DE60104560T2

DE60104560T2 - Mit metallhydriden und biomolekülen beschichtete medizinische prothesen und implantate mit verbesserter biokompatibilität

Info

Publication number: DE60104560T2
Application number: DE60104560T
Authority: DE
Inventors: Petter Staale LYNGSTADAAS; Eirik Jan ELLINGSEN
Original assignee: Astra Tech AB
Current assignee: Numat As Rud No
Priority date: 2000-12-06
Filing date: 2001-12-05
Publication date: 2005-03-03
Anticipated expiration: 2021-12-06
Also published as: CA2431211C; JP2009195731A; BR0115849A; WO2002045764A1; BR0115849B1; AU2095502A; AU2002220955B2; CN1227039C; JP2004515276A; CA2431211A1; ATE271887T1; EP1339437B1; DE60104560D1; EP1339437A1; JP5068918B2; CN1479635A; BRPI0115849B8; ES2223965T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft medizinische prosthetische Vorrichtungen und Implantate mit verbesserter biologischer Verträglichkeit.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es ist bereits vorgeschlagen worden, die Bioverträglichkeit von beispielsweise Titanprothesen zu verbessern, indem man deren metallische Oberflächen mit einer Schicht von Titanhydrid versieht, beispielsweise durch Bombardieren im Plasma oder durch Elektrolyse.
Es wurde ausserdem schon vorgeschlagen, die Bioverträglichkeit von Prothesen oder Implantaten zu verbessern, indem man verschiedene aktive Biomoleküle mit der Oberfläche der Prothesen verbindet oder diese in die Oberflächen integriert, beispielsweise auf die metallische Oberfläche einer Titan-Prothese. Das Ziel von Implantaten, die auf diese Weise präpariert sind, war es, dass sie eine verbesserte Einpassung, eine verbesserte Adhäsion am Gewebe und eine erhöhte Verträglichkeit mit diesem Gewebe erhalten; dass sie eine biologisch aktive Oberfläche für verbessertes Zellwachstum, eine verbesserte Differenzierung und Reife aufweisen; dass sie eine verminderte Immunoreaktivität aufweisen; dass sie eine antimikrobielle Aktivität zeigen; dass sie die verbesserte Fähigkeit zur Biomineralisierung erhalten; dass sie eine verbesserte Heilung von Wunden und/oder im Knochen aufweisen; zu einer verbesserten Kno chendichte führen; eine verminderte "Einbauzeit" zeigen und weniger Entzündungen verursachen.
Eine solche Bindung ist bereits mehrfach zur Ausführung mit beispielsweise chemischen Reagenzien vorgeschlagen worden, die zwei reaktive Funktionalitäten aufweisen, beispielsweise Formalin oder Glutaraldehyd, aber die reaktive Natur dieser Substanzen führt oft dazu, dass die Biomoleküle biologisch inaktiv werden und/oder dass eine erhöhte Immunoreaktivität auftritt, was unerwünscht ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass es möglich ist, eine Vielfalt von Biomolekülen mit oder in einer Hydridschicht im Verlaufe des anorganischen Verfahrens der Bildung einer solchen Hydridschicht auf Metallen durch Elektrolyse zu verketten, zu binden, einzuschliessen und/oder zu integrieren. Vor diesem Befund wurde es als sehr schwierig angesehen, nicht modifizierte, bioaktive Biomoleküle an Metalle zu binden und dort zu stabilisieren, insbesondere zur Verwendung als bioaktive Flächen auf Metallen zur Anwendung als Implantate in vivo im Körper von Wirbeltieren.
Die Erfindung betrifft demgemäss eine medizinische prosthetische Vorrichtung oder ein medizinisches Implantat, enthaltend ein metallisches Material (A), ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Titan oder einer seiner Legierungen, Zirconium oder einer seiner Legierungen, Tantal oder einer seiner Legierungen, Hafnium oder einer seiner Legierungen, Niobium oder einer seiner Legierungen und einer Chrom-Vanadium-Legierung, wobei Oberflächenbereiche des metallischen Materials (A) mit einer Schicht eines entsprechenden Hydridmaterials (B), ausgewählt aus Titanhydrid, Zirconium hydrid, Tantalhydrid, Hafniumhydrid, Niobiumhydrid sowie Chrom- und/oder Vanadiumhydrid versehen sind, dadurch gekennzeichnet, dass die Schicht des Hydridmaterials (B) eine oder mehrere Biomolekül-Substanzen (C) als Begleitsubstanz aufweist.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer medizinischen prosthetischen Vorrichtung oder eines medizinischen Implantats wie oben definiert, wobei das Verfahren darin besteht, dass Oberflächenbereiche des metallischen Materials (A), wie es oben definiert ist, einer Elektrolysebehandlung unterworfen werden, um eine Schicht eines Hydridmaterials (B) zu bilden, wobei die genannte Elektrolysebehandlung in Gegenwart einer oder mehrerer Biomolekül-Substanzen (C) ausgeführt wird.
EINZELBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Im vorliegenden Zusammenhang umfasst der Ausdruck "medizinische prosthetische Vorrichtung und Implantat" in seinem Geltungsbereich beliebige Vorrichtungen, die zum Implantieren in den Körper eines Wirbeltieres vorgesehen sind, insbesondere eines Säugetieres und eines Menschen. Nicht einschränkende Beispiele solcher Vorrichtungen sind medizinische Vorrichtungen, die die Anatomie ersetzen oder eine Körperfunktion wiederherstellen, beispielsweise ein Hüftgelenk; den Oberschenkelkopf; die Hüftgelenkpfanne; den Ellbogen einschliesslich Knochenschaft, Keile und Gelenkeinsätze, das Knie einschliesslich der Schenkelknochen- und Schienbeinteile, Knochenschäfte, Keile, Gelenkeinsätze oder Kniescheibenteile; Schultern einschliesslich Schaft und Kopf; Handgelenk; Knöchel; Hand; Finger; Zehen; Rückgratwirbel; Bandscheiben; künstliche Gelenke; Zahnimplantate; Ossiculoplastik-Implantate; Mittelohrimplantate einschliesslich Amboss, Hammer, Steigbügel, Amboss-Steigbügel, Hammer-Amboss, Hammer-Amboss-Steigbügel; Schnecken-Implantate; orthopädische Fixationsvorrichtungen wie Nägel, Schrauben, Klammern und Platten; Herzklappen; Schrittmacher; Katheter; Gefässe; Raumfüll-Implantate; Implantate zur Halterung von Hörhilfen; Implantate zur externen Fixation; Intra-uterin-Vorrichtungen (IUDs); sowie bioelektronische Vorrichtungen wie elektronische Vorrichtungen im Innenohr und im Schädelinneren.
Im vorliegenden Zusammenhang soll der Ausdruck "Biomolekül" eine weite Vielfalt biologisch aktiver Moleküle im weitesten Sinne des Wortes einschliessen und umfassen, wobei diese Moleküle natürliche Biomoleküle (d.h. natürlich vorkommende Moleküle aus natürlichen Quellen), synthetische Biomoleküle (d.h. natürlich vorkommende Moleküle, die synthetisch hergestellt werden, und auch nicht natürlich vorkommende Moleküle oder Formen solcher Moleküle, die synthetisch hergestellt werden) oder rekombinante Biomoleküle (d.h. mittels rekombinanten Techniken hergestellte Moleküle) sein können.
Eine nicht einschränkende Liste der wichtigsten Gruppe von Biomolekülen sowie von speziellen Biomolekülen, die zum Einbau in eine Schicht eines Metallhydrids (auf eine stabile und/oder physiologisch reversible Weise) gemäss der vorliegenden Erfindung als geeignet angesehen werden, wird nachstehend angegeben.
Extrahierte Biomoleküle
Bioadhäsive:
Solche Substanzen sind Biomoleküle, welche die Anlagerung von Zellen, Gewebe, Organen oder Organismen auf nicht biologischen Oberflächen wie Glas, Gestein usw. vermitteln.
Diese Gruppe von Biomolekülen enthält adhäsive Proteine der Meeresmuschel, fibrinähnliche Proteine, Proteine der Spinnenweben, von Pflanzen abgeleitete Adhäsive (Harze), Adhäsive, die aus Meerestieren extrahiert werden und Adhäsive aus der Extraktion von Insekten (beispielsweise Resiline). Einige spezifische Beispiele solcher Adhäsive sind die folgenden: Fibrin; Fibroin; Fussprotein Mythilus edulis (mefpl, "Muscheladhäsiv-Protein"); andere adhäsive Proteine aus Muscheln; Proteine und Peptide mit glycinreichen Blöcken; Proteine und Peptide mit Polyalanin-Blöcken; und Seidenproteine.
Zellenanlagerungsfaktoren:
Zellenanlagerungsfaktoren sind Biomoleküle, die die Anlagerung und die Ausbreitung von Zellen auf biologischen Oberflächen oder anderen Zellen und Geweben vermitteln. Diese Gruppe von Molekülen enthält typischerweise Moleküle, die bei der gegenseitigen Einwirkung von Zellen auf Matrizen und von Zellen auf Zellen bei der Entwicklung, der Neogenese, der Regenerierung und der Reparatur von Wirbeltieren teilnehmen. Typische Biomoleküle dieser Klasse sind Moleküle an der äusseren Oberfläche von Zellen wie die Klasse CD von Rezeptoren auf weissen Blutkörperchen, Immunoglobuline und hämagglutinierende Proteine sowie extrazelluläre Matrixmoleküle/Liganden, die an solchen zellulären Molekülen anhaften. Typische Beispiele von Zellanlagerungsfaktoren mit einer potentiell bioaktiven Verwendung bei der Beschichtung von Implantaten mit einem Überzug an Metallhydrid sind die folgenden: Ankyrine, Cadherine (calciumabhängige Adhäsionsmoleküle); Connexine; Dermatansulfat; Entactin; Fibrin; Fibronectin; Glycolipide, Glycophorin; Glycoproteine, Heparansulfat; Heparinsulfat; Hyaluronsäure; Immunoglobuline; Keratansulfate; Integrine; Laminine; N- CAMs (calcium-unabhängige Adhäsivmoleküle); Proteoglycane; Spektrin; Vinculin; Vitronectin.
Biopolymere:
Biopolymere sind beliebige biologisch hergestellte Moleküle, die unter den richtigen Bedingungen zu einer polymeren, makromolekularen Struktur zusammengesetzt werden können. Solche Moleküle sind wichtige Bestandteile der extrazellulären Matrix, wo sie zur Elastizität, Festigkeit, Starrheit, Integrität usw. von Gewebe beitragen. Einige wichtige Biopolymere mit einem Potential als bioaktive Beschichtung auf Implantaten mit einem Überzug eines Metallhydrids sind Alginate; Amelogenine; Cellulose; Chitosan; Collagen; Gelatine; Oligosaccharide; Pektin.
Blutproteine:
Diese Klasse von Proteinen enthält typischerweise beliebige aufgelöste oder feinteilige Proteine, die normalerweise im Blut vorhanden sind. Solche Proteine können sich an einer grossen Anzahl von biologischen Prozessen beteiligen, beispielsweise Entzündung, Verhornen von Zellen, Gerinnen, Markierung von Zellen, Abwehr, Immunoreaktionen, Stoffwechsel usw. Typische Beispiele mit einer Möglichkeit zur Verwendung als bioaktive Beschichtung in Implantaten mit einem Metallhydridüberzug sind Albumin; Albumen; Cytokine; Faktor IX; Faktor V; Faktor VII; Faktor VIII; Faktor X; Faktor XI, Faktor XII; Faktor XIII; Hämoglobine (mit oder ohne Eisen); Immunoglobuline (Antikörper); Fibrin; Wachstumsfaktoren aus Blutkörperchen (PDGFs); Plasminogen; Thrombospondin; Transferrin.
Enzyme
Enzyme sind beliebige Proteine oder Peptine, die eine spezifische katalytische Wirkung auf ein oder mehrere biologische Substrate ausüben und können von einfachen Zuckern bis zu komplexen Makromolekülen wie DNA reichen. Enzyme sind potentiell nützlich zur Auslösung biologischer Reaktionen im Gewebe durch Abbau von Matrixmolekülen, oder sie können andere bioaktive Verbindungen in der Beschichtung des Implantats aktivieren oder freisetzen. Einige wichtige Beispiele mit einer potentiellen Verwendbarkeit als eine bioaktive Beschichtung auf Implantaten mit einer Metallhydridschicht sind Abzyme (Antikörper mit enzymatischer Wirksamkeit); Adenylat-cyclase; Alkalin-Phosphatase; Carboxylasen; Collagenasen; Cyclooxigenasen; Hydrolasen; Isomerasen; Ligasen; Lyasen; Metallmatrix-Proteasen (MMPs); Nukleasen; Oxidoreduktasen; Peptidasen; Peptid-Hydrolase; Peptidyl-Transferase; Phospholipase; Proteasen; Sucrase-Isomaltase; TIMPs; Transferasen.
Extrazelluläre Matrix-Proteine und Biomoleküle:
Spezialisierte Zellen, z.B. Fibroblasten und Osteoblasten, erzeugen eine extrazelluläre Matrix. Diese Matrix nimmt an mehreren wichtigen Vorgängen teil. Die Matrix ist unbedingt erforderlich, beispielsweise bei der Wundheilung, Gewebe-Homeostasen, Entwicklung und Reparatur, Gewebefestigkeit und Gewebeintegrität. Die Matrix entscheidet ebenfalls über das extrazelluläre Milieu wie pH, Ionenstärke, Osmolarität usw. Weiterhin sind extrazelluläre Matrixmoleküle zur Einleitung und Regelung der Bildung von Biomineralien unbedingt nötig (Knochen, Knorpel, Zähne). Wichtige extrazelluläre Proteine und Biomoleküle mit einer möglichen Verwendung als bioaktive Beschichtung auf Implantaten mit einer Metallhydridschicht sind beispielsweise Ameloplastin; Amelin; Amelogenin; Collagen (I bis VII); Dentin-Sialo-Protein (DSP); Dentin-Sialo-Phospho-Protein (DSPF); Elastin; Enamelin; Fibrin; Fibronektin; Keratin (1 bis 20); Laminin; Tuftelin; Kohlenhydrate; Chondroitinsulfat; Heparansulfat; Heparinsulfant; Hyaluronsäure; Lipide und Fettsäuren; Lipopolysaccharide.
Wachstumsfaktoren und Hormone:
Wachstumsfaktoren und Hormone sind Moleküle, welche sich an Oberflächenstrukturen der Zelle (Rezeptoren) binden und ein Signal in der Zielzelle erzeugen, damit diese einen spezifischen biologischen Vorgang einleiten. Beispiele solcher Vorgänge sind Wachstum, programmierter Zelltod, Abgabe anderer Moleküle (beispielsweise extrazellulärer Matrixmoleküle oder Zucker), Differentiation und Reifung von Zellen, Regulierung der Stoffwechselgeschwindigkeit usw. Typische Beispiele solcher Biomoleküle mit einem Potential zur Verwendung als bioaktive Beschichtung auf Implantaten mit einer Metallhydridschicht sind folgende: Activine (Act); Amphiregulin (AR); Angiopoietine (Ang 1 bis 4); Apo3 (ein schwacher Starter für die Apoptose, ebenfalls bekannt unter der Bezeichung TWAK, DR3, WSL-1, TRAMP oder LARD); Betacellulin (BTC); basischer Fibroplasten-Wachstumsfaktor (bFGF, FGFb); saurer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (aFGF, FGF-a); 4-1BB-Ligand; neurotrophischer Faktor des Gehirns (BDNF); Bolokin aus Brust und Niere (BRAK); knochenmorphogene Proteine (BMPs); B-Lymphozyten-Chemoattraktant/B-Zellen anziehendes Chemokin 1 (BLC/BCA-1) ; CD27L (Ligand CD27) ; CD 30L (Ligand CD30); CD40L (Ligand CD40); Ligand zur Einleitung einer Proliferation (APRIL); Cardiotrophin-1 (CT-1.); neurotrophischer Faktor Cillary (CNTF); Wachstumsfator für Bindegewebe (CTGF); Cytokine; 6-Cystein-Chemokin (6Ckine); Wachstumsfaktoren der Epidermis (EGFs); Eotaxin (Eot); neutrophiles Aktivierungsprotein 78 aus Epithelzellen (ENA- 78); Erythropoletin (EPO); Wachstumsfaktoren für Fibroblasten (FGF 3 bis 19); Fractalkin; neurotrophische Faktoren, abgeleitet von Neuroglia (GDNFs); TNF-Rezeptorligand, induziert durch Glucocorticoid (GITRL); Stimulierungsfaktor für Granulocytenkolonien (G-CSF); Stimulierungsfaktor für Kolonien von Granulocyten-Makrophagen (GM-CSF); chemotaktische Proteine für Granulocyten (GCPs); Wachstumshormone (GH); I-309; wachstumbezogenes Onkogen (GRO); Inhibine (Inh); Interferon-induzierbarer Alpha-Chemoattraktor für T-Zellen (I-TAC); Fas-Ligand (FasL); Hereguline /HRGs); Wachstumsfaktor ähnlich dem Heparin-bindenden Epidermis-Wachstumsfaktor (HB-EGF); fms-ähnlicher Ligand für Tyrosin Kinase 3 (Flt-3L); Hämofiltrat CC Chemokine (HCC-1 bis 4); Wachstumsfaktor für Hepatocyten (HGF); Insulin; insulinähnliche Wachstumsfaktoren (IGF 1 und 2); Interferon-Gammainduzierbares Protein 10 (IP-10); Interleukine (IL 1 bis 18); Interferon-Gamma (IFN-gamma); Wachstumsfaktor für Keratinocyten (KGF); Wachstumsfaktor 2 für Keratinocyten (FGF-10); Leptin (OB); Leukemie-Inhibierungsfaktor (LIF); Lymphotoxin beta (LT-B); Lymphotactin (LöTN); Stimulierungsfaktor für Makrophagen-Kolonien (M-CSF); von Makrophagen abgeleitetes Chemokin (MDC); Makrophagen-Stimulierungs-Protein (MSP); Macrophagen-Entzündungsproteine (MIPs); Midkine (MK); Proteine von Monocyten-Chemoattraktor (MCP-1 bis 4); durch IFN-gamma induziertes Monokin (MIG); MSX 1; MSX 2; Inhibierungssubstanz nach Muller (MIS); Inhibierungsfaktor 1 für Myeloid-Progenitor (MPIF-1); Nervenwachstumsfaktor (NGF); Neurotrophine (NTs); neutrophiles Aktivierungspeptid 2 (NAP-2); Onkostatin M (OSM); Osteocalcin; OP-1; Oesteopontin; Ligand OX40; von Blutplättchen abgeleitete Wachstumsfaktoren (PDGFaa, ab und bb); Plättchenfaktor 4 (PF4); Pleiotrophin (PTN); pulmonäres und aktivierungsreguliertes Chemokin (PARC); exprimierte und sekretierte Normal T-Zellen, bei Aktivierung reguliert (RANTES); von sensoriellen und motorischen Neuronen abgeleiteter Faktor (SMDF); Vertreter 26 der Unterfamilie A des kleinen induzierbaren Cytokins (SCYA26); Stammzellenfaktor (SCF); von Stromalzellen abgeleiteter Faktor 1 (SDF-1); aktivierungsreguliertes Thymus-Chemokin (TARC); thymus-exprimiertes Chemokin (TECK); leukocytenexprimierter Ligand-1 in Verbindung mit TNF und ApoL (TALL-1); mit TNF verwandter Ligand zur Einleitung von Apoptose (TRAIL); mit TNF verwandtes aktivierungsinduziertes Cytokin (TRANCE); durch Lymphotoxin induzierbare Expression und mit HSV-Glycoprotein-D konkurrierender Rezeptor für HVEM-T-Lymphocyten (LIGHT); Placenta-Wachstumsfaktor (PIGF); Thrombopoletin (Tpo); Transformations-Wachstumsfaktoren (TGF alpha, TGF beta 1, TGF beta 2); Tumornekrose-Faktoren (TNF alpha und beta); vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktoren (VEGF-A, B, C und D); Calcitonine; und Steroidverbindungen wie die natürlich vorkommenden Sexualhormone, beispielsweise Östrogen, Progesteron, Testosteron und deren Analoga. Daher können bestimmte Implantate wie IUD (Intrauterin-Vorrichtungen) in Betracht kommen, die beispielsweise Östrogene oder Progesteron oder deren Analoga aufweisen.
Nucleinsäuren (DNA):
DNA kodiert die Gene für Proteine und Peptide. DNA enthält ebenfalls eine bedeutende Reihe von Sequenzen, die die Expression der darin enthaltenen Gene regulieren. Es bestehen mehrere Arten von DNA, abhängig von der Quelle, der Funktion, der Herkunft und der Struktur. Typische Beispiele für Moleküle auf der Basis von DNA, die als bioaktive Beschichtungen mit einer langsamen Freigabe auf Implantaten verwendet werden können (lokale Gentherapie), sind: A-DNA; B.DNA; Säugetier-DNA, welche künstliche Chromosome trägt (YACs); chromosomale DNA; zirkuläre DNA; Säugetier-DNA mit Cosmiden ; DNA; zweisträngige DNA (dsDNA); genomische DNA; halbmethylierte DNA; geradlinige DNA; Säugetier-cDNA (komplimentäre DNA; DNA-Kopie von RNA); Säugetier-DNA; methylierte DNA; mitrochondriale DNA; Säugetier-DNA, welche Phagen trägt; Säugetier-DNA mit Phagemiden; Säugetier-DNA mit Plasmiden; Säugetier-DNA mit Plastiden; rekombinante DNA; Restriktionsfragmente von Säugetier-DNA; Säugetier-DNA mit Retroposonen; einsträngige DNA (ssDNA); Säugetier-DNA mit Transposonen; T-DNA; Säugetier-DNA mit Viren; Z-DNA.
Nucleinsäuren (RNA)
RNA ist eine Transkription von DNA-kodierter Information (gelegentlich (in einigen Viren) ist RNA die eigentliche Einheit, welche Information kodiert). Ausser einem Zwischenprodukt bei der Expression von Genen zeigt sich RNA als Träger verschiedener biologischer Funktionen. Ribozyme sind einfache RNA-Moleküle mit einer katalytischen Wirksamkeit. Diese RNA kann die Spaltung und Anlagerung von DNA und RNA katalysieren, Peptide hydrolysieren, und die Moleküle sind der Kern der Translation von RNA in Peptide (das Ribosom ist ein Ribozym). Typische Beispiele von RNA-Molekülen mit einer möglichen Verwendung als bioaktive Beschichtung auf Implantaten mit einem Überzug aus einem Metallhydrid sind die folgenden: acetylierte Transfer-RNA (aktivierte trNA, beladene tRNA); cirkuläre RNA; lineare RNA; heterogene Kern-RNA in Säugetieren (hnRNA), Boten-RNA in Säugetieren (mRNA); Säugetier-RNA; ribosomale RNA in Säugetieren (rRNA); Transport-RNA in Säugetieren (tRNA); mRNA; poly-adenylierte RNA; ribosomale RNA (rRNA); rekombinante RNA; Säugetier-RNA, welche Retroposone trägt; Ribozyme; Transport-RNA (tRNA); Säugetier-RNA, welche Viren trägt.
Rezeptoren:
Rezeptoren sind Biomoleküle der Zelloberfläche, die Signale binden (beispielsweise Hormon-Liganden und Wachstumsfaktoren) und das Signal durch die Zellmembran und in den inneren Mechanismus von Zellen übertragen. Unterschiedliche Rezeptoren sind unterschiedlich "verdrahtet" und erzeugen unterschiedliche intrazelluläre Wirkungen selbst beim gleichen Liganden. Dies ermöglicht den Zellen, auf äussere Signale unterschiedlich zu reagieren, indem sie das Muster von Rezeptoren auf ihrer Oberfläche verändern. Rezeptoren binden typischerweise ihren Liganden auf reversible Weise, und dadurch werden sie als Träger von Wachstumsfaktoren geeignet, die in das Gewebe freigegeben werden sollen. Wenn man daher Implantate mit Rezeptoren für Wachstumsfaktoren beschichtet und dann diese Rezeptoren mit ihren hauptsächlichen Liganden belädt, erhält man eine bioaktive Oberfläche, die zur geregelten Abgabe von Wachstumsfaktoren in das umgebende Gewebe nach der Implantation verwendet werden kann. Beispiele von geeigneten Rezeptorenen mit einer möglichen Verwendung als bioaktive Beschichtung auf Implantaten mit einem Metallhydridüberzug sind die folgenden: die CD-Klasse von CD-Rezeptoren; EGF-Rezeptoren; FGF-Rezeptoren; Fibronectin-Rezeptor (VLA-5); Wachstumsfaktor-Rezeptor; IGF-Bindungsproteine (IGFBP 1 bis 4); Integrine (einschliesslich VLA 1 bis 4); Lamininrezeptor; PDGF-Rezeptoren; Alpha- und Beta-Rezeptoren für den Transformations-Wachstumsfaktor; BMP-Rezeptoren; Fas; Rezeptor des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (Flt-1); Vitronectin-Rezeptor.
Synthetische Biomoleküle
Synthetische Biomoleküle sind Moleküle, die auf natürlich vorkommenden Biomolekülen aufgebaut sind und diese nachah men. Durch die Synthese solcher Moleküle kann eine grosse Anzahl chemischer und struktureller Modifikationen eingeführt werden, die das Molekül stabilisieren oder es stärker bioaktiv oder spezifisch machen. Wenn daher ein Molekül entweder zu instabil oder zu unspezifisch ist, um aus Extrakten verwendet zu werden, ist es möglich, es umzubauen und das synthetisierte Molekül in Beschichtungen der Oberfläche von Implantaten zu verwenden. Weiterhin sind viele Biomoleküle so wenig zugänglich, dass ihre Extraktion im industriellen Massstab unmöglich ist. Solche seltenen Biomoleküle müssen synthetisch hergestellt werden, beispielsweise durch die rekombinante Technologie oder durch (Bio)Chemie. Eine Liste verschiedener Klassen synthetischer Moleküle, die möglicherweise für Implantatbeschichtungen nützlich sind, wird untenstehend angegeben:
Synthetische DNA:
A-DNA; gegensinnige DNA; B-DNA; komplementäre DNA (cDNA); chemisch modifizierte DNA); chemisch stabilisierte DNA; DNA; DNA-Analoga; DNA-Oligomere; DNA-Polymere; DNA-RNA-Hybride; doppelsträngige DNA (dsDNA); halbmethylierte DNA; methylierte DNA; einsträngige DNA (ssDNA); rekombinante DNA; Triplex-DNA; T-DNA; Z-DNA.
Synthetische RNA:
Gegensinnige RNA; chemisch modifizierte RNA; chemisch stabilisierte RNA; heterogene nukleare RNA (hnRNA); Boten-RNA (mRNA); Ribozyme; RNA; RNA-Analoga; RNA-DNA-Hybride; RNA-Oligomere; RNA-Polymere; ribosomale RNA (rRNA); Transport-RNA tRNA).
Synthetische Biopolymere:
Kationische und anionische Liposome; Celluloseacetat; Hyaluronsäure; Polymilchsäure; Polyglycolalginat; Polyglycolsäure; Polyproline; Polysaccharide.
Synthetische Peptide:
Decapeptide enthaltend DOPA und/oder diDOPA; Peptide mit der Sequenz "Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys"; Peptide, bei denen Pro durch Hydroxyprolin ersetzt ist; Peptide, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren Pro durch DOPA substituiert sind; Peptide, in denen eine oder mehrere Aminosäuren Pro durch diDOPA ersetzt ist; Peptide, bei denen eine oder mehrere Tyr durch DOPA ersetzt ist; Peptidhormone; Peptidsequenzen auf der Grundlage der oben angegebenen extrahierten Proteine; Peptide, welche einen Rest RGD (Arg Gly Asp) enthalten.
Rekombinante Proteine:
Sämtliche durch Rekombinieren hergestellten Peptide und Proteine.
Synthetische Enzym-Inhibitoren:
Synthetische Enzyminhibitoren reichen von einfachen Molekülen wie bestimmten Metallionen, welche Enzyme durch eine Direktbindung an das Enzym blockieren, bis zu synthetischen Molekülen, die das natürliche Substrat eines Enzyms nachahmen und daher mit dem ursprünglichen Substrat konkurrieren. Eine Implantatbeschichtung, welche Enzyminhibitoren enthält, kann zur Stabilisierung anderer Biomoleküle in der Schicht hilfreich sein und deren Abbau verhindern, so dass eine längere Reaktionszeit und/oder eine höhere Konzentra tion der bioaktiven Verbindung erzielt wird. Beispiele von Enzyminhibitoren sind: Pepstatin; Polyproline; D-Zucker; D-Aminosäuren; Cyanide; Diisopropyl-fluorphosphate (DFB); Metallionen; N-Tosyl-l-phenylalanin-chlormethylketon (TPCK); Physostigmin; Parathion; Penicillin.
Vitamine (synthetisch oder extrahiert) zur Einarbeitung in das Hydrid:
Biotin; Calciferol (Vitamine D; vital zur Mineralisierung des Knochens); Citrin; Folsäure; Niacin; Nicotinamid; Nicotinamid-Adenin-Dinucleotide (NAD, NAD+); Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat (NADP, NADPH); Retinolsäure (Vitamin A); Riboflavin; Vitamine B; Vitamin C (vital für die Collagensynthese); Vitamin E; Vitamine K.
Andere bioaktive Moleküle zur Einarbeitung in das Hydrid:
Adenosindiphosphat (ADP); Adenosinmonophosphat (AMP); Adenosintriphosphat (ATP); Aminosäuren; cyclisches AMP (cAMP); 3,4-Dihydroxyphenylalanin (DOPA); 5'-Di-(dihydroxyphenyl)-L-alanin (diDOPA); diDOPA-Chinon; DOPA-ähnliche o-diphenole; Fettsäuren; Glucose; Hydroxyprolin; Nucleoside; Nucleotide (RNA- und DNA-Basen);Prostaglandin; Zucker; Sphingosin-1-phosphat; Rapamycin; synthetische Sexualhormone wie Östrogen, Progesteron oder Testosteronanaloga, beispielsweise Tamoxifen; Östrogen-Rezeptor-Modulatoren (SERMs) wie Raloxifen; Bis-phosphonate wie Alendronat, Risendronat und Etidronat; Statine wie Cerivastatin, Lovastatin, Simvastatin, Pravastatin, Fluvastatin, Atorvastatin und 3,5-dihxydroxy-7-[3-(4-fluorphenyl)-1-(methylethyl)-1H-indol-2-yl]-hept-6-ensäure, Na-salz.
Medikamente zum Einbringen in die Hydridschichten:
Medikamente, welche in die Hydridschicht eingebracht werden, können zur Erzeugung lokaler Effekte verwendet werden, beispielsweise zur Verbesserung des örtlichen Widerstandes gegen das Eindringen von Mikroben, örtliche Schmerzbekämpfung, örtliche Inhibierung der Synthese von Prostaglandin; örtliche Entzündungsbekämpfung, örtliche Einleitung der Biomineralisierung und örtliche Stimulierung des Gewebewachstums. Beispiele von Medikamenten, die zum Einbringen in Metallhydridschichten geeignet sind, sollen wie folgt beschrieben werden: Antibiotica; Cyclooxygenaseinhibitoren; Hormone; Entzündungshemmer; NSAID-Substanzen; Schmerzmittel; Inhibitoren der Synthese von Prostaglandin; Steroide; Tetracyclin (ebenfalls als Mittel zur Biomineralisierung).
Biologisch aktive Ionen zum Einbringen in Hydridschichten:
Ionen sind für die unterschiedlichsten biologischen Mechanismen wichtig. Durch das Einbringen biologisch aktiver Ionen in Metallhydrid-Schichten auf Implantaten ist es möglich, biologische Vorgänge örtlich zu stimulieren, beispielsweise Enzymfunktionen, Enzymblockaden, zelluläre Aufnahme von Biomolekülen, Verhornung spezifischer Zellen, Biomineralisierung, Apoptose, zelluläre Ausscheidung von Biomolekülen, Zellstoffwechsel und Zellabwehr. Beispiele bioaktiver Ionen zum Einbringen in Metallhydrid-Schichten sind beispielsweise Calcium; Chrom; Kupfer; Fluorid; Gold; Iodid; Eisen; Kalium; Magnesium; Mangan; Selen; Silber; Natrium; Zink.
Markierende Biomoleküle:
Biologische Markierungsstoffe sind Moleküle, die ein deutliches Signal erzeugen, beispielsweise durch Abgabe von Licht, einer Enzymaktivität, Radioaktivität, spezifischen Färbungen, Magnetismus, Röntgenstrahlendichte, spezifische Struktur, Antigenwirkungen usw., die durch besondere Instrumente oder im Mikroskop oder durch ein Verfahren der Bilderzeugung wie Röntgenstrahlen oder magnetische Resonanz ermittelt werden können. Markierer verwendet man, um biologische Abläufe bei der Forschung und Entwicklung neuer biomedizinischer Behandlungsstrategien zu überwachen. Auf Implantaten würden solche Markierer typischerweise zur Überwachung von Vorgängen wie der Bioverträglichkeit, Bildung von Gewebe, Neogenese von Gewebe, Biomineralisierung, Entzündung, Infektion, Regenerierung, Reparatur, Gewebehomöostase, Gewebestörungen, Gewebeerneuerung, Freisetzung von Biomolekülen von der Oberfläche des Implantats, Bioaktivität freigesetzter Biomoleküle, Aufnahme und Expression von Nukleinsäuren, die von der Oberfläche des Implantats freigesetzt werden und einer antibiotischen Wirksamkeit der Implantatoberfläche zur Erzeugung eines "Prinzipienbeweises", eines Effektes, einer Wirksamkeit und der Beachtung der Sicherheit vor den klinischen Studien zu überwachen.
Als Markierer fungierende Biomoleküle, die sich zum Einbringen in Hydridbeschichtungen eignen, sind beispielsweise: Calcein; Alizarinrot; Tetracycline; Fluorescine; Fura; Luciferase; Alkaliphosphatase; radiomarkierte Aminosäuren (beispielsweise mit ³²P ³³P ³H ³⁵S ¹⁴C ¹²⁵I ⁵¹Cr, ⁴⁵Ca markiert); radioaktiv markierte Nucleotide (beispielsweise mit ³²P ³³P ³H ³⁵S ¹⁴C markiert); radiomarkierte Peptide und Proteine; radiomarkierte DNA und RNA; Immunogoldkomplexe (Goldteilchen mit daran gebundenen Antikörpern); Immunosilberkomplexe; Immunomagnetitkomplexe; grün fluoreszieren des Protein (GFP); rot fluoreszierendes Protein (E5); bioverzinnte Proteine und Peptide; bioverzinnte Nucleinsäuren; bioverzinnte Antikörper; bioverzinnte Kohlenstoffbrücken; Reportergene (Gene, die ein Signal erzeugen, wenn sie exprimiert werden); Propidiumiodide; Diamidinogelb.
Die Vorrichtung oder das Implantat gemäss der Erfindung kann für eine ganze Anzahl von Zwecken verwendet werden. Beispiele solcher Zwecke sind die Verwendung zur örtlichen Induzierung von hartem Gewebe (beispielsweise Knochengewebe), das sich an der Implantationsstelle bildet; Regelung des mikrobiellen Wachstums und/oder Eindringens an der Implantationsstelle oder systemisch; Verminderung von Entzündungen an der Implantationsstelle oder systemisch; Stimulierung der Reparatur, Regenerierung oder Bildung von Ligamenten; Einleitung der Bildung von Knorpel; Kernbildung, Steuerung und/oder Schematisierung der Biomineralisierung; Verbesserung der Verbindung zwischen Implantaten und Geweben; Verbesserung der Knochenintegration von Implantaten; Verbesserung des Anhaftens von Gewebe an einem Implantat; Verhinderung der Adhäsion von Gewebe an ein (halbpermanentes oder zeitweiliges) Implantat; Verbesserung des Kontaktes zwischen Geweben oder Geweben und Implantaten (Verbesserung des Verschlusses einer (chirurgischen) Wunde); Einleitung von Apoptosis (Zelltod) von unerwünschten Zellen (beispielsweise Krebszellen); Einleitung spezifischer Zelldifferenzierung und/oder Zellreife, Erhöhung der Zugfestigkeit von Gewebe; Verbesserung der Wundheilung; Beschleunigung der Wundheilung; Steuerung der Gewebebildung; Schematisierung der Gewebebildung; örtliche Gentherapie; Stimulierung des Nervenwachstums; Verbesserung der Gefässbildung in Geweben in der Umgebung eines Implantats; Stimulierung örtlicher extrazellulärer Matrixsynthesen; Inhibierung des Ausfallens extrazellulärer Matrix; Einleitung der Freisetzung örtlicher Wachstumsfaktoren; Verbesserung des lokalen Gewebestoffwechsels; Verbesserung der Funktion eines Gewebes oder eines Körperteils; Verminderung örtlicher Schmerzen und Störungen. Der Zweck hängt von der Art des Implantats und auch von der Natur und/oder Konzentration der in der Hydridschicht auf dem Implantat anwesenden Biomoleküle ab.
Wenn das metallische Material (A) eine Legierung des Titans, Zirkoniums, Tantals, Hafniums oder Niobs ist, kann es eine Legierung mit einem oder mehreren dieser metallischen Elemente sein; es kann sich auch um eine Legierung handeln, die eines oder mehrere andere Metalle wie Aluminium, Vanadium, Chrom, Kobalt, Magnesium, Eisen, Gold, Silber, Kupfer, Quecksilber, Zinn oder Zink enthält; oder um beide Möglichkeiten.
Es wird bevorzugt, dass das metallische Material (A) Titan oder eine Titanlegierung ist, beispielsweise eine Legierung mit Zirkonium, Tantal, Hafnium, Niob, Aluminium, Vanadium, Chrom, Kobalt, Magnesium, Eisen, Gold, Silber, Kupfer, Quecksilber, Zinn oder Zink. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das metallische Material (A) Titan.
Das entsprechende Hydridmaterial (B) ist vorzugsweise Titanhydrid.
Die Menge an der biomolekularen Substanz (C), die auf oder in der Hydridschicht (B) desjenigen Teiles der Prothese, der Vorrichtung oder des Implantates anwesend ist, welche mit dem Hydrid beschichtet ist, kann in sehr weiten Grenzen schwanken, beispielsweise in Abhängigkeit von den chemischen und biologischen Eigenschaften der biomolekularen Substanz oder der in Frage stehenden Substanzen. Die mit dem Hydridmaterial (B) verbundene biomolekulare Substanz (C) kann demgemäss in Mengen vorhanden sein, die von etwa 1 Picogramm pro mm² bis hinauf auf 1 mg pro mm² der mit Hydrid beschichteten Oberfläche der Vorrichtung oder des Implantats reichen. Es wird jedoch beabsichtigt, dass die nützlichsten biomolukularen Schichten von 0,1 Nanogramm bis 100 Mikrogramm pro mm² betragen.
Wie oben bereits angegeben wurde, werden beim erfindungsgemässen Verfahren Teile der Oberfläche des metallischen Materials (A) einer elektrolytischen Behandlung unter Bildung der Hydridschicht (B) unterworfen, und diese Behandlung wird in Anwesenheit eines oder mehrerer biomolukularen Substanzen (C) ausgeführt, wie oben ebenfalls beschrieben wurde. Es wurde gefunden, dass es wichtig ist, dass die Bedingungen im Elektrolyten (pH, Ionenstärke usw.) derart sind, dass das Biomolekül eine positive Nettoladung erhält. Es ist daher von Vorteil, wenn die meisten Biomoleküle Ampholyten sind, d.h. dass sie schwache Säuren (oder Basen) sind, die ihre Nettoladung je nach der Ionenstärke und des pH der Lösung, in der sie vorliegen, ändern. Demgemäss ist der wichtigste Gesichtspunkt bei ihrer Einarbeitung in eine Hydridschicht ihre Stabilität unter den Bedingungen, die zur Herstellung des Biohydrids erforderlich sind, d.h. eine Umgebung, welche genügend Wasserstoffionen zur Hydridherstellung liefert und gleichzeitig die Nettoladung des fraglichen Biomoleküls positiv hält. Dies bedeutet in den meisten Fällen, dass der Elektrolyt eine hohe Salzkonzentration besitzen soll und demgemäss eine hohe Ionenstärke; eine vergleichsweise hohe Temperatur, obschon bevorzugt unterhalb jeglicher Denaturierungstemperatur der biomolekularen Substanz; und ein niedriges pH.
Demgemäss kann der Elektrolyt eine beliebige Salzlösung sein, vorzugsweise eine wässrige Lösung, beispielsweise eine Lösung von Natriumchlorid, Natriumsulfat, Calciumphosphat, Calciumchlorid, mit Phosphat gepufferte Salzlösung, (PBS), Salzlösung, eine Salzlösung, welche physiologische Bedingungen nachahmt, Bicarbonate, Carbonate usw., in der das gewünschte Biomoleküle gelöst ist. Die Ionenstärke des Salzes ist typischerweise 1M, jedoch können die Konzentrationen auf einen niedrigen Wert von 0,01M und bis zu 10M eingestellt werden, je nach den chemischen Eigenschaften und der Konzentration des oder der Biomoleküle.
Die Temperatur des Elektrolyten, welcher das Biomolekül enthält, kann von Zimmertemperatur (20°C) bis hinauf zum Siedepunkt des Elektrolyten reichen, normalerweise bei 100°C, obschon die Anwendung von Temperaturen im oberen Gebiet dieses Bereiches in klarer Weise von der Fähigkeit des Biomoleküls abhängen, solche Temperaturen ohne Beschädigung auszuhalten. Wenn es das Biomolekül aushält, ist eine optimale Temperatur zur Bildung des Hydrides etwa 80°C.
Das pH des Elektrolyten wird typischerweise mittels einer starken Säure auf den gewünschten Wert eingestellt, beispielsweise HCl, HF, H₂SO₄ usw., obwohl der Tatsache Rechnung zu tragen ist, dass ein pH-Wert unterhalb 2 eine unregelmässige, korrodierte Implantatfläche auf Titan bildet, während ein pH oberhalb 2 die ursprüngliche Oberfläche beibehält. Das pH wird gemäss dem gewünschten Verhältnis von Hydrid zu Biomolekül eingestellt; niedrige pH-Werte erzeugen eine Implantat-Oberfläche mit einem hohen Verhältnis von Hydrid zu Biomolekül (= mehr Metallhydrid), während ein hohes pH nahe am pI des fraglichen Biomoleküls eine Oberfläche mit einem niedrigen Verhältnis von Hydrid zu Biomolekül ergibt (= mehr Biomoleküle). Demgemäss liegt das bevorzugte pH zur Herstellung des Hydrids zwischen 5 und 2, obwohl beliebige Werte zwischen 0 und 10 verwendet werden können, was von den chemischen Eigenschaften und der Konzentration des oder der Biomoleküle abhängt, weiterhin vom verwendeten Elektrolyten und vom bevorzugten Verhältnis von Hydrid zu Biomolekül. Für höhere Verhältnisse von Hydrid zu Biomolekül (= mehr Hydrid) wird das pH saurer gestellt, und für niedrigere Verhältnisse von Hydrid zu Biomolekül(en) (mehr Biomolekül(e)) stellt man das pH näher an den Wert des ^pIBiomolekül, aber nicht höher ein. Die einzige Anforderung ist diejenige, dass im Elektrolyt Wasserstoffionen (H⁺) und positiv geladene Biomoleküle (Biomolekül⁺, Nettoladung) vorhanden sind.
Die Konzentration des oder der Biomoleküle (ein Molekül oder beliebige Kombinationen von zwei oder mehreren) im Elektrolyten kann in weiten Grenzen schwanken, was von der Art der Bioaktivität, der Art des Moleküls, der chemischen und biologischen Eigenschaften, der Toxizität, der Wirkungskraft, der Wirkungsart, ob es sich von der Hydridschicht lösen soll oder nicht, der Stabilität in vivo, der Stabilität im Elektrolyten, der Zugänglichkeit, dem optimalen pH usw. abhängig ist. Die Konzentration des oder der Biomoleküle im Elektrolyten kann zwischen 1 pg und 50 mg pro Milliliter schwanken. Ein bevorzugter Bereich liegt zwischen 10 pg und 1 mg pro Milliliter, die optimale Konzentration an Biomolekül sollte letztlich jedoch immer in Kontrollversuchen bestimmt werden, wobei jedes Biomolekül oder ein Gemisch von Biomolekülen eingesetzt wird. Auch kann sich die Zeitspanne ändern, während derer die Elektrolyse ausgeführt wird, sie beeinflusst jedoch hauptsächlich die Dicke der Hydridschicht und daher die Konzentration von Biomolekülen in der Hydridschicht.
Eine Elektrolysezelle zur Verwendung im erfindungsgemässen Verfahren kann eine übliche Konstruktion aufweisen, ist jedoch typischerweise eine Zweikammerzelle ohne Leitungsverbindungen zwischen den Kammern ausser für den Elektrolyten. Das metallische Implantat, das durch das Hydrid zu modifizieren ist, wird in den Kathodenraum (d.h. als negativ ge ladene Elektrode) gebracht, während die Anode (die positiv geladene Elektrode) typischerweise aus Kohlenstoff besteht und in einen getrennten Raum gebracht wird. Die Elektrolyten jeder Kammer werden über eine Glasfritte oder ein poröses Porzellanfilter miteinander in Berührung gebracht, wodurch der Strom ungehindert hindurchgehen kann, aber kein Austausch von Elektrolyten zwischen den zwei Kammern möglich ist. Dies ist wichtig, da die Produkte der Anodenreaktion, beispielsweise Chlorid oder Hypochlorit usw., möglicherweise mit der Bildung der Schicht aus Biomolekül und Hydrid in Wechselwirkung treten oder das Biomolekül im Kathodenelektrolyten zerstören oder modifizieren könnten. Die Trennung der beiden Zellen gestattet ebenfalls die Verwendung eines kleineren Kathodenelektrolyt-Volumens und demgemäss eine wirksamere Ausnutzung der Biomoleküle sowie die Möglichkeit, ein System mit zwei Elektrolyten zu verwenden, wodurch das elektrolytische Verfahren optimiert werden kann, beispielsweise einen Elektrolyten, der an der Kathodenseite für Biomoleküle optimal ist und einen Elektrolyten an der Anodenseite, der für den Wirkungsgrad der Elektrolyse an sich optimiert ist (Leitfähigkeit, Vermeidung toxischer Produkte, und selbst die Herstellung nützlicher Nebenprodukte bzw. Überzüge).
Wie oben angegeben wurde, sollte die Temperatur in der Kathodenzelle (T_cat) so hoch wie möglich sein, wobei das Optimum zur Herstellung des Hydrides bei 80°C liegt.
Der Elektrolysevorgang als solcher erzeugt ebenfalls Wärme, die zwei Probleme schaffen kann; Bestandteile des Elektrolyten verdampfen, so dass das Volumen abnimmt und die Ionenstärke und die Konzentration von Biomolekülen über den bevorzugten Bereich hinaus zunimmt, und die Erhöhung der Temperatur kann Ausfällung, Koagulation, Denaturierung, Abbau oder Zerstörung der anwesenden Biomoleküle verursachen.
Daher ist die Kathodenkammer der Elektrolysezelle vorzugsweise mit einem gekühlten Deckel zur Kondensation verdampften Elektrolyts und einem temperaturgeregelten Mantel zur Stabilisierung der Temperaturen und Volumina bei der Elektrolyse ausgerüstet.
Durch die Einstellung von Strom, Ladung und Elektrolytzusammensetzung kann es ebenfalls möglich sein, ein günstiges Milieu für die positive Ladung der meisten Biomoleküle zu schaffen. Wenn dies nicht der Fall ist, so ist der Betrieb der Elektrolyse mit pulsierendem Feld, wobei die Polarität der Elektroden im geregelten Zyklus während der Herstellung der Schicht des Biohydrids umgeschaltet wird, ein Weg, das Problem einer negativen Nettoladung zu beseitigen. Die Stromquelle ist normalerweise eine so genannte Strompumpe, d.h. eine Vorrichtung, die einen konstanten Strom liefert, selbst wenn sich der Widerstand im Stromkreis ändert. Obschon Spannungen zwischen 0,1 und 1000 Volt angewendet werden können, beträgt die normale Spannung weniger als 10 Volt. Die Stromdichte während der Elektrolyse beträgt typischerweise 0,1 mA bis 1 A pro Quadratzentimeter (cm²) des Musters des Implantats. Eine bevorzugte Stromdichte ist 1 mA/cm², obschon Einstellungen des Elektrolyten, des pH und der Temperatur zur Erhöhung der Verträglichkeit des Biomoleküls kleinere oder grössere Abweichungen von diesem Wert verursachen können.
Die Dauer des Verfahrens hängt von verschiedenen Parametern ab, beispielsweise der gewünschten Dicke der Biohydridschicht, der Zusammensetzung und den Eigenschaften des Elektrolyten, den Eigenschaften des Biomoleküls, der Temperatur und des pH, dem gewünschten Verhältnis von Hydrid zu Biomolekül, der Grösse des jeweiligen Implantats, dem Volumen des Elektrolyten an der Kathode, der Konzentration des Biomoleküls usw. Demgemäss kann die Dauer des Verfahrens zwischen 0,5 Stunden und mehreren Tagen liegen. Eine optimale Zeitspanne ist im allgemeinen zwischen 8 und 24 Stunden.
Um das Biohydridverfahren zu überwachen, kann man meist eine Kalomelelektrode in die Kathodenkammer einbringen. Wenn der Vorgang der Bildung der Hydridschicht an der Kathode optimal verläuft, beobachtet man eine Differenz von –1 Volt zwischen der Kalomelelektrode und der Kathode. Wenn der Strom stark von diesem Wert abweicht, läuft das Verfahren nicht unter optimalen Bedingungen ab, und eine Änderung der Verfahrensweise sollte ins Auge gefasst werden. Weiterhin können ein Temperaturfühler und ein pH-Fühler in die Kathodenkammer eingebracht werden, um sicher zu stellen, dass das Verfahren in den gewünschten Grenzen von pH und Temperatur abläuft. Ein Rührer, beispielsweise ein Magnetrührer, kann ebenfalls in der Kathodenzelle vorhanden sein, um den Elektrolyten kontinuierlich umzuwälzen, die Temperatur homogen zu halten und Änderungen der örtlichen Ionenstärke, des pH und der Konzentrationen an Biomolekül zu vermeiden.
Nach der Elektrolyse wird die nun mit Biomolekül/Hydrid beschichtete metallische Vorrichtung bzw. das Implantat unmittelbar aus dem Elektrolyten entfernt und nach den Anforderungen des bzw. der fraglichen Biomoleküle weiterbehandelt. Typischerweise lässt man die Vorrichtung oder das Implantat an Luft trocknen und verpackt es dann in einem sterilen, luftdichten Kunststoffbeutel, worin es bis zur Verwendung zwecks Implantierung gelagert wird. Manche Biomoleküle können jedoch auf eine Trocknung empfindlich sein, und demgemäss kann eine Nasslagerung erwünscht sein, beispielsweise in Büchsen oder die Lagerung in einer Flüssigkeit, beispielsweise in einer Salzlösung oder ganz einfach im Elektrolyten aus dem Herstellungsverfahren. Obschon die Elektrolyse unter aseptischen oder selbst sterilen Bedingungen ausgeführt werden kann, ist dies nicht unbedingt nötig, wenn man eine Sterilisierung vor der Verwendung vorsieht, wobei die üblichen Methoden wie eine Ionisierungsstrahlung, Erhitzen, Sterilisieren im Autoklav oder mit gasförmigem Ethylenoxid angewandt werden können. Die Wahl des Verfahrens hängt von den spezifischen Eigenschaften und Eigenheiten des oder der Biomoleküle ab, welche in der metallischen Hydridschicht anwesend sind. Vor der elektrolytischen Behandlung sollte die Vorrichtung bzw. das Implantat gründlich gereinigt werden. Dazu wird typischerweise das Implantat mechanisch vorbehandelt, indem man es elektropoliert oder sandstrahlt, um die Oberfläche zu modifizieren, falls gewünscht, und eine nachfolgende gründliche Reinigung mit heisser Natrumlauge gefolgt von einer Entfettungsstufe, beispielsweise mit konzentriertem Trichlorethylen, Ethanol oder Methanol, bevor eine Behandlung in einer Beizlösung erfolgt, beispielsweise mit Flusssäure, um Oxide und Verunreinigungen von der Oberfläche zu entfernen. Nach dem Beizen wird das Implantat gründlich mit heissem, doppelt destilliertem und ionenfreiem Wasser gewaschen.
Die Erfindung wird in den folgenden, nicht einschränkenden Beispielen weiter erläutert, wobei die Beispiele 1 bis 4 die ausgeführten Versuche und die Beispiele 5 bis 11 die weiter vorgeschlagenen Arbeitsbeispiele sind.
BEISPIEL 1
Herstellung einer Oberflächenschicht auf einem Implantat aus Titanhydrid, welche ein extrazelluläres Matrixprotein enthält
Eine Elektrolysezelle mit zwei Abteilen wurde zur Herstellung einer Schicht aus Titanhydrid, die das extrazelluläre Matrixmolekül Amelogenin enthält, auf 5 münzenförmigen elektropolierten Titan-Implantaten angewandt, von denen jedes eine Oberflächengrösse von 0,6 cm² besass, die dem Elektrolyten ausgesetzt wurde. 5 ähnliche Gegenstände wurden als Blindproben verwendet, die im Elektrolytabteil anwesend sind, jedoch nicht mit dem Elektrolysestrom verbunden werden. Der Elektrolyt in beiden Abteilungen war 1M NaCl in sterilem Wasser, wobei das pH auf einen Wert von 4 mittels HCl eingestellt wurde, und die anfängliche Konzentration von Amelogelin betrug 0,1 mg/ml. Bei der Elektrolyse wurde eine Spannung von 10 Volt mit einer Stromdichte von 1 mA/cm² angewendet. Die Temperatur im Kathodenabteil wurde auf 70°C eingestellt. Die Elektrolyse wurde 18 Stunden lang ausgeführt, wonach die Titanimplantate aus der Elektrolysezelle entnommen, in sterilem Wasser gewaschen und in einem Exsiccator an der Luft trocknen gelassen wurden.
Nach dem Trocknen wurden die Testproben und Blindproben aus Titan jeweils dreimal in 1 ml Salzlösung bei einem pH von 6,5 gewaschen. Nach den Wäschen wurde etwaiges an den Titanflächen verbliebenes Protein aufgelöst, indem man die Titanprobe in 0,5 ml 2×SDS-PAGE-Puffer (0,4 g SDS, 1,0 g 2-Mercaptoethanol, 0,02 g Bromphenolblau und 4,4 g Glycerin in 10 ml 0,125 M Tris/HCl, pH 6,8) kochte. Die Waschlösungen und der Puffer 2-SDS-PAGE mit möglicherweise darin aufgelöstem Protein wurden mit einem gleichen Volumen an 0,6 N Perchlorsäure ausgefällt und die überstehende Schicht durch Zentrifugieren geklärt. Die ausgefallenen Rückstände, die Salz und möglicherweise organische Moleküle enthielten, wurden dann in 50 μl Puffer 2×SDS-PAGE gelöst und 5 Minuten lang gekocht. Sämtliche Proben wurden danach einer Elektrophorese auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel bei 80 mA über Nacht unterworfen. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine im Gel auf eine Polyvinylidendifluorid-Membran mittels der Arbeitsweise der halbtrockenen Elektroanfärbung nach einer "Sandwich"-Methode überführt. Die Amelogenin-Proteine wurden dann mittels eines Immunotests unter Verwendung eines primären IgG-Antikörpers gegen Amelogenin von Kaninchen und einem sekundären Antikörper, nämlich einem mit Biotin markierten Anti-Kaninchen-IgG aus Ziegen, bestimmt. Der Western-Blot zeigte bedeutende Mengen an Amelogenin in Extrakten aus den Testproben, und zwar eingebettet in der Schicht des Titanhydrids, wogegen in den Extrakten aus den Blindproben, die nicht mit dem Elektrolysestrom in Berührung gekommen waren, keine Amelogenine gefunden wurden.
Dieser Versuch zeigt in klarer Weise, dass eine bedeutende Menge an Amelogenin während der Elektrolyse in die Hydridschicht eingebaut worden war. Die Amelogenin-Proteine waren nicht nur in Form einer einfachen Schicht anwesend, da keine Proteine in den ersten Waschlösungen gefunden wurden. Nur durch eine Kombination eines starken Detergens (SDS), einem Reduktionsmittel (Mercaptoethanol) und einer hohen Temperatur (100°C) war es möglich, Amelogenin aus der Oberflächenschicht des Titanhydrids zu extrahieren und mittels des Western-Blots aufzufinden. Die Menge an extrahiertem Protein wurde zu 50 μg/cm² durch Vergleich mit einem Amelogenin-Standard berechnet. Dieser Wert liegt gut im Gebiet der Bioaktivität dieses extrazellulären Matrix-Proteins.
BEISPIEL 2
Herstellung einer Oberflächenschicht eines Implantats aus Titanhydrid, welche Amelogenin enthält
Die Arbeitsweise des Beispiels 1 wurde zur Herstellung einer Schicht aus Titanhydrid verwendet, welche das extrazelluläre Matrixmolekül Amelogenin auf elektropolierten Titan- Implantaten mit einer Oberflächengrösse von je 0,35 cm², die dem Elektrolyten ausgesetzt wurde, enthielt. Der Elektrolyt in beiden Abteilen war 1M NaCl in sterilem Wasser, das pH war unter Verwendung von HCl auf 4 eingestellt, und die anfängliche Konzentration an Amelogenin betrug 0,1 mg/ml. Bei der Elektrolyse wurde eine Spannung von 10 Volt bei einer Stromdichte von 1 mA/cm² angewendet. Der Wert von T_cat wurde auf 70°C eingestellt. Die Elektrolyse wurde 18 Stunden lang fortgesetzt, wonach die Titan-Implantate aus der Elektrolysezelle herausgenommen, mit sterilem Wasser gewaschen und an der Luft im Exsiccator getrocknet wurden.
Nach dem Trocknen wurden die Titan-Proben dreimal in 1 ml Salzlösung bei pH 6,5 gewaschen. Nach der Wäsche wurden die an den Titanflächen verbleibenden Proteine durch Kochen der Titanproben in 0,1 ml Puffer 2×SDS (0,4 g SDS, 1,0 g 2-Mercaptoethanol in 10 ml 0,125 M Tris/HCl, pH 6,8) während 5 Minuten abgelöst. Die Menge an Amelogenin, die von den gewaschenen Titan-Oberflächen in die SDS-Lösung aufgenommen worden war, wurde dann mittels Standard-Photometrie durch Messung der Lichtabsorption bei 280 und 310 nm gegen eine Blindprobe des Puffers 2×SDS analysiert und die Ergebnisse mit einer standardisierten Verdünnungsreihe von Amelogenin in 2×SDS-Puffer verglichen. Der Versuch wurde zwei Mal mit Serien von 16 Implantaten und beide Male mit 5 negativen internen Blindproben in Form identischer Titan-Implantate wiederholt, welche in der Reaktionskammer während des ganzen Verfahrens anwesend, aber mit der Kathode nicht verbunden waren.
Dieser Versuch zeigt klar, dass eine wesentliche Menge an Amelogenin im Verlaufe des Elektrolyseverfahrens in die Hydridschicht eingebaut worden war. Die Amelogenin-Proteine waren nicht als einfache Beschichtung anwesend, da die die Waschlösungen keinerlei Proteine enthielten. Lediglich durch die Kombination eines starken Detergens (SDS), eines Reduktionsmittels (2-Mercaptoethanol) und hoher Temperatur (100°C) konnte Amelogenin aus der Oberflächenschicht des Titanhydrids extrahiert werden. Die Menge an extrahiertem Protein wurde zu Werten zwischen 57 und 114 μg/cm² mit einem Mittelwert von 87 μg Amelogenin pro cm² berechnet, und zwar durch Vergleich mit dem Amelogenin-Standard. Diese Zahl liegt gut im Bereich der Bioaktivität dieses extrazellulären Matrixproteins. Identische Blindproben, die in der gleichen elektrolytischen Zelle wie die Versuchsimplantate anwesend waren, jedoch mit der Kathode nicht verbunden wurden, zeigten keine wesentlichen Mengen an Amelogenin-Proteinen, die an der Oberfläche anhafteten (< 1 μg/cm²).
BEISPIEL 3
Herstellung einer Oberflächenschicht aus einem nukleinsäurehaltigen Titanhydrid auf einem Implantat
Die Arbeitsweise des Beispiels 1 wurde zur Herstellung einer Schicht aus Titanhydrid angewendet, welche Nukleinsäuren in Form radiomarkierter DNA aus menschlicher Plazenta auf elektropolierten Titanimplantaten mit einer dem Elektrolyten ausgesetzten Oberflächengrösse von 0,35 cm² enthielt. Der Elektrolyt in beiden Kammern war 1M NaCl in sterilem Wasser. Das pH wurde auf 2 durch die Zugabe von HCl eingestellt. Die Anfangskonzentration der DNA im Elektrolyten betrug 10 μg/ml. Bei der Elektrolyse wurde eine Spannung von 10 Volt bei einer Stromdichte von 1 mA/cm² und einer T_cat von 75°C angewendet. Die Elektrolyse wurde während 16 oder 24 Stunden ausgeführt, wonach die Titanproben aus der Elektrolysezelle entnommen, dreimal mit grösseren Mengen von Tris-EDTA-Puffer (TE-Puffer; 10 mM Tris-Cl und 1 mM EDTA in sterilem Wasser, pH 7,6) gespült und dann über Nacht in einem Exsiccator an Luft getrocknet wurden.
Die DNA war unter Verwendung eines Markierungssatzes Stratagen Prime-It^® II Random Primer Labeling zur Herstellung von Fühlern mit einer hohen spezifischen Aktivität und einem [α-³²P]-dATP (Amersham) radiomarkiert worden. Nach dem Markieren der DNA wurde die spezifische Radioaktivität der DNA-Probe in einem Scintillationszähler Tricarb^® von Packard gemessen, wobei 3,0 × 108 Zerfallsereignisse pro Minute pro Mikrogramm markierter DNA gefunden wurden (dPm/μg).
Nach dem Trocknen wurden die Titanproben mit möglicherweise anhaftenden Nukleinsäuren 15 Minuten lang auf einen Phosphorschirm (Fujii^®) gelegt. Die Proben wurden dann abgenommen und der Phosphorschirm auf einer Phosphor-Abbildungsmaschine BioRad^® abgetastet, wobei die Anzahl der Zerfallsereignisse, die an der Oberfläche jedes Implantats auftraten, mit einer Auflösung eines Rasters mit 100 um (12265 Punkte pro Implantat) gemessen wurde. Der Versuch wurde zweimal mit einer Serie von 16 Implantaten wiederholt, jedes Mal mit 5 negativen internen Blindproben in Form identischer Titanimplantate, die in der Reaktionskammer während des gesamten Verfahrensablaufs anwesend waren, mit der Kathode jedoch nicht verbunden waren. In der ersten Serie betrug die Reaktionszeit 24 Stunden und in der zweiten Serie 16 Stunden. Die Gesamtanzahl von dpm pro Implantat wurde berechnet und in μg DNA pro Quadratzentimeter (μg DNA/cm²) umgerechnet.
Die Menge an DNA auf den Implantaten betrug zwischen 0,25 und 0,75 μg/cm² mit einem Mittelwert von 0,43 μg DNA/cm², wenn die Reaktionszeit 24 Stunden betrug. Wurde die Reaktionszeit auf 16 Stunden verkürzt, so lagen die entspre chenden Werte zwischen 0,19 und 0,32 μg/cm² mit Mittelwerten von 0,30 μg DNA/cm². Diese Zahl liegt gut im anwendbaren Bereich für eine Gentherapie und DNA-Impfstoffe und andere molekulare medizinische Anwendungen. Identische Blindproben, die in der gleichen Elektrolysezelle wie die Versuchsimplantate anwesend waren, jedoch mit der Kathode nicht verbunden wurden, zeigten nur sehr geringe Mengen (Picogramme) von DNA, die an die Oberfläche gebunden war.
Dieser Versuch zeigt in klarer Weise, dass eine bedeutende Menge an DNA während der Elektrolyse in die Hydridschicht eingebaut worden war. Die DNA war nicht lediglich anwesend als einfache Schicht, da sie beim Spülen mit TE nicht aufgelöst oder von den Versuchsimplantaten abgewaschen werden konnte. Weiterhin zeigt die Tatsache, dass die Menge an DNA, die in die Oberflächenschicht aus Titanhydrid eingebaut wird, linear mit der Reaktionszeit ansteigt, so dass die Reaktionszeit ein einfacher Weg ist, die Menge an Biomolekülen in der Hydridschicht zu regeln.
BEISPIEL 4
Herstellung einer Oberflächenschicht aus Titanhydrid, die Ascorbinsäure enthält, auf einem Implantat
Die Arbeitsweise des Beispiels 1 wurde zur Herstellung einer Schicht aus Titanhydrid angewendet, welche Ascorbinsäure (Vitamin C) auf elektropolierten, münzenförmigen Titanimplantaten enthielt. Diese besassen eine gesamte Oberflächengrösse, die dem Elektrolyten ausgesetzt wird, von 0,35 cm². Der Elektrolyt in beiden Kammern war eine Kochsalzlösung, deren pH mittels Phosphorsäure auf einen Wert von 3 eingestellt worden war. Die Anfangskonzentration an Ascorbinsäure betrug 10 mg/ml. Bei der Elektrolyse wurde eine Spannung von 6 Volt, eine Stromdichte von 2 mA/cm² und eine Temperatur in der Kathodenkammer von 20°C angewendet. Die Elektrolyse wurde während 16 Stunden ausgeführt, wonach das Titanimplantat der Elektrolysezelle entnommen, zweimal mit sterilem Wasser gespült und dann in einem Exsiccator getrocknet wurde.
Nach dem Trocknen über Nacht wurde die Ascorbinsäure von der Titanprobe abgelöst, indem man die Proben in 1 ml Tris-EDTA-Puffer (TE-Puffer; 10 mM Tris-Cl und 1 mM EDTA in sterilem Wasser) bei einem pH von 8 , 0 eine Stunde lang unter Schütteln eintauchte. Die Menge an Ascorbinsäure in den Pufferproben wurde dann durch eine Messung der Lichtabsorption bei 250 nm und einen Vergleich der Ergebnisse mit einer Standardkurve für Ascorbinsäure in TE vom pH 8,0 bei dieser Wellenlänge analysiert. Identische Blindproben an Implantaten, die in der gleichen elektrolytischen Zelle wie die Versuchsimplantate anwesend waren, jedoch mit der Kathode nicht verbunden waren, können als Kontrolle verwendet werden. Die Versuche wurden zweimal mit einer Reihe von 16 Implantaten, jedes Mal mit 5 internen negativen Blindproben, wiederholt.
Die Menge an Ascorbinsäure, die von den Titanproben extrahiert wurde, lag nach der Berechnung im Bereich zwischen 28 und 76 μg/cm² mit einem Mittelwert von 39 μg Ascorbinsäure pro cm², ermittelt durch Vergleich mit dem Standard der Ascorbinsäure. Dieser Wert liegt gut im Bereich der Bioaktivität dieses Vitamins (die normale Konzentration in menschlichem Blutplasma liegt zwischen 8 und 15 μg/ml). Die internen Blindproben, die in der gleichen elektrolytischen Zelle wie die Versuchsimplantate anwesend waren, jedoch mit der Kathode nicht verbunden waren, zeigten nur spärliche Mengen an Ascorbinsäure, die an der Oberfläche anhaftete (< 4 μg/cm²). Dieser Versuch zeigt auf klare Weise, dass eine biologisch bedeutende Menge an Ascorbinsäure in die Schicht aus Titanhydrid während der Elektrolyse in diese eingebaut oder mit ihr verbunden sein kann.
BEISPIEL 5
Herstellung einer Schicht aus Titanhydrid auf der Oberfläche eines Implantats, welche ein synthetisches Peptid auf der Grundlage eines Wachstumsfaktors enthält
Die Arbeitsweise des Beispiels 1 kann zur Herstellung einer Schicht aus Titanhydrid, welche ein synthetisches Peptid mit dem Wachstumsfaktor 4 von Fibroblasten (FGF-4) mit der vollen Länge von 37 Aminosäuren aufweist, auf elektropolierten Titanimplantaten in Form von Münzen mit einer dem Elektrolyten ausgesetzten Oberfläche von 0,6 cm² verwendet werden. Elektrolyten, pH, Spannung, Stromdichte und Elektrolysenzeit sind vorzugsweise diejenigen des Beispiels 1. Die Anfangskonzentration an FGF-4 kann vorzugsweise 0,1 mg/ml betragen, und die Temperatur in der Kathodenkammer ist mit 50°C eine geeignete.
Nach einer Wäsche in Kochsalzlösung und dem Puffer 2×SDS-PAGE, Fällung, Zentrifugieren, erneute Auflösung in SDS-PAGE, Kochen und Elektrophorese wie in Beispiel 1, kann das Protein im Gel in eine silberhaltige Anfärbungslösung eingebracht und die synthetischen FGF-4-Peptide mit der vollen Länge als scharfe Bande im Gel beobachtet werden. Identische Blindproben-Implantate, die in die gleiche elektrolytische Zelle wie die Versuchsimplantate eingebracht werden, mit der Kathode jedoch nicht verbunden sind, können zur Kontrolle dienen.
BEISPIEL 6
Herstellung einer Oberflächenschicht aus Titanhydrid auf einem Implantat, welche ein Antibioticum enthält
Die Arbeitsweise des Beispiels 1 kann zur Herstellung einer Schicht aus Titanhydrid angewendet werden, welche das Antibioticum Amoxicillin (Aminopenicillin) auf einem elektropolierten, münzenförmigen Titanimplantat enthält, welches eine Oberflächengrösse von 0,6 cm² aufweist, die dem Elektrolyten ausgesetzt wird. In beiden Kammern ist der Elektrolyt vorzugsweise 1M NaCl in sterilem Wasser, dessen pH auf den Wert von 2 mittels HCl eingestellt wurde, und die anfängliche Konzentration an Amoxicillin betrug 5 mg/ml. Bei der Elektrolyse wurde eine Spannung von 10 Volt mit einer Stromdichte von 1 mA/cm² und eine Temperatur von 50°C in der Kathodenkammer angewendet. Die Elektrolyse kann vorzugsweise 24 Stunden durchgeführt werden, wonach das Titanimplantat aus der Elektrolysezelle entnommen, mit sterilem Wasser gespült und in einem Exsiccator getrocknet wird.
Nach dem Trocknen kann die Menge an Amoxicillin, die in der Hydridschicht auf dem Titanimplantat eingebettet ist, als antibakterielle Wirkung auf Penicillin empfindliche Bakterien der Spezies Escherichia coli (E. coli), Stamm K12, in flüssigen Kulturen bestimmt werden. Die Kulturen werden vorzugsweise mit einer Kolonie von E. coli K12 in 5 ml LB-Nährlösung inokuliert. Nach der Inokulierung werden die modifizierten Implantate und die Blindproben in die Kultur eingebracht und die Kulturen bei 37°C über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag können die Mengen an Bakterien, die in den Kulturen vorhanden sind, durch Photometrie und anschliessenden Vergleich mit einer Standardverdünnung bestimmt werden. Identische Blindproben von Implantaten, die in der gleichen elektrolytischen Zelle wie die Versuchsimplantate anwesend, mit der Kathode jedoch nicht verbunden sind, können zur Kontrolle verwendet werden.
BEISPIEL 7
Herstellung einer Titanhydridschicht auf der Oberfläche eines Implantats, welche die Biomineralisierung einleitet
Die Arbeitsweise des Beispiels 1 kann angewandt werden, um eine Titanhydridschicht zu erzeugen, welche ein synthetisches Polyprolin-Peptid enthält, das die Eigenschaft hat, als biologischer Keimbildner bei der Mineralbildung gesättigter Lösungen von Calciumphosphat zu wirken. Das Biomolekül kann in die Hydridschicht auf Oberflächen elektropolierter, münzenförmiger Titanimplantate eingebaut werden, die eine Gesamt-Oberflächengrösse von 0,6 cm² aufweisen, welche dem Elektrolyten ausgesetzt wird. Der Elektrolyt in beiden Kammern kann vorzugsweise 1M NaCl in sterilem Wasser sein, dessen pH mittels HCl auf den Wert von 2 eingestellt wurde, und die Anfangskonzentration des synthetischen Polyprolins kann vorzugsweise 0,1 mg/ml betragen. Bei der Elektrolyse kann eine Spannung von 10 Volt bei einer Stromdichte von 1 mA/cm² und mit einer Temperatur in der Kathodekammer von 70°C angewendet werden. Die Elektrolyse wird vorzugsweise 18 Stunden lang fortgeführt, wonach die Titanimplantate der Elektrolysezelle entnommen, in sterilem Wasser gewaschen und an der Luft in einem Exsiccator getrocknet werden.
Nach dem Trocknen werden die Titanimplantate und die Blindproben mit dem anhaftenden Peptid zur mineralischen Keimbildung in 5 ml gesättigte Calciumphosphatlösung gebracht. Nach Inkubation während 4 Stunden bei Zimmertemperatur entfernt man die Implantate aus der Minerallösung, spült sie in sterilem Wasser und trocknet sie in einem Exsiccator.
Nach dem Trocknen können die Implantate unmittelbar im Abtast-Elektronenmikroskop zur Bestimmung der Anzahl mineralischer Herde, die auf den modifizierten Oberflächen vorhanden sind, unterworfen werden. Identische Blindproben von Implantaten, die in der gleichen Elektrolysezelle wie die Versuchsimplantate anwesend, mit der Kathode jedoch nicht verbunden waren, können als Kontrollproben verwendet werden.
BEISPIEL 8
Herstellung einer Oberflächenschicht aus Titanhydrid auf einem Implantat, welche ein quellbares (raumfüllendes) Biomolekül enthält
Die Arbeitsweise des Beispiels 1 kann zur Herstellung einer Schicht aus Titanhydrid verwendet werden, die Nanosphären von Ca-Alginat (Pronova AS) auf elektropolierten münzenförmigen Implantaten aus Titan enthält, welche eine Gesamtfläche, die dem Elektrolyten ausgesetzt ist, von 0,6 cm² aufweisen. Der Elektrolyt in beiden Kammern ist vorzugsweise 1M CaCl₂ in sterilem Wasser, wobei das pH mittels HCl auf einen Wert von 5,5 eingestellt ist, und die Anfangskonzentration an Ca-Alginat beträgt 1% Gew./Vol. Bei der Elektrolyse kann eine Spannung von 10 Volt mit einer Stromdichte von 1 mA/cm² und einer Temperatur in der Kathodenkammer von 35°C angewendet werden. Die Elektrolyse lässt man vorzugsweise 48 Stunden lang ablaufen, wonach die Implantate aus Titan aus der Elektrolysezelle herausgenommen, in kaltem sterilem Wasser gewaschen und an der Luft in einem Exsiccator getrocknet werden.
Nach dem Trocknen werden die Implantate aus Titan, die eine Schicht aus Hydrid und Alginat aufweisen, vorzugsweise in sterile Kochsalzlösung eingetaucht, mit Bromphenolblau (0,02 g/ml) gefärbt und 1 Stunde bei 37°C inkubiert, wobei die modifizierte Oberfläche der Lösung ausgesetzt wird. Nach der Inkubierung in der gefärbten Kochsalzlösung werden die Implantate und die Blindproben mit destilliertem Wasser gespült und mit einer Lupe auf den Rückhalt von blauem Farbstoff in der gequollenen Alginatschicht untersucht. Die Dicke der Alginatschichten kann ebenfalls ermittelt werden, indem man den Rand der Implantate unter einem kalibrierten Lichtmikroskop betrachtet. Identische Blindproben von Implantaten, die in der gleich Elektrolysezelle wie die Versuchsimplantate anwesend waren, mit der Kathode jedoch nicht verbunden wurden, können als Kontrollen verwendet werden.
BEISPIEL 9
Herstellung einer Doppelschicht von Biomolekül und Titanhydrid auf der Oberfläche eines Implantats
Die Arbeitsweise des Beispiels 1 kann zur Herstellung einer Doppelschicht von Titanhydrid, welche Biomoleküle enthält, auf der Oberfläche elektropolierter münzenförmiger Implantate aus Titan angewendet werden, die eine Gesamtoberfläche von 0,6 cm² aufweisen, welche dem Elektrolyten ausgesetzt wird. Die innere Schicht kann unter Verwendung von Amelogenin als Biomolekül nach dem Verfahren gemäss Beispiel 1 erzeugt werden. Unmittelbar nach diesem Vorgang, und ohne ein Zwischentrocknen, können der Elektrolyt und die Arbeitsbedingungen zu denen des Beispiels 3 gewechselt werden, in welchem genomische menschliche DNA als Biomolekül vorhanden ist. Auf diese Art können Implantate aus Titan hergestellt werden, die eine äussere Schicht aus Titanhydrid und DNA zeigen, welche auf einer inneren Schicht aus Titanhydrid und Amelogenin aufliegt. Nach den Elektrolysen werden die Implantate aus der Elektrolysezelle herausgenom men, in sterilem Wasser gewaschen und an der Luft in einem Exsiccator trocknen gelassen.
Nach dem Trocknen der Titanproben mit den anhaftenden Nucleinsäuren und Proteinen werden diese dreimal in Tris-EDTA-Puffer (TE-Puffer; 10 mM Tris-Cl und 1 mM EDTA in sterilem Wasser) gewaschen. Bei jedem Waschvorgang wird das pH erhöht, es wird ausgehend von pH 7,4, dann bei pH 7,6 und schliesslich bei pH 8,0 gewaschen. Nach dem Spülen im Puffer TE werden schliesslich die zurückbleibende DNA und das Protein auf den Implantaten aus Titan unter Verwendung von 0,1N NaOH entfernt. Die Spülfraktionen werden dann in zwei Teile aufgeteilt; einen Teil für die Analyse auf Nucleinsäuren und der andere für die Analyse auf Protein. Die DNA-Fraktionen werden vorzugsweise mit einem gleichen Volumen von absolutem Alkohol bei –20°C eine Stunde lang behandelt und die Fällung dann aus der überstehenden Flüssigkeit durch Zentrifugieren bei 13'000 g und 4°C abgetrennt. Die Rückstandstablette wird dann in 50 μl Puffer TE bei pH 7,4 aufgelöst und die Menge an DNA aus allen vier Spüllösungen durch eine fluometrische Analyse mit einem Farbstoff der Firma Hoechst (Boehringer Mannheim) analysiert.
Die Fraktionen für die Protein-Analyse werden vorzugsweise mit einem gleichen Volumen von 0,6N Perchlorsäure versetzt und die überstehende Flüssigkeit durch Zentrifugieren geklärt. Die Tabletten aus den Fällungen, welche Salz und Proteine enthalten, löst man dann in 50 μl Puffer 2×SDS-PAGE auf (0,4 g SDS, 1,0 g 2-Mercaptoethanol, 0,02 g Bromphenolblau und 4,4 g Glyzerin in 10 ml Puffer 0,125M Tris/HCl, pH 6,8) und kocht das Ganze fünf Minuten lang. Alle Proben werden dann einer Elektrophorese auf einem 10%igen SDS-Polyacrylamidgel bei 80 mA während 4 Stunden unterworfen. Nach der Elektrophorese werden die Proteine im Gel in eine silberhaltige Anfärbungslösung gebracht und das in den Fraktionen vorhandene Amelogenin wird als deutliche Bande im Gel visuell nachgewiesen.
Identische Blindproben von Implantaten sind in der gleichen elektrolytischen Zelle wie die Versuchsimplantate vorhanden, werden aber nicht mit der Kathode verbunden; sie können als Kontrollproben dienen.
BEISPIEL 10
Herstellung einer Implantatoberfläche mit zwei Zonen einer Schicht aus Biomolekül und Titanhydrid
Die Arbeitsweise des Beispiels 1 kann zur Erzeugung zweier getrennter Zonen von Titanhydridschichten angewendet werden. Elektropolierte, stabförmige Titanimplantate mit einer Gesamtfläche von 2 cm² wurden nach dem Verfahren der Beispiele 3 und 6 behandelt. Zunächst wurden die Implantate in den Elektrolyten gemäss Beispiel 3 eingetaucht, derart, dass nur eine Hälfte jedes Implantats in den Elektrolyten ragte. Nachdem die Arbeitsweise des Beispiels 3 beendet war, wurden die Implantate umgedreht und in einen neuen Elektrolyten, der demjenigen des Beispiels 6 ähnlich war, derart eingetaucht, dass die unbehandelte Hälfte jedes Implantats sich nun im Elektrolyten befand. Die Arbeitsweise und die Reaktionsbedingungen des Beispiels 6 wurden dann ausgeführt, wonach die Titanprobe aus der Elektrolysezelle entnommen, mit sterilem Wasser gespült und in einem Exsiccator getrocknet wurde.
Nach der Elektrolyse wurden die Implantate mit zwei Zonen jeweils in der Mitte zerteilt. Die Hälften, die mit einer Schicht aus Titanhydrid und synthetischem FGF-4-Peptid versehen waren, können nach Beispiel 2 weiter behandelt und analysiert werden. Die anderen Hälften der Implantate, die eine Schicht aus Titanhydrid und Amoxicillin aufweisen, können nach dem Verfahren des Bakteriumwachstums gemäss Beispiel 5 analysiert werden. Identische Blindproben der Implantate waren in der gleichen Elektrolysezelle wie die Versuchsimplantate anwesend, aber mit der Kathode nicht verbunden. Sie können als Kontrollproben dienen.
BEISPIEL 11
Herstellung einer osteoinduktiven Oberflächenschicht mit Titanhydrid auf einem Implantat, welche ein Biomolekül enthält
Nach dem Beispiel 1 erhaltene Implantate (Titanhydrid und Amelogenin) werden in kalibrierte Knochendefekte des Schienbeinknochens von Kaninchen eingebracht, wobei Fensterdurchbrüche im Knochenmark unterhalb der Implantate eine Migration knochenerzeugender Zellen zu den modifizierten Implantatoberflächen möglich machen und wobei ein normalisiertes und akzeptiertes Modell verwendet wurde (Rønold and Ellingsen, European Society for Biomaterials Conference, Amsterdam, Oktober 2000). Am Tag nach dem chirurgischen Eingriff und jede folgende Woche erhalten die Kaninchen eine intravenöse Calciuminjektion (Sigma) von 10 mg/kg Körpergewicht. Vier Wochen nach Einbringen der modifizierten Implantate und Kontrollimplantate werden die Kaninchen geopfert und das Schienbein entfernt, in 4% Formaldehyd fixiert und zur Herstellung von Schliffquerschnitten im Knochen und dem integrierten Implantatmaterial eingebettet. Identische Blindproben von Implantaten in der gleichen Elektrolysezelle wie die Versuchsimplantate, die aber nicht mit der Kathode verbunden waren, können zur Kontrolle dienen.

Claims

Medizinische prosthetische Vorrichtung oder medizinisches Implantat, enthaltend ein metallisches Material (A) ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Titan oder einer seiner Legierungen, Zirkonium oder einer seiner Legierungen, Tantal oder einer seiner Legierungen, Hafnium oder einer seiner Legierungen, Niobium oder einer seiner Legierungen und einer Chrom-Vanadium-Legierung, wobei Oberflächenbereiche des metallischen Materials (A) mit einer Schicht eines entsprechenden Hydridmaterials (B), ausgewählt aus Titanhydrid, Zirkoniumhydrid, Tantalhydrid, Hafniumhydrid, Niobiumhydrid sowie Chrom- und/oder Vanadiumhydrid, versehen sind, dadurch gekennzeichnet, dass die Schicht des Hydridmaterials (B) eine oder mehrere Biomolekül-Substanzen (C) als Begleitsubstanz aufweist.
Vorrichtung oder Implantat nach Anspruch 1, worin das metallische Material (A) Titan oder eine seiner Legierungen ist, bevorzugt jedoch Titan.
Vorrichtung oder Implantat nach Anspruch 1 oder 2, worin die Biomolekül-Substanz (C) aus den folgenden Arten von Substanzen ausgewählt ist: Natürliche oder rekombinante Bioadhäsive; natürliche oder rekombinante Zellbindungsfaktoren; natürliche, rekombinante oder synthetische Biopolymere; natürliche oder rekombinante Blutproteine; natürliche oder rekombinante Enzyme; natürliche oder rekombinante extrazelluläre Matrix-Biomoleküle; natürliche oder rekombinante Wachstumsfaktoren und -hormone; natürliche, rekombinante oder synthetische Peptidhormone; natürliche, rekombi nante oder synthetische Desoxyribonucleinsäuren; natürliche, rekombinante oder synthetische Ribonucleinsäuren; natürliche oder rekombinante Rezeptoren; Enzyminhibitoren; Medikamente; biologisch aktive Anionen und Kationen; Vitamine; Adenosinmonophosphat (AMP); Adenosindiphosphat (ADP) oder Adenosintriphosphat (ATP); Markier-Biomoleküle; Aminosäuren; Fettsäuren; Nukleotide (RNA- und DNA-Basen); Zucker.
Vorrichtung oder Implantat nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die Biomolekül-Substanz (C) an der Oberfläche des Hydridmaterials (B) liegt oder in diesem eingeschlossen ist.
Vorrichtung oder Implantat nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die Biomolekül-Substanz bzw. die Biomolekül-Substanzen (C) das Hydridmaterial (B) in einer Menge von 1 Picogramm pro mm² bis 1 mg pro mm², vorzugsweise von 0,1 Nanogramm bis 100 Mikrogramm pro mm², begleitet bzw. begleiten.
Vorrichtung oder Implantat nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die Biomolekül-Substanz bzw. Substanzen (C) auf den Oberflächen anwesend sind, die in Berührung mit Knochengewebe oder anderem Gewebe stehen, wenn die Vorrichtung in den Körper eines Säugetieres eingebracht wird.
Vorrichtung oder Implantat nach einem der vorstehenden Ansprüche, welche bzw. welches die Anatomie ersetzt oder eine Körperfunktion wiederherstellt, beispielsweise ein Hüftgelenk; den Oberschenkelkopf; die Hüftgelenkpfanne; den Ellbogen einschliesslich Knochenschaft, Keile, Gelenkeinsätze; das Knie einschliesslich der Schenkelknochen- und Schienbeinteile, Knochenschäfte, Keile, Gelenkeinsätze oder Kniescheibenteile; Schultern einschliesslich Schaft und Kopf; Handgelenk; Knöchel; Hand; Finger; Zehen; Rückgratwirbel; Bandscheiben; künstliche Gelenke; Zahnimplantate; Ossikuloplastik-Implantate; Mittelohrimplantate einschliesslich Amboss, Hammer, Steigbügel, Amboss-Steigbügel, Hammer-Amboss, Hammer-Amboss-Steigbügel; Schnecken-Implantate; Orthopädie-Fixationsvorrichtungen wie Nägel, Schrauben, Klammern und Platten; Herzklappen; Schrittmacher; Katheter; Gefässe; Raumfüll-Implantate; Implantate zur Halterung von Hörhilfen; Implantate zur externen Fixation; Intra-uterin-Vorrichtungen (IUDs); und bioelektronische Vorrichtungen wie elektronische Vorrichtungen im Innenohr und im Schädelinneren.
Verfahren zur Herstellung einer medizinischen prosthetischen Vorrichtung oder eines medizinischen Implantats nach einem der Ansprüche 1 bis 7, das darin besteht, dass Oberflächenbereiche des metallischen Materials (A) einer Elektrolysebehandlung unterworfen werden, um eine Schicht eines Hydridmaterials zu bilden, wobei die genannte Elektrolysebehandlung in Gegenwart einer oder mehrerer Biomolekül-Substanzen (C) ausgeführt wird.