CN1711278A - 新颖的阿糖胞苷单磷酸盐药物前体 - Google Patents

Abstract

本发明披露了一种化学式I的化合物及其制备方法和应用，在化学式I的化合物中：M和V彼此互为顺式，而MH是阿糖胞苷；上述阿糖胞苷的5’氧与磷相连；V是4－吡啶基；以及药学上可接受的药物前体及其盐。

Description

新颖的阿糖胞苷单磷酸盐药物前体

本申请要求于2002年10月31日提交的美国临时申请第60/423,259号以及于2002年10月31日提交的美国临时申请第60/423,211号的优先权，其全文结合于此作为参考。

技术领域

本发明涉及新颖的1，3丙烷-1-芳基二醇的阿糖胞苷单磷酸盐(araCMP)环状二酯及其制备方法和用途。更具体地说，本发明涉及具有顺式立体化学构型的1，3丙烷-1-(4-吡啶基)二醇的阿糖胞苷单磷酸盐(araCMP)环状二酯的领域。

背景技术

以下对本发明的背景技术的描述被提供用来帮助理解本发明，但并不是构成或描述本发明的现有技术。所有出版物的全部内容结合在本文中作为参考。

AraC是一种去氧胞苷的类似物，其通过核苷运载体被运输到细胞中，并且通过核苷和核苷激酶被磷酸化成活性代谢物araC三磷酸盐(araCTP)。它是治疗急性非淋巴细胞性白血病的最成功药物之一，但是它对于肝细胞癌(“HCC”)的治疗却无效，这是因为需要的核苷激酶在肝脏中的表达水平很低(Arner et al.Pharmacol.Ther.67(2)：155-86，(1995)；Ruiz van Haperen et al.Semin.Oncol.22Suppl 11(4)：35-41(1995))。然而，激酶在毒性靶器官(例如，骨髓)中保持高度表达，其导致相关的剂量限制毒性。araC的环状药物前体通过将更高浓度的araCTP递送到表达CYP3A4的肝脏和HCC细胞，使改善araC在肝脏的活性成为可能。可预料到araC作为其单磷酸盐araCMP的递送从旁路限制正常和抗性肿瘤细胞中的去氧胞苷激酶、去氧胞苷脱氨基酶和运输活性。因此，与araC相比，AraCMP 1，3-丙二醇的环状二酯在肝脏中具有增强的抗肿瘤活性，同时具有对肝外造血系统降低的毒性，其导致在人中所看到的剂量限制的骨髓抑制(参见US 6,312,662)。

由于受剂量限制的(dose limiting)肝外副作用或者化疗剂不能充分地释放到靶组织，当前的治疗方法对肝炎和肝癌的疗效仍然较差。上面描述的方法的局限性包括药物的装填能力、结合物的制备和表征的复杂性、以及受体的减量调节。因此，仍然需要一种将诸如araC这样的药物递送到肝脏的方法。

附图说明

图1a示出了在0时间点，以100mg/kg CE的剂量给予雄性NIHSwiss小鼠化合物A和化合物B时，araCTP在肝脏中的水平。

图1b示出了在0时间点，以100mg/kg CE的剂量给予雄性NIHSwiss小鼠化合物A和化合物B时，药物前体在血浆中的水平。

图1c示出了在0时间点，以100mg/kg CE的剂量给予雄性NIHSwiss小鼠化合物A和化合物B时，araC在血浆中的水平。

图2a示出了通过连续静脉(i.v.)注射给予化合物A、化合物B或化合物C后，araCTP在肝脏中的水平。

图2b示出了用化合物A或化合物B处理后，肝脏araCTP的剂量响应。

图3a示出了在通过每日腹膜内(IP)注射用araC以剂量30-1000mg/kg CE处理5天的小鼠中，以初始重量的百分数表示的体重随时间的函数。

图3b示出了在通过每日腹膜内(IP)注射用化合物C以剂量30-1000mg/kg CE处理5天的小鼠中，以初始重量的百分数表示的体重随时间的函数。

图4a示出了相对于含盐载体，用araC或化合物C处理5天后的血液学终点。有核骨髓细胞。

图4b示出了相对于盐水载体，用araC或化合物C处理5天后的血液学终点。外周血多核细胞(PMN’s)。

图4c示出了相对于盐水载体，用araC或化合物C处理5天后的血液学终点。外周血单核细胞。

图4d示出了相对于盐水载体，用araC或化合物C处理5天后的血液学 终点。血小板。

发明内容

本发明涉及新颖的1，3丙烷-1-芳基二醇的阿糖胞苷单磷酸盐(araCMP)环状二酯及其制备方法和用途。更具体地说，本发明涉及具有顺式立体化学构型的1，3丙烷-1-(4-吡啶基)二醇的阿糖胞苷单磷酸盐(araCMP)环状二酯的领域。

本发明的一个方面涉及化学式I的化合物、及其药用(药学上)可接受的药物前体和盐：

化学式I

其中：

M和V彼此互为顺式，而MH是阿糖胞苷；

阿糖胞苷的5’氧与磷相连；

V是4-吡啶基。

在另一方面，本发明涉及化学式III的化合物、及其药用可接受的药物前体及其盐类：

化学式III。

本发明的另一方面涉及用于制备化学式III的化合物的方法：

化学式III

其中：

阿糖胞苷的5’氧与磷相连，其包括偶联化学式IV的磷酸化剂，以及可选保护的阿糖胞苷；

化学式IV

其中，L选自由氯、以及4-硝基苯氧基组成的组。

定义

根据本发明以及如本文中所用，除非有清晰的叙述，以下的术语都按照以下的含义来定义。

术语“顺式”立体化学结构指的是在6环结构上的V基团和M基团位置的关系。以下化学式示出了顺式立体化学结构。

另一种顺式(cis)立体化学结构应为在平面上方指示的V和M。以下化学式示出了顺式立体化学结构。

术语“S-构型”、“S-异构体”、和S-药物前体”指的是碳C’的绝对构型S。以下化学式示出了S-立体化学结构。

术语“R-构型”、“R-异构体”、和R-药物前体”指的是碳C’的绝对构型R。以下化学式示出了R-立体化学结构。

术语“对映体过量百分比(％ee)”指的是光学纯度。它使用下面的等式获得：

$\frac{\left[R\right]-\left[S\right]}{\left[R\right]+\left[S\right]}\×100=\%R-\%S$

其中，[R]为R异构体的量，而[S]为S异构体的量。该等式给出了当R为主异构体时的％ee。

术语“立构中心”指的是

术语“d.e.”指的是非对映体过量。它使用下面的等式获得：

$\frac{\left[\mathrm{cis}\right]-\left[\mathrm{trans}\right]}{\left[\mathrm{cis}\right]+\left[\mathrm{trans}\right]}\×100=\%\left[\mathrm{cis}\right]-\%\left[\mathrm{trans}\right]$

术语“非对映异构体”指的是带有两个或多个非对称中心的化合物，该非对称中心具有相同的取代基并进行相同类型的化学反应，其中非对应异构体具有不同的物理特性，具有占据不同的空间位置的取代基，以及具有不同的生物性能。

术语“外消旋的”指的是一种化合物或混合物，该化合物或混合物由相同数量的对映体分子形式的分子组成，并且这些分子无光学活性。

术语“对映体”指的是具有彼此镜像关系结构的一对分子中任何一个分子。

术语“卤素”指的是氯化物、溴化物、碘化物、或氟化物。

术语“烷基”指的是饱和的脂族基团，包括直链、支链以及环状基团。适宜的烷基基团包括甲基、乙基、异丙基、以及环丙基。

术语“芳基”指的是具有5-6个环状原子的芳香基团。适宜的芳基基团包括苯基、呋喃基、吡啶基、以及噻吩基。芳基基团可以被取代。

术语“芳氧基”指的是基团芳基-O-。

术语“低级”在本文中指的是与有机基或化合物相连分别限定，如具有小于等于10、优选小于等于6、最好是1～4个碳原子。这样的基团可以是直链基团、支链基团或环链基团。

术语“可选取代的”或“取代的”包括被1～2取代基取代的芳基基团，独立地选自低级烷基、低级芳基、以及卤素。优选地，这些取代基选自由卤素组成的组。

术语“药用可接受的盐”包括化学式为I的化合物的盐类，以及获自本发明的化合物与有机酸或无机酸或碱的结合的药物前体。合适的酸包括乙酸、己二酸、苯磺酸、(+)-7，7-二甲基-2-氧双环[2.2.1]庚烷-1-甲磺酸、柠檬酸、1，2-乙二磺酸、十二磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡萄糖酸、葡糖苷酸、马尿酸、盐酸半乙醇酸、HBr、HCl、HI、2-羟基乙磺酸、乳酸、乳糖酸、马来酸、甲磺酸、甲溴酸、甲基硫酸、2-萘磺酸、硝酸、油酸、4，4’-亚甲基双[3-羟基-2-萘羧酸]、磷酸、多半乳糖醛酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、磺基水杨酸、丹宁酸、酒石酸、对苯二酸、和对甲苯磺酸。

本文中使用的术语“药物前体”指的是当被给予到生物系统中后，由于自发化学反应、酶催化化学反应、和/或代谢化学反应、或各种反应相结合而生成生物活性化合物的任意M化合物。标准的药物前体使用连接到与药物相关联的官能团(例如，HO-、HS-、HOOC-、R₂N-)上的基团制成，这些基团在体内会断开。标准的药物前体包括但不限于羧酸酯，其中，基团为烷基、芳基、芳烷基、酰氧基烷基、烷氧基羰氧基烷基、以及羟基、硫羟、氨基的酯，在这样的酯中，相连的基团为酰基、烷氧基羰基、氨基羰基、磷酸酯或硫酸酯。所示出的基团仅仅是举例，并不穷尽，本领域技术人员可制备出其他公知的各种药物前体。化学式为I的化合物的药物前体都落入到本发明的保护范围之中。药物前体必须进行某些形式的化学变化，以产生具有生物活性的化合物，或生成生物活性化合物的前提。在某些情况下，药物前体具有的生物活性通常低于药物本身，并通过改善口服生物利用率、药效半寿期等等而提高了药物的功效或安全性。生物活性化合物包括抗癌剂、和抗病毒剂。阿糖胞苷的特定药物前体，例如，N⁴-酰化阿糖胞苷(Wechter et al.，J.Med.Chem.19(8)，1013(1976))，其中，酰化的基团是棕榈酰或山萮炔酰，被认为可以提高脂类溶解度和膜运输，以及通过胞苷脱氨基酶降低脱氨基作用。其他位于N⁴的基团被认为是诸如亚烷基(即，含亚氨基基团)。在体内将这些基团除去以产生阿糖胞苷的4-氨基基团。预期类似的药物前体可用于本发明的药物前体。

术语“环状的1’，3’-丙烷酯”、“环状的1，3-丙烷酯”、“环状的1’，3’-炔丙酯”、以及“环状的1，3-炔丙酯”，如下所示：

术语“4-吡啶基”、“吡啶-4-基”和“4-吡啶基”指的是下面的基团：

术语“5’氧”指的是如下所示的氧：

术语“含N杂芳基溶剂”是指带有1～3个作为成环原子的氮原子的杂芳基，4＜pka＜6，以及与非含N杂芳基溶剂的任意混合物。

术语“含N-羟基-氮的杂芳基”指的是羟基与氮原子相连的含N杂芳基。一个实例是N-羟基-苯并三唑。

术语“含N杂芳基”是指带有1～3个作为成环原子的氮原子并通过碳原子连接的杂芳基基团。

术语“吸电子基团”在本技术领域中被普遍接受，指的是取代基具有从相邻原子吸引价电子的趋势，即，该取代基相对于相邻原子来说是负电性的。吸电子能力的量化通过Hammett(σ)常数给出。该公知常数在许多文献中都有描述，例如，J.March，AdvancedOrganic Chemistry，McGraw Hill Book Company，New York，(1997edition)pp.251-259。对于给电子基团，Hammett常数的值通常为负值(NH₂的σ_p＝-0.66)，而吸电子基团为正值(硝基的σ_p＝0.78)，σ_p表示对位取代。吸电子基团的实例包括硝基、酮、醛、磺酰基、三氟甲基、-CN、氯化物等等。

术语“离去基团”指的是在反应中断开时不包含在反应过程中提供键合的磷的底物分子部分。

术语“P450”指的是细胞色素P-450。P450酶被大量发现存在于肝脏和其他包含这些酶的组织中。特定的P450同工酶负责氧化本发明的环状膦酸酯，以使游离的膦酸酯或磷酸盐最终被制成。P450酶在哺乳动物的组织和细胞中被发现。

术语“表达P450的组织”指的是肝脏和其他相似组织及细胞中，包含被发现用于氧化本发明的环状药物前体的CYP3A4同工酶或任何其他P450同工酶。根据De Waziers et al.(J.Pharm.Exp.Ther.，253，387-394(1990))，CYP3A4位于下列人体组织内(通过免疫印迹法和/或酶测量法来确定)：

组织                   肝脏活性％

肝脏                    100

十二指肠                50

空肠                    30

回肠                    10

结肠                    ＜5

胃                      ＜5

食道                    ＜5

肾脏                    不可测量

术语“表达P450的组织中的疾病”指的是多种疾病，在此表达P450组织的功能是折衷的，以使这些组织不再能够进行其新陈代谢的功能。这将导致生物化学最终产物的生产过剩或减少。这些疾病可以包括肝脏的疾病如原发性或转移性肝癌(例如，HCC)、肝纤维症、或肝硬化；这些疾病还可以涉及肝脏的疾病而且涉及表达P450的组织的疾病，可以包括原发性或转移性结肠直肠癌、高脂血、糖尿病、以及病毒感染和寄生虫感染。

术语“可选保护的阿糖胞苷”指的是通过标准保护基保护的阿糖胞苷的2’和3’羟基和4-氮基。

术语“增强”指的是增加或提高特定的性能。

术语“富集”指的是增加由反应所生成的特定异构体的数量。

术语“同时给予”指的是在给予一种药物的同时或接近同时给予另外一种药物。优选地，彼此时间间隔在30分钟内。

术语“治疗指数”(“TI”)指的是药物或药物前体的剂量比率，相对于产生不理想反(如死亡、指示毒性的标记物升高、和/或药理学副作用)的剂量而言，产生治疗上有益的反应。

术语“症状缓解”指的是消除或减轻疾病症状的严重性。

术语“未患癌症”指的是缺乏指示恶性肿瘤(癌症)存在或转移到其他组织或器官中的证据。

以下是本说明书和权利要求书中所提及的已为人公知的药物。同时还提供了缩写和常用名。

CH₂CL₂；二氯甲烷或亚甲基氯化物

DCM；二氯甲烷或亚甲基氯化物

(-)-DIP-CL；(-)-β-氯二异丙基莰烯硼烷

DMAP；4-二甲基氨基吡啶

DMF；二甲基甲酰胺

DMPU；1，3-二甲基-3，4，5，6-四氢-2(1H)-嘧啶酮

DMSO；二甲基亚砜

HCl；盐酸

KI；碘化钾

MgSO₄；硫酸镁

MTBE；叔丁基甲醚

NaCl；氯化钠

NaOH；氢氧化钠

P450；细胞色素P450

PyBOP；六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻

TBDMSCL；TBSCL；叔丁基二甲基氯硅烷

TBS；TBDMS；叔丁基二甲基甲硅烷基

TEA；三乙胺

THF；四氢呋喃

TMSCL；三甲基氯硅烷

5’-O-顺-[4-(4-吡啶基)-1，3，2-二氧杂磷杂环己-2-氧代-2-基]-胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷；2(1H)-嘧啶酮，4-氨基-1-[5-O-顺式-[2-氧化(oxido)-4-(4-吡啶基)-1，3，2-二氧杂磷杂环己-2-基]-β-D-阿拉伯呋喃糖基]

以下是本说明书和权利要求书中所提及的已为人公知的药物。同时还提供了缩写和常用名。

阿糖胞苷；1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)胞嘧啶；araC

发明内容

本发明涉及5’-O-顺-[4-(4-吡啶基)-1，3，2-二氧杂磷杂环己-2-氧代-2-基]-胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷化合物及其在治疗肝脏疾病中的应用。在一个方面，肝脏疾病选自由病毒感染和肝癌组成的组。在另一方面，肝癌是肝细胞癌。在第二方面，肝癌是结肠直肠癌。在一个方面，5’-O-顺-[4-(4-吡啶基)-1，3，2-二氧杂磷杂环己-2-氧代-2-基]-胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷化合物的异构体是碳C’具有S构型的异构体。在另一方面，本发明还涉及用于合成5’-O-顺-[4-(4-吡啶基)-1，3，2-二氧杂磷杂环己-2-氧代-2-基]-胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷化合物的合成方法。本发明的方法涉及araCMP环状磷酸二酯的两种顺式异构体的合成。在一方面，阿糖胞苷磷酸二酯的顺式异构体是在C’碳具有S构型的阿糖胞苷磷酸二酯的顺式异构体。

很少的疗法在肝癌的治疗中显示出是有效的。在低比例的患者中，在肿瘤轮廓非常分明并且非常小时，外科消融、低温切除、以及乙醇注射的方法以及显示出在肝癌的治疗中有限的效果。然而，大部分患者通过这些疗法治疗结束后肿瘤复发。在另一个方面，本发明还涉及预防在进行过内科或外科治疗的患者中表达P450的肿瘤的癌症复发。

在本发明的另一个方面，本发明优选的药物前体用于治疗转移性癌症。在一个方面，转移性癌症是选自源自结肠直肠癌的继发性癌症。

用于治疗复发性癌症的方法

将肝细胞癌症患者利用多种方法进行鉴别和监测，包括超声图谱、计算机X线断层造影(CT)、核磁共振成像、血管造影术、以及活组织检查。甲胎蛋白(AFP)水平也被用在诊断中，并且可能是抗瘤活性的一个有益指标，尤其是对于患有高的初始AFP水平的患者。这些技术常常在确定治疗方案和患者适当性时是有用的。治疗方案包括肝同位移植(OLT)、外科切除、经皮穿刺注射不同的试剂(包括酒精)、低温治疗、动脉内化疗、动脉穿刺化学栓塞(TACE)、全身化疗、放疗、免疫疗法、以及激素治疗。小于1cm的肿瘤通常是不能被诊断出来的。经过外科方法治疗(OLT或外科切除)的患者在进行该疗法后可能不会显示出肿瘤可观察到的迹象。类似地，经过非外科方法治疗如消融治疗(乙醇、微波、射频)和TACE的患者可能还显示出肿瘤的大小显著减小并且看似没有肿瘤。患者还可采用微球体(用钇-90放射标记的微玻璃珠)的方法进行治疗，药物递送载体如由铁组成的微粒，可以利用外部磁体被定位到肿瘤上，直接注射的化疗试剂如凝胶状的顺铂、靶向HCC肿瘤的药物如阿霉素、以及在乙醇消融中使用的化学试剂(像阿霉素)。其他的化疗试剂同样也可用作潜在的最初的全身治疗处理，包括抗血管生成剂；胸苷酸合成酶抑制剂(如，诺拉曲特(thymitaq))；微管蛋白聚合抑制剂(如，T67)；各种拓扑异构酶抑制剂(例如，诸如依喜替康这样的来自tecan类的药物)；包括顺铂、干扰素、阿霉素(adriamycina)和5-FU的药物组合物。

HCC的所有治疗方法都与癌症复发的高发病率有关。复发性癌症可能由于一种或多种原因而发生。例如，继发性肝内转移时常由于其尺寸(＜1cm)而导致在手术中不能被检测到。门静脉或肝静脉发病的患者预后不佳，这是由于肿瘤可能已经接种其他的肝叶。这些微小转移的尺寸增加并增殖以及尤其易受本发明的药物前体的影响。导致复发性疾病第二个因素是由于原发性肿瘤的不完全切除或消融所致。与肝脏的环境(肝硬化、病毒感染)的第三因素可以使得肝脏对于“新”的原发性肿瘤处于高风险中，其中“新”的原发性肿瘤在治疗时已经存在，但是未被检测出。

为了预防和延迟复发性癌症，本发明的药物前体可被预期用于上述治疗之前、期间、或之后。在1-2年期间，该治疗需要给予HCC患者本发明的药物前体1-10个周期，优选地，3-6个周期。一个周期需要一个能够在延缓或预防肿瘤生长的过程中显示出有效的治疗过程。在本发明的一个方面，该治疗需要连续输注药物前体7-14天，接着，停药至少14天(一个周期)。将患者进行超时监测。药物前体导致癌症排除时间增加、生存期提高、和/或生活质量改善。

用于治疗白血病的方法

将阿糖胞苷用于治疗各种白血病。典型地，阿糖胞苷被以100-200mg/m²/天的剂量给药，连续给药高达7天后，停药几周，这是由于阿糖胞苷诱导的骨髓抑制而致。典型地，将3或更多的周期用于治疗白血病患者。还由于各种原因已经使用高剂量服法(例如，3gm/m²)。总之，由于阿糖胞苷的快速代谢而需要更高的药物水平，以使主要需要araC去氨基成为无活性代谢物araU。认为延长递送对于利用细胞周期依赖性溶瘤细胞如阿糖胞苷治疗癌症最佳。阿糖胞苷至少是部分有效的，这是由于其抑制DNA合成的能力、其抑制DNA聚合酶的能力，和/或导致在DNA聚合酶催化结合之后生长的DNA链的链终止。作为DNA合成的抑制剂，或许由于对其并入DNA的要求而致araC在细胞周期的S期具有其最大的细胞毒作用，以及在S期合成代谢酶的活性较强。因此，细胞暴露到araC的期间直接与细胞的杀伤相关，这是因为更长的暴露时间允许araC当其通过S期时被并入较大比例的细胞的DNA中。

利用较高剂量或araC或长期治疗的患者由于各种araC相关的毒性而致使处于危险中。此外，某些患者尤其可能处于阿糖胞苷毒性的危险中，例如，老年肝损伤患者。毒性包括骨髓抑制、胃肠上皮溃疡、肝内胆汁淤积、胰腺炎、小脑和大脑功能障碍、及结膜炎。

本发明的药物前体被预期能够减少一些这些剂量限制毒性。特别而言，在药物前体激活后在肝中产生并释放的araC将提供一种用于实现具有更少毒性的抗白血病活性。本发明的药物前体不必达到导致小脑和大脑功能障碍、结膜炎毒性的高峰值水平，便可达到稳定的状态水平。这种药物前体还提供了一种阿糖胞苷的给药方法，可以减少与注射部位有关的副作用。阿糖胞苷从药物前体中的持续释放可以改变定量服法，从连续输注变成静脉输注或短期输注、皮下输注、肌肉内输注、口服等等。骨髓抑制可以仍与治疗有关。多种机制可以被用于减少药物前体的骨髓抑制活性，包括药物假期、骨髓移植、或增加骨髓造血细胞激活的试剂，例如，白介素-3(IL-3)、GM-CSF、G-CSF、红细胞生成素。

增加的治疗指数

多种毒性还几乎与所有的抗癌试剂有关。为了在治疗原发性和继发性肝癌的过程中减少这些毒性，有时药物直接被投药到门动脉，其目的是增加肝脏药物暴露。由于溶瘤细胞药物通常与显著的副作用有关，因此局部给药使肝的摄取更高，从而减少肝外毒性。为了进一步增加肝的摄取，有时将化学栓塞形成与肝动脉输注一起使用。类似地，本发明中的药物前体对于肝的高特异性表明通过这种新颖的药物前体方法将全身副作用最小化。

而且，尤其是原发性和继发性肝癌对于化疗和放疗具有抗性。虽然用于抵抗的机制还未被完全理解，但它可能由于增加的肝基因产物而致，增加的肝基因产物导致化疗试剂的快速新陈代谢和/或排出。另外，通常与异型生物质的代谢和细胞毒中间产物的产生有关的肝脏本来具备多个保护性机制，以使来自这些中间产物的损坏被最小化。例如，相对于其他组织而言，在肝细胞中谷胱甘肽的浓度非常高，这样推测起来能够烷基化蛋白质和DNA的中间产物通过快速的细胞内反应而排除毒性。因而，肝脏可以因为上述这些机制而对化疗试剂具有抗性，因此需要比普通溶瘤细胞试剂浓度更高的浓度以获得成功。较高的肝浓度需要较高的药物剂量，其通常会导致肝外毒性。

本发明中的药物前体能够显著增加阿糖胞苷的治疗指数(“TI”)。在许多情况下，增加的TI是高的肝特异性造成的。例如，由于低的激酶水平，阿糖胞苷在肝脏内很少被磷酸化。然而，激酶在毒性靶器官中却能够高表达(例如，骨髓)，其导致相关的剂量限制毒性。因而，araC环状药物前体通过特异性地将更高浓度的araCTP递送到表达CYP3A4的肝和HCC细胞中，为增加araC在肝脏中的疗效提供可能。

药物前体分裂的高肝特异性表明药物前体分裂的副产物最初还是在肝中产生。相应地，与副产物相关的毒性被降至最低限度，这是因为副产物通常发生快速的解毒反应，这样便会消除和最小化副产物的毒性，例如，在副产物与化合物和/或存在于肝细胞中的蛋白质之间发生的反应(例如，谷胱甘肽和由药物前体分解所产生的α，β-不饱和烯烃)。此外，存在于肝脏中的酶还进一步将副产物转化成非毒性化合物(例如，羟基吡啶的氧化和硫酸化，或者α，β-不饱和酮的还原等等)。另外，包含在反应基团和通过药物前体分解所产生的α，β-不饱和的含羰基化合物之间环化反应的分子内反应能够将药物前体的毒性最小化。

将药物前体的细胞毒性利用缺乏P450活性的细胞系容易地进行评价(例如，CYP3A4活性)。

相对于同等剂量的母体药物，可以通过将较高量的生物活性试剂递送到肝脏而达到更高的治疗指数(TI)。通过药物前体和诱导P450活性的试剂联合给药来实现生物活性试剂的肝脏水平的增加，例如，CYP3A4活性(例如，利福平、肾上腺糖皮质激素、苯巴比妥、红霉素)。

改善药物前体稳定性的方法

生物系统中化合物的稳定性对于研制诸如阿糖胞苷这样的细胞毒素药物的药物前体是至关重要的。例如，存在于血浆中的酶缺乏稳定性将导致活性药物在血浆中分解，而不是在表达CYP3A4的靶组织中分解，并且将相应地减低要通过药物前体策略获得的预期的TI。类似地，如果在水溶性介质中缺乏内在的稳定性，将导致药物前体不仅仅在血浆中，而且在该药物前体所能分布到的任何器官中分解，再次导致TI的降低。此外，缺乏稳定性还可能妨害药物开发，这是因为它使活性药物的最终剂型更为不利，特别是，当该药物前体在胃肠外使用时。在一个方面，本发明涉及araCMP的1-(4-吡啶基)-1，3丙二醇药物前体的应用，其目的是改善araCMP药物前体的整体稳定性。在一个方面，araCMP的药物前体是araCMP的顺-(4-吡啶基)药物前体。在另一个方面，araCMP的药物前体是araCMP的药物前体是araCMP的顺-(4-吡啶基)药物前体，其中碳C’具有S构型。

药物前体的稳定性通过监测生物流体(如，血浆、以几个pH并利用不同缓冲试剂缓冲的溶液)中药物前体的分解来确定。

改善的药效半衰期

通过新颖的药物前体方法能够延长阿糖胞苷的药效半衰期，这是因为其能够产生药物一段持续时间并且在某些情况下药物前体的药效半衰期较长。两个特性可以单独地使治疗药物水平保持一段延长的时间，这些导致了药效半衰期的改善。可以通过阻止新陈代谢或消除跟随母体药物的通道来延长药效半衰期。对于一些药物而言，本发明的药物前体能够阻止新陈代谢或消除跟随母体药物的通道，从而能够延长在动物体内的存在时间。例如，阿糖胞苷是用于代谢性酶胞苷脱氨基酶的基质，能够将胞苷转化为尿核苷，同样地，阿糖胞苷被转化为阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶。然而，araCMP的药物前体不是用于这种酶的底物，并且相应地导致与阿糖胞苷的直接给药相比较长的阿糖胞苷的药效半衰期。

消除磷酸盐药物的常规方法是通过肾脏以及可识别阴离子化合物的传输装置。从循环中彻底排除包含药物的磷酸盐通常仅仅在服药后的几分钟内。本发明的药物前体通过除去负电荷来减缓药物的排除，直至在肝脏等组织中氧化和水解之后。

剂型

本发明的化合物以每天约0.1mg/kg至约100mg/kg的每日总剂量进行给药，优选地，约1mg/kg至约30mg/kg。优选的剂量范围是约10mg/kg/每天。该剂量按照需要可以多种分剂量给予。

本发明的化合物当与其他抗病毒剂或溶瘤细胞剂结合使用时，可以按每日剂量或适宜部分的每日剂量(例如，每日两次)进行给药。药物前体的给予可以在给予其他抗病毒剂或溶瘤细胞剂时或接近该时间或在不同时间发生。本发明的化合物可以多种药物服法进行使用，被称作复合治疗或“合剂”治疗，其中，多种试剂可以被同时给药，可以在同时分开给药或以不同时间间隔分开给药，或者顺序地给药。本发明的化合物可以在通过其他试剂的治疗过程之后进行给药，可以在利用其他试剂的治疗过程期间给药，作为治疗服法的一部分给药，或者也可以在治疗程序中通过其他试剂治疗之前进行给药。

本发明的药物前体可以与其他各种试剂结合使用，以便进一步增强疗效和/或减少阿糖胞苷有关的毒性。各种结合被认为可以增强治疗的效果。与认为可有效地抵抗癌症的药物结合可以帮助治疗已经脱逸肝脏并对药物前体治理没有响应的转移性病灶。这种试剂包括选自公知的化学疗法试剂组成的组，公知的化学疗法试剂包括DNA合成的抑制剂(DNA聚合酶抑制剂、脱氮嘧啶通道的抑制剂(例如，胸苷酸合成酶抑制剂、双氢乳清酸酶脱氢酶抑制剂、天冬氨酸氨甲酰转移酶抑制剂)、叶酸抗代谢物(例如，二氢叶酸还原酶、多聚谷氨酸合成酶抑制剂)、嘌呤生物合成抑制剂(肌苷5’-单磷酸盐脱氢酶抑制剂、甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶抑制剂、核糖核苷酸二磷酸还原酶抑制剂、聚胺生物合成抑制剂(例如，S-腺苷-L-蛋氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、亚精胺/精胺N-乙酰基转移酶)、抗癌抗生素、植物碱、法呢基转移酶抑制剂、铂基药物、抗血管生成药物、微管蛋白聚合酶抑制剂等等。

各种公知的药物类别都被认为适合于与本发明的药物前体结合，包括依托泊苷、喜树碱、环蒽霉素、蒽吡唑、康布瑞塔卡汀类似物、烯二炔抗生素、紫杉烷。

在本发明的一方面，依托泊苷优选包括足叶乙甙、替尼泊甙NK-611、GL-331、以及azatoxin。在一个方面，依托泊苷是足叶乙甙和替尼泊甙。在另一方面，这些喜树碱优选包括喜树碱、拓扑替康、伊立替康(CPT-11)、勒托替康(GI 147211)、9-氨基喜树碱、GG-211、DX-8951F、SKF 107874、以及SKF 108025。在另一方面，喜树碱包括喜树碱、拓扑替康、伊立替康、勒托替康、9-氨基喜树碱。在另一方面，喜树碱包括拓扑替康和伊立替康。在一个方面，紫杉烷包括紫杉醇、多西他塞、和FCE-28161。在另一个方面，紫杉烷包括紫杉醇。在一个方面，依托泊苷包括依托泊苷A-4和报导的(S，S)二氧戊环类似物(Bioorg.Med.Chem.Lett.88：1997-2000(1998))。在一个方面，蒽吡唑包括米托恩醌、必散特隆、和Losoxanthrone。在一个方面，环蒽霉素包括阿霉素、道诺霉素、伊达比星、吡喃阿霉素、普卡霉素、瓦耳霉素、放线菌素D、和表阿霉素。在另一个方面，环蒽霉素是道诺霉素、吡喃阿霉素、表阿霉素、和伊达比星。在另一方面，环蒽霉素包括吡喃阿霉素和道诺霉素。在一个方面，烯二炔抗生素包括新制癌菌素、卡奇霉素和esperamicin(十元环烯二炔类)。在另一个方面，烯二炔抗生素包括新制癌菌素、卡奇霉素和esperamicin(十元环烯二炔类)。在另一方面，使用DNA破坏性药物如烷化剂(氮芥、氮丙啶)、亚硝基脲、以及金属络合物。在一个方面，丝裂霉素是优选的。在一个方面，铂络合物包括顺铂、奈达铂、米芮铂、和卡波铂。在一个方面，烷基化剂包括环磷酰胺、异环磷酰胺。在一个方面，亚硝基脲包括卡氮芥氮芥(BCNU)、替莫唑胺。在本发明的优选方面，细胞周期依赖性抑制剂优选包括5-FU、脱氧氟尿苷、吉西他滨、克拉屈滨、氟达拉滨。在一个方面，叶酸抗代谢物包括甲氨蝶呤。在另一个方面，与本发明的药物前体相结合的有益溶瘤细胞药物包括白消安、三胺硫磷、苯丙氨酸氮芥、luroteca。

在一个方面，使用与阿糖胞苷起协同作用的试剂。这些试剂包括烷化剂如环磷酰胺、异环磷酰胺、亚硝脲氮芥(BCNU)、顺铂、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、甲氨蝶呤、6-硫鸟嘌呤、和3-脱氧尿苷。

在另一个方面，本发明的药物前体与已知药物结合以促进细胞循环到S期的进行，从而使它们更易受到本发明的药物前体的影响。

在另一方面，本发明产生的药物前体与某些能够加快促进细胞凋亡的药物相结合，这些药物包括caspase-3抑制剂。

结合疗法需要分别地或同时给予宿主试剂。在一个方面，药物前体与溶瘤细胞药物同时给予。药物可以相同的赋形剂或分别给予。两种药物可以非肠道给药(包括皮下给药、肌内给药、静脉内给药、和皮内给药)、或通过包括口服、直肠给药、鼻给药、局部给药、阴道给药、和经皮给药的其他途径给药。在一个方面，两种试剂可以同时在同一胶囊或单独的丸剂中给药。在另一个方面，两种试剂在进餐时给药(恰好在进食前或进食后)。在另一个方面，药物结合在分开的时间进行给予。在一个方面，除了在周期治疗期间，药物给予被及时进行分离。在另一个方面，一种药物在对于配合使用的药物(partner drug)的药物假期被给予。

溶瘤细胞试剂或抗病毒试剂和本发明的化合物可以分开给予或同时给予。适宜的溶瘤细胞试剂包括白消安、碳铂、顺铂、米芮铂、替莫唑胺、三胺硫磷、苯丙氨酸氮芥、异环磷酰胺、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、阿霉素、道诺霉素、表阿霉素、伊达比星、普卡霉素、戊柔比星、更生霉素、吉西他滨、氟尿苷、氟尿嘧啶、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、氨甲叶酸、丝裂霉素、依托泊苷、紫杉醇、多西紫杉、伊立替康、拓扑替康、依托泊苷、替尼泊苷、奈达铂、卡莫司汀、脱氧氟尿苷、克拉屈滨、氟达拉滨、卡莫司汀、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、azatoxin、喜树碱、勒托替康、喜树碱、9-氨基喜树碱、吡喃阿霉素、新制癌菌素、卡奇霉素、esperamicin(一种十元环烯二炔)、以及luroteca。

就本发明而言，在包含药用可接受的载体、辅助药和赋形剂的剂型中，这些化合物可以通过各种方式给予，包括口服、肠胃外给药，通过吸入喷雾、局部给药、或直肠给药。在此使用的术语“肠胃外的(给药)”包括利用各种输注技术的皮下注射、静脉注射、肌肉注射、以及动脉注射。在此使用的动脉注射和静脉注射包括通过导管给药。通常，静脉注射是优选的。

药用可接受的盐类包括乙酸盐、已二酸盐、苯磺酸盐、溴化物、右旋樟脑磺酸盐、氯化物、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯十二烷基硫酸盐，富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、glucoranate、马尿酸盐、乙内酰脲、氢溴化物、氢氯化物、碘化物、羟乙磺酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、溴化甲烷、硫酸二甲酯、萘磺酸盐、硝酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、磷酸盐、多聚半乳糖醛酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、磺基水杨酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、对苯二甲酸盐、甲苯磺酸盐、以及三乙基碘。

包含活性成分的药用组合物可以是适用于给药预期方法的任何形式存在。例如，当被用于口服时，可以被制备成片剂、锭剂、糖锭、含水混悬液或油状混悬液、可分散散剂或颗粒、乳剂、硬质或软质胶囊、糖浆剂、或酏剂。预期用于口服使用的组合物可以根据现有技术的任何已知方法进行制备，这些已知方法用于制造药用组合物，这种组合物可以包括一种或多种包含甜味剂、矫臭剂、着色剂、和防腐剂，以便提供美味的制剂。适用于制造片剂的与非毒性药用可接受的赋形剂混合的包含活性成分的片剂是可接受的。例如，这些赋形剂可以是惰性稀释剂，如碳酸钙或碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂和崩解剂，如玉蜀黍淀粉、或海藻酸；粘合剂，如淀粉、明胶、或阿拉伯胶；以及润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。这些片剂可以是无覆盖层的或者可以通过已知技术进行涂布，已知的技术包括微囊法以在胃肠道中延迟崩解和吸收，从而提供长期的持续作用。例如，可以单独使用时间延迟材料如甘油单硬脂酸盐或甘油二硬脂酸盐，或者与蜡一起使用。

用于口服使用的剂型还可制成硬质明胶胶囊，在该胶囊中将活性成分混合与惰性固态稀释剂混合，例如，磷酸钙或高岭土，或是是软质明胶胶囊，在该胶囊将活性成分与水和油介质混合，如花生油、液状石蜡、或橄榄油。

本发明的含水混悬液在与适用于制造含水混悬液的混合物中包含活性材料。这种赋形剂包括混悬剂如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪树胶、和阿拉伯树胶，以及分散剂或湿润剂如天然形成的磷脂(例如，卵磷脂)、含有脂肪酸的氧化烯浓缩物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)、具有长链脂肪醇的氧化乙烯的浓缩物(例如，十七烷乙烯氧基十六醇)、含有衍生自脂肪酸和已糖醇酐的偏酯的氧化乙烯浓缩物(例如，聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯)。含水的混悬液也可以包含一种或多种防腐剂如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯、一种或多种着色剂，一种或多种矫臭剂、以及一种或多种甜味剂如蔗糖或糖精。

油状混悬液可以通过在植物油如花生油、橄榄油、芝麻油、或椰子油、或矿物油如液状石蜡中混悬活性成分进行配制。口服混悬液可以包含增稠剂如蜂蜡、硬石蜡、或鲸蜡醇。可以将如上述那些甜味剂、以及矫臭剂加入以提供美味的口服制剂。这些组合物可以通过添加抗氧化剂如抗坏血酸来防腐。

适于通过加入水制备含水混悬液的本发明的可分散粉末和颗粒在与分散剂和润湿剂的混合物中提供活性成分。适宜的分散剂或润湿剂以及悬浮剂如上述实例所示。另外的赋形剂，如甜味剂、矫臭剂和着色剂也可能出现。

本发明的药物组合物也可能以水包油状乳胶的形式存在。在含油相可能是植物油如橄榄油或花生油、矿物油如液体石蜡、或其混合物。适宜的乳化剂包括天然存在的树胶如阿拉伯树胶和黄芪树胶、天然存在的磷脂如大豆卵磷脂，或衍生自脂肪酸和已糖醇酸酐的酯或偏酯如山梨糖醇酐单油酸酯，以及这些偏酯与氧化乙烯的浓缩物如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。乳剂也可以包含甜味剂及矫臭剂。

糖浆剂和酏剂可以利用甜味剂如甘油、山梨糖醇、或蔗糖配制。这类剂型也可能包含缓和剂、防腐剂、矫臭剂、或着色剂。

本发明的药物组合物可以无菌可注射制剂如无菌可注射的含水或含有混悬液的形式存在。该混悬液可以利用上述那些适宜的分散剂或润湿剂以及混悬剂根据已知技术进行配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中无菌可注射溶液或混悬液，如在1，3-丁二醇中的溶液或制成冻干的粉末。可以使用的可接受载体或溶剂是水、格氏(Ringer)溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌不挥发油通常可以被用作溶剂或混悬剂介质。为此，可以使用刺激性小的任何不挥发油，包括合成单酸甘油酯或甘油二酯。此外，同样可以将脂肪酸如油酸用于可注射制剂。

可以与载体材料结合以产生单剂型的活性成分的数量将根据所治疗宿主和给药的特定方式而改变。例如，用于人类口服给药的缓释剂型可以包含20至2000μmol(约10至1000mg)的与适当且适宜量的载体材料(可以从总组合物的约5％至约95％变化)混合的活性材料。优选的是，所制备的药物组合可提供易于测量的给药量。例如，用于静脉输注的含水溶液应该包含每毫升约0.05至50μmol(大约0.025到25mg)的溶液活性成分，目的在于可以约30mL/小时的速率进行适宜体积的输注。

如上所述，可以将适于口服给药的本发明剂型制成分离的单元如胶囊、扁囊剂或片剂，每种均包含预定量的活性成分；制成粉末或颗粒；制成溶液或在含水或非含水液体中的混悬液；或者制成水包油液态乳剂或油包水液态乳剂。活性成分也可以通过大丸剂、药糖剂、或糊剂给予。

片剂可以通过压缩或模压来制备，可选地具有一种或多种辅助成分。压缩的片剂可以在适合的机器上通过压缩来制备，活性组分以易流动形式存在，如散剂或颗粒，可选地与粘合剂(例如，聚烯吡酮、明胶、羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，淀粉羟基乙酸钠、交联的聚烯吡酮、交联的羧甲基钠纤维素)、表面活性剂或分散剂。模制的片剂可以在合适的机器中通过模制用活性液体稀释剂湿润的粉末化合物的混合物而制造。这些片剂可选地进行涂布或刻痕并可以进行配制，以便提供在其中使用的活性组分的缓释或控释，例如，各不相同比例的羟丙基甲基纤维素以提供所需要的释放轮廓。这些片剂可选地提供有肠溶衣，以便在肠部分释放而不是在胃部分释放。这在这种化合物易受酸解影响时是尤为有利的。

适合于在口中局部给药的剂型包括锭剂，包含香味基质的活性组分，通常为蔗糖、阿拉伯树胶或黄芪树胶；软锭剂，包含惰性基质活性成分，如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯树胶；漱口药，包含活性成分适宜的液体载体中的活性组分。

用于直肠给药剂型可以为具有合适基质的栓剂，例如，该基质包括可可豆脂或水杨酸盐。

用于阴道给药的剂型可以为阴道栓剂、棉塞、膏状物、凝胶体、糊剂、泡沫或喷雾剂型，除了活性成分外，含有在技术中被认为是适合的这类载体。

用于肠胃外给药剂型包括含水和非含水等渗无菌注射溶液，可以包括抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、和溶质，其提供与预期接受者的血液等渗的剂型；以及含水和非含水无菌混悬液，可以包括混悬剂和增稠剂。这些剂型可以存在于单位剂量或多剂量密封容器中，例如，安瓿和管瓶，以及可以在要使用前，在冷冻干燥(冻干)条件下贮存，该条件仅需要加入无菌液体载体，例如用于注射的水。注射溶液和混悬液可以由如前所述种类的无菌粉末、颗粒、和片剂制成。

用于胃肠外给药的剂型可以通过留置泵或通过医院用袋以连续输注方式给药。连续输注包括外部泵的输注。这些输注可以通过Hickman或PICC或者其他适宜的给予胃肠外或静脉内剂型的装置进行。

优选的单位剂量剂型是那些含有药物的每日剂量或单位、每日亚剂量(sub-dose)、或其适宜的部分的剂型。

然而，应当理解的是，用于任何特定患者的特定剂水平将取决于多种因素，包括所用特定化合物的活性；接受治疗个体的年龄、体重、总体健康情况、性别以及饮食；给药时间和途径；排泄率；其他以前给予的药物；以及进行治疗的特定疾病的严重程度，其是本领域技术人员所熟知的。

通过本发明制备的化合物

通过本发明制备的化合物和中间产物是表示为化学式I的araCMP药物前体的6元环磷酸二酯。

化学式I

其中：

M和V彼此互为顺式，而MH是阿糖胞苷；

阿糖胞苷的5’氧原子与该磷原子相连；

V是4-吡啶基；

及药用可接受的药物前体及其盐类。

本发明的另一方面是制备化学式II的化合物：

化学式II

其中：

M和V彼此互为顺式，而MH是阿糖胞苷；

阿糖胞苷的5’氧与磷相连；

V是4-吡啶基；

及药用可接受的药物前体及其盐类。

本发明的另一方面是制备化学式III的化合物以及药用可接受的药物前体及其盐类。

化学式III

1.0磷酸化试剂的合成：

已知有多种制备1，3-二醇的合成方法。这些方法分为两种类型：1)外消旋型1-(芳基)-1，3-丙二醇的合成；2)富对映体型1-(芳基)-1，3-丙二醇的合成。

1.1外消旋型1-(芳基)-1，3-丙二醇的合成：

1，3-二羟基化合物可通过文献中的多种已知方法进行合成。可利用取代的芳族醛通过加入烷基乙酸酯的烯醇锂、然后还原酯，合成出外消旋型1-(芳基)-1，3-丙二醇(路线A)(Turner，J.Org.Chem.55：4744(1990))。或者，将芳基格式试剂加入1-羟基-3-丙醛同样能生成1-(取代的芳基)-1，3-丙二醇(路线B)。该方法能将各种取代的芳基卤转变为1-(取代的芳基)-1，3-丙二醇(Coppi，et al.，J.Org.Chem.53：911(1988))。通过1，3-二氧杂环己-4-烯(1，3-diox-4-ene)的Heck偶联、然后通过还原和水解，该芳基卤还能用来合成1-取代的丙二醇(Sakamoto，et al.，Tetrahedron Lett.33：6845(1992))。通过形成N-氧化物、然后在乙酸酐条件下重排，吡啶基、喹啉、异喹啉-3-丙醇的衍生物可被氧化为1-取代-1，3-二醇(路线C)(Yamamoto，et al.，Tetrahedron 37：1871(1981))。通过添加乙烯基Grignard、然后通过氢硼化反应，多种芳族醛也可被转化为1-取代-1，3-二醇(路线D)。

V＝芳基，R＝烷基，R′＝苄基，M＝镁或锂，X＝卤化物或无1.2富对映体型1-(芳基)-1，3-丙二醇的合成

多种周知的通过化学试剂或酶试剂来分离仲醇的方法可用来制备二醇的对映体(Harada，et al.，Tetrahedron Lett.28：4843(1987))。将取代的3-芳基-3-氧代丙酸或丙酯利用过渡金属催化进行氢化反应是一种以高对映体纯度制备β羟基酸或酯的R或S异构体的有效方法(Comprehensive Asymmetric Catalysis，Jacobsen，E.N.，Pfaltz，A.，Yamamoto，H.(Eds)，Springer，(1999)；Asymmetric Catalysis in organicSynthesis，Noyori，R.，John Wiley，(1994))。这些β羟基酸或酯产物可进一步还原而生成所需的高ee的1-(芳基)-1，3-丙二醇(路线A)。可进行高压氢化反应或氢转移反应的β-酮的酸或酯底物可通过多种方法制备，例如，在碱存在的条件下进行苯乙酮与碳酸二甲酯的聚合(Chu，et al.，J.Het Chem.22：1033(1985))，或者通过酯聚合制备(Tuner，et al.，J.Org.Chem.54：4229(1989))，或者利用芳基卤制备(Kobayashi，et al.，Tetrahedron Lett.27：4745(1986))。或者，可通过对β-羟乙基芳基酮的衍生物或者β-酮酸的衍生物进行对映体选择性的硼烷还原而制得具有高对映体纯度的1，3-二醇(路线B)(Ramachandran，et al.，Tetrahedron Lett.38：761(1997))。另一种方法中，在催化不对称环氧作用的条件下，可将市售的肉桂醇转变为环氧醇。利用红铝(Red-Al)将这些环氧醇还原，可生成具有高ee的1，3-二醇(路线C)(Gao，et al.，J.Org.Chem.53：4081(1980))。对映体选择性的醛醇聚合是另外一种用来合成具有高ee的1，3-官能化合物(oxygenated functionality)的方法，该方法从芳族醛开始进行(路线D)(Mukaiyama，Org.React.28：203(1982))。

V＝芳基，R＝烷基或H，R′＝-CH₂OH、CO₂R

就本发明的目的而言，中间产物酮酸酯由化学式A的4-乙酰基吡啶制备。C’是指位于通过本发明所制备的最终化合物中次甲基碳立构中心的碳。

化学式A

化学式A的化合物与碳酸二甲酯反应以获得氧代-丙醇酸甲酯。立构中心的利用Noyori(Fujii et al.，J.Am.Chem.Soc.118(10)：2521-2(1996))的氢转移方法进行安置。氧代-丙醇酸甲酯在富对映体的钌催化剂(10)存在的情况下被还原成羟基酯中间产物，其利用氢化硼钠被进一步还原成富对映体的1，3-丙二醇，如以下化学式B所示：

化学式B

位于碳的立构中心，C’已经在该工艺步骤中被设立，并且贯穿该过程的剩余物保持对映体过量。

1.3磷酸化的试剂的合成

本发明的另一个方面是制备化学式C的磷酸化试剂：

化学式C

其中：

L为离去基团，选自由卤素、由1～3个吸电子基团取代的芳氧基组成的组。

基团L和4-吡啶基彼此互相反式。

化学式C的化合物是外消旋的，在碳C’处具有S构型，或者在碳C’处具有R构型。

化学式C的磷酸化试剂的一般的合成方法是通过1-(4-吡啶基)-1，3-丙二醇与化学式Cl₂P(O)-L的氯代二磷酸酯反应来完成。在一个方面，离去基团L选自卤素、以及由1～3个吸电子基团取代的芳氧基。在另一个方面，离去基团是诸如氯和溴这样的卤素、以及取代的芳氧基如氯代苯氧基、二氯苯氧基、或硝基苯氧基。在另一个方面，离去基团是氯代、4-氯苯氧基、3，5-二氯苯氧基、以及4-硝基苯氧基。氯代二磷酸酯(其中，L为芳氧基)是通过将取代的苯酚与磷酰氯反应而合成得到(Rathore et al.，Indian J.Chem B32(10)，1066(1993))。

富对映体型活性磷酸化试剂通过在碱存在的条件下，利用化学为式L-P(O)Cl₂的氯代二磷酸酯对富对映体型1-(V)-1，3-丙二醇进行磷酸化作用而合成得到(Ferroni et al.J.Org.Chem.64(13)，4943(1999))。一方面，添加的顺序包括将二醇和碱的溶液加入到氯代二磷酸酯溶于选定溶剂中的溶液中。另一方面，将二醇和碱的溶液、以及另一种包含溶于相同溶剂或不同溶剂中的氯代二磷酸酯的溶液同时加入到一种选定溶剂中。再一方面，将二醇溶液加入到磷试剂的溶液中，然后加入碱。用于二醇的磷酸化的典型溶剂是极性非质子溶剂，它与氯代二磷酸酯的反应性较低，并能够溶剂二醇或者氯代二磷酸酯。一方面，可进行磷酸化反应的溶剂为二氯甲烷、THF、乙腈、吡啶、四烷基脲、磷酸三烷基酯、或六烷基磷酸三酰胺。另一方面，这些溶剂为二氯甲烷、THF、乙腈、吡啶、DMPU、DMEU、四甲基脲、磷酸三甲基酯、六甲基磷酸三酰胺。应保持低的反应温度，尤其是在反应的开始阶段过程中(在该过程中会放热)，从而保持试剂的完整性。一方面，温度可低于室温-20℃～10℃。一方面，可对放热进行控制，使反应温度缓慢升至室温，从而完成磷酸化试剂的形成。另一方面，保持温度不变直至完成反应，以保持试剂的完整性。由于磷原子的手性特性，氯代二磷酸酯在上述的反应条件下与二醇反应将生成顺式和反式异构体的混合物，稍稍偏向于生成顺式异构体。典型的顺/反比的范围为50/50～60/40。顺式和反式异构体利用柱层析法和/或结晶法的结合来分离。在本发明的一个方面中，我们发现，当将所分离出来的4-硝基苯氧基磷酸化试剂的顺式异构体与4-硝基苯酚的盐一起加热时，分离出的磷酸化试剂中超过85％的是反式异构体。在本发明的另一方面中，我们发现，当将所分离出的4-硝基苯氧基磷酸化试剂的顺式和反式异构体的混合物与4-硝基苯酚的盐一起加热时，在与磷酸化步骤中使用的溶剂相同的溶剂或另一溶剂中，分离出的磷酸化试剂中超过85％的为反式异构体。而且，我们发现，不需要为了实现富集化而预先对混合物进行分离。因而，将苯酚离去基团的盐加入到在其中生成芳氧基磷酸化试剂的原始反应混合物中实现了化学式为I的反式异构体的富集化，其比例与针对磷酸化试剂的已分离混合物进行富集化所得相同。同样地，当对化学式为I的化合物的顺式和反式氯代磷酸酯(phosphorochloridate)的等摩尔混合物进行加热时，只有反式异构体能分离出来。苯酚盐可通过将相应的苯酚与碱(优选为三烷基胺)、含氮杂环或钠反应生成。一方面，碱为三乙胺、二异丙基乙胺、吡啶、DABCO、DBU、氢化钠、或碱金属。另一方面，碱为三乙胺、DBU、或苯酚的钠盐。富集化步骤可在室温下进行，但通常都会进行加热以缩短反应时间，优选温度范围为40℃～70℃。虽然芳氧基磷酸化试剂的转变要求加入相应苯氧化物的盐，但富对映体的二醇的氯代磷酸酯转变不要求必须使用额外的可溶性盐酸盐，这是因为形成的氯代磷酸酯本身与优选的碱就可生成两当量的氯离子。一方面，在完成了二醇的磷酸化后，然后对反应混合物加热(优选温度范围为40℃～70℃)，从而将顺式异构体完全转化成反式异构体。另一方面，保持添加试剂时的温度不变。

对由富对映体的二醇制备富对映体的磷酸化试剂来说，保持化学式为I的化合物中碳原子C’上的手性至关重要。虽然对于大多数富对映体的二醇来说，碳原子C’的差向异构作用微乎其微，但对使用前述反应条件的多种二醇测得的ee下降了。尤其麻烦的是，1-(含氮杂芳基)-1，3-丙二醇中二醇的初始ee为98％，但在分离得到的反式磷酸化试剂中时降至低于85％。在本发明的一个方面中，已经发现，含氮杂芳基溶剂的使用可将反式磷酸化试剂的ee保持在95％以上。一方面，该含氮杂芳基溶剂为可选取代的吡啶、喹啉、和吡嗪。另一方面，该含氮杂芳基溶剂为吡啶。在本发明的另一方面中，已经发现，在加入氯代二磷酸酯或磷酰氯、然后加入碱之前形成1-(含氮杂芳基)-1，3-丙二醇的盐，可帮助防止C’碳原子的差向异构作用，而不需要使用含氮杂芳基溶剂。一发明，1-(含氮杂芳基)-1，3-丙二醇的盐指的是通过将1-(含氮杂芳基)-1，3-丙二醇与pka＜2的有机酸或无机酸反应制得的盐。另一方面，该盐是与pka＜1的无机酸反应制得的盐。再一方面，该盐是盐酸盐和溴酸盐。顺式和反式异构体通过柱层析法和/或结晶法的结合进行分离。然而，已经发现，在进行富集化步骤之后，因为生成了高纯度(＞95％的反式异构体，并且ee＞95％)的磷酸化试剂，使得反式异构体的分离得到大大简化。一方面，可分离出反式磷酸化试剂。另一方面，可将磷酸化试剂保持于溶液中，并在不进行提纯的情况下用来对核苷进行磷酸化。相应的磷原子的构型通过比较³¹P NMR光谱来确定。近赤道磷氧部分(反式异构体)的化学位移比轴向异构体(顺式异构体)更向前(Verkade，et al.，J.Org.Chem.42，1549(1977))。

2.0araCMP的顺式-药物前体的合成

对于化学式为I的顺式药物前体的合成，药物前体部分可在合成过程的不同阶段时引入。由于环磷酸酯对于各种反应条件一般来说都很敏感，因此通常它们都是在靠后的阶段引入。根据存在于化合物中的功能团，还可以通过使用受保护或未受保护的核苷或核苷类似物来进行合成。顺式药物前体的单一立体异构体可以通过柱层析法和/或结晶法的结合对非对映体进行分离而制得，或者可以通过采用富对映体的磷酸化试剂对映体指定(enantiospecific)合成制得。

2.1阿糖胞苷的保护

披露于文献中(例如，U.S.3,116,282；Shen et al.，J.Org.Chem.30：835-838(1965)；Hessler，J.Org.Chem.41(10)：1828-1831(1976))中的araC的各种制剂(Merck Index 11^th Edition NO.2790)及其相似物是本领域技术人员所熟知的。

商业可获自的阿糖胞苷包括但不仅限于，Shanghai FreemanInternational Trading Co.(上海国际自由人贸易有限公司)，Brantford，Sigma，Fluka，以及Sunray Pharmaceuticals。

一般的受保护核苷的磷酸化过程通过将适当保护的核苷与碱反应、并将所生成的烷氧基化合物(alkoxide)与磷酸化试剂进行反应而实现。本领域技术人员可以使用多种核苷保护方法(GreeneT.W.，Protective Groups in Organic Chemistry，John Wiley & Sons，New York(1999))来制备受保护核苷。核苷被保护的方式是暴露出羟基(上面可加入磷酸酯基团)，同时保护了核苷上所有的剩余羟基和其他官能团，而这些基团可能会干扰磷酸化步骤，或者导致区域性异构体现象。一方面，所选的保护基团对于强碱具有抵抗力，例如，醚类和甲硅烷基醚。另一方面，保护基团是可选取代的MOM醚、MEM醚、和三甲基甲硅烷基醚。另一方面，保护基团为叔丁基二甲基硅烷基醚。另外，保护还能掩蔽阿糖胞苷的4-氮，从而除去了任何酸性质子(acidic proton)。一方面，选出的N保护基团是选自二甲基甲脒、单甲基和二甲基亚胺、单芳基和二芳基亚胺。一方面，N保护基团选自二甲基甲脒、单甲基亚胺和单芳基亚胺。一方面，单烷基亚胺是苯甲基亚胺，而单芳基亚胺是苯亚胺。另一方面，N保护基团为选自二甲基甲脒和二乙基甲脒的对称二烷基甲脒。

一方面，阿糖胞苷的保护通过以下四个步骤完成。阿糖胞苷在DMPU中利用苯甲酰氯进行处理以获得安息香酸酯。该酯与叔丁基二甲基硅烷基氯一起进行加热，以获得二甲硅基化合物和单甲硅烷基化合物的混合物。粗混合物用乙醇肼进行处理以分解酯。水溶液工作流程合提纯作为单个实体得到的所需2’，3’-二甲基硅烷基阿糖胞苷为盐酸盐。将其与二甲基甲酰胺、二甲基乙缩醛混合以生成如化学式D所示的受保护的阿糖胞苷甲脒：

化学式D

2.2受保护的阿糖胞苷的磷酸化

羟基暴露的适当保护核苷的烷氧基化合物的生成过程通过溶于非质子溶剂的碱实现，该溶剂对于碱不具有敏感性，例如THF、二烷基和环甲脒、醚、甲苯、以及它们的混合物。一方面，溶剂是DMF、DMA、DEF、N-甲基吡咯烷、THF、以及这些溶剂的混合物。

已经使用了多种不同的碱来进行核苷和非核苷化合物与环型和无环磷酸化试剂的磷酸化。举例来说，三烷基胺，例如三乙基胺(Roodsari et al.，J.Org.Chem.64(21)，7727(1999))或者二异丙基乙胺(Meek et al.，J.Am.Chem.Soc.110(7)，2317(1988))；含氮杂环胺，例如，吡啶(Hoefler et al.，Tetrahedron 56(11)，1485(2000))、N-甲基咪(Vankayalapati et al.，J.Chem.Soc.Perk T 1 14，2187(2000))、1，2，4-三吡咯(Takaku et al.，Chem.Lett.(5)，699(1986))或者咪唑(Dyatkinaet al.，Tetrahedron Lett.35(13)，1961(1994))；有机金属碱，例如叔丁基钾(Postel et al.，J.Carbohyd.Chem.19(2)，171(2000))、丁基锂(Torneiro et al.J.Org.Chem.62(18)，6344(1977))、氯化叔丁基镁(Hayakawa et al.，Tetrahedron Lett.2820)，2259(1987))或者LDA(Aleksiuk et al.，J.Chem.Soc.Comm.(1)，11(1993))；无机碱，例如氟化铯(Takaku et al.，Nippon Kagaku Kaishi(10)，1968(1985))、氢化钠(Hanaoka et al.，Heterocycles 23(11)，2927(1985))、碘化钠(Stromberg et al.，J.Nucleos.Nucleot.6(5)，815(1987))、碘(Stromberg et al.，J.Nucleos.Nucleot.6(5)，815(1987))或者氢氧化钠(Attanasi et al.，Phosphorus Sulfur 35(1-2)，63(1988))；金属，例如同(Bhatia et al.，Tetrahedron Lett.28(3)，271(1987))。然而，当使用前述的方法试图进行化学式为I的磷酸化试剂的偶联(coupling)时，磷手性中心上没有观察到发生反应或者产生外消旋作用。尤其是，对于前面所用的与取代的环型磷酸化试剂反应而以高得率生成相应的环型磷酸酯的碱来说，没有观察到有反应发生，例如氢化钠(Thuong et al.，Bull.Soc.Chim.Fr.667(1974))、吡啶(Ayral-Kaloustianet al.，Carbohydr.Res.187(1991))、丁基锂(Hulst et al.，TetrahedronLett.1339(1993))、DBU(Merckling et al.，Tetrahedron Lett.2217(1996))、三乙胺(Hadvary et al.，Helv.Chim.Acta，1986，69(8)，1862)、N-甲基咪唑(Li et al.，Tetrahedron Lett.6615(2001))或甲醇钠(Gorenstein et al.，J.Am.Chem.Soc.5077(1980))。在本发明的一个方面，已经发现，格式试剂的使用促进了磷酸化，同时具有最小的磷中心的差向异构作用。一方面，格式试剂为烷基和芳基格式试剂。另一方面，格式试剂是氯化叔丁基镁和氯化苯基镁。

在本发明的另一方面，烷氧基化合物(alkoxide)镁被用来生成阿糖胞苷的5’-烷氧基化镁。一方面，烷氧基化镁选自Mg(O-t-Bu)₂、和Mg(O-iPr)₂的组。

在本发明的另一方面，路易斯酸可加入5’-烷氧基化镁的溶液(利用前述的一种碱制成)中，用来或者交换烷氧基化合物的碳阳离子，或者用来调节所形成的烷氧基化合物与磷酸化试剂的反应性。路易斯酸的实例包括碱金属盐、稀土盐或过渡金属盐。一方面，路易斯酸为镁盐、钙盐、铯盐、铝盐、或铈盐。另一方面，路易斯酸的盐为氯化镁、溴化镁和碘化镁。

一方面，合成化学式为I的化合物的反应条件包括：第一，利用格式试剂或者在一种其他碱中加入镁盐来生成烷氧基化合物；第二，将化学式为C的磷酸化试剂加入到核苷的溶液中，磷酸化试剂或者为溶液状态(通常所用溶剂与核苷溶液相同，但不必一定如此)，或者直接以固态加入。另一方面，将烷氧基化合物的溶液加入到磷酸化试剂的溶液中。一方面，用碱生成烷氧基化合物的温度选自范围-78℃～40℃。一方面，反应温度范围为-20℃～25℃。另一方面，磷酸化步骤的温度选自范围-10℃～70℃。再一方面，该温度选自范围10℃～40℃。

然后，使用本领域技术人员所熟知的多种方法(Greene T.W.，Protective Groups in Organic Chemistry，John Wiley & Sons，New York(1999))中的一种，将如上所述所生成的受保护药物前体进行去保护步骤，以除去所有的保护性基团，所用的方法同样适合于磷酸酯药物前体的稳定性。一方面，若存在的话，去保护试剂包括用来除去甲硅烷基的氟化盐、用来除去例如甲硅烷基和/或缩酮和N保护基团的不稳定酸保护基团的无机酸或有机酸。另一方面，去保护试剂为氢氯酸溶液。最终的药物前体以及所有中间体的分离和提纯通过柱色谱法和/或结晶法的结合来完成，以获得化学式I的化合物。

在另一方面，本发明提供了用来合成化学式为I的化合物的单一异构体的方法。由于环磷酸酯试剂上C’的立构中心的存在，该碳原子具有两种不同的取向，即R或者S。因此，化学式C的反式磷酸酯试剂存在S-反式或者R-反式构型，这两种试剂是对映体。因而，由外消旋二醇的磷酸化试剂的合成产生R-反式和S-反式异构体的外消旋混合物。此外，由于阿糖胞苷都是非手性的，因此用外消旋反式-磷酸酯试剂对这些核苷进行磷酸化将生成两种化学式I的非对映体的顺式-药物前体的混合物。这些化合物可通过柱层析法和/或结晶法的结合进行分离。或者，用富对映体的反式-磷酸酯试剂对核苷的烷氧基化合物进行磷酸化，可生成富对映体的顺式-药物前体。因此，与C’-S-反式-磷酸酯试剂(由化学式B制成的二醇)的反应将生成化学式III的C’-S-反式-药物前体，而与C’-R-顺式-磷酸酯试剂的反应将生成C’-R-顺式-药物前体。

另一方面，在将顺式-磷酸化试剂到反式-磷酸酯试剂的差向异构化速度与阿糖胞苷与反式-磷酸酯试剂的反应速度进行比较的基础上，已经发现，顺式-磷酸化试剂仍然能生成阿糖胞苷的顺式-药物前体。在这一方面中，顺式-磷酸化试剂差向异构到反式-磷酸化试剂过程中，由于生成少量的药物前体，从而生成了痕量的离去基团。然后，阿糖胞苷与原位生成的反式-磷酸化试剂进行反应而生成顺式-药物前体。另一方面，阿糖胞苷与磷酸化试剂的粗混合物反应生成顺式-药物前体。一方面，磷酸化试剂的粗混合物已在反式-异构体中富集。另一方面，所使用的磷酸化试剂未进行富集化步骤。

2.3未受保护核苷的磷酸化

可供选择地，阿糖胞苷的药物前体可不必对阿糖胞苷进行预先保护、而通过选择性磷酸化伯羟基的反应来合成。利用酰氯对例如araC的核苷进行选择性5’-酰化已为人熟知(Gish et al.，J.Med.Chem.14，1159(1971))。然而，因为磷酸化试剂被认为具有较强的反应性，因此推测它们将引起较差的区域选择性和较低的收率，就像与在反应(DMF)中所用的溶剂反应一样。在本发明的一个方面中，我们发现，化学式为C的磷酸化试剂与未受保护阿糖胞苷反应生成了高产率的化学式I的5’-顺式-磷酸酯药物前体，并具有高的区域选择性和立体选择性。一方面，可将分离出的磷酸化试剂加到阿糖胞苷的溶液中。另一方面，可将阿糖胞苷加入到磷酸化试剂的溶液中。类似地，与S-反式-磷酸酯试剂(由化学式B制成的)的反应将生成化学式III的S-反式-药物前体，而与R-顺式-磷酸酯试剂的反应将生成R-顺式-药物前体。由于未受保护阿糖胞苷在通常的溶剂中溶解性较差，并且溶剂可能与磷酸化试剂发生反应，因此需要具有较高介电常数并且与磷酸化试剂的反应性较低的溶剂。这种溶剂的实例是四烷基脲。一方面，这种溶剂是DMPU、四甲基脲、DMEU、三甲基磷酸酯或六甲基磷酸三酰胺。

实施例

实施例1.3-氧代-3-(吡啶-4-yl)-丙酮酸甲酯(1)的合成

将一个50L的三口圆底烧瓶装配上部的搅拌器、加热包和氮气入口。在瓶中装入THF(8L)和叔-丁醇钾(5kg，44.6mol)，然后加入另外的THF(18L)。随着温度的升高添加4-乙酰吡啶(2.5kg，20.6mol)，接着加入碳酸二甲酯(3.75L，44.5mol)。在两种成分都添加之后，混合物的温度高于40℃。在不加热的情况下，反应混合物搅拌反应2.5小时，在这个过程中，温度提高到平均温度约为55℃。然后将混合物加热到57℃-60℃，持续3小时。该反应过程通过薄层色谱(TLC)来监测。停止加热，使混合物慢慢冷却过夜(15小时)。然后将混合物通过45cm的布氏漏斗过滤。将酮酸酯的烯醇化钾固体倒会到50L的烧瓶中，并用乙酸乙酸水溶液稀释(在15L的水中加入3L的乙酸)。将该酸性混合物用甲基叔-丁基醚(MTBE)提取(1×16L，1×12L)。将有机层合并，并用碳酸钠水溶液(Na₂CO₃)(1750g在12.5L水中)洗涤，用碳酸氢钠水溶液(NaHCO₃)(8L)和盐水(8L)去中和。用硫酸镁(MgSO₄)(500g)干燥合并的有机层过夜(15h)。将干燥后的有机溶液过滤，并通过旋转蒸发法除去溶剂，得到6.4kg的质量。在大约除去一半的溶剂之后，开始有物质沉淀出来。所得到的悬浮液在冰浴下冷却搅拌2小时。过滤收集固体，用MTBE(500mL)洗涤，并在真空烘箱中20℃下干燥15h，给出2425g(收率60％)的酮酸酯1的浅黄色固体。

将MTBE母液浓缩至大约1L。所得到的悬浮液在冰浴中冷却1小时。通过过滤收集固体，并用MTBE(2×150ml)冲洗，在真空烘箱中干燥，得到240g的二次产物。

TLC条件：用Merck硅胶60板对反应混合物进行监测，2.5×7.5cm，250微米，UV灯：1∶2THF/己烷溶剂。起始原料的Rf＝0.25；产物的Rf＝0.3

实施例2.(S)-3-羟基-3-(吡啶-4-yl)-丙酮甲酯(2)的合成

将22L三口圆底烧瓶，装配上部搅拌器、温度计套管/温度计、加料漏斗(1L)和冷却器(空的)。用氮气对烧瓶进行吹扫，装入甲酸(877g)并用冰浴冷却。将三乙胺(TEA)(755g)装入加料漏斗，并以超过50min的时间间隔缓慢地加入到搅拌的甲酸中。有一个带有中度发烟的放热反应，当加料趋向终点时中度发烟消失。当加料完成之后，除去冷却浴，并用二甲基甲酰胺(DMF)(0.5L)稀释反应产物。一次性加入酮酸酯1(2648g)，接着在吸热反应中加入另外0.5L的DMF。温度会下降约5℃，这表明酮酸酯1是不可溶的。烧瓶装有加热包，并且将搅拌的混合物逐渐加热到16℃以便溶解所有的固体。一次性加入手性钌催化剂(18.8g)，并将搅拌混合物在超过一小时后加热到55℃。所产生的黑色溶液在55℃下搅拌16小时。用TLC来确定反应何时完成。将溶剂在减压下蒸发(Buchi R152旋转蒸发器，在高真空条件下，热浴温度＝60℃)，产生3574g的棕色油状物。将油状物溶解于二氯甲烷中(10L)并转移至5加仑的固定的分液漏斗中。用饱和碳酸氢钠溶液(3.0L)洗涤黑色溶液，然后用二氯甲烷(3.0L)对水相进行反萃取。将合并的二氯甲烷提取物用MgSO₄(300g)干燥，过滤，并在减压下浓缩，提供3362g的棕色油状物(是理论的125％，由¹HNMR分析含有DMF)。对本实施例和以下的实施例进行的¹H-NMR分析是在VARLAN GEMINI-200MHz谱仪上进行的。将样品溶解于标出的溶剂中，并且化学位移是针对残留的溶剂而言。

TLC条件：用Merck硅胶60板对反应混合物进行监测，2.5×7.5cm，250微米，UV灯：5％甲醇的二氯甲烷溶液：起始原料的Rf＝0.44；产物的Rf＝0.15。

¹HNMR(CDCl₃)：δ2.73(d，2H，J＝1.5Hz)，3.73(s，3H)，4.35(s，1H)，5.11-5.19(m，1H)，7.31(d，2H，J＝6.6Hz)，8.53(d，2H，J＝6.0Hz)

e.e.＝87％S异构体(由HPLC确定)。

HPLC条件：

柱：Chiralpak AD，0.46×25cm；流动相＝10∶90，乙醇∶己烷，等度(isocratic)；流动速率＝1.5ml/min；注样体积＝10μL在254nm下UV测定；r.t.：R-羟基酯＝19.9min；S-羟基酯＝21.7min。

实施例3.(S)(-)-1-(4-吡啶)-1，3-丙二醇的合成

将22L四口圆底烧瓶装配上部搅拌器、温度计套管/温度计、加料漏斗(2L)、冷凝器和冷却器(空的)。用氮气吹扫烧瓶，并依次装入硼氢化钠(419g)和1-丁醇(9.0l)。将粗羟基酯(2)溶解于1-丁醇(1.0L，溶液的总体积为3.2L)。将四分之一(800mL)的羟基酯溶液在超过90分钟的间隔缓慢地加入到搅拌的硼氢化钠浆液中。温度从19℃升高到32℃，并有中度的气体释放发生。将混合物搅拌45分钟，最高温度达到36℃。将第二个四分之一的羟基酯溶液以超过45分钟的间隔缓慢地加入，温度从36℃升高到52℃。将混合物搅拌20分钟，而最高温度达到57℃。用冰浴将混合物冷却到40℃，并将第三个四分之一的羟基酯溶液以超过45分钟的间隔来加入。温度又从38℃升高到51℃。将混合物搅拌20分钟，最高温度达到57℃。将混合物冷却到38℃，并将最后四分之一的羟基酯溶液以超过25分钟的间隔来加入，这时没有出现明显的发热现象。将混合物搅拌40分钟，温度为45℃，然后将烧瓶加装加热包，并在超过2.5小时的间隔将搅拌的混合物加热到80℃。在80℃-85℃使混合物搅拌3小时。在超过12小时的时间间隔，使混合物逐渐冷却到环境温度。再次用TLC来监测反应是否完成。用碳酸钾水溶液(20wt％，5.2L)来结束混合物的反应，并且搅拌混合物10分钟。分离不同的层，并用碳酸钾水溶液(20wt％，2.6L)和氯化钠溶液(15wt％，1.3L)洗涤丁醇相层。在减压下脱除溶剂(Buchi R152旋转蒸发器，高真空，热浴温度＝60℃)，产生黄色半固态物质。将乙腈(3L)加入到蒸发瓶中，并在减压条件下蒸发溶剂。再次将乙腈(9L)加入到蒸发瓶中，并在60℃(热浴温度＝65℃，大气压)下搅拌(在旋转蒸发器上旋转)浆液15分钟。将热浆液通过SiO₂(C盐或寅式盐，Celite 521)过滤剂(在1L乙腈中有250g，作为浆液被预先填充在24厘米的布氏漏斗中)过滤。将滤液在减压下部分浓缩(将4L的馏出物浓缩)，并将所得到的浆液在常压下在旋转蒸发器上加热使所有的固体溶解(热浴温度＝65℃)。关闭加热源，并将所得到的溶液在旋转蒸发器中搅拌16小时，并逐步冷却到常温。将得到的混合物过滤，并用乙腈(2×200mL)洗涤，并干燥到恒重(在-30Hg，55℃，4h)，得到浅黄色固体。

熔点＝98-100℃

e.e.＝98％；S异构体(由HPLC确定)

HPLC条件：柱：Chiralpak AD，0.46×25cm；流动相＝10∶90，乙醇∶己烷，等度；流动速率＝1.5mL/min；注样体积＝10μL在254nm下UV测定；r.t.：R-二醇＝12.7min；S-二醇＝14min。

实施例4.(4S)-(-)-反-(4-吡啶)-2-(4-硝基苯氧基)-2-氧代-1，3，2-二氧杂磷杂环己烷(4)的合成

在装配有磁力搅拌器和氮气入口的1L圆底烧瓶中装入二醇3(100g，0.65mol)和吡啶(500ml)。将混合物在常温下强烈搅拌，直到二醇3完全溶解。二醇3的溶解性被TEA降低。将另一个3L的3口圆底烧瓶装配上部搅拌器、热电偶、1L的加料漏斗和氮气入口。在该容器中装有二氯代磷酸4-硝基苯酯(4-nitrophenylphosphorodichloridate)(166.4g，0.65mol)，放入冰浴中，然后通过加料漏斗加入吡啶(500mL)。将生成的混合物在冰浴温度下搅拌15分钟。

当化合物3完全溶解后(大约0.5h)，加入TEA(190mL，1.36mol)，并产生轻微的浑浊，将黄-褐色的溶液转移到3L烧瓶上的加料漏斗中，并在超过2小时40分钟的间隔加入冷的二氯酸酯溶液。该反应是放热的，保持一定的加料速率以使反应温度不超过6℃。当加料完成之后，将冰浴换成室温下的水浴，并继续搅拌3h。

在此期间，将另一个3L的三口圆底烧瓶装配上部搅拌器、热电偶、250mL的加料漏斗和氮气入口。然后将该烧瓶中装入氢化钠(15g，0.38mol)和THF(100mL)，并在加料漏斗中装入4-硝基苯酚(67.5g，0.49mol)的THF(100mL)溶液。然后将烧瓶被放入冰浴中，并缓慢地将硝基苯酚溶液加入到冷的氢化钠悬浮液中。在加入硝基苯酚的过程中温度保持在＜40℃。气体发生的停止表明加料的完成。所生成的鲜橙色悬浮液在室温下持续搅拌1h。

在通过HPLC判断二醇(3)-二氯酸酯反应完成之后，将黑色悬浮液进行真空过滤。用THF(100mL)冲洗玻璃仪器和滤饼(TEA-HCl)，并将合并的滤液和洗涤液倒入到橙色的4-硝基苯酚钠悬浮液中。然后将得到的混合物加热到40℃持续4h，并通过HPLC来监测顺/反式平衡。关掉加热包并在室温下搅拌反应。将粗反应混合物通过过滤剂，SiO₂(C盐521，0.5英寸)过滤，并用200mL的二氯甲烷冲洗玻璃仪器和C盐。将合并的滤液和洗涤液在旋转蒸发器中、在减压(油扩散泵)30-35℃下浓缩。将所得到的粘稠的、黑色泡沫状焦油溶解于1.0M盐酸水溶液(1.5L)和乙酸乙酯(800mL)中，并转移到4L的分液漏斗中分相。乙酸乙酯层用另外的300mL的1.0M盐酸水溶液分批洗涤。将二氯甲烷(750mL)加入到合并的水层中，同时剧烈搅拌该混合物，用碳酸氢钠固体小心地中和该混合物以使之PH值在7到8之间。再次将溶液转移入4L的分液漏斗中，并使各层分开。水层用二氯甲烷(750mL)提取，并将合并的有机层用硫酸镁干燥、过滤并浓缩至干燥状态。将所得到的干燥的残留物置于异丙醇(200mL)中搅拌成为浆液，经过滤得到190g的磷酸酯4。

将粗磷酸酯4溶于二氯甲烷(600mL)中，在10g活性碳(Darco)存在下搅拌10分钟，并经SiO₂(Celite 521，0.5英寸)过滤。用二氯甲烷(150mL)冲洗烧瓶和C盐，并将合并的滤液和洗涤液再次浓缩至干燥状态。将得到的固体研磨成粉，并在50℃下在异丙醇(250mL)中搅拌成为浆液。1小时之后将浆液冷却到室温，随后冷却至冰浴温度用于过滤。将固体在55℃于真空烘箱中干燥16小时，得到154.6g(70％)的磷酸酯4的浅褐色(beige)固体。

m.p.＝140-142℃

旋光率＝-80.350°(c＝1.0，MeOH)

HPLC条件：柱：Chiralpak AD，0.46×25cm；流动相＝50∶50，2-丙醇∶己烷，等度；流动速率＝1.0mL/min；注样体积＝10μL在254nm下UV测量；r.t.＝6.6min.，99+％顺式

ee＝99+％

¹HNMR(DMSO-d6)：δ2.23-2.29(m，2H)，4.56-4.71(m，2H)，5.88-5.95(m，1H)，7.44(d，2Hh，J＝5.8Hz)，7.59(d，2H，J＝9.2Hz)，8.34(d，2H，J＝9.4Hz)，8.63(d，2H，J＝5.8Hz)

实施例5.5’-O-苯甲酰阿糖胞苷(5)的合成

将12L的四口圆底烧瓶装配上部搅拌器、热电偶和氮气入口。在该容器中装有阿糖胞苷(500g，2.06mol)和DMPU(1L)，其形成粘稠的但可以搅拌的溶液。将HCl的二噁烷溶液(617mL，2.47mol)一次性加入，温度升高到52℃。将混合物搅拌2小时，并冷却到27℃。加入苯甲酰氯(578g，4.11mol)，并在室温下搅拌混合物22h，而在前30分钟内温度上升到34℃。在2.5h之后，温度下降到25℃。加入水(2.5L)并搅拌混合物30分钟，同时温度升高到37℃。将得到的各层分离，并用二氯甲烷(2×1L)对水层进行提取。将合并的有机层用10％(vol/vol)的盐酸水溶液(2×500mL)提取。将合并的水层装入12L的烧瓶中，用水(1.5L)稀释，并在冰浴中冷却。通过加入30％(wt/wt)的氢氧化钠水溶液(850毫升)来将pH值调整到10。在中和过程中、在30分钟的添加阶段温度从14℃升高到21℃。在pH值为3时开始出现沉淀物。当保存在冰浴中时，将得到的粘稠悬浮液搅拌8小时。将固体收集在24cm的布氏漏斗中。滤饼用水(2L)洗涤，并在漏斗中过夜使之部分干燥。将得到的固体物质在真空烘箱70℃下干燥18h，产出659g(产率93％)的5’-氧-苯甲酰阿糖胞苷(5)。用卡尔·费歇尔法测得的水含量过高时，将对该物质进行重结晶。在12L的烧瓶中装入化合物(5)、甲醇(5L)和乙醇(3L)，该混合物在搅拌后变粘稠。将混合物加热至回流，生成清亮的黄色溶液。将混合物在常压下蒸馏直到收集到2L的蒸馏液。加入乙醇(2L)，并继续蒸馏直到收集到多于1升的蒸馏液。在蒸馏过程结束时，温度为79℃。关闭加热，并将混合物冷却到21℃、搅拌19h。过滤收集固体，用乙醇(1L)洗涤，在真空烘箱70℃下干燥36小时，产生508g(71％)的化合物5的白色结晶固体。

HPLC条件：柱：Zorbax Eclipse XDB-C8；溶剂A＝5％的乙腈在20mM磷酸钠中的缓冲液；溶剂B＝80％的乙腈水溶液；梯度；流动速率＝1.0mL/min；注样体积＝10μL在270nm下UV测量；r.t.＝4.3min。

实施例6.5’-O-苯甲酰-2’，3’-二O-TBS-阿糖胞苷(6)的合成

将12L的四口圆底烧瓶装配上部搅拌器、热电偶、冷凝器和氮气入口。在烧瓶中装有吡啶(703mL，8.64mol)、DMF(1L)和化合物(5)。将混合物搅拌5分钟。将化合物(5)加入到溶剂中以促进溶解。加入叔-丁基二甲基氯化硅(tert-Butyldimethylsilylchloride)(TBSCl)，接着加入DMF(500mL)。将混合物加热到93℃±1℃，持续44h，期间不时地用HPLC监测。将混合物冷却到51℃，并加入甲醇(250mL)以使未反应的TBSCl骤冷。在加入水(2L)后将混合物搅拌4.5h。再继续搅拌40分钟之后，将混合物用乙酸乙酯(2L)提取。用10％的盐酸水溶液(2×2L)，7％的NaHCO₃水溶液(2×2L)和10％的NaCl(2L)洗涤上面的有机层。有机层用MgSO₄干燥并过滤。在旋转蒸发器中除去溶剂，得到粘稠的，黑色油状物的粗化合物(6)，重量为1.3kg。将该物质用在随后的反应中，并且不用进一步纯化。

HPLC条件：柱：Zorbax Eclipse XDB-C8；溶剂A＝5％的乙腈在20mM磷酸钠中的缓冲液；溶剂B＝80％的乙腈水溶液；梯度；流动速率＝1.0mL/min；注样体积＝10μL在270nm下UV测量；r.t.二-甲硅烷基＝10.1min；r.t.单甲硅烷基＝6.9min。

实施例7.2’，3’-二O-TBS-阿糖胞苷盐酸盐(7)的合成

将12L的四口圆底烧瓶装配上部搅拌器、在顶部带有氮气鼓泡的冷凝器、热电偶和加热包。在烧瓶中装入溶于乙醇(2.3L)和肼(185g，5.76摩尔)中的粗化合物(6)的溶液。将混合物加热至80℃持续15h并用HPLC监测。除去加热包，将混合物冷却到35℃并保持2h。将黑色的溶液倒入15％的NH₄Cl水溶液(4L)中，并用乙酸乙酯(4L)提取。用15％的NH₄Cl水溶液(2L)洗涤有机相，然后在旋转蒸发器中使之蒸发至粘稠的油状物。将残留物溶解于乙腈(3L)中，并转移至一个大的分液漏斗中。加入10％的HCl水(3L)溶液，并搅拌混合物5分钟。将得到的浑浊溶液用己烷(2×3L)提取。当用己烷提取之后，两相变清。将下层的含有化合物(7)的水/乙腈层在旋转蒸发器上浓缩，直到收集到3L的蒸馏液。加入水(3L)并继续蒸馏，直至除去大约500mL另外的溶剂为止。在除去2L溶剂之后，开始出现沉淀物，同时在停止蒸馏后仍为粘稠的浆液。用24厘米的布氏漏斗过滤收集固体，并用5％vol/vol的乙腈水溶液(2×1L)洗涤滤饼。将潮湿的固体(2.6kg)转移到12L的烧瓶中，并与5％的乙腈水溶液(6L)一起搅拌45分钟。(缓慢地)过滤收集固体，用水(1L)洗涤，并在真空烘箱65℃下干燥46h，得到644g(收率88％)的产物。用HPLC和1HNMR(DMSO-d₆)来测定纯度：将原材料装入12L的烧瓶中。加入乙酸乙酯(4L)，并在超过1小时的间隔将混合物加热至回流，然后保持回流1小时。将混合物在超过3小时的间隔冷却至25℃。通过过滤收集得到的固体(7)，用乙酸乙酯洗涤，并在真空烘箱65℃下干燥24h，得到白色固体(335g，46％)。

将母液用饱和的NaHCO₃溶液中和，并分相。用盐水洗涤有机相，用MgSO₄干燥，并在旋转蒸发器中蒸发，得到283g的粘稠的棕色油状物。将该物质用硅胶(1.1kg)层析，先用2％的MeOH/二氯甲烷，接着用15％的MeOH/二氯甲烷洗提。将含有纯净产物的部分合并，并将溶剂蒸发掉。得到的残留物，2’，3’-二-氧-TBS-阿糖胞苷游离碱，在真空下干燥过夜，得到琥珀色的无定形固体(171g)。

HPLC条件：柱：Zorbax Eclipse XDB-C8；溶剂A＝5％的乙腈在20mM磷酸钠中的缓冲液；溶剂B＝80％的乙腈水溶液；梯度；流动速率＝1.0mL/min；注样体积＝10μL在270nm下UV测量；r.t.＝7.4min。

实施例8.2’，3’-二O-TBS-阿糖胞苷-N，N-二甲基甲脒(8)的合成

在装配有上部搅拌器的12L4口圆底烧瓶中装入化合物(7)(333g，0.66mol)和甲苯(2L)。加入NaHCO₃(110g，1.31mol)在水(2L)中的溶液，并剧烈搅拌混合物15分钟。在烧瓶中仍有大量的固体，于是加入乙酸乙酯(2L)。在5分钟内，在pH值为8的条件下所有物质都被溶解了。分相，并用10％的NaCl水溶液(1.5L)洗涤有机相，用MgSO₄干燥并过滤。在旋转蒸发器中除去溶剂，得到白色泡沫状的游离碱398g(理论量的130％)。

将2’，3’-二-O-TBS-阿糖胞苷游离碱(在实施例7中由层析得到的)加入到上面在旋转蒸发器烧瓶中制备的游离碱中。加入甲苯(2L)，并将混合物加热到50℃持续1小时，得到清亮的棕色溶液。将溶液转移至12L的4口烧瓶中。用甲苯(400mL)洗涤旋转蒸发烧瓶(rotovap flask)。加入DMF二甲基乙缩醛(158g，1.32mol)，并在20℃下搅拌混合物21h，同时通过TLC来对反应进行监测。将溶剂在旋转蒸发器中除去，得到粘稠的油状物。加入己烷(1L)，然后在真空下除去。将该物质在60℃下在旋转蒸发器中干燥2h，但仍为粘性的油状物。将己烷(2L)和二氯甲烷(2L)加入到残留物中，并在50℃下搅拌混合物，得到清亮的棕色溶液。将混合物在常压下蒸馏，直至收集到2升的蒸馏物。将混合物略微冷却，并在真空下蒸发剩余的溶剂。将残留物在旋转蒸发器中干燥15h，得到硬的泡沫装物质。将该物质从烧瓶壁上刮下来，并将得到的自由流动的固体在25℃真空下干燥24h，得到527.6g化合物8的棕褐色固体。

TLC条件：用Merck硅胶60板对反应混合物进行监测，2.5×7.5cm，250微米，UV灯：10％甲醇的二氯甲烷溶液：起始原料的Rf＝0.4；产物的Rf＝0.7。

¹H NMR(DMSO-d₆)：δ-0.27(s，3H)，-0.02(s，3H)，.0.11(s，6H)，0.74(s，9H)，0.88(s，9H)，3.02(s，3H)，3.16(s，3H)，3.51-3.69(m，2H)，3.80-3.85(m，1H)，4.05-4.08(m，2H)，4.95-5.03(m，1H)，5.93-6.01(m，2H)，7.67(d，1H，J＝7.2Hz)，8.62(s，1H)。

实施例9.2(1H)-嘧啶酮，4-氨基-1-[5-O-[(2R，4S)-2-氧化-4-(4-吡啶基)-1，3，2-二氧杂环磷酸酯-2-基]-β-D-阿拉伯呋喃糖基](9)的合成

将12L的四口圆底烧瓶装配上部搅拌器、温度计套管/热电偶、加料漏斗和冷却浴。烧瓶用氮气吹扫，并装入被保护的核苷8(250g，0.47mol)和THF(2.5L)。将经搅拌的溶液冷却到4℃(冰浴)，并在超过1小时的间隔缓慢地加入氯化叔-丁基镁溶液(617mL，0.62mol)，保持温度≤8℃。在加料完毕后，将溶液在冰浴温度下搅拌1.25h。一次性加入磷酸酯试剂(4)(262g，0.78mol)并将冷却浴除去。将得到的混合物在室温下搅拌16小时。用氯化铵溶液(20wt％，2.5L)使反应骤冷，并用乙酸乙酯(2.5L)稀释。将混合物搅拌5分钟以使所有的残留物溶解，并分层。用乙酸乙酯(1.1L)反萃取水相，并用氯化钠溶液(15wt％，1.6升)洗涤合并的有机相，用MgSO₄(260g)干燥，过滤并在减压下浓缩，得到526g深橙色浆状物，将其进行HPLC分析(参见下面的HPLC条件A)。

将12L的三口圆底烧瓶装配上部搅拌器、温度计套管/温度计、带有底部疏水阀/出水口的冷凝器和加热包。在烧瓶中装入粗浆状物的甲醇溶液(2.5L)和HCl-二噁烷溶液(790mL，3.16mol)。将经过搅拌的橙色溶液加热到50℃，并在50℃-55℃下搅拌16小时同时用HPLC(参见下面的HPLC条件B)监测。在减压下蒸发溶剂，得到粘稠的橙色焦油。将蒸发烧瓶(10L)装配上部的搅拌器/轴承组件，将焦油在水(800mL)和乙酸乙酯(800mL)之间进行分配。以每批2-5g加入碳酸氢钠固体并搅拌直到气体放出减弱下来，而水相的pH值为7(广泛pH试纸)。分层，并再次用乙酸乙酯(800mL)对水相进行提取。将水相过滤，并在减压下用乙醇通过共沸蒸馏来蒸发水(通过乙醇的连续添加来完成，4×400mL的乙醇)，随着水逐渐被乙醇替代，得到445克的棕色油状物/固体混合物。加入乙醇(700mL)，并在常温下搅拌(上部搅拌器)浆状物2小时。

9.1将得到的混合物过滤，并用乙醇(2×50mL)洗涤收集到的固体，并干燥至恒重(-30英寸Hg，55℃，2h)，得到199g的米黄色固体，其中包含未知量的NaCl。将固体物质转移到1L装配有磁力搅拌器的圆底烧瓶中。加入水(200mL)，并在常温下将混合物搅拌16h。将混合物过滤，并将收集的固体(9)用水(2×25mL)洗涤并干燥至恒重(-30英寸Hg，50℃，16h)。回收物(Recovery)＝109g的米黄色粉末(9)包含大约10％的NaCl。

9.2将来自于上面的乙醇滤液在减压下浓缩，得到粘稠的棕色焦油。将焦油溶解于加温的乙醇(200mL)中，并将得到的粘稠溶液在常温下搅拌16h。形成了沉淀物。将混合物过滤，并用乙醇(2×25mL)洗涤收集到的固体(9)，并干燥至恒重(-30英寸Hg，55℃，16h)。回收物＝6.22g的乳白色固体。

来自本实施例的产物(9)分离自两个单独的工作流程(9.1和9.2)。

9.32(1H)-嘧啶酮，4-氨基-1-[5-O-[(2R，4S)-2-氧化-4-(4-吡啶基)-1，3，2-二氧杂环磷酸酯-2-基]-β-D-阿拉伯呋喃糖基](9)的纯化

将2L的三口圆底烧瓶装配上部搅拌器，并装入合并的来自各单独的工作流程的粗化合物(9)和水(650mL)。搅拌浆状物，并分批加入浓盐酸直至固体固体溶解(需要34mL，pH＝3广泛pH试纸)。迅速加入最初的20mL盐酸，并将剩余的部分以5×2mL和4×1mL分批加入。将橙色溶液过滤并再次加入到烧瓶中。以每批2-3g分批加入固体碳酸氢钠(共36g)直到混合物的pH值为6-7(广泛pH试纸)。搅拌混合物直至气体放出减弱下来。将混合物在常温下搅拌2h然后过滤。用水(2×25mL)洗涤收集到的固体，并干燥至恒重(-30英寸Hg，55℃，16h)，得到133g的2(1H)-嘧啶酮，4-氨基-1-[5-O-[(2R，4S)-2-氧化-4-(4-吡啶基)-1，3，2-二氧杂环磷酸酯-2-基]-β-D-阿拉伯呋喃糖基]的黄-浅褐色颗粒状固体(39.7％)。

计算得到的C₁₇H₂₁N₄O₈P的元素分析：C，46.09；H，4.85；N，12.65。测得的：C，45.88；H，4.72；N，12.58。

HPLC条件：柱：下面两个柱的串连连接；Agilent，Zorbax EclipseXDB-C8，4.6×250mm，5μm；溶剂A＝在11％乙腈/水中的20mM磷酸钠缓冲液；溶剂B＝在去离子水中的50％乙腈；反相的；流动速率＝1.0mL/min；注样体积＝10μL在270nm下UV测定；柱温＝30℃；r.t.＝13.4min(S异构体)；r.t.＝14.1min(R异构体)

¹H NMR(DMSO-d₆)：δ2.15-2.27(m，2H)，3.90-3.97(m，3H)，4.24-4.58(m，4H)，5.58(d，1H，J＝7.4Hz)，5.62-5.65(m，2H)，5.71-5.79(m，1H)，6.10(d，1H，J＝3.6Hz)，7.08(s，1H)，7.13(s，1H)，7.42(d，2H，J＝5.8Hz)，7.48(d，1H，J＝7.4Hz)，8.59(d，2H，J＝6.0Hz)。

HPLC条件A：

柱：Chiralpak AD，0.46×25cm；流动相＝10∶90，乙醇∶己烷，等度；流动速率＝1.5mL/min；注样体积＝10μL在254nm下UV测定；r.t.＝18.9min。

HPLC条件B：

柱：Bondclone10，C18，300×3.9mm；溶剂A为10％的乙腈在20mM的磷酸钾缓冲液中(pH6.2)，溶剂B为乙腈；梯度；流动速率＝1.4mL/min；注样体积＝10μL在260nm下UV测定；r.t.＝18.9分。

实施例10.手性钌催化剂(10)的合成

将3L的三口圆底烧瓶装配上部搅拌器、温度计套管/温度计。用氮气吹扫烧瓶，并装入钌络合物(32.0g)，(1S，2S)-(+)-N-对-甲苯磺酰基-1，2-二苯基亚乙基二胺(38.24g)和异丙醇(1.0L)。将三乙胺(30.0mL)加入到搅拌的浆液中，并将其在超过1h的间隔加热至80℃。将橙色混合物在80℃搅拌1h，然后除去加热包，并将搅拌混合物在超过45分钟间隔冷却至常温。在减压下蒸发溶剂得到深橙色固体。加入甲醇(320mL)，并将搅拌的浆液升温至50℃。在50℃下搅拌混合物15分钟，然后在超过30分钟的时间逐渐冷却至常温。在冰浴温度下将混合物再搅拌30分钟，然后过滤。用甲醇(2×15mL)洗涤收集到的固体，然后干燥至恒重(-30英寸Hg，55℃，16h)，得到53.1g的橙色固体催化剂(产率80％)。

实施例11.利用二醇的盐酸盐合成(4S)-(-)-(S)-(-)-(4-吡啶基)-2-(4-硝基苯氧基)-2-氧代-1，3，2-二氧杂磷杂环己烷(4)

将1L3口圆底烧瓶装配机械搅拌器、加料漏斗、温度计和氮气入口。在烧瓶中装入S-(-)-1-(吡啶-4-基)-丙烷-1，3-二醇(25g，163.4mmol)和乙酸乙酯(250mL)，并将得到的悬浮液用4N盐酸的二噁烷(43mL，176mmol)溶液在超过15min的时间间隔慢慢进行处理。在室温下搅拌30min之后，在正氮气流下尽可能快地加入4-硝基苯基二氯代磷酸酯(二氯代磷酸4-硝基苯酯，4-nitrophenylphosphorodichloridate)固体(41.81g，163.4摩尔)。借助于干冰-丙酮冷却浴将反应混合物的内部温度调节至-10℃。加入三乙胺(57.76g，79mL，572mmol)的乙酸乙酯(100mL)溶液，并保持反应温度＜-5℃。在三乙胺溶液加料完成之后30分钟，将冷却浴除去，并在室温下搅拌反应混合物1h。过滤反应混合物以便除去三乙胺-盐酸盐，用乙酸乙酯(3×30mL)洗涤三乙胺-盐酸盐直至滤液显示出只有轻微的吸收。在减压下将滤液蒸发直至体积下降至150-175mL。将4-硝基苯酚(7.5g，54.3mmol)和三乙胺(9mL)加入至浓缩的溶液中，并在室温下将得到的橙色反应混合物搅拌24h。通过过滤收集反应混合物中所形成的固体，用乙酸乙酯(2×25mL)和甲基叔-丁基醚(25mL)洗涤，并在55℃的真空下干燥，得到31.96g(58.4％)所需要的产物。该产物的分析数据如实施例4中的。

实施例12：(4S)-(-)-反-(4-吡啶基)-2-氯-2-氧代-1，3，2-二氧杂磷杂环己烷(11)的合成

在装有磁力搅拌棒的烘干的250ml圆底烧瓶中装入3.49g的S-(-)1-(4-吡啶基)-1，3-丙二醇，随后加入60ml的乙腈。此非均相混合物在室温下搅拌15分钟，然后在5分钟内将5.7ml的4M的HCl加入到二噁烷中。于室温下搅拌1h后，通过注射器一次性加入2.16mL的POCl₃对反应混合物进行处理。在25ml的另一细颈瓶中将2.68g的DABCO在氮气保护下溶于15ml的乙腈，并通过注射器或加料漏斗在超过5分钟间隔转移至反应混合物中。在DABCO溶液的加料终点观察到略微的放热(+10℃)。使反应混合物在室温下搅拌1h，在搅拌过程中混合物仍为非均相的。取出反应混合物的少量样品并用干燥的氮气流快速蒸发，并将残留物溶解在DMSO-d₆中以便输送到¹H-NMR谱仪中。

¹H NMR(DMSO d₆，Varian Gemini 200MHZ)：C’-质子：反式-异构体5.85-5.75(d，1H)。

实施例13.2(1H)-嘧啶酮，4-氨基-1-[5-O-[(2R，4S)-2-氧化-4-(4-吡啶基)-1，3，2-二氧杂磷杂环己-2-基]-β-D-阿拉伯树胶呋喃糖基](9)的合成

方法A：

在装有磁力搅拌棒的烘干的250ml圆底烧瓶中装入3.35g的阿糖胞苷-HCl和6.0ml的DMPU。将来自于实施例12的反应混合物直接过滤到此烧瓶中，并用乙腈(1×15mL)快速洗涤DABCO-HCl盐。在抽真空的条件下，在旋转蒸发器中将挥发性物质除去(热浴温度＜35℃)。将残留的油状物在高真空下暂时保存，并在室温下搅拌48h。用100mL的MeOH处理反应混合物，并在室温下搅拌2h。用25wt％的NaOMe的甲醇溶液将反应混合物的pH值调节到7.0(大约需要用13mL)。在此过程中反应混合物是浑浊的。进行HPLC检测用来确保反应图谱的完整性。将反应混合物蒸发至干燥，并将残留物与50mL的二氯甲烷于室温下搅拌30分钟。通过过滤来收集沉淀，用(1×20mL)的亚甲基氯洗涤，并重新转移至该烧瓶中，再次与50mL的二氯甲烷搅拌15分钟并过滤。将该固体与200mL的乙醇搅拌1-2h，过滤并用乙醇(2×10mL)洗涤。将滤液蒸发至干燥，得到4.9g的白色固体。将该固体溶解于10mL的水中，并在室温下搅拌过夜，将得到的固体通过过滤来收集，用水(2×3mL)洗涤并在真空烘箱中干燥，得到1.38g的化合物9(26％)。

方法B

步骤A：阿糖胞苷盐酸盐的合成

将阿糖胞苷(500g，2.06mol)和甲醇(2.0L)装入装配有上部搅拌器和热电偶的5L 3口烧瓶中。将悬浮液冷却至2℃。吹入HCl气体，得到非常粘稠的混合物，放热升温至25℃。用甲醇(0.5L)将所得到的悬浮液稀释，以便于搅拌。总共加入108g(2.96mol)的HCl气体。将混合物在20℃下搅拌4h，然后过滤收集固体。将该固体用MTBE(3×250mL)洗涤，并在真空烘箱中70℃下干燥，得到555g的絮状阿糖胞苷盐酸盐，为白色固体。

步骤B：5’-O-顺-[4-(S)-(吡啶-4-基)-1，3，2-二氧杂磷环己-2-氧代-2-基]-胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷的合成

将1L带夹套的圆柱形反应器装配上部搅拌器、热电偶和2个加料漏斗(60mL和125mL)。反应器用氮气吹扫并加入DMPU(188mL，195.8g)。将经搅拌的液体冷却到-16℃(Julabo F32冷却器/循环器)。

二醇溶液：将250mL圆底烧瓶装配磁力搅拌棒和热电偶。在该烧瓶中加入S-(-)-1-(吡啶-4-基)-1，3-丙二醇(50.0g)。然后在氮气氛下，将DMPU(62.5mL，64.5g)和吡啶(25.8g)置于烧瓶中。将经搅拌的内容物加热到40℃(水浴)，然后在40-42℃下搅拌，直至将所有固体溶解(10分钟)。然后将所得到的暗橙色溶液冷却到22℃，然后装入到125mL的加料漏斗中(体积＝127mL)。

POCl₃溶液：将乙腈(22.9g)和三氯氧化磷(50.0g)加入至125mL的锥形烧瓶中。在混合完全后，将无色溶液转移至60mL加料漏斗中(体积＝60mL)。

将上述两种溶液在超过2.6h的时间间隔中同时加入到1L的反应器中，将温度维持在-11℃。在加料完毕之后，搅拌暗橙色的粘性溶液，将温度维持在-11℃--17℃1h。取出反应液样品，并通过HPLC检测反应是否完成(部分反应物水解形成环磷酸，然后由HPLC进行分析)。加入阿糖胞苷盐酸盐(60.9g)。将得到的混合物在超过1h间隔加热到5℃，并在4-6℃搅拌87h。将得到的粘性反应液每天取样进行HPLC分析。以使温度维持在20℃以下的速度慢慢用NaOH(13％wt/vol)溶液使经搅拌的反应溶液终止反应，直至溶液的pH值达到5.0(需要290mL的NaOH溶液)。将二氯甲烷(450mL)加入到二相混合物中，并在15-20℃搅拌30分钟。终止搅拌，并将混合物静置30分钟。将下层有机层分离，上层水层用二氯甲烷(450mL，搅拌30分钟，静置30分钟)抽提两次以上(注5)。将反应器固定一pH计，并将NaOH溶液(13％wt/vol)在至少10分钟内加入，使pH值至7.0(需要68mL的NaOH溶液)。将冷却剂(5℃)引入夹套以保持温度低于20℃。将得到的溶液在室温下搅拌20h，然后冷却至5℃5h(注6)。将得到的混合物过滤，并将收集到的固体用水(2×100mL)洗涤，并干燥至恒重(-30in.Hg，60℃，18h)。回收物＝46.6g的暗黄色细颗粒状固体(收率48％)。

用于氯代磷酸酯合成的HPLC：

柱：Zorbax Eclipse XDB-C8，4.6×250mm，5μm粒径；溶剂A＝溶于11％乙腈/水的20mM磷酸钠缓冲液，溶剂B＝50％乙腈溶于去离子水中(在15分钟内梯度为100％A至100％B)；流速＝1.0mL/min；注样体积＝10μL，在250nm下UV检测，柱温＝30。.r.t＝4.3min。

用于5’-O-顺-[4-(S)-(吡啶-4-基)-1，3，2-二氧杂磷环己-2-氧代-2-基]-胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷的HPLC：

柱：Inertsil ODS-3，4.6×150mm，3μm粒径；溶剂A＝溶于5％乙腈/水的20mM磷酸铵缓冲液；溶剂B＝乙腈(梯度(时间分钟/％B在％A中)：0/0，30/10，40/40，40.1/0，50/0)；流速＝1.0mL/min；注样体积＝50μL于210nm下UV检测，柱温＝30℃±5℃。r.t.＝15.7min。

步骤C：对5’-O-顺-[4-(S)-吡啶-4-基]-1，3，2-二氧杂磷环己-2-氧代-2-基]-胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷的纯化。

流程1：在1L的装有上部搅拌器、热电偶、加料漏斗和pH计的三口烧瓶中装入5’-O-顺-[4-(S)-(吡啶-4-基)-1，3，2-二氧杂磷环己-2-氧代-2-基]-胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷粗品(80g，0.18mol)和去离子水(256mL)。此混合物的pH值为5.16。在至少10分钟内，逐滴加入3.0M(60.6mL，0.18mol)的硫酸。用10℃的冷却浴以使温度维持在19-22℃之间。得到微混的黄色液体。溶液经由0.45μm的尼龙膜过滤(直径47mm)。用水(40mL)洗涤烧瓶和过滤器。将滤液和洗涤液放回到1L烧瓶中，并加入3M的NaOH(155mL)和3M硫酸将pH调到6.5。在pH值为5.1时开始观察到沉淀形成。将混合物搅拌2.5h，然后过滤收集固体。用水(2×8mL)清洗烧瓶和过滤器，并在真空烘箱中干燥过夜(-30in.Hg，60℃，18h)，得到73.4g的5’-O-顺-[4-(S)-(吡啶-4-基)]-1，3，2-二氧杂磷环己-2-氧代-2-基]-胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷粗糙的暗黄色固体。

步骤2：在250mL装有上部搅拌器、热电偶、加料漏斗和pH计的三口烧瓶中装入5’-O-顺-[4-(S)-(吡啶-4-基)-1，3，2-二氧杂磷环己-2-氧代-2-基]-胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷粗品(16g，36.3mmol)和去离子水(50mL)。逐滴加入3.0M的硫酸水溶液(12mL，36.3mmol)至pH为3.5，维持温度低于22℃。在至少20分钟内加入甲醇(160mL)，得到白色沉淀。将悬浮液在20℃下搅拌1.5h，然后过滤收集固体。用甲醇(2×25mL)清洗该固体，并在真空烘箱干燥(-30in.Hg，60℃，1.5h)，得到18.89g的硫酸盐。

将固体加入250mL装有上部搅拌器和pH计的三口烧瓶中。加入水(180mL)，并将混合物搅拌10分钟，使所有的固体物质溶解(pH＝2.7)。加入一水合磷酸二氢钠(0.25g，1.81mmol)，并将混合物搅拌5分钟。将溶液过滤通过C盐。将滤液放回到烧瓶中，并加入13％(wt/vol)的NaOH水溶液至pH为7.1。将悬浮液于20℃搅拌3h。通过过滤收集固体，用水洗涤(2×15mL)，并在真空烘箱干燥(-30in.Hg，60℃，16h)至恒重，得到13.55g(收率85％)的5’-O-顺-[4-(S)-(吡啶-4-基)-1，3，2-二氧杂磷环己-2-氧代-2-基]-胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷的乳白色颗粒状固体。

实施例14：R-(+)-1-(4-吡啶基)-1，3丙二醇的合成

R-(+)-1-(4-吡啶基)-1，3丙二醇如在实施例3中所示，利用实施例10中的催化剂10的对映体

熔点＝98-100℃

e.e.＝98％R异构体(通过HPLC检测)。

HPLC条件：柱：Chirapak AD，0.46×25cm；流动相＝10∶90的乙醇∶己烷，等度；流速＝1.5mL/min；注样体积＝10μL于254nm下UV检测；r.t.：R二醇＝12.7min；S二醇＝14min

实施例15.(4R)-(+)-(4-吡啶基)-2-(4-硝基苯氧基)-2-氧代-1，3，2-二氧杂磷杂环己烷(12)的合成

在0℃下搅拌4-硝基苯基二氯磷酸酯(9.2g，36mmol)的THF(100mL)溶液，在至少30分钟内缓慢加入吡啶(7.9mL，98mmol)。将反应混合物在0℃搅拌5分钟，并在0℃下至少1.5小时内缓慢加入R-(+)-(4-吡啶基)-1，3-丙二醇溶液(95.8％ee，5g，32.7mmol)和三乙胺(15.6mL，114mmol)的THF(300mL)溶液。将反应混合物升温至室温，并搅拌2.5小时。将4-硝基苯酚钠(18.17g，131mmol)加入到非均相橙色反应混合物中，加热至40℃4.5小时。将反应混合物冷却至0℃，用饱和氯化铵水溶液(250mL)终止反应，并使各层分离。用饱和氯化铵溶液(200ml)洗涤有机层，并将合并的水相洗涤液用二氯甲烷(100mL)反相萃取。将合并的有机抽提物用0.3N的NaOH水溶液(200mL×4)洗涤，然后用硫酸镁干燥。将滤过的溶液在减压条件下浓缩，得到的油状物是静置(standing)结晶的。该黄色固体在100ml的2-丙醇中重结晶，得到所需要的反-磷酸盐(12)(95％ee，[α]_D ²⁰+74.2(c 1.0，MeOH)的白色固体。

TLC条件：250微米的硅胶平板(Unitplate)；流动相＝3/2的丙醇/己烷；二醇：rf＝0.2，反式-磷酸酯：rf＝0.6，顺式-磷酸酯：rf＝0.5。

用于顺/反异构化反应的HPLC条件：柱＝Zorbax Rx-C18(4.6×250mm)；流动相＝35％的乙腈/65％的pH值为7.95的20mM磷酸盐缓冲液；流动速率＝0.5mL/min；检测＝在250nm下UV检测；保留时间：顺式-异构体＝9.39分钟，反式-异构体＝10.11分钟。

用于ee测定的HPLC条件：柱＝Chiral Pak AD；流动相＝1∶1的2-丙醇/己烷；流动速率＝1.0mL/min；检测＝254nm下UV检测；保留时间以分钟计：反式-磷酸盐＝7.02。

实施例16.2(1H)-嘧啶酮，4-氨基-1-[5-O-[(2S，4R)-2-氧化-4-(4-吡啶基)-1，3，2-二氧杂磷杂环己-2-基]-β-D-阿拉伯呋喃糖苷基](13)的合成

16.1磷酸化步骤

在室温下，将t-BuMgCl溶液(1M的THF溶液，6ml，6mmol)缓慢加入至经搅拌的化合物8(2.4g，4.55mmol)的THF(40ml)溶液中。30分钟后，将R-反式-磷酸酯12(1.84g，5.5mmol)加入到反应混合物中，并在室温下搅拌16小时。将反应物冷却至0℃，通过加入饱和氯化铵水溶液来终止反应，并用乙酸乙酯抽提(50mL×2)。将合并的有机层用硫酸镁干燥，过滤并在减压条件下浓缩。将粗产品通过硅胶柱层析来进行纯化，用丙酮洗提，得到所需要的被保护的白色固态的药物前体(2.19g，66％，mp：142.0-145.0℃)。

TLC条件：250微米的硅胶平板；流动相＝丙酮，反式-磷酸酯；rf＝0.6，被保护的ara-C：rf＝0.2。

16.2.去保护反应步骤

将上述被保护的药物前体溶于70％的TFA(20mL)中，将经搅拌的该溶液加热至60℃持续16小时，并在减压条件下除去溶剂。在残留物中加入甲醇(30mL)，并将混合物用碳酸钠调至微碱性。将浑浊的溶液用硫酸镁干燥，过滤。在减压条件下脱除溶剂，并将粗产品通过硅胶柱层析来进行纯化，并用甲醇-丙酮(1∶1)洗提，得到所需要的乳白色固态药物前体(1.06g，80％，98％de，mp：178.0-180.0℃)。

TLC条件：250微米的硅胶平板；流动相＝丙酮-甲醇(1∶1)，被保护的ara-C：rf＝0.7，产物rf＝0.3。

HPLC条件：柱＝Zorbax Eclipse x DB-C84.6×150mm；流动相＝溶于5％乙腈-水的20mM的磷酸盐缓冲液；流动速率＝1.0mL/min；检测＝210nm下UV检测；保留时间以分钟计：产物＝10.60。

实施例17：2(1H)-嘧啶酮，4-氨基-1-[5-O-[(2R，4S)-2-氧化-4(4-吡啶基)-1，3，2-二氧杂磷杂环己-2-基]-β-D-阿拉伯呋喃糖苷基](+)-樟脑磺酸酯(盐)的合成

将(+)-樟脑磺酸(232mg，1mmol)加入至2(1H)-嘧啶酮，4-氨基-1-[5-O-[(2R，4S)-2-氧化-4(4-吡啶基)-1，3，2-二氧杂磷杂环己-2-基]-β-D-阿拉伯呋喃糖苷基](化合物9，400mg，0.91mmol)的甲醇(8mL)悬浮液中。将得到的无色透明溶液在室温下搅拌2h，然后减压条件下浓缩。将残留的白色泡沫体与乙酸乙酯一起研磨，并在减压条件下浓缩。将残留物悬浮在乙酸乙酯中，并加热至回流。冷却1小时后，过滤收集固体，用乙酸乙酯洗涤，并于50℃真空烘箱中干燥过夜，得到白色固态的题述化合物(562mg)。m.p.193℃。计算得到的C₁₇H₂₁N₄O₈P·C₁₀H₁₆O₄S·H₂O元素分析(RobertsonMicrolit)：C，46.95；H，5.69；N，8.11。测得的：C，47.22；H，5.51；N，7.81。

实施例18：2(1H)-嘧啶酮，4-氨基-1-[5-O-[(2R，4S)-2-氧化-4(4-吡啶基)-1，3，2-二氧杂磷杂环己-2-基]-β-D-阿拉伯呋喃糖苷基]马来酸酯(盐)的合成

采用实施例17相同的反应流程，使用马来酸(1.1eq)。

m.p.140℃。计算得到的C₁₇H₂₁N₄O₈P·C₄H₄O₄.H₂O·0.5C₄H₈O₂的元素分析(Robertson Microlit)：C，44.67；H，5.05；N，9.06。测得的：C，44.58；H，4.61；N，8.48。

实施例19：2(1H)-嘧啶酮，4-氨基-1-[5-O-[(2R，4S)-2-氧化-4(4-吡啶基)-1，3，2-二氧杂磷杂环己-2-基]-β-D-阿拉伯呋喃糖苷基]水合硫酸盐的合成

将硫酸(89mg，0.91mmol)加入至2(1H)-嘧啶酮，4-氨基-1-[5-O-[(2R，4S)-2-氧化-4(4-吡啶基)-1，3，2-二氧杂磷杂环己-2-基]-β-D-阿拉伯呋喃糖苷基](化合物9，400mg，0.91mmol)的甲醇(8mL)悬浮液中。自由流动的固体变粘，并粘在烧瓶壁上。使混合物回流15分钟，冷却至室温，固体从烧瓶壁上脱落。在室温下搅拌3h后，通过过滤收集白色自由流动的固体，用甲醇洗涤，并于20℃真空干燥，得到题述化合物(428mg)。

m.p.158℃。计算得到的C₁₇H₂₁N₄O₈P·H₂SO₄·2H₂O的元素分析(Robertson Microlit)：C，35.54；H，4.74；N，9.75；测得的：C，35.50；H，4.73；N，9.51。

实施例20：2(1H)-嘧啶酮，4-氨基-1-[5-O-[(2R，4S)-2-氧化-4(4-吡啶基)-1，3，2-二氧杂磷杂环己-2-基]-β-D-阿拉伯呋喃糖苷基]盐酸盐的合成

将1N的盐酸溶液(228μL，0.23mmol)加入到装有2(1H)-嘧啶酮，4-氨基-1-[5-O-[(2R，4S)-2-氧化-4(4-吡啶基)-1，3，2-二氧杂磷杂环己-2-基]-β-D-阿拉伯呋喃糖苷基](化合物9，100.6mg，0.228mmol)的烧瓶中。将水(5mL)和甲醇(5mL)加入到该部分可溶的固体中，然后将混合物进行超声处理。将该无色透明溶液通过0.45μm的针筒式过滤器过滤，用甲醇冲洗该过滤器。在减压条件下将合并的滤液浓缩。使残留物与乙腈(2×10mL)一起共沸。将残留物溶解于乙腈和甲醇的混合物(1/1，10mL)，并浓缩至干燥。将该白色粉末于20℃真空下干燥，得到题述的化合物(78mg)。

m.p.＞200℃。计算得到的C₁₇H₂₁N₄O₈P·HCl·H₂O的元素分析(Robertson Microlit)：C，42.03；H，4.77；N，11.53；Cl，7.30。测得的：C，41.70；H，4.84；N，11.68；Cl，7.45。

实施例21：2(1H)-嘧啶酮，4-氨基-1-[5-O-[(2R，4S)-2-氧化-4(4-吡啶基)-1，3，2-二氧杂磷杂环己-2-基]-β-D-阿拉伯呋喃糖苷基]L-酒石酸盐的合成

采用实施例20相同的反应流程，使用0.1N的L-酒石酸水溶液。

m.p.＞200℃。计算得到的C₁₇H₂₁N₄O₈P·C₄H₆O₆·H₂O·0.1C₂H₃N的元素分析(Robertson Microlit)：C＝41.57；H，4.82；N＝9.38；测得的：C＝41.32；H＝5.03；N＝9.69。

实施例22：外消旋的反-4-(4-吡啶基)-2-(4-硝基苯氧基)-2-氧代-1，3，2-二氧杂磷杂环己烷的合成

将外消旋的1-(4-吡啶基)-1，3-丙二醇(4g，26.1mmol)和三乙胺(12mL，86mmol)的THF溶液加入至4-硝基苯基二氯磷酸酯(7.35g，28.7mmol)的THF溶液中。在室温下搅拌过夜之后，加入4-硝基苯酚钠(10g，71.8mmol)，而后将混合物在50℃加热4小时。将冷却后的反应混合液用饱和氯化铵溶液终止反应，并用乙酸乙酯(3x)抽提。将合并的有机抽提物用饱和氯化钠溶液洗涤，并用硫酸钠干燥。将滤过的溶液在减压条件下浓缩，并将得到的残留物通过柱层析进行纯化(硅胶，用95/5的二氯甲烷/乙醇)。

¹H NMR(CDCl₃，Varian Demini 200MHz)：C’-质子：顺式-异构体5.6-5.8(m，1H)；反式-异构体5.5-5.69(m，1H)。

TLC条件：250微米的硅胶平板；流动相＝3/2的丙酮/己烷；二醇：rf＝0.2，反式-磷酸酯：rf＝0.6，顺式-磷酸酯rf＝0.5。

用于顺式/反式-异构化反应的HPLC分析条件：柱＝ZorbaxRx-C18(4.6×250mm)；流动相＝35％的乙腈/65％pH值7.95的20mM磷酸盐缓冲液；流动速率＝0.5mL/min；检测＝在210nm下UV检测；保留时间以分钟计：顺式-异构体＝9.39分，反式-异构体＝10.11分。

实施例23 2(1H)-嘧啶酮，4-氨基1-[5-O-顺-[-2-氧化-4(4-吡啶基)-1，3，2-二氧杂磷杂环己-2-基]-β-D-阿拉伯呋喃糖苷基]的合成

23.1.磷酸化步骤

如同实施例16.1.，使用外消旋的反-4-(4-吡啶基)-2-(4-硝基苯氧基)-2-氧代-1，3，2-二氧杂磷杂环己烷。

TLC条件：250微米的硅胶平板；流动相＝丙酮，反式-磷酸酯：rf＝0.6，被保护的ara-C：rf＝0.2。

23.2.去保护步骤

如实施例16.2.

TLC条件：250微米的硅胶平板；流动相＝丙酮/甲醇(1∶1)，被保护的ara-C：rf＝0.7，产物：rf＝0.3。

本发明的方法的用途实施例包括下述各实施例。应该明了这些实施例是示例性的，并且本发明的方法并不仅仅限于这些实施例。

出于清楚简明的目的，在下面实施例中，2(1H)-嘧啶酮，4-氨基-1-[5-O-(2R，4S)-2-氧化-4(4-吡啶基)-1，3，2--二氧杂磷杂环己-2-基](9)被称作化合物A，2(1H)-嘧啶酮，4-氨基-1-[5-O-[(2R，4R)-2-氧化-4(4-吡啶基)-1，3，2-二氧杂磷杂环己-2-基]-β-D-阿拉伯呋喃糖苷基](13)被称作化合物B，而来自实施例23的2(1H)-嘧啶酮，4-氨基-1-[5-O-顺-[-2-氧化-4(4-吡啶基)-1，3，2-二氧杂磷杂环己-2-基]-β-D-阿拉伯呋喃糖苷基]被称作化合物C。

生物学实施例

实施例A：人肝微粒体酶反应动力学

测量通过人肝微粒体将化合物A和化合物B活化成araCMP，以与人肝脏组织的活化进行比较。利用药理抑制剂评价CYP3A4的特异性。

方法：

化合物A和化合物B与含有2mg/mL人肝脏微粒体的混合一起进行温育5分钟(体外技术(IVT)，产品目录#X00821，批号#RQX，50个供体的混性别池)，100mM磷酸钾缓冲液(Sigma，产品目录#P3786，批号#62H0619)，pH7.4，和1mM的NADPH(Calbiochem，产品目录#481973，批号#B38806)。在不存在NADPH的条件下，反应混合物在Eppendorf Thermal Mixer 5436中，在700rpm、37℃下预保温2分钟，然后通过加入1mM终浓度的NADPH进行引发。5分钟后，该反应利用112.5μL的甲醇被终止，样品在Eppendorf微量离心机中，在14,000rpm下离心10分钟，将150μL上清液利用介质加热进行蒸发至干燥。样品重悬在60μl的离子对缓冲液中(10mM磷酸钾，Fisher，产品目录#P286-1，比号#9152328A，50mM四丁基氢氧化铵，Aldrich，产品目录#17，878-0，批号#07030KO，用约3.3mL/L的在水中85％的磷酸将pH调至4.5，Chempure，产品目录#831-621，批号#M224KBRR)，进行涡旋、超声处理约30分钟，并在14,000rpm下旋转约10秒。

为了测定araCMP的活化，通过反相HPLC(Hewlett Packard1100)分析样品。将50μl的各样品注入具有Alltech C-18 EPS防护柱(产品目录#32607，7.5mm×4.6mm)的Agilent C18 ZorbaxSB-AQ反相柱中(产品目录#883975-914，5μm，4.6mm×150mm)。在柱温40℃和样品温度4℃下，以1mL/min的流速，将离子对缓冲液(参照上述)装入样品。将AraCMP进行均匀地洗提约7分钟，接着用甲醇洗涤约2分钟。通过在272nm的紫外线吸收来监测流出物。

通过利用0.1μM至100μM的三乙酰夹竹桃霉素(TAO；SigmaT-6514，批号#81K1655)或0.01μM至10μM的酮康唑(KTZ；Research Biochemicals International，产品目录(catalog)#K105，批号#SJG-597A)预保温进行抑制研究。TAO和KTZ在甲醇中进行溶解，因此，包括对照组的所有样品包含终浓度为1％(v/v)的甲醇。对于利用TAO的抑制研究而言，在不存在底物的情况下，利用TAO将微粒体在37℃下预保温30分钟。反应(100μl体积)通过加入底物被引发：该底物为1000μM的化合物A或1000μM的化合物B和1mM的NADPH的新鲜等分式样。酮康唑不需要这种预保温过程，因此上述反应通过在加入底物时将酮康唑加入反应混合物来进行。

动力学参数以平均值±标准偏差来表示(n＝2或3个独立的实验)。Michaelis-Menten等式，速率＝V_max[S]/[S]+K_m，被用于利用来自Sigma Plot(SPSS，Inc.)的酶动力学模块来计算V_max和K_m。内部清除率通过V_max除以K_m而获得。用于抑制研究的IC₅₀值通过带有IC₅₀值的半最大插值法来确定检测，该IC₅₀值以平均值±标准偏差来表示(n＝2或3个独立的实验)。K_i通过Cheng和Prusoff等式来确定，K_i＝IC₅₀/1+[底物]/K_m。

结果：

利用人肝微粒体批号(lot)#RQX(表1)，化合物A具有比化合物B高2.6倍的内部清除率。

表1.在人肝微粒体中活化化合物A和化合物B的动力学参数

                               表1

	化合物A	化合物B
			测试的浓度，mM	0.25，0.5，0.75，1	0.5，1，3，6
Vmax，nmol/min/mg	0.11±0.02	0.13±0.02
			Km，mM	1.08±0.27	3.13±0.51
克林特(Clint)，μL/min/mg	0.11±0.02	0.042±0.003

通过TAO引发化合物A和化合物B的活化，同时用于化合物A和化合物B的IC₅₀值分别为0.9±0.1μM和0.7±0.4μM(表2)。在100μM的TAO浓度下，观察到化合物A的完全抑制(99％)。用化合物B测试的最高TAO浓度为10μM，其导致73±2％的抑制。TAO的K_i值对于化合物A和化合物B是相似的，分别为0.5±0.1μM和0.5±0.3μM。

与TAO的情况相同，KTZ抑制了化合物A和化合物B的活化。IC₅₀值低于TAO的那些IC₅₀值：对于化合物A和化合物B而言，均为0.2±0.1μM(表2)。同样，在10μM的KTZ下，对于化合物A和化合物B而言，分别进行观察96±3％和89±1％的最大抑制作用。对于化合物A而言，K_i值是0.1±0.03μM，而对于化合物B而言，K_i值是0.1±0.05μM。

                       表2TAO和KTZ抑制人肝微粒体的活化

化合物	测试的浓度(μM)	抑制剂	IC50(μM)	Ki(μM)	％，抑制在测试的抑制剂的最大浓度下
						化合物A	1000	TAO	0.9±0.1	0.5±0.1	在100μM下为99％(在10μM下为94％)
化合物B	1000	TAO	0.7±0.4	0.5±0.3	在10μM下为73±2％
						化合物A	1000	KTZ	0.2±0.1	0.1±0.03	在10μM下为96±3％
化合物B	1000	KTZ	0.2±0.1	0.1±0.05	在10μM下为89±1％

结果：

通过人肝微粒体将化合物A和化合物B活化成CMP。化合物A在比化合物B的比率高2.6倍下进行活化。KTZ和TAO引发的药物前体活化表明了它是通过CYP3A4进行调节。

实施例B：单剂量肝脏的水平

在对小鼠进行腹腔内(i.p.)输注给药后，将体内药物前体的活化进行测定。

方法：

将正常的未禁食雄性Swiss小鼠(体重为25-35g，Harlan SpragueDawley，Indianapolis，IN)分别用化合物A与化合物B以189和193mg/kg(对应于摩尔当量为100mg/kg的araC)进行腹腔内注射。在注射后的特定时期，将小鼠麻醉并通过心脏穿刺来放血。割除整个肝脏，并速冻在液氮中，利用Polytron匀浆器PT 10/35(B rinkmannInstruments，Westbury，NY)在3体积的10％(v/v)高氯酸(PCA)中进行均化。在2500xg下离心5分钟后，将1mL的上清液用0.3mL的3M的KOH/3M KHCO₃进行中和，并进行充分混合。然后将样品进行离心5分钟，并且所得到的上清液用高碘酸盐进行处理，其目的是除去内原性核糖核苷酸，否则其可能干扰araCTP的检测。为此，将100μl的组织提取物与4μl的0.5M高碘酸钠(Al drichChemical Co.，Milwaukee，WI，lot#08009BU)和10μl的1.8M甲胺(Aldrich lot#04526DQ，PH5.5)，在室温下进行温育30分钟。通过加入2μl的1M L-鼠李糖终止反应(Aldrich lot#06801 JS)。所得到的样品通过下述HPLC进行分析。

为了测定骨髓araCTP，用1.2ml盐水将骨髓样品从股骨的骨髓腔冲洗到已预称重的Eppendorf管中。在离心20-30秒后(Eppendorf微型离心机，14,000rpm)并去除上清液，将12体积的3％PCA(v/v)加入到骨髓细胞小团中。然后将样品进行涡旋，直至该小团充分地溶解，并如上所述进行离心10分钟。用30μL的1M KOH/1MKHCO₃将90μl提取的上清液进行中和至pH 7-8，然后再次进行离心。如上所述，将所得到的上清液进行高碘酸盐处理。

肝和骨髓araCTP的水平通过利用Whatman Partisil 5SAX(5μm，4.6×250mm)柱的离子交换相HPLC(Hewlett Packard 1050)进行测定。在pH 3.5并含有6％乙醇下，将样品(50μL)注射到在70％的10mM磷酸铵缓冲液和30％的1M磷酸铵缓冲液中的柱上。将三磷酸核苷以1.25mL/min的流速从利用线性梯度的柱洗提到1M磷酸铵pH3.5/6％乙醇缓冲液中。将AraCTP通过紫外吸收(280nm)进行检测，并且通常进行洗提12至13分钟。通过以下步骤制作标准曲线：在中和之前，将已知量的araCTP加入来自对照肝脏或骨髓的PCA提取物，并且相应地制备HPLC样品。

为了获取血浆，将血液输送到肝素化的微量收集管中，并在Eppendorf微量离心机中，在14,000rpm下，离心2分钟。将所得到的血浆进行收集，置于干冰上，接着在-20℃下贮存。在分析的当天，蛋白质通过将1mL乙腈加入100μL血浆中来沉淀。在离心10分钟后(Eppendorf微量离心机，14,000rpm)，将上清液除去，并在Savant SpeedVac Plus SC110A中进行干燥。将这些样品用110μL流动相缓冲液进行复制(20mM KH₂PO₄，pH4.5)，进行超声处理5分钟，并进行离心30秒。将上清液通过装配有Alltech C18柱(5μm，4.6mm×250mm)的反目HPLC(Hewlett Packard 1090)进行分析。在将50μL样品注入流动相缓冲液后，乙腈浓度在10分钟内增加至10％，然后在15分钟内增加至50％。araC和药物前体的洗提时间分别是3分钟和19分钟左右。AraC和药物前体通过在280nm下吸收而进行检测，并通过用上述处理的示踪血浆样品获得的标准曲线进行定量。

结果以平均值±该平均值的标准误差来表示。通过重复的测量ANOVA进行数据分析，接着，进行用于在适当的时候在单个时间点处比较的Tukey HSD post-hoc测试。小于0.05的p值被认为有统计学显著性。图中的虚线表明利用所给出的HPLC方法的LOQ值(限量)。

结果：

化合物A和化合物B在肝中生成高水平的araCTP(图1a)，注射后60分钟，对于化合物A和化合物B而言，分别达到峰值69.89±6.37和27.00±4.04纳摩尔/克。化合物A产生比化合物B明显(p＜0.05)更高的肝的araCTP水平，除了4小时的时间点之外。对于化合物A和化合物B而言，血浆药物前体水平是相似的(p＜0.01；图1b)。在给予化合物A的小鼠中血浆的araC水平较高(对于0.5、1、2小时，p＜0.01；图1c)，肝脏的araCTP水平比血浆的药物前体水平更具有相关性。这表明血浆的araC可能是源于肝脏的araCTP的水平，而不是源于血浆中药物前体的降解。在显示出好的肝脏靶性的所有样品中，骨髓的araCTP等于或小于定量水平(3nmol/g)。

结论：

当通过腹腔内(i.p.)快速输注给药时，化合物A和化合物B在肝脏中产生显著水平的araCTP。化合物A产生高于化合物B的肝的araCTP的约2倍。在用两种化合物之一处理的骨髓中没有检测AraCTP。对于两种药物前体而言，血浆药物前体水平是相似的，但是用化合物A的血浆的araC水平高约2倍。基于血浆的araC水平和肝脏的araCTP水平的相关性，推测出血浆的araC可能通过araCTP脱磷酸生成araC以及araC从肝脏细胞露出返回血浆中而由肝脏araCTP产生。

实施例C：当通过连续静脉输注递送时肝脏的araCTP

在多只大鼠中对药物前体的活化(激活)成araCTP和肝脏的araCTP水平的维持进行测试，这些老鼠通过安装用于药物递送的仪器来进行静脉连续输注。

方法：

雄性Simonsen Albino大鼠(Sprague Dawley，来源于SimonsenLaboratories，Inc.，Gilroy，GA)，通过腹膜腔内注射0.25ml的含有150mg氯胺酮(“Vetamine”，100mg/ml，Phoenix Scientific，Inc.St.Joseph，MD)、10mg的甲苯噻嗪(100mg/ml，Butler公司，哥伦布，OH)以及5mg吗啡(15mg/ml，Marsam Pharmaceuticals，Inc.，Cherry，Hill，NJ)的麻醉剂混合物进行麻醉。将充满盐水的钝PE-50管道导管(Intramedic，Becton Dickinson，Sparks，MD)插入到颈静脉中，从肩甲骨之间取出，并且与限定旋转的恒量输注系统(Lomir Biomedical，Inc.，Malone，NY and Harvard Apparatus，Inc.，South Natick，MA)连接。管道用肝素化盐水进行填充并进行密封，并1-7天使动物恢复健康。安装仪器的动物按照下述方案进行输注。

化合物A：以200mg/kg/24小时araC(CE)当量输注化合物A2、4、8、16、24或48小时(n＝4-5/组，除48小时组中n＝1外)。

化合物B：以200mg/kg/24小时CE输注化合物A 2、4、8、16、24或48小时(n＝3-5/组)。此外，化合物A以相同的剂量输注4小时(n＝3)。

化合物C：以200mg/kg/24小时CE输注化合物A 2、4、8、16、24或48小时(n＝3-5/组)。

剂量响应：以144和200mg/kg/24小时CE输注化合物A 4小时(n＝4-5/组)。以50、100和200mg/kg/24小时CE输注化合物A24小时(n＝3-5/组)。

在不同期间的输注后，动物通过导管内注射上述的麻醉剂混合物进行麻醉。血液样品通过利用23号(gauge，规格)针头心脏穿刺取样，该针头与肝素涂布的3cc注射管连接。利用冷冻夹钳(freeze-clamp)将肝脏样品切断并速冻于液氮中并且如实施例B所述进行。如实施例B所述将样品的肝脏araCTP水平进行分析。如实施例B所述，将血浆和骨髓样品进行收集，并且对血浆药物前体、血浆的araC水平、以及骨髓的araC水平进行分析。

结果：

以200mg/kg/24小时连续输注化合物A，在4小时时能够达到稳态肝脏的araCTP水平(12.84±1.50纳摩尔/克)及剩余44小时内能够维持平均值13±1纳摩尔/克。对于所有三个化合物，在30-60μM的范围内，48小时治疗中，血浆药物前体的水平是相似的。化合物B和化合物A与化合物A相比，在肝脏中产生的araCTP少。这些研究均是独立进行的；因而，为了控制可能的试验上的变化，将化合物A给予化合物B组中的一组动物。这些动物的肝脏araC水平输注4小时后，与化合物A的48小时研究的相同时间点获得的相似，两种药物的血浆药物前体水平是一致的，其表明肝脏的araC水平的差异并不是由于两种药物的药物动力学微小差异造成的。在所有样品中，骨髓的araC水平低于定量水平(3nmol/g)。

肝脏的araCTP水平剂量反应性通过在24小时的时间内，以100或50mg/kg/24小时速度输注化合物B，或在4小时内以144mg/kg/24小时，输注化合物B。如图2b所示，肝脏的araC水平对于两种药物前体都具有剂量敏感性。

结论：

连续输注化合物A、B、或C，维持肝脏中的araCTP水平。在具有相似的血浆药物前体水平的条件下，与化合物B或化合物C相比，给予化合物A肝脏的araC水平更高表明差异是由于活化速率的差异造成的，而不是由于药物动力学的差异。

实施例D：肝脏靶向作用

通过将肝脏的araCTP与其他器官中的活性代谢物比较，在体外测量通过CYP3A活化的药物前体递送araCTP的肝脏特异性。特别地，评价相对于骨髓的肝脏靶向作用，这是因为骨髓是阿糖胞苷的毒性靶器官。

方法：

组织分布研究在实施例B和C所述的小鼠和大鼠中进行。在这些研究中，肝脏、血浆、和骨髓样品是在尸体剖检中获取，以评价肝脏靶向作用。利用母体化合物，阿糖胞苷进行上述相似研究，以显示作为肝脏靶向试剂的效用。

结果以平均值±该平均值的标准误差来表示。适当的时候，从0时间点到研究的最终时间点计算AUC。对于每种化合物来说，用肝脏araCTP的AUC除以血浆araC(血浆LTI)的AUC，或肝脏araCTP的AUC除以骨髓的araCTP(骨髓LTI)，来计算肝脏靶向作用指数(LTI)。就连续输注研究而言，将稳态araCTP水平值除以稳态血浆araC水平值。

结果：

如实施例B所述，当将化合物A、化合物B、化合物C给予小鼠或大鼠时，能够在肝脏中检测到高水平的araCTP。表3总结了腹腔内(i.p.)快速输注研究的峰值水平和AUC。在所有的研究中，骨髓araCTP等于或小于定量(3nmol/g)，表明具有良好的肝脏靶向作用。相反，若100mg/kg的阿糖胞苷以相同的方式给药，则能够在骨髓中检测到更高水平的araCTP。没有证据表明骨髓直接将化合物活化成araCMP；任何潜在的araCTP可能源于血浆中吸收的araC和在骨髓中被磷酸化成araCTP的活化(激活，activation)。在这些动物的血浆中和所有研究中所检测的araC看来似乎与肝脏araCTP水平相关。如表3所示，在腹腔内给予化合物A或化合物B后，小鼠和大鼠的血浆araC AUC值在3-22μM^*小时的范围内。通过获取在实验期间暴露的肝脏araCTP与血浆araC的比率评价的肝脏靶向作用指数(LTI)，表明肝脏的靶向作用是相对于外周暴露的19.2-27倍。这些值比阿糖胞苷的LTI高100倍。当化合物A、化合物B、化合物C通过连续静脉输注递送时，可以将稳态值进行类似比较(表4)。上述研究中LTI的范围在5-＞12，其比阿糖胞苷的LTI高100倍。

表3：阿糖胞苷的4-吡啶基(化合物A、化合物B)肝靶向药物前体体外小鼠肝靶向作用。这些化合物以100mg(阿糖胞苷当量)/kg通过快速IP注射进行给药

化合物		肝脏araCTP在1小时的峰值(nmol/g)	肝脏araCTPAUC0-4小时(nmol/g*hr)	血浆药物前体AUC0.5-4小时(nmol/g*hr)	血浆araCAUC0-4小时(μM*hr)	LTI(肝脏/血浆)(nmol/g/μM)
							化合物A	小鼠	96	225	138	8.3	27
化合物A	小鼠	70	149	156	7.6	19.5
							化合物B	小鼠	27	68	102	35	19.6
化合物A	大鼠	267	442	147.1	21.9	19.2
							AraC	小鼠	7.6	＜19.2	N/A	121.2	＜0.2

表4：阿糖胞苷肝靶向药物前体4-吡啶基(化合物A，化合物B或化合物C)大鼠连续输注。药物前体以200mg(阿糖胞苷当量)/kg/day连续静脉输注。^*AraC以2000mg/ka/day给药

化合物(研究)	肝脏在4小时的araCTP(nmol/g)	肝脏在24小时的araCTP(nmol/g)	血浆药物前体稳态(μM)	血浆araC稳态(μM)	在24小时的LTI(肝脏/血浆)(nmol/g/μM)
						化合物A	12.8	12.0	40-50	～1.6	75
化合物B	6.4	5.9	25-35	＜0.5	＞12
						化合物C	9.9	7.8	35-60	～1.5	5
AraC*	在2小时为2.3	＜2.26	N/A	～300	＜0.01

结论：

化合物A、化合物B、化合物C能够有效地使araCTP靶向肝脏，当腹膜内注射时能够约20倍地减少外周暴露，当连续静脉内输注给药时，能够约10倍地减少外周暴露。靶向作用表现出高于araC 100-1000倍的提高。

实施例E：水溶液稳定性

化合物的水溶液稳定性以pH和缓冲液浓度的函数进行测量。

方法：

将化合物A和化合物B以500μM(0.23mg/mL)溶解于水中，作为储液。将经过稀释的溶液(50μM)在37℃下于Fisher Scientific干浴保温箱(产品目录#11-718-2)中温育，每24小时收集一次样品，并于-80℃下贮存。血浆样品(100μL)用1mL的乙腈骤冷。当收集到所有血浆样品后，将样品解冻，于Eppendorf微量离心机中以14,000rpm速度离心10分钟，除去1mL上清液，利用介质加热(约37℃)蒸发2或3小时至干燥。在HPLC进样前，将样品重悬于120μL的流动相缓冲液中。

样品经HP1090或HP1100(Hewlett Packard)HPLC分析，使用的是C-18Alltech Econosphere柱，150mm×4.6mm(产品目录#70065)，以及C-18Alltech Econosphere保护柱，7.5mm×4.6mm(产品目录#96121)。样品利用甲醇梯度液洗提：5分钟为0％，然后10分钟增加到10％，20分钟为30％，25分钟为60％。下一次进样前，使柱在0％的甲醇中平衡10分钟。流速为1mL/分钟，柱温为40℃。药物前体洗提约19.5分钟时，通过280nmUV吸收进行监测。对于水性条件下的药物前体，可采用上述相同的方法，但甲醇梯度液为：5分钟为0％，10分钟时增加到10％，20分钟时增加到30％，药物前体洗提约20分钟。

结果：

化合物A和化合物B在水溶液中都十分稳定，在10mM的磷酸钾(Pi)、pH7.4中和在10mM的柠檬酸盐、pH5.0中时，t₉₀＞6天。化合物A在100mM Pi、pH7.4中的稳定性同样是＞6天，但化合物B在这种缓冲液中的稳定性稍差，t₉₀为4天。这两种化合物在100mM的柠檬酸盐、pH5.0溶液中的稳定性均下降，t₉₀分别为2天和1.7天。

结论：

4-吡啶基药物前体的稳定性相当好，但在具有高缓冲强度的低pH溶液中，这些化合物稳定性稍差。

实施例F：溶解性

在多种条件下测量化合物A和化合物B的溶解性，以确定用于体内给药的可能剂型(formulation，配方)。

方法：

化合物A和化合物B的溶解性在0.5M Pi、pH8.0，0.5M柠檬酸盐、pH7.0，和0.5M柠檬酸盐、pH4.0缓冲液中进行评价。对于这三个缓冲体系中的每一个，化合物A和B的饱和溶液按下述方法制备。将30mg化合物A和150mg化合物B靶体转移至单独的4cc干净玻璃小瓶(vial)中，向每个小瓶中分别加入1.0mL缓冲液。将最终的小瓶密封，于25℃振荡平衡至少24小时。在培养结束时，通过0.45μm的尼龙注射过滤器(syringe filter)过滤除去未溶成分。所获样品经实施例E所述的HPLC方法进行分析。

结果：

化合物A的溶解度分别为：pH8的缓冲液中为2.9mg/mL、pH7.0的缓冲液中为2.6mg/mL、pH4.0的缓冲液中为45.8mg/mL。化合物B的溶解度分别为：pH8的缓冲液中为10.2mg/mL、pH7.0的缓冲液中为9.0mg/mL，以及，pH4.0的缓冲液中为94.6mg/mL。

结论：

化合物A和化合物B相对可溶于中性pH溶液中，且化合物B的溶解度高于化合物A。当于pH≤4条件下制备时，两种化合物的溶解度大大增加。

实施例G：血浆稳定性

测量化合物A、化合物B、和化合物C在血浆中的稳定性，超过6天，以确定这些化合物在体内是否稳定。

方法：

对于含肝素(例如，抗凝血剂)的雄性和雌性共存(Male-andfemale-pooled)人体血浆(Bioreclamation Inc.，Hickville，NY产品目录#HMPLNAHP，批号#BRH02236)，所有血浆试样的pH皆为8.3。化合物A和化合物B以500μM(0.23mg/mL)溶于水中，作为储液，在血浆样品中稀释至50μM，并在37℃下于Fisher Scientific干浴保温箱(产品目录#11-718-2)中温育，每24小时收集一次样品，并于-80℃储存。血浆样品(100μL)用1mL的乙腈骤冷。当收集到所有血浆样品后，将样品解冻，于Eppendorf微量离心机中以14,000rpm的速度离心10分钟。除去1mL的上清液，利用介质加热(约37℃)蒸发2或3小时至干燥。样品重悬于120μL的流动相缓冲液中，然后进行HPLC检测。对于血浆样品，将40μL或50μL样品与流动相缓冲液，pH为6.2的20mM的磷酸钾缓冲液(FisherScientific，产品目录#P261-1，不同的批号)一起注入如实施例E所述的柱中。所有其他的HPLC分析如实施例E所述。

结果：

所有样品在37℃的人体血浆中的t_都是6±_天。

结论：

化合物A、化合物B、和化合物C在人体血浆中的半衰期＞1天，并未如预期那样在体内发生显著的降低。

实施例H：大鼠急性毒性

通过24小时连续静脉注射来评价化合物A在2000mg/kg/24小时的剂量下的耐受性和安全性。

方法：

雄性和雌性Simonsen大鼠如实施例C所述安装仪器来进行连续注射。治疗当天，将大鼠钩到持续输注系绳(constant infusiontether)上，使其自由获取水和食物。利用2.08ml/kg/小时的流速，将2000mg/kg/24小时的剂量的化合物A给予三个雄性和三个雌性大鼠。化合物A以42.5mg/mL的浓度溶解于水中，用1M HCl将pH调到4。用5M的NaCl将摩尔渗透压浓度调到约300mOsm。作为对照，两个雄性大鼠在相同时期内输注pH为4的生理盐水。定期观测大鼠的体症和活动，并注意工作日时每1～3小时记录它们的行为。

通过Fluotec 3喷雾器以1.5～2升/分钟的流速将5％异氟烷(Abbot Laboratories，NDC 0074-3292-02)100％氧气输送到室(chamber)中，将上述动物麻醉。用与涂有肝素的3cc注射器相连的23号针，通过心脏穿刺方法在静脉注射过程中获得血液样本。每个动物的血样分装在含K2-EDTA的微量管(Becton Dickinson，36/5974)、带有凝胶血清分离器(gel separator for serum)的微管(Becton Dickinson，36/5956)、和含有用于收集血浆的肝素锂的微管(Becton Dickinson，36/5958)中。如果可能的话，通过与3cc注射器相连的23号针从膀胱中除去尿液。组织样品按照下列次序采集：肝、肾、小肠、膀胱、和骨髓。小肠样品分成三等份，分别代表十二指肠、空肠、回肠；用一钝镊子以轻微的滑动压力(gentlesliding pressure)手动移走粪便物。对于各个组织，一部分样品置于10％的福尔马林缓冲液中，以进行组织学检测。为了测量有核骨髓细胞，用1ml的PBS(w/o Ca⁺⁺或Mg⁺⁺)冲洗股骨的骨髓腔得到骨髓样品，严格捣碎，涡旋以分离细胞。

为了进行细胞计数，将50μL的经EDTA处理的血液或PBS悬浮的骨髓冲洗液分别与450μL或950μL包含0.19mg/mL结晶紫(Sigma#C-1658，批号112H3660)的1M乙酸溶液的核染色溶液中，然后于室温下至少培养5分钟。经过短时间涡旋后，将10μL上述混合物的等分试样置于血球计上，使用Nikon Optiphot-2显微镜计数。在40x物镜下计数血样中的单核细胞(淋巴细胞和单核细胞)数和多形核白细胞数(PMN，包括嗜中性、嗜曙红、嗜碱性粒细胞)。在10x物镜下计数有核骨髓细胞。

经过EDTA处理的血液样品送至LabCorp(San Diego，CA)，进行血液分析，包括分析红细胞和血小板数，血红蛋白和血细胞比容。同样在LabCorp进行血清化学分析。将经过处理小鼠的组织标本进行编号，然后于福尔马林中送至Comparative Biosciences(Mountain View，CA)制备苏木素/曙红染色的组织切片，以便组织病理学分析。

结果：

观察药物处理组、载体处理组或未处理对照组的实验动物得出，各组动物能够耐受高剂量的化合物A，且没有显著的行为差异。解剖发现，所有经过灌注的动物的胃都是空的，没有观察到其他差异。没有测注射前或注射过程中的动物的体重和进食状况。

血液、骨髓、组织切片可以根据多个参数评价。其一为暴露于高浓度的化合物A后潜在的肝毒性或者与剂型有关的明显毒性。如前所述，在24小时处理后，并未观察到明显的毒性。所有血清化学和血液学参数均在正常范围内。与已公开的文献相比，只有少数样品产生了明显的异常值，但是其与未处理的对照组没有差异或者没有观察到相关毒性。在所有已评价的血清参数中，只有血清甘油三酯超出了正常范围。

测血液单核细胞、PMN、和骨髓数目是测试血液学上的潜在急性作用。我们预期在短期处理中不会有显著或明显的差异。事实上，未处理组、载体处理组和药物处理组的单核细胞和PMN细胞并未测得有显著差异。载体处理和药物处理的动物的有核骨髓细胞数也未有见显著差异。

取于肝、肾、小肠(十二指肠、空肠、回肠)和膀胱的组织样品经病理检测，所有样品中均未见显著的组织病理学发现。

结论：

当连续(至少24小时)高剂量静脉输注化合物A时，大鼠可很好地耐受化合物A。

实施例I：小鼠5天安全药理学

通过正常雄性大鼠5天重复剂量研究，来评价化合物C相对于母体化合物araC的安全性。

方法：

AraC购自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO，产品目录#C1768，批号39H5962)。将化合物C和araC均溶解于无菌的生理盐水中。每天用预先称重的药物制备储液。除了最高浓度以外，所有的浓度都可通过加入额外的生理盐水稀释储存液而制得。不马上用的药物冻于冰箱中，并于24小时内使用。所有药物以阿糖胞苷摩尔当量(CE)给药。

雄性NIH Swiss Webster小鼠(体重25～33g，Harlan SpragueDawley，Indianapolis，IN)在0～4天时，每隔一天腹腔内(i.p.)注射化合物C、araC、或载体，大约在动物轻循环(vivarium light cycle)开始的3～4小时后进行。化合物C的剂量为1000、300、100、和30mg/kg核苷当量/天(等于1848、554、185、和55.4mg/kg/天)，而araC给药剂量为100、30、10和3mg/kg/天。载体为盐水。在0～4天时化合物给药前称重，5天时取杀前称重。所有的小鼠在第5天时(最后一次i.p.剂量的23～25小时后)氟烷麻醉下放血，并脱颈取杀。如实施例H所述分析取自各个动物的血液的血液化学参数和血液学参数。切取肝组织样品，固定于10％的中性缓冲福尔马林中，用1mL无钙和镁的PBS冲洗右股骨得到骨髓，并如实施例H所述对有核细胞计数。

经EDTA处理的血液样品送至LabCorp(LabCorp，San Diego，CA)进行血液学分析，包括红细胞和血小板计数，血色素和血细胞比容检测。同时在LabCorp进行血清的化学分析。对取自利用载体或100mg/kg araC或1000mg/kg CE化合物C处理过的小鼠的组织样品编号，并于福尔马林中送至Comparative Biosciences(MountainView，CA)进行苏木素/曙红染色和组织病理学分析。组织病理样本的编号为：#1-7，化合物C，1000mg/kg/天；#33-40，araC，100mg/kg/天；#65-72，盐水载体。

结果以平均值±标准误差表示，每种剂量组的动物数为5～8只。对于所选的血液学参数，以载体组的平均值的百分比(％)来表示。用单元方差分析(one-way ANOVA)进行统计学分析，并进行Dunnett’s T检验(post-hoc test)比较对照组和各不同剂量组间的差异。P值小于0.05则可认为在统计学上显著性。

结果：

小鼠以不同的剂量连续腹腔内注射化合物C和araC 5天，在最后一次注射24小时后取杀小鼠。从行为和总的外表来看，实验小鼠未出现明显疾病。而araC的最高剂量组出现了逐渐的和统计意义上的体重下降(图3a，100mg/kg/天)，化合物C没有显著的效力，即使在最高剂量情况下(1000mg/kg/天的核苷当量)(图3b)。

以30和100mg/kg/天剂量给药时，araC显著地降低了有核细胞数、循环PMN数、单核细胞数、和血小板数(图4)。在araC的最高剂量情况下，骨髓细胞含量减少至经过载体处理的动物的11％。而化合物C若出现这种有核细胞数减少情况则需要30倍的剂量(图4a)。与araC相比，任何剂量下的化合物C都不会影响到PMN、单核细胞、或血小板(图4b～4d)。

AraC和化合物C都能够显著影响红血球参数，但影响剂量却相差10倍。在两个最高剂量30和100mg/kg/天的剂量下，AraC显著地降低了红细胞数、血细胞比容和血色素。在10mg/kg/天的araC剂量下，血细胞比容发生轻微改变。化合物C需在高10倍的剂量下才能相似程度的影响这些参数。

血清的化学分析表明大部分分析物并未受到任何化合物的影响。具体来说，肝功指标(胆红素，天冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶)与载体处理组、araC处理组、或化合物C处理的动物的相似。仅高剂量的araC组的碱性磷酸酶显著下降。所有处理组的白蛋白和BUN未见改变。araC最高剂量处理组(100mg/kg/天)的肌氨酸和葡萄糖降低了。araC 30mg/kg/天处理组和化合物C1000mg/kg/天处理组的葡萄糖降低。化合物C处理组的葡萄糖值变化是唯一能观察到变化的血清化学参数。

Comparative Biosciences的病理学家对取自利用载体或100mg/kg的araC或1000mg/kg的CE化合物C处理的小鼠的福尔马林固定的肝、肾、小肠标本进行评价，未发现任何样本中存在毒性相关的组织病理变化。

结论：

根据有核骨髓细胞、外周PMN、和单核细胞等血液学终点(endpoint)可知，在5天重复给药的条件下，化合物C的安全性大于等于araC的30倍。化合物C或者它的母体化合物araC都未观察到明显的肝脏毒性。

Claims (19)

1.一种化学式I的化合物、及其药学上可接受的药物前体和盐：

化学式I

其中：

M和V彼此互为顺式，而MH是阿糖胞苷；

所述阿糖胞苷的5’氧与所述磷相连；

V是4-吡啶基。

2.根据权利要求1所述的化合物，其中，所述化合物是化学式III的化合物：

化学式III。

3.一种用于治疗动物中表达P450的组织中的疾病的方法，所述方法通过给予化学式III的化合物、及药学上可接受的药物前体及其盐进行治疗，所述化学式III为：

化学式III。

4.根据权利要求3的方法，其中，所述表达P450的组织中的疾病选自由肝癌、结肠癌、以及肝脏病毒感染组成的组。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述表达P450的组织中的疾病是肝细胞癌。

6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述表达P450的组织中的疾病是结肠直肠癌。

7.一种预防在对动物中的癌症进行内科治疗或外科治疗之后表达P450的组织中癌症复发的方法，所述方法通过给予化学式III的化合物、及其药学上可接受的药物前体和盐来实现，所述化学式III为：

化学式III。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述动物是未患癌症的动物。

9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述动物是癌症症状缓解的动物，并且所述给予化学式III的化合物预防所述癌症的进一步发展。

10.一种通过给予化学式III的化合物、及其药学上可接受的药物前体和盐来提高阿糖胞苷的治疗指数的方法，所述化学式III为：

化学式III。

11.一种药物组合物，包括药用有效量的化学式I的化合物、其药学上可接受的药物前体和盐，所述化学式I为：

化学式I

其中：

M和V彼此互为顺式，并且MH是阿糖胞苷；

所述阿糖胞苷的5’氧与所述磷相连；

V是4-吡啶基。

12.根据权利要求11所述的药物组合物，包括药用有效量的化学式III的化合物，所述化学式III为：

化学式III。

13.一种药物组合物，所述药物组合物包括药用有效量的化学式I的化合物、其药学上可接受的药物前体和盐，以及药用有效量的溶瘤细胞剂、或其盐，及药学上可接受的赋形剂，所述化学式I如下：

化学式I

M和V彼此互为顺式，并且MH是阿糖胞苷；

所述阿糖胞苷的5’氧与所述磷相连；

V是4-吡啶基。

14.根据权利要求13所述的药物组合物，包括药用有效量的化学式III的化合物，所述化学式III为：

化学式III。

15.根据权利要求13所述的药物组合物，其中，所述溶瘤细胞剂选自由白消安、碳铂、顺铂、米芮铂、替莫唑胺、三胺硫磷、苯丙氨酸氮芥、异环磷酰胺、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、阿霉素、道诺霉素、表阿霉素、伊达比星、普卡霉素、戊柔比星、更生霉素、吉西他滨、氟尿苷、氟尿嘧啶、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、氨甲叶酸、丝裂霉素、依托泊苷、紫杉醇、多西紫杉、伊立替康、拓扑替康、依托泊苷、替尼泊苷、奈达铂、卡莫司汀、脱氧氟尿苷、克拉屈滨、氟达拉滨、卡莫司汀、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、azatoxin、喜树碱、勒托替康、喜树碱、9-氨基喜树碱、吡喃阿霉素、新制癌菌素、卡奇霉素、十元环烯二炔、以及luroteca组成的组。

16.一种治疗表达P450的组织中的癌症的方法，所述方法通过给予化学式III的化合物、其药学上可接受药物前体和盐，并通过给予药用有效量的溶瘤细胞剂来实现，所述化学式III为：

化学式III。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，将所述溶瘤细胞剂和所述化学式III的化合物分别进行给药。

18.根据权利要求16所述的方法，其中，将所述溶瘤细胞剂和所述化学式III的化合物同时进行给药。

19.根据权利要求16所述的方法，其中，所述溶瘤细胞剂选自由白消安、碳铂、顺铂、米芮铂、替莫唑胺、三胺硫磷、苯丙氨酸氮芥、异环磷酰胺、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、阿霉素、道诺霉素、表阿霉素、伊达比星、普卡霉素、戊柔比星、更生霉素、吉西他滨、氟尿苷、氟尿嘧啶、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、氨甲叶酸、丝裂霉素、依托泊苷、紫杉醇、多西紫杉、伊立替康、拓扑替康、依托泊苷、替尼泊苷、奈达铂、卡莫司汀、脱氧氟尿苷、克拉屈滨、氟达拉滨、卡莫司汀、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、azatoxin、喜树碱、勒托替康、喜树碱、9-氨基喜树碱、吡喃阿霉素、新制癌菌素、卡奇霉素、十元环烯二炔、以及luroteca组成的组。

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