesto son mucho menos sensibles al compuesto. La primera enzima responsable de su fosforilación es la desoxicitidina-quinasa humana. Los estudios enzimáticos in vitro indican que la (-)-OddC puede ser fosforilada por esta enzima.

A diferencia del AraC, la (-)-OddC no es desaminada por la citidina-desaminasa. La presencia de citidina-desaminasa en tejidos de tumores sólidos puede ser un factor clave que interviene, responsable de la falta de actividad de AraC en tumores sólidos. Esto podría explicar en parte porque la (-)-OddC es activa frente a células HepG2 en ratones sin sistema inmune, mientras que AraC es inactivo. También explica porque la (-)-OddC tiene diferentes espectros de actividad antitumoral que AraC. Además, la presencia de citidina-desaminasa en el tracto gastrointestinal puede jugar un papel importante en por qué AraC no se puede tomar por vía oral.

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Ejemplo 12 Estudios in vitro

Se inocularon 2 x 10^{6} células HepG2 o DU-145 en ratones NCr sin sistema inmune, de tres a seis semanas de edad (Taconic Immunodeficient Mice and Rats) por vía s.c. en cada costado, y los tumores se dejaron crecer. El tratamiento se empezó cuando los tumores tenían 100-250 mg, determinado por medición de las dimensiones y se calculó de acuerdo con la fórmula:

Peso del tumor (mg) = longitud (mm) x anchura (mm^{2}) + 2

Se dieron fármacos con las dosis indicadas los días 0 a 4, y los tamaños de los tumores se midieron cada varios días. Las curvas de crecimiento del tumor se generaron como describen Bell et al., Cancer (phila.) 36:2437-2440 (1975), y se ilustran en las Figuras 5(a) y 5(b).

La toxicidad se evaluó por los cambios en el peso corporal.

Aunque la toxicidad in vitro de AraC era similar a la de (L-)-OddC, AraC eran ineficaz en este modelo animal. El análisis enzimático del extracto de tumor indicaba que esto no se debía a la mayor actividad de la dCD o menor actividad de la dCK, si no que podía ser el resultado del importante metabolismo de AraC en el hígado que tiene altos niveles de dCD. A diferencia de AraC, (L)-OddC era eficaz tanto en xenoinjertos de HepG2 como de DU-145. La muerte celular neta (log 10) calculada para los tumores de HepG2 era 0,67 y 0,87 para tratamiento por vía i.p. y oral respectivamente. Los tumores de DU-145 se hicieron más pequeños en tamaño, retrocediendo completamente la mitad de ellos el día 15. Los tumores no empezaron a reaparecer hasta aproximadamente 25 días después del último tratamiento, pero el crecimiento volvió a parar después del día 47. El día 60 los animales se sacrificaron y se sacaron los tumores. Los tumores tenían una morfología necrótica con muy pocas células que pudieran excluir el azul triptán. Además, no se pudieron detectar actividades enzimáticas en este tejido. Las dosis de AraC y (L)-OddC dadas eran tóxicas por igual, como indicaba la pérdida de peso de los animales, y los experimentos de toxicidad preliminares sugieren que 25 mg/kg dos veces al día puede ser la dosis máxima tolerada para cinco días continuos de tratamiento. Se puede preferir un protocolo en el que el fármaco se administre en una base intermitente.

Los datos in vitro e in vivo mostrados aquí demuestran que la (L)-OddC tiene actividad anticancerígena significativa y en muchos sentidos puede ser superior a los análogos de desoxicitidina actualmente disponibles. No sólo es el primer análogo de nucleósido L que se ha mostrado que tiene actividad anticancerígena, si no que también es el primer finalizador de cadena verdadero capaz de inhibir el crecimiento tumoral. Aunque su estereoquímica no natural no impide que la (L)-OddC sea activada por enzimas metabólicas o sea incorporada en el ADN, puede ser un factor que protege a este compuesto de la degradación por la dCD. La (L)-OddC también es única en cuanto que es activa en tumores sólidos que normalmente son insensibles a la terapia con análogos de nucleósidos. El fármaco 2',2'-difluorodesoxicitidina (gemcitibina), que actualmente está sometido a evaluación clínica para el tratamiento de tumores sólidos, todavía es susceptible a la inactivación por la dCD(16). Debido a que el aumento de los niveles de dCD es un mecanismo por el cual las células se hacen resistentes a los análogos de dCyd tales como AraC(17), la (L)-OddC puede ser útil en el tratamiento de pacientes que se han vuelto insensibles a estos fármacos.

IV. Uso de (-)-OddC en oligonucleótidos y en tecnología antisentido

La tecnología antisentido se refiere en general a la modulación de la expresión génica por un procedimiento en el que un oligonucleótido sintético se hibrida con una secuencia de ácido nucleico complementaria para inhibir la transcripción o replicación (si la secuencia diana es ADN), inhibir la traducción (si la secuencia diana es ARN) o inhibir el procesamiento (si la secuencia diana es pre-ARN). Se pueden modular una amplia variedad de actividades celulares usando esta técnica. Un ejemplo sencillo es la inhibición de la biosíntesis de proteína por un oligonucleótido antisentido unido al ARNm. En otra realización, un oligonucleótido sintético se hibrida con una secuencia génica específica en ADN bicatenario, formando un complejo tricatenario (triple) que inhibe la expresión de esa secuencia génica. Los oligonucleótidos antisentido también se pueden usar para activar la expresión génica indirectamente por supresión de la biosíntesis de un represor natural, o directamente reduciendo la terminación de la transcripción. La terapia con oligonucleótidos antisentido (TOA) se puede usar para inhibir la expresión de genes patógenos, incluyendo los que están implicados en el crecimiento incontrolado de células de tumores benignos o malignos, o que están implicados en la replicación de virus, incluyendo VIH y VHB.

La estabilidad de los oligonucleótidos frente a nucleasas es un factor importante para las aplicaciones in vivo. Se sabe que la actividad de la 3'-exonucleasa es responsable de la mayoría de las degradaciones de oligonucleótidos antisentido no modificados en el suero. Vlassov, V.V., Yakubov, L.A., en Prospects for Antisense Nucleic Acid Therapy of Cancers and AIDS, 1991, 243-266, Wiley-Liss, Inc., New York; Nucleic Acids Res., 1993, 21, 145.

La sustitución del nucleótido en el extremo 3' del oligonucleótido por (-)-OddC o su derivado, puede estabilizar al oligonucleótido frente a la degradación por la 3'-exonucleasa. Alternativamente, o además, se puede sustituir un nucleótido interno por (-)-OddC o su derivado para resistir a la degradación del oligonucleótido por endonucleasas.

Dada la discusión de la presente memoria, un experto en la técnica podrá usar la (-)-OddC o su derivado para estabilizar una amplia variedad de oligonucleótidos frente a la degradación tanto por exonucleasas como por endonucleasas, incluyendo nucleósidos usados en terapia con oligonucleótidos antisentido. Se considera que todas estas relaciones están dentro del alcance de esta invención. El Ejemplo 13 proporciona un ejemplo, no limitante, del uso de la (-)-OddC para resistir la actividad de una 3'-exonucleasa.

Ejemplo 13 Resistencia a la actividad de la 3'-exonucleasa por la (-)-OddC

Se determinó la actividad de la exonucleasa citosólica humana de H9 humano (células de leucemia linfocítica de tipo T) por ensayo de secuenciación en gel. Brevemente, se preparó el sustrato 3'-terminado a partir de un cebador de ADN de 20 ó 23 bases de longitud, con la siguiente secuencia:

16

Los cebadores se marcaron en el extremo 5' con [\gamma-^{32}P]ATP, se reasociaron con moldes de ARN complementario y se terminaron en el extremo 3' con dTTP (oligómero de 20 unidades), dCTP (oligómero de 23 unidades) o (-)-OddCTP (oligómero de 23 unidades) en una reacción de inicio constante catalizada por la TI del VIH-1. En estas condiciones, el oligómero de 20 unidades se terminó con dTMP (A), el de 23 unidades se terminó con dCMP (B) o (-)-O-ddCMP (C). Estos sustratos de ADN monocatenarios se usaron para ensayar su susceptibilidad a la exonucleasa citoplasmática. Estos ensayos se hicieron en reacciones de 10 \mul que contenían Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, MgCl_{2} 1 mM, ditiotreitol 1 mM, albúmina de suero bovino 0,1 mg/ml, sustrato 3'-terminado 0,18 \muCi/ml y 2 \mul de exonucleasa (0,03 unidades). Las reacciones se incubaron a 37ºC durante los tiempos indicados, y se terminaron por adición de 4 \mul de formamida al 98%, EDTA 10 mM y azul de bromofenol al 0,025%. Las muestras se desnaturalizaron a 100ºC durante 5 minutos, seguido de rápido enfriamiento en hielo. El material sin reaccionar así como los productos de reacción se separaron en geles de secuenciación de poliacrilamida/urea al 15% y se visualizaron por autorradiografía. El oligonucleótido con (-)-OddC en el extremo 3' era al menos cinco veces más resistente a la 3'-exonucleasa que los otros oligonucleótidos.

Claims

1. Uso de una composición farmacéutica que comprende una cantidad antitumoral eficaz de un compuesto nucleósido \beta-L de acuerdo con la estructura:

9

en la que R^{1} y R^{2} se seleccionan de hidrógeno, acilo y alquilo C_{1} a C_{18}, o su sal farmacéuticamente aceptable, en un vehículo farmacéuticamente aceptable, para fabricar un medicamento para tratar un tumor en un animal hospedante.

2. El uso de la composición de acuerdo con la reivindicación 1, en el que R^{1} y R^{2} son hidrógeno.

3. El uso de la composición de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el grupo alquilo se selecciona de metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, isopropilo, isobutilo, secbutilo, t-butilo e isopentilo.

4. El uso de la composición de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el grupo acilo es -C(O)R, en el que R es un grupo alquilo C_{1} a C_{5}, fenilo o bencilo.

5. El uso de la composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho tumor es canceroso.

6. El uso de la composición de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el vehículo es adecuado para suministro oral.

7. El uso de la composición de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el vehículo es adecuado para suministro intravenoso.

8. El uso de la composición de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el vehículo es adecuado para suministro tópico o transdérmico.

9. Uso de una composición que comprende una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula:

10

en la que R se selecciona de H, F, Cl, -CH_{3}. -C(H)=CH_{2}, -C=CH, -CN, Br, -NO_{2}, y R^{1} y R^{2} se seleccionan de hidrógeno, alquilo, acilo, monofosfato, difosfato y trifosfato, o una de sus sales farmacéuticamente aceptable, opcionalmente en un vehículo farmacéuticamente aceptable, para fabricar un medicamento para tratar un tumor en un animal hospedante.

10. El uso de la composición de la reivindicación 9, en el que R es flúor, y R^{1} y R^{2} son hidrógeno.

11. El uso de la composición de las reivindicaciones 1, 9 ó 10, en el que el animal hospedante es un ser humano.

12. El uso de la composición de las reivindicaciones 1, 9 ó 10, en el que el tumor es canceroso.

13. El uso de la composición de la reivindicación 12, en el que el tumor es leucemia.

14. El uso de la composición de la reivindicación 12, en el que el tumor es cáncer de colon.

15. El uso de la composición de la reivindicación 12, en el que el tumor es cáncer de vejiga.

16. El uso de la composición de la reivindicación 12, en el que el tumor es cáncer hepatocelular.

17. El uso de la composición de la reivindicación 12, en el que el tumor es cáncer de pecho.

18. El uso de la composición de la reivindicación 12, en el que el tumor es cáncer de pulmón.

19. El uso de la composición de la reivindicación 12, en el que el tumor es cáncer nasofaríngeo.

20. El uso de la composición de la reivindicación 12, en el que el tumor es cáncer pancreático.

21. El uso de la composición de la reivindicación 12, en el que el tumor es cáncer ovárico.

22. El uso de la composición de la reivindicación 12, en el que el tumor es linfoma.

23. El uso de la composición de la reivindicación 12, en el que el tumor es cáncer de próstata.

24. Uso de la (-)-(2S,4S)-1-(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il)citosina o sus sales, o del enantiómero (+) o su mezcla racémica, o sus sales farmacéuticamente aceptables, para fabricar un medicamento para el tratamiento o profilaxis de un tumor, incluyendo un tumor canceroso.