RO118748B1

RO118748B1 - Utilizarea unei compoziţii farmaceutice conţinând derivaţi nucleozidici de 1,3-dioxalan, la tratamentul tumorilor

Info

Publication number: RO118748B1
Application number: RO97-00419A
Authority: RO
Inventors: Inc. University Of Georgia Research Foundation; University Yale
Original assignee: Chu Chung K.; Cheng Yung Chi
Priority date: 1994-09-06
Filing date: 1995-09-05
Publication date: 2003-10-30
Also published as: FI970918L; NO971015L; IL115156A0; ES2219666T3; OA10473A; NO971015D0; KR100374477B1; PL318971A1; IL115156A; ATE267015T1; HUT77172A; WO1996007413A1; US20050261320A1; DE69533066D1; NO313268B1; AU704977B2; US7262213B2; EP0781136A1; AP783A; CN1160351A

Abstract

Invenţia se referă la utilizarea unei compoziţii farmaceutice conţinând derivaţi nucleozidici de 1,3-dioxolan, la tratamentul tumorilor, în particular, al cancerului. ŕ

Description

Prezenta invenție se referă la utilizarea unei compoziții farmaceutice conținând derivați nucleozidici de 1,3-dioxolan la tratamentul tumorilor.

O tumoare reprezintă o proliferare neregulată, dezorganizată a creșterii celulelor. O tumoare este malignă, sau canceroasă, dacă ea are proprietățile de invazie și metastază. Invazia se referă la tendința unei tumori de a pătrunde în țesutul înconjurător, trecând prin lamina bazală care definește marginile țesuturilor, pătrunzând astfel deseori în sistemul circulator al organismului. Metastaza se referă la tendința unei tumori de a migra spre alte zone ale organismului și de forma zone de proliferare departe de locul apariției inițiale.

Cancerul reprezintă acum a doua cauză ca importanță a deceselor în Statele Unite. Peste 8000000 de persoane din Statele Unite au fost diagnosticate cu cancer, așteptându-se la 1208000 de noi diagnostice în 1994. Peste 500000 de oameni mor anual din cauza acestei boli în această țară.

Cancerul nu este complet înțeles la nivel molecular. Este cunoscut că expunerea unei celule la un agent cancerigen cum ar fi, anumite virusuri, anumite substanțe chimice, sau radiații, conduce la alterarea ADN care inactivează o genă “supresivă” sau activează o “oncogenă”. Genele supresive sunt gene regulatoare ale creșterii, care prin mutații, nu mai pot controla creșterea celulară. Oncogenele sunt inițial gene normale (numite prooncogene) care prin mutații sau prin alterarea contextului de expresie devin gene de transformare. Produsul genelor de transformare generează creșterea celulară inadecvată. Mai mult de douăzeci de gene celulare normale diferite pot deveni oncogene prin alterarea genetică. Celulele transformate diferă de celulele normale în multe feluri, incluzând morfologia celulară, interacțiunile intracelulare, conținutul membranei, structura citoscheletică, secreția proteinelor, modul de acțiune al genelor și mortalitatea (celulele transformate pot crește indefinit).

Toate tipurile diverse de celule ale organismului pot fi transformate în celule tumorale benigne sau maligne. Cea mai frecventă localizare a tumorii este plămânul, urmată de localizare colorectală, sân, prostată, vezică, pancreas și apoi ovar. Alte tipuri dominante de cancer includ leucemia, cancerul sistemului nervos central, melanomul, limfomul, eritroleucemia, cancerul uterin, și cancerul capului și al gâtului.

Cancerul este acum tratat, în principal, cu una sau cu o combinație a trei tipuri de terapii: chirurgicală, radiație și chemoterapie. Chirurgia implică îndepărtarea de volum a țesutului bolnav. în timp ce chirurgia este uneori eficace în îndepărtarea tumorilor localizate în anumite locuri, de exemplu, în sân, colon, și piele, ea nu poate fi utilizată în tratamentul tumorilor localizate în alte zone, cum ar fi, coloana vertebrală, nici în tratamentul stărilor cancerigene diseminate precum leucemia.

Chemoterapia implică întreruperea multiplicării celulare sau a metabolismului celular. Ea este utilizată cel mai des în tratamentul leucemiei, ca și în cancerul sânului, plămânului și testiculelor.

Există cinci clase importante de agenți chemoterapeutici utilizați curent pentru tratamentul cancerului: produse naturale și derivatele lor; antracicline; agenți de alchilare; antiproliferative (de asemenea, numiți antimetaboliți); și agenți hormonali. Agenții chemoterapeutici sunt denumiți adesea agenți antineoplazici.

Agenții de alchilare se consideră că acționează prin alchilarea și legarea încrucișată a guaninei și eventual a altor baze din ADN, oprind diviziunea celulară. Agenții tipici de alchilare includ iperita azotată, derivați ai etileniminei, sulfați de alchil, cisplatină, și diverse nitrozouree. Un dezavantaj al acestor compuși constă în aceea că ei nu atacă numai celulele maligne, ci și alte celule care se divid natural, cum ar fi acelea din măduva osoasă, piele, mucoasa gastrointestinală, și țesut fetal.

Antimetaboliții sunt în mod tipic inhibitori de enzime reversibili sau ireversibili, sau compuși care interferează în alt mod cu diviziunea, translația sau transcripția acizilor nucleici.

RO 118748 Β1

Au fost identificate numeroase nucleozide sintetice care prezintă activitate anti- 50 canceroasă. Un derivat binecunoscut de nucleozidă cu activitate anticanceroasă este 5fluorouracilul. 5-Fluorouracilul a fost utilizat clinic în tratamentul tumorilor maligne, incluzând, de exemplu, carcinoame, sarcoame, cancer de piele, cancer al organelor digestive și cancerul sânului. 5-Fluorouracilul determină totuși reacții adverse serioase precum greață, alopecie, diaree, stomatită, trombocitopenie leucocitară, anorexie, pigmentare și edem. 55 în brevetul US 4336381 și în brevetele japoneze 50-50383, 50-50384, 50-64281, 51-146482 și 53-84981 sunt descriși derivați de 5-fluorouracil cu activitate anticanceroasă.

în brevetul US 4000137 se descrie că produsul de peroxidare al inozinei, adenozinei sau citidinei cu metanol sau etanol prezintă activitate împotriva leucemiei limfocitare.

Citozina arabinozidă (denumită, de asemenea, citarabină, araC și citozar) este o 60 nucleozidă analogă dezoxicitidinei care a fost sintetizată pentru prima dată în 1950 și introdusă în medicina clinică în 1963. Ea este în prezent un medicament important în tratamentul leucemiei mielocitare acute. Ea este, de asemenea, activă împotriva leucemiei limfoide acute, și într-o măsură mai mică, este utilă în leucemia mielocitară cronică și în limfomul non-Hodgkin. Acțiunea primară a araC constă în inhibarea sintezei ADNului nuclear, 65 așa cum este descris de Handschumacher, R. și Cheng, Y. în “Antimetaboți pe bază de purină și pirimidină”, Cancer Medicine, cap. XV-1, ediția a lll-a, editat de J. Holland și alții, Lea și Febigol.

5-Azacitidina este un analog al citidinei care este utilizat, în special, în tratamentul leucemiei mielocitare și al sindromului mielodisplazic. 70

2-Fluoroadenozin-5'-fosfatul (Fludara, denumită, de asemenea, FaraA) este unul dintre cei mai activi agenți în tratamentul leucemiei limfoide cronice. Compusul acționează prin inhibarea sintezei ADN. Tratamentul celulelor cu F-araA este asociat cu acumularea celulelor la granița fazei G1/S și în faza S; astfel, el este un medicament specific fazei S a ciclului celular. încorporarea metabolitului activ F-araATP întârzie alungirea lanțului ADN. F- 75 araA este un inhibitor puternic al reductazei ribonucleotidă, enzima cheie responsabilă pentru formarea dATP.

2-Clorodezoxiadenozina este utilizată în tratamentul neoplasmelor B-celulare de grad inferior, cum ar fi, leucemia limfocitară cronică, limfomul non-Hodgkins, leucemia celulei părului. Spectrul activității este similar cu cel al Fludara. Compusul inhibă sinteza ADN-ului 80 în celule în creștere și inhibă refacerea ADN-ului în celulele în repaus.

Deși, o serie de agenți chemoterapeutici au fost identificați și sunt utilizați în mod curent în tratamentul cancerului, sunt căutați în continuare noi agenți care să fie eficienți și care să prezinte toxicitate scăzută față de celulele sănătoase.

Prezenta invenție se referă la utilizarea unei compoziții farmaceutice cuprinzând o 85 cantitate eficientă de /3-L-enantiomer al unui compus cu formula:

NHRg

RO 118748 Β1 în care, R¹ și R² sunt selectați din grupul constând din hidrogen, acil, și alchil de la C, la C₁₈, sau sarea farmaceutic acceptabilă a acestuia, într-un purtător acceptabil farmaceutic, la fabricarea,unui medicament pentru tratamentul unei tumori într-un animal gazdă.

Invenția se referă, de asemenea, la utilizarea unei compoziții cuprinzând o cantitate eficientă de compus cu formula:

nhr₂ în care, R este selectat din grupul care constă din H, F, CI, -CH₃, -C(H)=CH₂, -CH=CH, C^N, Br, -NO₂ iar R¹ și R²este selectat din grupul care constă din hidrogen, alchil, acil, monofosfat, difosfat și trifosfat, sau o sare farmaceutic acceptabilă a acestuia, opțional, întrun purtător accepatbil farmaceutic, la fabricarea unui medicament pentru tratamentul unei tumori într-un animal gazdă.

Un alt obiect al invenției se referă la utilizarea (-)-(2S, 4S)-1 -(2-hidroximetil-1,3dioxolan-4-il)citozinei și a derivaților și sărurilor farmaceutic acceptabile ale acesteia, sau a (+)-enantiomerului, sau a amestecului racemic al acesteia și a derivaților și sărurilor acestora acceptabile farmaceutic, la fabricarea unui medicament pentru tratamentul sau profilaxia unei tumori, inclusiv o tumoare canceroasă.

Invenția se referă și la utilizarea (-)-(2S, 4S)-1-(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il) citozinei și a derivaților și sărurilor farmaceutic acceptabile ale acesteia, sau a (+)-enantiomerului, sau a amestecului racemic al acesteia și a derivaților și sărurilor acestora acceptabile farmaceutic la fabricarea unui medicament pentru tratamentul unei proliferări anormale sau nedorite a celulelor.

Avantajul pe care îl prezintă invenția constă în aceea că derivații heterociclici de 1,3dioxolan, precum și compozițiile farmaceutice conținând acești derivați sunt utilizați în tratamentul tumorilor, în particular al cancerului, acționând eficient asupra celulelor canceroase cu toxicitate minimă, sau fără toxicitate, făță de celulele sănătoase.

Este descrisă o metodă și compoziție pentru tratamentul tumorilor și în particular, a cancerului la oameni și la alte animale gazdă care include administrarea unei cantități eficiente de (-)-(2S,4S)-1-(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il)citosină (la care se face referire, de asemenea, ca la (-)-OddC, L-OddC, sau (-)-L-OddC), un derivat farmaceutic acceptabil al acesteia incluzând derivatul 5‘ sau N⁴ alchilat sau acilat, sau o sare farmaceutic acceptabilă a acesteia, eventual într-un purtător farmaceutic acceptabil.

într-o variantă de realizare, derivații descriși în invenție pot fi utilizați pentru a trata stări, în special, cele diferite de tumori sau cancer, care implică proliferarea anormală sau nedorită a celulelor. Exemplele includ boli ale pielii cum ar fi, hipercheratoza (incluzând ihtioza, cheratoderma, lichen, planus și psoriazis), negi, inclusiv negi genitali și pustule, precum și orice proliferare celulară anormală sau nedorită care poate fi tratată cu metotrexat. Derivații activi descriși mai jos pot fi utilizați, de asemenea, pentru a induce sau facilita avorturile.

într-o variantă preferată (-)-(2S,4S)-1-(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il)citosina este obținută ca enantiomerul indicat (L-enantiomerul) și substanțial în absența enantiomerului său corespunzător (adică în forma enantiomeric îmbogățită incluzând forma enantiomeric pură).

RO 118748 Β1

Se consideră că (-)-(2S,4S)-1-(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il)citosina este un prim exemplu de “L”-nucleozidă care prezintă activitate antitumorală. (-)-(2S,4S)-1-(2-hidroximetil1,3-dioxolan-4-il)citosina are structura reprezentată de formula I:

150

155

160

S-a constatat că (-)-(2S,4S)-1-(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il)citosina prezintă activitate semnificativă împotriva celulelor canceroase și prezintă toxicitate scăzută față de celulele sănătoase ale gazdei. Exemple nelimitative de cancer care poate fi tratat cu acești compuși includ cancerul pulmonar, colorectal, de sân, de prostată, vezică, nazogaringian, de pancreas, ovarian, leucemia, limfomul, cancerul de cap și gât, cancerul sistemului nervos central (inclusiv cancerul cranian), carcinomul cervical, melanomul, și cancerul hepatocelular.

într-o variantă de realizare, este descrisă o metodă de obținere a unei compoziții pentru tratamentul tumorilor, și în particular a cancerului sau a altor proliferări celulare anormale sau nedorite, la om și alte animale gazdă, care include administrarea într-o cantitate eficientă a unui derivat de L-OddC cu formula:

165

170

în care, R este F, CI, -CH₃, -C(H)=CH₂, Br, -NO₂ -C=CH, sau -C=N și R¹ este hidrogen, alchil, acil, monofosfat, difosfat, sau trifosfat, sau un derivat farmaceutic acceptabil al acestuia, opțional într-un purtător accepatbil farmaceutic, de preferință în forma îmbogățită enantiomeric. 185

Deși, varianta preferată de realizare a invenției este utilizarea compușilor activi sau a derivaților lor sau a sărurilor lor în configurație nenaturală (configurația L), derivații descriși în invenție, sau derivații, sau sărurile lor pot fi administrați alternativ în configurația lor naturală (configurația D) sau ca amestec racemic. Oricare din compușii descriși în cele ce urmează utilizați în tratamentul tumorilor pot fi administrați în combinație sau alternativ cu alți 190 agenți farmaceutici antitumorali, pentru a crește eficiența terapiei. Exemple includ produse naturale și derivați ai acestora; antracicline; agenți de alchilare; antiproliferative (numiți, de asemenea, antimetaboliți); și agenți hormonali. în mod specific agenții includ, dar nu sunt limitați la iperite azotate, compuși de etilenimină, sulfați de alchil, cisplatină,

RO 118748 Β1 nitrozouree, 5-fluorouracil, citozină arabinozidă, 5-azacitidină, 2-fluoroadenozină-5’-fosfat₎2-clorodezoxiadenosină, tamoxifen, actinomicină, amsacrină, bleomicină, carboplatin, carmustin.ciclofosfamidă, ciclosporina, daunorubicină, doxirubicină, interleuchină, lomustină, mercaptopurină, metotrexat, mitomicină, tioguanină, vinblastină, factori de creștere, incluzând GCSF, GMCSF, și factori de creștere în plăci; adriamicină, WP-16, hidroxiuree, etoposidă; interferoni a, β, și ζ și vincristină. Metode pentru administrarea unor cantități eficiente din acești agenți sunt determinate ușor, sau sunt descrise, de exemplu, în “The Physician’s Desk Reference”, ultima ediție, publicată de Medical Economics Data Production Company, și Martindale, The Extra Pharmacopoeia, ultima ediție, publicată de The Farmaceutical Press. Aceste metode pot fi modificate ca operație de rutină pentru a optimiza eficacitatea terapiei de combinare și alternare.

Fig.1 indică valorile ID^ ale (-)-OddC și o combinație a (-)-OddC + THU (tetrahidrouridină, un inhibitor al citidin-dezaminazei) pentru celulele canceroase ale colonului. Graficul reprezintă inhibarea creșterii ca procent al controlului creșterii funcție de concentrație (μΜ). în grafic, datele pentru (-)-OddC singur sunt reprezentate prin (·), iar datele pentru (-)-OddC + THU sunt reprezentate prin (- ▲ -).

Fig.2 reprezintă un grafic al variației greutății datorită creșterii tumorii pentru carcinomul șoarecelui (Colon 38) tratat de două ori pe zi cu (-)-OddC într-o doză de 25 mg/kg corp pe zi. Graficul reprezintă creșterea tumorii ca procent al greutății inițiale a tumorii în funcție de zile. Tratamentul șoarecilor a avut loc în zilele 1,2, 3, 4 și 5. în grafic, datele pentru control (fără administrare de (-)-OddC) sunt reprezentate prin (·), datele pentru (-)OddC sunt reprezentate prin (- ▲ -).

Fig.3 indică rata de supraviețuire a șoarecilor leucemici P388 care au fost tratați cu (-)-OddC. Graficul reprezintă procentul de supraviețuire funcție de zilele de tratament. Tratamentul șoarecilor a avut loc în zilele 1, 2, 3, 4 și 5. în grafic, rata de supraviețuire a lotului de control (fără administrare de (-)-OddC) este reprezentată prin (·), rata de supraviețuire a acelora cărora li s-a administrat (-)-OddC la 25 mg/kg corp pe zi, de două ori pe zi, este reprezentată prin (- Δ -), iar rata de supraviețuire a șoarecilor cărora li s-a administrat (-)-OddC, o dată pe zi, la 50 mg/kg corp pe zi, este reprezentată prin (o).

Fig.4 este o reprezentare a sensibilității relative a anumitor linii de celule canceroase la (-)-OddC pe baza valorilor GI50. Barele care se extind spre dreapta reprezintă sensibilitatea liniei de celule la (-)-OddC peste sensibilitatea medie a tuturor liniilor de celule testate. Deoarece, scala barelor este logaritmică, o bară cu 2 unități la dreapta indică faptul că respectivul compus a atins GI50 pentru linia de celule la o concentrație de o sutime din concentrația medie necesară pentru toate liniile de celule, și astfel, linia de celule este neobișnuit de sensibilă la (-)-OddC). Barele care se extind la stânga indică în mod corespunzător o sensibilitate mai mică decât media.

Fig.5 este o reprezentare grafică a inhibării creșterii tumorii umane prin (•)-OddC. șoareci NCr în vârstă de la 3 la 6 săptămâni au fost inoculați subcutanat în fiecare flanc cu 2 x 10⁶ celule HepG2 sau DU-145. Tratamentul a fost început atunci când tumorile au atins un stadiu avansat de creștere. Medicamentele au fost administrate de două ori pe zi în zilele 0 până la 4 și mărimea tumorilor a fost măsurată în zilele indicate. Curbele A și B indică efectele medicamentului asupra tumorilor HepG2 și respectiv asupra tumorilor Du-145 (-0control; - · - Arac 25 mg/kg, i.p.; - □ -(-)-OddC, 25 mg/kg, p.o.; - - (-)-OddC, 25 mg/kg, i.p.)). Fiecare punct al datelor reprezintă mediile ± SD a 10 tumori în graficul A și a 6 tumori în graficul B.

Invenția așa cum este descrisă aici prezintă o metodă și compoziție pentru tratamentul tumorilor, și în particular, a cancerului, la om sau la alte animale gazdă, care include administrarea unei cantități eficiente de (-)-(2S,4S)-1-(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il)citosină,

RO 118748 Β1 un derivat al compusului după cum a fost definit mai înainte, incluzând un derivat 5-substituit sau N⁴ alchilat sau acilat, sau o sare fiziologic acceptabilă a acestuia, opțional într-un purtătorfarmaceutic acceptabil.

(-)-(2S,4S)-1-(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il)citosina este definită ca o “L”-nucleozidă. Deoarece, atomii de carbon 2 și 5 ai ciclului dioxolan sunt chirali, substituenții lor nonhidrogen (CH₂OH și baza citosină, respectiv) pot fi cis (pe aceeași parte) sau trans (pe părți opuse) în raport cu sistemul care conține ciclul dioxolanic. Cei patru izomeri optici sunt reprezentați de aceea prin următoarele configurații (când restul dioxolan este orientat într-un plan orizontal, astfel, încât atomul de oxigen din poziția 3 să fie în față): cis (cu ambele grupe “sus”, ceea ce corespunde configurației naturale a nucleozidelor, denumite “D”-nucleozide), cis (cu ambele grupe “jos”, care este configurația nenaturală, denumită “L”-nucleozidă), trans (cu substituentul de la C2 “sus” și substituentul de la C5 “jos”), și trans (cu substituentul de la C2 “jos” și substituentul de la C5 “sus”). Se consideră că, (-)-(2S,4S)-1-(2-hidroximetil-1,3dioxolan-4-il)citosina sau derivatul reprezintă primul exemplu de “L”-nucleozidă cu activitate antitumorală. Acest fapt este surprinzător, ținând cont de faptul că această configurație de “L”-nucleozidă” nu apare în natură.

Așa cum este folosit aici, termenul “îmbogățit enantiomeric” se referă la o compoziție de nucleozidă care include cel puțin aproximativ 95%, de preferință, aproximativ 97%, 98% sau 100% dintr-un singur enantiomer al acestei nucleozide. într-o realizare preferată, (-)(2S,4S)-1 -(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il)citosina, sau derivatul, sau sarea ei sunt prevăzute într-o compoziție de nucleozidă care constă esențial dintr-un enantiomer, adică, enatiomerul indicat (enatiomerul L) și substanțial în absența enantiomerului D corespunzător (adică, în forma enantiomeric îmbogățită, incluzând forma enantiomeric pură).

Compusul activ poate fi administrat ca oricare derivat care prin administrare asupra primitorului, este capabil să asigure direct sau indirect, compusul inițial (-)-L-OddC sau un derivat 5-substituit după cum este altfel definit în invenție, sau care prezintă activitate el însuși. Exemple nelimitative sunt sărurile farmaceutice acceptabile (la care se face referire alternativ ca la “săruri fiziologic acceptabile”) ale (-)-OddC, 5-derivații așa cum este ilustrat mai sus, și derivații 5* și N⁴ acilați sau alchilați ai compusului activ (la care se face referire alternativ ca la “derivați fiziologic activi”). într-o formă de realizare, gruparea acil este un ester de acid carboxilic (-C(O)R) în care partea necarbonilică a grupării ester este selectată dintre alchil liniar, ramificat, sau ciclic (tipic C, până la C₁₈, și mai tipic până la C₅), alcaril, aralchil, alcoxialchil incluzând metoximetil, aralchil incluzând benzii, alchil sau la C₄ alcoxi; esteri sulfonați precum, alchil sau aralchil sulfonil incluzând metansulfonil, esterul mono, di sau trifosfat, tritil sau monoetoxitritil, benzii substituit, trialchilsilil (de exemplu, dimetil-t-butilsilil) sau difenilmetilsilil. Grupările arii din esteri cuprind optim o grupare fenil.

Exemple specifice de derivați farmaceutic acceptabili ai L-O-ddC includ, dar nu sunt limitați la:

245

250

255

260

265

270

275

280

285

290

RO 118748 Β1 în care, R este F, CI, -CH₃, -C(H)=CH₂, -C=CH, sau -C^N, -Br, -NO₂, iar R₁ și R₂ sunt selectați independent din grupul constând din hidrogen, alchil și acil, incluzând specific dar nu limitativ metil, etil, propil, butii, pentil, hexil, izopropil, izobutil, sec-butil, t-butil, izopentil, amil, Fpentil, 3-metilbutiril, hidrogen succinat, 3-clorobenzoat, ciclopentil, ciclohexil, benzoil, acetil, pivaloil, mesilat, propionil, butiril, valeril, caproil, caprilil, capril, laurii, miriștii, palmitil, stearil, oleil și aminoacizi incluzând, dar nefiind limitați la alanil, valinil, leucinil, izoleucinil, prolinil, fenilalaninil, triptofanil, metionil, glicinil, serinil, treoninil, cisteinil, tirosinil, asparaginil, glutaminil, aspartoil, glutaoil, lisinil, argininil, și histidinil. într-o realizare preferată, derivatul este prevăzut ca L-enantiomer și substanțial în absența enantiomerului lui corespunzător (adică, în forma îmbogățită enantiomeric, incluzând forma enantiomeric pură).

L-OddC sau derivații lui pot fi prevăzuți în forma unor săruri farmaceutic acceptabile. Așa cum este utilizat aici, termenul săruri sau complecși farmaceutic acceptabili se referă la săruri sau complecși ai L-OddC sau ai derivaților acesteia care păstrează activitatea biologică dorită a compusului de bază și prezintă efecte toxice minime, sau deloc. Exemple nelimitative de asemenea săruri sunt (a) săruri de adiție acidă formate cu acizi anorganici (de exemplu, acid clorhidric, acid bromhidric, acid sulfuric, acid, fosforic, acid azotic, și altele asemenea), și săruri formate cu acizi organici cum ar fi, acid acetic, acid oxalic, acid tartric, acid succinic, acid malic, acid ascorbic, acid benzoic, acid tanic, acid pamoic, acid alginic, acid poliglutamic, acizi naftalensulfonici, acizi naftalendisulfonici, și acid poligalacturonic; (b) săruri de adiție bazică formate cu cationi de metale polivalente precum zinc, calciu, bismut, bariu, magneziu, aluminiu, cupru, cobalt, nichel, cadmiu, sodiu, potasiu, și altele asemenea, sau cu un cation organic format din Ν,Ν-dibenziletilen-diamină, amoniu sau etilendiamine; sau (c) combinații ale (a) și (b); de exemplu, o sare de tanat de zinc sau altele asemenea.

Modificări ale compusului activ, în special în pozițiile N⁴ și 5'-O, pot afecta solubilitatea, biodisponibilitatea și rata metabolismului speciilor active, furnizând astfel control asupra eliberării speciilor active. Mai mult, modificările pot afecta activitatea anticanceroasă a compusului, în anumite cazuri crescând activitatea peste cea a compusului de bază. Aceasta poate fi ușor evaluată prin prepararea derivatului și testarea activității lui anticanceroase, conform metodelor descrise aici, sau conform altor metode cunoscute specialiștilor în domeniu.

Prezenta invenție include următoarele caracteristici:

(a) (-)-(2S,4S)-1-(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il)citosină și derivații și sărurile acesteia;

(b) (+)-(2S,4S)-1-(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il)citosină și derivații și sărurile acesteia;

(c) (-/+)-(2S,4S)-1 -(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il)citosină și derivații și sărurile acesteia;

(d) (-)-(2S,4S)-1-(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il)citosină și derivații și sărurile acesteia, sau (+)-enantiomerul sau amestecul racemic corespunzător și derivați și săruri ale acesteia farmaceutic acceptabile pentru utilizarea în terapia medicală, de exemplu, pentru tratamentul sau profilaxia unei tumori, incluzând o tumoare canceroasă;

(e) utilizarea (-)-(2S,4S)-1-(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il)citosinei și a derivaților și sărurilor acesteia farmaceutic acceptabile, sau (+)-enantiomerul sau amestecul racemic corespunzător, și derivați și săruri farmaceutic acceptabile ai acestora în fabricarea unui medicament pentru tratamentul unei tumori, incluzând o tumoare canceroasă;

(f) formulări farmaceutice cuprinzând (-)-(2S,4S)-1-(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4il)citosină și derivați și sărurile acesteia farmaceutic acceptabile, sau (+)-enantiomerul sau amestecul racemic corespunzător, sau un derivat sau o sare a acestuia farmaceutic acceptabilă împreună cu un purtător farmaceutic acceptabil;

R0118748 Β1 (g) un procedeu pentru prepararea (2S,4S)-1-(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il) citosinei care cuprinde:

345 (i) reacția citosinei, opțional protejată, cu un 1,3-dioxolan cu formula A:

350 în care, R_1a este hidrogen sau o grupare protectoare a grupării hidroxi, incluzând o grupare acil și L este o grupare scindabilă; și opțional îndepărtarea oricărei grupări protectoare a grupării hidroxil;

(ii) reacția unui compus cu formula B: 355

360

365 (în care, R_1a este definit ca mai sus) cu un agent care servește la transformarea grupării oxo din poziția 4 a inelului uracil într-o grupă amino; oricare din grupările protectoare rămase fiind îndepărtată pentru a obține produsul dorit;

(h) un procedu pentru prepararea unui enatiomer (-) sau (+) al (-)-(2S,4S)-1-(2- 370 hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il)citosinei care constă în supunerea compusului sau derivatului corespunzător (de exemplu, 5‘-esterului) sau derivatului acestora sub forma unui amestec de enantiomeri (-) și (+) la condiții sau reacția cu reactivi (de exemplu, o enzimă adecvată) care servesc la separarea enantiomerilor și dacă este necesar transformarea derivatului rezultat în compusul de bază. în mod alternativ amestecul poate fi trecut printr-o coloană 375 cromatografică cu lichid chiral care separă enantiomerii de acest tip;

(i) un procedu pentru prepararea (2S,4S)-1-(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il)citosinei care constă în reacția unui 1,3-dioxolan protejat, cu formula:

cu o bază citozinică protejată, eventual substituită în poziția 5, folosind un acid Lewis care 385 nu racemizează produsul, cum ar fi, trimetilsilil triflatul.

Referitor la procedeul (g) etapa (i) grupa hidroxi protectoare include grupele protectoare descrise în detaliu mai jos, incluzând acil (de exemplu, acetil), arilacil (de exemplu, benzoil sau benzoil substituit), tritil, sau monometoxitritil, benzii sau benzii substituit, silii

RO 118748 Β1 trisubstituit, incluzând trialchilsilil (de exemplu, dimetil-t-butilsilil) sau difenilmetilsilil. Compusul citosinic poate fi protejat opțional cu grupări silii trisubstituite. Grupările protectoare pot fi îndepărtate într-un mod convențional. Gruparea scindabilă L este grupare scindabilă tipică acelora cunoscută din stadiul tehnicii în chimia nucleozidelor, de exemplu, un halogen, precum clor, fluor, tosil, mesil, triflat sau brom, alcoxi precum metoxi sau etoxi, sau acil precum acetil sau benzoil.

Reacția din procedeul (g) etapa (i) poate fi efectuată într-un solvent organic (de exemplu, 1,2-dicloretan sau acetonitril) în prezența unui acid Lewis, cum ar fi SnCI₄, clorură de titan, sau trimetilsilil triflat.

Compușii cu formula A (în care L reprezintă o grupare acil, de exemplu, o grupare acetil) pot fi obținuți prin reacția unui compus cu formula C:

(în care, R_1a este definit mai sus) cu un agent de reducere, de exemplu, hidrură de litiu și aluminiu, urmată de tratarea cu reactivul convențional adecvat pentru intermediarul dorit, de exemplu, o anhidridă de acid carboxilic, de exemplu, anhidridă acetică, pentru acilare, reactivilor de clorurare sau bromurare,pentru halogenare, sau reactivi de alchilare.

Compusul cu formula C poate fi obținut prin reacționarea unui compus cu formula D:

H ^D cu HOCH₂CO₂H la o temperatură ridicată.

Compusul cu formula E poate fi preparat prin ozonoliza unui alil eter, sau a unui ester, sau a unui ester cu formula CH₂=CH-CH₂-OR, sau a unui dieter, sau diester al 2buten-1,3-diolului cu formula ROCH₂-CH=CH-CH₂OR, în care R este o grupare protectoare, cum ar fi o grupare alchil, silii, sau acil.

Relativ la procedeul (g) etapa (ii), compusul cu formula C poate fi tratat cu 1,2,4triazol, și 4-clorofenil diclorofosfat, pentru a forma compusul corespunzător 4-(1,2,4-triazolil) care este apoi transformat la compusul 4-amino (citidină) dorit prin reacția cu metanol, de exemplu.

Materiile prime cu formulele B și C pot fi preparate, de exemplu, prin reacția unei baze adecvate (opțional protejată) cu un compus cu formula A într-un mod analog aceluia descris în procedeul (g) etapa (i). Uracilul și citosina sunt disponibile comercial de la Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wl 53233, USA.

L-OddC sau derivații săi pot fi transformați într-un ester farmaceutic acceptabil prin reacția cu un agent adecvat de esterificare, de exemplu, o halogenură sau anhidridă acide.

L-OddC sau derivații lui farmaceutic acceptabil pot fi transformați într-o sare corespunzătoare farmaceutic acceptabilă a acestora într-un mod convențional, de exemplu, prin tratare cu o bază corespunzătoare. Esterul sau sarea, poate fi transformat în produsul de bază, de exemplu, prin hidroliza.

R0118748 Β1

440 într-o formă de realizare alternativă, compușii descriși aici pot fi utilizați la tratamentul afecțiunilor, în special, a acelora diferite de tumori sau cancer, care implică proliferarea anormală sau nedorită a celulelor. Exemple includ boli ale pielii, cum ar fi, hipercheratoze (incluzând ihtioza, cheratoderma, lichen planus și psoriazis), negi, incluzând negi genitali și pustule, precum și orice proliferare celulară anormală care poate fi tratată cu metotrexat. Compușii activi descriși aici pot fi de asemenea utilizați pentru a induce sau facilita avortul.

Astfel, invenția include, de asemenea, (-)-(2S,4S)-1-(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4il)citosină și derivații și sărurile corespunzătoare, sau (+)-enantiomerul sau amestecul racemic al acestora, și derivați farmaceutic acceptabili și săruri ai acestora pentru utilizare în terapia medicală, de exemplu, pentru tratamentul sau profilaxia unei proliferări anormale sau nedorite a celulelor; ca și utilizarea (-)-(2S,4S)-1-(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il)citosinei și derivaților ei farmaceutic acceptabili și sărurilor lor, sau (+)-enantiomerul sau amestecul racemic al acestora, și derivații farmaceutic acceptabili și sărurile acestora în fabricarea unui medicament pentru tratamentul proliferări anormale sau nedorite a celulelor.

I. Prepararea compușilor activi (-)-L-OddC și derivații lui pot fi preparați așa cum este descris mai sus, conform metodei descrise în detaliu în WO 92/18517 prin metoda prezentată în Schema 1 și exemplele de realizare 1-7 de mai jos, sau prin orice altă metodă cunoscută de specialiștii în domeniu. Aceste metode sau alte metode cunoscute pot fi adaptate pentru prepararea derivaților exemplificați ai L-OddC.

în continuare, se prezintă 13 exemple de realizare a invenției.

445

450

455

460

IJBiCLPyr

NalOu.taOt

CHptCClt^O

465

(£13)

W

J X· nnpmpililUTw)

MaOH KT

470

ț 3SW) UK XJ»

475

480

KT | KT

-o

485

Schema 1: Sinteza (-)-OddC

RO 118748 Β1

Exemplul 1. Prepararea 6-anhidro-L-gulozei

6-Anhidro-L-guloza se prepară într-o singură etapă din L-guloză prin tratarea Lgulozei cu un acid, de exemplu, HCI 0,5N, cu randament 60% (Evans, M.E. et al., Carbohydr.Res. (1973), 28, 359). Fără protecție selectivă, așa cum s-a procedat mai înainte (Jeong, L.S. et al., Tetrahedron Lett. (1992), 33, 595 și Beach, J.W. et al., J.Org.Chem., (1992) (2) se transformă direct în dioxolan triol (3) prin oxidare cu NalO₄, urmată de reducere cu NaBH₄, care fără izolare se transformă în derivatul izopropiliden (4). Benzoilarea la (5), deprotejarea la (6) și oxidarea diolului (6) conduce la obținerea acidului (7). Decarboxilarea oxidativă a lui (7) cu Pb(OAc)₄ în THF anhidru conduce la obținerea cu randament bun a acetatului (8), intermediarul cheie. Acetatul este condensat cu pirimidinele dorite (de exemplu, timină sililată și N-acetilcitosină) în prezență de TMSOTf pentru a se obține un a, β-amestec, care este separat pe coloană de silicagel pentru a se obține izomerii individuali (9 și 10). Debenzoilarea cu amoniac metanolic conduce la obținerea (-)-OddC (11) dorit.

Exemplul 2. Prepararea (-)-1,6-anhidro-a-L-gulopiranosei (2)

Un amestec de 33 g L-guloză (1) (0,127 mol) și 330 ml HCI 0,5N (0,165 mol) este refluxat timp de 20 h. Amestecul este răcit și neutralizat la pH=6 cu o rășină (Dowex-2, forma HCO₃) cu barbotare de aer. Rășina este recirculată prin spălare cu HC110%, apă, metanol, apă și soluție saturată de NaHCO₃. Amestecul de reacție este filtrat și rășina spălată cu 500 ml apă. Filtratele combinate sunt concentrate la sec și uscate în vid peste noapte. Reziduul este purificat pe o coloană (5 cm adâncime, silicagel, mesh, CHCI₃:CH₃OH, 10:1) pentru a se obține un solid ușor gălbui, care este recristalizat din alcool absolut pentru a se obține un solid incolor (2) (R_t=0,43; CHCI₃-CH₃OH, 5,19, 7,3 g, 35,52%). L-guloza (R_t=0,07, 11 g) obținută este recirculată pentru a se obține 5 g de (2) (randament total 60%): p.t.=142,5...145°C.

Ή-RMN (DMSO-d₆) δ : 3,22-3,68(m, 4H, H-2, -3, -4 și -6a), 3,83(d, 4,.^=7,25 Hz, 1H, Ηζ-6), 4,22(pseudo t, J_{5 6a}=4,61 și 4,18 Hz, H, H-5), 4,46(d, J₂-oh.2=6,⁵⁹ Hz, 1H, 2-OH, schimbabil cu D2O), 4,62(d, J3.OH3=5,28 Hz, 1H, 3-OH, schimbabil cu D2O), 5,07(d, JWH4=4,84 Hz, 1H, 4-OH, schimbabil cu D2O), 5,20(d, J12=2,19 Hz, 1H, H-1) /o/D²⁵-50,011 (c=1,61, CH3OH).

Exemplul 3. Prepararea (-)-(1'S,2S,4S)-4-(1,2-dihidroxietil-1,2-O-izopropiliden)-2hidroximetil)-dioxalanului (4)

O soluție de 22,36 g NalO₄ (0,1 mol) în 300 ml apă se adaugă în picătură, într-un interval de 10 min, la o soluție de 11,3 g (2) (0,07 mol) în 350 ml metanol răcit la 0°C. Amestecul se agită mecanic timp de 15 min. Se adaugă 7,91 g NaBH₄ (0,21 mol) la acest amestec și amestecul de reacție se agită timp de 10 min la 0°C. Solidul alb se filtrează și spală cu 300 ml metanol. Filtratul combinat se neutralizează cu -200 ml HCI 0,5N și se concentrează la sec. Reziduul se usucă în vid peste noapte. Reziduul siropos se triturează cu 1200 ml amestec metanol-acetonă (1:5) folosind un agitator mecanic (5 h) și solidul alb (primul) se filtrează. Filtratul se concentrează la sec și reziduul se dizolvă în 500 ml acetonă și apoi se adaugă 6,63 g acid p-toluensulfonic (0,035 mol). După agitare timp de 6 h, amestecul se neutralizează cu trietilamină, solidul (al doilea) se filtrează și filtratul se concentrează la sec. Reziduul se dizolvă în 350 ml acetat de etil și se spală cu 2x50 ml apă, se usucă pe MgSO₄, se filtrează și se evaporă pentru a se obține 3,6 g de produs (4) brut sub formă de sirop gălbui. Stratul apos se concetrează la sec și se uscat în vid. Solidul obținut (primul și al doilea) se combină cu stratul uscat de apă și se recirculă prin agitare timp de 1 h în 900 ml 10% metanol-acetonă și 16 g acid p-toluensulfonic (0,084 mol) pentru a obține 5,6 g produs (4) brut. Produsul (4) brut se purifică pe coloană uscată de silicagel (CH₃OH-CHCI₃, 1-5%) pentru a se obține 8,8 g de (4). [R_t=0,82 (CHCI₃-CH₃OH, 10:1), 61,84%], sub forma unui ulei incolor.

RO 118748 Β1 ¹H-RMN (DMSO-d6) δ: 1,26 și 1,32 (2xs, 2x3H, izopropiliden), 3,41 (dd, JCh2oh,oh=⁶>0⁴ Hz, Jch2OH2=3,96 Hz, 2H, CH2OH), 3,56-4,16(m, 6H, H-4, -5, -1' și -2'), 4,82(t, Joh,ch2=6.0 Hz, 1H, CH₂OH; schimbabil cu D₂O), 4,85(t, J_2Oh. _Ch₂oh=3,96 Hz, 1H, H-2). [a]_D ²⁵-12,48 (c=1,11, CHCI₃). Analiza: calculat pentru C₉H₁₆O₅: C=52,93; H=7,90; găsit: C=52,95; H=7,86.

Exemplul 4. Prepararea (+)-(TS,2S,4S)-4-(1,2-dihidroximetil-1,2-O-izopropiliden)-2(O-benzoiloximetil)-dioxolanului (5)

6,5 ml de clorură de benzoil (0,56 mol) se adaugă în picătură la o soluție de 8,5 g (4) (0,042 mol) în 120 ml piridină-CH₂CI₂ (1:2) la 0°C și temperatura se mărește la temperatura camerei. După agitare timp de 2 h, reacția se oprește prin adăugare a 10 ml metanol și amestecul se concentrează la sec în vid. Reziduul se dizolvă în 300 ml CH₂CI₂ și se spală cu 2x100 ml apă, saramură, se usucă (MgSO₄), se filtrează, se evaporă pentru a se obține un sirop galben, care este purificat prin trecere pe o coloană cromatografică de silicagel (EtOAc-hexan 4%-30%) pentru a se obține 10,7 g (5) [R_t=0,45 (hexan-EtOAc, 3:1), 83%], sub formă de ulei incolor.

¹H-RMN (CDCI3) δ: 1,35 și 1,44 (2xs, 2x3H, izopropiliden), 3,3-4,35(m, 6H, H-4, -5, -T și -2'), 4,44(d, J=3,96 Hz, 2H, CH2-OBz), 5,29(t, J=3,74 Hz, 1H, H-2), 7,3-7,64, 8,02-8,18(m, 3H, 2H, -OBz). [a]D²⁵ +10,73 (c= 1,75, CH?OH).

Analiza: calculat pentru C₁₆H₂₀O₆: C=62,33; H=6,54; găsit: C=62,39; H=6,54.

Exemplul 5. Prepararea (+)-(1 'S,2S,4S)-4-(1,2-dihidroxietil-2-(O-benzoiloximetil)-1,3dioxolanului (6)

Un amestec de 5,7 g (5) (0,018 mol) și 1,05 g de acid p-toluensulfonic (0,0055 mol) în 70 ml metanol se agită la temperatura camerei timp de 2 h. Reacția nu este completă, astfel, încât solventul se evaporă la jumătate din volumul inițial și se adaugă încă 50 ml metanol și 0,7 g de acid p-toluensulfonic (3,68 mmol). După agitare încă o oră, amestecul de reacție se neutralizează cu trietilamină și solventul se evaporă la sec. Reziduul se purifică pe coloană cromatografică cu silicagel (hexan-EtOAc, 10%-33%) pentru a se obține 4,92 g (6).

[R_t=0,15 (hexan-EtOAc, 1:1), 99,2%], sub formă de sirop incolor.

¹H-RMN (DMSO-dJ δ: 3,43(m, 2H, H-2'), 3,67-4,1 (m, 4H, H-4, -5 și -1‘), 4,32(d, J=3,73 Hz, 2H, CH2-OBz), 4,60(t, J=5,72 Hz, 2'-OH, schimbabil cu D2O), 5,23(t, J=3,96 Hz, 1H, H-2), 7,45-7,7, 7,93-8,04(m, 3H, 2H, -OBz). [a]D²⁵ +9,16 (c=1,01, CHCI3).

Analiza: calculat pentru C₁₃H₁₆O₆: C=58,20; H=6,01; găsit: C=58,02; H=6,04.

Exemplul 6. Prepararea (-)-(2S,4S) și (2S,4R)-4-Acetoxi-2-(O-benzoiloximetil)-1,3dioxolanului (8)

O soluție de 10,18 g de NalO₄ (0,048 mol) în 120 ml apă se introduce într-o soluție de 3,04 g de (6) (0,011 mol) în 160 ml CCI₄:CH₃CN (1:1,), și apoi 0,02 g de hidrat de RuO₂. După ce amestecul de reacție se agită timp de 5 h, solidul se îndepărtează prin filtrare pe Cetită și filtratul se evaporă la 1/3 din volum. Reziduul se dizolvă în 100 ml de CH₂CI₂ și stratul apos se extrage cu 2x100 ml CH₂CI₂. Stratul organic combinat se spală cu 50 ml saramură, se usucă (MgSOJ, se filtrează, se evaporă la sec și se usucă în vid timp de 16 h pentru a se obține 2,6 g de produs brut (7) (91%). La o soluție de 2,6 g (7) brut (0,01 mol) în 60 ml THF uscat se adaugă 5,48 g Pb(OAc)₄ (0,0124 mol) și 0,83 ml piridină (0,0103 mol) sub atmosferă de azot. Amestecul se agită timp de 45 min sub azot și solidul se îndepărtează prin filtrare. Solidul se spală cu 60 ml acetat de etil și stratul organic combinat se evaporă la sec. Reziduul se purifică pe coloană cromatografică de silicagel (hexan-EtOAc, 2:1) pentru a se obține 1,9 g de (8) [R_t=0,73 și 0,79 (hexan-EtOAc, 2:1), 69,34%], sub formă de ulei incolor.

¹H-RMN (CDCIJ δ: 1,998, 2,11(2xs, 3H, -OAc), 3,93-4,33(m, 2H, H-5), 4,43, 4,48(2xd,

J=3,73, 3,74Hz, 2H, CH₂-OBz), 5,46, 5,55(2xt, J=4,18 Hz, 3,63 Hz, 1H, H-2), 6,42(m, 1H,

H-4), 7,33-7,59, 8,00-8,15(m, 3H, 2H, -OBz). [a]_D ²⁵ -12,53(c= 1,11, CHCIJ.

Analiza: calculat pentru C₁₃H₁₄O₆: C=58,64; H=5,30; găsit: C=58,78; H=5,34.

535

540

545

550

555

560

565

570

575

580

585

RO 118748 Β1

Exemplul 7. Prepararea (-)-(2S,4S)-1-[2-(benzoiloximetil)-1,3-dioxolan-4-il]-N⁴- acetilcitosinei (9) și (+)-(2S,4R)-1-[2-(benzoiloximetil)-1,3-dioxolan-4-H]-N⁴-acetil-citosinei (10)

Un amestec de 1,24 g N⁴-acetilcitosină (7,52 mmol) în 20 ml dicloroetan uscat, hexametildisilazan și sulfat de amoniu (cantitate catalitică) se refluxează timp de 4 h într-o atmosferă de azot. Soluția limpede rezultată se răcește la temperatura camerei. La această acetilcitosină sililată se adaugă o soluție de 1,0 g de (8) (3,76 mol) în 10 ml dicloroetan uscat și 1,46 ml TMSOTf (7,55 mmol). Amestecul se agită timp de 6 h. Se adaugă 10 ml de soluție saturată de bicarbonat de sodiu, NaHCO₃ și amestecul se agită încă 15 min și se filtrează prin Celită. Filtratul se evaporă și solidul se dizolvă în EtOAc și se spală cu saramură, se usucă, se filtrează și se evaporă pentru a se obține produsul brut. Acest produs a fost purificat pe coloană de silicagel (5%CH₃OH/CHCI₃) pentru a se obține un amestec σ, β brut de produs (9) și (10) (0,40 g, 30%) și 0,84 g de amestec α,β de (13) și (14) (40%). Amestecul de (14) se reacetilează pentru separare, amestecul combinat α,β se separă pe o coloană lungă de silice (3% CH₃OH/CHCI₃) pentru a se obține 0,414 g de (9) (30,7%) și 0,481 g de (10) (35,6%) sub formă de spume. Aceste spume se triturează cu CH₃OH pentru a se obține solide albe. 9:UV(CH₃OH) Ă max 298 nm.

Analiza (C₁₇H₁₇N₃O₈) C, Η, N. 10: UV(CH₃OH) Ă max 298 nm.

Exemplul 8. Prepararea (-)-(2S,4S)-1-(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il)citosinei (11)

O soluție de 0,29 g de (9) (0,827 mol) în 50 ml CH₃OH/NH₃ (saturată la 0°C) se agită la temperatura camerei timp de 10 h. Solventul se evaporă și produsul brut (11) se purifică pe farfurii preparative de silice (20% CH₃OH/CHCI₃) pentru a se obține un ulei. Acesta este cristalizat din CHjCI/hexan pentru a se obține 0,136 g de produs (11) (77,7%), sub formă de solid alb. UV Ă max 278,0 nm (ξ 11967) (pH=2), 270,0 nm (ξ 774) (pH=7), 269,0 nm (ξ 8379) (pH=11); Analiza (C₈H_nN₃O₄) C, Η, N.

II. Compoziții farmaceutice

Oameni, ecvine, canine, bovine și alte anumale și în particular mamifere, suferind de tumori, și în particular cancer pot fi tratate prin administrare către pacient a unei cantități eficiente de (-)-OddC sau derivații acestuia sau a unei sări farmaceutic acceptabilă a acestuia, eventual într-un purtător sau diluant farmaceutic acceptabil, fie separat, fie din combinație cu alți agenți anticanceroși sau farmaceutici cunoscuți. Acest tratament poate fi, de asemenea, administrat împreună cu alte terapii convenționale folosite în tratarea cancerului, cum ar fi, tratamentul cu radiații sau chirurgical.

Acești compuși pot fi administrați pe orice cale adecvată, de exemplu, oral, parenteral, intravenos, intradermic, subcutanat, sau topic, sub formă de lichid, cremă, gel sau sub formă solidă sau de aerosol.

Compusul activ este inclus în purtătorul sau diluantul farmaceutic acceptabil, într-o cantitate suficientă pentru a se administra unui pacient o cantitate eficientă terapeutic pentru indicația dorită, fără a provoca efecte toxice serioase pentru pacientul care este tratat. O doză preferată de compus pentru toate condițiile menționate în cerere este în intervalul de aproximativ 10 până la 300 mg/kg, de preferință, 0,1 până la 100 mg/kg pe zi, mai general 0,5 până la circa 25 mg/kg corp greutate primitor pe zi. O doză topică tipică este între 0,01 3% gr/gr într-un purtător adecvat.

Compusul este administrat în mod convențional în orice formă adecvată de unitate de dozare, incluzând, dar nefiind limitată la, o formă conținând 1 până la 3000 mg, de preferință, 5 până la 500 mg de ingredient activ pe formă de unitate de dozare. O dozare orală de 25-250 mg este în mod uzual convenabilă.

Ingredientul activ este, de preferință, administrat pentru a obține concentrații plasmatice de vârf ale compusului activ de circa 0,00001- 30 mM, de preferință, de aproximativ 0,1 30 μΜ. Aceasta se poate realiza, de exemplu, prin injectare intravenoasă a unei soluții sau formulări a ingredientului activ, opțional într-un mediu salin sau apos, sau administrat sub formă de bol de ingredient activ.

RO 118748 Β1

Concentrația compusului activ în compoziția de medicament depinde de absorbția, distribuția, inactivarea și vitezele de excreție ale medicamentului precum și de alți factori cunoscuți specialiștilor în domeniu. Este de menționat faptul că valorile de dozare vor varia, de asemenea, cu gravitatea stărilor ce trebuie ameliorate. Este, în continuare, de înțeles că 640 pentru orice subiect particular regimul dozelor specifice trebuie ajustat în timp, conform necesităților individuale și capacității profesionale a persoanei care administrează sau supraveghează administrarea compozițiilor, și că valorile concen-trațiilor stabilite în prezenta descriere sunt date cu titlu de exemplu, și nu ca să limiteze scopul sau practica compoziției revendicate. Ingredientul activ poate fi administrat dintr-o dată, sau poate fi împărțit într-un 645 număr de doze mai mici administrate la diferite intervale de timp. Compozițiile orale vor include, în general, un dialuant inert sau un purtător comestibil. Ele pot fi incluse în capsule de gelatină sau comprimate în tablete. în scopul administrării terapeutice orale, compusul activ sau derivatul promedicamentului său poate fi încorporat cu excipiente și utilizat sub formă de tablete, comprimate sau capsule. Lianți farmaceutic compatibili și/sau materiale 650 adjuvante pot fi incluse ca parte a compozițiilor.

Tabletele, pilulele, capsulele, comprimatele destinate dizolvării în gură și altele asemenea pot conține oricare din următoarele ingrediente, sau compuși de natură similară: un liant cum ar fi celuloza microcristalină, guma tragacantă sau gelatina; un excipient ca amidonul sau lactoza; un agent de dispersare, cum ar fi, acidul alginic, Primogel sau amidon de 655 porumb; un lubrifiant cum ar fi stearatul de magneziu sau Sterotes; un glisant cum ar fi dioxidul de siliciu coloidal; un edulcorant cum ar fi, zaharoza sau zaharina; un agent aromatizant cu gust de mentă, salicilat de metil sau cu gust de portocală. Atunci când unitatea de dozare este sub forma unei capsule ea poate conține, în plus față de materialul de tipul menționat mai sus, un purtător lichid cum ar fi, un ulei gras. în plus, formele de unitate de 660 dozare pot conține numeroase alte materiale care modifică forma fizică a unității de dozare de exemplu, învelișuri de zahăr, șelac sau agenți enterici.

Compusul activ, sau sarea farmaceutic acceptabilă a acestuia, poate fi administrat ca o componentă a unei licori, suspensii, sirop, napolitană, gumă de mestecat sau altele asemenea. Un sirop poate conține în plus față de compușii activi, zaharoză, ca edulcorant, și 665 anumiți conservanți, coloranți și arome.

Compusul activ, sau sărurile farmaceutic acceptabile ale acestuia, poate fi amestecat, de asemenea, cu alte materiale active care nu împiedică acțiunea dorită, sau cu materiale care potențează acțiunea dorită, cum ar fi, alți agenți anticanceroși, antibiotice, antifungice, antiinflamatoare sau compuși antivirali. 670

Soluțiile sau suspensiile utilizate pentru aplicațiile parenterale, intradermale, subcutanate, sau topice pot include următoarele componente: un diluant steril cum ar fi, apa pentru injecții, soluție salină, uleiuri stabile, polietilen glicoli, glicerină, propilen glicol sau alți solvenți sintetici; agenți antibacterieni cum ar fi alcoolul benzilic sau metil parabenul; antioxidanți cum ar fi, acidul ascorbic sau bisulfitul de sodiu, agenți chelatori, cum ar fi, acidul etilen- 675 diaminotetraacetic; substanțe tampon cum ar fi, acetații, citrații sau fosfații și agenți pentru ajustarea tonusului cum ar fi, clorura de sodiu sau dextroza. Preparatele parenterale pot fi închise în fiole, seringi de unică folosință sau flacoane multi-doză confecționate din sticlă sau material plastic.

Dacă se administrează intravenos purtătorii preferați sunt soluții saline fiziologice sau 680 soluții saline tamponate cu fosfat (PBS).

într-o formă de realizare compușii acitivi sunt preparați cu purtători care protejează compusul împotriva eliminării rapide din organism, cum ar fi o formulare cu eliberare controlată incluzând implanturi și sisteme microîncapsulate de furnizare. Se pot folosi polimeri biodegradabili, biocompatibili, cum ar fi, etilen vinii acetatul, polianhidridele, acidul poliglicolic, 685 colagenul, poliortoesterii și acidul poliacetic. Metodele de preparare a unor astfel de formulări sunt evidente pentru specialiștii în domeniu.

RO 118748 Β1

Suspensiile lipozomice pot fi, de asemenea, purtători farmaceutic acceptabili. Acestea pot fi preparate conform metodelor cunoscute de specialiști, de exemplu, așa cum este descris în brevetul US 4522811 (dat ca referință în descriere). De exemplu, formulările lipozomice pot fi preparate prin dizolvarea lipidei (lipidelor) adecvate (cum ar fi, stearoil fosfatidil etanolamina, stearoil posfatidil colina, aracadoil fosfatidil colina și colesterolul) întrun solvent anorganic care este apoi evaporat, lăsând un film subțire de lipidă uscată pe suprafața containerului. O soluție apoasă de compus activ este apoi introdusă în container. Containerul este apoi agitat manual pentru a dezlipi materialul lipidic de pe laturile containerului și a dispersa agregatele lipidice, prin aceasta formându-se o suspensie lipozomică.

III. Activitate biologică

Un număr mare de teste biologice au fost utilizate și acceptate de specialiștii în domeniu pentru punerea în evidență a activității anticanceroase a compușilor. Oricare din aceste metode poate fi folosită pentru a evalua activitatea compușilor descriși în prezenta invenție.

O metodă uzuală de testare a activității este prin utilizarea listelor de teste ale liniilor celulare canceroase ale Institutului Național al Cancerului (“NCI”). Aceste teste evaluează in vitro activitatea anticanceroasă a unor compuși particulari, și furnizează predicții referitoare la utilizarea compușilor de testat in vivo. Alte teste includ evaluări in vivo ale efectelor compușilor asupra celulelor tumorale, umane sau ale șoarecilor, implantate în sau grefate pe șoareci. (-)-OddC a fost testată in vivo pentru activitatea sa anticanceroasă împotriva liniei P388 de celule leucemice și liniei C38 de celule de cancer de colon. Exemplele 9 și 10 furnizează detalii și rezultate experimentale ale acestor teste.

Exemplul 9. Tratamentul in vivo al celulelor P388 leucemice cu (-)-OddC

Un număr de 10® celule P388 leucemice se implantează ip la șoareci BDF1 obținuți de la Southem Research Institute, Alabama. (-)-OddC se administreză ip de două ori pe zi timp de 5 zile începând din ziua următoare implantării celulei tumorale. Folosind acest tratament, doza de 75 mg/kg se dovedește a fi toxică pentru șoareci.

Fig. 3 și tabelul 1 prezintă rezultatele acestor studii. în fig. 3, (· ) reprezintă datele de control (animale netratate), (- Δ -) reprezintă rata de supraviețuire a acelora cărora li s-a administrat (-)-OddC în doză de 25 mg/kg corp pe zi, de două ori pe zi, și (O) reprezintă rata de supraviețuire a șoarecilor cărora li s-a administrat (-)-OddC o dată pe zi câte 50 mg/kg corp pe zi. Din cei șase șoareci tratați cu doză de 25 mg/kg/doză de (-)OddC a existat un supraviețuitor pe termen lung și durata de viață a celorlalți cinci s-a mărit cu 103 %.

Tabelul 1

Grup	Doză, mg/kg	Cale	Durată medie de supraviețuire, zile	ILS%	Timpul decesului, zile	Vindecări/ total
Control	—	—	13,3	—	11,12,13 13,13,18	0/6
-OddC	25x2x5	ip	27	103	18,20,22 25,33,45	1/6

Inoculum: 10® celule P388 au fost inoculate ip în fiecare șoarece în ziua 0 a: Tratamentul a fost administrat de două ori pe zi în zilele 1 la 5 b: Durata de viață mărită în procente față de control c: Supraviețuitori cu durată de viață egală sau mai mare de 45 de zile

R0118748 Β1

735

Exemplul 10. Tratamentul in vivo al celulelor tumorale colon 38 cu (-)-OddC

Celulele tumorale colon 38 au fost implantate sc la șoareci BDF1. (-)-OddC a fost administrat la șoareci de două ori pe zi timp de 5 zile, într-o doză de 25 mg/kg/doză. Creșterea celulelor tumorale de colon a fost întârziată, așa cum se arată în fig.2. în fig. 2, (·) reprezintă datele provenite de la animalele de control și (▲) reprezintă datele de la șoarecii tratați cu (-)-OddC.

Exemplul 11. Testarea in vitro a (-)-OddC (-)-OddC este evaluat în programul de monitorizare a cancerului de la NCI. Testul măsoară inhibarea diverselor linii de celule canceroase la diverse concentrații de (-)-OddC. Liniile celulare care au fost testate sunt prezentate în tabelul 2.

Tabelul 2 prezintă, de asemenea, concentrația la care GI50 și TGI au fost observate în liniile celulare testate. GI50, TGI și LC50 sunt valori care reprezintă concentrațiile la care PG (procentul de inhibare a creșterii), definit mai jos, este +50, 0 și respectiv -50. Aceste valori au fost determinate prin interpolare din curbele de răspuns la dozele stabilite pentru fiecare linie celulară, reprezentate grafic ca funcție a PG în raport cu log₁₀ al concentrației de (-)-OddC.

PG reprezintă efectul măsurat al (-)-OddC asupra unei linii celulare și se calculează conform uneia din următoarele expresii: Dacă (Od_test mediu - Od_teero mediu) > 0, atunci

PG = 100 x (Od_test mediu - Od_teero mediu) / (Od_ctrl mediu - Od_Uero mediu).

Dacă (Od_test mediu - Od_tero mediu) < 0, atunci PG = 100 x (Od_test mediu - Od_teero mediu) / (Od^ mediu).

în care: Od^ mediu = media măsurătorilor de densitate optică a culorii derivate SRB înainte de expunerea celulelor la compusul de testat.

Od_test mediu = media măsurătorilor de densitate optică a culorii derivate SRB după 48 h expunere a celulelor la compusul de testat.

Od_ctrl mediu = media măsurătorilor de densitate optică a culorii derivate SRB după 48 h fără expunere a celulelor la compusul de testat.

în tabelul 2 primele două coloane prezintă sublista (de exemplu, leucemia) și linia celulară (de exemplu, CCRF-CEM) care au fost tratate cu (-)-Oddc. Coloana 3 indică log₁₀la care apare GI50 și coloana 4 indică log₁₀ la care apare TGI. Dacă acești parametrii de răspuns nu pot fi obținuți prin interpolare, valoarea dată pentru fiecare parametru de răspuns este concentrația cea mai mare testată și este precedată de un semn De exemplu, dacă toate PG la toate concentrațiile de (-)-OddC date pentru o linie celulară particulară depășesc +50, atunci acest parametru nu poate fi obținut prin interpolare.

740

745

750

755

760

765

Tabelul 2

Listă	Linia de celule	Log_inGI50	Log₁₀TGI
Leucemie	CCRF-CEM	-6,64	>-4,00
	RL-60(TB)	-6,28	>-4,00
	K-562	-4,59	>-4,00
	BSOLT-4	-6,66	-4,39
	RPMI-2,26	-4,03	>-4,00
	SR	-5,95	>-4,00

770

775

RO 118748 Β1

Tabelul 2 (continuare)

Listă	Linia de celule	Log₁₀GI50	Log₁₀TGI
Cancer pulmonar celule non mici	A549/ATCC	-6,01	>-4,00
	BKVX	>-4,00	>-4,00
	HOP-62	-6,23	-4,71
	NCI-H23	-4,92	>-4,00
	NCI-H322M	>-4,00	>-4,00
	NCI-H460	-4,32	>-4,00
	NCI-H522	-6,06	>-4,00
Cancer de colon	COLO205	-4,03	>-4,00
	HCT-116	-5,23	>-4,00
	HCT-15	-5,39	>-4,00
	HT29	>-4,00	>-4,00
	K2112	>-4,00	>-4,00
Cancer CNS	SP-268	-5,18	>-4,00
	SP-295	-6,24	>-4,00
	SNB-19	-5,71	>-4,00
	U251	-4,91	>-4,00
Melanom	LOX D6VI	-6,39	>-4,00
	MALME-3M	-4,51	>-4,00
	M14	-6,27	-5,07
	SK-MEL-28	-4,31	>-4,00
	SK-MEL-5	-4,91	>-4,00
	UACC-257	>-4,00	>-4,00
	UACC-62	-5,53	>-4,00
Cancer ovarian	OROV1	-4,03	>-4,00
	OVCAR-3	-4,44	>-4,00
	OVCAR-4	>-4,00	>-4,00
	OVCAR-5	-4,41	>-4,00
	OVCAR-8	-5,82	>-4,00
	SK-OV-3	-5,35	>-4,00

R0118748 Β1

Tabelul 2 (continuare)

810

Listă	Linia de celule	Log₁₀GI50	Log_inTGI
Cancer renal	785-4	-5,36	>-4,00
	ACHN	-6,46	>-4,00
	CAKI-1	-6,65	-4,87
	RXF-393	-6,17	>-4,00
	SN12C	-6,27	>-4,00
	TK-30	>-4,00	>-4,00
	UO-31	-5,60	>-4,00
Cancer de prostată	PC-3	-6,29	>-4,00
	DU-145	-6,97	>-4,00
Cancer de sân	MCF7	-5,95	>-4,00
	MCF7/ADR-RES	-4,97	>-4,00
	MDA-MB231/ATCC	>-4,00	>-4,00
	HS578T	>-4,00	>-4,00
	MDA-MB-435	-4,62	>-4,00
	MDA-N	-4,33	>-4,00
	BT-549	-4,59	>-4,00
	T-47D	>-4,00	>-4,00

815

820

825

Fig.4 este un grafic care prezintă selectivitatea relativă a (-)-OddC pentru o linie particulară de celule. Liniile îngroșate care se prelungesc spre dreapta reprezintă sensibi- 830 litatea liniei celulare față de (-)-OddC în exces față de sensibilitatea medie a tuturor liniilor celulare testate. Deoarece scala de bare este logaritmică, o bară cu 2 unități la dreapta reprezintă compusul supus la GI50 pentru linia celulară la o concentrație de o sutime din concentrația medie necesară pentru toate liniile celulare, și astfel linia celulară este neobișnuit de sensibilă față de (-)-OddC. Barele care se prelungesc către stânga în mod corespun- 835 zător implică o sensibilitate mai mică decât media. Aceste linii celulare pot fi ușor determinate din tabelul 2, întrucât log₁₀ al concentrației va fi precedat de un semn “>”.

Se poate observa în fig.4, că cel puțin o linie celulară din fiecare tip celulă canceroasă testată prezintă sensibilitate față de (-)-OddC. Anumite linii celulare de cancer de prostată, linii celulare de leucemie, și linii celulare de cancer de colon prezintă sensibilitate extremă 840 față de (-)-OddC.

Exemplul 12. Compararea (-)-OddC cu AraC

Așa cum s-a arătat deja, citozin arabinozida (denumită și citarabina, araC și citozar) este o nucleozidă analogă dezoxicitidinei folosită în tratamentul leucemiei mielocitare acute. Ea este activă, de asemenea, față de leucemia acută limfoidă, și în mai mică măsură este 845 folosită în leucemia mielocitară cronică și limfomul non-Hodgkin. Activitatea primară a araC constă în inhibarea sintezei AND-ului nuclear. A fost interesant să se compare toxicitatea

RO 118748 Β1 celulelor tumorale față de (-)-OddC și AraC. Celule cu creștere logaritmică au fost plasate la o densitate de 5000 celule/ml/godeu pe 24 de godeuri. Medicamentele s-au adăugat celulelor în diferite doze și culturile au fost menținute pe o perioadă de timp de trei generații. La sfârșitul acestui interval, s-au efectuat teste cu albastru de metilen și/sau numărul de celule a fost calculat direct. Albastrul de metilen este un colorant care se leagă în mod stoichimetric la proteinele celulelor viabile și poate fi utilizat pentru numărarea indirectă a cantității de celule (Finlay, 1984). Valorile IC₅₀ se determină prin interpolarea datelor obținute. Fiecare valoare indicată reprezintă deviația medie + standard a cinci experimente cu fiecare valoare a punctului dată în duplicat.

în toate celulele tumorale testate, (-)-OddC a fost mai citotoxic decât AraC. (-)-OddC a fost în mod semnificativ mai eficient decât AraC în cazul liniei celulare de carcinom KB nazofaringian și în cele două linii de carcinom de prostată DU-145 și PC-3. Celulele HepG2 își au originea din carcinomul hepatocelular și linia 2.2.15 este derivată din celulele HepG2 care au fost transfectate cu o copie a genomului de virus al hepatitei B. Celulele CEM sunt derivate din leucemia limfoblastică acută. (-)-OddU, compusul care ar trebui să fie format prin dezaminarea (-)-OddC nu este toxic în nici una din liniile celulare testate. Studiile enzimatice indică faptul că, spre deosebire de AraC a cărui eficiență clinică este în mare măsură diminuată prin susceptibilitatea sa la dezaminare, (-)-OddC nu reprezintă un substrat pentru dezaminază.

S-a constatat că (-)-OddC poate fi fosforilat la mono-, di- și tri-fosfat nucleotidă in vivo. Se constată că (-)-OddC prezintă toxicitatea sa celulară într-o formă fosforilată deoarece celulele care nu sunt capabile să fosforileze compusul sunt mult mai puțin sensibile față de compusul respectiv. Prima enzimă responsabilă pentru fosforilarea ei este deoxicitidin kinaza umană. Studiile enzimatice in vitro indică faptul că (-)-OddC poate fi fosforilată prin această enzimă.

Spre deosebire de AraC, (-)-OddC nu este dezaminată de citidin dezaminază. Prezența citidin dezaminazei în țesuturile tumorale solide poate fi un factor cheie de contribuție responsabil de lipsa de activitate a AraC în tumorile solide. Aceasta ar explica parțial de ce (-)-OddC este activ împotriva celulelor HepG2 de la șoareci, în timp ce AraC este inactiv. Ea explică de asemenea de ce (-)-OddC are un spectru diferit al activității antitumorale comparativ cu cea a AraC. Mai mult, prezența citidin dezaminazei în tractul gastrointestinal poate juca un rol important în faptul că AraC nu poate fi administrat oral.

Studii biochimice ale (-)-OddC

Citotoxicitatea in vitro a AraC, (-)-OddC și (-)-OddU

Linie celulară	AraC	LD₅₀ (pm)(-)-OddC	(-)-OddU
KB	0,152±0,010	0,048±0,021	>30
DU-145	0,170+0,035	0,024±0,020	>30
PC-3	0,200±0,078	0,056±0,039	>30
HepG2	0,0125±0,013	0,110±0,050	>30
2.2.15	0,145±0,007	0,110±0,011	>30
CEM	0,030±0,010	0,025±0,030	>30

Exemplul 12. Studii in vivo

Șoareci Ncr (șoareci și șobolani Taconic imunodeficienți) în vârstă de trei la șase săptămâni sunt inoculați s.c. în fiecare flanc cu 2 x 10⁶ celule HepG2 sau DU-145 și tumorile

R0118748 Β1 sunt lăsate să crească. Tratamentul este început când tumorile sunt de 100...250 mg așa cum se determină prin măsurători de calibru și se calculează conform formulei:

Greutatea tumorii (mg) = lungime (mm) x lărgime (mm²) + 2

Medicamentele se administrează în dozele indicate în zilele 0 la 4 și dimensiunile tumorilor sunt măsurate zilnic timp de mai multe zile. Curbele creșterii tumorii sunt generate conform Beli, et al., Cancer (phila) 36:2437-2440 (1975) și sunt ilustrate în fig.5(a) și 5(b). Toxicitatea este evaluată prin modificările greutății corporale.

Deși toxicitatea in vitro a AraC a fost similară cu cea a (L)-OddC, AraC s-a dovedit ineficient la acest tip de animale. Analizele enzimatice ale extractului de tumoare indică faptul că aceasta nu s-a datorat activității crescute dCD sau diminuate dCK, dar ar fi putut fi rezultatul unui metabolism AraC extins în ficat, care a avut niveluri dCD ridicate. Spre deosebire de AraC, (L)-OddC este eficient în ambele xenogrefe HepG2 și DU-145. Mortalitatea celulară netă (log 10) calculată pentru tumorile HepG2 a fost 0,67 și 0,87 pentru tratamentul i.p. și respectiv oral. Tumorile DU-145 s-au micșorat în dimensiune la jumătate regresând complet din ziua a 15-a. Tumorile au reînceput să apară la circa 25 de zile după ultimul tratament, dar creșterea a fost oprită din nou după ziua 47. în ziua 60 animalele au fost sacrificate și tumorile au fost îndepărtate. Tumorile au avut o morfolgie necrotică, foarte puține celule fiind apte să excludă albastrul de tripan. în plus, nu s-a putut detecta nici o activitate enzimatică în acest țesut. Dozele de AraC și (L)-OddC au fost la fel de toxice ca și cele indicate prin pierderea în greutate a animalelor și experimentele preliminare de toxicitate sugerează că 25 mg/kg de două ori pe zi poate fi doza maximă tolerată pentru cinci zile de tratament continuu. O posologie în care medicamentul poate fi administrat pe o bază intermitentă poate fi preferată.

Rezultatele in vitro și in vivo prezentate demonstrează că (L)-OddC are activitate anticanceroasă semnificativă și poate fi în multe moduri superioară analogilor de dezoxicitidină disponibili în mod curent. Nu numai că s-a dovedit pentru prima oară că este vorba de primul analog de L-nucleozidă cu activitate anticanceroasă, dar este, de asemenea, primul distrugător de catenă apt de a inhiba creșterea tumorală. Deși, stereochimia sa nenaturală nu împiedică (L)-OddC să fie activată de enzimele metabolice sau să fie încorporată în ADN, ea poate fi un factor de protecție a acestui compus împotriva degradării prin dCD. (L)-OddC este, de asemenea, unic prin faptul că este activ în tumorile solide care nu răspund în mod uzual la terapia analogă cu nucleozide. Medicamentul 2'-2'-difluorodezoxicitidină (gemcitibină), care este în mod curent supusă evaluărilor clinice pentru tratamentul tumorilor solide, este sensibilă la inactivare prin dCD(16). Deoarece, creșterea nivelurilor dCD este un mecanism prin care celulele devin rezistente la analogii dCyd, cum ar fi AraC(17), (L)OddC poate fi utilizat în tratamentul pacienților care nu mai răspund la aceste medicamente.

IV. Utilizarea (-)-OddC în oligonucleotide și în tehnologia antisens

Tehnologia antisens se referă în general la modularea expresiei de genă printr-un procedeu în care o oligonucleotidă sintetică este hibridizată la o secvență comple-mentară de acid nucleic pentru a inhiba transcrierea sau reproducerea (dacă secvența țintă este ADN-ul), a inhiba translația (dacă secvența ținta este ARN-ul) sau pentru a inhiba procesarea (dacă secvența ținta este pre-ARN-ul). O mare varietate de activități celulare pot fi modulate folosind această tehnică. Un exemplu simplu este inhibarea biosintezei proteinelor printr-o legătură oligonucleotidică antisens la mARN. într-o altă formă de realizare, o oligonucleotidă sintetică este hibridizată la o secvență specifică de genă într-un ADN cu două tulpini, formând un complex cu triplă tulpină (triplex) care inhibă expresia acelei secvențe de genă. Oligonucleotidele antisens pot fi, de asemenea, folosite pentru a activa expresia genei

895

900

905

910

915

920

925

930

935

RO 118748 Β1 indirect prin suprimarea biosintezei unui represor natural sau indirect prin reducerea terminației transcrierii. Terapia antisens cu oligo-nucleotide (AOT) poate fi utilizată pentru a inhiba expresia genelor patogene, incluzând pe acelea care sunt implicate în creșterea necontrolată a celulelor tumorale benigne și maligne sau care sunt implicate în reproducerea virusurilor, inclusiv a HIV și HBV.

Stabilitatea oligonucleotidelor față de nucleaze este un factor important pentru aplicațiile in vivo. Este cunoscut faptul că activitatea 3'-exonucleazei este responsabilă de majoritatea degradării oligonucleotidelor antisens nemodificate în ser. Vlassov, V.V., Yakubov, L.A., în Prospects for Antisens Nucleic Acid Therapy of Cancer and AIDS, 1991,243-266, Wiley-Liss, Inc., New York; Nucleic Acids Res., 1993, 21,145.

înlocuirea nucleotidei de la capătul 3' al oligonucleotidei cu (-)-OddC sau derivatul acesteia poate stabiliza oligonucleotida împotriva 3'-exonucleazei. în mod alternativ, sau în plus, o nucleotidă internă poate fi înlocuită cu (-)-OddC sau derivații acesteia pentru a rezista degradării oligonucleotidei prin endonuclează. Conform celor descrise în prezenta cerere de brevet, un specialist în domeniu va putea utiliza (-)-OddC sau derivații acesteia pentru a stabiliza o gamă largă de oligonucleotide împotriva degradării, atât prin exonuclează, cât și endonuclează, inclusiv nucleozidele utilizate în terapia oligonucleotidică antisens. Toate aceste forme de realizare sunt considerate a face parte din scopul prezentei invenții. Exemplul 13 furnizează un exemplu nelimitativ de utilizare a (-)-OddC pentru a rezista activității 3'-exonucleazei.

>

Exemplul 13. Rezistența la activitatea 3'-exonucleazei prin (-)-OddC

Activitatea exonucleazei citozolitice umane din celulele umane H9 (celule leucemice limfocitice tip T) este determinată prin testul gelului de secvență. Pe scurt, substratul terminat la capătul 3' este preparat dintr-un primer ADN lung de 20 sau 23 baze cu următoarea secvență:

3'-CAATTTTGAATTTCCTTAACTGCC-5'

1

Acidul primar este marcat la capătul 5' cu [y^pjATP, renaturate de șabloane complementare ARN și terminate la capătul 3' cu dTTP (20 mer) dCTP (23 mer) sau (-)-OddC (23 mer) într-o reacție de inițiere catalizată de HIV-1. în aceste condiții 20 mer-ul este terminat cu dTMP (A), iar 23 mer-ul este terminat cu dCMP (B) sau (-)-O-ddCMP (C). Aceste substraturi de ADN cu o singură tulpină sunt folosite pentru a testa sensibilitatea lor la exonucleaza citoplasmatică. Testele sunt efectuate în reacții de 10 pl conținând 50 mM tris-HCI, pH 8,0, 1 mM MgCI₂ ditiotreitol, 0,1 mg/ml albumină de ser bovin, 0,18 μθι/ml substrat 3'terminat și 2 μΙ din exonuclează (0,03 unități). Reacțiile sunt incubate la 37°C pentru intervalul de timp indicat și terminate prin adăugare de 4 μΙ formamidă 98%, 10 mM EDTA și 0,025% albastru de bromofenol. Probele sunt denaturate la 100°C timp de 5 min urmată de răcire rapidă pe gheață. Materialul nereacționat precum și produsele de reacție sunt separate pe geluri de secvenționare 15% poliacrilamidă/uree și vizualizate prin autoradiografie. Oligonucleotida cu (-)-OddC la capătul 3' a fost de cel puțin cicnci ori mai rezistentă la 3'-exonuclează decât la alte oligonucleotide.

Modificările și variațiile prezentei invenții în tratamentul cancerului sunt evidente pentru specialiștii în domeniu, din cele prezentate în detaliu mai sus. Astfel de modificări și variații sunt în limitele revendicărilor anexate.

Claims

Revendicări

1. Utilizarea unei compoziții farmaceutice cuprinzând o cantitate eficientă de β-Lenantiomer al unui compus cu formula:

990

995

NHRg în care, R¹ și R² sunt selectați din grupul constând din hidrogen, acil, și alchil de la C, la C₁₈, sau sarea farmaceutic acceptabilă a acestuia, într-un purtător acceptabil farmaceutic, la fabricarea unui medicament pentru tratamentul unei tumori într-un animal gazdă.
2. Utilizarea compoziției, conform revendicării 1, în care R¹ și R² sunt hidrogen.
3. Utilizarea compoziției, conform revendicării 1, în care gruparea alchil este selectată din grupul constând din metil, etil, propil, butii, pentil, hexil, izopropil, izobutil, sec-butil, t-butil și izopentil.
4. Utilizarea compoziției, conform revendicării 1, în care gruparea acil este -C(O)R, unde R este o grupare alchil de la C, la C₅, fenil, sau benzii.
5. Utilizarea compoziției, conform oricăreia din revendicările 1 sau 2, în care purtătorul este adecvat pentru administrare orală.
6. Utilizarea compoziției, conform oricăreia din revendicările 1 sau 2, în care, purtătorul este adecvat pentru administrare intravenoasă.
7. Utilizarea compoziției, conform oricăreia din revendicările 1 sau 2, în care purtătorul este adecvat pentru administrare topică sau transdermală.
8. Utilizarea compoziției, conform oricăreia din revendicările 1 sau 2, în care animalul gazdă este omul.
9. Utilizarea compoziției, conform revendicării 8, în care respectiva tumoare este canceroasă.
10. Utilizarea compoziției, conform revendicării 8, în care tumoarea este leucemie.
11. Utilizarea compoziției, conform revendicării 8, în care tumoarea este cancer de colon.
12. Utilizarea compoziției, conform revendicării 8, în care tumoarea este cancer de vezică.
13. Utilizarea compoziției, conform revendicării 8, în care tumoarea este cancer hepatocelular.
14. Utilizarea compoziției, conform revendicării 8, în care tumoarea este cancer de sân.
15. Utilizarea compoziției, conform revendicării 8, în care tumoarea este cancer pulmonar.
16. Utilizarea compoziției, conform revendicării 8, în care tumoarea este cancer nazofaringian.
17. Utilizarea compoziției, conform revendicării 8, în care tumoarea este cancer pancreatic.

1000

1005

1010

1015

1020

1025

1030

RO 118748 Β1
18. Utilizarea compoziției, conform revendicării 8, în care tumoarea este cancer ovarian.
19. 'Utilizarea compoziției, conform revendicării 8, în care tumoarea este limfom.
20. Utilizarea compoziției, conform revendicării 8, în care tumoarea este cancer de prostată.
21. Utilizarea unei compoziții cuprinzând o cantitate eficientă de compus cu formula: nhr₂ în care, R este selectat din grupul care constă din H, F, CI, -CH₃, -C(H)=CH₂, -CH=CH, CsN, Br, -NO₂ iar R¹ și R²este selectat din grupul care constă din, hidrogen, alchil, acil, monofosfat, difosfat și trifosfat, sau o sare farmaceutic acceptabilă a acestuia, opțional întrun purtător accepatbil farmaceutic, la fabricarea unui medicament pentru tratamentul unei tumori într-un animal gazdă.
22. Utilizarea compoziției, conform revendicării 21, în care R este fluor, iar R¹ și R²sunt hidrogen.
23. Utilizarea compoziției, conform revendicării 21, în care purtătorul este adecvat pentru administrare orală.
24. Utilizarea compoziției, conform revendicărilor 21 sau 22, în care animalul gazdă este omul.
25. Utilizarea compoziției, conform revendicării 24, în care tumoarea este canceroasă.
26. Utilizarea compoziției, conform revendicării 24, în care tumoarea este leucemie.
27. Utilizarea compoziției, conform revendicării 24, în care tumoarea este cancer de colon.
28. Utilizarea compoziției, conform revendicării 24, în care tumoarea este cancer de vezică.
29. Utilizarea compoziției, conform revendicării 24, în care tumoarea este cancer hepatocelular.
30. Utilizarea compoziției, conform revendicării 24, în care tumoarea este cancer de sân.
31. Utilizarea compoziției, conform revendicării 24, în care tumoarea este cancer pulmonar.
32. Utilizarea compoziției, conform revendicării 24, în care tumoarea este cancer nazofaringian.
33. Utilizarea compoziției, conform revendicării 24, în care tumoarea este cancer pancreatic.
34. Utilizarea compoziției, conform revendicării 24, în care tumoarea este cancer ovarian.
35. Utilizarea compoziției, conform revendicării 24, în care tumoarea este limfom.
36. Utilizarea compoziției, conform revendicării 24, în care tumoarea este cancer de prostată.

RO 118748 Β1
37. Utilizarea (-)-(2S,4S)-1-(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il)citozinei și a derivaților și sărurilor farmaceutic acceptabile ale acesteia, sau a (+)-enantiomerului, sau a amestecului racemic al acesteia și a derivaților și sărurilor acestora acceptabile farmaceutic, la fabricarea unui medicament pentru tratamentul sau profilaxia unei tumori, inclusiv o tumoare canceroasă.
38. Utilizarea (-)-(2S,4S)-1 -(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il)citozinei și a derivaților și sărurilor farmaceutic acceptabile ale acesteia, sau a (+)-enantiomerului, sau a amestecului racemic al acesteia și a derivaților și sărurilor acestora acceptabile farmaceutic la fabricarea unui medicament pentru tratamentul unei proliferări anormale sau nedorite a celulelor.