HUT77172A

HUT77172A - Rák kezelésére alkalmas citozinszármazékok, eljárás előállításukra és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények

Info

Publication number: HUT77172A
Application number: HU9701687A
Authority: HU
Inventors: Yung-Chi Cheng; Chung K. Chu
Original assignee: University Of Georgia Research Foundation Inc.; Yale University
Priority date: 1994-09-06
Filing date: 1995-09-05
Publication date: 1998-03-02
Also published as: MY121548A; AU704977B2; NO971015L; KR100374477B1; OA10473A; PL188359B1; CZ63397A3; NO971015D0; IS4434A; IS2011B; FI970918A; CN1251680C; US8076347B2; ES2219666T3; SK28197A3; DK0781136T3; JP3979662B2; DE69533066T2; CA2199117A1; CN1160351A

Description

R¹ és R² jelentése hidrogénatom, alkilcsoport, acilcsoport, monofoszfát, difoszfát vagy trifoszfát és sóik vagy a (+)-enantiomer vagy a racém elegy, és ezek fenti származékai és sói daganatok, például rákos daganatok vagy egyéb nemkívánatos vagy abnormális sejtburjánzással járó betegségek kezelésére vagy megelőzésére alkalmazhatók állatokban, beleértve az embert is. Ismertetik a fenti vegyületek előállítását is.

/ífm

Képviselő:

Danubia Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.

(T tv ~w'fiiáU}ea lhs _;

RÁK KEZELÉSÉRE ALKALMASVbGYÜLETEK^

Λ fii

UNIVERSITY OF GEORGIA RESEARCH FOUNDATION, INC.,

Athens, GA, US és

YALE UNIVERSITY, New Haven, CT, US

Feltalálók:

CHU Chung Κ., Athens, GA, US

CHENG Yung-Chi, Woodbridge, CT, US

A bejelentés napja: 1995. 09. 05.

Elsőbbségei: 1994. 09. 06. (08/301298) US

1995. 02. 17. (08/390633) US

A nemzetközi bejelentés száma: PCT/US95/11464 A nemzetközi közzététel száma: WO 96/07413

85335-8219 Sí

A találmány a (-)-(2S,4S)-l-[2-(hidroxi-metil)-l,3-dioxolán-4-il]-citozinra [a továbbiakban (-)-OddC-nek rövidítjük] és származékaira, valamint ezek alkalmazására vonatkozik rák kezelésére állatokban, beleértve az embert is.

A daganat a sejtek szabályozatlan, szervezetlen burjánzása. A daganat rosszindulatú, vagy rákos akkor, ha inváziós képességgel és az áttétel tulajdonságával rendelkezik. Inváziós képesség alatt a daganat azon képességét értjük, hogy képes bejutni a környező szövetekbe, áttörni a szövetek határát alkotó alapréteget, ezáltal gyakran képes bejutni a test keringési rendszerébe is. Áttétel alatt a daganat azon tulajdonságát értjük, hogy a test más területeire képes elvándorolni, és ezáltal az eredeti megjelenési helytől távol is kialakulnak a burjánzásos területek.

A rák napjainkban az Amerikai Egyesült Államokban a második leggyakoribb halálozási ok. Az Amerikai Egyesült Államokban több, mint 8 000 000 személyben diagnosztizáltak rákot eddig, és 1994-ben több, mint 1 208 000 új diagnózisra számítanak. Több, mint 500 000 ember hal meg évente rákban ebben az országban.

A rákot molekuláris szinten még nem teljesen értjük. Ismeretes, hogy ha a sejteket karcinogéneknek, például bizonyos vírusoknak, bizonyos vegyszereknek vagy sugárzásnak tesszük ki, ez olyan változásokhoz vezet a DNS-ben, amely egy „szuppresszív” gént inaktivál vagy egy „onkogént” aktivál. A szuppresszív gének növekedésszabályozó gének, amelyek a mutációt követően már nem képesek szabályozni a sejt szaporodását. Az onkogének eredetileg normális gének (amelyeket proonkogéneknek nevezünk) amelyek mutáció vagy az expresszió megvál-

tozása következtében transzformáló génekké válnak. A transzformáló gének termékei nem megfelelő sejtszaporodást okoznak. Több, mint 20 különböző normális celluláris gén válhat onkogénné genetikus változás révén. A transzformált sejtek a normális sejtektől több tekintetben is különböznek, többek között a sejt morfológiája, a sejtek közötti kölcsönhatások, a membrántartalom, a sejtváz-szerkezet, a protein-szekréció, a gén-expreszszió és a mortalitás tekintetében (a transzformált sejtek élettartama határozatlan).

A test különböző sejttípusainak mindegyike transzformálható jóindulatú vagy rosszindulatú daganatsejtté. A daganat leggyakoribb előfordulási helye a tüdő, ezután jön a bélrendszer, a mell, a prosztata, a húgyhólyag, a hasnyálmirigy, majd a petefészek. A rák egyéb gyakori fajtái közé tartozik a leukémia, a központi idegrendszeri rákok, például az agytumor, a melanoma, limfóma, eritroleukémia, a méhrák és a fej- és nyakrák.

A rákot jelenleg elsődlegesen az alábbi háromféle gyógymód egyikével, vagy ezek kombinációjával kezelik: sebészet, besugárzás és kemoterápia. A sebészeti beavatkozás során a beteg szövet fő tömegét eltávolítják. Noha a sebészeti beavatkozás gyakran hatékonyan alkalmazható bizonyos helyeken lokalizálódó daganatok eltávolítására, például a mell, a vastagbél vagy a bőr daganati esetén, nem alkalmazható egyéb területeken, például a gerincoszlopon lokalizálódó daganatok esetében, vagy a szóródott daganatos állapotok, például leukémia kezelésére.

A kemoterápia a sejt szaporodását vagy a sejt metabolizmusát teszi tönkre. Ezt leggyakrabban a leukémia, valamint a mell-, tüdő- és hererák kezelésére használják.

A rák kezelésére jelenleg alkalmazott kemoterápiás szereknek öt fő csoportja van: természetes termékek és ezek származékai; antraciklinek; alkilezőszerek; antiproliferatív szerek (amelyeket antimetabolitoknak is neveznek); és hormonális szerek. A kemoterápiás szereket gyakran daganatellenes szereknek is nevezik.

Az alkilezőszerek valószínűleg úgy fejtik ki hatásukat, hogy a DNS-ben lévő guanint és valószínűleg az egyéb bázisokat is alkilezik és keresztkötést alakítanak ki, ezáltal megakadályozzák a sejtosztódást. Jellegzetes alkilezőszerek például a nitrogénmustár, az etilén-imin-vegyületek, alkil-szulfátok, ciszplatin és a különféle nitrozó-karbamidok. Az ilyen vegyületek legnagyobb hátránya az, hogy nemcsak a rákos sejteket támadják meg, hanem a normálisan osztódó egyéb sejteket is, például a csontvelő, a bőr, a gyomor-bél-rendszeri nyálka és a magzati szövet sejtjeit.

Az antimetabolitok rendszerint reverzibilis vagy irreverzibilis enzim-inhibitorok, vagy olyan vegyületek, amelyek egyéb módon zavarják a nukleinsavak replikációját, transzlációját vagy transzkripcióját.

Számos szintetikus nukleozid ismert már, amely rákellenes aktivitást mutat. Egy jól ismert, erős rákellenes aktivitással rendelkező nukleozidszármazék az 5-fluor-uracil. Az 5-fluor-uracilt klinikailag is alkalmazták rosszindulatú daganatok, például karcinómák, szarkómák, bőrrák, emésztőszervi rák és mellrák kezelésére. Az 5-fluor-uracilnak azonban súlyos mellékhatásai vannak, például hányinger, hajhullás, hasmenés, szájgyulladás, leukocitás csökkent trombocitaszám, étvágytalanság, pigmentáció

- 5 és ödéma. Rákellenes aktivitással rendelkező 5-fluor-acil-származékokat ismertetnek például az US 4 336 381 számú szabadalmi leírásban és az 50-50383, 50-50384, 50-64281, 51-146482 és 53-84981 számon publikált japán szabadalmi leírásokban.

Az US 4 000 137 számú szabadalmi leírásból ismert, hogy az inozin, adenozin vagy citidin peroxidát oxidációs terméke metanollal vagy etanollal limfocitás leukémia elleni aktivitással rendelkezik.

A citozin-arabinozid (amelyet Cytarabinnak, araC-nek vagy Cytosarnak is neveznek) a dezoxicitidin nukleozidanalógja, amelyet először 1950-ben szintetizáltak és 1963-ban vezettek be a klinikai gyógyászatba. Ez jelenleg fontos gyógyszer az akut mieloid leukémia kezelésére. Ez a szer akut limfocitás leukémia ellen is hatásos, és kisebb mértékben krónikus mielocitás leukémia és nem-Hodgkin-féle limfóma ellen is alkalmazható. Az araC primer hatása a sejtmag DNS-szintézisnek gátlása [Handschumacher R. és Cheng Y.: Purine and Pyrimidine Antimetabolites, Cancer Medicine, XV-1. fejezet, 3. kiadás, szerk.: J. Holland és munkatársai, kiadó: Lea and Febigol].

Az 5-aza-citidin egy citidin-analóg, amelyet elsődlegesen akut mielocitás leukémia és mielodiszpláziás szindróma kezelésére alkalmaznak.

A 2-fluor-adenozin-5’-foszfát (Fludara, vagy F-araA-nak is nevezik) egyike a leghatékonyabb szereknek a krónikus limfocitás leukémia kezelésére. Ez a vegyület a DNS-szintézis gátlása révén fejti ki hatását. A sejtek F-araA-val való kezelése a sejtek Gl/S fázishatáron és S-fázisban való felszaporodásával jár; ezért ez a sejtciklus S-fázisára specifikus szer. Az aktív

- 6 metabolit, az F-araATP beépülése késlelteti a DNS lánchoszszabbodását. Az F-araA a ribonukleotid-reduktáz enzimnek is erős inhibitora, amely enzim kulcsszerepet játszik a dATP képződésében.

A 2-klór-dezoxiadenozin a kismértékű B-sejt daganatok, például krónikus limfocitás leukémia, nem-Hodgkins-féle limfóma és szőrös-sejt leukémia kezelésére alkalmazható. Az aktivitás spektruma hasonló a Fludaráéhoz. A vegyület szaporodó sejtekben a DNS-szintézist, és nyugvó sejtekben a DNS-javítást gátolja.

Annak ellenére, hogy számos kemoterápiás szert felismertek már és alkalmaznak jelenleg rák kezelésére, olyan új szerekre mindig szükség van, amelyek hatékonyak, és az egészséges sejtekkel szemben toxicitásuk alacsony.

A találmány egyik célja ezért olyan vegyületek felismerése volt, amelyek daganatellenes aktivitást, és különösen rákellenes aktivitást mutatnak.

A találmány másik célja gyógyászati készítmények előállítása volt, amelyek rák kezelésére alkalmasak.

A találmány szerinti készítmény, amely emberben és egyéb gazdaállatban daganatok, és különösen rák kezelésére alkalmas, a (-)-(2S,4S)-l-[2-(hidroxi-metil)-l,3-dioxolán-4-il]-citozin [rövidítve (-)-OddC, L-OddC, vagy (-)-L-OddC] vagy annak gyógyászatilag elfogadható származéka, például 5’- vagy N⁴-alkilezett vagy -acilezett származéka, vagy ezek gyógyászatilag elfogadható sója hatásos mennyiségét és kívánt esetben gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot tartalmaz.

A találmány szerinti vegyületek daganaton és rákon kívül

- 7 olyan állapotok kezelésére is alkalmazhatók, amelyek a sejtek abnormális vagy nem kívánatos burjánzásával járnak. Példaként említjük a különféle bőrbetegségeket, például a hiperkeratózist (beleértve a bőrpikkelyesedést, szaruszerű bőrt, sömört, planust és psoriasist), a szemölcsöket (például a genitális szemölcsöt) és hólyagokat, valamint a metotrexáttal kezelhető abnormális és nemkívánatos sejtburjánzásokat. A találmány szerinti hatóanyagok abortusz indukálására vagy megkönnyítésére is alkalmazhatók.

Egy előnyös kiviteli alakban a (-)-(2S,4S)-l-[2-(hidroxi-metil)-l,3-dioxolán-4-il]-citozint a megadott enantiomer formában (L-enantiomerként) tartalmazzák a készítmények, lényegében a megfelelő (+)-enantiomer nélkül (azaz enantiomer szempontból feldúsult vagy enantiomer szempontból tiszta formában).

Tudomásunk szerint a (-)-(2S,4S)-l-[2-(hidroxi-metil)-l,3-dioxolán-4-iI]-citozin az első olyan L-nukleozid, amely daganatellenes aktivitást mutat. A (-)-(2S,4S)-l-[2-(hidroxi-metil)-l,3-dioxolán-4-il]-citozin szerkezete az (I) képlettel írható le.

Felismertük, hogy a (-)-(2S,4S)-l-[2-(hidroxi-metil)-l,3-dioxolán-4-il]-citozin jelentős aktivitást mutat rákos sejtek ellen, ugyanakkor a gazdaszervezet egészséges sejtjeivel szemben toxicitása alacsony. A fenti vegyülettel kezelhető daganatokra példaként említhetjük a tüdő-, vastag- és végbél-, mell-, prosztata-, húgyhólyag-, orr-garat-, hasnyálmirigy-, petefészekrákot, leukémiát, limfómát, fej- és nyakrákot, központi idegrendszeri rákot (beleértve az agytumort), a méhnyakrákot, melanómát és a hepatocelluláris rákot.

Egy másik kiviteli alakban a találmány szerinti készítmény

• · · ····· ···· «······ · · daganatok és különösen rák, vagy egyéb, a sejtek abnormális vagy nem kívánatos burjánzásával járó betegségek kezelésére emberben vagy egyéb gazdaszervezetben, az L-OddC (II) általános képletű származékának - a képletben

R jelentése F, Cl, -CH₃, -C(H)=CH₂, -Br, -NO₂, -C=CH vagy -CsN és

R¹ jelentése hidrogénatom, alkilcsoport, acilcsoport, monofoszfát, difoszfát vagy trifoszfát vagy ezek gyógyászatilag elfogadható származékának gyógyászatilag hatásos mennyiségét tartalmazzák előnyösen enantiomer szempontból feldúsult formában, kívánt esetben gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal együtt.

Noha a találmány előnyös kiviteli alakjaiban a találmány szerinti hatóanyagokat, vagy azok származékait vagy sóit a nem természetes konfigurációban (azaz L-konfigurációban) alkalmazzuk, a fenti vegyületek, vagy ezek származékai vagy sói a természetben előforduló konfigurációban (azaz D-konfigurációban) vagy racém elegyként is alkalmazhatók.

Daganatok kezelésére, a terápia hatékonyságának növelése céljából a fenti vegyületek bármelyikét együtt vagy váltakozva adhatjuk egyéb daganatellenes gyógyászati szerekkel. Az egyéb daganatellenes szerekre példaként említhetjük a természetes termékeket és azok származékait; antraciklineket; alkilezőszereket; antiproliferatív szereket (másnéven antimetabolitokat); és a hormonális szereket. Fenti szerek közé tartozik például a nitrogénmustár, az etilén-imin-vegyületek, alkil-szulfátok, ciszplatin, nitrozó-karbamidok, 5-fluor-uracil, citozin, arabinozidok, 5-aza-citidin, 2-fluor-adenozin-5’-foszfát, 2-klór-dezoxiadenozin,

- 9 ·· · • · · · · • · · « tamoxifen, aktinomicin, amszakrin, bleomicin, karboplatin, karmusztin, ciklofoszfamid, ciklosporin, daunorubicin, doxirubicin, interleukin, lomusztin, merkaptopurin, metotrexát, mitomicin, tioguanin, vinblasztin, növekedési faktorok, például GCSF, GMCSF, és vérlemezke növekedési faktorok; adriamicin, WP16, hidroxi-karbamid, etopozid; α-, β- és ς-interferonok és vinkrisztin. A fenti szerek hatásos mennyiségeit könnyen meghatározhatjuk, vagy azokat az alábbi irodalmi helyeken találhatjuk: The Physician’s Desk Reference, legfrissebb kiadás, kiadó: a Medical Economics Data Production Company; és Martindalé: The Extra Pharmacopoeia, legfrissebb kiadás, kiadó: The Pharmaceutical Press. Ezeket a módszereket rutinszerűen módosíthatjuk a kombinációs vagy alternatív terápia hatékonyságának optimalizálára.

Az ábrákat röviden alább ismertetjük.

Az 1. ábra mutatja a (-)-OddC és a (-)-OddC + THU (tetrahidrouridin, egy citidin-dezamináz inhibitor) kombináció ID₅₀értékeit vastagbélrák-sejteken. A grafikonon a szaporodás gátlását a kontroll szaporodásának százalékaként a koncentráció függvényében ábrázoltuk (gmol/l). A grafikonon a csak (-)-OddC-vel kapott értékeket · és a (-)-OddC + THU kombinációval kapott értékeket ▲ jelzi.

A 2. ábra mutatja a tumor tömegének növekedését az idő függvényében egér-karcinóma sejtek (vastagbél 38) esetén, (-)-OddC-vel naponta kétszer 25 mg/kg dózissal végzett kezeléssel. A grafikonon a tumor növekedését a kezdeti tumortömeg százalékában fejeztük ki a napok függvényében. Az egereket az 1., 2.,

3., 4. és 5. napon kezeltük. A grafikon adataiban a kontroll [(-)- 10 -OddC nélkül] kapott értékeket ·, míg a (-)-OddC-vel kapott adatokat Á jelzi.

A 3. ábrán mutatjuk be a P388 leukémiás egerek túlélési arányát (-)-OddC-vel végzett kezelés esetén. A grafikonon a százalékos túlélést a napok függvényében ábrázoltuk. Az egereket az 1., 2., 3., 4. és 5. napon kezeltük. A grafikonon a kontroll túlélési arányát [(-)-OddC nélkül] ·, míg a naponta kétszer 25 mg/kg dózissal kezelt egerek túlélési arányát Δ, a naponta egyszer 50 mg/kg dózissal kezelt egerek túlélési arányát O jelenti.

A 4. ábra mutatja bizonyos rákos sejtvonalak relatív érzékenységét (-)-OddC-vel szemben GI50-ben kifejezve. A jobbra nyúló vonalak az adott sejtvonalnak az összes vizsgált sejtvonal átlagos érzékenységét meghaladó érzékenységét jelentik (-)-OddC-vel szemben. Mivel a vonalskála logaritmikus, a jobbra két egységgel kinyúló vonal azt jelenti, hogy a vegyület GI50 értéke az adott sejtvonalra 1/100 része az összes sejtvonal esetén szükséges átlagos koncentrációnak, vagyis a sejtvonal rendkívül érzékeny (-)-OddC-re. A balra nyúló vonalak ennek megfelelően az átlagosnál kisebb érzékenységet jelentenek.

Az 5. ábra grafikusan mutatja a humán tumor növekedésének gátlását (-)-OddC-vel. A 3-6 hetes NCr csupasz egereket szubkután módon minden egyes vizsgálat-sorozatban 2 χ 10⁶HepG2 vagy DU-145 sejttel inokuláltunk. A kezelést akkor kezdtük, amikor a daganatok előrehaladott állapotban voltak. A szereket naponta kétszer adtuk a O-tól a 4. napig, és a daganat méretét a megjelölt napokon mértük. Az A görbe a szer hatását HepG2 daganatra, míg a B görbe a szer hatását DU-145 daganat- 11 ra mutatja, a kontroll értékeket O, az AraC-vel 25 mg/kg dózisban i.p. végzett kezeléssel kapott értékeket ·, a (-)-OddC-vel 25 mg/kg dózisban p.o. kezeléssel kapott értékeket □, a (-)-OddC-vel 25 mg/kg dózisban i.p. végzett kezelés esetén kapott értékeket jelenti. Az egyes adatok az átlagérték ± SD-t jelentik 10 tumorra az A görbén, és 6 tumorra a B görbén.

A találmányt részletesen az alábbiakban ismertetjük.

A találmány tárgya készítmény daganatok, különösen rák kezelésére emberben vagy egyéb gazdaállatban, amely a (-)-(2S,4S)-l-[2-(hidroxi-metil)-l,3-dioxolán-4-il]-citozin, ennek egy alább meghatározott származéka, például 5-szubsztituált vagy 5’- vagy N⁴-alkilezett vagy -acilezett származéka, vagy ezek valamely fiziológiásán elfogadható sója hatásos mennyiségét tartalmazza kívánt esetben egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal.

A (-)-(2 S,4S)-1 -[2-(hidroxi-metil)-l ,3-dioxolán-4-il]-citozint a továbbiakban L-nukleozidnak nevezzük. Mivel a dioxolángyűrű 2-es és 5-ös szénatomja királis, ezek nem hidrogénatom szubsztituensei (CH₂OH és a citozin bázis) vagy cisz (azonos oldalon), vagy transz (ellenkező oldalon) helyzetben lehetnek a dioxolángyűrűhöz viszonyítva. A négy optikai izomert ezért az alábbi konfigurációk képviselik (ha a dioxolán-maradékot horizontális síkban helyezzük el, úgy, hogy a 3-as helyzetű oxigénatom van elől): cisz (mindkét csoport felfelé néz, amely a természetben előforduló nukleozidok konfigurációjának felel meg, amelyet D-nukleozidnak nevezünk), cisz (mindkét csoport lefelé néz, amely a nem természetben előforduló konfigurációnak felel meg, amelyet L-nukleozidnak nevezünk), transz (a C2-es helyzetű szubsztituens felfelé és a C5-ös helyzetű szubsztituens lefelé helyezkedik el), és transz (a C2-es helyzetű szubsztituens lefelé és a C5-ös helyzetű szubsztituens felfelé helyezkedik el). Úgy gondoljuk, hogy a (-)-(2S,4S)-l-[2-(hidroxi-metil)-l,3-dioxolán-4-il]-citozin vagy ennek valamely származéka az első példa olyan L-nukleozidra, amely daganatellenes aktivitást mutat. Ez meglepő annak tükrében, hogy az L-nukleozid konfiguráció a természetben nem fordul elő.

Enantiomer szempontból feldúsult alatt a leírásban olyan nukleozidösszetételt értünk, amely legalább 95%, előnyösen közelítőleg 97%, 98%, 99% vagy 100% mennyiségben tartalmazza az adott nukleozid egyik enantiomerjét. Egy előnyös kiviteli alakban a (-)-(2S,4S)-l-[2-(hidroxi-metil)-l,3-dioxolán-4-il]-citozint vagy ennek származékát vagy sóját egy olyan nukleozidkompozíció formájában állítjuk elő, amely alapvetően egyetlen enantiomert tartalmaz, azaz a fent megnevezett enantiomert (az L-enantiomert) és a megfelelő D-enantiomer lényegében hiányzik (azaz a vegyület az egyik enantiomerben feldúsult, illetve enantiomer szempontból tiszta formában van).

A hatóanyagot minden olyan származéka formájában adagolhatjuk, amelyből a beadagolás után közvetlenül vagy közvetett módon a (-)-L-OddC alapvegyület vagy annak egy alább definiált 5-szubsztituált származéka keletkezhet, vagy amely maga is aktivitást mutat. Példaként említjük - a korlátozás szándéka nélkül - a (-)-OddC-t, annak fent említett 5-ös helyzetű származékait és 5’- és N⁴-acilezett vagy -alkilezett származékait (amelyeket fiziológiásán aktív származékoknak is nevezünk), gyógyászatilag elfogadható sóikat (amelyeket gyógyászatilag elfőgadható sóknak is nevezünk). Egy kiviteli alakban az acilcsoport egy karbonsav-észter [-C(O)R], amelyben az észtercsoport nem-karbonil maradéka egyenes vagy elágazó szénláncú, vagy gyűrűs alkilcsoport (rendszerint 1-18 szénatomos, még gyakrabban 1-5 szénatomos), alkarilcsoport, alkoxi-alkil-csoport, például metoxi-metil-csoport, aralkilcsoport, például benzilcsoport, alkilcsoport vagy 1-4 szénatomos alkoxicsoport; szulfonát-észter, például alkil- vagy aralkil-szulfonil-csoport, például metánszulfonilcsoport; mono-, di- vagy trifoszfát-észter; tritil- vagy monometoxi-tritil-csoport, szubsztituált benzilcsoport, trialkil-szilil-csoport (például dimetil-terc-butil-szilil-csoport) vagy difenil-metil-szilil-csoport. Az észterekben az arilcsoport előnyösen fenilcsoportot tartalmaz.

Az L-OddC gyógyászatilag elfogadható származékainak specifikus példájaként említjük a (III) általános képletű vegyületeket, a képletben

R jelentése F, Cl, -CH₃, -C(H)=CH₂, -C=CH vagy -CsN,

-Br, -NO₂ és

Rj és R₂ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, alkilcsoport vagy acilcsoport, közelebbről metil-, etil-, propil-, butil-, pentil-, hexil-, izopropil-, izobutil-, szek-butil-, terc-butil-, izopentil-, amil-, terc-pentil-, 3-metil-butiril-, hidrogén-szukcinát-, 3-klór-benzoát-, ciklopentil-, ciklohexil-, benzoil-, acetil-, pivaloil-, mezilát, propionil-, butiril-, valeril-, kaproil-, kapriloil-, kaprinoil-, lauroil-, mirisztoil-, palmitoil-, sztearoil-, oleoilcsoport, aminosav-maradékok, például alanil-, valil-, leucil-, izoleucil-, prolii-, fenil-alanil-, triptofanil-, meti- 14 • · · « · • ···« onil-, glicil-, szeril-, treonil-, ciszteinil-, tirozil-, aszparagil-, glutamil-, aszpartoil-, glutaoil-, lizil-, arginilvagy hisztidil-maradék.

Az előnyös kiviteli alakban a származék L-enantiomer formában van, lényegében a megfelelő D-enantiomer nélkül (azaz enantiomer szempontból feldúsult, illetve enantiomer szempontból tiszta formában).

Az L-OddC-t és származékai gyógyászatilag elfogadható só formájában is lehetnek. A leírásban gyógyászatilag elfogadható sók vagy komplexek alatt az L-OddC vagy származékai olyan sóit vagy komplexeit értjük, amelyek az alapvegyület kívánt biológiai aktivitását megtartják, és minimális nem kívánatos toxikológiai hatást mutatnak vagy egyáltalán nem mutatnak ilyen hatást. A fenti sókra példaként említhetjük:

a) a szervetlen savakkal (például sósavval, hidrogén-bromiddal, kénsavval, foszforsavval, salétromsavval és hasonlóval) képzett savaddíciós sókat, és a szerves savakkal (például ecetsavval, oxálsavval, borkősavval, borostyánkősavval, almasavval, aszkorbinsavval, benzoesavval, tanninsavval, pamoasavval, alginsavval, poliglutaminsavval, naftalinszulfonsavval, naftalindiszulfonsavakkal, poligalakturonsavval) képzett sókat;

b) a többértékű fém-kationokkal (például cinkkel, kalciummal, bizmuttal, báriummal, magnéziummal, alumíniummal, rézzel, kobalttal, nikkellel, kadmiummal, nátriummal, káliummal és hasonlóval) vagy az Ν,Ν-dibenzil-etilén-diaminból, ammóniumból vagy etilén-diaminból származó szerves kationokkal képzett bázisaddiciós sókat; vagy

c) az a) és b) kombinációit, például a cink-tannát-sót és hason- 15 ·^:lót.

A hatóanyag módosításai, különösen az N⁴- és 5’-O-helyzetben megváltoztathatják a hatóanyag oldhatóságát, biológiai hozzáférhetőségét és a metabolizmus sebességét, ezáltal a hatóanyag szabályozott bejuttatására alkalmasak. Ezenkívül a módosítások a vegyület rákellenes aktivitását is befolyásolhatják, bizonyos esetekben növelik az aktivitást az alapvegyülethez képest. Ezt könnyen kimutathatjuk úgy, hogy előállítjuk a származékot, és a leírásban ismertetett eljárások szerint, vagy más ismert eljárásokkal meghatározzuk annak rákellenes aktivitását.

Összefoglalóan, a találmány tárgyát az alábbiak képezik:

a) (-)-(2S,4S)-l-[2-(hidroxi-metil)-l,3-dioxolán-4-il]-citozin és származékai és sói;

b) (+)-(2S,4S)-l-[2-(hidroxi-metil)-l ,3-dioxolán-4-il]-citozin és származékai és sói;

c) (-/+)-(2 S,4S)-l-[2-(hidroxi-metil)-l, 3-dioxolán-4-il]-citozin és számazékai és sói;

d) (-)-(2S,4S)-l-[2-(hidroxi-metil)-l,3-dioxolán-4-il]-citozin és származékai és sói, vagy a (+)-enantiomer, vagy a racém elegye, és gyógyászatilag elfogadható származékaik és sóik gyógyszerként! alkalmazásra, például daganatok kezelésére vagy megelőzésére, beleértve a rákos daganatokat is;

e) (-)-(2S,4S)-l-[2-(hidroxi-metil)-l,3-dioxolán-4-il]-citozin és gyógyászatilag elfogadható származékai és sói, vagy a (+)-enantiomer, vagy a racém elegye, és gyógyászatilag elfogadható származékaik és sóik alkalmazása gyógyszer előállítására daganatok kezelésére, beleértve a rákos daganatokat is;

f) gyógyászati készítmények, amelyek (-)-(2S,4S)-l-[2-(hidroxi-metil)-l,3-dioxolán-4-il]-citozint vagy gyógyászatilag elfogadható származékait vagy sóit, vagy a (+)-enantiomert vagy a racém elegyet, vagy gyógyászatilag elfogadható származékaikat vagy sóikat tartalmazzák egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal;

g) eljárás (2S,4S)-l-[2-(hidroxi-metil)-l,3-dioxolán-4-il]-citozin előállítására, oly módon, hogy

i) az adott esetben védett citozint egy (A) általános képletű 1,3-dioxolánnal - a képletben

R_la jelentése hidrogénatom vagy hidroxil-védőcsoport, például egy acilcsoport, és

L jelentése kilépő csoport reagáltatjuk, és az adott esetben jelenlévő hidroxil-védőcsoportot adott esetben eltávolítjuk; vagy ii) egy (B) általános képletű vegyületet - a képletben R_la jelentése a fent megadott az uracilgyűrű 4-es helyzetben lévő oxocsoportját aminocsoporttá alakítani képes reaktánssal reagáltatunk, és az adott esetben jelenlévő védőcsoportokat eltávolítjuk;

h) eljárás a (2S,4S)-l-[2-(hidroxi-metil)-l,3-dioxolán-4-il]-citozin (-)- vagy (+)-enantiomerjének előállítására, oly módon, hogy a (-)- és (+)-enantiomerek elegye formájában lévő vegyületet vagy annak származékát (például 5’-észterét) az enantiomerek szétválasztása céljából megfelelő körülmények közé helyezzük, vagy egy reaktánssal (például megfelelő enzimmel) reagáltatjuk, és kívánt esetben a kapott származékot az alapvegyületté alakítjuk. Alternatív megoldásként az elegyet az ilyen típusú enantiomerek szétválasztására alkalmas királis folyadékkromatográfiás oszlopon is átvezethetjük;

i) eljárás (2S,4S)-l-[2-(hidroxi-metil)-l,3-dioxolán-4-il]-citozin előállítására, oly módon, hogy egy (D) általános képletű védett 1,3-dioxolánt egy adott esetben 5-ös helyzetben szubsztituált védett citozin-bázissal reagáltatunk Lewis-sav alkalmazásával, amely a terméket nem racemizálja, ilyen például a trimetil-szilil-triflát.

A g) eljárás i) lépésében a hidroxil-védőcsoport egy alább részletesen ismertetett védőcsoport lehet, például egy acilcsoport (így például acetilcsoport) aril-acil-csoport (például benzoilcsoport vagy szubsztituált benzoilcsoport), tritilcsoport vagy monometoxi-tritil-csoport, benzilcsoport vagy szubsztituált benzilcsoport, triszubsztituált szililcsoport [például trialkil-szililcsoport, így például dimetil-(terc-butil)-szilil-csoport vagy difenil-metil-szilil-csoport]. A citozinvegyületet adott esetben triszubsztituált szililcsoportokkal védhetjük. A védőcsoportokat szokásos módon távolíthatjuk el. Az L kilépő csoport egy, a nukleozidkémiában szokásosan alkalmazott kilépő csoport, például halogénatom, így például klóratom, fluoratom, tozilcsoport, mezilcsoport, triflátcsoport vagy brómatom, alkoxicsoport, például metoxi- vagy etoxicsoport, vagy acilcsoport, például acetilvagy benzoilcsoport lehet.

A g) eljárás i) lépését szerves oldószerben, például 1,2-diklór-etánban vagy acetonitrilben játszathatjuk le Lewis-sav, például SnCl₄, titán-klorid vagy trimetí 1-szilil-triflát jelenlétében.

Az (A) általános képletű vegyületeket - amelyekben L jelentése acilcsoport, például acetilcsoport - úgy állíthatjuk elő, hogy egy (C) általános képletű vegyületet - a képletben

Λ · · ····· » · · · ···· lg ·_·...........

R_la jelentése a fent megadott redukálószerrel, például lítium-alumínium-hidriddel reagáltatunk, majd a kívánt köztiterméktől függően szokásos reagenssel, például acilezés céljából karbonsavanhidriddel, például ecetsavanhidriddel, vagy halogénezés céljából klórozószerrel vagy brómozószerrel, vagy egy alkilezőszerrel reagáltatjuk.

A (C) általános képletű vegyületeket úgy állíthatjuk elő, hogy egy (E) általános képletű vegyületet HOCH₂CO₂H képletű vegyülettel reagáltatunk magasabb hőmérsékleten.

Az (E) általános képletű vegyületeket egy CH₂=CH-CH₂-OR általános képletű allil-éter vagy -észter vagy egy ROCH₂-CH=CH-CH₂OR általános képletű 2-butén-l,3-diol-diéter vagy -diészter - a képletekben

R jelentése védőcsoport, például egy alkilcsoport, szililcsoport vagy acilcsoport ozonolízisével állíthatjuk elő.

A g) eljárás ii) lépését tekintve a (C) általános képletű vegyületet 1,2,4-triazollal kezelhetjük 4-klór-fenil-diklór-foszfát jelenlétében, így megfelelő 4-(l,2,4-triazoloil)-vegyületet kapunk, amelyet azután például metanollal reagáltatva alakítunk a kívánt 4-amino (citidin)-vegyületté.

A (B) és (C) általános képletű kiindulási anyagokat például úgy ámíthatjuk elő, hogy egy megfelelő (adott esetben védett) bázist egy (A) általános képletű vegyülettel reagáltatunk a g) eljárás i) lépésében leírtakkal analóg módon. Az uracil és citozin kereskedelmi forgalomban kapható (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI 53233, USA).

Az L-OddC-t vagy származékait gyógyászatilag elfogadható észterré alakíthatjuk oly módon, hogy egy megfelelő észterezőszerrel, például savhalogeniddel vagy -anhidriddel reagáltatjuk. Az L-OddC-t és gyógyászatilag elfogadható származékait gyógyászatilag elfogadható sóvá alakíthatjuk szokásos módon, például megfelelő bázissal végzett kezeléssel. Az észtert vagy sót például hidrolízissel alakíthatjuk az alapvegyületté.

A találmány szerinti vegyületek daganatoktól vagy ráktól eltérő állapotok kezelésére is alkalmazhatók, amelyek a sejtek abnormális vagy nem kívánatos burjánzásával függnek össze. Példaként említhetjük a bőrbetegségeket, például a hiperkeratózist (beleértve a bőrpikkelyesedést, szaruszerű bőrt, sömört, planust és psoriasist), a szemölcsöket (például a genitális szemölcsöket) és a hólyagokat, valamint bármely abnormális sejtburjánzást, amely metotrexáttal kezelhető. A találmány szerinti vegyületek abortusz indukálására vagy megkönnyítésére is alkalmazhatók.

Ennek megfelelően a (-)-(2S,4S)-l-[2-(hidroxi-metil)-l,3dioxolán-4-il]-citozin és származékai és sói, vagy a (+)-enantiomer, vagy a racém elegy és gyógyászatilag elfogadható származékaik és sóik a gyógyászatban például abnormális és nem kívánatos sejtburjánzás kezelésére vagy megelőzésére alkalmazhatók; a találmány tárgyát képezi továbbá a (-)-(2S,4S)-l-[2-(hidroxi-metil)-l,3-dioxolán-4-il]-citozin és gyógyászatilag elfogadható származékai és sói, vagy a (+)-enantiomer vagy a racém elegy, és a gyógyászatilag elfogadható származékaik és sóik alkalmazása gyógyszerek előállítására a sejtek nemkívánatos vagy abnormális burjánzásának kezelésére.

A (-)-L-OddC és származékai a fentiek szerint, a WO

92/18517 számon publikált nemzetközi szabadalmi leírásban ismertetett módon (közzétéve 1992. október 29-én), az alábbiakban ismertetett 1. reakcióvázlatban és az 1-7. példákban ismertetett eljárással vagy bármely, a szakemberek számára ismert módon előállíthatok. Ezek a módszerek, valamint az egyéb eljárások is adaptálhatók az L-OddC példaszerűen bemutatott származékainak előállítására.

1. példa (-)-OddC (11) eló'állítása (1. reakcióvázlat)

A 6-anhidro-L-gulózt L-gulózból állítjuk elő egy lépésben oly módon, hogy az L-gulózt egy savval, például 0,5 n sósavval kezeljük, a hozam 60% [Evans M.E. és munkatársai, Carbohydr. Rés. 28, 359 (1973)]. Szelektív védelem nélkül - ahogy azt Jeong L. S. és munkatársai [Tetrahedron Lett. 33, 595 (1992)] és Beach J. W. és munkatársai [J. Org. Chem. (1992)] korábban végezték - a (2) képletű vegyületet nátrium-jodáttal végzett oxidációval, majd nátrium-bór-hidriddel végzett redukcióval közvetlenül (3) képletű dioxolán-triollá alakítjuk, amelyet izolálás nélkül (4) képletű izopropilidén-származékká alakítunk. A terméket benzoilezéssel (5) képletű vegyületté, a védőcsoport eltávolításával (6) képletű vegyületté alakítjuk, majd a (6) képletű dióit (7) képletű savvá oxidáljuk. A (7) képletű vegyületet Pb(OAc)₄-gyel oxidatív dekarboxilezésnek vetjük alá vízmentes tetrahidrofuránban, így kapjuk a (8) képletű acetátot, mint kulcs intermediert jó hozammal. Az acetátot a kívánt pirimidinekkel, például szililezett timinnel és N-acetil-citozinnal kondenzáljuk TMSOTf jelenlétében, így α,β-elegyet kapunk, amelyet szilikagél oszlopon szétválasztva kapjuk a (9) és (10) képletű egyes izomereket. Metanolos ammóniával végzett debenzoilezéssel kapjuk a kívánt (11) képletű (-)-OddC-t.

2. példa (-)-l,6-Anhidro-a-L-gulopiranóz (2) előállítása g (0,127 mól) L-gulóz (1) és 330 ml (0,165 mól) 0,5 n sósav elegyét 20 órán keresztül visszafolyató hűtő alatt forraljuk. Az elegyet lehűtjük, és gyantával (Dowex-2, HCO₃-forma) pH 6 értékre semlegesítjük levegő átbuborékoltatása közben. A gyantát 10%-os sósavval, vízzel, metanollal, vízzel és telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal mosva regeneráljuk. A reakcióelegyet szűrjük, és a gyantát 500 ml vízzel mossuk. Az egyesített szűrleteket szárazra pároljuk, és vákuumban egy éjszakán keresztül szárítjuk. A maradékot 5 cm vastagságú szilikagél oszlopon tisztítjuk, az eluálást 10/1 arányú kloroform/metanol eleggyel végezzük. Enyhén sárga színű, szilárd anyagot kapunk, amelyet abszolút alkoholból átkristályosítunk. Cím szerinti (2) vegyületet kapunk színtelen, szilárd anyag formájában.

R_f = 0,43 (kloroform/metanol = 5/1);

Hozam: 7,3 g (35,52%).

A kapott 11 g L-gulózt (R_f = 0,07) a reakcióba visszavezetve (2) képletű vegyületté alakítjuk, így további 5 g cím szerinti vegyületet kapunk, az összhozam 60%.

Olvadáspont: 142,5 - 145 °C;

‘η-NMR (DMSO-d₆) δ: 3,22-3,68 (m, 4H, H-2, -3, -4- és -6a),

3,83 (d, J_{6b 6a} = 7,25 Hz, 1H, H_b-6), 4,22 (pszeudo t, J_{5 6a} = = 4,61 és 4,18 Hz, Η, H-5), 4,46 (d, J₂._OH2 = 6,59 Hz, 1H,

2- OH, D₂O-val kicserélhető), 4,62 (d, J₃._{0H 3} ^{= 5},28 Hz, 1H,

3- OH, D₂O-val kicserélhető), 5,07 (d, J₄._{0H 4} ⁼ 4,84 Hz, 1H,

4-OH, D₂O-val kicserélhető), 5,20 (d, J_l>2 = 2,19 Hz, 1H, H-l).

[a]_D ²⁵ = -50,01 1 (c=l,61, CH₃OH).

3. példa (-)-(l’S,2S,4S)-4-[l,2-(Izopropilidén-dioxi)-etil]-2-(hidroxi-metil)-l,3-dioxolán (4) előállítása

22,36 g (0,1 mól) NaIO₄ 300 ml vízzel készült oldatát cseppenként, 10 perc alatt hozzáadjuk 11,3 g (0,07 mól) (2) vegyület 350 ml metanollal készült, 0 °C-ra hűtött oldatához. A reakcióelegyet mechanikus keverővei 15 percen keresztül keverjük. Az elegyhez 7,91 g (0,21 mól) NaBH₄-et adunk, és a reakcióelegyet 0 °C-on 10 percen keresztül keverjük. A fehér, szilárd anyagot leszűrjük, és a szilárd anyagot 300 ml metanollal mossuk. Az egyesített szűrleteket körülbelül 200 ml 0,5 n sósavval semlegesítjük, és szárazra pároljuk. A maradékot vákuumban egy éjszakán keresztül szárítjuk. A szirupos maradékot 1200 ml 1/5 arányú metanol/aceton eleggyel eldörzsöljük mechanikus keverő alkalmazásával 5 órán keresztül, és a fehér, szilárd anyagot leszűrjük (1. hozadék). A szűrletet szárazra pároljuk, és a maradékot 500 ml acetonban oldjuk, majd hozzáadunk 6,63 g (0,035 mól) p-toluolszulfonsavat. Az elegyet 6 órán keresztül keverjük, majd trietil-aminnal semlegesítjük, a szilárd anyagot (2. hozadék) leszűrjük, és szűrletet szárazra pároljuk. A maradékot 350 ml etil-acetátban oldjuk, kétszer 50 ml vízzel mossuk, vízmentes magnézium-szulfát felett szárítjuk, szűrjük, és bepároljuk. 3,6 g cím szerinti nyersterméket (4) kapunk sárgás szirup formájában. A vizes fázist szárazra pároljuk, és vákuumban szárítjuk. A kapott szilárd anyagokat (1. és 2. hozadék) a szárított vizes fázis- 23 sál egyesítjük, és a rendszerbe visszavezetjük, 900 ml 10% metanolt tartalmazó acetonnal és 16 g (0,084 mól) p-toluolszulfonsavval 1 órán keresztül keverjük, így 5,6 g cím szerinti nyersterméket (4) kapunk. A nyersterméket (4) száraz szilikagél oszlopon tisztítjuk (metanol - kloroform, l%-5%), 8,8 g (61,84%) cím szerinti (4) vegyületet kapunk színtelen olaj formájában.

R_f = 0,82 (kloroform/metanol = 10/1).

'Η-NMR (DMSO-d₆) δ: 1,26 és 1,32 (2 x s, 2 χ 3H, izopropilidén), 3,41 (dd, Jch2OH,oh ⁼ 6,04 Hz, Jch20h,2 ⁼ 3,96 Hz, 2H, CH2OH), 3,56-4,16 (m, 6H, H-4, -5, -1’ és -2’), 4,82 (t, ^joh,ch2 = Hz, 1H, CH2OH, D₂O-val kicserélhető), 4,85 0» ^20Η,<3Η20Η ⁼ 3,96 Hz, 1H, H-2).

[a]_D ²⁵ = -12,48 (c=l,ll, CHC1₃).

Elemanalízis eredmények a C₉H₁₆O₅ összegképlet alapján: számított: C = 52,93%, H = 7,90%;

talált: C = 52,95%, H = 7,86%.

4. példa (+)-(1 ’S,2S, 4S)-4-[l, 2-(Izopropilidén-dioxi)-etil]-2-(benzoil-oxi-mctil)-1,3-dioxoIán (5) előállítása

6,5 ml (0,056 mól) benzoil-kloridot adunk cseppenként 8,5 g (0,042 mól) (4) vegyület 120 ml 1:2 arányú piridin/diklór-metán eleggyel készült oldatához 0 °C-on, és a hőmérsékletet szobahőmérsékletre emeljük. A reakcióelegyet 2 órán keresztül keverjük, majd 10 ml metanol hozzáadásával a reakciót leállítjuk, és az elegyet vákuumban szárazra koncentráljuk. A maradékot 300 ml diklór-metánban oldjuk, kétszer 100 ml vízzel, majd sóoldattal mossuk, vízmentes magnézium-szulfát felett szárítjuk, szűrjük, és bepároljuk. Maradékként sárgás szirupot kapunk, amelyet

szilikagélen oszlopkromatográfiásan tisztítunk, az eluálást etil-acetát - hexán 4% - 30% eleggyel végezzük. 10,7 g (83,4%) cím szerinti (5) vegyületet kapunk színtelen olaj formájában.

R_f = 0,45 (hexán/etil-acetát = 3:1).

’H-NMR (CDC1₃) δ: 1,35 és 1,44 (2 x s, 2 x 3H, izopropilidén),

3,3-4,35 (m, 6H, H-4, -5, -1’ és -2’), 4,44 (d, J=3,96 Hz, 2H,

CH₂-OBz), 5,29 (t, J=3,74 Hz, 1H, H-2), 7,3-7,64, 8,02-8,18 (m, 3H, 2H, -OBz).

[a]_D ²⁵ = +10,73 (c=l,75, CH₃OH).

Elemanalízis eredmények a 0₁₆Η₂οθ6 összegképlet alapján: számított: C = 62,33%, H = 6,54%;

talált: C = 62,39%, H = 6,54%.

5. példa (+)-(1’S,2S,4S)-4-(l,2-Dihidroxi-etil)-2-(benzoil-oxi-metil)-l,3-dioxolán (6) előállítása

5,7 g (0,018 mól) (5) vegyület és 1,05 g (0,0055 mól) p-toluolszulfonsav elegyét 70 ml metanolban szobahőmérsékleten 2 órán keresztül keverjük. A reakció nem teljes, ezért az oldószert az eredeti térfogat felére bepároljuk, és újabb 50 ml metanolt és 0,7 g (3,68 mmol) p-toluolszulfonsavat adunk az elegyhez. A reakcióelegyet 1 órán keresztül keverjük, majd trietil-aminnal semlegesítjük, és oldószertől szárazra pároljuk.

A maradékot szilikagélen, oszlopkromatográfiásan tisztítjuk (hexán/etil-acetát 10% - 33%). 4,92 g (99,2%) cím szerinti (6) vegyületet kapunk színtelen szirup formájában.

Rf = 0,15 (hexán/etil-acetát = 1:1).

‘η-NMR (DMSO-d₆) δ: 3,43 (m, 2H, H-2’), 3,67-4,1 (m, 4H, H4, -5 és -1’), 4,32 (d, J=3,73 Hz, 2H, CH₂-OBz), 4,60 (t,

J=5,72 Hz, 2’-0H, D₂O-val kicserélhető), 5,23 (t, J-3,96

Hz, 1H, H-2), 7,45-7,7, 7,93-8,04 (m, 3H, 2H, -OBz).

[a]_D ²⁵ = +9,16 (c=l,01, CHC1₃).

Elemanalízis eredmények a C₁₃H₁₆O₆ összegképlet alapján: számított: C = 58,20%, H = 6,01%; talált: C = 58,02%, H = 6,04%.

6. példa (-)-(2S,4S) és (2S,4R)-4-Acetoxi-2-(benzoil-oxi-metil)-1,3-dioxolán (8) előállítása

10,18 g (0,048 mól) nátrium-perjodát 120 ml vízzel készült oldatát 3,04 g (0,011 mól) (6) vegyület 160 ml 1:1 arányú szén-tetraklorid/acetonitril eleggyel készült oldatához adjuk, majd hozzáadunk 0,02 g RuO₂-hidrátot. A reakcióelegyet 5 órán keresztül keverjük, a szilárd anyagot celiten átszűrve eltávolítjuk, és a szűrletet eredeti térfogatának egyharmadára bepároljuk. A maradékot 100 ml diklór-metánban oldjuk, és a vizes fázist kétszer 100 ml diklór-metánnal extraháljuk. Az egyesített szerves fázisokat 50 ml sóoldattal mossuk, vízmentes magnézium-szulfát felett szárítjuk, szűrjük, és szárazra pároljuk, majd vákuumban 16 órán keresztül szárítjuk. 2,6 g (91%) (7) vegyületet kapunk nyerstermékként.

2,6 g (0,01 mól) (7) nyerstermék 60 ml vízmentes tetrahidrofuránnal készült oldatához 5,48 g (0,0124 mól) Pb(OAc)₄-et és 0,83 ml (0,0103 mól) piridint adunk nitrogénatmoszférában. A reakcióelegyet 45 percen keresztül keverjük nitrogén alatt, majd a szilárd anyagot szűréssel eltávolítjuk. A szilárd anyagot 60 ml etil-acetáttal mossuk, és az egyesített szerves fázisokat szárazra pároljuk. A maradékot szilikagélen oszlopkromatográfiásan tisz-

títjuk, az eluálást 2:1 arányú hexán/etil-acetát eleggyel végezzük. 1,9 g (69,34%) cím szerinti (8) vegyületet kapunk színtelen olaj formájában.

R_f = 0,73 és 0,79 (hexán/etil-acetát = 2:1).

’H-NMR (CDC1₃) 8: 1,998, 2,11 (2 x s, 3H, -OAc), 3,93-4,33 (m, 2H, H-5), 4,43, 4,48 (2 x d, J=3,73, 3,74 Hz, 2H,

CH₂OBz), 5,46, 5,55 (2 x t, J=4,18, 3,63 Hz, 1H, H-2), 6,42 (m, 1H, H-4), 7,33-7,59, 8,00-8,15 (m, 3H, 2H, -OBz).

[a]_D ²⁵ = -12,53 (c, 1,11, CHC1₃).

Elemanalízis eredmények a C₁₃H₁₄O₆ összegképlet alapján: számított: C = 58,64%, H = 5,30%;

talált: C = 58,78%, H = 5,34%.

7, példa (-)-(2 S,4S)-l-[2-(Benzoil-oxi-metíl)-l,3-dioxolán-4-il]-N -acetil-citozin (9) es (+)-(2 S,4R)-l-[2-(benzoil-oxi-metil)-l,3-dioxolán-4-il]-N⁴-acetil-citozin (10)

1,24 g (7,52 mmol) N⁴-acetil-citozin 20 ml vízmentes diklór-etánnal, 15 ml hexametilén-diszilazánnal és katalitikus mennyiségű ammónium-szulfáttal készült elegyét nitrogénatmoszférában 4 órán keresztül visszafolyató hűtő alatt forraljuk. A kapott tiszta oldatot szobahőmérsékletre hűtjük. Az így kapott szililezett acetil-citozinhoz hozzáadjuk 1,0 g (3,76 mmol) (8) vegyület 10 ml diklór-etánnal készült oldatát, és 1,46 ml (7,55 mmol) TMSOTf-et. A reakcióelegyet 6 órán keresztül keverjük. Hozzáadunk 10 ml telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldatot, és az elegyet 15 percen keresztül tovább keverjük, majd celit rétegen átszűrjük. A szűrletet bepároljuk, és a szilárd anyagot etil- 27 -acetátban oldjuk, vízzel és sóoldattal mossuk, szárítjuk, szűrjük, és bepároljuk. A kapott nyersterméket szilkagél oszlopon kromatografálva tisztítjuk, az eluálást 5% metanolt tartalmazó kloroformmal végezzük. 0,40 g (30%) (9) és (10) vegyületet tartalmazó tiszta α,β elegyet, és 0,48 g (40%) (13) és (14) vegyületet tartalmazó α,β elegyet kapunk. Elválasztás céljából a (14) elegyét újra acetilezzük, az egyesített α,β elegyet hosszú szilikagél oszlopon elválasztjuk, az eluálást 3% metanolt tartalmazó kloroformmal végezzük. 0,414 g (30,7%) (9) vegyületet és 0,481 g (35,6%) (10) vegyületet kapunk hab formájában. A fenti habokat metanollal eldörzsölve fehér, szilárd anyagokat kapunk.

(9) vegyület UV (metanol) X_max 298 nm;

Elemanalízis eredmények a C₁₇H₁₇N₃O₈ összegképlet alapján:

C, Η, N.

(10) vegyület UV (metanol) X_max 298 nm.

8. példa (-)-(2 S,4S)-l-[2-(hidroxi-metil)-l,3-dioxolán-4-il]-citozin (11) előállítása

0,29 g (0,827 mmol) (9) vegyület ammóniával 0 °C-on telített 50 ml metanollal készült oldatát szobahőmérsékleten 10 órán keresztül keverjük. Az oldószert elpárologtatjuk, és a (11) nyersterméket preparatív szilikagél lemezen tisztítjuk, az eluálást 20% metanolt tartalmazó kloroformmal végezzük. A kapott olajat diklór-metán/hexán elegyből átkristályosítva 0,136 g (77,7%) (11) vegyületet kapunk fehér, szilárd anyag formájában. UV X_max 278,0 nm (ε = 11967) (pH 2); 270,0 nm (ε - 774) (pH 7); 269,0 nm (ε = 8379) (pH 11);

Elemanalízis eredmények a C₈H_hN₃O₄ összegképlet alapján:

- 28 C, Η, N.

Gyógyászati készítmények

Daganatos betegségben, és különösen rákban szenvedő embert, lovat, kutyát, marhát vagy egyéb állatot, különösen emlőst kezelhetünk a találmány értelmében oly módon, hogy a betegnek a (-)-OddC vagy annak származéka vagy gyógyászatilag elfogadható sója hatásos menynyiségét adagoljuk adott esetben gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal vagy hígítóanyagban, önmagában, vagy egyéb ismert rákellenes vagy gyógyászati szerekkel kombinációban. Ezt a kezelést egyéb szokásos rákellenes gyógymódokkal, például besugárzásos kezeléssel vagy sebészeti kezeléssel együtt is alkalmazhatjuk.

A találmány szerinti vegyületeket bármely megfelelő módon, például orálisan, parenterálisan, intravénásán, intradermálisan, szubkután módon vagy helyileg alkalmazhatjuk cseppfolyós készítmények, krémek, gélek vagy szilárd készítmények formájában, vagy aeroszol formában.

A gyógyászatilag elfogadható hordozóanyag vagy hígítóanyag a hatóanyagot olyan mennyiségben tartalmazza, amely elegendő a gyógyászatilag hatásos mennyiség betegbe juttatására a kívánt indikáció esetén anélkül, hogy komoly toxikus hatásokat váltana ki a kezelt betegben. A találmány szerinti vegyületek előnyös dózisa a fent említett betegségek kezelésére általában körülbelül 10 ng/kg - 300 mg/kg, előnyösen 0,1 - 100 mg/kg naponta, még általánosabban 0,5 - 25 mg/testtömeg kg/nap. A dózis helyi alkalmazás esetén általában 0,01 - 3 tömeg% hatóanyag megfelelő hordozóanyagban.

A találmány szerinti vegyületeket célszerűen valamely al- 29 -

kalmas egységdózis formában adagoljuk, ilyenek például az 1-3000 mg, előnyösen 5-500 mg hatóanyagot tartalmazó egységdózis formák. Orális adagolás esetén rendszerint 25-250 mg a célszerű dózis.

A hatóanyagot előnyösen olyan mennyiségben adagoljuk, hogy azzal a plazmában körülbelül 0,00001-30 mmol/1, előnyösen körülbelül 0,1-30 pmol/l csúcsértékű koncentrációt kapjunk. Ezt például úgy érhetjük el, hogy a hatóanyagot tartalmazó oldatot vagy készítményt intravénásán injektáljuk, kívánt esetben sóoldatban vagy vizes közegben, vagy a hatóanyagot bólusz formájában adagoljuk.

A gyógyszerkészítményben a hatóanyag koncentrációja a hatóanyag abszorpciójától, megoszlásától, inaktiválódásától és kiürülést sebességétől, valamint egyéb ismert faktoroktól függ. Megjegyzendő, hogy a dózisértékek a kezelendő betegség súlyosságától is függnek. Magától értetődően minden egyes beteg esetén a specifikus dózistartományokat az egyedi szükséglettől függően kell beállítani, és ennek megállapítása a kezelést vagy gyógyszerezést végző személy szakmai megítélésétől függően változik, továbbá azt is megjegyezzük, hogy a fent említett koncentrációtartományokat a korlátozás szándéka nélkül említettük, tájékoztató jelleggel. A hatóanyagot naponta egy alkalommal, vagy különböző időközökben, több kisebb dózisra osztva adhatjuk a kezelendő betegnek. Az orális készítmények általában egy inért hígítóanyagot vagy egy emészthető hordozóanyagot tartalmaznak. Ezeket a készítményeket zselatin kapszulába zárhatjuk, vagy tablettává préselhetjük. Orális gyógyászati alkalmazás céljából a hatóanyagot vagy annak prodrog formáját a segédanya• β *· • · · • · · · gokkal összekeverjük, és tabletta, pirula vagy kapszula formájában alkalmazhatjuk. A találmány szerinti gyógyászati készítmények tartalmazhatnak gyógyászatilag összeférhető kötőanyagokat és/vagy adjuváns anyagokat is.

A találmány szerinti tabletták, pilulák, kapszulák, pirulák és hasonlók az alábbi komponensek vagy hasonló természetű vegyületek bármelyikét tartalmazhatják: kötőanyagokat, például mikrokristályos cellulózt, tragantgyantát vagy zselatint; segédanyagokat, például keményítőt vagy laktózt; diszpergálószereket, például alginsavat, primogélt vagy kukoricakeményítőt; síkosítóanyagokat, például magnézium-sztearátot vagy Sterotes-t; csúsztatóanyagokat, például kolloidális szilícium-dioxidot; édesítőszereket, például szacharózt vagy szacharint; vagy ízesítőanyagokat, például borsmentát, metil-szalicilátot vagy narancsaromát. Ha a dózisegység formája kapszula, az a fent említett típusú anyagokon kívül cseppfolyós hordozóanyagot, például egy olajat is tartalmazhat. Ezenkívül a dózisegység formák különféle egyéb anyagokat is tartalmazhatnak, amelyek a dózisegység fizikai formáját módosítják, ilyenek például a cukorbevonatok, a sellak vagy az enterális szerek.

A találmány szerinti hatóanyagot vagy annak gyógyászatilag elfogadható sóját elixírek, szuszpenziók, szirupok, ostyák, rágógumik és hasonlók komponenseként is beadhatjuk. A szirup a hatóanyagon kívül édesítőszerként szacharózt és bizonyos konzerválószereket, festékeket és színezőanyagokat és aromaanyagokat tartalmazhat.

A hatóanyagot vagy gyógyászatilag elfogadható sóit egyéb hatóanyagokkal is elegyíthetjük, amelyek a kívánt hatást nem ···· ······· · ·

-Elrontják le, vagy olyan anyagokkal, amelyek a kívánt hatást kiegészítik, például egyéb rákellenes szerekkel, antibiotikumokkal, antifungális szerekkel, gyulladásgátlókkal vagy antivirális vegyületekkel.

A parenterális, intradermális, szubkután vagy helyi adagolásra alkalmas oldatok vagy szuszpenziók az alábbi komponenseket tartalmazhatják: steril hígítóanyagot, például injekció készítésére alkalmas vizet, sóoldatot, fixált olajokat, polietilénglikolokat, glicerint, propilénglikolt vagy egyéb szintetikus oldószereket; antibakteriális szereket, például benzil-alkoholt vagy metil-parabeneket; antioxidánsokat, például aszkorbinsavat vagy nátrium-hidrogén-szulfitot; kelátképzőszereket, például etiléndiamin-tetraecetsavat; puffereket, például acetátokat, citrátokat vagy foszfátokat, és a tonicitás beállítására alkalmas szereket, például nátrium-kloridot vagy dextrózt. A parenterális készítményeket ampullákba, eldobható fecskendőkbe vagy üvegből vagy műanyagból készült, több dózist tartalmazó fiolákba tölthetjük.

Intravénás adagolásra előnyös hordozóanyagok a fiziológiás sóoldat vagy foszfáttal pufferolt sóoldat (PBS).

Egyik kiviteli alakban a hatóanyagokat olyan hordozóanyagokkal formáljuk, amelyek a hatóanyagot megvédik a testből való gyors eliminációtól, ilyenek például a szabályozott hatóanyagfelszabadulást biztosító készítmények, beleértve az implantátumokat és a mikrokapszulába zárt adagolórendszereket. Biológiailag lebomló, biológiailag kompatibilis polimereket alkalmazhatunk ezekben a készítményekben, például etilén/vinil-acetát polimert, polianhidrideket, poliglikolsavat, kollagént, po·» · ·· ·· · • ···· ·· · · _Α. a · ··· · · . · · ♦ ···* «·· · ······· · *

- 32 liortoésztereket és politejsavat. A fenti készítményeket szakemberek számára jól ismert eljárásokkal állíthatjuk elő.

Gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagok lehetnek a liposzómás szuszpenziók is. Ezeket szakemberek által jól ismert eljárásokkal állíthatjuk elő, például az US 4 522 811 számú szabadalmi leírásban ismertetett módon (amelynek teljes tartalmát referenciaként leírásunkba beépítettünk). A liposzómás készítményeket például úgy állíthatjuk elő, hogy a megfelelő lipideket (például sztearoil-foszfatidil-etanol-amint, sztearoil-foszfatidil-kolint, arachidoil-foszfatidil-kolint vagy koleszterint) szervetlen oldószerben oldjuk, majd azt elpárologtatjuk, maradékként a száraz lipidből alkotott vékony filmet kapunk a tartály felületén. A tartályba ezután bevisszük a hatóanyag vizes oldatát. A tartályt ezután kézzel rázogatjuk, ezáltal a tartály oldaláról a lipidanyagot bemossuk, és a lipid aggregátumot diszpergáljuk, így kapjuk a liposzómás szuszpenziót.

Biológiai aktivitás

A vegyületek daganatellenes aktivitásának kimutatására számos biológiai vizsgálatot alkalmaznak és elismernek. A fenti eljárások bármelyike alkalmazható a találmány szerinti vegyületek aktivitásának kiértékelésére.

Az aktivitás meghatározására alkalmazott egyik gyakori eljárás a National Cancer Institute (NCI) tipikus daganat-sejtvonalainak alkalmazásán alapul. Ezekkel a tesztekkel az in vitro daganatellenes aktivitást értékeljük ki, és ebből következtethetünk a vizsgált vegyületek in vivő hatására. Más vizsgálatok szerint a vegyület hatását csupasz egerekbe oltott, emberből vagy egérből származó tumorsejteken in vivő értékeljük ki. A (-)-OddC daga- 33 -

natellenes aktivitását in vivő P388 leukémia-sejtvonalon és C38 vastagbélrák-sejtvonalon vizsgáltuk. A fenti vizsgálatokat és eredményeiket a 9. és 10. példában részletezzük.

9. példa

P388 leukémiasejtek kezelése (-)-OddiC-vel in vivő BDF1 egerekbe (Southern Research Institute, Alabama) intraperitoniálisan ΙΟ⁶ P388 leukémia sejtet implantáltunk. A (-)-OddC-t i.p. adagoltuk naponta kétszer 5 napon keresztül, a kezelést a tumorsejt implantációja után egy nappal kezdtük el. A fenti vizsgálat során a 75 mg/kg dózist toxikusnak találtuk az egerekre nézve. A fenti vizsgálatok eredményeit a 3. ábra és az

1. táblázat mutatja. A 3. ábrán · jelenti a kontrollal (kezeletlen állatok) kapott adatokat, míg a Δ jelenti a 25 mg/kg x 2/nap dózissal kezelt állatokkal, a O pedig az 50 mg/kg x 1/nap dózissal kezelt állatokkal kapott túlélési arányokat. A (-)-OddC-vel 25 mg/kg dózisban kezelt hat egér közül az egyik állat hosszú túlélőnek mutatkozott, míg a többi öt egér élettartama 103%-kal növekedett.

- 34 1. táblázat

Gyógy ult^c/összes	9/0	i©
se
**?
G		eri	oó	04	«ri
O		T-H	T—<	04	’e·
Λ io	o- e	Λ 04	C\ CO	r\ ©	r\ cC
T3	G	r-^		04	m
		r\	r\	r\
-eö 3			cc	00 r·^	ri 04
S


				m
X		1 1		©
!Z)






	a.
'3	te	rO
•w	G	r>		Γ
5Λ		fO		04
© ex el	idő
*·

T3
»© g
E5
5Λ		\|		.ex
		1

N
V


bű
c				in
			X
B		1 1		04 X
A 5Λ				25
N
'©
Q
oport		•ntroll		OddC
5Λ u		o		1 x-*s 1

c o

a.

ce (3 te c

cü <e <u

G o

ε

J3

O

G c

o ex «3 c

iri

N te

G ^:s

N <U tű <<u >

<υ

N w

«->

<<u ce ·«-»

G o

ex «3

G

CZ3

N ω

£ £

N

Cfl >

N

O

G ©

§ á

*3

N k<S

N

CZ3 te •c te +-» ω

Ό <υ

1) >

:O

G tű <u e

£X

Λ

G

Ti ^T

ΛΙ te te

C te

Í5 *o

10. példa

C38 vastagbéldaganat-sejtek kezelése (-)-OddC-vel in vivő

A BDF1 egerekbe se. a C38 vastagbéldaganat-sejteket. A (-)-OddC-t az egereknek naponta kétszer adagoltuk 5 napon keresztül, 25 mg/kg/dózis mennyiségben. A C38 vastagbéldaganat-sejtek növekedése a 2. ábrán látható módon gátlódott. A 2. ábrán · jelenti a kontroll állatokkal kapott adatokat, a A jelenti (-)-OddC-vel kezelt egerekkel kapott adatokat.

11. példa (-)-OddC vizsgálata in vitro

A (-)-OddC-t az NCI rákszűrő programjával értékeltük ki. A vizsgálat során mértük a különféle ráksejtvonalak gátlását az OddC különböző koncentrációi jelenlétében. A vizsgált sejtvonalakat a 2. táblázatban foglaltuk össze.

A 2. táblázatban megadjuk azokat a koncentrációkat is, amelyeknél a GI50-et és a TGI-t megfigyeltük a vizsgált sejtvonalakban. A GI50, TGI és LC50 azokat a koncentráció értékeket jelentik, amelyeknél a szaporodás százalékos gátlása (PG) +50, 0, illetve -50, az alábbiak szerint meghatározva. Ezeket az értékeket az egyes sejtvonalakkal felvett dózis-válasz görbék interpolálásával határoztuk meg, a görbéken a PG-t a (-)-OddC log₁₀koncentrációja függvényében ábrázoltuk.

A PG a (-)-OddC mért hatása a sejtvonalon, amelyet az alábbi egyenletek egyikével számítunk ki: ha az (átlagos OD_teszt - átlagos OD_tzéro) > O, akkor PG = 100 x (átlagos OD_teszt - átlagos OD_tóro)/(átlagos OD_kootroll- átlagos OD_tórö); ha az (átlagos OD_teszt - átlagos OD_tzéro) < O, akkor

- 36 -.........

PG - 100 x (átlagos OD_teszt - átlagos OD_tzéro)/átlagos OD_tzéro, ahol átlagos OD_tzéro jelentése SRB-ből származó szín átlagos optikai sűrűség értéke közvetlenül azelőtt, hogy a sejteket a tesztvegyület hatásának kitettük;

átlagos OD_teszt jelentése SRB-ből származó szín átlagos optikai sűrűség értéke 48 órával azután, hogy a sejteket a tesztvegyület hatásának kitettük;

átlagos OD_kontroll jelentése SRB-ből származó szín átlagos optikai sűrűségi értéke 48 óra éltével, a tesztvegyület nélkül.

A 2. táblázat első két oszlopában a (-)-OddC-vel kezelt sejttípust (például leukémia) és sejtvonalat (például CCRF-CEM) adtuk meg. A harmadik oszlopban azt a log₁₀ koncentrációt adtuk meg, amelynél a GI50-et észleltük, és a negyedik oszlopban azt a log₁₀ koncentrációt adtuk meg, amelynél a TGI-t észleltük. Ha ezeket a válasz-paramétereket nem lehet interpolálással kiszámítani, akkor az egyes válaszok esetén megadott értékek a legmagasabb vizsgált koncentrációt jelentik, amely elé > jelet tettünk. így például, ha a PG a (-)-OddC összes vizsgált koncentrációjánál meghaladja a +50-et egy adott sejtvonal esetén, akkor ezt a paramétert nem lehet interpolálással megkapni.

- 37 • · u « ·· · · • ····

2. táblázat

Típus	Sejtvonal	Log₁₀GI50	Log₁₀TGI
Leukémia	CCRF-CEM	-6,64	> -4,00
	RL-60 (TB)	-6,28	> -4,00
	K-562	-4,59	> -4,00
	BSOLT-4	-6,66	-4,39
	RPMI-2,26	-4,03	> -4,00
	SR	-5,95	> -4,00
Nem-kissejtes tüdőrák	A549/ATCC	-6,01	> -4,00
	BKVX	> -4,00	> -4,00
	HOP-62	-6,23	-4,71
	NCI-H23	-4,92	> -4,00
	NCI-H322M	> -4,00	> -4,00
	NCI-H460	-4,32	> -4,00
	NCI-H522	-6,06	> -4,00
Vastagbélrák	HCT-116	-5,23	> -4,00
	HCT-15	-5,39	> -4,00
	HT29	> -4,00	> -4,00
	K2112	> -4,00	> -4,00
Központi idegrendszeri rák	SP-268	-5,18	> -4,00
	SP-295	-6,24	> -4,00
	SNB-19	-5,71	> -4,00
	U251	-4,91	> -4,00
Melanoma	LOX D6VI	-6,39	> -4,00
	MALME-3M	-4,51	> -4,00

- 38 • ·· a 2. táblázat folytatása

Típus	Sejtvonal	Log₁₀GI50	Log₁₀TGI
	M14	-6,27	-5,07
	SK-MEL-28	-4,31	> -4,00
	SK-MEL-5	-4,91	> -4,00
	UACC-257	> -4,00	> -4,00
	UACC-62	-5,53	> -4,00
Petefészekrák	0R0V1	-4,03	> -4,00
	OVCAR-3	-4,44	> -4,00
	OVCAR-4	> -4,00	> -4,00
	OVCAR-5	-4,41	> -4,00
	OVCAR-8	-5,82	> -4,00
	SK-OV-3	-5,35	> -4,00
Veserák	785-4	-5,36	> -4,00
	ACHN	-6,46	> -4,00
	CAKI-1	-6,65	-4,87
	RXF-393	-6,17	> -4,00
	SN12C	-6,27	> -4,00
	TK-30	> -4,00	> -4,00
Prosztatarák	UO-31	-5,60	> -4,00
	PC-3	-6,29	> -4,00
	DU-145	-6,97	> -4,00
Mellrák	MCF7	-5,95	> -4,00
	MCF7/ADR-RES	-4,97	> -4,00
	MDA-MB- 231/ATCC	> -4,00	> -4,00
	HS578T	> -4,00	> -4,00

- 39 a 2. táblázat folytatása

Típus	Sejtvonal	Log₁₀GI50	Log₁₀TGI
	MDA-MB-435	-4,62	> -4,00
	MDA-N	-4,33	> -4,00
	BT-549	-4,59	> -4,00
	T-47D	> -4,00	> -4,00

A 4. ábrán grafikusan mutatjuk be a (-)-OddC relaktív szelektivitását az egyes sejtvonalakra. A jobbra kinyúló vonalak a vizsgált sejtvonalnak az összes vizsgált sejtvonal átlagos érzékenységét meghaladó érzékenységét jelentik (-)-OddC-vel szemben. Mivel a vonalskála logaritmikus, a jobbra két egységnyire nyúló vonal azt jelenti, hogy a vegyület az összes sejtvonal esetén szükséges átlagos koncentráció század részénél fejti ki a GI50-et az adott sejtvonalra, így ez a sejtvonal rendkívül szenzitív (-)-OddC-re. A balra kinyúló vonalak ennek megfelelően az átlagosnál kisebb érzékenységet jelentik. Ezek a sejtvonalak könnyen meghatározhatók a 2. táblázatból, mivel ez esetben a log₁₀ koncentráció előtt egy > van.

A 4. ábrából látható, hogy az egyes ráksejt típusoknál az összes sejtvonalak közül legalább egy érzékenynek mutatkozott (-)-OddC-vel szemben. Bizonyos prosztatarák sejtvonalak, leukémia sejtvonalak és vastagbélrák sejtvonalak kiemelkedően nagy érzékenységet mutattak (-)-OddC-vel szemben.

12. példa (-)-OddC és AraC összehasonlítása

A technika állásában ismertettük, hogy a citozin-arabinozid (amelyet Cytarabin-nak, araC-nek vagy Cytosar-nak is nevez- 40 nek) a dezoxicitidin egy nukleozid-analógja, amelyet akut mieloid leukémia kezelésére alkalmaznak. Ez a vegyület akut limfocitás leukémia ellen is hatásos, és kisebb mértékben krónikus mielocitás leukémia és nem-Hodgkin-féle limfóma ellen is használható. Az araC primer hatása a sejtmag DNS-szintézisének gátlása. Érdekes volt összehasonlítani a (-)-OddC és az araC daganatsejtekre kifejtett toxicitását.

Logaritmikus szaporodási fázisban lévő sejteket 5000 sejt/ml/rezervoár sűrűségben oltottunk le 24-rezervoáros lemezekre. A hatóanyagokat különböző dózisokban adtuk a sejtekhez, és a tenyészeteket három generáción keresztül tenyésztettük. A fenti időpont végén metilénkékkel festést végeztünk és/vagy közvetlen sejtszámlálást végeztünk. A metilénkék egy olyan festék, amely sztöchiometrikus mennyiségben kötődik az élő sejtek proteinjeihez, és közvetve kvantitatív sejtszám meghatározására lehet alkalmazni (Finlay, 1984). Az IC₅₀ értékeket a grafikusan ábrázolt adatokból interpolálással határoztuk meg. Az egyes értékek az öt kísérletből származó átlagérték ± standard deviációt jelentik, minden egyes adatot duplikátban határoztunk meg.

Az összes vizsgált daganatsejt-vonalra a (-)-OddC toxikusabb volt, mint az araC. A (-)-OddC szignifikánsan hatásosabb volt, mint az araC a KB orr-garat-karcinóma sejtvonalra és a DU-145 és PC-3 prosztata-karcinóma sejtvonalakra. A HepG2 sejtek hepatocelluláris karcinómából és a 2.2.15 sejtvonal a hepatitis B vírus genom kópiájával transzfektált HepG2 sejtekből származik. A CEM sejtek akut limfoblasztos leukémiából származnak. A (-)-OddC dezaminálásával kapott (-)-OddU nem volt toxikus egyetlen vizsgált sejtvonalra nézve sem. Az enzimatikus • · · ····· • · · ····· ···· ······· · ·

- 41 vizsgálatok azt jelzik, hogy az araC-től eltérően - amelynek klinikai hatékonyságát dezaminálásra való hajlama nagymértékben csökkenti - a (-)-OddC nem szubsztrátja a dezamináznak.

Kimutattuk, hogy a (-)-OddC in vivő mono-, di- és trifoszfát nukleotiddá foszforileződhet. Úgy tűnik, hogy a (-)-OddC sejtekkel szembeni toxicitását foszforilezett formában fejti ki, mivel azok a sejtek, amelyek nem képesek e vegyületet foszforilezni, sokkal kevésbé érzékenyek a vegyülettel szemben. A vegyület foszforilezéséért felelős első enzim a humán dezoxicitidin kináz. In vitro enzimatikus vizsgálatok jelzik, hogy a (-)-OddC-t ez az enzim képes foszforilezni.

Az araC-től eltérően a (-)-OddC-t a citidin-dezamináz nem dezaminálja. A citidin-dezamináz jelenléte a tömör daganatos szövetekben kulcsfontosságú faktor lehet, amely felelős azért, hogy az araC tömör daganatokban nem fejt ki aktivitást. Ez részben magyarázhatja azt, hogy a (-)-OddC hatásos HepG2 sejtekkel szemben csupasz egérben, míg az araC hatástalan. Ez magyarázatot ad arra is, hogy miért különbözik a (-)-OddC daganatellenes aktivitásának spektruma az araC-étől. Ezenkívül a citidin-dezamináz jelenléte a gyomor-bél-traktusban fontos szerepet játszhat abban, hogy miért nem lehet az araC-t orálisan adagolni.

(-)-OddC biokémiai vizsgálata >

c rt ζ/3

Ό χ

ο <->

ο '5 □

Τ3 •σ

Ο

Ό υ

Ό

Τ3

Ο

I

I υ

σ3 u* <

ζ“*\ β S Α ο Q Μ	(-)-Oddü	>30	>30	>30	>30	>30	>30
(-)-OddC	0,048 ±0,0210	0,024 ± 0,020	0,056 ± 0,039	0,110 ±0,050	0,110 ±0,011	0,025 ± 0,030
AraC	0,152 ±0,010	0,170 ±0,035	0,200 ± 0,078	0,125 ±0,013	0,145 ± 0,007	0,030 ±0,010
Sejtvonal	KB	DU-145	PC-3	HepG2	2.2.15	CEM

II · ·· · · · • ···· ·· ·· • · · · · · · • · · * · ···· ··· ···· ·

- 43 12. példa

In vivő vizsgálatok

3-6 hetes NCr csupasz egeret (Taconic Immunodeficient Mice and Rats) s.c. inokuláltunk 2 χ 10⁶ HepG2 vagy DU-145 sejttel, és a daganatokat hagytuk növekedni. A kezelést akkor kezdtük el, amikor a daganatok elérték a 100-250 mg méretet, amelyet tolómércével mértünk, és az alábbi egyenlet szerint számítottunk ki:

Daganat tömege (mg) = hosszúság (mm) x szélesség (mm²) / 2

A hatóanyagokat a megadott dózisokban adtuk a 0. - 4. napon keresztül, és a daganatok méretét több napon mértük. A daganat szaporodási görbéjét Bell és munkatársai módszere szerint vettük fel [Cancer (phila.) 36, 2437-2440 (1975)], a szaporodási görbéket az 5(a) és 5(b) ábrán mutatjuk be.

A toxocitást a testtömeg változásával értékeltük ki.

Noha az araC in vitro toxicitása hasonló volt, mint az (L)-OddC-é, az araC ebben az állatkísérleti modellben hatástalannak bizonyult. A daganat extraktumának enzimatikus analízise azt jelezte, hogy ez nem a dCD megnövekedett aktivitásának vagy a dCK csökkent aktivitásának következménye, hanem az araC nagymértékű metabolizmusának eredménye a májban, amelyben a dCD koncentráció magas. Az araC-től eltérően az (L)-OddC hatásos volt mind HepG2, mind DU-145 daganatokkal szemben. A HepG2 daganatokra kiszámított nettó sejtpusztulás (log₁₀) 0,67 volt i.p. és 0,87 orális kezelés esetén. A DU-145 daganatok mérete kisebb lett, és a daganatok fele teljesen visszafejlődött a 15. napra. Az utolsó kezelés után körülbelül 25 nappal a daganatok újra kezdtek megjelenni, de növekedésük a 47. nap után ismét leállt. A 60. napon az állatokat leöltük, és a daganatokat eltávolítottuk. A daganatok nekrotikus morfológiai vizsgálata azt mutatta, hogy a sejtek közül csak nagyon kevés volt képes kizárni a tripánkéket. Ezenkívül nem lehetett enzimaktivitást kimutatni ezekben a szövetekben. Az araC és (L)-OddC a megadott dózisokban egyformán toxikusak voltak, amelyet az állatok tömegvesztesége jelzett, és az előzetes toxikológiai kísérletek azt mutatták, hogy egy öt egymást követő napon tartó kezelésben a maximálisan tolerálható dózis 25 mg/kg naponta kétszer. Előnyös lehet egy olyan kezelési rend, amelyben a hatóanyagot megszakításokkal adagoljuk.

A bemutatott in vitro és in vivő adatok azt bizonyítják, hogy az (L)-OddC szignifikáns daganatellenes aktivitással rendelkezik, és több szempontból is előnyösebb lehet a jelenleg kapható dezoxicitidin-analógoknál. Nemcsak azért, mert ez az első ismert (L)-nukleozid-analóg, amely daganatellenes aktivitással rendelkezik, hanem azért is, mert az első valódi láncterminátor, amely képes a daganat növekedését gátolni. Noha nem természetes sztereokémiái szerkezete nem akadályozza meg, hogy az (L)-OddC-t a metabolikus enzimek aktiválják, vagy a DNS-be beépítsék, ez a szerkezet szerepet játszhat abban, hogy ezt a vegyületet a dCD nem bontja le. Az (L)-OddC egyedülálló abból a szempontból is, hogy olyan tömör daganatokra is hat, amelyek rendszerint nem reagálnak a nukleozid-analóg terápiára. A 2’,2’-difluor-dezoxi-citidin (gemcitibin) - amelynek tömör daganatok elleni aktivitását jelenleg klinikai vizsgálatokban érté- 45 kelik - érzékeny a dCD(16) általi aktiválásra. Mivel a dCD koncentrációjának növekedése az a mechanizmus, amellyel a sejtek rezisztenssé válnak a dCyd analógokkal, például araC-vel (17) szemben, az (L)-OddC olyan betegek kezelésére is alkalmazható lehet, akik a fenti szerekre nem reagálnak.

(-)-OddC alkalmazása oligonukleotid és antiszensz módszerekben

Antiszensz módszerek alatt általában a gén-expresszió olyan eljárással történő módosítását értjük, amelyben egy szintetikus oligonukleotidot egy komplementer nukleinsav-szekvenciával hibridizálnak, hogy a transzkripciót vagy replikációt gátolják (ha a célszekvencia egy DNS), vagy a transzlációt gátolják (ha a célszekvencia egy RNS), vagy gátolják az átalakítást (ha a célszekvencia egy pre-RNS). E módszer alkalmazásával számos sejt aktivitás módosítható. Egyszerű példa erre a protein-bioszintézis gátlása az mRNS-hez kötött antiszensz oligonukleotiddal. Másik kiviteli alakban egy szintetikus oligonukleotidot egy kettős szálú DNS formájában lévő, specifikus génszekvenciával hidridizálnak, ezáltal triplaszálú komplex (triplex) alakul ki, amely gátolja a génszekvencia expresszióját. Az antiszensz oligonukleotidok a gén expressziójának aktiválására is alkalmazhatók közvetve, a természetes represszor bioszintézisének gátlásával, vagy közvetlenül, a transzkripció terminációjának csökkentésével. Az antiszensz oligonukleotid terápia (AOT) a patogén gének expressziójának gátlására alkalmazható, beleértve a jóindulatú vagy rosszindulatú daganatsejtek szabályozatlan növekedésében szerepet játszó gének expresszióját, vagy azon génekét, amelyek a vírusok, például HÍV és HBV replikációjában játszanak szere- 46 pet.

Az oligonukleotidok nukleázokkal szembeni stabilitása fontos tényező az in vivő alkalmazások során. Ismeretes, hogy a 3’-exonukleáz aktivitás felelős a módosítatlan antiszensz oligonukleotidok legtöbbjének degradálódásáért a szérumban [Vlassov V.V., Yakubov, L.A.: „Prospects fór Antisense Nucleic Acid Therapy of Cancers and AIDS”, 243-266. oldal, WileyLiss, Inc., New York (1991); és Nucleic Acids Rés. 21, 145 (1993)].

Az oligonukleotid 3’-végén lévő nukleotidjának helyettesítése (-)-OddC-vel vagy annak származékával stabilizálhatja az oligonukleotidot a 3’-exonukleáz általi degradálódással szemben. Alternatív módon, vagy ezen túlmenően, egy belső nukleotidot is helyettesíthetünk (-)-OddC-vel vagy annak származékával, hogy az oligonukleotid endonukleázok általi lebontását megakadályozzuk.

A találmány segítségével a (-)-OddC-t vagy annak származékait egy szakember alkalmazni tudja különféle oligonukleotidok stabilizálására mind exonukleázok, mind endonukleázok általi lebontással szemben, beleértve az antiszensz oligonukleotid terápiában alkalmazott nukleozidokat is. A találmány tárgykörébe tartoznak mindezen kiviteli alakok. A 13. példában közlünk egy példát - a korlátozás szándéka nélkül - a (-)-OddC alkalmazására 3’-exonukleáz aktivitással szembeni rezisztencia kialakítására.

- 47 13. példa (-)-OddC alkalmazása 3’-exonukleáz aktivitással szembeni rezisztencia kialakítására

Humán H9-ből (T-típusú limfocitás leukémia sejt) származó humán citoszol exonukleáz-aktivitását szekvenáló gélvizsgálattal határoztuk meg. Röviden, a 3’-terminált szubsztrátot 20 vagy 23 bázis hosszúságú DNS primerből állítottuk elő, amelynek szekvenciája:

3’-CAATTTTGAATTTCCTTAACTGCC-5’

1

A printereket 5’-végükön [γ- P]ATP-vel jeleztük, komplementer RNS templátokhoz kapcsoltuk, és 3’-végükön dTTP-vel (20 mer), dCTP-vel (23 mer) vagy (-)-OddCTP-vel (23 mer) termináltuk HIV-1 által katalizált álló rajt reakcióval, szobahőmérsékleten. A fenti körülmények között a 20 mert dTMP-vel (A), a 23 mert dCMP-vel (B) vagy (-)-OddCMP-vel (C) termináltuk. Ezeket az egyszálú DNS szubsztrátokat alkalmaztuk citoplazmás exonukleázzal szembeni érzékenységük vizsgálatára. A vizsgálatokat 10 pl reakcióelegyben végeztük, amely 50 mmol/1 Tris-HCl-t (pH 8,0), 1 mmol/1 MgCl₂-t, 1 mmol/1 ditiotreitet, 0,1 mg/ml marhaszérumalbumint, 0,18 pCi/ml 3’-terminált szubsztrátot és 2 μΐ (0,03 egység) exonukleázt tartalmazott. A reakcióelegyet 37 °C-on inkubáltuk a megadott időkön keresztül, majd a reakciót 4 μΐ 98% formamidot, 10 mmol/1 EDTA-t és 0,025% brómfenolkéket tartalmazó elegy hozzáadásával állítottuk le. A mintákat 100 °C-on 5 percen keresztül denaturáltuk, majd jégen gyorsan lehűtöttük. A reagálatlan anyagot, valamint • · · ····· • · · ····· ···· ······· · ·

- 48 a reakciótermékeket 15% poliakrilamid/karbamid szekvenáló gélen választottuk szét, és autoradiográfiásan hívtuk elő. A 3’-végen (-)-OddC-t tartalmazó oligonukleotid legalább ötször ellenállóbb volt 3’-exonukleázzal szemben, mint az egyéb oligonukleotidok.

Szakember számára nyilvánvalóak a fenti leírásból a találmány módosításai és variációi, amelyek rák kezelésére alkalmazhatók. A találmány oltalmi körébe tartoznak az összes ilyen módosítások és változatok.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. (IV) általános képletű vegyületek - a képletben f 0

R és R jelentése hidrogénatom, acilcsoport vagy 1-18 szénatomos alkilcsoport β-L-enantiomerjei, amelyek legalább 95%-ban mentesek a megfelelő β-D-enantiomertől.
2. Az 1. igénypont szerinti vegyületek, amelyekben R¹ és R² jelentése hidrogénatom.
3. Az 1. igénypont szerinti vegyületek, amelyekben az alkilcsoport jelentése metil-, etil-, propil-, butil-, pentil-, hexil-, izopropil-, izobutil-, szek-butil-, terc-butil- vagy izopentilcsoport.
4. Az 1. igénypont szerinti vegyületek, amelyekben az acilcsoport jelentése -C(O)R, ahol

R jelentése 1-5 szénatomos alkilcsoport, fenilcsoport vagy benzilcsoport.
5. Gyógyászati készítmény, amely egy 1. vagy 2. igénypont szerinti vegyületet vagy annak gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazza valamely gazdaállatban lévő daganat kezelésére hatásos mennyiségben, gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagban.
6. Az 5. igénypont szerinti készítmény, amelyben a hordozóanyag orális adagolásra alkalmas.
7. Az 5. igénypont szerinti készítmény, amelyben a hordozóanyag intravénás adagolásra alkalmas.
8. Az 5. igénypont szerinti készítmény, amelyben a hordozóanyag helyi vagy transzdermális adagolásra alkalmas.

- 50
9. Készítmény valamely gazdaállatban lévő daganat kezelésére való alkalmazásra, amely az 1. vagy 2. igénypont szerinti vegyület hatásos mennyiségét tartalmazza.
10. A 9. igénypont szerinti készítmény, amely gazdaállatként ember kezelésére alkalmas.
11. A 9. igénypont szerinti készítmény, amely rákos daganat kezelésére alkalmas.
12. A 11. igénypont szerinti készítmény, amely daganatként leukémia kezelésére alkalmas.
13. A 11. igénypont szerinti készítmény, amely daganatként vastagbélrák kezelésére alkalmas.
14. All. igénypont szerinti készítmény, amely daganatként hugyhólyagrák kezelésére alkalmas.
15. A 11. igénypont szerinti készítmény, amely daganatként hepatocelluláris rák kezelésére alkalmas.
16. A 11. igénypont szerinti készítmény, amely daganatként mellrák kezelésére alkalmas.
17. A 11. igénypont szerinti készítmény, amely daganatként tüdőrák kezelésére alkalmas.
18. A 11. igénypont szerinti készítmény, amely daganatként orr-garat-rák kezelésére alkalmas.
19. A 11. igénypont szerinti készítmény, amely daganatként hasnyálmirigyrák kezelésére alkalmas.
20. A 11. igénypont szerinti készítmény, amely daganatként petefészekrák kezelésére alkalmas.
21. A 11. igénypont szerinti készítmény, amely daganatként limfóma kezelésére alkalmas.

• · · · · · · · • · · ····· ···· ······· V ·

- 51
22. All. igénypont szerinti készítmény, amely daganatként prosztatarák kezelésére alkalmas.
23. Készítmény rák kezelésében való alkalmazásra, amely egy (III) általános képletű vegyület - a képletben

R jelentése H, F, Cl, -CH₃, -C(H)=CH₂, -C=CH, -CsN, Br vagy -NO₂, és

R¹ és R² jelentése hidrogénatom, alkilcsoport, acilcsoport, monofoszfát, difoszfát vagy trifoszfát vagy annak gyógyászatilag elfogadható sója hatásos mennyiségét és adott esetben egy gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz.
24. A 23. igénypont szerinti készítmény, ahol

R jelentése fluoratom, és

R¹ és R² jelentése hidrogénatom.
25. A 23. vagy 24. igénypont szerinti készítmény, amely gazdaállatként ember kezelésére alkalmas.
26. A 23. vagy 24. igénypontok szerinti készítmény, amely rákos daganat kezelésére alkalmas.
27. A 26. igénypont szerinti készítmény, amely daganatként leukémia kezelésére alkalmas.
28. A 26. igénypont szerinti készítmény, amely daganatként vastagbélrák kezelésére alkalmas.
29. A 26. igénypont szerinti készítmény, amely daganatként hugyhólyagrák kezelésére alkalmas.
30. A 26. igénypont szerinti készítmény, amely daganatként hepatocelluláris rák kezelésére alkalmas.
31. A 26. igénypont szerinti készítmény, amely daganatként mellrák kezelésére alkalmas.

- 52
32. A 26. igénypont szerinti készítmény, amely daganatként tüdőrák kezelésére alkalmas.
33. A 26. igénypont szerinti készítmény, amely daganatként orr-garat-rák kezelésére alkalmas.
34. A 26. igénypont szerinti készítmény, amely daganatként hasnyálmirigyrák kezelésére alkalmas.
35. A 26. igénypont szerinti készítmény, amely daganatként petefészekrák kezelésére alkalmas.
36. A 26. igénypont szerinti készítmény, amely daganatként limfóma kezelésére alkalmas.
37. A 26. igénypont szerinti készítmény, amely daganatként prosztatarák kezelésére alkalmas.
38. Gyógyászati készítmény, amely egy, a 23. vagy 24. igénypont szerinti vegyületet vagy annak gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazza valamely gazdaállatban lévő daganat kezelésére hatásos mennyiségben, gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagban.
39. A 9., 23. vagy 24. igénypont szerinti készítmény, amelyben a hordozóanyag orális adagolásra alkalmas.
40. A 9., 23. vagy 24. igénypont szerinti készítmény, amelyben a hordozó egy kapszulát képez.
41. A 9., 23. vagy 24. igénypont szerinti készítmény, amelynek formája tabletta.
42. A 9., 23. vagy 24. igénypont szerinti készítmény, amely parenterális adagolásra alkalmas.
43. Eljárás (-)-(2S,4S)-l-[2-(hidroxi-metil)-l,3-dioxolán-4-il]-citozin előállítására, azzal jellemezve, hogy adott esetben , · « ·· · · · • · * «·»·· ·» < l ·····«· » 9

- 53 védett citozint egy (A) általános képletű 1,3-dioxolánnal - a képletben

R_la jelentése hidrogénatom vagy hidroxil-védőcsoport, például acilcsoport, és

L jelentése kilépő csoport reagáltatunk, és az adott esetben jelenlévő hidroxil-védőcsoportot eltávolítjuk.
44. Eljárás 2-(hidroxi-metil)-5-(citozin-l-il)-l,3-dioxolán előállítására, azzal jellemezve, hogy egy (B) általános képletű vegyületet - a képletben

R_la jelentése hidroxil-védőcsoport az uracilgyűrű 4-es helyzetében lévő oxocsoport aminocsoporttá alakítására alkalmas reagenssel reagáltatunk, majd a védőcsoportokat eltávolítjuk.
45. Eljárás (2S,4S)-l-[2-(hidroxi-metil)-l,3-dioxolán-4-il]-citozin előállítására, azzal jellemezve, hogy egy (D) általános képletű védett 1,3-dioxolánt egy adott esetben 5-ös helyzetben szubsztituált védett citozin bázissal reagáltatunk egy, a terméket nem racemizáló Lewis-sav jelenlétében.
46. (-)-(2S,4S)-l-[2-(hidroxi-metil)-l ,3-dioxolán-4-il]-citozin és származékai és sói, vagy a (+)-enantiomer, vagy a racém elegy, és gyógyászatilag elfogadható származékaik és sóik gyógyászatban való alkalmazásra, például daganatok, így például rákos daganatok kezelésére vagy megelőzésére.
47. (-)-(2S,4S)-l-[2-(hidroxi-metil)-l,3-dioxolán-4-il]-citozin és gyógyászatilag elfogadható származékai és sói, vagy a (+)-entantiomer vagy a racém elegy, és gyógyászatilag elfogad• · · · ···· •·»« ··· ···· *

- 54 ható származékaik és sóik alkalmazása gyógyszerek előállítására daganatok, például rákos daganatok kezelésére.
48. (-)-(2S,4S)-l-[2-(hidroxi-metil)-l,3-dioxolán-4-il]-citozin és származékai és sói, vagy a (+)-enantiomer vagy a racém elegy, és gyógyászatilag elfogadható származékaik és sóik gyógyászatban való alkalmazásra, például abnormális vagy nem kívánatos sejtburjánzás kezelésére vagy megelőzésére.
49. (-)-(2S,4S)-l-[2-(hidroxi-metil)-l,3-dioxolán-4-il]-citozin és gyógyászatilag elfogadható származékai és sói vagy (+)-entantiomer vagy a racém elegy, és gyógyászatilag elfogadható származékaik és sóik alkalmazása gyógyszerek előállítására abnormális vagy nem kívánatos sejtburjánzás kezelésére vagy megelőzésére.
50. Készítmény psoriasis kezelésében való alkalmazásra, amely egy (III) általános képletű vegyület - a képletben

R jelentése H, F, Cl, -CH₃, -C(H)=CH₂, -C^CH, -CsN, Br vagy -NO₂, és

R és R jelentése hidrogénatom, alkilcsoport, acilcsoport, monofoszfát, difoszfát vagy trifoszfát vagy annak gyógyászatilag elfogadható sója hatásos mennyiségét és adott esetben egy gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz.

A meghatalmazott:

DANUBIA

Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.

dr. Kiss Ildikó szabadalmi ügyvivő

Aktaszámunk: 85335-8219 Sí • · ·

NYOMD APÉLDÁNY másolata • ··· · · • · · · · · • · · · · · ·

1/7 ,/ύ-οΗ • ·