DE69533066T2

DE69533066T2 - Verbindungen und verfahren zur behandlung von krebs

Info

Publication number: DE69533066T2
Application number: DE69533066T
Authority: DE
Inventors: Chung K. Chu; Yung-Chi Cheng
Original assignee: Yale University; University of Georgia Research Foundation Inc UGARF
Current assignee: Yale University; University of Georgia Research Foundation Inc UGARF
Priority date: 1994-09-06
Filing date: 1995-09-05
Publication date: 2005-06-02
Anticipated expiration: 2015-09-06
Also published as: EP0781136A1; ATE267015T1; RO118748B1; NO313268B1; RU2168995C2; ZA957483B; EP1468687A1; AU704977B2; CN1827108A; PL188359B1; IS2011B; BG101284A; US7262213B2; KR100374477B1; SK284564B6; FI970918A0; IL115156A; PT781136E; DE69533066D1; FI970918A

Description

Diese Erfindung liegt auf dem Gebiet der medizinischen Chemie und insbesondere in der Verwendung von (–) – (2S,4S)-1-(2-Hydroxymethyl-1,3-dioxolan-4-yl)cytosin (auch bezeichnet als (–)-OddC) oder dessen Derivate und deren Verwendung zur Behandlung von Krebs in Tieren einschließlich des Menschen.
Hintergrund der Erfindung
Ein Tumor ist eine unregulierte, nicht organisierte Erhöhung des Zellwachstums. Ein Tumor ist malignant oder krebsartig, wenn er die Eigenschaften der Invasivität und der Metastasierung aufweist. Invasivität bezieht sich auf die Tendenz eines Tumors das ihn umgebende Gewebe zu befallen, die Basalschicht, die die Grenzen des Gewebes definieren, zu durchdringen und dabei oft in das Kreislaufsystem des Körpers einzudringen. Metastasierung bezieht sich auf die Tendenz eines Tumors in andere Gebiete des Körpers zu wandern und Wucherungen in anderen Gebieten abseits der Stelle des ursprünglichen Auftretens zu etablieren.
Krebs ist nun die zweithäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten. Bei mehr als 8 000 000 Personen in den Vereinigten Staaten wurde Krebs diagnostiziert, wobei 1 208 000 neue Diagnosen für das Jahr 1994 erwartet werden. Mehr als 500 000 Menschen sterben jährlich an dieser Krankheit in diesem Land.
Krebs wird auf molekularer Ebene noch nicht vollständig verstanden. Es ist bekannt, daß das Aussetzen von Zellen gegenüber Karzinogenen wie bestimmten Viren, bestimmten Chemikalien oder Strahlung zu DNA-Veränderungen führt, die ein „suppressives" Gen deaktivieren oder ein „Onkogen" aktivieren. Suppressive Gene sind Wachstumsregulationsgene, die durch Mutation nicht länger das Zellwachstum kontrollieren können. Onkogene sind ursprünglich normale Gene (sogenannte Proonkogene), die durch Mutation oder einem geänderten Zusammenhang der Expression Transformationsgene werden. Die Produktion von Transformationsgenen führt zu ungeeignetem Zellwachstum. Mehr als 20 unterschiedliche normale Zellgene können durch genetische Alteration zu Onkogenen werden. Transformierte Zellen unterscheiden sich von normalen Zellen in vielerlei Hinsicht, einschließlich der Zellmorphologie, den Zell-Zellwechselwirkungen, dem Membraninhalt, der zytoskeletalen Struktur, dem Proteinausstoß, der Genexpression und der Sterblichkeit (Transformierte Zellen können undefiniert wachsen.).
Alle unterschiedlichen Zelltypen des Körpers können in benigne oder maligne Tumorzellen transformiert werden. Die am häufigsten auftretenden Tumorpunkte sind Lunge, gefolgt von Dickdarm, Brust, Prostata, Blase, Magen und den Eierstöcken. Andere häufige Typen des Krebs schließen Leukämie, Zentralnervensystemkrebs einschließlich Gehirnkrebs, Hautkrebs, Lymphalkrebs, Erythroleukämie, Unterleibskrebs und Kopf- oder Nackenkrebs ein.
Krebs wird momentan hauptsächlich mit einer oder einer Kombination aus drei Typen von Therapien behandelt: chirurgischer Eingriff, Bestrahlung und Chemotherapie. Der chirurgische Eingriff umfaßt das großflächige Entfernen des erkrankten Gewebes. Während die Chirurgie manchmal effektiv bei der Entfernung von an bestimmten Orten lokalisierten Tumoren wie z. B. in der Brust, dem Dickdarm und der Haut ist, kann sie nicht zur Behandlung von Tumoren eingesetzt werden, die in anderen Bereichen lokalisiert sind, wie z. B. Wirbelsäule, noch in der Behandlung verbreiteter neoplastischer Zustände wie der Leukämie.
Chemotherapie umfaßt die Zerstörung der Zellreplikation oder des Zellmetabolismus. Bei der Behandlung von Leukämie wie auch Brust-, Lungen- und Hodenkrebs wird dieses am häufigsten eingesetzt.
Momentan werden 5 Hauptklassen von chemotherapeutischen Reagenzien zur Behandlung von Krebs eingesetzt: Natürliche Produkte und deren Derivate; Anthracycline, Alkylierungsreagenzien; Antiproliferantien (auch Antimetaboliten genannt); und Hormonreagenzien. Chemotherapeutische Reagenzien werden auch oft als antineoplastische Reagenzien bezeichnet.
Von den Alkylierungsreagenzien wird angenommen, daß diese durch Alkylierung und Kreuzvernetzung von Guanin und möglicher anderer Basen in der DNA die Zellteilung unterdrücken. Typische Alkylierungsreagenzien sind Stickstoffsenfgas, Ethyleniminverbindungen, Alkylsulfate, Cisplatin und unterschiedliche Stickstoffquellen. Ein Nachteil bei diesen Verbindungen ist, daß sie nicht nur die malignaten Zellen angreifen, sondern auch andere Zellen, die sich natürlich teilen, wie die des Knochenmarks, der Haut, des gastro-intestinalen Trakts und des fötalen Gewebes.
Antimetaboliten sind typischerweise reversible oder nicht reversible Enzyminhibitoren oder Verbindungen, die in anderer Weise mit der Replikation, Translation oder Transkription von Nukleinsäuren wechselwirken.
Einige synthetische Nukleoside, die Antikrebsaktivitäten zeigen, wurden identifiziert. Ein sehr bekanntes Nukleosidderivat mit starker Antikrebseigenschaft ist 5-Fluorouracil. 5-Fluorouracil wurde klinisch in der Behandlung von malignaten Tumoren einschließlich z. B. Karzinomen, Sarkomen, Hautkrebs, Krebs der digestiven Organe und Brustkrebs eingesetzt. 5-Fluorouracil verursacht jedoch schwere Nebenreaktionen wie Übelkeit, Alopezie, Diarrhö, Stomatitis, leukozytische Thrombocytopenie, Anorexie, Pigmentation und Ödeme. Derivate des 5-Fluorouracils mit Antikrebsaktivitäten wurden im US-Patent Nr. 4,336,381 und in den japanischen Patentpublikationen Nr. 50–50383, 50–50384, 50–64281, 51–146482 und 53–84981 beschrieben.
US Patent Nr. 4,000,137 offenbart, daß peroxidierte Peroxidationsprodukte von Inosin, Adenosin oder Cytidin mit Methanol oder Ethanol Aktivität gegen lymphozytische Leukämie zeigen.
Cytosinarabinoside (auch als Cytoarabin, araC und Cytosar bezeichnet) ist ein Nukleosid analog des Deoxicytidin, das 1950 erstmals synthetisiert und 1963 in die klinische Medizin eingeführt wurde. Es ist momentan ein wichtiges Medikament bei der Behandlung akuter Myeloidleukämie. Es ist gleichfalls aktiv gegen akute Lymphozytenleukämie und im geringeren Umfang hilfreich in der Behandlung von chronischer myelocytischer Leukämie und nicht-Hodgkinsche „Lymphome". Die erste Aktion von araC ist die Unterdrückung der nuklearen DNA-Synthese. Handschuhmacher, R. und Cheng, Y., „Purine and Pyrimidine Antimetabolites", Cancer Medicine, Chapter XV–1, 3. Auflage, Herausgeber J. Holland et al, Verlag Lea and Febigol.
5-Azacytidin ist ein Cytidinanalog, das hauptsächlich zur Behandlung von akuter myelocytischer Leukämie und myelodysplastischer Syndrome eingesetzt wird.
2-Fluoroadenosin-5'-Phosphat (Fludara, auch bezeichnet als FaraA) ist eins der aktivsten Reagenzien in der Behandlung von chronischer lymphozytischer Leukämie. Die Verbindung wirkt durch Unterdrückung der DNA-Synthese. Die Behandlung von Zellen mit F-araA geht einher mit der Akkumulation von Zellen in der G1/S Phasengrenze und in der S-Phase; daher ist es ein Zellkreislauf-S-Phasen spezifisches Medikament. Das Einbeziehen des aktiven Metaboliten F-araATP unterdrückt die DNA-Kettenverlängerung. F-araA ist auch starker Unterdrücker der Ribonukleotidreduktase, dem Schlüsselenzym, das für die Bildung von dATP verantwortlich ist.
2-Chlorodeoxyadenosin ist sinnvoll in der Behandlung von niedriggradigen D-Zellneoplasmen wie chronischer lymphozytischer Leukämie, nicht-Hodgkinscher Lymphome und Haarzellenleukämie. Das Aktivitätsspektrum ist vergleichbar mit dem von Fludara. Die Verbindung unterdrückt die DNA-Synthese in wachsenden Zellen und unterdrückt die DNA-Reparatur in ruhenden Zellen.
Auch wenn eine Zahl von chemotherapeutischen Reagenzien identifiziert wurden und momentan zur Behandlung von Krebs eingesetzt werden, werden neue Reagenzien gesucht, die effizient sind und sich als wenig toxisch gegenüber gesunden Zellen erweisen.
Daher ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verbindungen bereitzustellen, die Antitumor- und insbesondere Antikrebsaktivität zeigen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, pharmazeutische Zusammensetzungen zur Behandlung von Krebs bereitzustellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Verwendung von Zusammensetzungen in der Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Tumoren und insbesondere von Krebs in menschlichen und anderen Wirtstieren wird offenbart, was die Verabreichung einer effektiven Menge von (–)-(2S,4S)-1-(2-Hydroxymethyl-1,3-dioxolan-4-yl)cytosin (auch bezeichnet als (–)-OddC, L-OddC oder (–)-L-OddC), ein pharmazeutisch akzeptables Derivat davon, einschließlich einem 5' oder N⁴ alkylierten oder acylierten Derivat oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon, optional in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, beinhaltet.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird (–)-(2S,4S)-1-(2-Hydroxymethyl-1, 3-dioxolan-4-yl)cytosin in seinem angezeigten Enantiomer (das L-Enantiomer) und im wesentlichen in Abwesenheit des korrespondierenden Enantiomers (z. B. Eantiomeren angereichert einschließlich der enantiomer reinen Form) bereitgestellt.
Es wird angenommen, daß (–)-(2S,4S)-1-(2-Hydroxymethyl-1,3-dioxolan-4-yl)cytosin das erste Beispiel eines „L"-Nucleosids ist, welches Antitumoraktivität zeigt. (–)-(2S,4S)-1-(2-Hydroxymethyl-1,3-dioxolan-4-yl)cytosin hat die in Formel 1 dargestellte Struktur:
Formel 1
Es wurde gefunden, daß (–)-(2S,4S)-1-(2-Hydroxymethyl-1,3-dioxolan-4-yl)cytosin signifikante Aktivität gegen Krebszellen und niedrige Toxizität gegenüber gesunden Zellen im Wirt zeigt. Nicht limitierende Beispiele von Krebs, die mit dieser Verbindung behandelt werden können, sind Lunge, Dickdarm, Brust, Prostata, Blase, Rachen, Bauchspeicheldrüse, Eierstöcke, Leukämie, Lymphdrüsen, Kopf und Nackenkrebs, Krebs des zentralen Nervensystems (einschließlich Gehirnkrebs), Cervicalkarzinome, Melanome und hepatozellularer Krebs.
In einem alternativen Ausführungsbeispiel wird eine Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Tumoren und insbesondere von Krebs in Menschen und anderen Wirtstieren offenbart, was die Verabreichung einer effektiven Menge eines Derivats von L-OddC der nachfolgenden Formel einschließt:
wobei R gleich F, Cl, -CH₃, -C(H)=CH₂, -Br, -NO₂, -C=CH oder -C≡N ist und R¹ Wasserstoff, Alkyl, Acyl, Monophosphat, Diphosphat oder Triphosphat oder ein pharmazeutisch akzeptables Derivat davon ist, optional in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, bevorzugt in enantiomerisch angereicherter Form.
Auch wenn im bevorzugten Ausführungsbeispiel dieser Erfindung die aktive Verbindung oder deren Derivate oder deren Salze in der nicht natürlich auftretenden Konfiguration (der L-Konfiguration) verwendet werden, können die hierin offenbarten Verbindungen oder deren Derivate oder Salze auch alternativ in der natürlich auftretenden Konfiguration (der D-Konfiguration) oder als racemisches Gemisch verabreicht werden.
Jede der hier offenbarten Verbindungen zur Behandlung von Tumoren kann in Kombination oder abwechselnd mit anderen antitumor-pharmazeutischen Reagenzien verabreicht werden, um die Effizienz der Therapie zu erhöhen. Beispiele sind natürliche Produkte und deren Derivate; Anthracycline; Alkylierungsreagenzien, Antiproliferantien (auch als Antimetaboliten bezeichnet); und Hormonreagenzien.
Insbesondere Reagenzien wie z. B., jedoch nicht darauf begrenzt, Stickstoffsenfgas, Ethyleniminverbindungen, Alkylsulfate, Cysplatin, Stickstoffquellen, 5-Fluorouracil, Cytosinarabinoside, 5-Azacytidine, 2-Fluoroadenosin-5'-Phosphat, 2-Chlorodeoxiadenosin, Tamoxifen, Actinomycin, Amsacrin, Bleomycin, Carboplatin, Carmustin, Cyclophosphamid, Cyclosporin, Daunorubicin, Doxirubicin, Interleukin, Lomustin, Mercaptopurin, Methotrexat, Mitomycin, Thioguanin, Vinblastin, Wachstumsfaktoren einschließlich GCSF, GMCSF und Plättchenwachstumsfaktoren; Adriamycin, WP-16, Hydroxyharnstoff, Etoposid; α, β und ϛ – Interferone und Vincristin. Verfahren zur Verabreichung von effektiven Mengen dieser Reagenzien sind leicht zu bestimmen oder sind z. B. in „The Physician's Desk Reference", letzte Ausgabe, verlegt von Medical Economics Data Production Company, und Martindale, "The Extra Pharmacopoeia", letzte Ausgabe, verlegt von The Pharmaceutical Press, beschrieben. Diese Methoden können zur Optimierung der Effizienz von Kombinations- und Alternationstherapien routinemäßig modifiziert werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt den ID₅₀ Wert von (–)-OddC und einer Kombination von (–)-OddC + THU (Tetrahydrouridin, ein Cytidindeaminaseunterdrücker) gegen Dickdarmkrebszellen. Die Grafik zeigt die Wachstumsunterdrückung in Prozent des Kontrollwachstums gegen die Konzentration (μM), In der Grafik werden die Daten für (–)-OddC allein durch (•) und die Daten für (–)-OddC + THU durch
dargestellt.
2 ist eine Grafik des Tumorwachstumsgewichts für Mauskarzinome (Colon 38), welche zweimal am Tag mit (–)-OddC in einer Dosierungsmenge von 25 mg/kg Körpergewicht behandelt wurden. Die Grafik zeigt das Tumorwachstum als Prozentwert des Originaltumorgewichts gegenüber Tagen. Die Behandlung der Mäuse erfolgte am ersten, zweiten, dritten, vierten und fünften Tag. In der Grafik werden die Daten für die Kontrolle (keine Verabreichung von (–)-OddC) durch (•) dargestellt, die Daten für (–)-OddC durch
.
3 zeigt die Überlebensrate von P388 Leukämiemäusen, die mit (–)-OddC behandelt wurden. Die Grafik zeigt die Prozentrate des Überlebens gegen die Behandlungstage. Die Behandlung der Mäuse erfolgte am ersten, zweiten, dritten, vierten und fünften Tag. In der Grafik wird die Überlebensrate der Kontrolle (keine Verabreichung von (–)-OddC) durch (•), die Überlebensrate der mit 25 mg/kg Körpergewicht (–)-OddC zweimal am Tag behandelten Mäuse durch
und die Überlebensrate der einmal am Tag mit 50 mg/kg Körpergewicht (–)-OddC behandelten Mäuse durch (O) dargestellt.
4 ist eine Darstellung der relativen Empfindlichkeit von bestimmten Krebszellinien gegen (–)-OddC auf Basis von GI50. Die nach rechts sich erstreckenden Balken repräsentieren die Empfindlichkeit der Zellinie gegen (–)-OddC gegenüber der mittleren Sensitivität aller getesteten Zellinien. Da die Balkenskalierung logarithmisch ist, implizieren zwei Balkeneinheiten nach rechts, daß die Verbindung GI50 für alle Zellinien bei einer Konzentration von einem Hundertstel der Ausgangskonzentration, die für alle Zellinien notwendig ist, erreicht, und die Zellinie daher außergewöhnlich empfindlich auf (–)-OddC ist. Balken, die sich nach links erstrecken, implizieren dementsprechend eine Empfindlichkeit geringer als die allgemeine.
5 ist eine graphische Darstellung der Unterdrückung des menschlichen Tumorwachstums durch (•)-OddC. Drei bis sechs Wochen alte NCr Nacktmäuse wurden subkutan in jeder Flanke mit zweimal 10⁶ HepG2 oder DU-145 Zellen angeimpft. Die Behandlung wurde begonnen, als sich die Tumore in einem fortgeschrittenen Wachstumsstadium befanden. Die Medikamente wurden zweimal am Tag vom Tag 0 bis 4 verabreicht und die Tumorgröße wurde an den angezeigten Tagen gemessen. Die Kurven A und B zeigen die Medikamentenwirkung auf HepG2 Tumore und Du-145 Tumore (-0-Kontrolle; -•-AraC 25 mg/kg, i. p.; - ⎕ -(–)-OddC, 25 mg/kg, p.o.; - ❚ - (–)-OddC, 25 mg/kg, i. p.).
Jeder Datenpunkt repräsentiert den Durchschnitt ± Standardabweichungen von 10 Tumoren in Grafik A und 6 Tumoren in Grafik B.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung, wie sie hierin offenbart ist, ist die Verwendung von Zusammensetzungen zur Behandlung von Tumoren, und im besonderen von Krebs in menschlichen oder anderen Wirtstieren, das die Verwendung einer effektiven Menge von (–)-(2S,4S)-1-(2-Hydroxymethyl-1, 3-dioxolan-4-yl)cytosin, einem Derivat dieser Verbindung wie es hierin genauer definiert ist, einschließlich einem 5-substituierten oder 5' oder N⁴ alkylierten oder acylierten Derivat oder einem physiologisch akzeptablen Salz dieser Verbindung, optional in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger einschließt.
(–)-(2S,4S)-1-(2-Hydroxymethyl-1, 3-dioxolan-4-yl)cytosin wird als ein „L"-Nukleosid bezeichnet. Da der 2 und 5 Kohlenstoff des Dioxolanrings chiral ist, können deren Substituenten (CH₂OH und Cytosinbasen) sowohl cis (auf derselben Seite) oder trans (auf gegenüberliegenden Seiten) bezüglich des Dioxolanringsystems sein. Die vier optischen Isomere davon werden durch die folgenden Konfigurationen wiedergegeben (wobei der Dioxolanteil in einer horizontalen Ebene mit dem Sauerstoff in der 3 Position vorne angeordnet ist): cis (mit beiden Gruppen „oben", was mit der Konfiguration der natürlich auftretenden Nukleoside übereinstimmt, bezeichnet als ein „D"-Nukleosid), cis (mit beiden Gruppen „nach unten", was die nicht-natürlich auftretende Konfiguration darstellt, bezeichnet als ein „L"-Nukleosid, trans (mit dem C₂-Substituenten „nach oben" und dem C₅Substituenten „nach unten"), und trans (mit dem C₂-Substituenten „nach unten" und dem C₅-Substituenten „nach oben"). Es wird angenommen, daß (–)-(2S,4S)-1-(2-Hydroxymethyl-1, 3-dioxolan-4-yl)cytosin oder dessen Derivate das erste Beispiel von „L"-Nukleosiden sind, die Antitumoraktivität zeigen. Dies ist überraschend angesichts dessen, daß „L"-Nukleosidkonfigurationen in der Natur nicht auftauchen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Enantiomeren angereichert" auf Nukleosidzusammensetzungen, die mindestens ungefähr 95 %, bevorzugt ungefähr 97 %, 98 %, 99 % oder 100 % eines einzelnen Enantiomers des Nukleosids aufweisen. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird (–)-(2S,4S)-1-(2-Hydroxymethyl-1, 3-dioxolan-4-yl)cytosin oder dessen Derivat oder Salz in einer Nukleosidzusammensetzung bereitgestellt, die hauptsächlich aus einem Enantiomer besteht, d. h. dem angezeigten Enantiomer (dem L-Enantiomer) und im wesentlichen kein korrespondierendes D-Enantiomer aufweist (das heißt, in Enantiomeren angereicherter Form, einschließlich der enantiomer-reinen Form).
Die aktive Verbindung kann als jedes Derivat eingesetzt werden, das nach Verabreichung an einen Empfänger geeignet ist, direkt oder indirekt die vorliegende (–)-L-OddC – Verbindung oder ein 5-substituiertes Derivat wie es hierin definiert wird bereitzustellen, oder die ihrerseits Aktivität zeigt. Beispiele sind die pharmazeutisch akzeptablen Salze, alternativ auch als physiologisch akzeptable Salze bezeichnet) von (–)-OddC, den 5-Derivaten wie zuvor beschrieben, und den 5' und N⁴ acylierten oder alkylierten Derivaten der aktiven Verbindung (alternativ als physiologisch aktive Derivate bezeichnet). In einem Ausführungsbeispiel ist die Acylgruppe ein Carbonsäureester, in welchem der nicht-carbonyl Molekülteil der Estergruppe ausgewählt ist aus gradlinigen, verzweigten oder zyklischen Alkylen (typischerweise C₁ bis C₁₈, und typischererweise C₁ bis C₅), Alkaryl, Aralkyl, Alkoxyalkyl einschließlich Methoxymethyl, Aralkyl einschließlich Benzyl, Alkyl oder C₁ bis C₄ Alkoxy; sulfonierte Ester wie Alkyl oder Aralkylsulfonyl einschließlich Methansulfonyl, dem Mono-, Di- oder Triphosphoester, Trityl oder Monomethoxytrityl, substituierten Benzyl, Trialkylsilyl (z. B. Dimethyl-t-Butylsilyl) oder Diphenylmethylsilyl. Arylgruppen in den Estern können optional Phenylgruppen aufweisen.
Spezifische Beispiele der pharmazeutisch akzeptablen Derivate des L-O-ddC schließen ein
wobei R gleich F, Cl, -CH₃, -C(H)=CH₂, -C=CH oder -C≡N, -Br, -NO₂ sind und R₁ und R₂ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Alkyl und Acyl, insbesondere einschließend Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Isopropyl, Isobutyl, sec-Butyl, t-butyl, Isopentyl, amyl, t-Pentyl, 3-Methylbutyryl, Hydrogensuccinat, 3-Chlorbenzoat, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Benzoyl, Acetyl, Pivaloyl, Mesylat, Propionyl, Butyryl, Valeryl, Capronat, Caprylsäure, Laurinsäure Myristinsäure, Palmiinsäure, Stearinsäure, Ölsäure und Aminosäuren einschließlich Alanyl, Valinyl, Leucinyl, Isoleucinyl, Prolinyl, Phenylalaninyl, Tryptophanyl, Methioninyl, Glycinyl, Serinyl, Threoninyl, Cysteinyl, Tyrosinyl, Asparaginyl, Glutaminyl, Aspartoyl, Glutaoyl, Lysinyl, Argininyl und Histidinyl. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel werden die Derivate als L-Enantiomere und im wesentlichen in Abwesenheit des korrespondierenden Enantiomers bereitgestellt (d. h. in Enantiomeren angereicherter Form einschließlich der enantiomer-reinen Form).
L-OddC oder dessen Derivate können in Form von pharmazeutisch akzeptablen Salzen bereitgestellt werden. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck pharmazeutisch akzeptable Salze oder Komplexe auf Salze oder Komplexe von L-OddC oder dessen Derivate, die die gewünschte biologische Aktivität der vorliegenden Verbindung aufrechterhalten und minimale, wenn überhaupt, ungewünschte toxikologische Effekte zeigen. Beispiele für solche Salze sind (a) Säureadditionssalze, gebildet mit anorganischen Säuren (z. B. Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure und Salze gebildet mit organischen Säuren wie Essigsäure, Oxasäure, Weinsäure, Bernsteinsäure, Äpfelsäure, Ascorbinsäure, Benzoesäure, Tanninsäure. Pamoinsäure, Alginsäure, Polyglutasäure, Naphtalensulfonsäure, Naphtalendisulfonsäure und Polygalakturonsäure; (b) Basenadditionssalze gebildet aus polyvalenten Metallkationen wie Zink, Kalzium, Wismut, Barium, Magnesium, Aluminium, Kupfer, Kobalt, Nickel, Cadmium, Natrium, Kalium oder mit organischen Kationen gebildet aus N, N-Dibenzylethylendiamin, Ammonium oder Ethylendiamin; oder (c) Kombinationen aus (a) und (b); z. B. ein Zinktannatsalz.
Modifikationen der aktiven Verbindung, insbesondere an der N⁴ und der 5'–0 Position können die Löslichkeit, biologische Verfügbarkeit und Metabolismusrate der aktiven Spezies beeinflussen, was die Kontrolle über die Freisetzung der aktiven Spezies ermöglicht. Des weiteren kann die Modifikation die Antikrebsaktivität der Verbindung beeinflussen, was in einigen Fällen zu einer Erhöhung gegenüber der Aktivität der vorliegenden Erfindung führt. Dies kann leicht durch Herstellen der Derivate und Testen der Antikrebsaktivität gemäß der hierin beschriebenen Methoden oder gemäß anderer dem Fachmann bekannter Methoden erreicht werden.
Zusammenfassend weist die vorliegende Erfindung die folgenden Merkmale auf: Verwendung von Verbindungen wie in der Formel definiert, einschließlich (–)-(2S,4S)-1-(2-Hydroxymethyl-1,3-dioxolan-4-yl)cytosin und pharmazeutisch akzeptable Derivate und Salze davon oder (+)-Enantiomere oder racemische Gemische davon, und pharmazeutisch akzeptable Salze davon zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Tumoren, einschließlich von Krebstumoren.
II. Herstellung der aktiven Verbindungen
(–)-L-OddC und dessen Derivate können wie zuvor beschrieben, gemäß der im Detail in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/18517, veröffentlicht am 29. Oktober 1992, nach der Methode des Schema 1 und den Ausführungsbeispielen 1 bis 7 wie nachfolgend beschrieben, oder durch jede weitere dem Fachmann bekannte Methode synthetisiert werden. Diese Methoden oder die anderen bekannten Methoden können auf die Herstellung der beispielhaft gezeigten Derivate von L-OddC angepaßt werden.
Schema 1: Synthese von (–)-OddC
Beispiel 1 Synthese von 6-Anhydro-L-gulose
6-Anhydro-L-gulose wurde in einem Schritt aus L-gulose durch Behandlung von L-gulose mit einer Säure, z. B. 0,5 N HCL, in 60 %iger Ausbeute synthetisiert (Evans, M.E., et al., Carbohydr. Res. (1973), 28, 359). (2) wurde direkt, ohne selektiven Schutz, wie bereits zuvor durchgeführt (Jeong, L.S. et al. Tetrahedron Lett. (1992), 33, 595 und Beach, J. W. et al. J. Org. Chem. (1992, in Press), zum Dioxolantriol (3) durch Oxidation mit NalO₄ gefolgt von einer Reduktion mit NaBH₄ überführt, welches ohne Reinigung in das Isopropylidenderivat (4) überführt wurde. Benzoylierung zu (5), Entschützung zu (6) und Oxidation des Diols (6) führen zur Säure (7). Die oxidative Decarboxylierung von (7) mit Pb(OAc)₄ in trockenem THF ergab das Acetat (8) als Schlüsselintermediat in guter Ausbeute. Das Acetat wurde mit den gewünschten Pyrimidinen (z. B. silyliertes Thymin und N-Acetylcytosin) in Gegenwart von TMSOTf kondensiert, um eine α, β-Mischung zu erhalten, welches auf einer Silicagelsäule zum Erhalt der individuellen Isomere (9) und (10) getrennt wurde. Debenzoylierung mit methanolischem Ammoniak führt zum gewünschten (–)-OddC (11).
Beispiel 2 Synthese von (–)-1,6-Anhydro-α-L-gulopyranose (2)
Eine Mischung L-gulose (1) (33 g, 0,127 mol) und 0,5 N HCl (330 ml, 0,165 mol) wurden für 20 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Die Mischung wurde abgekühlt und durch ein Harz (Dowex-2, HCO₃-Form) mit Luftbegasung auf pH 6 neutralisiert. Das Harz wurde durch Waschen mit 10 %iger HCI, Wasser, Methanol, Wasser und gesättigter NaHCO₃ Lösung wieder aufbereitet. Die Reaktionsmischung wurde filtriert und das Harz mit Wasser (500 ml) gewaschen. Die kombinierten Filtrate wurden zur Trockne konzentriert und im Vakuum über Nacht getrocknet. Der Rückstand wurde über eine Säule (5 cm Tiefe, Silikagel, Mesch, CHCl₃-CH₃OH, 10:1) gereinigt und ergab einen leicht gelben Feststoff, welcher nach Umkristallisation aus absolutem Alkohol einen farblosen Feststoff (2) ergab [R_f = 0,43 (CHCl₃-CH₃OH, 5:1 ), 7,3 g, 35,52 %]. Die erhaltene L-gulose (R₁ = 0,07, 11 g) wurde recycelt um (2) zu erhalten (5 g, Gesamtausbeute 60 %): mp 142.5-145°C; ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 3,22–3,68 (m, 4H, H-2, -3, -4 und -6a), 3,83 (d, J_6b6a = 7,25 Hz, 1 H, H_b-6), 4,22 (pseudo t, J_5,6a = 4,61 und 4,18 Hz, H, H-5), 4,46 (d, J_2-OH,2 = 6,59 Hz, 1 H, 2-OH, austauschbar mit D₂O), 4,62 (d, J_3-OH,3 = 5,28 Hz, 1 H, 3-OH, austauschbar mit D₂O), 5,07 (d, J_4-OH,4 = 4,84 Hz, 1 H, 4-OH, austauschbar mit D₂O, 5,20 (d, J_1,2 = 2,10 Hz, 1H, H-1). [α]_D ²⁵-50,011 (c, 1,61, CH₃OH).
Beispiel 3 Synthese von (–)-(1'S,2S,4S)-4-(1,2-dihydroxyethyl-1,2-o-isopropyliden) – 2-hydroxymethyl)-dioxolan (4)
Eine Lösung von NalO₄ (22,36 g, 0,1 mol) in Wasser (300 ml) wurden tropfenweise über 10 Minuten zu einer Lösung von (2) (11,3 g, 0,07 mol) in Methanol (350 ml) bei 0° C zugesetzt. Die Mischung wurde für 15 Minuten mechanisch gerührt. NaBH₄ (7,91 g, 0,21 mol) wurden dieser Mischung zugesetzt und die Reaktionsmischung wurde für 10 Minuten bei 0° gerührt. Der weiße Feststoff wurde abfiltriert und der Feststoff mit Methanol (300 ml) gewaschen. Die kombinierten Filtrate wurden mit 0,5 NHCl (~ 200 ml) neutralisiert und bis zur Trockne aufkonzentriert. Der Rückstand wurde unter Vakuum über Nacht getrocknet. Der sirupartige Rückstand wurde mit Methanol-Aceton (1:5, 1200 ml) mit einem mechanischen Rührer (5 Stunden) pulverisiert und der weiße Feststoff (erstens) abfiltriert. Das Filtrat wurde bis zur Trockne aufkonzentriert und der Rückstand in Aceton (500 ml) und anschließend Paratoluolsulfonsäure (6,63 g, 0,025 mol) gelöst. Nach 6-stündigem Rühren wurde die Mischung mit Triethylamin neutralisiert, der Feststoff (zweitens) abfiltriert und die Filtrate bis zur Trockne aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in Ethylacetat (350 ml) gelöst und mit Wasser (2 × 50 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und abgedampft, um das Rohprodukt (4) (3,6 g) als gelblichen Sirup zu ergeben. Die wässrige Phase wurde bis zur Trockne aufkonzentriert und im Vakuum getrocknet. Die erhaltenen Feststoffe (erster und zweiter) wurden mit der getrockneten Wasserphase vereinigt und durch einstündiges Rühren in 10 % Methanol-Aceton (900 ml) und Paratoluolsulfonsäure (16 g, 0,084 mol) recycelt, um das Rohprodukt (4) zu ergeben (5,6 g). Das Rohprodukt (4) wurde durch eine trockene Silikagelsäule (CH₃OH-CHCl₃, 1 % – 5 %) gereinigt, um (4) zu ergeben. [R_f = 0,82 (CHCl₃-CH₃OH, 10:1), 8,8 g, 61,84 %] als farbiges Öl. ¹H NMR(DMSO-d₆) δ 1,26 und 1,32 (2 × s, 2 × 3 H, Isopropyliden), 3,41 (dd, J_CH2OH,OH = 6,04 Hz, J_CH2OH,2 = 3,96 Hz, 2H, CH₂OH), 3,56 – 4,16 (m, 6H, H-4, -5, -1' und -2'), 4,82 (t, J_OH,CH2 = 6,0 Hz, 1 H, CH₂OH, austauschbar mit D₂O), 4,85 (t, J_2OH,CH2OH = 3,96 Hz, 1 H, H-2) · [α]_D ²⁵ – 12,48 (C, 1,11, CHCl₃), Analog berechnet für C₉H₁₆O₅ C,52.93; H, 7,90. Gefunden: C, 52,95; H, 7,86.
Beispiel 4 Synthese von (+)-(1'S,2S,4S)-4-(1,2-dihydroxymethyl-1,2-o-isopropyliden)-2-(0-benzoyloxymethyl)-dioxolan (5)
Benzoylchlorid (6,5 ml, 0,056 mol) wurden zu einer Lösung aus (4) (8,5 g, 0,042 mol) in Pyridin-CH₂Cl₂ (1:2, 120 ml) bei 0° C zugetropft und die Temperatur auf Raumtemperatur erhöht. Nach Rühren für 2 Stunden wurde die Reaktion mit Methanol (10 ml) abgebrochen und die Mischung im Vakuum zur Trockne aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in CH₂Cl₂ (300 ml) gelöst und mit Wasser (2 × 100 ml) gelöst, ausgesalzt, getrocknet (MgSO₄), filtriert und abgedampft, um einen gelblichen Sirup zu ergeben, welcher mittels Silikagelsäulenchromatographie (EtOAc-Hexan 4 % – 30 %) gereinigt wurde, um Produkt (5) zu ergeben [R_f = 0,45 (Hexan-EtOAc, 3:1 ), 10,7 g, 83,4 %] als farbloses Öl. 1H NMR (CDCl₃) δ 1,35 und 1,44 (2 × s, 2 × 3H, Isopropyliden) 3,3 – 4,35 (m 6H, H-4, -5, -1' und -2'), 4,44 (d, J=3,96 Hz, 2H, CH₂-OBz), 5,29 (t, J=3,74 Hz, 1H, H-2), 7,3 – 7,64, 8,02 – 8,18 (m, 3H, 2H, -OBz). [α]_D ²⁵ + 10,73 (c,1,75,CH₃OH). Analog berechnet für C₁₆H₂₀O₆ C, 62.33;H,6,54. Gefunden: C,62.39; H, 6,54.
Beispiel 5 Synthese von (+)-(1'S,2S,4S)-4-1,2-dihydroxyethyl)-2-(o-benzoyloxymethyl)-dioxolan (6)
Eine Mischung von (5) (5,7 g, 0,0180 mol) und Paratoluolsulfonsäure (1,05 g, 0,0055 mol) in Methanol (70 ml) wurde für zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion war beendet, so daß das Lösungsmittel auf die Hälfte des Originalvolumens abgedampft werden konnte und zusätzliches Methanol (50 ml) und Paratoluolsulfonsäure (0,7 g, 3,68 mmol) zugegeben wurden. Nach einer weiteren Stunde Rühren wurde die Mischung mit Triethylamin neutralisiert und die Lösung zur Trockne eingedampft.
Der Rückstand wurde durch Silikagelsäulenchromatographie gereinigt (Hexan-EtOAC, 10 % – 33 %) und ergab (6) [R_f = 0,15 (Hexan-EtOAc, 1:1), 4,92 g, 99,2 %] als ein farbloser Sirup ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 3,43 (m, 2H, H-2'), 3,67–4,1 (m, 4H, H-4, -5 und -1'), 4,32 (d, J=3,73 Hz, 2H, CH₂-OBz), 4,60 (t, J=5,72 Hz, 2'-OH, austauschbar mit D₂O), 5,23 (t, J=3,96 Hz, 1H, H-2), 7,45–7,7, 7,93–8,04 (m, 3H, 2H, -OBz), [α]_D ²⁵ + 9,16 (c, 1,01, CHCl₃). Analog berechnet für C₁₃H₁₆O₆ : C, 58,20; H, 6,01. Gefunden: c, 58,02; H. 6,04.
Beispiel 6 Synthese von (–)-(2S,4S) und (2S,4R)-4-Acetoxy-2-(o-benzoyloxymethyl)-dioxolan (8)
Eine Lösung von NalO₄ (10,18 g, 0,048 mol) in Wasser (120 ml) wurde zu einer Lösung von (6) (3,04 g, 0,011 mol) in CCl₄ : CH₃CN (1:1, 160 ml), gefolgt von RuO₂ – Hydrat (0,02 g), gegeben. Nach der Reaktion wurde die Mischung für 5 Stunden gerührt, der Feststoff durch Filtration über Celite filtriert und das Filtrat auf ein Drittel des Volumens abgedampft. Der Rückstand wurde in CH₂Cl₂ (100 ml) gelöst und die wässrige Phase mit CH₂Cl₂ (2 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Salzlösung gewaschen (50 ml), getrocknet (MgSO₄), filtriert, bis zur Trockne abgedampft und in Vakuum für 16 Stunden getrocknet, um das Rohprodukt (7) (2,6 g, 91 %) zu ergeben.
Zu einer Lösung des Rohproduktes (7) (2,6 g, 0,01 mol) in trocknem THF (60 ml) wurde Pb(OAc)₄ (5,48 g, 0,0124 mol) und Pyridin (0,83 ml, 0,0103 mol) unter N₂-Atmosphäre gegeben. Die Mischung wurde 45 Minuten unter N₂ gerührt und der Feststoff durch Filtration entfernt. Der Feststoff wurde mit Ethylacetat (60 ml) gewaschen und die vereinigten organischen Phasen zur Trockne abgedampft. Der Rückstand wurde durch Silikagelsäulenchromatographie (Hexan-EtOAc, 2:1) gereinigt und ergab (8). [R_f = 0,73 und 0,79 (Hexan-EtOAc, 2:1) 1,9 g, 69,34 %] als ein farbloses Öl. ¹H NMR (CDCl₃) δ 1,998, 2,11 (2X s, 3H, -OAc), 3,93 – 4,33 (m, 2H, H-5), 4,43, 4,48 (2Xd, J=3,73, 3,74 Hz, 2H, CH₂OBz), 5,46, 5,55 (2Xt, J = 4,18, 3,63 Hz, 1H, H-2), 6,42(m, 1H, H-4), 7,33–759, 8,00–8,15 (m, 3H, 2H, -OBz). [α]_D ²⁵ – 12,53 (c, 1,11, CHCl₃). Analog berechnet für C₁₃H₁₄O₆; C, 58,64; H, 5,30. Gefunden C, 58,78; H, 5,34.
Beispiel 7 Synthese von (–)-(2S,4S)-1-[2-(Benzoyl)-1,3-dioxolan-4-yl]cytosin (9) und (+)-(2S,4R)-1-[2-(Benzoyloxy)-1,3-dioxolan-4-yl)cytosin (10)
Eine Mischung aus N⁴-Acetylcytosin (1,24 g, 7,52 mmol) in trockenem Dichlorethan (20 ml), Hexamethyldisilazan (15 ml) und Ammoniumsulfat (katalytische Menge) wurden für 4 Stunden unter Stickstoffatmosphäre zum Sieden erhitzt. Die erhaltene klare Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt. Zu diesem silylierten Acetylcytosin wurde eine Lösung (8) (1,0 g, 3,76 mmol) in trockenem Dichlorethan (10 ml) und TMSOTf (1,46 ml, 7,55 mmol) gegeben. Die Mischung wurde 6 Stunden gerührt. Gesättigtes NaHCO₃ (10 ml) wurde zugesetzt und die Mischung für weitere 15 Minuten gerührt und über ein Celite-Kissen filtriert. Das Filtrat wurde abgedampft und der Feststoff EtOAc und mit Wasser und Salzlake gewaschen, getrocknet, filtriert und abgedampft, um das Rohprodukt zu ergeben. Das Rohprodukt wurde auf einer Silikasäule (5 % CH₃OH/CHCl₃) gereinigt und führte zu einer reinen α, β Mischung von (9) und (10) (0,40 g, 30 %) und der α, β Mischung von (13) und (14) (0,48 g, 40 %). Die Mischung von (14) wurde zur Trennung reacetyliert, die vereinigten a, ß Mischungen wurden durch eine lange Silikasäule (3 % CH₃OH/CHCl₃) getrennt, um Produkt (9) (0,414 g, 30,7 %) und (10) (0,481 g, 35,6 %) als Schaum zu ergeben. Diese Schäume wurden mit CH₃OH gepulvert, um einen weißen Feststoff zu erhalten. 9: UV (CH₃OH) λ max 298 nm; Analog: (C₁₇H₁₇N₃O₈) C, H, N. 10: UV (CH₃OH) λ max 298 nm.
Beispiel 8 Synthese von (–)-(2S,4S)-1-(2-Hydroxymethyl-1,3-dioxolan-4-yl)cytosin (11)
Eine Lösung von (9) (0,29 g, 0,827 mmol) in CH₃OH/NH₃ (50 ml, gesättigt bei 0° C) wurde für 10 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde abgedampft und das Rohprodukt (11) wurde durch preparative Silikaplatten (20 %, CH₃OH/CHCl₃) gereinigt, um ein Öl zu ergeben. Dieses wurde aus CH₂Cl₂/Nexan kristallisiert, um (11) als weißen Feststoff zu ergeben (0,136 g, 77,7 %). UV λ max 278,0 nm (e 11967) (pH 2), 270,0 nm (e 774) (pH 7), 269,0 nm (ε 8379) (pH 11); Analog (C₈H₁₁N₃O₄) C, H, N.
II. Pharmazeutische Zusammensetzungen
Menschen, Pferde, Hunde, Rinder und andere Tiere und insbesondere Säugetiere, welche an Tumoren, und insbesondere an Krebs, erkrankt sind, können durch Verabreichung einer effektiven Menge an (–)-OddC oder dessen Derivate oder einem pharmazeutisch akzeptablen Salz davon optional in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Lösungsmittel an dem Patienten alleine oder in Kombination mit anderen bekannten Antikrebs oder pharmazeutischen Reagenzien behandelt werden. Diese Behandlung kann auch in Kombination mit anderen konventionellen Krebstherapien wie der Strahlungstherapie oder der Chirurgie kombiniert werden.
Diese Verbindungen können durch jede geeignete Weise verabreicht werden, wie z. B. oral, parenteral, intravenös, intradermal, subkutan oder nach Sachgebiet in Flüssigkeiten, Creme, Gel oder fester Form oder als Aerosolform verabreicht werden.
Die aktive Komponente ist im pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel in einer Menge enthalten, die hinreichend ist, dem Patienten eine therapeutisch effektive Menge für die gewünschte Indikation bereitzustellen, ohne ernsthafte toxische Effekte im Patienten hervorzurufen. Eine bevorzugte Dosis für alle hierin erwähnten Bedingungen liegt im Bereich von ungefähr 10 ng/kg bis 300 mg/kg, bevorzugt 0,1 bis 100 mg/kg pro Tag, allgemeiner 0,5 bis 25 mg/kg Körpergewicht des Rezipienten pro Tag. Eine typische sachgebietsgemäße Dosis liegt im Bereich von 0,01 bis 3 % Gew./Gew. in einem geeigneten Träger.
Die Verbindung wird konventionell in einer geeigneten Dosierungseinheit verabreicht von einschließlich, jedoch nicht begrenzt hierauf, eine Einheit beinhaltend 1 bis 3000 mg, bevorzugt 5 bis 500 mg des aktiven Inhaltsstoffs pro Dosierungseinheit. Eine orale Dosis von 25 bis 250 mg ist gewöhnlich zufriedenstellend.
Der aktive Inhaltsstoff wird bevorzugt verabreicht, um eine Plasmaspitzenkonzentration der aktiven Verbindung von ungefähr 0,00001 bis 30 mM, bevorzugt ungefähr 0,1 bis 30 μM zu erhalten. Das kann beispielsweise durch intravenöse Injektion einer Lösung oder Formulierung der aktiven Inhaltsstoffe, optional in Salzlösung oder in einem wässrigen Medium oder durch Verabreichung einer Pille mit dem aktiven Inhaltsstoff erreicht werden.
Die Konzentration der aktiven Verbindung in der Arzneimittelzusammenstellung wird von der Absorption, Verteilung, Inaktivierung und den Ausscheideraten des Pharmazeutikums wie auch von anderen Faktoren, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, abhängen. Es wird auch darauf hingewiesen, daß die Dosierungsmengen mit dem Zustand der zu heilenden Erkrankung variieren werden. Es wird des weiteren davon ausgegangen, daß für jedes einzelne Subjekt die spezifischen Dosierungen über die Zeit in Abhängigkeit der individuellen Bedürfnisse und der professionellen Entscheidungen der verabreichenden oder die Verabreichung der Zusammensetzungen überwachenden Person eingestellt werden müssen und daß die hierin offenbarten Konzentrationsbereiche nur exemplarisch und nicht die Anwendung oder den Bereich der beanspruchten Zusammensetzung einschränkend sind. Der aktive Inhaltsstoff kann in einem oder aufgeteilt in eine Anzahl kleinerer Dosen zur Verabreichung in variierenden Zeitintervallen verabreicht werden.
Orale Zusammensetzungen werden generell inerte Lösungsmittel oder eßbare Träger beinhalten. Sie können in Gelatinekapseln eingeschlossen oder in Tabletten gepreßt sein. Für die Anwendung der oralen therapeutischen Verabreichung kann die aktive Verbindung oder deren propharmazeutisches Derivat mit Bindemitteln vermengt und in Form von Tabletten, Pillen oder Kapseln eingesetzt werden.
Die Tabletten, Pillen, Kapseln, Pastillen und dergleichen können jede der folgenden Inhaltsstoffe oder Verbindungen derselben Natur aufweisen: Ein Bindemittel wie mikrokristalline Zellulose, Tragantgummi oder Gelatine; ein Bindemittel wie Stärke oder Laktose, ein Dispergierreagenz wie Alginsäure, Primogel oder Maisstärke; ein Schmiermittel wie Magnesiumstearat oder Sterotes; ein Gleitmittel wie kolloidale Siliciumdixodie; ein Süßungsreagenz wie Saccharose oder Saccharin; ein Aromamittel wie Pfefferminze, Methylsalicylat oder Orangenaroma. Wenn die Dosierungseinheitsform eine Kapsel ist, kann diese zusätzlich zu den oben genannten Typen von Materialien einen flüssigen Träger wie ein Fettöl enthalten. Zusätzlich können die Darreichungsformen eine Vielzahl anderer Materialien, die die physikalische Form der Darreichungsform verändern wie z. B. Zuckerbeschichtungen, Schellack oder Entericreagenzien enthalten.
Die aktive Verbindung oder das pharmazeutisch akzeptable Salz dieser können als Bestandteil eines Elixiers, einer Suspension, eines Sirups, einer Scheibe, eines Kaugummis oder dergleichen verabreicht werden. Ein Sirup kann zusätzlich zu den aktiven Verbindungen Saccharose als Süßungsmittel und bestimmte Konservierungsstoffe, Pigmente und Färbungsmittel und Aromastoffe enthalten.
Die aktive Verbindung oder das pharmazeutisch akzeptable Salz dieser kann auch mit anderen aktiven Materialien gemischt werden, die nicht die gewünschte Reaktion stören oder mit Materialien, die die gewünschte Reaktion unterstützen, wie andere Antikrebsreagenzien, Antibiotika, Fungizide, entzündungshemmende Substanzen oder antiviralen Verbindungen gemischt werden.
Lösungen oder Suspensionen zur parenteralen, intradermalen, subkutanen oder sachgebietsgemäßen Applikation können die folgenden Komponenten beinhalten: Ein steriles Lösungsmittel wie Wasser zur Injektion, Salzlösungen, fette Öle, Polyethylenglykole, Glycerin, Propylenglykol oder andere synthetische Lösungsmittel; antibakterielle Reagenzien wie Benzylalkohol oder Methylparaben; Antioxidantien wie Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit; Chelatisierungsreagenzien wie Ethylendiamintetraessigsäure; Puffer wie Acetat, Citrat oder Phosphat und Reagenzien zur Einstellung der Tonizität wie Natriumchlorid oder Dextrose. Die parentalen Preparationen können in Ampullen, Einmalinjektionen oder Mehrdosisphiolen aus Glas oder Plastik abgefüllt sein.
Wenn intravenös verabreicht, sind bevorzugte Träger physiologische Salzlösungen oder phosphatgepufferte Salzlösungen (PBS).
In einem Ausführungsbeispiel sind die aktiven Verbindungen mit Trägern hergestellt, die die Verbindung gegen schnelle Eliminierung durch den Körper schützen, wie Formulierungen zur kontrollierten Abgabe, einschließlich Implantaten und mikrogekapselten Dosierungssystemen. Biologisch abbaubare, biokompatible Polymere wie Ethylenvinylacetat, Polyanhydrided, Polyglykolsäure, Kollagen, Polyorthoester und Polymilchsäure können eingesetzt werden. Methoden zur Herstellung solcher Formulierungen sind dem Fachmann bekannt.
Liposomale Suspensionen können gleichfalls pharmazeutisch akzeptable Träger sein. Diese können nach den Methoden, die dem Fachmann bekannt sind, wie z. B. beschrieben im US-Patent 4,522,811 (auf welches hierin in seiner Gänze verwiesen wird), hergestellt werden. Zum Beispiel können Liposomoformulierungen durch Lösen geeigneter Lipide (wie Stearoyl Phosphatidyl Ethanolamin, Stearoyl Phosphatidyl Cholin, Arachadoyl Phosphatidyl Cholin und Cholesterol) in einem organischen Lösungsmittel hergestellt werden, das dann abgedampft wird, wodurch dann ein dünner Film aus getrocknetem Lipid auf der Oberfläche des Gefäßes zurückbleibt. Eine wässrige Lösung der aktiven Verbindung wird dann in das Gefäß eingebracht. Das Gefäß wird von Hand bewegt, um den Lipidfilm von den Seiten des Gefäßes zu befreien und Lipidaggregate zu dispergieren, wobei eine liposomale Suspension gebildet wird.
III. Biologische Aktivität
Eine große Vielzahl biologischer Assays wurde eingesetzt und sind durch Fachleute zur Bestimmung der Antikrebsaktivität der Verbindungen anerkannt. Jede dieser Methoden kann zur Evaluierung der Aktivität der hier offengelegten Verbindungen eingesetzt werden.
Eine allgemeine Methode zur Bestimmung der Aktivität ist durch die Verwendung von Testplatten von Krebszellinien des National Cancer Institutes (NCl). Diese Tests evaluieren die in vitro Antikrebsaktivität von bestimmten Verbindungen und ermöglichen voraussagende Daten hinsichtlich der Verwendung der getesteten Verbindungen in vivo. Andere Assays schließen die in vivo Evaluation der Verbindungseffizienz auf humane oder Maustumorzellen ein, die in Nacktmäuse implantiert werden oder auf diese aufgebracht werden. (–)-OddC wurde in vivo auf die Antikrebsaktivität gegen P388 Leukämiezellinien und C38 Dickdarmkrebszellinien getestet. Beispiele 9 und 10 liefern die experimentellen Details und Ergebnisse dieser Tests.
Beispiel 9 In vivo Behandlung von Leukämie P388 Zellen mit (–)-OddC 10⁶ Leukämie P388 Zellen wurden ip in BDF1 Mäuse des Southern Research Institute, Alabama, implantiert. (–)-OddC wurde zweimal täglich an fünf Tagen ip verabreicht, beginnend einen Tag nach der Tumorzellenimplantation. Gemäß diesem Protokoll zeigte sich eine Dosis von 75 mg/kg/Dosis als tödlich für die Mäuse.
3 und Tabelle 1 zeigen die Ergebnisse dieser Studie. In 3 stellt (•) die Daten für die Kontrollgruppe (unbehandelte Tiere), (--Δ--) die Daten für die Überlebensrate von denen, die zweimal am Tag mit 25 mg/kg/Körpergewicht (–)-OddC und (O) die Daten der Überlebensrate von Mäusen, die einmal täglich mit 50 mg/kg Körpergewicht (–)-OddC behandelt wurden. Von den 6 mit 25 mg/kg/Dosis (–)-OddC behandelten Mäusen war eine eine Langzeitüberlebende und die Lebensspanne der verbleibenden 5 Mäuse wurde um 103 % erhöht.
Tabelle 1
Beispiel 10 In vivo Behandlung von Dickdarmkrebs 38 Tumorzellen mit (–)OddC Dickdarm 38 Tumorzellen wurden sc in BDF1 Mäuse implantiert. (–)-OddC wurde den Mäusen zweimal täglich an 5 Tagen mit einer Dosierung von 25 mg/kg/Dosis verabreicht. Das Dickdarmtumorzellenwachstum wurde, wie in 2 gezeigt, zurückgedrängt. In 2 zeigt (•) die Daten der Kontrolltiere und (
) die Daten der mit (–)-OddC behandelten Mäuse.
Beispiel 11 In vitro Untersuchung von (–)-OddC
(–)-OddC wurde im NCl Krebsscreening-Programm evaluiert. Der Test mißt die Unterdrückung unterschiedlicher Krebszellinien bei unterschiedlichen Konzentrationen von (–)-OddC. Die Zellinien, die getestet wurden, sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2 zeigt gleichfalls die Konzentration, bei welchen G150 und TGI in den getesteten Zellinien beobachtet wurde. GI50, TGI und LC50 sind die Werte, die die Konzentration darstellen, bei welchen das TG (prozentuale Wachstumsunterdrückung), nachfolgend definiert, + 50,0 und – 50 ist. Die Werte wurden durch Interpolation der Dosisantwortkurven, die für jede Zellinie erstellt wurden, dargestellt als Funktion von TG versus log₁₀ der (–)-OddC – Konzentration, erhalten.
TG ist der gemessene Effekt von (–)-OddC auf eine Zellinie und wurde gemäß einer der nachfolgenden beiden Gleichungen berechnet:

Wenn (Durchschnitt OD_test – Durchschnitt OD_tnull) ≥ 0, dann ist PG = 100 × (Durchschnitt ODtest – Durchschnitt ODtnull) / (Durchschnitt ODKonrolle – Durchschnitt ODtnull)
Wenn (Durchschnitt OD_test – Durchschnitt OD_tnull) < 0, dann ist PG = 100 × (Durchschnitt ODtest – Durchschnitt ODtnull) / (Durchschnitt ODtnull) wobei Durchschnitt OD_tnull = den gemittelten optischen Dichtemessungen von SRB-geleiteten Farben genau vor dem Aussetzen der Zellen gegenüber der Testverbindung.

Durchschnitt OD_test = den gemittelten optischen Dichtemessungen der SRB-abgeleiteten Farbe 48 Stunden nach Aussetzen der Zellen gegenüber den Testverbindungen.
Durchschnitt OD_Kontrolle = den durchschnittlichen optischen Dichtemessungen der SRB-abgeleiteten Farbe nach 48 Stunden ohne Aussetzung der Zellen gegenüber der Testverbindung.
In Tabelle 2 beschreiben die ersten beiden Spalten das Unterpanel (z. B. Leukämie) und die Zellinie (z. B. CCRF-CEM), welche mit (–)-OddC behandelt wurden. Spalte 3 zeigt den Logo – Wert an, an welchem G150 auftrat und Spalte 4 zeigt den Logo – Wert an, an welchem TGI auftrat. Wenn diese Antwortparameter nicht durch Interpolation eingehalten werden konnten, ist der angegebene Wert für jeden Antwortparameter die höchste getestete Konzentration und ist durch ein „>"-Zeichen gekennzeichnet. Wenn z. B. alle PG-Werte zu allen gegebenen Konzentrationen von (–)-OddC bei einer bestimmten Zellinie + 50 überschreiten, kann dieser Parameter nicht mehr durch Interpolation erhalten werden.
Tabelle 2
4 ist eine graphische Darstellung, welche die relative Selektivität von (–)-OddC für bestimmte Zellinien zeigt. Balken, die sich zur rechten erstrecken, repräsentieren die Empfindlichkeit von Zellinien gegenüber (–)-OddC im Vergleich zur mittleren Empfindlichkeit aller getesteten Zellinien.
Da die Skalierung logarithmisch erfolgt, impliziert ein Balken, der sich zwei Einheiten nach rechts erstreckt, daß die Verbindung GI50 für die Zellinie bei einer Konzentration von 1/100 der benötigten Konzentration über alle Zellinien erreicht und daß diese Zellinie ungewöhnlich empfindlich gegenüber (–)-OddC ist. Balken, die sich nach links erstrecken, implizieren eine Empfindlichkeit geringer als der Durchschnitt. Diese Zellinien können einfach in Tabelle 2 erkannt werden, da die Log₁₀-Konzentration mit einem „<"-Zeichen versehen ist.
Es kann aus 4 entnommen werden, daß mindestens eine Zellinie jedes getesteten Krebszelltypen eine Empfindlichkeit gegenüber (–)-OddC zeigt. Bestimmte Prostata-Krebszellinien, Leukämie-Zellinien und Dickdarmkrebs-Zellinien zeigen extreme Empfindlichkeit gegenüber (–)-OddC.
Beispiel 12 Vergleich von -(–)OddC und AraC
Wie im technologischen Hintergrund zu dieser Erfindung ausgeführt, ist Cytosinarabinosid (auch als Cytoarabin, araC und Cytosar bezeichnet) ein Nukleosidanalogon von Deoxycytidin, welches in der Behandlung von akuter myeloischer Leukämie und in geringerem Ausmaß hilfreich bei chronischer myolocytischer Leukämie und non-Hodgkin Lymphomen ist. Die hauptsächliche Wirkung von araC ist die Unterdrückung der nuklearen DNA-Synthese. Es war auch von Interesse, die Toxizität gegenüber Tumorzellen von (–)-OddC und AraC zu vergleichen.
Zellen im logarithmischen Wachstum wurden mit einer Dichte von 5000 Zellen/ml/Bohrloch auf 24-Bohrlochplatten aufgebracht. Die Pharmazeutika wurden den Zellen in unterschiedlichen Dosierungen zugesetzt und die Kulturen wurden für einen Zeitraum von drei Generationen gepflegt. Am Ende dieser Zeit wurde ein Methylenblautest durchgeführt und/oder die Zellenzahl wurde direkt bestimmt. Metyhlenblau ist ein Farbstoff, welcher sich in stöchiometrischer Weise an Proteine unterschiedlicher Zellen bindet und welcher zur indirekten quantitativen Zellzahlbestimmung genutzt werden kann (Finlay, 1984). Die IC₅₀-Werte wurden durch Interpolation der aufgetragenen Daten bestimmt. Jeder gezeigte Wert ist die mittlere +/– Standardabweichung von 5 Experimenten, wobei jeder Datenpunkt doppelt bestimmt wurde.
In allen getesteten Tumorzellinien war (–)-OddC cytotoxischer als AraC. (–)-OddC war signifikant effektiver als AraC gegenüber Nasopharyngealkarzinomzellinien und gegenüber den beiden Prostatakarzinomlinien DU-145 und PC-3. Von hepatozellularen Karzinomen abstammende HepG2-Zellen und die 2.2.15-Linie, die aus HepG2-Zellen hergeleitet ist, wurden mit einer Kopie des Hepatitis B-Virusgenoms transfiziert. CEM-Zellen wurden aus akuter lymphoblastischer Leukämie gewonnen. (–)-OddU, die Verbindung, die durch die Deaminierung von (–)-OddC hergestellt wurde, war gegenüber allen getesteten Zellinien nicht toxisch. Enzymatische Studien indizierten, daß im Gegensatz zu AraC, dessen klinische Effizienz größtenteils auf die Suszeptibilität zur Deaminierung zurückgeführt wird, (–)-OddC kein Substrat für die Deaminase ist.
Es wurde bestimmt, daß (–)-OddC in vivo zum Mono-, Di- und Triphosphatnukleotid phosphoryliert werden kann. Es scheint, daß (–)-OddC seine zellulare Toxizität in der phosphorylierten Form zeigt, da Zellen, die unfähig zur Phosphorylierung der Verbindung sind, eine deutlich geringere Sensitivität gegenüber der Verbindung zeigen. Das erste Enzym, das für die Phosphorylierung verantwortlich ist, ist die menschliche Deoxycytidinkinase. In vitro enzymatische Studien legen nahe, daß (–)-OddC durch dieses Enzym phosphoryliert werden kann.
Entgegen araC wird (–)-OddC nicht durch die Cytidindeaminase deaminiert. Die Gegenwart von Cytidindeaminase im festen Tumorgewebe kann ein Schlüsselfaktor sein, der für die mangelnde Aktivität von araC in festen Tumoren verantwortlich ist. Das kann teilweise erklären, warum (–)-OddC aktiv gegen HepG2-Zellen in Nacktmäusen ist, während araC inaktiv ist. Dies erklärt gleichfalls, warum (–)-OddC ein anderes Spektrum der Antitumoraktivität hat als araC.
Des weiteren spielt die Anwesenheit von Cytidindeaminase im gastro-intestinalen Trakt vielleicht eine Rolle darin, warum araC nicht oral aufgenommen werden kann.
Biochemische Untersuchung von (–)-OddC In vitro Cytotoxizität von AraC, (–)-OddC und (–)-OddU
Beispiel 12 In vivo Untersuchungen
Drei bis sechs Wochen alte NCr Nacktmäuse (Taconische Immundefizitmäuse und Ratten) wurden subkutan in jeder Flanke mit 2 mal 10⁶ HepG2 oder DU-145 Zellen inoculiert und dem Tumor wurde erlaubt zu wachsen. Die Behandlung begann, wenn der Tumor 100 bis 250 mg bei der Bestimmung mittels Calipermessung und Berechnung gemäß der Formel: Tumorgewicht (mg) = Länge (mm) × Breite (mm2) ÷ 2erreicht hatte. Die Pharmazeutika wurden in den angezeigten Dosen am Tag 0 bis 4 verabreicht und die Tumorgröße jeden einzelnen Tag gemessen. Die Tumorwachstumskurven wurden wie in Bell et al., Cancer (phila.) 36:2437–2440 (1975), generiert und sind in 5(a) unter 5(b) dargestellt.
Die Toxizität wurde durch die Änderung des Körpergewichts bestimmt.
Auch die in vitro Toxizität von AraC wurde genauso wie die von (L)-OddC bestimmt, wobei AraC ineffizienter in diesem Tiermodell war. Die enzymatische Analyse der Tumorextrakte deutete darauf hin, daß dies nicht an der steigenden dCd-Aktivität oder der abnehmenden dCK-Aktivität lag, sondern ein Ergebnis des extensiven AraC-Metabolismus in der Leber ist, welche einen hohen dCd-Spiegel aufweist. Im Gegensatz zu AraC war (L)-OddC sowohl bei HepG2 als auch DU-145 xenotest-effektiv. Die Nettozelltötung (log 10) berechnet für HepG2-Tumore war 0,67 und 0,87 für die IP bzw. orale Behandlung. Die DU-145-Tumore wurden kleiner in der Größe, wobei die Hälfte von Ihnen innerhalb von 15 Tagen vollständig zurückging. Die Tumore begannen 25 Tage nach der letzten Behandlung wieder aufzutreten, aber das Wachstum stoppte wieder nach 47 Tagen. Am 60. Tag wurden die Tiere geopfert und die Tumore entnommen. Die Tumore hatten eine nekrotische Morphologie mit sehr wenigen Zellen, die in der Lage waren, Trypanblau einzuschließen. Zusätzlich konnte keine Enzymaktivität in dem Gewebe beobachtet werden. Die verabreichten Dosen an AraC und (L)-OddC waren gleich toxisch, wie durch den Gewichtsverlust der Tiere gezeigt, und vorläufige Toxizitätsexperimente suggerieren, daß 25 mg/kg zweimal täglich die maximal tolerable Dosis für 5 aufeinanderfolgende Behandlungstage ist. Ein Protokoll, bei welchem das Pharmazeutikum unterbrochen verabreicht wird, ist wahrscheinlich zu bevorzugen.
Die hier gezeigten in vitro und in vivo Daten demonstrieren, daß (L)-OddC eine signifikante Antikrebsaktivität besitzt und in vielen Punkten den momentan erhaltbaren Deoxycytidinanalogon überlegen ist. Es ist nicht nur das erste L-Nukleosidanalogon, das jemals Antikrebsaktivität gezeigt hat, sondern ist auch der erste wahre Kettenunterbrecher, der geeignet ist, das Tumorwachstum zu unterdrücken. Auch wenn die unnatürliche Stereochemie (L)-OddC nicht davor schützt, durch metabolische Enzyme aktiviert oder in die DNA inkorporiert zu werden, ist dies vielleicht doch ein Faktor, der diese Verbindung vor dem Abbau durch dCD schützt. (L)-OddC ist auch einmalig in seiner Aktivität in festen Tumoren, welche gewöhnlich unempfänglich für eine Nukleosidanalogontherapie sind. Das Pharmazeutikum 2', 2'-Difluorodeoxycytidin(Gemcitibin), welches momentan für die Behandlung fester Tumore klinisch untersucht wird, ist weiterhin empfindlich gegenüber der Inaktivierung durch dCD(16). Da die Erhöhung des dCD-Spiegels ein Mechanismus, bei welchem die Zellen resistent gegenüber dCyd-Analoger wie AraC(17) werden, kann (L)-OddC hilfreich bei der Behandlung von Patienten sein, die unempfindlich gegenüber diesen Pharmazeutika wurden.
IV. Verwendung von (–)-OddC in Oligonukleotiden und in der Antisenstechnik
Antisenstechnologie bezieht sich im allgemeinen auf die Modulation der Genexpression durch ein Verfahren, bei welchem ein synthetisches Oligonukleotid zu einer komplementären Nukleinsäuresequenz hybridiziert wird, um die Transkription oder Replikation zu unterdrücken (wenn die Zielsequenz die DNA ist), die Translation zu unterdrücken (wenn die Zielsequenz die RNA ist) oder die Verarbeitung zu unterdrücken (wenn die Zielsequenz die pre-RNA ist). Eine große Vielzahl von Zellaktivitäten kann durch diese Technik moduliert werden. Ein einfaches Beispiel ist die Unterdrückung der Proteinbiosynthese durch eine Antisensnukleotidbindung an die mRNA. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird ein synthetisches Oligonukleotid zu einer spezifischen Gensequenz in der Doppelstrang-DNA hybridiziert, wodurch sich ein Triplestrangkomplex (Triplex) bildet, der die Expression der Gensequenz unterdrückt. Antisensoligonukleotide können auch zur indirekten Aktivierung der Genexpression durch Unterdrückung der Biosynthese der natürlichen Repressoren genutzt werden oder direkt durch Unterdrückung der Termination der Transkription. Die Antisensoligonukleotidtherapie (AOT) kann zur Unterdrückung der Expression von pathogenen Genen genutzt werden, einschließlich solcher, die für das unkontrollierte Wachstum von benignen oder malignen Tumorzellen verantwortlich sind oder welche an der Replikation von Viren, einschließlich HIV und HBV, beteiligt sind.
Die Stabilität von Oligonukleotiden gegen die Nuklease ist ein wichtiger Faktor in der in vivo Anwendung. Es ist bekannt, daß die 3'-Exonukleaseaktivität verantwortlich ist für die meisten unmodifizierten Antisensoligonukleotidabbauten im Serum. Vlassov, V. V., Yakubov, L. A., in „Prospects for Antisense Nucleic Acid Therypy of Cancers and AIDS, 1991, 243–266, Wiley-Liss, Inc., New York; Nucleic Acids Res., 1993, 21, 145".
Der Austausch von Nukleotiden am 3'-Ende der Nukleotide mit (–)-OddC oder dessen Derivate kann die Oligonukleotide gegen den 3'-Exonukleaseabbau stabilisieren. Alternativ oder zusätzlich kann ein internes Nukleotid gegen (–)-OddC oder dessen Derivate ausgetauscht werden, um dem Abbau der Oligonukleotide durch Endonukleasen zu widerstehen.
Durch die hier gegebene Offenbarung ist ein Fachmann auf diesem Gebiet in der Lage, (–)-OddC oder dessen Derivate zur Stabilisierung einer großen Reihe von Oligonukleotiden gegen den Abbau sowohl durch Exonukleasen als auch durch Endonukleasen zu stabilisieren, einschließlich der Nukleoside, die in der Antisensoligonukleotidtherapie eingesetzt werden. All diese Ausführungsbeispiele fallen in den Bereich dieser Erfindung. Beispiel 13 zeigt ein nicht limitierendes Beispiel der Verwendung von (–)-OddC zum Widerstehen gegen die Aktivität einer 3'-Exonuklease.
Beispiel 13 Resistenz gegenüber 3'-Exonukleaseaktivität durch (–)-OddC
Die menschliche Cytosolexonukleaseaktivität von menschlichem H9 (T-Typ lymphozytischen Leukämiezellen) wurde durch das Sequenzgelverfahren bestimmt. Kurz gesprochen wurde das 3'-terminierte Substrat aus einer 20 oder 23 Basen langen DNA Vorstufe mit der folgenden Gensequenz hergestellt:
Die Vorstufen wurden am 5'-Ende mit [T-³²P] ATP markiert, in die komplementäre RNA-Template überführt und am 3'-Ende mit dTTP (20 mer) dCTP (23 mer) oder (–)-OddCTP (23 mer) in einer stehenden Startreaktion katalysiert durch HIV-1 RT terminiert. Unter diesen Bedingungen wurde das 20 mer mit dTMP(A) terminiert, das 23 mer mit dCMP(B) oder (–)-O-ddCMP(10) terminiert. Diese Einzelstrang DNA-Substrate wurden zur Bestimmung der Suszeptibilität gegenüber cytoplastischer Exonuklease eingesetzt. Die Untersuchung wurde in 10 μl Reaktionen, aufweisend 50 mM Tris-HCL pH 8,0, 1 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreitol, 0,1 mg/ml Rinderalbuminserum, 0,18 μCi/ml 3'-terminiertes Substrat und 2μl Exonuklease (0,03 Einheiten) durchgeführt. Die Reaktionen wurden bei 37° C für die angezeigte Zeit inkubiert und durch Zugabe von 4 μl 98 %iges Formamid, 10 mM EDTA und 0,025 % Bromphenolblau abgebrochen. Die Proben wurden bei 100° C für fünf Minuten denaturiert, gefolgt von einer schnellen Abkühlung auf Eis. Das nicht abreagierte Material sowie auch die Reaktionsprodukte wurden auf 15 %igen Polyacrylamid/Harnstoffsequenzierungsgelen getrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Die Oligonukleotide mit (–)-OddC am 3'-Ende waren mindestens fünfmal resistenter gegenüber der 3'-Exonuklease als die anderen Oligonukleotide.

Claims

Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung aufweisend einen anti-Tumor effektiven Anteil eines β-L Nukleosidbestandteils der Struktur:
worin R¹ und R² Wasserstoff, Acyl- und C₁ – bis C₁₈ – Alkylreste darstellen, oder das pharmazeutisch akzeptable Salz dieser Verbindung, in einem pharmazeutisch akzeptablen Trägersystem, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Tumors in einem Wirtstier.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin R¹ und R² Wasserstoffe sind.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin die Alkylgruppe ausgewählt ist aus Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Isopropyl, Isobutyl, Sec. Butyl, t-Butyl und Iso-Pentyl.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin die Acylgruppe eine -C(O)R-Gruppe ist, worin R eine C₁ bis C₅ – Alkylgruppe, Phenyl oder Benzyl ist.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 bis 4, wobei der Tumor krebsartig ist.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Trägersystem eine orale Applikation ermöglicht.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Trägersystem eine intravenöse Applikation ermöglicht.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Trägersystem eine oberflächliche oder transdermale Applikation ermöglicht.
Verwendung einer Zusammensetzung aufweisend einen hinreichenden Anteil eines Bestandteils gemäß der Formel:
wobei R ausgewählt ist aus H, F, Cl, -CH₃, -C(H)=CH₂, -C=CH, -C≡N, Br, -NO₂, und R¹ und R² ausgewählt sind aus Wasserstoff, Alkyl, Acyl, Monophosphat, Diphosphat und Triphosphat, oder die pharmazeutisch akzeptablen Salze dieser, wahlweise in einem pharmazeutisch akzeptablen Trägersystem, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Tumors in einem Wirtstier.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 9, worin R Fluor, und R¹ und R² Wasserstoff sind.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, 9 oder 10, wobei das Wirtstier menschlich ist.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, 9 oder 10, wobei der Tumor krebsartig ist.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, wobei der Tumor Leukämie ist.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, wobei der Tumor Dickdarmkrebs ist.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, wobei der Tumor Blasenkrebs ist.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, wobei der Tumor Leberkrebs ist.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, wobei der Tumor Brustkrebs ist.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, wobei der Tumor Lungenkrebs ist.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, wobei der Tumor Rachenkrebs ist.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, wobei der Tumor Bauchspeicheldrüsenkrebs ist.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, wobei der Tumor Eierstockkrebs ist.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, wobei der Tumor Lymphdrüsenkrebs ist.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, wobei der Tumor Prostatakrebs ist.
Verwendung von (–)-(2S,4S)-1-(2-Hydroxymethyl-1,3-dioxolan-4-yl)-cytosin oder Salze davon, oder das (+) Enantiomer oder das racemische Gemisch davon, oder pharmazeutisch akzeptable Salze davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder zur Prophylaxe von Tumoren, einschließend krebsartige Tumore.