ES2223965T3

ES2223965T3 - Protesis e implantes medicos revestidos con hidruros metalicos y biomoleculas que tienen biocompatibilidad mejorada.

Info

Publication number: ES2223965T3
Application number: ES01999228T
Authority: ES
Inventors: Staale Petter Lyngstadaas; Jan Eirik Ellingsen
Original assignee: Astra Tech AB
Current assignee: Astra Tech AB
Priority date: 2000-12-06
Filing date: 2001-12-05
Publication date: 2005-03-01
Anticipated expiration: 2021-12-05
Also published as: CN1227039C; CA2431211A1; BRPI0115849B8; DE60104560D1; JP2004515276A; WO2002045764A1; EP1339437B1; EP1339437A1; AU2002220955B2; BR0115849B1; BR0115849A; CN1479635A; CA2431211C; JP5068918B2; AU2095502A; JP2009195731A; DE60104560T2; ATE271887T1

Abstract

Una prótesis o implante protésico médico que contiene un material (A) metálico seleccionado del grupo que consta de titanio o una de sus aleaciones, circonio o una de sus aleaciones, tántalo o una de sus aleaciones, hafnio o una de sus aleaciones, niobio o una de sus aleaciones y de una aleación de cromovanadio, en la que las partes superficiales del material (A) metálico están recubiertas con una capa de un material (B) del hidruro correspondiente seleccionado de hidruro de titanio, hidruro de circonio, hidruro de tántalo, hidruro de hafnio, hidruro de niobio e hidruro de cromo y/o vanadio, respectivamente, caracterizado porque la capa de material (B) de hidruro comprende una o más sustancias (C) biomoleculares asociadas a ésta.

Description

Prótesis e implantes médicos revestidos con hidruros metálicos y biomoléculas que tienen biocompatibilidad mejorada.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a prótesis y a implantes médicos con biocompatibilidad mejorada.

Antecedentes de la invención

Se ha propuesto mejorar la biocompatibilidad, p. ej. de una prótesis de titanio mediante superficies metálicas de recubrimiento de la misma con una capa de hidruro de titanio, p. ej., por bombardeo de plasma o por electrolisis.

Se ha propuesto también mejorar la biocompatibilidad de las prótesis o implantes uniendo o integrando varias biomoléculas activas a la superficie de la prótesis, p. ej., sobre la superficie metálica de una prótesis de titanio. Éste ha sido el objetivo con implantes preparados de este modo que han mejorado la adaptación; presentan un aumento de la adherencia del tejido y un aumento de la compatibilidad con el tejido; poseen una superficie biológicamente activa para el aumento del crecimiento, de la diferenciación y de la maduración celular; presentan una inmunorreactividad reducida; presentan actividad antimicrobiana; presentan un aumento de las capacidades de biomineralización; producen una mejor cicatrización de la herida y/o del hueso; conducen a mejorar la densidad del hueso; poseen un "tiempo de sobrecarga" reducido y producen menos inflamación.

Se ha propuesto con frecuencia realizar dicha unión utilizando por ejemplo reactivos químicos con dos funcionalidades reactivas tales como formalina o glutaraldehído, pero la naturaleza reactiva de estos agentes conduce con frecuencia a que las biomoléculas se vuelvan biológicamente inactivas y/o con aumento de inmunorreactividad, lo que no es deseable.

Compendio de la invención

Se ha descubierto ahora sorprendentemente que es posible enclavar, unir, ocluir y/o integrar una amplia variedad de biomoléculas en o con una capa de hidruro durante el proceso inorgánico de formación de dicha capa de hidruro sobre metales por electrolisis. Antes de esta observación se consideraba muy difícil unir y estabilizar biomoléculas bioactivas, no modificadas sobre metales, para su utilización especialmente como superficies bioactivas sobre metales para su utilización como implantes en el cuerpo del vertebrado in vivo.

La invención se refiere por consiguiente a una prótesis o a un implante médico que contiene un material (A) metálico seleccionado del grupo que consta de titanio o una de sus aleaciones, circonio o una de sus aleaciones, tántalo o una de sus aleaciones, hafnio o una de sus aleaciones, niobio o una de sus aleaciones y de una aleación de cromo-vanadio, en la que las partes superficiales del material (A) metálico están recubiertas con una capa de un material (B) del hidruro correspondiente seleccionado de hidruro de titanio, hidruro de circonio, hidruro de tántalo, hidruro de hafnio, hidruro de niobio e hidruro de cromo y/o vanadio, respectivamente, caracterizado porque la capa de material (B) de hidruro comprende una o más sustancias (C) biomoleculares asociadas a ésta.

La invención se refiere además a un método para preparar una prótesis o implante médico como se definió anteriormente, comprendiendo dicho método someter las partes superficiales del material (A) metálico definido anteriormente a un tratamiento de electrolisis para formar la capa de material (B) de hidruro, realizándose dicho tratamiento de electrolisis en presencia de una o más sustancias (C) biomoleculares.

Descripción detallada de la invención

En el presente contexto, la frase "prótesis e implante médico" incluye en su alcance cualquier producto destinado a ser implantado en el cuerpo de un animal vertebrado, en particular un mamífero tal como un ser humano. Ejemplos no limitativos de dichas prótesis son las prótesis médicas que reemplazan la anatomía o restablecen una función del cuerpo tal como la articulación femoral de la cadera; la apófisis femoral; el cotilo; el codo incluyendo hipófisis, diáfasis, las inserciones articulares; la rodilla, incluyendo los componentes femorales y tibiales, hipófisis, diáfasis, las inserciones articulares o los componentes rotulianos; omoplatos incluyendo hipófisis y diáfisis; la muñeca; los tobillos; la mano; los dedos de las manos; los dedos de los pies; las vértebras; los discos vertebrales; las articulaciones artificiales; los implantes dentales; los implantes plásticos de huesos pequeños; los implantes en el oído medio incluyendo el yunque, el martillo, el estribo, yunque-estribo, martillo-yunque, martillo-yunque-estribo, los implantes cocleares; los aparatos ortopédicos de fijación tales como clavos, tornillos, grapas y placas; las válvulas cardíacas; marcapasos; catéteres; recipientes; implantes de relleno de espacio; implantes para retención de audífonos; implantes para fijación externa; y también dispositivos intrauterinos (DIU); y dispositivos bioelectrónicos tales como los dispositivos electrónicos intracocleares o intracraneales.

En el presente contexto, el término "biomolécula" se destina a cubrir y comprender dentro de su significado una variedad muy amplia de moléculas biológicamente activas en el sentido más amplio de la palabra, sean biomoléculas naturales (es decir, moléculas naturales procedentes de fuentes naturales), moléculas sintéticas (es decir, moléculas naturales preparadas por síntesis, así como moléculas o formas de moléculas no naturales preparadas por síntesis) o biomoléculas recombinantes (es decir, preparadas mediante la utilización de técnicas recombinantes).

A continuación se da una lista no limitativa de grupos y especies principales de biomoléculas que se contemplan por ser adecuadas para la incorporación en una capa de hidruro metálico (de modo estable y/o fisiológicamente reversible) según la invención.

Biomoléculas extraídas Bioadhesivos

Éstas son biomoléculas que intervienen en la unión de las células, tejido, órganos u organismos en superficies no biológicas como vidrio, roca, etc. Este grupo de biomoléculas incluye las proteínas adherentes del mejillón marino, las proteínas de tipo fibrina, las proteínas de la telaraña, los adhesivos procedentes de plantas (resinas), los adhesivos extraídos de animales marinos y los adhesivos procedentes de insectos (como las resilinas). Algunos ejemplos específicos de adhesivos son:

Fibrina; fibroína; proteína del viso de Mytilus edulis (mefp1, "proteína adherente del mejillón"); otras proteínas adherentes del mejillón; proteínas y péptidos con bloques ricos en glicina; proteínas y péptidos con bloques de poli-alanina; y sedas.

Factores de unión de las células

Los factores de unión de las células son biomoléculas que intervienen en la unión y en la propagación de las células en las superficies biológicas o de otras células y tejidos. Este grupo de moléculas contiene normalmente moléculas que participan activamente en la interacción célula-matriz y célula-célula durante el desarrollo, neogénesis, regeneración y reparación del vertebrado. Biomoléculas típicas de esta clase son moléculas en la superficie externa de las células como la clase CD de receptores en los glóbulos blancos, immunoglobulinas y proteínas hemoaglutinantes y moléculas/ligandos de la matriz extracelular que se adhieren a dichas moléculas celulares. Ejemplos típicos de factores de la unión celular con potencial para su utilización como recubrimiento bioactivo en los implantes recubiertos de hidruro metálico son: anquirinas; caderinas (moléculas adhesivas dependientes del calcio); conexinas; sulfato de dermatán; entactina; fibrina; fibronectina; glicolípidos; glicoforina; glicoproteínas; sulfato de heparán; sulfato de heparina; ácido hialurónico; inmunoglobulinas; sulfato de queratán, integrinas; lamininas; N-CAM (moléculas adherentes independientes del calcio); proteoglucanos; espectrina; vinculina y vitronectina.

Biopolímeros

Los biopolímeros son cualquier molécula preparada biológicamente que, dadas las condiciones apropiadas, se pueden montar en estructuras macromoleculares, poliméricas. Dichas moléculas constituyen partes importantes de la matriz extracelular en la que participan proporcionando resiliencia, resistencia, rigidez, integridad, etc. del tejido. Algunos biopolímeros importantes con potencial para su utilización como recubrimiento bioactivo en implantes recubiertos por hidruro metálico son: alginatos; amelogeninas; celulosa; chitosán; colágeno; gelatinas; oligosacáridos y pectina.

Proteínas de la sangre

Esta clase de proteínas contiene normalmente cualquier proteína disuelta o agregada que normalmente está presente en la sangre completa. Dichas proteínas pueden participar en un amplio intervalo de procesos biológicos como la inflamación, guiado de células, coagulación, señalización de células, defensa, reacciones inmunitarias, metabolismo, etc. Ejemplos típicos con potencial para su utilización como recubrimiento bioactivo en los implantes recubiertos por hidruro metálico son: albúmina; albumen; citocinas; factor IX; factor V; factor VII; factor VIII; factor X; factor XI; factor XII; factor XIII; hemoglobinas (con o sin hierro); inmunoglobulinas (anticuerpos); fibrina; factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF); plasminógeno; trombospondina y transferrina.

Enzimas

Las enzimas son cualquier proteína o péptido que tenga un efecto catalítico específico en uno o más substratos biológicos que pueden ser prácticamente cualesquiera de los azúcares sencillos que acomplejan macromoléculas como ADN. Los enzimas son potencialmente útiles para desencadenar respuestas biológicas en el tejido por degradación de moléculas de la matriz, o se podrían utilizar para activar o liberar otros compuestos bioactivos en el recubrimiento del implante. Algunos ejemplos importantes con potencial para su utilización como recubrimiento bioactivo en los implantes recubiertos de hidruro metálico son: abzimas (anticuerpos con capacidad enzimática); adenilatociclasa; fosfatasa alcalina; carboxilasas; colagenasas; ciclooxigenasa; hidrolasas; isomerasas; ligasas; liasas; metaloproteasas de la matriz (MMP); nucleasas; oxidorreductasas; peptidasas; peptidohidrolasa; peptidil-transferasa; fosfolipasa; proteasas; sucrasa-isomaltasa; TIMP y transferasas.

Proteínas y biomoléculas de la matriz extracelular

Células especializadas, p. ej. fibroblastos y osteoblastos, producen la matriz extracelular. Esta matriz participa en varios procesos importantes. La matriz es crucial, entre otros, para la cicatrización de la herida, la homeostasis del tejido, el desarrollo y la restauración, la resistencia del tejido y la integridad del tejido. La matriz también decide el medio extracelular como pH, fuerza iónica, osmolaridad, etc. Además las moléculas de la matriz extracelular son cruciales para la inducción y el control de la formación biomineral (hueso, cartílago, dientes). Importantes proteínas y biomoléculas extracelulares con potencial para su utilización como recubrimiento bioactivo en implantes recubiertos de hidruro metálico incluyen: ameloblastina; amelina; amelogeninas; colágenos (I a XII); dentina-sialo-proteína (DSP); dentina-sialo-fosfo-proteína (DSPP); elastinas; enamelina; fibrinas; fibronectinas; queratinas (1 a 20); lamininas; tuftelina; carbohidratos; sulfato de condroitina; sulfato de heparán; sulfato de heparina; ácido hialurónico, lípidos y ácidos grasos; lipopolisacáridos.

Factores de crecimiento y hormonas

Los factores de crecimiento y las hormonas son moléculas que se unen a las estructuras de la superficie celular (receptores) y generan una señal en la célula diana para iniciar un proceso biológico específico. Ejemplos de dichos procesos son el crecimiento, la muerte celular programada, la liberación de otras moléculas (p. ej. las moléculas de la matriz extracelular o el azúcar), la diferenciación celular y la maduración, la regulación del ritmo metabólico, etc. Ejemplos típicos de dichas biomoléculas con potencial para su utilización como recubrimiento bioactivo en los implantes recubiertos de hidruro metálico son: activinas (Act); anfirregulina (AR); angiopoyetinas (Ang 1 a 4); Apo3 (inductor débil de apóptosis también conocido como TWEAK, DR3, WSL-1, TRAMP o LARD); Betacelulina (BTC); Factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF, FGF-b); Factor de crecimiento ácido de fibroblastos (aFGF, FGF-a); Ligando 4-1BB; Factor neurótrofo procedente del cerebro (BDNF); Boloquina procedente del pecho y del riñón (BRAK); Proteínas morfógenas óseas (BMP); Quimiocina 1 que atrae linfocitos B quimioatrayentes/linfocitos B (BLC/BCA-1); CD27L (ligando CD27); CD30L (ligando CD30); CD40L (ligando CD40); Ligando inductor de proliferación (APRIL); Cardiotrofina-1 (CT-1); Factor neurótrofo ciliar (CNTF); Factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF); citocinas; 6-cisteína quimiocina (6Ckine); factores de crecimiento epidérmicos (EGF); Eotaxina (Eot); proteína 78 activadora neutrófila procedente de las células epiteliales (ENA-78); eritropoyetina (Epo); factores de crecimiento de fibroblastos (FGF 3 a 19); Fractalcina; factores neutrópos derivados del glial (GDNF); ligando receptor de TNF inducido por glucocorticoides (GITRL); factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF); factor estimulante de colonia de granulocitos macrófagos (GM-CSF); proteínas quimiotácticas de granulocitos (GCP); hormona del crecimiento (GH); I-309; oncógeno relacionado con el crecimiento (GRO); inhibinas (Inh); linfocito T alfa quimioatrayente inducible por interferón (I-TAC); ligando Fas (FasL); heregulinas (HRG); factor de crecimiento de tipo factor de crecimiento epidérmico que se une a la heparina (HB-EFG); ligando de tirosina cinasa 3 de tipo fms (Flt-3L); quimiocinas de hemofiltrado CC (HCC-1 a 4); factor de crecimiento de hepatocitos (HGF); insulina; factores de crecimiento de tipo insulina (IGF 1 a 2); proteína 10 inducible por interferón gamma (IP-10); interleucinas (IL 1 a 18); interferón gamma (INF-gamma); factor de crecimiento de queratinocitos (KGF); factor 2 de crecimiento de queratinocitos (FGF-10); leptina (OB); factor inhibidor de la leucemia (LIF); Linfotoxina beta (LT-B); Linfotactina (LTN); factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CFS); quimiocina procedente de macrófagos (MDC); proteína estimulante de macrófagos (MSP); proteínas inflamatorias de macrófagos (MIP); Midcina (MK); proteínas quimioatrayentes de monocitos (MCP-1 a 4); monocina inducida por IFN-gamma (MIG); MSX 1; MSX 2; sustancia inhibidora de Müller (MIS); factor 1 inhibidor progenitor mieloide (MPIF-1); factor de crecimiento de nervios (NGF); neurotrofinas (NT); péptido 2 activador neutrófilo (NAP-2); Oncostatina M (OSM); Osteocalcina; OP-1; Osteopontina; ligando OX40; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF aa, ab y bb); factor 4 de plaquetas (PF4); pleyotrofina (PTN); quimiocina pulmonar y regulada por activación (PARC); linfocitos T normales, regulados en activación, expresados y segregados (RANTES); factor procedente de neuronas sensitivas y motrices (SMDF); miembro 26 de la subfamilia A de citocinas inducibles pequeñas (SCYA26); factor de células madre (SCF); factor 1 procedente de las células del estroma (SDF-1); quimiocina del timo y regulada por activación (TARC); quimiocina expresada en el timo (TECK); ligando 1 expresado en leucocitos relacionados con ApoL y TNF (TALL-1); ligando inductor de apoptosis relacionada con TNF (TRAIL); citocina inducida por activación relacionada con TNF (TRANCE); expresión inducible por linfotoxina y en competencia con glucoproteína D de HSV para el receptor de linfocitos T de HVEM (LIGHT); factor de crecimiento de la placenta (PIGF); Trombopoyetina (Tpo); factores de crecimiento transformantes (TGF alfa, TGF beta 1, TGF beta 2); factores de necrosis tumoral (TNF alfa y beta); factores de crecimiento vascular endotelial (VEGF-A,B,C y D); calcitoninas y compuestos esteroideos tales como las hormonas sexuales naturales como por ejemplo estrógeno, progesterona, testosterona, así como sus análogos. Por lo tanto, se podrían contemplar determinados implantes tales como los IUD (dispositivos intrauterinos) que comprenden p. ej., estrógenos o progesterona o sus análogos.

Ácidos nucleicos (ADN)

El ADN codifica los genes para las proteínas y péptidos. Asimismo, el ADN contiene un amplio conjunto de secuencias que regulan la expresión de los genes contenidos. Existen varios tipos de ADN, dependiendo de la procedencia, función, origen y estructura. Ejemplos típicos de moléculas basadas en ADN que se pueden utilizar como recubrimientos de liberación lenta, bioactivos en implantes (terapia génica local) son: A-ADN; B-ADN; cromosomas artificiales que llevan ADN de mamíferos (YAC); ADN cromosómico; ADN circular; cósmidos que llevan ADN de mamífero; ADN; ADN de doble cadena (ADNds); ADN genómico; ADN semi-metilado; ADN lineal; ADNc de mamífero (ADN complementario; ADN copia de ARN); ADN de mamífero; ADN metilado; ADN mitocondrial; fagos que llevan ADN de mamífero; fagómidos que llevan ADN de mamífero; plásmidos que llevan ADN de mamífero; plástidos que llevan ADN de mamífero; ADN recombinante; fragmentos de restricción de ADN de mamífero; retroposones que llevan ADN de mamífero; ADN de una sola cadena (ADNss); transposones que llevan ADN de mamífero; T-ADN; virus que llevan ADN de mamífero; Z-ADN.

Ácidos nucleicos (ARN)

El ARN es una transcripción de la información codificada por el ADN. (A veces (en algunos virus) el ARN es la unidad que codifica la información esencial). Además de ser un intermediario de la expresión de los genes, el ARN ha demostrado tener varias funciones biológicas. Los ribozimas son moléculas de ARN sencillas con acción catalítica. Estos ARN pueden catalizar la escisión y la unión del ADN y del ARN, hidrolizar péptidos y son el núcleo de la traducción del ARN en los péptidos (el ribosoma es un ribozima). Ejemplos típicos de moléculas de ARN con potencial para su utilización como recubrimiento bioactivo en implantes recubiertos con hidruro metálico son: ARN de transferencia acetilado (ARNt activado, ARNt con carga); ARN circular; ARN lineal; ARN nuclear heterogéneo de mamífero (ARNhn), ARN mensajero de mamífero (ARNm); ARN de mamífero; ARN ribosómico de mamífero (ARNr); ARN de transferencia de mamífero (ARNt); ARNm; ARN poliadenilado; ARN ribosómico (ARNr); ARN recombinante; retroposones que llevan ARN de mamífero; ribozimas; ARN de transferencia (ARNt); virus que llevan ARN de mamífero.

Receptores

Los receptores son biomoléculas de la superficie celular que unen señales (p. ej. ligandos de hormonas y factores de crecimiento) y transmiten la señal sobre la membrana celular y en el sistema interno de las células. Diferentes receptores se "conectan" de forma diferente imponiendo diferentes respuestas intracelulares incluso al mismo ligando. Esto hace posible que las células reaccionen de forma diferente a las señales externas variando la configuración de los receptores en su superficie. Los receptores se unen normalmente a su ligando de forma reversible, haciéndoles adecuados como vehículos de factores de crecimiento que son para liberarse en el tejido. De este modo al recubrir implantes con receptores de factor de crecimiento y a continuación cargar estos receptores con sus ligandos principales, se consigue una superficie bioactiva que se puede utilizar para la liberación controlada de los factores de crecimiento en los tejidos circundantes después de la implantación. Ejemplos de receptores adecuados con potencial para su utilización como recubrimiento bioactivo en los implantes recubiertos con hidruro metálico incluyen: La clase CD de receptores CD; receptores de EFG; receptores de FGF; receptor de fibronectina (VLA-5); receptor del factor de crecimiento, proteínas de unión a IGF (IGFBP 1 a 4); integrinas (incluyendo VLA 1-4); receptor de laminina; receptor de PDGF; receptores alfa y beta del factor de crecimiento transformante; receptores de BMP; Fas; receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (Flt-1); receptor de vitronectina.

Biomoléculas sintéticas

Las biomoléculas sintéticas son moléculas que se basan en (simular) biomoléculas naturales. Sintetizando dichas moléculas se puede introducir un amplio conjunto de modificación química y estructural que puede estabilizar la molécula o hacerla más bioactiva o específica. De este modo si una molécula es demasiado inestable o no específica para ser utilizada a partir de extractos es posible modificarlas genéticamente y sintetizarlas para su utilización como recubrimientos de la superficie del implante. Además, muchas biomoléculas son tan poco abundantes que la extracción a escalas industriales es imposible. Dichas biomoléculas raras se han de preparar por síntesis, p. ej. mediante tecnología recombinante o por (bio-) química. A continuación se relacionan varias clases de moléculas sintéticas que pueden ser potencialmente útiles para implantar recubrimientos:

ADN sintético

A-ADN; ADN de cadena complementaria; B-ADN; ADN complementario (ADNc); ADN modificado químicamente; ADN estabilizado químicamente; ADN; análogos de ADN; oligómeros de ADN; polímeros de ADN; híbridos de ADN-ARN; ADN de doble cadena (ADNds); ADN semimetilado; ADN metilado; ADN de una sola cadena (ADNss); ADN recombinante; ADN de triple cadena; T-ADN; Z-ADN.

ARN sintético

ARN de cadena complementaria; ARN modificado químicamente; ARN estabilizado químicamente; ARN nuclear heterogéneo (ARNhn); ARN mensajero (ARNm); ribozimas; ARN; análogos de ARN; híbridos de ARN-ADN; oligómeros de ARN; polímeros de ARN; ARN ribosómico (ARNr); ARN de transferencia (ARNt).

Biopolímeros sintéticos

Liposomas catiónicos y aniónicos; acetato de celulosa; ácido hialurónico; ácido poliláctico; alginato de poliglicol; ácido poliglicólico; poliprolinas y polisacáridos.

Péptidos sintéticos

Decapéptidos que contienen DOPA y/o diDOPA; péptidos con la secuencia "Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys"; péptidos en los que Pro está sustituido con hidroxiprolina; péptidos en los que uno o más Pro está sustituido con DOPA; péptidos en los que uno o más Pro está sustituido con diDOPA; péptidos en los que uno o más Tyr está sustituido con DOPA; hormonas de péptido; secuencias de péptido basadas en las proteínas extraídas relacionadas anteriormente; péptidos que contienen un motivo (Arg Gly Asp) de RGD.

Proteínas recombinantes

Todos los péptidos y proteínas preparados de forma recombinante.

Inhibidores sintéticos de enzima

Los inhibidores sintéticos de enzimas varían desde moléculas sencillas, como determinados iones metálicos, que bloquean la actividad enzimática uniéndose directamente al enzima, hasta moléculas sintéticas que simulan el sustrato natural de un enzima y de este modo compiten con el sustrato principal. Un recubrimiento del implante que incluye inhibidores enzimáticos podría ayudar a estabilizar y contrarrestar la destrucción de otras biomoléculas presentes en el recubrimiento, de modo que se consiga más tiempo de reacción y/o mayor concentración del compuesto bioactivo. Ejemplos de inhibidores enzimáticos son: Pepstatina; poli-prolinas; D-azúcares; D-aminoácidos; cianuro; fluorofosfatos de isopropilo (DFP); iones metálicos; N-tosil-I-fenilalaninaclorometil cetona (TPCK); Fisostigmina; Paratión; Penicilina.

Vitaminas (sintéticas o extraídas) para la incorporación en el hidruro

Biotina; calciferol (vitaminas D; vitales para una buena mineralización); citrina; ácido fólico; niacina; nicotinamida; dinucleótido de nicotinamida adenina (NAD, NAD+); fosfato del dinucleótido de nicotinamida adenina (NADP, NADPH); ácido retinoico (vitamina A); riboflavina; vitaminas B; vitamina C (vital para la síntesis del colágeno); vitamina E; vitamina K.

Otras moléculas bioactivas para la incorporación en el hidruro

Difosfato de adenosina (ADP); monofosfato de adenosina (AMP); trifosfato de adenosina (ATP); aminoácidos; AMP cíclico (AMPc); 3,4-dihidroxifenilalanina (DOPA); 5'-di(dihidroxifenil-L-alanina (diDOPA); diDOPA quinona; o-difenoles de tipo DOPA; ácidos grasos; glucosa; hidroxiprolina; nucleósidos; nucleótidos (bases de ARN y de ADN); prostaglandina; azúcares; 1-fosfato de esfingosina; rapamicina; hormonas sexuales sintéticas tales como análogos de estrógeno, progesterona o testosterona, p. ej Tamoxifeno; moduladores del receptor del estrógeno (SERM) tal como Raloxifeno; bis-fosfonatos tales como alendronato, risendronato y etidronato; estatinas tales como cerivastatina, lovastatina, simvastatina, pravastatina, fluvastatina, atorvastatina y 3,5-dihidroxi-7-[3-(4-fluorofenil)-1-(metiletil)-1H-indol-2-il]- hept-6-enoato de sodio.

Fármacos para la incorporación en los recubrimientos de hidruro

Los fármacos incorporados en la capa de hidruro se podrían utilizar para efectos locales como mejorar la resistencia local frente a la invasión de microbios, el control del dolor local, la inhibición local de la síntesis de prostaglandina, la regulación de la inflamación local, la inducción local de la biomineralización y la estimulación local del crecimiento del tejido. Ejemplos de fármacos adecuados para la incorporación en las capas de hidruro metálico incluyen: antibióticos; inhibidores de ciclooxigenasa; hormonas; inhibidores de inflamación; NSAID; analgésicos; inhibidores de la síntesis de prostaglandina; esteroides; tetraciclina (también como agente de biomineralización).

Iones biológicamente activos para la incorporación en recubrimientos de hidruro

Los iones son importantes en diversos mecanismos biológicos. Al incorporar iones biológicamente activos en las capas de hidruro metálico en los implantes es posible estimular localmente los procesos biológicos como la función enzimática, el bloqueo enzimático, la absorción celular de biomoléculas, el direccionamiento de células específicas, la biomineralización, la apoptosis, la secreción celular de biomoléculas, el metabolismo celular y la defensa celular. Ejemplos de iones bioactivos para incorporación en el hidruro metálico incluyen: calcio; cromo; cobre; fluoruro; oro; yoduro; hierro; potasio; magnesio; manganeso; selenio; plata; sodio y cinc.

Biomoléculas marcadoras

Los marcadores biológicos son moléculas que generan una señal detectable, p. ej. emitiendo luz, actividad enzimática, radioactividad, color específico, magnetismo, densidad de rayos-x, estructura específica, antigenicidad, etc., que se puede detectar mediante instrumentos específicos, por microscopía, por un método detector de imagen como rayos-x o por resonancia magnética. Los marcadores se utilizan para controlar procesos biológicos en la investigación y desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento biomédico. En implantes, dichos marcadores se emplearían de forma típica para controlar procesos como la biocompatibilidad, formación del tejido, neogénesis del tejido, biomineralización, inflamación, infección, regeneración, restauración, homeostasis del tejido, destrucción del tejido, renovación del tejido, liberación de biomoléculas de la superficie del implante, bioactividad de las biomoléculas liberadas, absorción y expresión de los ácidos nucleicos liberados de la superficie del implante y capacidad antibiótica de la superficie del implante para proporcionar validación de "la prueba del principio", del efecto, de la eficacia y de la seguridad antes de los estudios clínicos.

Las biomoléculas marcadoras adecuadas para su incorporación en los recubrimientos de hidruro incluyen:

Calceína; alizarán; ed; tetraciclinas; fluorescinas; fura; luciferasa; fosfatasa alcalina; aminoácidos radiomarcados (p. ej. marcados con ^{32}P, ^{33}P, ^{3}H, ^{35}S, ^{14}C, ^{125}I, ^{51}Cr, ^{45}Ca); nucleótidos radiomarcados (p. ej. marcados con ^{32}P, ^{33}P, ^{3}H, ^{35}S, ^{14}C); péptidos y proteínas radiomarcados; ADN y ARN radiomarcados; complejos inmuno-oro (partículas de oro con anticuerpos unidos); complejos inmuno-plata; complejos inmuno-magnetita; proteína verde fluorescente (GFP); proteína roja fluorescente (E5); proteínas y péptidos biotinilados; ácidos nucleicos biotinilados; anticuerpos biotinilados; conectadores al carbono biotinilados; genes indicadores (cualquier gen que genere una señal cuando se expresa); yoduro de propidio; diamidino amarillo.

El dispositivo o implante según la invención se puede utilizar para numerosos fines. Ejemplos de dichos fines incluyen la utilización para: inducir localmente la formación del tejido duro (p. ej. tejido óseo) en el punto de implantación; controlar el crecimiento y/o la invasión microbiana en el punto de la implantación o de forma generalizada; reducir la inflamación en el punto de la implantación o de forma generalizada; estimular la restauración, regeneración o formación del ligamento; inducir la formación del cartílago; crear núcleos, controlar y/o crear plantillas de biomineralización; mejorar la unión entre implantes y tejidos; mejorar la integración ósea de los implantes; mejorar la adherencia del tejido a un implante; impedir la adherencia del tejido a un implante (semipermanente o temporal); mejorar el contacto entre tejidos o tejidos e implantes; mejorar el cierre del tejido de una herida (quirúrgica); inducir la apoptosis (muerte celular) en las células indeseables (p. ej. células cancerosas); inducir la diferenciación y/o maduración celular específica, aumentando la resistencia a la tensión del tejido; mejorar la cicatrización de la herida; acelerar la cicatrización de la herida; modelar la formación del tejido; guiar la formación del tejido; terapia génica local; estimular el crecimiento del nervio; mejorar la vascularización en los tejidos adyacentes a un implante; estimular la síntesis de la matriz extracelular local; inhibir la destrucción de la matriz extracelular local; inducir la liberación del factor de crecimiento local; aumentar localmente el metabolismo del tejido; mejorar la función de un tejido o de una parte del cuerpo; reducir el dolor y las molestias localmente. El objetivo dependerá del tipo de implante así como de la naturaleza y/o de la concentración de la biomolécula presente en la capa de hidruro en el implante.

Cuando el material (A) metálico es una aleación de titanio, circonio, tántalo, hafnio o niobio, puede ser una aleación entre uno o más de estos elementos metálicos; o puede ser una aleación que contenga uno u otros más metales tales como aluminio, vanadio, cromo, cobalto, magnesio, hierro, oro, plata, cobre, mercurio, estaño o cinc; o ambos.

Es preferible que el material (A) metálico sea titanio o una aleación de éste, p. ej. una aleación con circonio, tántalo, hafnio, niobio, aluminio, vanadio, cromo, cobalto, magnesio, hierro, oro, plata, cobre, mercurio, estaño o cinc. En una realización particularmente preferida, el material (A) metálico es el titanio.

El correspondiente material (B) de hidruro es preferentemente hidruro de titanio.

La cantidad de sustancia (C) biomolecular presente sobre o en la capa (B) de hidruro de las partes de la prótesis, producto o implante recubierto con el hidruro puede variar dentro de amplios límites, p. ej. dependiendo de las características químicas y biológicas de la sustancia o sustancias biomoleculares en cuestión. De este modo, la sustancia (C) biomolecular asociada con el material (B) de hidruro puede estar presente en cantidades que oscilan desde tan bajas como 1 picogramo por mm^{2} hasta tan altas como 1 mg por mm^{2} de superficie del producto o del implante recubierta de hidruro. Sin embargo, se contempla que los recubrimientos de biomolécula más útiles varíen desde 0,1 nanogramos hasta 100 microgramos por mm^{2}.

Tal como se indicó anteriormente, el método de la invención implica someter a las partes superficiales del material (A) metálico a un tratamiento de electrolisis para formar la capa (B) de hidruro, realizándose dicho tratamiento en presencia de una o más sustancias biomoleculares tal como se expuso anteriormente. Se ha observado que es importante que las condiciones en el electrolito (pH, fuerza iónica, etc.) sean tales que la biomolécula tenga una carga positiva neta. Por lo tanto presenta ventajas que la mayoría de las biomoléculas sean anfolitos, es decir sean ácidos (o bases) débiles que carguen su carga neta según la fuerza iónica y el pH de la solución en que están disueltas. Por consiguiente, el asunto principal para la incorporación de éstas en una capa de hidruro es la estabilidad en las condiciones necesarias para la preparación del bio-hidruro, es decir un medio que suministre suficientes iones H^{+} para la preparación del hidruro y al mismo tiempo mantenga la carga neta positiva de la biomolécula en cuestión. Esto significa principalmente que el electrolito debería tener una concentración de sal y por consiguiente fuerza iónica elevada; una temperatura comparativamente elevada, aunque preferentemente por debajo de cualquier temperatura de desnaturalización de la sustancia biomolecular; y un pH bajo.

Por lo tanto, el electrolito puede ser cualquier solución salina, preferentemente acuosa, p. ej. una solución de cloruro de sodio, sulfato de sodio, fosfato de calcio, cloruro de calcio, solución salina tamponada con fosfato (PBS), solución salina, una solución salina que simule las condiciones fisiológicas, bicarbonatos, carbonatos, etc., en los que se disuelva la biomolécula deseada. La fuerza iónica de la sal es normalmente 1M, pero se pueden ajustar concentraciones tan bajas como 0,01 M y tan altas como 10 M según las propiedades químicas y la concentración de la(s) biomolécula(s).

La temperatura del electrolito que contiene la biomolécula puede variar desde la ambiente (20ºC) hasta tan alta como el punto de ebullición del electrolito, normalmente alrededor de 100ºC, aunque la utilización de temperaturas en la parte superior de este intervalo depende obviamente de la capacidad de la biomolécula para resistir dichas temperaturas sin alteración. Si la biomolécula puede resistirlas, una temperatura óptima para la formación del hidruro es alrededor del 80ºC.

El pH del electrolito se ajusta normalmente al pH deseado mediante un ácido fuerte, p. ej. HCl, HF, H_{2}SO_{4}, etc. aunque debería tenerse en cuenta que un pH por debajo de 2 producirá una superficie de implante irregular, corroída en el titanio mientras que un pH por encima de 2 conserva la superficie original. El pH se ajusta según la relación hidruro/biomolécula deseada; el pH bajo produce una superficie del implante con una proporción elevada de hidruro/biomolécula (= más hidruro metálico), mientras que un pH alto próximo al pI de la biomolécula en cuestión producirá una superficie con una proporción baja de hidruro/biomolécula (= más
biomoléculas). Por consiguiente, aunque se puede utilizar cualquier pH entre 0 y 10, el pH preferido para la preparación de hidruro está entre 5 y 2, dependiendo de las características químicas y de la concentración de la(s) biomolécula(s), del electrolito utilizado y de la proporción hidruro/biomolécula preferida. Para proporciones hidruro/biomolécula(s) mayores (= más hidruro), se ajusta el pH más ácido, para proporciones hidruro/biomolécula(s) más bajas (= más
biomolécula(s)) se ajusta el pH próximo a, pero no por encima de, pI_{BIOMOLÉCULA}. El único requisito es que existan iones hidrógeno (H^{+}) y biomoléculas cargadas positivamente (Biomolécula^{+}, carga neta) presentes en el electrolito.

La concentración de la(s) biomolécula(s) (una o cualquier combinación de dos o más) en el electrolito puede variar en todo un intervalo muy amplio, dependiendo del tipo de bioactividad, del tipo de molécula, de las características químicas y biológicas, de la toxicidad, de la potencia, del modo de acción, si se ha de liberar o no de la capa de hidruro, de la estabilidad in vivo, de la estabilidad en el electrolito, de la disponibilidad, del pH óptimo, etc. De este modo, la concentración de la(s) biomolécula(s) en el electrolito puede estar comprendida dentro del intervalo de 1 pg a 50 mg por mililitro. Un intervalo preferido está comprendido entre 10 pg y 1 mg por mililitro, pero la concentración de biomolécula óptima debería determinarse siempre por último en experimentos pilotos con cada biomolécula o mezcla de biomoléculas. Además, la duración durante la que se realiza la electrolisis puede variar pero influye principalmente en el espesor de la capa de hidruro y por consiguiente en la concentración de las biomoléculas en la capa de hidruro.

Una celda de electrolisis para su utilización en el método de la invención puede ser de cualquier diseño convencional pero normalmente es una celda de dos cámaras sin ninguna conexión de conducción entre las cámaras excepto para el electrolito. El implante metálico que debe ser modificado por el hidruro se coloca en la cámara del cátodo (es decir, el electrodo cargado negativamente) mientras que el ánodo (electrodo cargado positivamente), normalmente hecho de carbono, se coloca en una cámara independiente. Los electrolitos de cada cámara se conectan a través de un filtro de vidrio o porcelana poroso permitiendo pasar la corriente sin resistencia pero sin ningún intercambio de electrolitos entre las dos cámaras. Esto es importante porque los productos en la reacción del ánodo, p. ej. cloruro o hipocloritos, etc., podrían interferir potencialmente con la formación de la capa de hidruro de la biomolécula o destruir o modificar la biomolécula en el electrolito del cátodo. La separación de las dos celdas permite asimismo la utilización de un volumen más pequeño de electrolito del cátodo y de este modo una utilización más eficaz de las biomoléculas así como la posibilidad de utilizar un sistema de dos electrolitos que permita la optimización del proceso electrolítico, p. ej. un electrolito óptimo para las biomoléculas en el lado del cátodo y un electrolito en el lado del ánodo que está optimizado para la eficacia de la electrolisis por sí mismo (conductividad, evitando productos tóxicos, o incluso produciendo subproductos/recubrimientos útiles).

Tal como se indicó anteriormente, la temperatura en la celda del cátodo (T_{cat}) debería ser tan alta como fuera posible con un óptimo para la preparación del hidruro a 80ºC.

El propio proceso electrolítico produce también calor que puede plantear dos problemas; los constituyentes del electrolito se evaporarán de modo que el volumen disminuye y la fuerza iónica y la concentración de las biomoléculas aumenta por encima del intervalo preferido, y el aumento de la temperatura puede producir precipitación, coagulación, desnaturalización, degradación o destrucción de la(s) biomolécula(s) presente(s). Por lo tanto, el compartimento del cátodo de la célula de electrolisis está equipado preferentemente con una tapa enfriada para la condensación del electrolito vaporizado y una carcasa de radiador regulada por temperatura para estabilizar las temperaturas y los volúmenes durante la electrolisis.

Al ajustar la corriente, la carga y la composición del electrolito puede ser también posible proporcionar un medio favorable para la carga positiva de la mayoría de las biomoléculas. Si no es así, un sistema de electrolisis en campo pulsado en el que la polaridad de los electrodos está cambiando en ciclos controlados durante la preparación de la capa de bio-hidruro podría ser una manera de omitir un problema de carga neta negativa.

El suministro de potencia normalmente consiste en la denominada bomba de corriente, es decir un dispositivo que libera una corriente constante incluso si varía la resistencia dentro del circuito. Aunque se pueden utilizar voltajes entre 0,1 y 1000 voltios, el voltaje está típicamente por debajo de 10 voltios. La densidad de corriente durante la electrolisis está normalmente comprendida en el intervalo de 0,1 mA a 1 A por centímetro cuadrado (cm^{2}) de la muestra del implante. Una densidad de carga preferida es 1 mA/cm^{2} aunque ajustes en el electrolito, el pH y la temperatura para aumentar la compatibilidad de la biomolécula pueden ordenar desviaciones menores o mayores de este valor.

La duración del proceso depende de varios parámetros tales como del espesor deseado de la capa de bio-hidruro, de la composición y características del electrolito, de las características de la biomolécula, de la temperatura y del pH, de la proporción de hidruro/biomolécula deseada, del tamaño de la muestra de implante, del volumen del electrolito del cátodo, de la concentración de la biomolécula, etc. De este modo, la duración del proceso puede estar comprendida entre 0,5 horas y varios días. Sin embargo, una duración óptima está comprendida generalmente entre 8 y 24 horas.

Para controlar el proceso del bio-hidruro, se puede colocar normalmente un electrodo de calomelanos en la cámara del cátodo. Cuando el proceso de formación de la capa de hidruro en el cátodo es óptimo, se observa una diferencia de -1 voltios entre el electrodo de calomelanos y el cátodo. Si la corriente se diferencia mucho de este valor, el proceso se desarrollará en condiciones sub-óptimas y se debería considerar un cambio en el sistema. Además, se pueden colocar normalmente una sonda de temperatura y una sonda de pH en la cámara del cátodo para controlar que el proceso se desarrolle dentro de los límites deseados de pH y temperatura. Un dispositivo de agitación, tal como un agitador magnético, se puede también aplicar en la celda del cátodo para mezclar en continuo el electrolito y mantener la temperatura homogénea y evitar variaciones en la fuerza iónica local, pH y concentraciones de biomoléculas.

Después de la etapa de electrolisis, el actual dispositivo o implante metálico recubierto de biomoléculas/hidruro se separa inmediatamente del electrolito y se trata según el requisito de la(s) biomolécula(s) en cuestión. Normalmente, la muestra de dispositivo o de implante se deja secar al aire y a continuación se envasa en una bolsa de plástico esterilizada, estanca al aire, en la que se almacena hasta su utilización para la implantación. Sin embargo, algunas moléculas podrían ser sensibles al secado y por consiguiente podría ser deseable un sistema de almacenaje húmedo, p. ej., similar al enlatado o almacenaje en un fluido como solución salina o simplemente el electrolito del proceso de fabricación. Aunque la electrolisis puede desarrollarse en condiciones asépticas o incluso estériles, la necesidad de hacer esto se puede evitar incluyendo una etapa de esterilización antes de la utilización, utilizando métodos convencionales tales como radiación ionizante, calentamiento, esterilización en autoclave o gas óxido de etileno, etc. La selección del método dependerá de las características y propiedades específicas de la(s) biomolécula(s) presente(s) en la capa de hidruro metálico.

Antes del tratamiento de electrolisis, el dispositivo de implante se debería limpiar a fondo. Esto puede consistir normalmente en pretratar mecánicamente el implante por electropulido o limpieza con chorro de arena para modificar la estructura de la superficie si se desea, y posteriormente limpiar a fondo utilizando sosa cáustica caliente seguido de una etapa de desengrasado, p. ej. en tricloroetileno, etanol o metanol concentrados, antes de tratar en una solución de decapado, p. ej. ácido fluorhídrico, para eliminar los óxidos y las impurezas en la superficie. Después del decapado se lava a fondo la muestra de implante en agua de intercambio iónico, destilada dos veces, caliente.

La invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos, no limitativos, cuyos ejemplos 1 a 4 describen los experimentos realizados y los experimentos 5 a 11 ilustran los ejemplos de trabajo contemplados.

Ejemplo 1 Preparación de una capa superficial del implante del hidruro que contiene una proteína de la matriz extracelular

Se utilizó una celda de electrolisis de dos cámaras para preparar una capa de hidruro de titanio que contiene la molécula de amelogenina de la matriz extracelular en cinco implantes de titanio cada uno con un área superficial de 0,6 cm^{2} expuesta al electrolito. Se utilizaron como controles cinco artículos similares estando presentes en la cámara del electrolito, pero no conectados a la corriente de electrolisis. El electrolito en ambas cámaras fue NaCl 1M en agua esterilizada, pH ajustado a 4 mediante la utilización de HCl, y la concentración inicial de amelogenina fue 0,1 mg/ml. Para la electrolisis se utilizó un voltaje de 10 voltios a una densidad de carga de 1 mA/cm^{2}. La temperatura de la cámara del cátodo se fijó en 70ºC. Se dejó seguir la electrolisis durante 18 horas después de las cuales se separaron los implantes de titanio de la celda de electrolisis, se lavó en agua esterilizada y se dejó secar al aire en un desecador.

Después del secado las muestras de la prueba de titanio y de referencia se lavaron cada una tres veces en 1 ml de solución salina a pH 6,5. Después de los lavados, se disolvió cualquier proteína restante en las superficies de titanio hirviendo la muestra de titanio en 0,5 ml de tampón de muestra 2\timesSDS-PAGE (0,4 g de SDS, 1,0 g de 2-mercaptoetanol, 0,02 g de azul de bromofenol y 4,4 g de glicerol en 10 ml de Tris/HCl 0,125 M, pH 6,8). Se precipitaron las soluciones de lavado y el tampón de la muestra 2xSDS-PAGE con la posible proteína en éste con un volumen igual de ácido perclórico 0,6 M y se eliminó el sobrenadante por centrifugación. Los sedimentos de precipitación, que contengan sal y posibles moléculas orgánicas, se disolvieron a continuación en 50 \mul de tampón de muestra 2\timesSDS-PAGE y se hirvió durante cinco minutos. Todas las muestras se sometieron a continuación a electroforesis en un gel de SDS al 12%-poliacrilamida a 80 mA toda la noche. Después de la electroforesis, se transfirieron las proteínas en el gel sobre una membrana de poli(difluoruro de vinilideno) mediante la técnica de electrotransferencia "en capas" semi-seca. Se detectaron a continuación las proteínas de amelogenina mediante un análisis inmunitario utilizando un anticuerpo de IgG primario específico de amelogenina de conejo y un anticuerpo secundario de IgG anti-conejo de cabra marcado con biotina. La transferencia Western mostró cantidades significativas de amelogeninas presentes en los extractos procedentes de las muestras de la prueba y por consiguiente ocluidas en la capa de hidruro de titanio en éstos, en tanto que no se detectaron amelogeninas en los extractos de las muestras de referencia que no estaban conectadas a la corriente de electrolisis.

Este experimento demuestra claramente que se incorporó una cantidad significativa de amelogenina en la capa de hidruro durante el proceso electrolítico. Las proteínas de amelogenina no estaban presentes meramente como un solo recubrimiento, ya que no existen pruebas de las proteínas en las soluciones de lavado inicial. Únicamente con la combinación de un detergente (SDS) fuerte, un agente reductor (mercaptoetanol) y alta temperatura (100ºC) podrían extraerse las amelogeninas de la capa superficial de hidruro de titanio y detectarse por transferencia Western. Se calculó por comparación con un patrón de amelogenina que la cantidad de proteína extraída era de 50 \mug/cm^{2}. Esta cifra está comprendida dentro del intervalo de bioactividad de esta proteína de la matriz extracelular.

Ejemplo 2 Producción de una capa de la superficie del implante de hidruro de titanio que contiene amelogenina

Se utilizó la estructura del Ejemplo 1 para producir una capa de hidruro de titanio que contenía la molécula de amelogenina de la matriz extracelular en implantes de titanio electropulidos con un área superficial de 0,35 cm^{2} expuesta al electrolito. El electrolito en ambas cámaras fue NaCl 1M en agua esterilizada, se ajustó el pH a 4 mediante la utilización de HCl y la concentración inicial de amelogenina fue 0,1 mg/ml. Para la electrolisis se utilizó un voltaje de 10 voltios a una densidad de carga de 1 mA/cm^{2}. La T_{cat} se fijó en 70ºC. Se dejó continuar la electrolisis durante 18 horas después de las cuales se retiraron los implantes de titanio de la celda de electrolisis, se lavó en agua esterilizada y se dejó secar al aire en un desecador.

Después del secado las muestras de titanio se lavaron tres veces en 1 ml de solución salina a pH 6,5. Después de los lavados, se disolvieron las proteínas restantes en las superficies de titanio hirviendo la muestra de titanio en 0,1 ml de tampón de muestra 2\timesSDS-PAGE (0,4 g de SDS, 1,0 g de 2-mercaptoetanol en 10 ml de Tris/HCl 0,125 M, pH 6,8). La cantidad de amelogenina disuelta en la solución de SDS en las superficies de titanio enjuagadas se analizó a continuación por fotometría estándar midiendo la absorbancia de la luz a 280 y 310 nm frente a un blanco de tampón de la muestra 2\timesSDS y comparando los resultados con una serie de dilución patrón de amelogenina en tampón de la muestra 2\timesSDS. Se repitió el experimento dos veces en series de 16 implantes, ambas veces con 5 referencias internas negativas en forma de implantes de titanio idénticos que estaban presentes en la cámara de reacción durante el proceso total, pero no unidos al cátodo.

Este experimento demuestra claramente que se incorporó una cantidad significativa de amelogenina en la capa de hidruro durante el proceso electrolítico. Las proteínas de amelogenina no estaban presentes únicamente como un solo recubrimiento, ya que no existen pruebas de las proteínas en las soluciones de lavado inicial. Únicamente con la combinación de un detergente (SDS) fuerte, un agente reductor (mercaptoetanol) y alta temperatura (100ºC) podrían extraerse las amelogeninas de la capa superficial de hidruro de titanio. Se calculó por comparación con el patrón de amelogenina que la cantidad de proteína extraída estaba comprendida entre 57 y 114 \mug/cm^{2} con un valor medio de 87 \mug de alogenina por cm^{2}. Esta cifra está comprendida dentro del intervalo de bioactividad de esta proteína de la matriz extracelular. Implantes de referencia idénticos que habían estado presentes en la misma celda electrolítica que los implantes experimentales, pero que no estaban conectados al cátodo, no presentaban cantidades significativas de proteínas de amelogenina unidas a la superficie (<1 \mug/cm^{2}).

Ejemplo 3 Producción de una capa en la superficie del implante de hidruro de titanio que contiene ácido nucleico

Se utilizó la estructura del Ejemplo 1 para producir una capa de hidruro de titanio que contenía ácidos nucleicos en forma de ADN total de placenta humana radiomarcado en implantes de titanio electropulidos con un área superficial de 0,35 cm^{2} expuesta al electrolito. El electrolito en ambas cámaras fue NaCl 1M en agua esterilizada. Se ajustó pH a 2 mediante la utilización de HCl. La concentración inicial de ADN en el electrolito fue 10 \mug/ml. Para la electrolisis se utilizó un voltaje de 10 voltios a una densidad de carga de 1 mA/cm^{2} y a una T_{cat} de 75ºC. Se dejó seguir la electrolisis durante 16 ó 24 horas después de las cuales se separaron las muestras de titanio de la celda de electrolisis, se lavaron tres veces en cantidades abundantes de tampón Tris-EDTA (tampón TE; Tris-Cl 10 mM y EDTA 1 mM en agua esterilizada, pH 7,6) y se dejó secar al aire toda la noche en un desecador.

Se radiomarcó el ADN utilizando un kit de marcado del cebador aleatorio Stratagene Prime-It® II para la producción de sondas de alta actividad específica y [\alpha-^{32}P]dATP (Amersham). Después del marcado del ADN, se midió la radioactividad específica de la sonda de ADN en un contador de centelleo Packard Tricarb® que era 3,0x10^{8} desintegraciones por minuto por microgramo de ADN marcado (dpm/\mug).

Después de secar las muestras de titanio con ácidos nucleicos experimentales unidos, se colocaron en una pantalla de fósforo (Fujii®) durante 15 minutos. A continuación se separaron las muestras y se hizo un barrido de la pantalla de fósforo en una máquina de detección por imagen de fósforo BioRad® midiendo el número de desintegraciones ocurridas en la superficie de cada implante utilizando una rejilla de 100 \mum (12265 puntos por implante). Se repitió el experimento dos veces en una serie de 16 implantes, ambas veces con 5 controles internos negativos en forma de implantes de titanio idénticos que estaba presente en la cámara de reacción durante todo el proceso, pero que no estaban conectados al cátodo. Para la primera serie el tiempo de reacción fue de 24 horas, para la segunda fue de 16 horas. Se calculó el número total de dpm por implante y se transformó en \mug de ADN por centímetro cuadrado (\mug de ADN/cm^{2}).

La cantidad de ADN presente en los implantes varió entre 0,25 y 0,75 \mug/cm^{2} con un valor medio de 0,43 mg de ADN por cm^{2} cuando el tiempo de reacción era de 24 horas. Cuando se redujo el tiempo de reacción a 16 horas, los valores respectivos variaron entre 0,19 y 0,32 \mug/cm^{2} con un valor medio de 0,30 \mug de ADN por cm^{2}. Esta cifra está comprendida dentro del intervalo aplicable para la terapia génica, las vacunas de ADN y otras aplicaciones de la medicina molecular. Implantes de referencia idénticos que habían estado presentes en la misma celda electrolítica que los implantes experimentales, pero que no estaban conectados al cátodo, presentaban solamente cantidades muy pequeñas (picogramos) de ADN unido a la superficie.

Este experimento demuestra claramente que durante el proceso electrolítico se incorporó una cantidad significativa de amelogenina en la capa de hidruro. El ADN no estaba meramente presente como simple recubrimiento porque el ADN no se disolvió o lavó los implantes de la prueba durante el enjuague con TE. Además, el hecho de que la cantidad de ADN incorporado en la capa superrficial de hidruro de titanio aumentase linealmente con el tiempo de reacción también demuestra que ajustar el tiempo de reacción es una manera fácil de controlar la cantidad de biomoléculas en la capa de hidruro.

Ejemplo 4 Preparación de una capa superficial de implante de hidruro de titanio que contiene ácido ascórbico

Se utilizó la estructura del Ejemplo 1 para preparar una capa de hidruro de titanio que contenía ácido ascórbico (vitamina C) en implantes de titanio electropulidos en forma de moneda con un área superficial total expuesta al electrolito de 0,35 cm^{2}. El electrolito en ambas cámaras fue solución salina con el pH ajustado a 3 mediante ácido fosfórico. La concentración inicial de ácido ascórbico fue 10 mg/ml. Se utilizó electrolisis con un voltaje de 6 voltios a una densidad de carga de 2 mA/cm^{2} y una temperatura de la cámara catódica de 20ºC. Se dejó continuar la electrolisis durante 16 horas después de las cuales se retiran los implantes de titanio de la celda de electrolisis, se enjuagan dos veces en agua esterilizada y se dejan secar en un desecador.

Después de secar durante la noche se disolvió el ácido ascórbico experimental en las muestras de titanio sumergiendo las muestras en 1 ml de tampón Tris-EDTA (TE-tampón; Tris-Cl 10 mM y EDTA 1mM en agua esterilizada) a pH 8,0 durante 1 hora en agitación. Se analizó a continuación la cantidad de ácido ascórbico en las muestras de tampón midiendo la absorción de la luz a 250 nm y comparando los resultados con una curva patrón para ácido ascórbico en TE, pH 8,0 a esta longitud de onda. Se pueden utilizar como referencias implantes de referencia idénticos presentes en la misma célula electrolítica como implantes experimentales, pero no conectados al cátodo. Se repitió el experimento dos veces en una serie de 16 implantes, ambas veces con 5 referencias internas negativas.

Se calculó la cantidad de ácido ascórbico extraído de las muestras de titanio en el intervalo entre 28 y 76 \mug/cm^{2} con un valor medio de 39 \mug de ácido ascórbico por cm^{2}, por comparación con el patrón de ácido ascórbico. Esta cifra está dentro del rango de bioactividad de esta vitamina (la concentración normal en el plasma en el hombre varía entre 8 y 15 \mug/ml). Las muestras de referencia internas que han estado presentes en la misma celda electrolítica como implantes experimentales pero que no se conectaron al cátodo, presentan sólo cantidades diminutas de ácido ascórbico unidas a la superficie (<4\mug/cm^{2}). Este experimento demuestra claramente que se puede incorporar o unir una cantidad de ácido ascórbico biológicamente significativa a la capa de hidruro de titanio durante el proceso electrolítico.

Ejemplo 5 Preparación de una capa superficial de implante de hidruro de titanio que contiene un péptido basado en el factor de crecimiento sintético

Se puede utilizar la instalación del Ejemplo 1 para preparar una capa de hidruro de titanio que contiene un péptido del factor 4 de crecimiento de fibroblastos completo (37 aminoácidos) sobre implantes de titanio electropulidos, en forma de moneda con un área superficial total expuesta al electrolito de 0,6 cm^{2}. Los electrolitos, el pH, el voltaje, la densidad de corriente y el tiempo de electrólisis pueden ser propiamente como en el Ejemplo 1. La concentración inicial de FGF-4 puede ser propiamente 0,1 mg/ml, y la temperatura de la cámara del cátodo puede ser propiamente de 50ºC.

Después del lavado en solución salina y tampón 2\timesSDS-PAGE, de la precipitación, de la centrifugación, de la redisolución en SDS-PAGE, de la ebullición y de la electroforesis como en el Ejemplo 1, la proteína en el gel puede transferirse a una solución de coloración con plata y los péptidos FGF-4 sintéticos completos presentes observarse como una banda diferenciada en el gel. Se pueden utilizar como referencias implantes de referencia idénticos incorporados en la misma celda electrolítica como implantes experimentales, pero no conectados al cátodo.

Ejemplo 6 Preparación de una capa superficial de implante de hidruro de titanio que contiene un antibiótico

Se utilizó la estructura del Ejemplo 1 para preparar una capa de hidruro de titanio que contenía el agente antibiótico amoxicilina (aminopenicillium) en un implante de titanio electropulido en forma de moneda con un área superficial expuesta al electrolito de 0,6 cm^{2}. El electrolito en ambas cámaras es propiamente NaCl 1 M en agua esterilizada con el pH ajustado a 2 mediante HCl y la concentración inicial de amoxicilina es propiamente 5 mg/ml. Para la electrolisis se puede utilizar un voltaje de 10 voltios a una densidad de carga de 1 mA/cm^{2} y una temperatura de la cámara catódica de 50ºC. Se puede dejar continuar la electrolisis de forma apropiada durante 24 horas, después de las cuales se retiran los implantes de titanio de la celda de electrolisis, se enjuagan en agua esterilizada y se dejan secar en un desecador.

Después del secado se puede evaluar la cantidad de amoxicilina ocluida en la capa de hidruro en los implantes de titanio por su efecto antibacteriano sobre la bacteria sensible a la penicilina de la especie Escherichia coli (E. coli), cepa K12, en cultivos líquidos. Los cultivos se inoculan apropiadamente con una colonia de E. coli K12 en 5 ml de caldo de cultivo LB. Después de la inoculación los implantes y referencias modificados se colocan en el cultivo y se incuban los cultivos a 37ºC toda la noche. Al día siguiente se puede evaluar la cantidad de bacteria presente en los cultivos por fotometría y comparación con una dilución patrón. Se pueden utilizar como referencias implantes de referencia idénticos presentes en la misma celda electrolítica como implantes experimentales, pero no conectados al cátodo.

Ejemplo 7 Preparación de una capa superficial de implante de hidruro de titanio biomineral-inductora

Se puede utilizar la estructura del Ejemplo 1 para preparar una capa de hidruro de titanio que contiene un péptido de poli-prolina sintético que tiene potenciar para actuar como nucleador biológico de formación mineral en soluciones saturadas de fosfato de calcio. La biomolécula se puede incorporar en una capa de hidruro en la superficie electropulida de los implantes de titanio, en forma de moneda en forma de moneda con un área superficial expuesta al electrolito de 0,6 cm^{2}. El electrolito en ambas cámaras puede ser propiamente NaCl 1 M en agua esterilizada con el pH ajustado a 2 mediante HCl y la concentración inicial de la poli-prolina sintética puede ser propiamente 0,1 mg/ml. Para la electrolisis se puede utilizar un voltaje de 10 voltios a una densidad de carga de 1 mA/cm^{2} y una temperatura de la cámara catódica de 70ºC. Se puede dejar continuar la electrolisis de forma apropiada durante 18 horas, después de las cuales se retiran los implantes de titanio de la celda de electrolisis, se enjuagan en agua esterilizada y se dejan secar al aire en un desecador.

Después del secado los implantes y referencias de titanio con péptido de nucleación mineral experimental unido se colocan en 5 ml de solución saturada de fosfato de calcio. Después de la incubación durante 4 horas a temperatura ambiente, se retiran los implantes de la solución mineral, se enjuagan en agua esterilizada y se secan al aire en un desecador. Cuando están secos, los implantes se pueden someter directamente a microscopía de barrido electrónico para la evaluación de número de focos minerales presentes en las superficies modificadas. Se pueden utilizar como referencias implantes de referencia idénticos presentes en la misma celda electrolítica como implantes experimentales, pero no conectados al cátodo.

Ejemplo 8 Preparación de una capa superficial de implante de hidruro de titanio-biomolécula (relleno del espacio) de esponjamiento

Se puede utilizar la estructura del Ejemplo 1 para preparar una capa de hidruro de titanio que contiene nanosferas de alginato de calcio (Pronova AS) en implantes de titanio electropulidos, con forma de moneda con un área total expuesta al electrolito de 0,6 cm^{2}. El electrolito en ambas cámaras es propiamente CaCl_{2} 1M en agua esterilizada con pH ajustado a 5,5 por medio de HCl y la concentración inicial de alginato de calcio es propiamente 1% p/v. Para la electrolisis se puede utilizar un voltaje de 10 voltios a una densidad de carga de 1 mA/cm^{2} y una temperatura de la cámara catódica de 35ºC. Se deja continuar la electrolisis apropiadamente durante 48 horas, después de las cuales se retiran los implantes de titanio de la celda de electrolisis, se enjuagan en agua esterilizada y se dejan secar al aire en un desecador.

Después del secado, los implantes de titanio con una capa de hidruro-alginato se sumergen de forma apropiada en solución salina esterilizada, se secan con azul de bromofenol (0,02 g/ml) y se incuban durante una hora a 37ºC con la superficie modificada de cara a la solución. Después de la incubación en la solución salina seca se enjuagan los implantes y referencias en agua destilada y se observa con una lupa la retención del colorante azul dentro de la capa experimental de alginato esponjada. El espesor de las capas de alginato se puede evaluar asimismo observando los bordes de los implantes en un microscopio óptico calibrado. Se pueden utilizar como referencias implantes de referencia idénticos presentes en la misma celda electrolítica como implantes experimentales, pero no conectados al cátodo.

Ejemplo 9 Preparación de una capa doble de biomolécula-hidruro de titanio en la superficie del implante

Se puede utilizar la estructura del Ejemplo 1 para preparar una capa doble biomolécula conteniendo hidruro de titanio en la superficie de los implantes de titanio electropulidos, con forma de moneda con un área total expuesta al electrolito de 0,6 cm^{2}. La capa interna se puede preparar utilizando amelogenina como biomolécula según el método del Ejemplo 1. Inmediatamente después de este procedimiento y sin secado con aire en medio, se pueden cambiar el electrolito y las condiciones a las del Ejemplo 3 utilizando ADN humano genómico como biomolécula. De esta manera se pueden preparar implantes de titanio con una capa externa de hidruro de titanio-ADN solapándose con una capa interna de hidruro de titanio-amelogenina. Después de la electrolisis se retiran los implantes de titanio de la celda de electrolisis, se enjuagan en agua esterilizada y se dejan secar al aire en un desecador.

Después del secado las muestras de titanio con ácidos nucleicos y proteínas experimentales unidos se enjuagan apropiadamente tres veces en tampón Tris-EDTA (tampón TE; Tris-Cl 10 mM y EDTA 1 mM en agua esterilizada). En cada enjuague el pH se aumenta partiendo de un pH 7,4, a continuación se enjuaga a pH 7,6 y por último a pH 8,0. Después del enjuague en TE se eliminan por último el ADN restante y la proteína en los implantes de titanio utilizando NaOH 0,1 N. Se dividen a continuación en dos las fracciones del enjuague; una parte para análisis de ácido nucleico y la otra para análisis de proteínas. Las fracciones de ADN se precipitan de manera apropiada con un volumen igual de alcohol absoluto a -20ºC durante 1 hora y a continuación se eliminan del sobrenadante por centrifugación a 13.000 g a 4ºC. Se disuelve a continuación el sedimento en 50 \mul de tampón TE a pH 7,4 y la cantidad de ADN de las 4 soluciones de enjuague se evalúa por análisis fluorométrico utilizando colorante Hoechst (Boehringer Mannheim).

Las fracciones para el análisis de proteínas se precipitan apropiadamente con un volumen de ácido perclórico 0,6 N y se eliminan los sobrenadantes por centrifugación. Los sedimentos de la precipitación que contienen sales y proteínas se disuelven a continuación en 50 \mul de tampón de la muestra 2\timesSDS-PAGE (0,4 g de SDS, 1,0 g de 2-mercaptoetanol, 0,02 g de azul de bromofenol y 4,4 g de glicerol en 10 ml de Tris/HCl 0,125 M, pH 6,8) y se hierven durante cinco minutos. Se someten a continuación todas las muestras a electroforesis en un gel de SDS al 10%- poliacrilamida a 80 mA durante 4 horas. Después de la electroforesis las proteínas en el gel se transfieren a una solución coloreada de plata y se observa la amelogenina presente en las fracciones como bandas diferenciadas en el gel.

Se pueden utilizar como referencias implantes de referencia idénticos presentes en la misma celda electrolítica como implantes experimentales, pero no conectados al cátodo.

Ejemplo 10 Preparación de una zona doble en la superficie de implante con capas de biomolécula-hidruro de titanio

Se puede utilizar la estructura del Ejemplo 1 para preparar dos zonas independientes de capas de hidruro de titanio. Los implantes de titanio electropulidos, en forma de varilla, con un área total de 2 cm^{2} se trataron según los Ejemplos 3 y 6. En primer lugar se colocaron los implantes en el electrolito del Ejemplo 3, de modo que solamente la mitad de cada implante se sumergió en el electrolito. Después de terminar el procedimiento del Ejemplo 3, se dio la vuelta a los implantes y se colocaron en nuevo electrolito similar al utilizado en el Ejemplo 6, de modo que la mitad no tratada de cada implante se sumergió ahora en el electrolito. Se realizaron a continuación el procedimiento y las condiciones de reacción de los Ejemplos 6, después de lo cual se retiró la muestra del titanio de la celda de electrolisis, se enjuagó en agua esterilizada y se dejó secar en un desecador.

Después de la electrolisis los implantes con zona doble se cortan en dos en el centro. Las mitades estratificadas con hidruro de titanio-péptido FGF-4 sintético se pueden someter a análisis según el Ejemplo 2. Las demás mitades de los implantes, estratificadas con hidruro de titanio-amoxicilina, se pueden analizar en el ensayo de crecimiento bacteriano según el Ejemplo 5. Se pueden utilizar como referencias implantes de referencia idénticos presentes en la misma celda electrolítica como implantes experimentales, pero no conectados al cátodo.

Ejemplo 11 Preparación de una capa superficial de implante de hidruro de titanio osteoinductiva que contiene una biomolécula

Se colocan implantes preparados como en el Ejemplo 1 (hidruro de titanio-amelogenina) en anomalías de huesos calibrados en el hueso de la tibia de conejos, asegurándose de que las perforaciones en la médula ósea por debajo de los implantes permiten la migración de las células osteogénicas a las superficies modificadas del implante, utilizando un modelo normalizado y validado (R\phinold y Ellingsen, European Society for Biomaterials Conference, Amsterdam, Octubre de 2000). Un día después de la intervención quirúrgica y cada una de las siguientes semanas se administra a los conejos una inyección intravenosa de calceína (Sigma) de 10 mg/kg de peso corporal. A las cuatro semanas después de la colocación de los implantes modificados y de los implantes de referencia se sacrificarán los conejos y se extrae la tibia, se fija en formaldehído al 4% y se hace una inclusión para la preparación de secciones molidas de todo el hueso y del material de implante integrado. Se pueden utilizar como referencias implantes de referencia idénticos presentes en la misma celda electrolítica como implantes experimentales, pero no conectados al cátodo.

Claims

1. Una prótesis o implante protésico médico que contiene un material (A) metálico seleccionado del grupo que consta de titanio o una de sus aleaciones, circonio o una de sus aleaciones, tántalo o una de sus aleaciones, hafnio o una de sus aleaciones, niobio o una de sus aleaciones y de una aleación de cromo- vanadio, en la que las partes superficiales del material (A) metálico están recubiertas con una capa de un material (B) del hidruro correspondiente seleccionado de hidruro de titanio, hidruro de circonio, hidruro de tántalo, hidruro de hafnio, hidruro de niobio e hidruro de cromo y/o vanadio, respectivamente, caracterizado porque la capa de material (B) de hidruro comprende una o más sustancias (C) biomoleculares asociadas a ésta.

2. Una prótesis o un implante según la reivindicación 1, en el que el material (A) metálico es titanio o una de sus aleaciones, preferentemente titanio.

3. Una prótesis o un implante según la reivindicación 1 ó 2, en el que la sustancia (C) biomolecular se selecciona de los siguientes tipos de sustancias: Bioadhesivos naturales o recombinantes; factores de unión de células naturales o recombinantes; biopolímeros naturales, recombinantes o sintéticos; proteínas de la sangre naturales o recombinantes; enzimas naturales o recombinantes; proteínas de la matriz extracelular naturales o sintéticas; biomoléculas de la matriz extracelular naturales o recombinantes; factores de crecimiento y hormonas naturales o recombinantes; hormonas de péptidos naturales, recombinantes o sintéticas; ácidos desoxirribonucleicos naturales, recombinantes o sintéticos; ácidos ribonucleicos naturales, recombinantes o sintéticos; receptores naturales o recombinantes; inhibidores enzimáticos; fármacos; aniones y cationes biológicamente activos; vitaminas; monofosfato de adenosina (AMP), difosfato de adenosina (ADP) o trifosfato de adenosina (ATP); biomoléculas marcadoras; aminoácidos; ácidos grasos; nucleótidos (bases de ADN y de ARN) y azúcares.

4. Una prótesis o un implante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la sustancia (C) biomolecular está presente en la superficie del material (B) del hidruro u ocluida en el material del hidruro.

5. Una prótesis o un implante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la sustancia o sustancias (C) biomolecular(es) está(n) asociada(s) con el material (B) del hidruro en una cantidad de 1 picogramo por mm^{2} a 1 mg por mm^{2}, preferentemente de 0,1 nanogramo a 100 microgramos por mm^{2}.

6. Una prótesis o un implante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la sustancia o sustancias (C) biomolecular(es) está(n) asociada(s) con superficies que están en contacto con el hueso u otro tejido cuando el producto se despliega en el cuerpo de un mamífero.

7. Una prótesis o implante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que reemplaza la anatomía o restablece una función del cuerpo tal como la articulación femoral de la cadera; la apófisis femoral; el cotilo; el codo incluyendo las hipófisis, las cuñas, las inserciones articulares; la rodilla, incluyendo los componentes femorales y tibiales, las hipófisis, las cuñas, las inserciones articulares o los componentes rotulianos; los omoplatos incluyendo la hipófisis y la diáfisis; la muñeca; los tobillos; la mano; los dedos de las manos; los dedos de los pies; las vértebras; los discos vertebrales; las articulaciones artificiales; los implantes dentales; los implantes plásticos de huesos pequeños; los implantes en el oído medio incluyendo el yunque, el martillo, el estribo, yunque-estribo, martillo-yunque, martillo-yunque-estribo, los implantes cocleares; aparatos ortopédicos de fijación tales como clavos, tornillos, grapas y placas; las válvulas cardíacas; marcapasos; catéteres; recipientes; implantes de relleno de espacio; implantes para retención de audífonos; implantes para fijación externa; dispositivos intrauterinos (DIU); y dispositivos bioelectrónicos tales como los dispositivos electrónicos intracocleares o intracraneales.

8. Un método para preparar una prótesis o implante médico según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, comprendiendo dicho método el someter las partes superficiales del material (A) metálico a un tratamiento de electrolisis para formar una capa de material (B) de hidruro, realizándose dicho tratamiento de electrolisis en presencia de una o más sustancias (C) biomoleculares.