CN1227039C

CN1227039C - 具有改善的生物相容性的医用假体器件和移植物

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Publication number: CN1227039C
Application number: CNB018202381A
Authority: CN
Inventors: S·P·林斯塔多斯; J·E·埃林森
Original assignee: Astra Tech AB
Current assignee: Straumann Holding AG
Priority date: 2000-12-06
Filing date: 2001-12-05
Publication date: 2005-11-16
Anticipated expiration: 2021-12-05
Also published as: BR0115849B1; CN1479635A; JP2009195731A; AU2095502A; EP1339437B1; BR0115849A; CA2431211C; EP1339437A1; BRPI0115849B8; WO2002045764A1; JP5068918B2; DE60104560D1; AU2002220955B2; JP2004515276A; CA2431211A1; DE60104560T2; ATE271887T1; ES2223965T3

Abstract

一种医用假体器件或医用移植物，含有一种金属材料(A)，选自钛或其合金、锆或其合金、钽或其合金、铪或其合金、铌或其合金和一种铬-钒合金，其中金属材料(A)的表面部分涂有一层分别相应的氢化物材料(B)，选自氢化钛、氢化锆、氢化钽、氢化铪、氢化铌和氢化铬和/或氢化钒，所述器件或移植物的特征在于氢化物材料(B)层包含一种或多种与其相结合的生物分子物质(C)。该器件或移植物表现出改进的生物相容性。金属材料(A)优选钛。

Description

具有改善的生物相容性的医用假体器件和移植物

技术领域

本发明涉及具有改善的生物相容性的医用假体器件和移植物。

背景技术

已经提出通过用氢化钛层涂布例如钛假体的金属表面来改善其生物相容性，例如采用等离子体轰击或采用电解。

还已经提出通过将各种活性生物分子键合或结合到假体表面上，例如钛假体的金属表面上来改善假体和移植物的生物相容性。由这种方式制备的移植物的目的是它们具有改进的固定；表现出增加的组织粘附性和增加的组织相容性；具有用于提高细胞生长、分化和成熟的生物活性表面；表现出免疫反应性降低；表现出抗菌活性；表现出生物矿化能力提高；导致改进的创伤和/或骨愈合；使得骨密度增加；降低了“时间/负载”并使得炎症减少。

通常建议采用例如含有两个反应官能团的化学反应物来进行这种键合，如甲醛或戊二醛，但是这些试剂的反应活性通常导致生物分子在生物学上失活和/或增强了不希望的免疫反应性。

发明概述

现在已经令人惊讶地发现，在采用电解进行无机处理以在金属上形成这些氢化物层期间，可以将多种生物分子互锁、键合、捕获和/或结合到氢化物层上。在此发现之前，一般认为在金属上键合并稳定化未修饰的生物活性生物分子是非常困难的，特别是在脊椎动物体内用作移植物的金属上的生物活性表面。

因此，本发明涉及一种医用假体器件或移植物，含有一种金属材料(A)，选自钛或其合金、锆或其合金、钽或其合金、铪或其合金、铌或其合金和一种铬-钒合金，其中金属材料(A)的表面部分涂有一层分别相应的氢化物材料(B)，选自氢化钛、氢化锆、氢化钽、氢化铪、氢化铌和氢化铬和/或氢化钒，其特征在于氢化物材料(B)层包含一种或多种与其相结合的生物分子物质(C)。在本发明的一个方面，生物分子物质(C)选自下列种类的物质：天然或重组生物粘合剂，天然或重组细胞粘附因子，天然、重组或合成生物大分子，天然或重组血蛋白，天然或重组酶，天然或重组胞外基质蛋白，天然或合成胞外基质生物分子，天然或重组生长因子和激素，天然、重组或合成多肽激素，天然、重组或合成脱氧核糖核酸，天然、重组或合成核糖核酸，天然或重组受体，酶抑制剂，药物，生物活性阴离子和阳离子，维生素，单磷酸腺苷，二磷酸腺苷或三磷酸腺苷，标记生物分子，氨基酸，脂肪酸，核苷酸，糖。

本发明还涉及一种制备上述医用假体器件和移植物的方法，所述方法包括将上述金属材料(A)的表面部分进行电解处理以形成氢化物材料(B)层，所述电解处理在一种或多种生物分子物质(C)的存在下进行。

发明详述

在本文中，术语“医用假体器件和移植物”的范围包括任何将要移植到脊椎动物体内的器件，特别是哺乳动物如人。这些器件的非限制性实例是下列替换解剖或修复身体功能的医用器件：如股髋关节；股骨头；髋臼；肘，包括茎、楔、关节嵌入物；膝，包括股骨和胫骨组件、茎、楔、关节嵌入物或髌骨组件；肩，包括茎和头；腕；踝；手；手指；足趾；椎骨；椎间盘；人造关节；牙齿移植物；ossiculoplastic移植物；中耳移植物，包括砧骨、锤骨、镫骨、砧骨一镫骨、锤骨-砧骨、锤骨-砧骨-镫骨；耳蜗移植物；整形外科固定器件如钉、螺丝、排钉和板；心脏瓣膜；起搏器；导管；脉管；腔隙充填移植物；保持助听的移植物；用于外部固定的移植物；还有子宫内器件(IUD)；以及生物电子装置如耳蜗内或颅内的电子装置。

在本文中，术语“生物分子”的含义涵盖并包括该措辞最广泛意义上的许多种生物学上是活性的分子，它们可以是天然生物分子(即衍生于天然来源的天然存在的分子)、合成生物分子(即合成制备的天然存在分子以及合成制备的非天然存在分子或分子形式)或者重组生物分子(即采用重组技术制备的生物分子)。

根据本发明，适用于结合到金属氢化物层(以一种稳定的和/或生理可逆的方式)的生物分子主要种类的非限制性清单如下。

提取的生物分子

生物粘合剂：

这些是介导细胞、组织、器官或生物体粘附到非生物表面如玻璃、石头等上的生物分子。该组生物分子包括海洋贝类粘合蛋白、纤维蛋白样蛋白、蛛网蛋白、衍生于植物的粘合剂(树脂)、从海洋动物中提取的粘合剂、和衍生于昆虫的粘合剂(如节肢弹性蛋白)。粘合剂的一些具体实例有：纤维蛋白；丝素蛋白；贝壳类足蛋白(贻贝类粘合蛋白)；其他贝类的粘合蛋白；具有甘氨酸富集链段的蛋白质和多肽；具有聚丙氨酸链段的蛋白质和多肽；以及蚕丝。

细胞粘附因子：

细胞粘附因子是介导细胞粘附并铺展到生物表面或其他细胞和组织上的生物分子。该组分子通常含有在脊椎动物发育、新生、再生或修复期间参与细胞-基质和细胞-细胞相互作用的分子。此类生物分子通常是在细胞外表面的分子，如白细胞上的CD类受体、免疫球蛋白和血凝细胞蛋白，以及粘合在这些细胞分子上的胞外基质分子/配体。可以用作涂有金属氢化物的移植物上的生物活性涂层的细胞粘附因子的典型实例有：锚蛋白；钙粘着蛋白(钙依赖型粘附分子)；连结蛋白；硫酸皮肤素；巢蛋白；纤维蛋白；纤连蛋白；糖脂；血型糖蛋白；糖蛋白；类肝素硫酸盐；肝素硫酸盐；透明质酸；免疫球蛋白；角质素硫酸盐；整合蛋白；层粘连蛋白；N-CAMs(钙非依赖型粘附分子)；蛋白聚糖；血影蛋白；粘着斑蛋白；玻连蛋白。

生物大分子：

生物大分子是任何在适当情况下能够组装成为聚合的大分子结构的生物制备分子。这些分子构成胞外基质的重要部分，其中它们参与提供组织弹性、强度、韧性、完整性等。一些可以用作涂有金属氢化物的移植物上的生物活性涂层的重要的生物大分子有：海藻酸盐；珐琅蛋白；纤维素；壳聚糖；胶原；明胶；低聚糖；胶质。

血蛋白：

此类蛋白质通常含有任何常存在于全血中的溶解或聚集蛋白。这些蛋白质可以参与广泛的生物过程，如炎症反应、细胞归位、凝血、细胞信号传导、防御、免疫反应、新陈代谢等。可以用作涂有金属氢化物的移植物上的生物活性涂层的典型例子有：白蛋白、精蛋白、细胞因子、IX因子、V因子、VII因子、VIII因子、X因子、XI因子、XII因子、XIII因子、血色素(含或不含铁)、免疫球蛋白(抗体)、纤维蛋白、衍生于血小板的生长因子(PDGF)、血纤维蛋白溶酶原、血栓收缩蛋白、转铁蛋白。

酶：

酶是对一种或多种生物底物具有特定催化作用的任何蛋白质或多肽，底物实质上可以是从简单的糖到复杂的大分子如DNA的任何物质。酶可以通过基质分子的降解以用于触发组织中的生物反应，或者它们可以用来在移植物涂层中激活或释放其他生物活性化合物。可以用作涂有金属氢化物的移植物上的生物活性涂层的一些重要例子有：抗体酶(具有酶活性的抗体)、腺苷酸环化酶、碱性磷酸酶、羧化酶、胶原酶、环加氧酶、水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、金属基质蛋白酶(MMP)、核酸酶、氧化还原酶、肽酶、多肽水解酶、肽基转移酶、磷脂酶、蛋白酶、蔗糖酶-异麦芽糖酶、TIMP、转移酶。

胞外基质蛋白和生物分子：

特异化细胞如成纤维细胞和成骨细胞产生胞外基质。该基质参与若干重要的过程。对于创伤愈合、组织动态平衡、分化和修复、组织强度、和组织完整性而言，基质都是至关重要的。基质还决定胞外环境如pH、离子强度、渗透压浓度等。此外胞外基质分子对于诱导和控制生物矿物质形成(骨，软骨，牙齿)也是至关重要的。可以用作涂有金属氢化物的移植物上的生物活性涂层的重要胞外蛋白质和生物分子包括：成釉细胞因子、amelin、珐琅蛋白、胶原(I-XII)、牙质-唾液酸-蛋白(DSP)、牙质-唾液酸-磷酸-蛋白(DSPP)、弹性蛋白、enamelin、纤维蛋白、纤连蛋白、角蛋白(1-20)、层粘连蛋白、tuftelin、碳水化合物、硫酸软骨素、类肝素硫酸盐、肝素硫酸盐、透明质酸、脂质和脂肪酸、脂多糖。

生长因子和激素：

生长因子和激素是结合到细胞表面结构上(受体)并在靶细胞内产生信号以开始特异性生物过程的分子。这些过程的例子是生长、细胞程序化死亡、其他分子的释放(例如胞外基质分子或糖)、细胞分化和成熟、代谢速率的调节等。可以用作涂有金属氢化物的移植物上的生物活性涂层的这些生物分子的典型例子有：活化素(Act)、双调蛋白(AR)、血管生成素(Ang 1-4)、Apo 3(一种弱凋亡诱导剂，也称之为TWEAK，DR3，WSL-1，TRAMP或LARD)、β-动物纤维素(BTC)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，FGFb)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF，FGF-a)、4-1BB配体、衍生于大脑的神经营养性因子(BDNF)、衍生于乳腺和肾的腺溶分泌物(BRAK)、骨形态发生蛋白(BMP)、B-淋巴细胞趋化物/B细胞趋化因子1(BLC/BCAl)、CD27L(CD27配体)、CD30L(CD30配体)、CD40L(CD40配体)、增殖诱导配体(APRIL)、血管营养因子-1(CT-1)、毛细神经营养因子(CNTF)、结缔组织生长因子(CTGF)、细胞因子、6-半胱氨酸趋化因子(6Ckine)、表皮细胞生长因子(EGF)、Eotaxin(Eot)、衍生于上皮细胞的嗜中性活化蛋白78(ENA-78)、促红细胞生成素(Epo)、成纤维细胞生长因子(FGF3-19)、Fractalkine、衍生于神经胶质的神经营养因子(GDNFs)、肾上腺糖皮质激素诱导的TNF受体配体(GITRL)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)、趋粒细胞蛋白(GCPs)、生长激素(GH)、I-309、生长相关的原癌基因(GRO)、抑制素(Inh)、可诱导α-干扰素的T-细胞趋化因子(1-TAC)、Fas配体(FasL)、Heregulins(HRGs)、结合肝素的表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)、fms样酪氯酸激酶3配体(Fit-3L)、Hemofiltrate CC趋化因子(HCC-1-4)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF 1 and 2)、可诱导γ干扰素的蛋白10(IP-10)、白细胞介素(IL 1-18)、γ干扰素(γ IFN)、角化细胞生长因子(KGF)、角化细胞生长因子-2(FGF-10)、Leptin(OB)、白血病抑制因子(LIF)、β-淋巴毒素(LT-B)、Lymphotactin(LTN)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、衍生于巨噬细胞的趋化因子(MDC)、巨噬细胞刺激蛋白(MSP)、巨噬细胞炎症蛋白(MIPs)、中核因子(MK)、单核细胞趋化蛋白(MCP-1到4)、γ干扰素诱导的单核因子(MIG)、MSX1、MSX 2、缪勒抑制物(MIS)、髓样前体抑制因子1(MPIF-1)、神经生长因子(NGF)、神经营养蛋白(NT)、嗜中性激活肽2(NAP-2)、制瘤素M(OSM)、骨钙蛋白、OP-1、骨桥蛋白、OX40配体、血小板衍生生长因子(PDGF aa，ab和bb)、血小板因子4(PF4)、Pleiotrophin(PTN)、肺和激活调节趋化因子(PARC)、激活正常T-细胞表达和分泌的调节因子(RANTES)、感觉和运动神经元衍生因子(SMDF)、小型可诱导细胞因子亚家族A成员26(SCYA26)、干细胞因子(SCF)、基质细胞衍生因子1(SDF-1)、胸腺和激活调节趋化因子(TARC)、胸腺表达趋化因子(TECK)、TNF和ApoL-相关的白细胞表达配体-1(TALL-1)、TNF-相关的细胞程序死亡诱导配体(TRAIL)、TNF-相关的激活诱导细胞因子(TRANCE)、可诱导淋巴毒素表达和与HSV糖蛋白质D竞争的HVEM T-淋巴细胞受体(LIGHT)、胎盘生长因子(PIGF)、血小板生成素(Tpo)、转移生长因子(TGFα，TGF β1，TGF β2)、肿瘤坏死因子(TNFα和β)、血管内皮细胞生长因子(VEGF-A，B，C和D)、降钙素和类固醇化合物如天然存在的性激素，如雌激素、孕酮、睾丸激素及其类似物。因此可以包括包含例如雌激素或孕酮或其类似物的某些移植物如IUD(子宫内器件)。

核酸(DNA)：

DNA为蛋白质和多肽编码基因。DNA还含有调节所包含基因表达的多个序列。存在若干类型的DNA，取决于来源、功能、起源和结构。可以用作移植物上的生物活性缓释涂层的DNA分子的典型例子有(局部基因疗法)：A-DNA；B-DNA；携带人工染色体的哺乳动物DNA(YAC)；染色体DNA；环DNA；携带粘粒的哺乳动物DNA；DNA；双链DNA(dsDNA)；基因组DNA；半-甲基化DNA；直链DNA；哺乳动物cDNA(互补DNA；RNA的DNA拷贝)；哺乳动物DNA；甲基化DNA；线粒体DNA；携带噬菌体的哺乳动物DNA；携带噬菌粒的哺乳动物DNA；携带质粒的哺乳动物DNA；携带质体的哺乳动物DNA；重组DNA；哺乳动物DNA的限制片段；携带反转录子的哺乳动物DNA；单链DNA(sDNA)；携带转位子的哺乳动物DNA；T-DNA；携带病毒的哺乳动物DNA；Z-DNA。

核酸(RNA)：

RNA是DNA-编码的信息的转录物。(有时(在一些病毒中)RNA是基本的信息编码单位)。除了作为基因表达的中间体外，还已经表明RNA具有若干生物功能。核酶是具有催化活性的简单RNA分子。这些RNA可以催化DNA和RNA断裂和连接，水解多肽，并且是RNA翻译为多肽的核心(核糖体是一种核酶)。可以用作涂有金属氢化物的移植物上的生物活性涂层的RNA分子的典型例子有：乙酰化的转移RNA(活化tRNA，带电荷tRNA)；环RNA；直链RNA；哺乳动物异源核RNA(hnRNA)，哺乳动物信使RNA(mRNA)；哺乳动物RNA；哺乳动物核糖体RNA(rRNA)；哺乳动物转运RNA(tRNA)；mRNA；聚腺苷酸化RNA；核糖体RNA(rRNA)；重组RNA；携带反转录子的哺乳动物RNA；核酶；转运RNA(tRNA)；携带病毒的哺乳动物RNA。

受体：

受体是结合信号(例如激素配体和生长因子)并且跨细胞膜传递信号并进入细胞内部的细胞表面生物分子。不同的受体甚至对于相同的配体都会激发不同的胞内反应。这使得细胞可以通过改变其表面上受体的模式来对外部信号产生不同反应。受体通常与它们的配体以可逆方式结合，使得它们适合用作将要释放到组织中的生长因子的载体。因此通过用生长因子受体涂布移植物，随后使这些受体与它们主要的配体结合，得到了可以用于在移植后控制生长因子向周围组织释放的生物活性表面。可以用作涂有金属氢化物的移植物上的生物活性涂层的合适受体的例子包括：CD类受体CD；EGF受体；FGF受体；纤连蛋白受体(VLA-5)；生长因子受体，IGF结合蛋白(IGFBP 1到4)；整合蛋白(包括VLA1-4)；层粘连蛋白受体；PDGF受体；转移生长因子α和β受体；BMP受体；Fas；血管内皮细胞生长因子受体(Flt-1)；玻连蛋白受体。

合成生物分子

合成生物分子是基于(模仿)天然存在生物分子的分子。在合成这些分子时，可以引入多种化学和结构修饰以使分子稳定化或使之更加生物活性或特异性。因此如果提取得到的分子很不稳定或非特异性，则可以对它们进行修饰并且合成它们以用作移植物表面涂层。此外，许多生物分子并不很丰富，以致于工业规模的提取是不可能的。这些稀有生物分子必需以合成方式制备，例如采用重组技术或采用(生物)化学技术。以下是几类可以用于移植物涂层的合成分子：合成DNA：A-DNA；反义DNA；B-DNA；互补DNA(cDNA)；化学修饰DNA；化学稳定化DNA；DNA；DNA类似物；DNA寡聚物；DNA大分子；DNA RNA杂交体；双链DNA(dsDNA)；半甲基化DNA；甲基化DNA；单链DNA(ssDNA)；重组DNA；三链DNA；T-DNA；Z-DNA。

合成RNA：

反义RNA；化学修饰RNA；化学稳定化RNA；异源核RNA(hnRNA)；信使RNA(mRNA)；核酶；RNA；RNA类似物；RNA-DNA杂交体；RNA寡聚物；RNA大分子；核糖体RNA(rRNA)；转运RNA(tRNA)。

合成生物大分子：

阳离子和阴离子脂质体；纤维素乙酸酯；透明质酸；聚乳酸；聚藻酸乙二醇酯；聚乙醇酸；聚脯氨酸；多糖。

合成多肽：

含有DOPA和/或DOPA的十肽；具有序列“Ala Lys Pro Ser TyrPro Pro Thr Tyr Lys”的多肽；脯氨酸用羟脯氨酸取代的多肽；其中一个或多个Pro用DOPA取代的多肽；其中一个或多个Pro用diDOPA取代的多肽；其中一个或多个Tyr用DOPA取代的多肽；多肽激素；基于上述提取蛋白的多肽序列；含有RGD(Arg Gly Asp)的多肽。

重组蛋白：

所有重组制备的多肽和蛋白。

合成酶抑制剂：

合成酶抑制剂的范围从简单的分子，如某些金属离子，它通过直接与酶结合来阻断酶活性，到可以模拟酶的天然底物并且因此与主要的底物竞争的合成分子。一种包括酶抑制剂的移植物涂层可以帮助稳定和抵消涂层上存在的其他生物分子的降解，从而实现生物活性化合物的更长反应时间和/或更高浓度。酶抑制剂的例子是：抑胃肽；聚脯氨酸；D-糖；D-氨基酸；氰化物；二异丙基氟代磷酸酯(DFP)；金属离子；N-甲苯磺酰基-1-苯基丙氨酸氯甲基酮(TPCK)；毒扁豆碱；对硫磷；青霉素。

用于结合到氢化物中的维生素(合成或提取)：

生物素；钙化醇(维生素D；对于骨矿化很重要)；柠檬素；叶酸；烟酸；烟碱；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，NAD⁺)；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯(NADP，NADPH)；视黄酸(维生素A)；核黄素；维生素B；维生素C(在胶原合成中很重要)；维生素E；维生素K。

用于结合到氢化物中的其它生物活性分子：

二磷酸腺苷(ADP)；单磷酸腺苷(AMP)；三磷酸腺苷(ATP)；氨基酸；环AMP(cAMP)；3，4-二羟基苯基丙氨酸(DOPA)；5′二(二羟基苯基-L-丙氨酸)(diDOPA)；diDOPA苯醌；DOPA-样间联苯酚；脂肪酸；葡萄糖；羟脯氨酸；核苷酸；核苷(RNA和DNA碱基)；前列腺素；糖；鞘氨醇1-磷酸酯；雷帕霉素；合成性激素如雌激素、孕酮或睾丸激素类似物，例如三苯氧胺；雌激素受体调节剂(SERM)如Raloxifene；双膦酸酯如阿仑特罗、risendronate和羟乙二磷酸酯；他汀如塞伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀和3，5-二羟基-7-[3-(4-氟苯基)-1-(甲基乙基)1H-吲哚-2-基]-庚-6-酸钠。

用于结合到氢化物涂层中的药物：

结合到氢化物层中的药物可以用于局部效应如改善局部抗微生物侵入，局部控制疼痛，局部抑制前列腺素合成；局部炎症调节，局部诱导生物矿化和局部刺激组织生长。适用于结合到金属氢化物层中的药物的例子包括：抗生素；环加氧酶抑制剂；激素；免疫抑制剂；NSAID；止痛剂；前列腺素合成抑制剂；类固醇，四环素(也作为生物矿化剂)。

用于结合到氢化物层中的生物活性离子：

在各种生物机理中离子都是很重要的。提高在移植物上的金属氢化物中结合生物活性离子，可以局部刺激生物过程如酶功能、酶阻断、生物分子的细胞摄取、特殊细胞的回归、生物矿化、凋亡、生物分子的细胞分泌、细胞代谢和细胞防卫。用于结合到金属氢化物中的生物活性离子的例子包括：钙；铬；铜；氟化物；金；碘；铁；钾；镁；锰；硒；银；钠；锌。

标记生物分子：

生物标记物是产生可检测信号的分子，例如通过发射光、酶活性、放射活性、特殊颜色、磁性、x-光密度、具体结构、抗原性等，它可以用特定仪器或用显微镜或成像方法如x-光或核磁共振检测。在研究和开发新的生物医用治疗策略时标记物用来监测生物过程。在移植物上，这些标记物通常可以用来监测下列过程，如生物相容性、组织形成、组织再生、生物矿化、炎症、感染、再生、修复、组织动态平衡、组织裂解、组织更新、生物分子从移植物表面的释放、释放生物分子的生物活性、从移植物表面释放的核酸的摄取和表达、以及移植物表面的抗菌能力，以在临床研究之前提供“主要的证据”、效力、效果和安全可靠性。

适用于结合到氢化物涂层中的标记生物分子包括：钙黄绿素；茜素红；四环素；氢化荧光素；fura；荧光素酶；碱性磷酸酯酶；放射标记的氨基酸(例如用³²P、³³P、³H、³⁵S、¹⁴C、¹²⁵I、⁵¹Cr、⁴⁵Ca标记)；放射标记的核苷酸(例如用³²P、³³P、³H、³⁵S、¹⁴C标记)；放射标记的多肽和蛋白；放射标记的DNA和RNA；免疫金络合物(连接有抗体的金颗粒)；免疫银络合物；免疫磁性络合物；绿色荧光蛋白质(GFP)；红色荧光蛋白质(E5)；生物素标记的蛋白质和多肽；生物素标记的核酸；生物素标记的抗体；生物素标记的碳连接体；报道基因(在表达时产生信号的任何基因)；碘化丙啶；二脒基黄。

根据本发明的器件和移植物可以用于多种目的。这些目的的例子包括用于：在移植位点诱导局部硬组织形成(例如骨组织)；在移植位点处或系统地控制微生物生长和/或入侵；在移植位点处或系统地减少炎症；刺激韧带修复、再生或形成；诱导软骨形成；成核、控制和/或作为生物矿化的模板；改善移植物和组织之间的连接；改善移植物的骨整合；改善组织粘附到移植物上；阻碍组织粘附到(半永久性的或暂时的)移植物上；改善组织或组织和移植物之间的接触，改善(外科)创伤的组织愈合；在不希望的细胞中(例如肿瘤细胞)诱导凋亡(细胞死亡)；诱导特定细胞分化和/或成熟，提高组织抗张强度；改善伤口愈合；加速伤口愈合；为组织形成提供模板；指导组织形成；局部基因治疗；刺激神经生长；改善移植物附近组织中的血管形成；刺激局部胞外基质合成；抑制局部胞外基质降解；诱导局部生长因子释放；提高局部组织代谢；改善组织或身体器官的功能；减少局部疼痛和不适。这些目的将取决于移植物的类型以及移植物上氢化物涂层中存在的生物分子的性质和/或浓度。

当金属材料(A)是一种钛、锆、钽、铪或铌的合金时，它可以是一种或多种这些金属元素的合金；或者它可以是含有一种或多种其他金属的合金，如铝、钒、铬、钴、镁、铁、金、银、铜、汞、锡或锌；或者都有。

优选金属材料(A)是钛或其一种合金，例如与锆、钽、铪、铌、铝、钒、铬、钴、镁、铁、金、银、铜、汞、锡或锌的合金。在一个特别优选的实施方案中，金属材料(A)是钛。

对应的氢化物材料(B)优选氢化钛。

存在于涂有氢化物的假体、器件和移植物部件的氢化物层(B)上或其中的生物分子物质(C)的量可以在很宽范围内变化，例如取决于生物分子物质或所讨论物质的化学和生物性质。因此，与氢化物材料(B)相关的生物分子物质(C)的量可以是低至1皮克/mm²-高至1毫克/mm²氢化物涂布器件和移植物表面。但是预计大多数可用的生物分子涂层范围是0.1纳克-100微克/mm²。

如上所述，本发明的方法包括将金属材料(A)的表面部分进行电解处理以形成氢化物层(B)，所述处理在一种或多种如上所讨论的生物分子物质存在下进行。已经发现重要的是电解液中的条件(pH，离子强度等)要使得这些生物分子具有净的正电荷。因此有利的是多数生物分子是两性电解质，即它们是根据溶于其中的溶液的离子强度和pH来改变其净电荷的弱酸(或碱)。因此对于将其结合到氢化物层中，主要关心的是在制备生物-氢化物所需条件下的稳定性，即为制备氢化物提供足够的H⁺离子而且同时保持所讨论生物分子的净电荷为正的环境。这在很大程度上意味着电解液应当具有较高的盐浓度，从而是高的离子强度；相对高温，尽管优选的是低于生物分子物质的任何失活温度；以及低pH。

因此电解液可以是任何盐溶液，优选水溶液，例如氯化钠、硫酸钠、磷酸钙、氯化钙、磷酸盐缓冲液(PBS)、生理盐水(模仿生理环境的盐溶液)、碳酸氢盐、碳酸盐等的溶液，其中溶解有所需生物分子。盐的离子强度通常是1M，但是浓度可以根据生物分子的化学性质和浓度调节到低至0.01M-高至10M。

含有生物分子的电解液的温度范围可以是常温(20℃)-电解液的沸点，通常在100℃左右，尽管在此范围上限的使用温度明显取决于生物分子耐受该温度的能力。如果生物分子能够耐受，则形成氢化物的最佳温度约为80℃。

电解液的pH通常用强酸调节到所需pH，例如HCl、HF、H₂SO₄等。尽管应该考虑到pH低于2将会在钛上产生不规则的腐蚀移植物表面，而pH大于2则会保留原始表面。pH根据所需氢化物/生物分子比例来调节；低pH产生具有高氢化物/生物分子比例的移植物表面(＝更多金属氢化物)，而接近于所讨论生物分子pI的高pH将会产生具有低氢化物/生物分子比例的表面(＝更多生物分子)。因此，尽管0-10之间的任何pH都可以使用，但用于制备氢化物的优选pH介于5-2，取决于生物分子的化学性质和浓度、所采用的电解液和优选的氢化物/生物分子比例。对于较高的氢化物/生物分子比例(＝更多氢化物)，调节pH更加酸性，对于较低的氢化物/生物分子比例(＝更多生物分子)，调节pH更接近但不高于生物分子的pI。唯一的条件是电解液中存在氢离子(H⁺)和生物分子带正电荷(生物分子⁺，净电荷)。

电解液中生物分子的浓度(一种或两种及以上的组合)可以在非常宽的范围内变化，取决于生物活性的类型、分子的类型、化学和生物性质、毒性、效力、作用模式，如果将要从氢化物层中释放或不释放，还要取决于体内稳定性、电解液中的稳定性、利用率、最佳pH等。因此，电解液中生物分子的浓度范围可以是1pg-50mg/ml。优选的范围是10pg-1mg/ml，但最佳的生物分子浓度应该一直通过用每种生物分子或生物分子混合物在飞行实验中最终测定。此外，电解进行的时间可以变化，但主要影响氢化物层的厚度并从而影响氢化物层中生物分子的浓度。

用于本发明方法的电解池可以是任何传统设计，但通常是一种两室电解池，在室之间除了电解液之外没有任何导电连接。将要进行氢化物改性的金属移植物置于阴极室(即负电极)，而阳极(正电极)通常由碳制成，置于分离的室中。每个室的电解液通过多孔玻璃或陶瓷过滤器连接，以使电流可以无阻碍地通过但不会在两个室之间进行任何电解液的任何交换。这是重要的，因为阳极反应生成的产物，例如氯化物或次氯酸盐等，能够潜在地干涉生物分子-氢化物层的形成或者破坏或改变阴极电解液中生物分子的性质。

两室的分离还使得可以使用较少体积的阴极电解液并因此更有效地使用生物分子以及可能采用双电解液体系，这会使电解过程更加优化，例如在阴极侧最适合于生物分子的一种电解液和在阳极侧使电解本身的效果更好的一种电解液(导电性，避免毒性产物，或甚至产生有用的副产物/涂层)。

如上所述，阴极室内的温度(T_cat)应当尽可能高，用于氢化物制备的最佳温度为80℃。

电解过程本身也会产生热量，这会造成两个问题；电解液的成分将会被蒸发使得体积减小，并且离子强度和生物分子的浓度增加超过优选的范围，并且温度的升高可能导致存在的生物分子的沉淀、凝集、失活、降解或破坏。因此，电解池的阴极室优选装配有冷却盖以将蒸发的电解液冷凝和温度调节散热器以使电解期间的温度和体积保持稳定。

通过调节电流、电荷和电解液组成，还可以为多数生物分子提供一个正电荷的有利环境。如果不这么作，那么采用在生物氢化物层制备期间以可控循环的方式变化电极极性的脉冲场电解装置也可以是避免负净电荷问题的一种方法。

电源通常是所谓的电流泵，即输送恒定电流的装置，即使在电路中电阻会变化。尽管电压可以采用0.1-1000伏，但通常电压低于10伏。电解期间的电流密度范围通常是0.1mA-1A/平方厘米(cm²)移植物样品。优选的电荷密度是1mA/cm²，尽管调节电解液、pH和温度以增加生物分于的相容性可以造成高于或低于此数值的变动。

处理持续时间取决于若干参数，如所需的生物氢化物层的厚度，电解液的组成和特性，生物分子的特性，温度和pH，所需的氢化物/生物分子比例，移植物样品的尺寸，阴极电解液的体积，生物分子的浓度等。因此，处理持续时间可以介于0.5小时到几天。但是最佳的时间通常是8-24小时。

为了监控生物氢化物处理，甘汞电极通常可以置于阴极室中。当在阴极的氢化物层形成过程最优化时，观察到在甘汞电极和阴极之间有1伏的电压降。如果电流与此数值的差距较大时，该过程将在次最佳状态下进行并且应该考虑装置中的变化。此外，温度传感器和pH传感器通常可以置于阴极室以监控该过程是否在所需pH和温度范围内进行。搅拌装置如磁力搅拌器也可以用于阴极池中以连续混合电解液并且保持温度均匀和避免局部离子强度、pH和生物分子浓度的变化。

电解步骤之后，现在的生物分子/涂有金属氢化物的器件和移植物立即从电解液中取出并且按照所讨论生物分子的需要进行处理。通常将该装置和移植物样品风干并随后包装在无菌、密封的塑料袋中，在其中储存直至用于移植。但是某些生物分子可能对干燥敏感，因此可能需要湿润的储存体系，例如罐或储存在流体如盐水中，或者简单地在制造过程的电解液中。尽管电解可以在无菌或甚至消毒的条件下进行，但并不需要这么作，可以在使用前采用常规方法进行消毒步骤如离子辐射、加热、高压釜或环氧乙烷气体等。方法的选择将取决于金属氢化物层中生物分子的具体特性和性质。

电解处理之前，器件和移植物应当彻底清洗。如果需要，移植物通常可以采用电解抛光或喷沙进行机械预处理以使表面结构改性，并随后采用热苛性钠溶液彻底清洁，接着进行脱脂步骤，例如在浓三氯乙烯、乙醇或甲醇中，然后在酸洗溶液例如氢氟酸中处理以除去表面上的氧化物和杂质。酸洗之后，移植物样品在热的二次蒸馏离子交换水中彻底清洗。

本发明通过以下非限制性实施例加以进一步说明，其中实施例1-4描述已进行的实验，实施例5-11描述预期的加工实施例。

实施例1

制备含有一种胞外基质蛋白的氢化钛移植物表面层。

采用两室电解池来制备氢化钛层，在每个表面积为0.6cm²的五个硬币状电解抛光后的钛移植物上含有胞外基质分子珐琅蛋白的氢化钛层暴露于电解液中。放置在电解液室中的五个相同样品用作对照，但是不与电解电流连通。两个室中的电解液都是无菌水中的1M NaCl，采用盐酸将pH调节到pH4，珐琅蛋白的初浓度为0.1mg/ml。电解采用的电压是10伏，电荷密度为1mA/cm²。阴极室的温度设定在70℃。电解进行18小时，随后从电解池中取出钛移植物，在无菌水中清洗并在干燥器中风干。

干燥后，钛测试和对照样品在1ml盐水中分别洗涤三次，pH为6.5。洗涤之后，通过将钛样品在0.5ml 2xSDS-PAGE样品缓冲液(0.4gSDS，1.0g 2-巯基乙醇，0.02g溴酚蓝和4.4g甘油在10ml 0.125MTris/HCl，pH6.8)中煮沸使残留在钛表面上的任何蛋白质溶解。其中可能含有蛋白质的洗涤溶液和2xSDS-PAGE样品缓冲液用等体积0.6N高氯酸沉淀，上清液通过离心澄清。含有盐和可能的有机分子的沉淀丸粒随后溶解在50ml 2xSDS-PAGE样品缓冲液中并且煮沸5分钟。所有样品随后在12％SDS聚丙烯酰胺凝胶中于80mA进行电泳过夜。电泳之后，凝胶中的蛋白质通过半干燥“三明治”电转印技术转移到聚偏氟乙烯膜上。随后采用兔珐琅蛋白特异IgG一抗和生物素标记羊抗兔IgG二抗通过免疫测试来检测珐琅蛋白。蛋白印迹表明在从测试样品的提取物中存在显著量的珐琅蛋白，并从而被捕获在其上的氢化钛层中，而不与电解电流连通的对照样品的提取物中没有检测到珐琅蛋白。

该实验清楚地表明在电解过程中显著量的珐琅蛋白结合到氢化物层中。珐琅蛋白并不仅仅作为简单的涂层存在，因为没有证据表明在最初的洗涤溶液中存在蛋白质。是强洗涤剂(SDS)、还原剂(巯基乙醇)和高温(100℃)的组合使珐琅蛋白从氢化钛表面层提取出来并用蛋白印迹检测。提取出的蛋白质的量通过与珐琅蛋白标准物对比计算为50μg/cm²。该数值恰好在该胞外基质蛋白的生物活性范围内。

实施例2

生产含有珐琅蛋白的氢化钛移植物表面层。

采用实施例1的装置生产氢化钛层，在表面积为0.35cm²的电解抛光后的钛移植物上含有胞外基质分子珐琅蛋白的氢化钛层暴露于电解液中。两个室中的电解液都是无菌水中的1M NaCl，采用盐酸将pH调节到pH4，珐琅蛋白的初浓度为0.1mg/ml。电解采用的电压是10伏，电荷密度为1mA/cm²。阴极室的温度设定在70℃。电解进行18小时，随后从电解池中取出钛移植物，在无菌水中清洗并在干燥器中风干。

干燥后，钛样品在1ml盐水中洗涤三次，pH为6.5。洗涤之后，通过将钛样品在0.1ml 2xSDS-PAGE样品缓冲液(0.4g SDS，1.0g2-巯基乙醇在10ml 0.125M Tris/HCI，pH6.8)中煮沸5分钟使残留在钛表面上的蛋白质溶解。从清洗后的钛表面上溶解到SDS溶液中的珐琅蛋白量随后通过标准的在280nm和310nm对比2xSDS空白样品缓冲液测定光吸收度来分析，并且将结果与2xSDS样品缓冲液中的珐琅蛋白系列标准稀释液比较。该实验在16个移植物的系列中重复两次，两次都采用在整个处理期间位于反应室内但不与阴极连接的5个相同钛移植物形式的阴性内部对照。

该实验清楚地表明在电解过程中显著量的珐琅蛋白结合到氢化物层中。珐琅蛋白并不仅仅作为简单的涂层存在，因为没有证据表明在洗涤溶液中存在蛋白质。是强洗涤剂(SDS)、还原剂(巯基乙醇)和高温(100℃)的组合使珐琅蛋白从氢化钛表面层提取出来。提取出的蛋白质的量通过与珐琅蛋白标准物对比计算，范围是57-114μg/cm²，平均值是87μg珐琅蛋白/cm²。该数值恰好在该胞外基质蛋白的生物活性范围内。作为实验移植物但不与阴极连接的位于相同电解池中的相同对照移植物表明没有显著量的珐琅蛋白结合到表面上(＜1μg/cm²)。

实施例3

生产含有核酸的氢化钛移植物表面层。

采用实施例1的装置生产氢化钛层，在总表面积为0.35cm²的电解抛光后的钛移植物上含有放射标记的全人胎盘DNA形式核酸的氢化钛层暴露于电解液中。两个室中的电解液都是无菌水中的1M NaCl。采用盐酸将pH调节到pH2。电解液中DNA的初浓度为10μg/ml。电解采用的电压是10伏，电荷密度为1mA/cm²。阴极室的温度设定在75℃。电解进行16或24小时，随后从电解池中取出钛样品，在足量Tris-EDTA缓冲液(TE-缓冲液；10mM Tris-Cl和1mM EDTA在无菌水中，pH7.6)中清洗三次，然后在干燥器中风干过夜。

DNA采用Stratagene Prime-ItII随机引物标记试剂盒进行放射标记，以生产高度特异活性的探钟和[a-³²P]dATP(Amersham)。标记DNA之后，在Packard Tricarb闪烁计数器中测量DNA探针的比放射活度为3.0×10⁸崩解/分钟/μg标记的DNA(dpm/μg)。

干燥后，连接有试验核酸的钛样品放置在磷光屏上(phosphorscreen)(Fujii)15分钟。然后取出样品，磷光屏随后在BioRad磷成像仪上采用100μm光栅(12265点/移植物)进行扫描，测量在每个移植物表面上产生的崩解数。该实验在16个移植物的系列中重复两次，两次都采用在整个处理期间位于反应室内但不与阴极连接的5个相同钛移植物形式的阴性内部对照。第一系列的反应时间为24小时，第二系列为16小时。计算dpm/移植物的总数并且转换为μg DNA/平方厘米(μgDNA/cm²)。

当反应时间是24小时，移植物上DNA量的范围是0.25-0.75μg/cm²，平均值为0.43μgDNA/cm²。当反应时间减少到16小时时，各自的数值范围是0.19-0.32μg/cm²，平均值是0.30μgDNA/cm²。该数值恰好在基因疗法和DNA疫苗以及其他分子医药领域的可用范围内。作为实验移植物但不与阴极连接的位于相同电解池中的相同对照移植物表明仅有很少量的(pg)DNA结合在表面上。

该实验清楚地表明在电解过程中显著量的DNA结合到氢化物层中。DNA并不仅仅作为简单的涂层存在，因为在用TE洗涤期间DNA没有溶解或从测试移植物上洗掉。此外，结合到氢化钛表面层中的DNA量随反应时间线性增加的事实也表明调节反应时间是一种控制氢化物层中生物分子的量的简便方式。

实施例4

制备含有抗坏血酸的氢化钛移植物表面层

采用实施例1的装置生产氢化钛层，在总表面积为0.35cm²的电解抛光后的硬币状钛移植物上含有抗坏血酸(维生素C)的氢化钛层暴露于电解液中。两个室中的电解液都是盐水，采用磷酸将pH调节到pH 3。抗坏血酸的初浓度是10mg/ml。电解采用的电压是6伏，电流密度为2mA/cm²，阴极室的温度为20℃。电解进行16小时，随后从电解池中取出钛移植物，在无菌水中清洗两次并在干燥器中风干。

干燥过夜后，通过将样品在1ml Triss-EDTA缓冲液(TE-缓冲液；10mM Tris-Cl和1mM EDTA在无菌水中)于pH8.0浸泡1小时并摇晃将试验抗坏血酸从钛样品上溶解下来。缓冲液样品中抗坏血酸的量随后通过在250nm处测量光吸收度并将结果与抗坏血酸在TE(pH8.0)中于此波长处的标准曲线进行比较来分析。作为实验移植物但不与阴极连接的位于相同电解池中的相同对照移植物可以用作对照。该实验在16个移植物的系列中重复两次，两次都采用5个阴性内部对照。

从钛样品提取的抗坏血酸量通过与抗坏血酸标准物比较进行计算，范围是28-76μg/cm²，平均值是39μg抗坏血酸/cm²。该数值恰好在该维生素的生物活性范围内(人体中通常血浆浓度范围是8-15μg/ml)。作为实验移植物但不与阴极连接的位于相同电解池中的内部对照样品表明仅有痕量的抗坏血酸结合到表面上(＜4μg/cm²)。该试验清楚地表明在电解过程期间生物显著量的抗坏血酸可以结合或连接到氢化钛层中。

实施例5

制备含有基于合成生长因子的多肽的氢化钛移植物表面层

采用实施例1的装置制备氢化钛层，在总表面积为0.6cm²的电解抛光后的硬币状钛移植物上含有合成的全长度(37个氨基酸)成纤维细胞生长因子4(FGF-4)多肽的氢化钛层暴露于电解液中.电解液、pH、电压、电流密度和电解时间可以适当地如实施例1。FGF-4的初浓度可以适当地是0.1mg/ml，阴极室温度可以适当地是50℃。

如实施例1在盐水和2xSDS-PAGE缓冲液中洗涤、沉淀、离心、再溶解于SDS-PAGE、煮沸和电泳后，凝胶中的蛋白质可以转移到银染色溶液中，全长度合成FGF-4多肽显色为凝胶中的明显条带。作为实验移植物但不与阴极连接的位于相同电解池中的相同对照移植物可以用作对照。

实施例6

制备含有抗生素的氢化钛移植物表面层

可以采用实施例1的装置制备氢化钛层，在表面积为0.6cm²的电解抛光后的硬币状钛移植物上含有抗生素阿莫西林(羟氨苄青霉素)的氢化钛层暴露于电解液中。两个室中的电解液都是无菌水中的1MNaCl。采用盐酸将pH调节到pH2，阿莫西林的初浓度是5mg/ml。电解采用的电压是10伏，电荷密度为1mA/cm²，阴极室的温度是50℃。电解可以进行24小时，随后将钛移植物从电解池中取出，在无菌水中清洗并在干燥器中干燥。

干燥后，捕获在钛移植物上氢化物层中的阿莫西林量可以通过对青霉素敏感的菌种大肠杆菌(E.coli)的抗菌效果来估计(K12株，液体培养基中)。培养基适当地在5ml LB肉汤中接种有一个E.coli K12克隆。接种后，被修饰的移植物和对照物置于培养基中并且培养基在37℃孵育过夜。第二天，培养基中存在的细菌量可以通过光度法并与标准稀释液比较进行评价。作为实验移植物但不与阴极连接的位于相同电解池中的相同对照移植物可以用作对照。

实施例7

制备诱导生物矿化的氢化钛移植物表面层

可以采用实施例1的装置制备氢化钛层，氢化钛层含有可能用作在磷酸钙饱和溶液中形成矿物质的生物成核剂的合成聚脯氨酸多肽。生物分子可以结合到总表面积为0.6cm²的电解抛光后的硬币状钛移植物表面上的氢化物层中，氢化物层暴露于电解液中。两个室中的电解液都可以是无菌水中的1M NaCl，采用盐酸将pH调节到pH2，合成聚脯氨酸的初浓度可以是0.1mg/ml。电解采用的电压是10伏，电流密度为1mA/cm²，阴极室的温度是70℃。电解可以适当地进行18小时，随后将钛移植物从电解池中取出，在无菌水中清洗并在干燥器中风干。

干燥后，结合有试验矿物成核多肽的钛移植物和对照物置于5ml磷酸钙饱和溶液中。室温下孵育4小时后，从矿物溶液中取出移植物，在无菌水中清洗并在干燥器中风干。干燥后，移植物可以直接进行扫描电镜观察以测定在改性后的表面上矿物焦点的数目。作为实验移植物但不与阴极连接的位于相同电解池中的相同对照移植物可以用作对照。

实施例8

制备溶胀(填充腔隙)生物分子-钛-氢化物移植物表面层。

可以采用实施例1的装置制备氢化钛层，在总表面积为0.6cm²的电解抛光后的硬币状钛移植物上含有藻酸钙纳米球(Pronova AS)的氢化钛层暴露于电解液中。两个室中的电解液都是无菌水中的1M CaCl₂，采用盐酸将pH调节到pH5.5，藻酸钙的初浓度适当地是1％w/v。电解可以采用的电压是10伏，电流密度为1mA/cm²，阴极室的温度是35℃。电解可以适当地进行48小时，随后将钛移植物从电解池中取出，在冷无菌水中清洗并在干燥器中风干。

干燥后，具有氢化物-藻酸盐层的钛移植物适当地浸泡在无菌盐水中，用溴酚蓝染色(0.02g/ml)并用改性表面贴着溶液在37℃孵育1小时。在染色盐水中孵育之后，移植物和对照物在蒸馏水中洗涤并用放大镜观察蓝色染料在试验溶胀藻酸盐层中的保持。藻酸盐层的厚度还可以通过在校准光学显微镜下观察移植物边缘来测定。作为实验移植物但不与阴极连接的位于相同电解池中的相同对照移植物可以用作对照。

实施例9

制备双层生物分子-钛-氢化物移植物表面

可以采用实施例1的装置制备在总表面积为0.6cm²的电解抛光后的硬币状钛移植物表面上含有双层生物分子的氢化钛层，氢化钛层暴露于电解液中。内层可以采用珐琅蛋白作为生物分子按照实施例1的方法制备。此处理完毕后，立即并且不进行风干，改变电解液和条件按照实施例3的方式采用基因组人DNA作为生物分子。以这种方式，可以制备具有氢化钛-DNA外层，覆盖氢化钛-珐琅蛋白内层的钛移植物。电解后将移植物从电解池中取出，在无菌水中清洗并在干燥器中风干。

干燥后，结合有试验核酸和蛋白质的钛样品在Tris-EDTA缓冲液(TE-缓冲液；10mM Tris-Cl和1mM EDTA在无菌水中)中适当地洗涤三次。在每次洗涤中pH逐渐增加，起始于pH7.4，然后在pH7.6洗涤，最后在pH8.0。在TE中洗涤后，钛移植物上残留的DNA和蛋白质最后采用0.1N NaOH除去。洗涤级份随后分为两部分：一部分用于核酸分析，另一部分用于蛋白质分析。DNA级份用等体积的无水乙醇在-20℃沉淀1小时，然后在4℃以13000g离心从上清液中澄清。随后丸粒溶解在50μl TE缓冲液(pH7.4)中，所有四次洗涤溶液中的DNA量采用Hoechst染料通过荧光分析来测定(BoehringerMannheim)。

用于蛋白质分析的级份用等体积的0.6N高氯酸适当地沉淀，上清液通过离心澄清。含有盐和蛋白质的沉淀丸粒随后溶解在50μl2xSDS-PAGE样品缓冲液中(0.4g SDS，1.0g 2-巯基乙醇，0.02g溴酚蓝和4.4g甘油在10ml 0.125M Tris/HCI，pH6.8)并煮沸5分钟。所有样品随后在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中于80mA进行4小时电泳。电泳后，凝胶中的蛋白质转移到银染色溶液中，存在于级份中的珐琅蛋白在凝胶中显示明显的条带。作为实验移植物但不与阴极连接的位于相同电解池中的相同对照移植物可以用作对照。

实施例10

制备双区生物分子-钛-氢化物层合移植物表面。

可以采用实施例1的装置制备两个分离的氢化钛层区域。总面积为2cm²的电解抛光后的棒状钛移植物按照实施例3和6的方式处理。首先移植物置于实施例3的电解液中，以使每个移植物只有一半浸泡在电解液中。

实施例3的处理结束后，将移植物翻转并置于类似于实施例6中所使用的一种新电解液中，以使每个移植物未处理的一半现在浸泡在电解液中。然后进行实施例6的处理和反应条件，随后将钛样品从电解池中取出，在无菌水中清洗并在干燥器中干燥。

电解后，双区移植物沿中心切成两半。层合有氢化钛-合成FGF-4多肽的一半可以按照实施例2进行分析。移植物的另一半层合有氢化钛-阿莫西林，可以按照实施例5在细菌生长试验中进行分析。作为实验移植物但不与阴极连接的位于相同电解池中的相同对照移植物可以用作对照。

实施例11

制备含有生物分子的诱导成骨的氢化钛移植物表面层

如实施例1中制备的移植物(氢化钛-珐琅蛋白)置于兔胚骨中的校准骨缺陷中，采用标准化和有效的模式确保开窗术贯通到移植物下的骨髓中，使得成骨细胞迁移到改性移植物表面上(Rnold和Ellingsen，European Society for Biomaterials Conference，Amsterdam，October 2000)。在手术后的当天和每周对兔子进行10mg/kg体重的静脉内钙黄绿素(Sigma)注射。在植入改性移植物和对照移植物四周时，杀死兔子并取出胫骨，在4％甲醛中固定并且包埋以制备通过骨和整合移植物材料的基础切片。作为实验移植物但不与阴极连接的位于相同电解池中的相同对照移植物可以用作对照。

Claims

1.一种医用假体器件或医用移植物，含有一种金属材料(A)，选自钛或其合金、锆或其合金、钽或其合金、铪或其合金、铌或其合金和一种铬-钒合金，其中金属材料(A)的表面部分涂有一层分别相应的氢化物材料(B)，所述氢化物材料(B)选自氢化钛、氢化锆、氢化钽、氢化铪、氢化铌和氢化铬和/或氢化钒，其特征在于氢化物材料(B)层包含一种或多种与其相结合的生物分子物质(C)。

2.权利要求1的医用假体器件或医用移植物，其中金属材料(A)是钛或其合金。

3.权利要求1的医用假体器件或医用移植物，其中生物分子物质(C)选自下列种类的物质：天然或重组生物粘合剂，天然或重组细胞粘附因子，天然、重组或合成生物大分子，天然或重组血蛋白，天然或重组酶，天然或重组胞外基质蛋白，天然或合成胞外基质生物分子，天然或重组生长因子和激素，天然、重组或合成多肽激素，天然、重组或合成脱氧核糖核酸，天然、重组或合成核糖核酸，天然或重组受体，酶抑制剂，药物，生物活性阴离子和阳离子，维生素，单磷酸腺苷，二磷酸腺苷或三磷酸腺苷，标记生物分子，氨基酸，脂肪酸，核苷酸，糖。

4.权利要求1的医用假体器件或医用移植物，其中生物分子物质(C)存在于氢化物材料(B)的表面上或捕获在氢化物材料中。

5.权利要求1的医用假体器件或医用移植物，其中生物分子物质(C)与氢化物材料(B)的结合量为1皮克/mm²-1毫克/mm²。

6.权利要求1-5中任何一项的医用假体器件或医用移植物，它修复身体功能，所述器件或移植物选自股髋关节；股骨头；髋臼；肘；膝；肩；腕；踝；手；手指；足趾；椎骨；椎间盘；人造关节；牙齿移植物；ossiculoplastic移植物；中耳移植物；耳蜗移植物；整形外科固定器件；心脏瓣膜；起搏器；导管；脉管；腔隙充填移植物；保持助听的移植物；用于外部固定的移植物；子宫内器件；以及生物电子装置。

7.一种用于制备如权利要求1-6中任何一项所述医用假体器件或医用移植物的方法，所述方法包括将金属材料(A)的表面部分进行电解处理以形成氢化物材料(B)层，所述电解处理在一种或多种生物分子物质(C)的存在下进行。