BR0115849B1

BR0115849B1 - Dispositivo protético médico ou implante médico, e, método para a preparação dos mesmos

Info

Publication number: BR0115849B1
Application number: BRPI0115849-0A
Authority: BR
Inventors: Staale Petter Lyngstadaas; Jan Eirik Ellingsen
Original assignee: Straumann Holding Ag
Priority date: 2000-12-06
Filing date: 2001-12-05
Publication date: 2014-06-24
Also published as: CA2431211A1; AU2095502A; JP2004515276A; EP1339437A1; EP1339437B1; JP2009195731A; BRPI0115849B8; BR0115849A; CN1227039C; WO2002045764A1; DE60104560D1; ES2223965T3; JP5068918B2; ATE271887T1; CN1479635A; DE60104560T2; CA2431211C; AU2002220955B2

Description

“DISPOSITIVO PROTÉTICO MÉDICO OU IMPLANTE MÉDICO, E, MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DOS MESMOS”.

CAMPO DA INVENÇÃO A invenção atual refere-se a implantes e dispositivos protéticos medicinais tendo biocompatibilidade melhorada.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Foi proposto melhorar a biocompatibilidade, por exemplo, de uma prótese de titânio, através do revestimento das superfícies metálicas da mesma com uma camada de hidreto de titânio, por exemplo, pelo bombardeio com plasma ou por eletrólise.

Também foi proposto melhorar-se a biocompatibilidade de próteses ou implantes pela ligação ou pela integração de várias biomoléculas ativas na superfície da prótese, como por exemplo, na superfície metálica de uma prótese de titânio. O objetivo com os implantes preparados desta forma é que eles tenham um encaixe melhorado; apresentem uma aderência aumentada do tecido e uma compatibilidade aumentada do tecido; tenham uma superfície biologicamente ativa para o crescimento, diferenciação e maturação aumentada das células; apresentem uma imunorreatividade reduzida; apresentem uma atividade antimicrobiótica; apresentem potencial aumentado de biomineralização; resultem em uma recuperação melhor do ferimento e/ou do osso; propiciem uma densidade melhorada do osso; tenham um "tempo para carregar" reduzido e causem menos inflamação.

Tal ligação com freqüência tem sido proposta para ser executada utilizando-se, por exemplo, reagentes químicos tendo duas funções reativas, tais como formalina ou glutaraldeído, mas a natureza reativa destes agentes com freqüência faz com que as biomoléculas se tomem biologicamente inativas e/ou com imunorreatividade aumentada, o que é indesejável.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Foi agora surpreendentemente verificado que é possível interligar, ligar, segurar e/ou integrar uma larga variedade de biomoléculas em ou com uma camada de hidreto durante o processo inorgânico de formação de tal camada de hidreto nos metais, por eletrólise. Antes desta observação era considerado ser muito difícil ligar e estabilizar biomoléculas bioativas, não modificadas, nos metais, especialmente para uso como superfícies bioativas nos metais para uso como implantes no corpo vertebrado, in vivo. A invenção, portanto, refere-se a um implante ou dispositivo protético medicinal contendo um material metálico (A) escolhido do grupo consistindo de titânio ou uma liga do mesmo, zircônio ou uma liga do mesmo, tântalo ou uma liga do mesmo, ráfnio ou uma liga do mesmo, nióbio ou uma liga do mesmo e uma liga de cromo-vanádio, onde as partes da superfície do material metálico (A) são revestidas com uma camada de um material de hidreto correspondente (B) escolhido de hidreto de titânio, hidreto de zircônio, hidreto de tântalo, hidreto de ráfnio, hidreto de nióbio e hidreto de cromo e/ou vanádio, respectivamente, caracterizado pelo fato de que a camada de material de hidreto (B) é composta de uma ou mais substâncias de biomoléculas (C) associadas com a mesma. A invenção refere-se ainda a um método para preparar um implante ou dispositivo protético medicinal conforme definido acima, o referido método compreendendo submeter-se as partes da superfície do material metálico (A) conforme definido acima a um tratamento por eletrólise para formar a camada de material de hidreto (B), o referido tratamento de eletrólise sendo executado na presença de uma ou mais substâncias de biomoléculas (C).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

No contexto atual, a frase " implante e dispositivo protético medicinal" inclui dentro do seu escopo qualquer dispositivo que se destine a ser implantado no corpo de um animal vertebrado, especialmente em um mamífero como um ser humano. Exemplos não limitantes de tais dispositivos são dispositivos medicinais que substituem a anatomia ou restauram uma função do corpo, tais como a junta femural; a cabeça femural; a cálice acetabular; cotovelo, incluindo hastes, cunhas, insertos articulares; joelho, incluindo os componentes do fêmur e da tíbia, haste, cunhas, insertos articulares ou componentes patelares; ombros, incluindo hastes e cabeça; pulso; tornozelos; mãos; dedos; dedos do pé; vértebras; discos da espinha; juntas artificiais; implantes dentários; implantes ossiculoplásticos; implantes do ouvido médio incluindo bigorna, martelo, estribo, bigoma-estribo, martelo- bigoma, martelo- bigoma-estribo; implantes da cóclea; dispositivos de fixação ortopédica tais como pregos, parafusos, grampos e placas; válvulas do coração; marcapassos; cateteres; vasos; implantes de enchimento de espaço; implantes para a retenção de auxiliares do ouvido; implantes para fixação externa; e também dispositivos intra-uterinos (DIU); e dispositivos bioeletrônicos tais como dispositivos intracocleares ou intracranianos eletrônicos.

No contexto atual, o termo "biomoléculas" se destina a cobrir e compreende dentro do seu significado uma variedade muito grande de moléculas biologicamente ativas no sentido mais amplo da palavra, sejam elas biomoléculas naturais (i.e. moléculas de ocorrência natural derivadas de fontes naturais), biomoléculas sintéticas (i.e. moléculas de ocorrência natural preparadas sinteticamente, assim como moléculas de ocorrência não natural ou formas de moléculas preparadas sinteticamente) ou biomoléculas recombinantes (i.e. preparadas através do uso de técnicas recombinantes).

Uma lista não limitante dos principais grupos e espécies de biomoléculas que são contempladas como sendo adequadas para a incorporação em uma camada de hidreto metálico (de uma forma estável e/ou fisiologicamente reversível) de acordo com a invenção, é apresentada abaixo.

Biomoléculas extraídas Bioadesivas: Estas são biomoléculas que medeiam a ligação de células, tecidos, órgãos ou organismos em superfícies não biológicas tais como vidro, rocha etc. Este grupo de biomoléculas inclui as proteínas adesivas de mexilhão marinho, proteínas semelhantes à fibrina, proteínas de teia de aranha, adesivos derivados de plantas (resinas), adesivos extraídos de animais marinhos, adesivos derivados de insetos (tais como resilinas). Alguns exemplos específicos de adesivos são: Fibrina; fibroina; proteína do pé de Mytilus edulis (mefpl, "Proteína adesiva de mexilhão"); outras proteínas adesivas de mexilhões; proteínas e peptídeos com blocos ricos em glicina; proteínas e peptídeos com blocos de polialanina; e sedas.

Fatores de ligação das células: Os fatores de ligação das células são biomoléculas que medeiam a ligação e a distribuição de células nas superfícies biológicas ou em outras células e tecidos. Este grupo de moléculas contém tipicamente moléculas participando na matriz das células e na interação de célula-célula durante o desenvolvimento, neogênese, regeneração e reparos de vertebrados.

As biomoléculas típicas desta classe são moléculas da superfície externa das células tais como a classe CD de receptores nas células brancas do sangue, imunoglobulinas e proteínas hemoaglutinantes, e moléculas/ligandos de matriz extracelular que aderem a tais moléculas celulares. Exemplos típicos de fatores de ligação de células com potencial para uso como revestimento bioativo em implantes revestidos por hidreto metálico são: Anquirinas; caderinas (moléculas de adesão dependente de cálcio); conexinas; sulfato de dermatano; entactina; fibrina; fibronectina; glycolipidios; glicoforina; glicoproteínas; sulfato de reparano; sulfato de reparina; ácido rialurônico; imunoglobulinas; sulfato de queratano; integrinas; lamininas; N-CAMs (moléculas adesivas independentes de cálcio); proteoglicanos; espectrina; vinculina; vitronectina.

Biopolímeros: Os biopolímeros são qualquer molécula preparada biologicamente a qual, dadas as condições adequadas, pode ser ligada em estruturas poliméricas, macromoleculares. Tais moléculas constituem partes importantes da matriz extracelular onde elas participam fornecendo resiliência, resistência, rigidez, integridade ao tecido, etc. Alguns biopolímeros importantes com potencial para uso como revestimento bioativo em implantes revestidos por hidreto metálico são: alginatos; amelogeninas; celulose; quitosana; colágeno; gelatinas; oligossacarídeos; pectina.

Proteínas do sangue: Esta classe de proteínas contém tipicamente qualquer proteína dissolvida ou agregada que normalmente está presente no sangue todo. Tais proteínas podem participar em uma larga faixa de processos biológicos como inflamação, direcionamento de células, coagulação, sinalização de células, proteção, imunorreações, metabolismo, etc. Exemplos típicos com potencial para uso como revestimento bioativo em implantes revestidos por hidreto metálico são: albumina; albúmem; citocinas; fator IX; fator V; fator VII; fator VIII; fator X; fator XI; fator XIII; hemoglobinas (com ou sem ferro); imunoglobulinas (anticorpos); fibrina; plaquetas derivadas de fatores de crescimento (PDGFs); plasminogene; trombospondina; transferina.

Enzimas: As enzimas são qualquer proteína ou peptídeo que tem um efeito catalítico específico em um ou mais substratos biológicos, as quais podem ser virtualmente qualquer coisa desde açúcar simples até macromoléculas complexas como DNA. As enzimas são potencialmente úteis para provocarem as respostas biológicas no tecido pela degradação das moléculas da matriz, ou elas podem ser usadas para ativar ou liberar outros compostos bioativos no revestimento do implante. Alguns exemplos importantes com potencial para uso como revestimento bioativo em implantes revestidos por hidreto metálico são: Abzimas (anticorpos com capacidade enzimatica); adenilata ciclase; fosfatase alcalina; carboxilases; colagenases; ciclooxigenases; hidrolases; isomerases; ligases; liases; proteases de metalo- matriz (MMPs); nucleases; oxidorredutases; peptidases; peptídeo hidrolase; peptidil transferase; fosfolipase; proteases; sucrase-isomaltase; TIMPs; transferases.

Proteínas e biomoléculas de matriz extracelular: As células especializadas, como por exemplo, os fibroblastos e os osteoblastos, produzem a matriz extracelular. Esta matriz participa em vários processos importantes. A matriz é crucial para a restauração de ferimentos, homeostase, desenvolvimento e reparo de tecidos, resistência do tecido, e integridade do tecido. A matriz também determina o ambiente extracelular como o pH, a resistência iônica, a osmolaridade, etc.

Além disso as moléculas de matriz extracelular são cruciais para a indução e o controle da formação biomineral (osso, cartilagem, dentes).

As proteínas e as biomoléculas extracelulares importantes com potencial para uso como revestimento bioativo em implantes revestidos por hidreto metálico incluem: Ameloblastina; amelina; amelogeninas; colágenos (I até XII); proteína sialo-dentina (DSP); proteína fosfo-sialo-dentina (DSPP); elastinas; enamelina; fibrinas; fibronectinas; queratinas (1 a 20); lamininas; tuftelina; carbohidratos; sulfato de condroitina; sulfato de heparan; sulfato de heparina; ácido rialurônico; lipídios e ácidos graxos; lipopolissacarídeos.

Fatores de crescimento e hormônios: Os fatores de crescimento e os hormônios são moléculas que se ligam às estruturas da superfície celular (receptores) e geram um sinal na célula alvo para iniciar um processo biológico específico. Exemplos de tais processos são o crescimento, a morte programada da célula, a liberação de outras moléculas (como por exemplo as moléculas de matriz extracelular ou açúcar), a diferenciação e a maturação de células, a regulação da taxa metabólica, etc. Exemplos típicos de tais biomoléculas com potencial para uso como revestimento bioativo em implantes revestidos por hidreto metálico são: Activinas (Act); Anfiregulina (AR); Angiopoietinas (Ang 1 a 4); Apo3 (um indutor apoptosis fraco também conhecido como TWEAK, DR3, WSL-1, TRAMP or LARD); Betacellulin (BTC); fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF, FGFb); fator de crescimento de fibroblasto ácido (aFGF, FGF-a); Ligando 4-1138; fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF); bolocina derivado do rim e mama (BRAK); proteínas morfogências do osso (BMPs); e-Linfócito quimioatraente/quimiocina 1 atraente de célula B (BLC/BCA1); CD27L (CD271igando); CD30L (CD30 ligando); CD40L (CD40 ligando); ligando indutor de proliferação A (APRIL); Cardiotrofin-1 (CT-1); fator neurotrófico ciliar (CNTF); fator de crescimento de tecido conectivo (CTGF); Citocinas; 6-cisteína quimimiocina (óCkine); fatores de crescimento epidérmicos (EGFs); Eotaxina (Eot); proteína 78 de ativação neutrofílica derivada de célula epitelial (ENA-78); Eritropoietina (Epo); fatores de crescimento de fibroblasto (FGF 3 a 19); Fractalcina; fatores neurotróficos derivados de Glial (GDNFs); ligando receptor de TNF induzido por glucocorticóide (GITRL); fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSF); fator de estimulação de colônia de macrófago de granulócito (GM- CSF); proteínas quimiotáticas de granulócitos (GCPs); hormônio de crescimento (GH); 1-309; Oncogene relacionada ao crescimento (GRO);

Inibinas (Inh); quimoatraentes Alfa de célula T que pode ser concluído por Interferon (I-TAC); Ligando Fas (FasL); Heregulins (HRGs); fator de crescimento tipo fator de crescimento epidérmico de ligação de Heparina (HB-EGF); ligando 3 Tirosina quinase tipo frns (Flt-3L); Hemofiltrado CC quimocinas (HCC-1 to 4); fator de crescimento de Hepatócito (HGF);

Insulina; fator de crescimento do tipo Insulina (IGF 1 e c); proteína que pode ser concluída por gama interferon 10 (IP-10); Interleucinas (IL 1 a 18);

Interferon-gama (IFN-gamma); fator de crescimento de ceratinocita (KGF); fator de crescimento de ceratinocita 2 (FGF-10); Leptina (OB); fator de inibição de Leucemia (LIF); Linfotoxina Beta (LT-B); Linfotactina (LTN); fator de estimulação de colônia de macrófago (M-CSF); quimocina derivado de macrófago (MDC); proteína de estimulação de Macrófago (MSP); proteínas inflamatórias de Macrófago (MIPs); Midcina (MK); proteínas quimioatraente de Monócito (MCP-1 to 4); Monocina Induzida por IFN-gama (MIG); MSX 1; MSX 2; Substância de inibição de Mulleriam (MIS); fator inibitório progenitor de Mielóide 1 (MPIF-1); fator de crescimento do nervo (NGF); Neurotrofinas (NTs); peptídeo de ativação neutrofílica 2 (NAP-2);

Oncostatina M (OSM); Osteocalcina; OP-1; Osteopontina; 0X40 Ligando; fatores de crescimento derivados de palqueta (PDGF aa, ab e bb); fator de plaqueta 4 (PF4); Pleiotrofina (PTN); quimiocina regulada por ativalçao e pulmonar (PARC); Regulada sobre ativação, T-cell Normal Expressa e Secretada (RANTES); fator derivado de neurônio motor e sensório (SMDF);

Membro 26 da Subfamília A de citocina pequena (SCYA26); fator de célula tronco (SCF); fator 1 derivado de célula estromal (SDF-1); quimiocina regulada por ativação de Timo (TARC); quimiocina expressa por Timo (TECK); TNF e ligando 1 expresso por leucócito relacionado por ApoL (TALL-1); ligando de indução de apoptose relacionada por TNF (TRAIL); citocina induzida por ativação relacionada por TNF (TRANCE); Expressão que pode ser concluída por Linfotoxina e compete com HSV Glicoproteína D para receptor HVEM T-linfócito (LIGHT); fator de crescimento da placenta (PIGF); Trombopoietina (Tpo); fatores de crescimento de Transformação (TGF alfa, TGF beta 1, TGF beta 2); fatores de necorose de tumor (TNF alfa e beta); fator de crescimento endotelial Vascular; (VEGF-A,B,C e D); cacitoninas; e compostos esteróides, tais como os hormônios do sexo de ocorrência natural, como estrógeno, progesterona, testosterona assim como análogos dos mesmos. Assim sendo, certos implantes tais como os DIUs (dispositivos intra-uterinos) compreendendo, por exemplo, estrógeno ou progesterona ou análogos dos mesmos podem ser considerados. r Ácidos nucléicos ÍDNAÍ: O DNA codifica os genes para proteínas e peptídeos. O DNA também contém uma larga série de seqüências que regulam a expressão do gene contido. Existem vários tipos de DNA, dependendo da fonte, função, origem, e estrutura. Exemplos típicos de moléculas com base em DNA que podem ser utilizadas como revestimentos bioativos de liberação lenta em implantes (geneterapia local) são: A-DNA; B-DNA; cromossomos artificiais contendo DNA de mamífero (YACs); DNA de cromossomo; DNA circular; DNA de mamífero contendo cosmídeos; DNA; DNA de segmento duplo (dsDNA); DNA genômico; DNA hemi-metilado; DNA linear; cDNA de mamífero (DNA complementar; DNA cópia de RNA); DNA de mamífero;

DNA metilado; DNA mitocondrial; DNA de mamífero contendo fagos; DNA de mamífero contendo fagomidas; DNA de mamífero contendo plasmídeos; DNA de mamífero contendo plastídios; DNA recombinante; fragmentos de restrição de DNA de mamífero; DNA de mamífero contendo retroposons; DNA de um só segmento (ssDNA); DNA de mamífero contendo transposons; T-DNA; DNAN de mamífero contendo vírus; Z-DNA. r Ácidos nucléicos ÍRNAV O RNA é uma transcrição de uma informação codificada pelo DNA. (Algumas vezes (em alguns vírus) o RNA é a unidade de codificação da informação essencial). Além de ser um intermediário para a expressão do genes, o RNA demonstrou ter várias funções biológicas. Ribozimas são moléculas simples de RNA com uma ação catalítica. Estes RNAs podem catalisar o DNA e a divagem e a ligação de RNA, hidrolizar peptídeos, e são o núcleo da transformação de RNA em peptídeos (o ribossomo é uma ribozima). Exemplos típicos de moléculas de RNA com potencial para uso como revestimento bioativo em implantes revestidos por hidreto metálico são RNA acetilado de transferência (tRNA ativado, tRNA carregado); RNA

circular; RNA linear; RNA nuclear heterogêneo de mamífero (hnRNA), RNA mensageiro de mamífero (mRNA); RNA de mamífero; RNA ribossomal de mamífero (rRNA); RNA de transporte de mamífero (tRNA); mRNA; RNA poli-adenilado; RNA (rRNA ) ribossomal; RNA recombinante; RNA de mamífero contendo retroposons; ribozimas; RNA de transporte (tRNA); RNA de mamífero contendo vírus.

Receptores: Os receptores são biomoléculas da superfície das células que ligam sinais (por exemplo, ligandos de hormônios e fatores de crescimento) e transmitem o sinal ao longo da membrana da célula para dentro da maquinaria interna das células. Receptores diferentes são "ligados" de forma diferente, impondo respostas intracelulares diferentes mesmo para o mesmo ligando.

Isto toma possível que as células reajam diferentemente a sinais externos através da variação do padrão de receptores na sua superfície. Os receptores tipicamente ligam o seu ligando de uma forma reversível, tomando-os adequados como transportadores de fatores de crescimento que devem ser liberados no tecido. Assim sendo revestindo-se os implantes com receptores de fator de crescimento, e então carregando-se estes receptores com os seus ligandos principais, é obtida uma superfície bioativa, a qual pode ser utilizada para a liberação controlada dos fatores de crescimento para os tecidos circunvizinhos após a implantação. Exemplos de receptores adequados com potencial para uso como revestimento bioativo em implantes revestidos por hidreto metálico incluem: classe CD de receptores CD; receptores EGF; receptores FGF; receptor de fibronectina (VLA-5); receptor de fator de crescimento, proteínas de ligação com IGF (IGFBP de 1 a 4); Integrinas (incluindo VLA de 1-4); receptor de Laminina; receptores PDGF; receptores alfa e beta de transformação de fator de crescimento; receptores BMP; Fas; receptor de fator de crescimento vascular endotelial (Flt-1); receptor Vitronectina.

Biomoléculas sintéticas As biomoléculas sintéticas são moléculas que são baseadas em biomoléculas de ocorrência natural (réplicas). Sintetizando-se tais moléculas uma larga serie de modificações químicas e estruturais pode ser introduzida, a qual pode estabilizar a molécula ou tomá-la mais bioativa ou especifica.

Assim sendo, se uma molécula é muito instável ou não especifica para ser utilizada de extratos, é possível engenheirá-la e sintetizá-la para uso como revestimento na superfície de implantes. Além disso, várias biomoléculas são tão pouco abundantes que a extração em escala industrial é impossível. Tais biomoléculas raras têm que ser preparadas sinteticamente, como por exemplo, por tecnologia recombinante ou por (bio)química. Abaixo é apresentada uma lista de várias classes de moléculas sintéticas que podem ser potencialmente úteis para revestimentos de implantes: DNA sintético: A-DNA; DNA anti-sentido; B-DNA; DNA complementar (cDNA); DNA modificado quimicamente; DNA estabilizado quimicamente; DNA; análogos de DNA; oligômeros de DNA; polímeros de DNA; inibidores de DNA-RNA; DNA de um só segmento (dsDNA); DNA hemi-metilado; DNA metilado; DNA de um só segmento (ssDNA); DNA recombinante; DNA triplex; T- DNA; Z-DNA. RN A sintético: RNA anti-sentido; RNA modificado quimicamente; RNA

estabilizado quimicamente; RNA nuclear heterogêneo (hnRNA); RNA mensageiro (mRNA); ribozimas; RNA; análogos de RNA; hidretos de RNA- DNA; oligômeros de RNA; polímeros de RNA; RNA ribossomal (rRNA); RNA de transporte (tRNA).

Biopolímeros sintéticos: Lipossomas catiônicos e aniônicos; acetato de celulose; ácido rialurônico; ácido polilático; poliglicol alginato; ácido poliglicólico; poliprolinas; polissacarídeos.

Peptídeos sintéticos: Decapeptídeos contendo DOPA e/ou diDOPA; peptídeos com seqüência "Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys"; peptídeos onde Pro é substituído por hidroxiprolina; peptídeos onde um ou mais Pro são substituídos por DOPA; peptídeos onde um ou mais Pro são substituídos por diDOPA; peptídeos onde um ou mais Tyr são substituídos por DOPA; hormônios de peptídeos; seqüências de peptídeos baseadas nas proteínas extraídas listadas acima; peptídeos contendo um motivo RGD (Arg Gly Asp).

Proteínas recombinantes: Todos os peptídeos e proteínas preparados recombinantemente.

Inibidores de enzima sintética: Os inibidores de enzima sintética variam de moléculas simples, como certos íons metálicos, que bloqueiam a atividade da enzima através da ligação direta com a enzima, até moléculas sintéticas que imitam o substrato natural de uma enzima e portanto competem com o substrato principal. Um revestimento de implante incluindo inibidores de enzima podería auxiliar a estabilizar e compensar a ruptura de outras biomoléculas presentes no revestimento, de forma que seja obtido um tempo maior de reação e/ou uma concentração maior do composto bioativo. Exemplos de inibidores de enzima são: Pepstatina; poliprolinas; açúcares-D; aminoácidos- D; Cianida; Diisopropil fluorofosfatos (DFP); íons metálicos; N-tosil-1- fenilalaninaclorometil cetona (TPCK); Fisostigmina; paration; penicilina.

Vitaminas (sintéticas ou extraídas) para a incorporação no hidreto: Biotina; calciferol (vitamina D; vital para a mineralização do osso); citrina; ácido fólico; niacina; nicotinamida; nicotinamida adenina dinucleotideo (NAD, NAD+); nicotinamida adenina dinucleotideo fosfato (NADP, NADPH); ácido retinóico (vitamina A); riboflavina; vitamina B; vitamina C (vital para a síntese de colágeno); vitamina E; vitamina K.

Outras moléculas bioativas para a incorporação no hidreto: Adenosina di-fosfato (ADP); adenosina monofosfato (AMP); adenosina tri-fosfato (ATP); aminoácidos; AMP cíclico (cAMP); 3,4- dihidroxifenilalanina (DOPA); 5'-di(dihidroxifenil-L-alanina (diDOPA); diDOPA quinona; o-difenóis semelhantes a DOPA; ácidos graxos; glicose; hidroxiprolina; nucleosídeos; nucleotídeos (bases de RNA e DNA); prostaglandina; açúcares; spingosina 1-fosfato; rapamicina; hormônios sexuais sintéticos tais como os análogos de estrógeno, progesterona ou testosterona, como por exemplo, Tamoxifeno; moduladores do receptor de estrógeno (SERMs) como Raloxifeno; bis-fosfonatos como alendronato, risendronato e etidronato; estatinas como cerivastatina, lovastatina, simvastatina, pravastatina, fluvastatina, atorvastatina e sódio 3,5-dihidroxi-7- [3-(4-fluorfenil)- l-(metiletil)- lH-indol-2-il]-hept-6-enoato.

Drogas para a incorporação nos revestimentos de hidretos: As drogas incorporadas na camada de hidreto poderíam ser utilizadas para efeitos locais como a melhoria da resistência local contra micróbios invasores, o controle da dor local, inibição local da síntese da prostaglandina; controle da inflamação local, indução local da biomineralização e estimulação local de crescimento do tecido. Exemplos de drogas adequadas para incorporação nas camadas de hidreto metálico incluem: antibióticos; inibidores de ciclooxigenase; hormônios; inibidores de inflamação; NSAIDs; eliminadores de dor; inibidores da síntese da prostaglandina; esteróides, tetraciclina (também como agente de biomineralização). íons biologicamente ativos para a incorporação em revestimentos de hidretos: Os íons são importantes em diversos mecanismos biológicos.

Através da incorporação biológica de íons ativos nas camadas de hidreto metálico nos implantes é possível estimular localmente processos biológicos como a função da enzima, o bloqueio da enzima, a retirada celular de biomoléculas, direcionamento de células específicas, a biomineralização, apoptose, a secreção celular de biomoléculas, o metabolismo celular e a defesa celular. Exemplos de íons bioativos para a incorporação no hidreto metálico incluem: cálcio; cromo; cobre; fluoreto; ouro; iodeto; ferro; potássio; magnésio; manganês; selênio; prata; sódio; zinco.

Biomoléculas marcadoras: Os marcadores biológicos são moléculas que geram um sinal detectável, como por exemplo, através da emissão de luz, atividade enzimática, radioatividade, cor específica, magnetismo, densidade de raios X, estrutura específica, antigenicidade, etc., que pode ser detectada por instrumentos específicos ou por microscopia ou um método de imagem como raios X ou ressonância magnética. Os marcadores são utilizados para monitorar os processos biológicos na pesquisa e desenvolvimento de novas estratégias de tratamento médico. Nos implantes, tais marcadores tipicamente seriam utilizados para monitorar processos como a biocompatibilidade, a formação de tecido, neogênese do tecido, biomineralização, inflamação, infecção, regeneração, reparo, homeostase do tecido, ruptura do tecido, substituição do tecido, liberação de biomoléculas da superfície do implante, bioatividade de biomoléculas liberadas, retirada e expressão de ácidos nucléicos liberados da superfície do implante, e capacidade antibiótica da superfície do implante para fornecer a "prova do princípio", o efeito, a validação da eficácia e da segurança antes dos estudos clínicos.

As biomoléculas marcadoras adequadas para incorporação em revestimentos de hidretos incluem: Calceína; vermelho alizaran; tetraciclinas; fluorescinas; fura; luciferase; fosfatase alcalina; aminoácidos radio marcados (como por exemplo marcados com 32P, 33P, 3H, 35S, 14C, 125I, 51Cr, 45Ca); nucleotídeos rádio marcados (como por exemplo, marcados com 32P, 33P, 3H, 35S, 14C,); peptídeos e proteínas rádio marcados; DNA e RNA rádio marcados; complexos imuno- ouro (partículas de ouro com anticorpos ligados); complexos imuno-prata; complexos imuno-magnetita; proteína fluorescente verde (GFP); proteína florescente vermelha (E5); proteínas e peptídeos bioestanhados; ácidos nucléicos bioestanhados; anticorpos bioestanhados; ligantes de carbono bioestanhados; genes repórter (qualquer gene que gera um sinal quando expresso); iodeto de propídio; amarelo diamidino. O dispositivo ou implante de acordo com a invenção pode ser utilizado para vários fins.

Exemplos de tais fins incluem o uso de: indução local da formação de tecido rígido (por exemplo, o tecido do osso) no lugar do implante; controle do crescimento microbiótico e/ou invasão no local do implante ou sistemicamente; redução da inflamação no local do implante ou sistemicamente; estimulação do reparo, regeneração ou formação de ligamentos; indução da formação de cartilagem; nucleação, controle e/ou modelagem da biomineralização; melhoria da ligação entre os implantes e os tecidos; melhoria da integração dos implantes com os ossos; melhoria da aderência dos tecidos em um implante; ou impedir a aderência do tecido em um implante (semi-permanente ou temporário); melhorar o contato entre os tecidos ou entre os tecidos e os implantes, melhorar o isolamento do tecido de um ferimento (cirúrgico); induzir a apoptose (a morte da célula) em células indesejáveis (como por exemplo, células de câncer); induzir a diferenciação e/ou maturação específica da célula, aumentando a resistência à tração do tecido; melhorar a recuperação do ferimento; acelerar a recuperação do ferimento; modelar a formação do tecido; orientar a formação do tecido; terapia do gene local; estimular o crescimento de nervos; melhorar a vascularização em tecidos adjacentes a um implante; estimular a síntese local da matriz extracelular; inibir a ruptura local da matriz extracelular; induzir a liberação local do fator de crescimento; aumentar o metabolismo local do tecido; melhorar a função de um tecido ou de uma parte do corpo; reduzir a dor e o desconforto local. A finalidade dependerá do tipo de implante assim como da natureza e/ou concentração das biomoléculas presentes na camada de hidreto no implante.

Quando o material metálico (A) é uma liga de titânio, zircônio, tântalo, ráfnio ou nióbio, ele poderá ser uma liga dentre um ou mais destes elementos metálicos; ou ele poderá ser uma liga contendo um ou mais metais diferentes tais como alumínio, vanádio, cromo, cobalto, magnésio, ferro, ouro, prata, cobre, mercúrio, estanho ou zinco; ou ambos. r E preferível que o material metálico (A) seja titânio ou uma liga do mesmo, como por exemplo, uma liga com zircônio, tântalo, ráfnio, nióbio, alumínio, vanádio, cromo, cobalto, magnésio, ferro, ouro, prata, cobre, mercúrio, estanho ou zinco. Em uma realização especialmente preferida, o material metálico (A) é titânio. O material de hidreto correspondente (B) de preferência é o hidreto de titânio. A quantidade de substância de biomoléculas (C) presente na camada de hidreto (B) das partes da prótese, dispositivo ou implante revestido com o hidreto, poderá variar dentro de limites amplos, como por exemplo, dependendo das características químicas e biológicas e da substância da biomolécula ou substâncias em questão. Assim sendo, a substância da biomolécula (C) associada com o material de hidreto (B) poderá estar presente em quantidade variando de tão pouco quanto 1 picograma por milímetro quadrado até tão elevada quanto 1 mg por milímetro quadrado do dispositivo ou superfície de implante revestida por hidreto.

No entanto, é considerado que os revestimentos com biomoléculas mais úteis variarão de 0,1 nanogramas até 100 microgramas por milímetro quadrado.

Conforme indicado acima, o método da invenção envolve submeter-se as partes da superfície do material metálico (A) a um tratamento por eletrólise para formar a camada de hidreto (B), o referido tratamento sendo executado na presença de uma ou mais substâncias de biomoléculas, conforme discutido acima. Descobriu-se que é importante que as condições no eletrólito (pH, resistência iônica, etc) sejam tais que a biomolécula tenha r uma carga líquida positiva. E portanto vantajoso que a maior parte das biomoléculas sejam anfólitos, i.e. sejam ácidos fracos (ou bases) que modificam a sua carga líquida de acordo com a resistência iônica e o pH da solução em que eles são dissolvidos. Em conseqüência, a preocupação principal em relação à incorporação dos mesmos em uma camada de hidreto é a estabilidade nas condições necessárias para a preparação do bio-hidreto, i.e. um ambiente que forneça íons H+ suficientes para a preparação do hidreto e ao mesmo tempo mantenha a carga líquida da biomolécula em questão positiva. Isto significa principalmente que o eletrólito deve ter uma concentração salina elevada e portanto resistência iônica; uma temperatura comparativamente elevada, apesar de, preferencialmente, abaixo de qualquer temperatura desnaturante da substância da biomolécula; e um pH baixo.

Assim sendo, o eletrólito poderá ser qualquer solução salina, de preferência aquosa, como por exemplo, uma solução de cloreto de sódio, sulfato de sódio, fosfato de cálcio, cloreto de cálcio, salmoura tamponada por fosfato (PBS), salmoura, uma solução salina simulando as condições fisiológicas, bicarbonatos, carbonatos, etc., nos quais a biomolécula desejada é dissolvida. A resistência iônica do sal é tipicamente 1M, mas as concentrações podem ser ajustadas tão baixas quanto 0,01 M e tão altas quanto 10 M de acordo com as propriedades químicas e a concentração das biomoléculas. A temperatura do eletrólito contendo as biomoléculas poderá variar da ambiente (20°C) até tão elevada quanto o ponto de ebulição do eletrólito, tipicamente ao redor de 100°C, apesar do uso de temperaturas na parte superior desta faixa depender claramente da habilidade das biomoléculas suportarem tais temperaturas sem danos. Se as biomoléculas podem suportá-la, uma temperatura ótima para a formação de hidreto é ao redor de 80°C. O pH do eletrólito é ajustado tipicamente para o pH desejado por intermédio de um ácido forte, como por exemplo, HC1, HF, H2S04, etc. apesar de dever ser levado em conta que um pH abaixo de 2 produzirá uma superfície irregular, corroída do implante no titânio, enquanto que um pH acima de 2 conserva a superfície original. O pH é ajustado de acordo com a relação desejada de hidreto/biomoléculas; O pH baixo produz uma superfície de implante com uma relação elevada de hidreto/biomoléculas (=mais hidreto metálico), enquanto que um pH elevado próximo do pi da biomolécula em questão produzirá uma superfície com uma relação baixa de hidreto/biomoléculas (= mais biomoléculas). Assim sendo, embora qualquer pH entre 0 e 10 possa ser utilizado, o pH preferido para a preparação do hidreto é entre 5 e 2, dependendo das características químicas e da concentração das biomoléculas, do eletrólito utilizado e da relação preferida de hidreto/biomoléculas. Para relações de hidreto/biomoléculas mais elevadas (= mais hidreto), ajustar o pH mais ácido, para relações de hidreto/biomoléculas menores (= mais biomoléculas, ajustar o pH próximo, mas não acima, do pi das biomoléculas. O requisito único é que existam íons de hidrogênio (H+) e biomoléculas carregadas positivamente (biomoléculas+, carga líquida) presentes no eletrólito). A concentração das biomoléculas (uma ou qualquer combinação de duas ou mais) no eletrólito poderá variar ao longo de uma larga faixa, dependendo do tipo de bioatividade, tipo de molécula, características químicas e biológicas, toxicidade, potência, modo de ação, se ela é liberada ou não da camada de hidreto, estabilidade in vivo, estabilidade no eletrólito, disponibilidade, pH ótimo, etc. Assim sendo, a concentração das biomoléculas no eletrólito poderá estar entre a faixa de 1 pg até 50 mg/ml.

Uma faixa preferida é entre 10 pg e 1 mg/ml, mas a concentração ótima de biomoléculas deve sempre ser finalmente determinada em experiências piloto com cada biomolécula ou mistura de biomoléculas. Também o período de tempo ao longo do qual a eletrólise é executada poderá variar mas influencia principalmente a espessura da camada de hidreto e portanto a concentração de biomoléculas na camada de hidreto.

Uma célula eletrolítica para uso no método da invenção poderá ter qualquer desenho convencional e mais tipicamente é uma célula de duas câmaras sem quaisquer conexões condutoras entre as câmaras, exceto para o eletrólito. O implante metálico a ser modificado por hidreto é colocado na câmara do catodo (i.e. o eletrodo carregado negativamente) enquanto que o anodo (ou eletrodo carregado positivamente), tipicamente feito de carbono, é colocado em uma câmara separada. Os eletrólitos de cada câmara são ligados através de um filtro poroso de vidro ou porcelana permitindo que a corrente passe sem ser obstruída mas sem qualquer troca de eletrólitos entre as duas câmaras. Isto é importante porque os produtos da reação do anodo, como por exemplo, cloreto ou hipocloritos, etc., poderíam potencialmente interferir com a formação da camada de biomoléculas-hidreto ou destruir ou modificar a biomolécula no eletrólito do catodo. A separação das duas células também permite o uso de um volume menor de eletrólito do catodo e portanto o uso mais efetivo de biomoléculas, assim como a possibilidade de utilizar um sistema de dois eletrólitos que permita uma otimização do processo eletrolítico, como por exemplo, um eletrólito ótimo para biomoléculas no lado do catodo e um eletrólito no lado do anodo que é otimizado para a eficácia da própria eletrólise (condutividade, evitar produtos tóxicos, ou mesmo produzir subprodutos/revestimentos úteis).

Conforme indicado acima, a temperatura na célula do catodo (Tcat) deve ser tão elevada quanto possível, com um ótimo para a preparação do hidreto sendo 80°C. O próprio processo eletrolítico também produz calor o qual pode gerar dois problemas; os constituintes do eletrólito se evaporação de tal forma que o volume é reduzido e a resistência iônica e a concentração das biomoléculas aumentada acima da faixa preferida, e o aumento na temperatura poderá causar a precipitação, coagulação, desnaturação, degradação ou destruição das biomoléculas presentes. Portanto, o compartimento do catodo da célula eletrolítica de preferência é equipado com uma cálice resfriada para a condensação do eletrólito vaporizado e uma carcaça de radiador com a temperatura regulada para estabilizar as temperaturas e os volumes durante a eletrólise.

Ajustando-se a corrente, a carga e a composição do eletrólito, será possível também fornecer um ambiente que é favorável para cargas positivas na maior parte das biomoléculas. Se não for possível, uma instalação de eletrólise e de pulsação de campo onde a polaridade dos eletrodos é trocada em ciclos controlados durante a preparação da camada do bio-hidreto podería ser uma forma de eliminar um problema de carga líquida negativa. O suprimento de força tipicamente é assim chamado de “bomba de corrente”, i.e. dispositivo fornecendo uma corrente constante mesmo se a resistência dentro do circuito varia. Apesar de voltagens entre 0,1 e 1000 volts poderem ser usadas, a voltagem é tipicamente menor do que 10 volts. A densidade de corrente durante a eletrólise é tipicamente na faixa de 0,1 mA até IA por centímetro quadrado (cm2) do espécime do implante. Uma densidade preferida de carga é 1 mA/cm apesar de ajustes no eletrólito, pH e temperaturas para aumentar a compatibilidade da biomolécula poderem comandar desvios menores ou maiores deste valor. A duração do processo depende de vários parâmetros, tais como a espessura desejada da camada de bio-hidreto, a composição e as características do eletrólito, as características das biomoléculas, a temperatura e o pH, a relação desejada de hidreto/biomoléculas, o tamanho do espécime do implante, o volume do eletrólito do catodo, a concentração de biomoléculas, etc. Assim sendo, a duração do processo poderá ser entre 0,5 horas e vários dias. No entanto, uma faixa ótima de tempo geralmente é entre 8 e 24h.

Para monitorar o processo do bio-hidreto, um eletrodo de calomelano tipicamente poderá ser colocado na câmara do catodo. Quando o processo de formação da camada de hidreto no catodo é ótima, uma diferença de -1 volt é observada entre o eletrodo de calomelano e o catodo. Se a corrente é muito diferente deste valor, o processo será executado em condições sub-ótimas e uma mudança na instalação deve ser considerada.

Além disso, um sensor de temperatura e um sensor de pH poderão ser tipicamente colocados na câmara do catodo para se verificar se o processo está sendo executado dentro dos limites desejados de pH e de temperatura.

Um dispositivo de agitação como um agitador magnético poderá também ser utilizado na célula do catodo para misturar continuamente o eletrólito e manter a temperatura homogênea e evitar variações na resistência iônica local, pH e concentrações de biomoléculas.

Depois da etapa de eletrólise, o dispositivo metálico ou implante agora revestido de biomolécula/hidreto é removido imediatamente do eletrólito e tratado de acordo com os requisitos da biomolécula em questão. Tipicamente, o dispositivo ou espécime de implante é deixado secar ao ar e então é embalado em uma bolsa plástica estéril, a prova de ar, na qual ele é estocado até o seu uso para implante. No entanto, algumas biomoléculas poderão ser sensíveis à secagem, e em conseqüência um sistema de estocagem úmido poderá ser desejado, como por exemplo, enlatado ou estocado em um fluido como salmoura ou simplesmente no eletrólito do processo de fabricação. Apesar da eletrólise poder ser executada sob condições ascéticas ou mesmo estéreis, a necessidade de se fazer isto poderá ser evitada incluindo-se uma etapa anterior ao uso, de esterilização, utilizando-se métodos convencionais tais como a radiação por ionização, aquecimento, autoclave, óxido de etileno gasoso, etc. A escolha do método dependerá das características específicas e das propriedades das biomoléculas presentes na camada de hidreto metálico.

Antes do tratamento de eletrólise, o dispositivo ou implante deverá ser intensamente limpo. Isto poderá consistir tipicamente no implante sendo pré-tratado mecanicamente por polimento elétrico ou polimento por areia para modificar a estrutura da superfície, se desejado, e posteriormente intensamente limpo utilizando-se soda cáustica seguido por uma etapa de desengraxamento, como por exemplo, em tricloroetileno concentrado, etanol ou metanol, antes de ser tratado em uma solução de decapagem, como por exemplo, ácido fluorídrico, para remover óxidos e impurezas na superfície.

Depois da decapagem o espécime de implante é lavado intensamente em água desionizada, quente, destilada duplamente. A invenção é ainda mais ilustrada pelos seguintes exemplos não limitantes dos quais os exemplos 1-4 descrevem experiências executadas, e os exemplos 5-11 ilustram os exemplos considerados de trabalho. EXEMPLO 1 Preparação de uma camada superficial de implante de hidreto de titânio contendo uma proteína de matriz extracelular.

Uma célula eletrolítica com duas câmaras foi utilizada para preparar uma camada de hidreto de titânio contendo a molécula de matriz extracelular amelogenina em 5 implantes de titânio eletropolidos na forma de moeda, cada um deles com uma área superficial de 0,6 cm2 exposta ao eletrólito.Cinco itens semelhantes foram utilizados como controles, estando presentes na câmara do eletrólito, mas não conectados à corrente de eletrólise. O eletrólito em ambas as câmaras era NaCl 1M em água estéril, pH ajustado para um pH 4 através do uso de HC1, e a concentração inicial de amelogenina era de 0,1 mg/ml. Para a eletrólise foi utilizada uma voltagem de 10 volts com uma densidade de carga de 1 mA/cm2. A temperatura da câmara do catodo foi ajustada em 70 0 C. A eletrólise foi deixada progredir durante 18h após o que os implantes de titânio foram removidos da célula eletrolítica, lavados em água estéril e deixados secar ao ar em um dessecante.

Depois da secagem, o teste de titânio e os espécimes de controle, cada um deles foi lavado três vezes em 1 ml de salmoura em um pH de 6,5. Após as lavagens, qualquer proteína remanescente na superfície de titânio foi dissolvida pela fervura do espécime de titânio em 0,5 ml de uma amostra tamponada 2XSDS-PAGE (0,4 g de SDS, 1,0 g de 2-mercaptoetanol, 0,02 g de bromofenol azul e 4,4 g de glicerol em 10 ml de Tris/HCl 0,125 M, pH 6,8). As soluções de lavagem e a amostra tamponada 2XSDS-PAGE com possível proteína na mesma foram precipitadas com um volume igual de ácido perclórico 0,6N e o sobrenadante foi retirado por centrifugação. As pelotas precipitadas, contendo sal e as moléculas orgânicas possíveis, foram então dissolvidas em 50 μΐ da amostra tamponada 2XSDS-PAGE e fervidas durante 5 minutos. Todas as amostras foram então submetidas à eletrólise em um gel a 12% de SDS-poliacrilamida a 80 mA durante a noite. Depois da eletroforese, as proteínas no gel foram transferidas para uma membrana de difluoreto de poli(vinilideno) pela técnica de eletroblotting semi seca em "sanduíche". As proteínas de amelogenina foram então detectadas por um imune ensaio utilizando-se um anticorpo IgG primário específico de amelogenina de coelho e um anticorpo secundário IgG de cabra marcado por biotina anti-coelho. A mancha a oeste mostrou quantidades significativas de amelogeninas presentes nos extratos dos espécimes de teste, e portanto retidas na camada de hidreto de titânio dos mesmos, enquanto que nenhuma amelogenina foi detectada em extratos dos espécimes de controle que não estavam ligados na corrente de eletrólise.

Esta experiência demonstrou claramente que uma quantidade significativa de amelogenina foi incorporada na camada de hidreto durante o processo eletrolítico. As proteínas de amelogenina não estavam meramente presentes como um simples revestimento, por que não há evidência de proteínas nas soluções de lavagem iniciais. Somente com a combinação de um detergente forte (SDS), um agente de redução (mercaptoetanol) e alta temperatura (100 ° C) as amelogeninas puderam ser extraídas da camada da superfície de hidreto de titânio e detectadas pela mancha a oeste. A quantidade de proteína extraída foi calculada como sendo 50 pg/cm2 por comparação com um padrão de amelogenina. Esta figura está bem dentro da faixa de bioatividade desta proteína de matriz extracelular. EXEMPLO 2 Produção de uma camada superficial de implante de hidreto de titânio contendo amelogenina A instalação do exemplo 1 foi utilizada para produzir uma camada de hidreto de titânio contendo amelogenina da molécula de matriz extracelular nos implantes de titânio eletropolidos com uma área superficial que 0,35 cm exposta ao eletrólito. O eletrólito em ambas as câmaras era NaCl a 1M em água estéril, e o pH ajustado para um pH 4 pelo uso de HC1, e a concentração inicial de amelogenina era de 0,1 mg/ml. Para a eletrólise foi utilizada uma voltagem de 10 volts com uma densidade de carga de 1 mA/cm . A Tca, foi ajustada para 70 0 C. A eletrólise foi deixada progredir durante 18h após o que os implantes de titânio foram removidos da célula eletrolítica, lavados em água estéril e deixados secar ao ar em um dessecante.

Depois dos espécimes de titânio serem secos eles foram lavados três vezes com 1 ml de salmoura em um pH de 6,5. Após as lavagens, as proteínas que permaneceram nas superfícies de titânio foram dissolvidas pela fervura do espécime de titânio em 0,1 ml de amostra tamponada 2XSDS (0,4 g de SDS, 1,0 g de 2-mercaptoetanol em 10 ml de Tris/HCl a 0,125 M, pH 6,8) durante 5 minutos. A quantidade de amelogenina dissolvida na solução de SDS a partir das superfícies de titânio lavadas foi então analisada por fotometria standard de medição de absorção de luz a 280 e 310 nm contra uma amostra tamponada pura de 2XSDS, e comparando-se os resultados com uma série de diluição standard de amelogenina em amostra tamponada 2XSDS. A experiência foi repetida duas vezes em seqüências de 16 implantes, ambos os tempos com cinco controles internos negativos na forma de implantes de titânio que estavam presentes na câmara da reação durante todo o processo mas não ligados ao catodo. A experiência demonstrou claramente que uma quantidade significativa de amelogenina foi incorporada na camada de hidreto durante o processo eletrolítico. As proteínas de amelogenina não somente estavam presentes como um revestimento simples, assim como não havia nenhuma evidência de proteínas nas soluções de lavagem. Somente com a combinação de um detergente forte (SDS), um agente de redução (mercaptoetanol) e alta temperatura (100 0 C) as amelogeninas puderam ser extraídas da superfície de hidreto de titânio. A quantidade de proteína extraída foi calculada como variando entre 57 e 114 pg/cm2 com um valor médio de 87 pg de amelogenina por cm2, por comparação com o standard de amelogenina. Esta figura está bem dentro da faixa de bioatividade desta proteína de matriz extracelular. Implantes de controle idênticos que estavam presentes na mesma célula eletrolítica que os implantes da experiência, mas os quais não estavam conectados no catodo, não mostraram quantidades significativas de proteínas de amelogenina ligadas na superfície (<1 pg/cm2). EXEMPLO 3 Produção de uma camada de superfície de implante de hidreto de titânio contendo ácido nucléico A instalação do exemplo 1 foi utilizada para produzir uma camada de hidreto de titânio contendo ácido nucléico na forma de DNA de placenta humana total rádio-marcada em implantes de titânio eletropolidos com uma área superficial total de 0,35 cm2 exposta ao eletrólito. O eletrólito em ambas as câmaras era NaCl 1M em água estéril. O pH foi ajustado até um pH2 através do uso de HC1. A concentração inicial de DNA no eletrólito era de 10 pg/ml. Para a eletrólise foram usadas uma voltagem de 10 volts com uma densidade de carga de 1 mA/cm2 em uma Tcat de 75 ° C. A eletrólise foi deixada progredir durante 16 ou 24h após o que os espécimes de titânio foram removidos da célula eletrolítica, lavados três vezes em grandes quantidades de solução tampão de Tris-EDTA (TE-solução tampão; Tris-Cl 10 mM e EDTA 1 mM em água estéril, pH 7,6) e então deixada secar durante a noite em um dessecante. O DNA foi rádio-marcado utilizando-se um conjunto de marcação de iniciador randômico II Stratagene Prime-It R" para a produção de sensores de alta atividade específica e [ α- P] dATP (Amersham). Depois da marcação do DNA, a radioatividade específica do sensor de DNA foi medida em um contador de cintilação "Packard Tricarb®" como sendo 3,0 x o 10 desintegrações por minuto por pg de DNA marcado (dpm/pg).

Depois de secos os espécimes de titânio com os ácidos nucléicos tentativos ligados aos mesmos, foram colocados em uma peneira fosforescente (Fujii®) durante 15 minutos. Os espécimes foram então removidos e a peneira fosforescente foi varrida em uma máquina de imagem fosforescente "BioRad®" medindo o número de desintegrações ocorridas na superfície de cada implante utilizando-se uma grade de 100 pg (12.265 pontos por implante). A experiência foi repetida duas vezes em uma série de 16 implantes, ambas as vezes com 15 controles internos negativos na forma de implantes de titânio idênticos que estavam presentes na câmara de reação durante todo o processo, mas os quais não estavam ligados ao catodo. Para a primeira serie o tempo de reação foi de 24h, para a segunda ele foi de 16h. O

número total de dpm por implante foi calculado e convertido em pg de DNA por cm2 (pg DNA/cm2). A quantidade de DNA presente nos implantes variou entre 0,25 e 0,75 pg/cm2 com um valor médio de 0,43 pg de DNA por cm2 quando o tempo de reação era de 24h. Quando o tempo de reação foi reduzido para 16h, os valores respectivos variaram entre 0,19 e 0,32 pg/cm2 com um valor médio de 0,30 pg de DNA por cm2. Esta figura está bem dentro da faixa aplicável para a geneterapia e vacinas de DNA e outros aplicações de medicina molecular.

Implantes de controle idênticos que estavam presentes na mesma célula eletrolítica que os implantes da experiência, mas que não estavam ligados no catodo mostraram somente quantidades muito pequenas (picogramas) de DNA ligado na superfície.

Esta experiência demonstra claramente que uma quantidade significativa de DNA foi incorporada na camada de hidreto durante o processo de eletrólise. O DNA não estava meramente presente como um simples revestimento porque o DNA não estava dissolvido ou lavado dos implantes de teste durante a lavagem com TE. Além disso, o fato de que a quantidade de DNA incorporada na camada de superfície de hidreto de titânio aumentou linearmente com o tempo da reação também mostrou que o ajuste do tempo de reação é um meio fácil de controlar a quantidade de biomoléculas na camada de hidreto. EXEMPLO 4 Preparação de uma camada de superfície de implante de hidreto de titânio contendo ácido ascórbico A instalação do exemplo 1 foi utilizada para preparar uma camada de hidreto de titânio contendo ácido ascórbico (vitamina C) em implantes de titânio eletropolidos na forma de moeda e com uma área superficial total exposta ao eletrólito de 0,35 cm2. O eletrólito em ambas as câmaras era salmoura com um pH ajustado para o pH 3 por intermédio de ácido fosfórico. A concentração inicial de ácido ascórbico era de 10 mg/ml.

Foi utilizada uma eletrólise com uma voltagem de 6 volts e uma densidade de corrente de 2 mA/cm2 e uma temperatura da câmara do catodo de 20 ° C. A eletrólise foi deixada progredir durante 16h após o que o implante de titânio foi removido da célula eletrolítica, lavado duas vezes em água estéril e deixado secar em um dessecante.

Depois da secagem durante a noite o ácido ascórbico tentativo ficou livre dos espécimes de titânio mergulhando-se os espécimes em 1 ml de solução tampão Tris-EDTA (TE-solução tampão; Tris-Cl 10 mM e EDTA 1 mM em água estéril) em um pH 8,0 durante lh com agitação. A quantidade de ácido ascórbico nas amostras da solução tampão foi então analisada medindo- se a absorção de luz a 250 nm e comparando-se os resultados com uma curva standard para ácido ascórbico em TE, pH 8,0 neste comprimento de onda.

Implantes de controle idênticos presentes na mesma célula eletrolítica que os implantes da experiência, mas não ligados no catodo, poderão ser utilizados como controles. A experiência foi repetida duas vezes em uma série de 16 implantes, ambos os tempos com cinco controles internos negativos. A quantidade de ácido ascórbico extraído dos espécimes de titânio foi calculada como variando entre 28 e 76 pg/cm2 com um valor médio de 39 pg de ácido ascórbico por cm2, por comparação com o ácido ascórbico standard. Esta figura está bem dentro da faixa de bioatividade desta vitamina (a concentração normal de plasma em seres humanos varia entre 8-15 pg/ml).

Os espécimes internos de controle que estavam presentes na mesma célula eletrolítica que os implantes da experiência, mas que não estavam ligados no catodo, mostraram somente quantidades mínimas de ácido ascórbico ligado na superfície (< 4 pg/cm2). Esta experiência demonstrou claramente que uma quantidade biologicamente significativa de ácido ascórbico pode ser incorporada ou ligada na camada de hidreto de titânio durante o processo eletrolítico. EXEMPLO 5 Preparação de uma camada de superfície de implante de hidreto de titânio contendo um peptídeo com base em fator de crescimento sintético A instalação do exemplo 1 poderá ser utilizada para preparar uma camada de hidreto de titânio contendo um peptídeo de fator de crescimento 4 de fíbroblasto (FGF-4) sintético em todo o comprimento (37 aminoácidos) em implante de titânio eletropolido na forma de moeda com uma área superficial total de 0,6 cm2 exposta ao eletrólito. Os eletrólitos, pH, voltagem, densidade de corrente e tempo de életrólise poderão ser adequadamente os do exemplo 1. A concentração inicial de FGF-4 adequadamente poderá ser 0,1 mg/ml e a temperatura da câmara do catodo adequadamente poderá ser de 50 0 C.

Após a lavagem em salmoura em solução tampão 2XSDS- PAGE, precipitação, centrifugação, redissolução em SDS-PAGE, fervura e eletroforese conforme o exemplo 1, a proteína no gel poderá ser transferida para uma solução de contraste de prata e os peptídeos sintéticos FGF-4 de cumprimento integral presentes visualizados como uma banda distinta do gel.

Implantes de controle idênticos incorporados na mesma célula eletrolítica que os implantes da experiência, mas não ligados no catodo, podem ser utilizados como controles. EXEMPLO 6 Preparação de uma camada de superfície de implante de hidreto de titânio contendo antibiótico A instalação do exemplo 1 poderá ser utilizada para separar uma camada de hidreto de titânio contendo o agente antibiótico amoxicilina (aminopenicilina) em um implante de titânio na forma de moeda, eletropolido, com uma área superficial exposta ao eletrólito de 0,6 cm 2. O eletrólito em ambas as câmaras adequadamente é NaCl 1M em água estéril com o pH ajustado para um pH 2 por intermédio de HC1, e a concentração inicial de amoxicilina adequadamente é de 5 mg/ml. Para a eletrólise foi utilizada uma voltagem de 10 volts com uma densidade de carga de 1 mA/cm2 e uma temperatura da câmara de catodo de 50 0 C. A eletrólise adequadamente poderá prosseguir durante 24h após o que o implante de titânio é removido da célula eletrolítica, lavado em água estéril e deixado secar em um dessecante.

Depois da secagem a quantidade de amoxicilina retida na camada de hidreto nos implantes de titânio poderá ser avaliada pelo seu efeito antibactericida em bactérias sensíveis à penicilina da espécie Escherichia coli (E. coli), familia Kl 2, em culturas líquidas. As culturas são inoculadas adequadamente com uma colônia de E. coli Kl2 em 5 ml de caldo de LB.

Depois da inoculação os implantes e controles modificados são colocados na cultura e as culturas incubadas a 37 0 C durante a noite. No dia seguinte a quantidade de bactérias presentes nas culturas poderão ser estimadas por fotometria e comparação com uma diluição standard. Os implantes de controle idênticos presentes na mesma célula eletrolítica que os implantes da experiência, mas não ligados ao catodo, poderão ser utilizados como controles. EXEMPLO 7 Preparação de uma camada superficial de implante de hidreto de titânio de indução biomineral A instalação do exemplo 1 poderá ser utilizada para preparar uma camada de hidreto de titânio contendo um peptídeo sintético de poli- prolina que tem um potencial de agir como um nucleador biológico de formação mineral em soluções saturadas de fosfato de cálcio. A biomolécula poderá ser incorporada na camada de hidreto na superfície dos implantes de titânio na forma de moeda, eletropolidos, com uma área total exposta ao eletrólito de 0,6 cm2. O eletrólito em ambas as câmaras adequadamente poderá ser NaCl 1M em água estéril com o pH ajustado para um pH 2 por intermédio de HC1, e a concentração inicial do poli-prolina sintética adequadamente poderá ser de 0,1 mg/ml. Para a eletrólise foi usada uma voltagem de 10 volts em uma densidade de corrente de 1 mA/cm2 e uma temperatura da câmara do catodo de 70 0 C. A eletrólise adequadamente poderá ser deixada prosseguir durante 18 h após o que os implantes de titânio são removidos da célula eletrolítica, lavados em água estéril e deixados secar ao ar em um dessecante.

Após a secagem os implantes e controles de titânio com o peptídeo nucleante mineral tentativo ligado são colocados em 5 ml de solução saturada de fosfato de cálcio. Depois da incubação durante 4h na temperatura ambiente, os implantes são removidos da solução mineral, lavados em água estéril e secos ao ar em um dessecante. Quando secos, os implantes poderão ser submetidos diretamente a uma varredura de microscopia eletrônica para avaliação do número de foco mineral presente nas superfícies modificadas.

Implantes de controle idênticos presentes na mesma célula eletrolítica que os implantes da experiência mas não ligados ao catodo poderão ser utilizados como controles. EXEMPLO 8 Preparação de uma camada superficial de implante de hidreto de titânio de biomolécula expandida (de enchimento de espaço). A instalação do exemplo 1 poderá ser utilizada para preparar uma camada de hidreto de titânio contendo nanosferas de alginato-Ca (Pronova AS) em implantes de titânio na forma de moeda, eletropolidos, com uma área total expostas ao eletrólito de 0,6 cm2. O eletrólito em ambas as câmaras adequadamente é CaCl2 1M em água estéril com o pH ajustado para um pH 5,5 por intermédio de HC1, e a concentração inicial de alginato-Ca adequadamente é de 1% peso/volume. Para a eletrólise poderá ser utilizada uma voltagem de 10 volts com uma densidade de corrente de 1 mA/cm2 e uma temperatura da câmara do catodo de 35 ° C. A eletrólise é deixada prosseguir adequadamente durante 48h após o que os implantes de titânio são removidos da célula eletrolítica, lavados em água estéril e deixados secar ao ar em um dessecante.

Após a secagem, os implantes de titânio com uma camada de alginato-hidreto adequadamente são mergulhados em salmoura estéril, secos com bromofenol azul (0,02 g/ml) e incubados durante lh a 37 ° C com a superfície modificada de frente para a solução. Depois da incubação na salmoura seca os implantes e controles são lavados com água destilada e observados com um vidro de aumento para a retenção do corante azul dentro da camada de alginato expandida tentativa. A espessura das camadas de alginato poderá também ser avaliada olhando-se as cunhas dos implantes em um microscópico de luz calibrado. Os implantes de controle idênticos presentes na mesma célula eletrolítica que os implantes da experiência, mas não ligados no catodo, poderão ser utilizados como controles. EXEMPLO 9 Preparação de uma superfície de implante de hidreto de titânio-biomolécula com duas camadas A instalação do exemplo 1 poderá ser utilizada para preparar uma camada dupla de hidreto de titânio contendo biomolécula na superfície dos implantes de titânio na forma de moeda, eletropolidos, com uma superfície total exposta ao eletrólito de 0,6 cm2. A camada interna poderá ser preparada utilizando-se a amelogenina como biomolécula de acordo com o método do exemplo 1. Imediatamente após este procedimento, e sem a secagem ao ar no intervalo, o eletrólito e as condições poderão ser modificadas para aquelas do exemplo 3 utilizando-se o DNA humano genômico como biomolécula. Para este fim os implantes de titânio poderão ser preparados com uma camada externa de hidreto de titânio-DNA sobrepondo uma camada interna de hidreto de titânio-amelogenina. Depois da eletrólise os implantes são removidos da célula eletrolítica, lavados em água estéril e deixados secar ao ar em um dessecante.

Depois da secagem os espécimes de titânio com os ácidos nucléicos tentativos e as proteínas ligadas são adequadamente lavados três vezes em solução tampão Tris-EDTA (TE-solução tampão; Tris-Cl 10 mM e EDTA 1 mM em água estéril). Em cada lavagem o pH é aumentado, começando com o pH 7,4, e então sendo lavado em um pH de 7,6 e finalmente em um pH 8,0. Depois da lavagem em TE o DNA restante e a proteína dos implantes de titânio são fmalmente removidos utilizando-se NaOH IN. As frações de rinsagem são então divididas em dois; uma parte para a análise de ácido nucléico e uma para a análise de proteínas. As frações de DNA adequadamente são precipitadas com um volume igual de álcool absoluto a -20 0 C durante lh e então retirado o sobrenadante por centrifugação a 13.000 g e 4 ° C. A pelota é então dissolvida em 50 μΐ de solução tampão TE com pH 7,4 e a quantidade de DNA de todas as quatro soluções de rinsagem é avaliada por análise fluorométrica utilizando-se um corante Hoechst (Boehringer Mannheim).

As frações para a análise de proteínas adequadamente são precipitadas com um volume igual de ácido perclórico a 0,6 N e o sobrenadante retirado por centrifugação. As pelotas precipitadas contendo sal e proteínas são então dissolvidas em 50 μΐ de amostra de solução tampão 2XSDS-PAGE (0,4 g de SDS, 1,0 g de 2-mercaptoetanol, 0,02 g de azul de bromofenol e 4,4 g de glicerol em 10 ml de Tris/HCl a 0,125 M, pH 6,8) e fervida durante 5 minutos. Todas as amostras são então submetidas a eletroforese em um gel de poliacrilamida-10% de SDS a 80 mA durante 4h.

Depois da eletroforese as proteínas do gel são transferidas para uma solução de contraste de prata e a amelogenina presente nas frações é visualizada como bandas distintas do gel.

Os implantes de controle idênticos presentes na mesma célula eletrolítica que os implantes da experiência mas não ligados ao catodo poderão ser utilizados como controles. EXEMPLO 10 Preparação de uma superfície de implante com camadas de hidreto de titânio-biomoléculas de duas zonas A instalação do exemplo 1 poderá ser utilizada para preparar duas zonas separadas de camadas de hidreto de titânio. Os implantes de titânio na forma de hastes, eletropolidos com uma área total de 2 cm2 foram tratados de acordo com os exemplos 3 e 6. Primeiramente os implantes foram colocados no eletrólito do exemplo 3, de forma que somente uma metade de cada implante foi mergulhada no eletrólito. Depois do procedimento do exemplo 3 ter sido completado, os implantes foram retirados e colocados em um eletrólito semelhante àquele utilizado no exemplo 6, de forma que a metade não tratada de cada implante foi agora mergulhada no eletrólito. O procedimento e as condições de reação dos exemplos 6 foram então executados, após o que o espécime de titânio foi removido da célula eletrolítica, lavado em água estéril e deixado secar em um dessecante.

Após a eletrólise os implantes de zona dupla são cortados em 2 no centro. As metades com camadas de hidreto de titânio-peptídeo FGF-4 sintético poderão ser submetidas à análise de acordo com o exemplo 2. As outras metades dos implantes, com camadas de hidreto de titânio-amoxicilina, poderão ser analisadas no ensaio de crescimento de bactérias de acordo com o exemplo 5. Os implantes de controle idênticos presentes nas mesmas células eletrolíticas que os implantes da experiência mas não ligados ao catodo poderão ser utilizados como controles. EXEMPLO 11 Preparação de uma camada superficial de implante de hidreto de titânio osteoindutivo contendo uma biomolécula Os implantes preparados conforme o exemplo 1 (hidreto de titânio-amelogenina) são colocados em ossos defeituosos calibrados do osso da tíbia de coelhos, assegurando-se que as fenestrações na medula do osso entre os implantes permite a migração de células osteogênicas para as superfícies modificadas do implante, utilizando-se um modelo padronizado e validado (Ronold e Ellingsen, European Society for Biomaterials Conference, Amsterdam, outubro de 2000). No dia seguinte à cirurgia e em cada semana seguinte os coelhos recebem uma injeção intravenosa de calceína (Sigma) de 10 mg/kg de peso do corpo. Após quatro semanas depois da colocação dos implantes modificados e dos implantes de controle os coelhos serão sacrificados e a tíbia removida, fixada em formaldeído a 4% e embebida para preparação de sessões no solo por todo o osso e material de implante integrado. Os implantes de controle idênticos na mesma célula eletrolítica que os implantes da experiência, mas não ligados ao catodo, poderão ser utilizados como controles.

Claims

1. Dispositivo protético médico ou implante médico contendo um material metálico (A) escolhido do grupo consistindo de titânio ou uma liga do mesmo, zircônio ou uma liga do mesmo, tântalo ou uma liga do mesmo, ráfnio ou uma liga mesmo, nióbio ou uma liga do mesmo e uma liga de cromo-vanádio, onde as partes da superfície do material metálico (A) são revestidas com uma camada de um material de hidreto correspondente (B) escolhido de hidreto de titânio, hidreto de zircônio, hidreto de tântalo, hidreto de ráfnio, hidreto de nióbio e hidreto de cromo e/ou vanádio, respectivamente, caracterizado pelo fato de que a camada de material de hidreto (B) compreende uma ou mais substâncias de biomoléculas (C) associadas com o mesmo, em que as biomoléculas (C) não são modificadas e se encontram retidas no material de hidreto (B).

2. Dispositivo ou implante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o material metálico (A) é titânio ou uma liga do mesmo, de preferência titânio.

3. Dispositivo ou implante de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a substância da biomolécula (C) é escolhida dos seguintes tipos de substâncias: bioadesivos naturais ou recombinantes; fatores de ligação de células naturais ou recombinantes; biopolímeros naturais, recombinantes ou sintéticos; proteínas do sangue naturais ou recombinantes; enzimas naturais ou recombinantes; proteínas de matriz extracelular naturais ou recombinantes; biomoléculas de matriz extracelular naturais ou sintéticas; hormônios e fatores de crescimento naturais ou recombinantes; hormônios de peptídeos naturais, recombinantes ou sintéticos; ácidos desoxirribonucléicos naturais, recombinantes ou sintéticos; ácidos ribonucléicos naturais, recombinantes ou sintéticos; receptores naturais ou recombinantes; inibidores de enzimas; drogas; ânions e cátions biologicamente ativos; vitaminas; monofosfato de adenosina (AMP), difosfato de adenosina (ADP) ou trífosfato de adenosina (ATP); biomoléculas marcadoras; aminoácidos; ácidos graxos; nucleotídeos (bases de RNA e DNA); açúcares.

4. Dispositivo ou implante de acordo com qualquer das reivindicações de 1-3, caracterizado pelo fato de que a substância ou substâncias da biomolécula (C) é/são associadas com o material de hidreto (B) em uma quantidade de 1 picogramas por milímetro quadrado até 1 mg por milímetro quadrado, de preferência de 0,1 nanogramas a 100 microgramas por milímetro quadrado.

5. Dispositivo ou implante de acordo com qualquer das reivindicações de 1-4, caracterizado pelo fato de que a substância ou substâncias de biomoléculas (C) é associada com as superfícies que estão em contato com o osso ou outro tecido quando o dispositivo é implantado no corpo de um mamífero.

6. Dispositivo ou implante de acordo com qualquer das reivindicações de 1-5, caracterizado pelo fato de que substitui a anatomia ou restaura uma função do corpo como a junta femural; a cabeça femural; o cálice acetabular; o cotovelo incluindo hastes, cunhas, insertos articulares; joelho, incluindo os componentes femural e da tíbia, hastes, cunhas, insertos articulares ou componentes patelares; ombros, incluindo hastes e cabeça; pulso; tornozelos; mãos; dedos; dedos do pé; vértebras; discos da coluna; juntas artificiais; implantes dentários; implantes ossiculoplásticos; implantes do ouvido médio incluindo bigorna, martelo, estribo, bigoma-estribo, martelo- bigoma, martelo- bigoma-estribo; implantes da cóclea; dispositivos de fixação ortopédica, tais como pregos, parafusos, grampos e placas; válvulas do coração; marcapassos; catéteres; vasos; implantes de enchimento de espaço; implantes para a retenção de auxiliares da audição; implantes para fixação externa; dispositivos intra-uterinos (DIU); e dispositivos bioeletrônicos, tais como dispositivos eletrônicos intracocleares ou intracraniais.

7. Método para a preparação de um implante ou dispositivo protético médico como definido em qualquer das reivindicações de 1-6, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende a submissão das partes da superfície de um material metálico (A) a um tratamento de eletrólise para formar a camada de material de hidreto (B), o referido tratamento de eletrólise sendo executado na presença de uma ou mais substâncias de biomoléculas (C).