CN1191481A - N－炔丙基－1－氨基二氢化茚的r－对映体、其盐和组合物的应用 - Google Patents

N－炔丙基－1－氨基二氢化茚的r－对映体、其盐和组合物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了R(+)－N－炔丙基－1－氨基二氢化茚及其药物上可接受的盐和包含这些化合物的药物组合物。本发明还提供了利用R(+)－N－炔丙基－1－氨基二氢化茚或其药物上可接受的盐对患有下列疾病的患者进行治疗的方法:帕金森病、记忆紊乱、痴呆、抑郁症、机能亢进综合征、情感性疾病、神经变性疾病、神经中毒性损伤、中风、脑缺血、头损伤、脊柱损伤、神经外伤、精神分裂症、注意力缺乏、多发性硬化或脱瘾综合征。本发明进一步提供了预防患者神经损伤的方法。最后,本发明提供了R(+)－N－炔丙基－1－氨基二氢化茚及其盐和外消旋N－炔丙基－1－氨基二氢化茚的制备方法。

Description

N-炔丙基-1-氨基二氢化茚的R-对映体、 其盐和组合物的应用
本申请中参考了各种参考文献。这里将这些出版物中的公开内容引入本申请以更详细地描述本发明所涉及的现有技术。
                 发明背景I.
本发明属于一氨基氧化酶(此后写为MAO)的选择性不可逆抑制剂领域，提供了N-炔丙基-1-氨基二氢化茚(也可称为PAI)的R(+)对映体，它是B型-氨基氧化酶(此后指MAO-B)的选择性不可逆抑制剂。本发明还提供了含有R(+)PAI的药物组合物，这些药物组合物具体用来治疗帕金森病、记忆紊乱、痴呆、抑郁症、机能亢进综合症、情感性疾病、神经变性疾病、神经中毒性损伤、中风、脑缺血、头损伤、脊柱损伤、神经外伤、精神分裂症、注意力缺乏疾病、多发性硬化和脱瘾综合征。II.
人们广泛认为帕金森病是脑突触前多巴胺能神经退化、随后神经递质多巴胺释放量减少的结果。因此，多巴胺释放量不足导致随意肌肉控制发生失调，这种失调是帕金森病的症状。
现已建立了治疗帕金森病的各种方法，目前广泛应用的包括，例如L-DOPA与脱羧酶抑制剂象L-卡别多巴(L-carbidopa)或羟苄丝肼一起给药。脱羧酶抑制剂保护L-DOPA分子免受外周脱羧作用，由此确保脑纹状体(striatum)中剩余多巴胺能神经对L-DOPA的摄取。这里，L-DOPA被转化为多巴胺，导致这些神经中多巴胺水平上升。因此在应答生理冲动时，这些神经能释放出较大量的多巴胺，水平约为正常所需水平。由此L-DOPA疗法能减轻疾病症状，使病人状态良好。
然而，L-DOPA治疗有它的缺点，主要一点是仅在治疗的开始几年效果是最佳的。这段时期之后，临床应答会减少并伴有下面的副作用，包括运动障碍、全天药效波动(“开-关效应”(no-off effect))及精神病综合征如精神错乱症状、偏执狂和幻觉。这种L-DOPA治疗效果的降低归因于许多因素，包括疾病的自然发展、由于产生的多巴胺增多或多巴胺代谢物水平提高造成多巴胺受体改变、以及L-DOPA吸收的药动学问题(Youdim等人综述，《药物化学进展》，(Progress inMedicinal Chemistry)21，138-167(1984))。
为克服L-DOPA疗法的缺陷，已提出各种治疗方法，其中将L-DOPA与MAO抑制剂结合，目的在于减少所形成多巴胺的代谢分解(参见，例如Chiese，U.S.专利No.4,826,875，1989年5月2日授权)。
MAO以两种称为MAO-A和MAO-B的形式存在，它们对不同底物和抑制剂具有选择性。例如，MAO-B对底物如2-苯乙胺代谢更有效，并被下述(-)-司立吉林(deprenyl)选择性不可逆抑制。
然而应该注意到，L-DOPA与抑制剂MAO-A和MAO-B结合治疗是不受欢迎的，因为它们能导致涉及整个轴索儿茶酚胺水平提高的副作用。而且，MAO完全抑制作用也是不受欢迎的，因为它能增强拟交感神经胺如酪胺的作用，导致所谓的“奶酪效应(cheese effect)”(Youim等人综述，《实验药理学手册》(Hondbook of ExperimentalPharmacology)，Trendelenburg和Weiner编，Springer-Verlag，90，第3章(1988))。因为MAO-B显示为脑中MAO的主要形式，所以认为针对这种形式的选择性抑制剂可能一方面能达到多巴胺分解减少的效果，另一方面使总的MAO抑制作用的全身效果最小化。
MAO的许多抑制剂是手性分子。虽然，一种对映体常对MAO-A和-B在相对效力上显示出一些立体选择性，但一种所给对映体构型在区别MAO-A和MAO-B时并不总比它的镜像异构体更具选择性。
表1列出了大鼠脑MAO制剂中炔丙基胺的对映异构体对的IC50(mmol/L)。这些结果显示了R和S对映体间对MAO-B抑制效力的较小区别。(B.Hazelhoff，等，Naunyn-Schmeideberg′s《药理学文献》(Arch.Pharmacol.)，330，50(1985))。两个对映体对MAO-B均有选择性。1967年Magyar等人报道，在抑制大鼠脑匀浆对酪胺的氧化脱胺作用时R-(-)-司立吉林比S-(+)对映体效力高500倍。(K.Magyar等，Act.Physiol.Acad.Sci.，Hung.，32，377(1967))。
在大鼠肝匀浆中，R-司立吉林仅是S对映体效力的15倍。在其它药理学活性分析中，如对酪胺摄取的抑制作用分析，司立吉林显示出不同的立体选择性。某些情况下，S型是更有效的差向异构体。(J.Knoll和K.Magyar，《生物化学精神药理学进展》(Advances in BiochemicalPsychopharmacology，5，393(1972))。
N-甲基-N-炔丙基-1-氨基-1，2，3，4-四氢化萘(2-MPAT)是司立吉林相近结构类似物。2-MPAT的绝对立体化学构型还是未知的。然而，(+)异构体对MAO-B具有选择性，(-)异构体对MAO-A具有选择性。2-MPAT对映体间效力差别小于5倍。(B.Hazelhoff等，同上)。N-炔丙基-1-氨基-1，2，3，4-四氢化萘(1-PAT)的对映体活性也相似。表1中缺失数据表明分离的(+)或(-)-2-MPAT间明确构效关系，使得不可能预言它们的绝对立体化学。
在进行了大量的计算机模拟之后，Polymeropoulos最近预言到，作为MAO-B抑制剂，(R)-N-甲基-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚(R-1-MPAI)比(S)型更有效。(E.Polymeropoulos，单胺氧化酶B抑制剂(Inhibitors of Monoamine Oxidase B)，I.Szelenyi编，Birkhauser Verlag，第110页(1993))。但是，所述实验表明，R-1-MPAI是比S-1-MPAI稍有效的MAO-B抑制剂，而是更为有效的MAO-A的抑制剂。在MAO-A和-B之间的选择性以及R和S差向异构体的相对效力均低。因此，与本领域所期望的相反，1-MPAI不能作为药剂。
下面示出的数据表明，一种对映体相对于另一种对MAO的高度选择性是不能预知的。MAO活性位点的结构还没有完全弄清楚，不能预知任何给定化合物或其对映体对的相对效力或选择性。III.
在发达国家，脑中风是导致死亡的第三位原因。幸存者通常患神经和运动原残疾。大多数CNS中风被认为是动脉血流阻塞引起氧和葡萄糖缺乏后局部组织贫血。大鼠大脑中动脉的闭合(MCAO)是一种常用实验方法，被假定代表人中风。已指出，大鼠由此动脉近端闭合造成的神经损伤相应于人大病灶性大脑梗塞(Yamori等，1976)。这种对应性是基于两物种颅部循环的相似性。Stefanovich(1983)描述了其它中风动物模型。
由Tamura等人描述的组织学变化(1981)通常可见于前皮层(100％)、感觉区(75％)和听觉区(75％)、枕叶皮层程度较小(25％)，这些人是首先介绍MCAO方法的。此外，在尾状核外侧部分发现损伤(100％)，在其内侧部分仅有可变程度的损伤(38％)。同时，据报道在MCAO动物中有下列疾病：神经缺损(Menzies等，1992)、识别混乱(Yamamoto等，1988)、脑水肿(Young等，1993；Matsui等，1993；Saur等，1993)、大脑血流减少(Teasdale等，1983)、儿茶酚胺波动(Cechetto等，1989)。这些疾病中任一种都表现出随着鼠中MCAO的脑损伤的严重性和程度。相反，具有限制或治疗给出疾病潜能的药物可被考虑用作治疗人中风的候选药。表IA  炔丙基胺抑制大鼠脑MAO的IC50(mmol/L)数据化合物      差向异构体    抑制作用         相对效力
    参考              A     B    A/B     +/-
    文献                               A      B
           +         140    16   8.82-MPAI   a                                 3     0.2
           -         46     88   0.5
                                         R/S司立吉林 a     S         3600   16   120
                                       80    2.6
           R         450    6    75
           S         70     50   1.41-MPAI   b                                 23    5
           R         3      10   0.3
           S         3800   50   761-PAT    c                                 4     0.5
           R         900    90   10a.  B.Hazelhoff，等人，Naunyn-Schmeideberg′s药理学文献，330，
50(1985)。b.  欧洲专利申请436,492 A2，1991年7月10日公开。c.  本申请发明人。
一种选择性MAO-B抑制剂(-)-司立吉林已被广泛研究并用作MAO-B抑制剂以加强L-DOPA治疗。使用(-)-司立吉林治疗通常是有利的并且在能导致MAO-B近乎完全被抑制的剂量时不会引起“奶酪效应(cheese effect)”(Elsworth，等，《精神药理学》(Psychopharmacology)，57，33(1978))。并且，在对帕金森病患者结合给药L-DOPA和脱羧酶抑制剂中加入(-)-司立吉林会改善运动不能和全身官能容量，以及消除“开-关(on-off)”型波动(Birkmayer & Riederer综述，《帕金森病》(Parkinson′s Disease)，Springer-Verlag，第138页-149页(1983))。因此，(-)-司立吉林(a)增强和延长L-DOPA的效应，(b)不会增加L-DOPA治疗的不利作用。
然而，(-)-司立吉林不是没有其自身的副作用，这些副作用包括活化预先存在的胃溃疡和偶然性高血压发作。并且，(-)-司立吉林是苯异丙胺的衍生物，并代谢为苯异丙胺和去氧麻黄碱，这些物质可导致不期望的副作用如心率增加(Simpson，《生物化学药理学》(Biochemical Pharmacology)，27，1951(1978)；Finberg等在“单胺氧化酶抑制剂-现有技术的论述”(Monoamine OxidaseInhibitors-The State of the Art)，Youdim和Paykel编，Wiley，第31-43页(1981))。
已经描述了作为MAO-B的选择性不可逆抑制剂的其它化合物，但它们没有(-)-司立吉林相关的的副作用。这种化合物即N-炔丙基-1-氨基二氢化茚盐酸盐(外消旋PAI·HCl)被描述于GB1,003,686和GB1,037,014和U.S.专利No.3,513,244，授权于1970年5月19日。外消旋PAI·HCl是潜在的、选择性的MAO-B不可逆抑制剂，不会被代谢为苯异丙胺，且不会产生不需要的拟交感神经效应。
在对比动物实验中，外消旋PAI显示出比(-)-司立吉林具有相当多的优点。例如，外消旋PAI在剂量达5mg/kg时，不产生明显的心博过速、不增高血压(剂量5mg/kg的(-)-司立吉林会产生此效应)、不导致瞬膜收缩或心率上升((-)-司立吉林在超过0.5mg/kg剂量时产生的效应)。并且，外消旋PAI·HCl不增强酪胺的心血管效应(Finberg等，在“精神病中的酶和神经传递质”(Enzymes andNeurotransmitters in Mental Disease)，第205-219页(1980)，Usdin等编，Wiley，New York；Finberg等(1981)，在“单胺氧化酶抑制剂-现有技术的论述”(Monoamine Oxidase Inhibitors-The State of the Art.)出处同上；Finberg和Youdim，《英国药理学杂志》(British Journal Pharmacol)，85，451(1985))。
本发明的另一主要目的是分离外消旋PAI化合物且获得具有MAO-B抑制活性的对映体，它没有其它对映体任何不期望的副作用。
由于司立吉林与PAI结构相似，且已知司立吉林的(-)-对映体即(-)-司立吉林比(+)-对映体的药物活性高得多，因此期望PAI的(-)对映体是更有效的MAO-B抑制剂。
然而，与所预计的相反，在拆分对映体后发现(+)-PAI对映体事实上是有效的MAO-B抑制剂，而(-)-对映体显示出极低的MAO-B抑制活性。并且，(+)-PAI对映体对MAO-B抑制的选择性程度出奇地高于相应的外消旋体形式，因此在治疗所述疾病时不期望的副作用应比外消旋混合物少。这些发现均基于下述更详细的体外和体内实验。
其次还说明(+)-PAI具有R绝对构型。根据预期(+)-PAI类似物与司立吉林和苯异丙胺间结构相似性，该发现也是出人意外的。
下述的R(+)-PAI和S(-)对映体间药物活性的高度立体选择性也是显著的。在抑制MAO-B时R(+)-PAI化合物比S(-)对映体活性高近4个数量级。这一比值显著高于两个司立吉林对映体间所观察的比值(Knoll和Magyar，《生物化学精神药理学进展》(Adv.Biochem.Psychopharmacol.)，5，393(1972)；Magyar等，ActaPhysiol.Acad.Sci.Hung.，32，377(1967))。并且，在一些生理试验中，据报道(+)-司立吉林所具活性等于或甚至高于(-)-对映体活性(Tekes等，Pol.《药理学与药物学杂志》(J.Pharmacol.Pharm.)，40，653(1988))。
MPAI是更有效的MAO活性抑制剂，但对MAO-B比A的选择性较低(Tipton等，《生物化学药理学》(Biochem.Pharmacol.)，31，1250(1982))。因为出人意料地发现用MPAI两个已拆分对映体的相对活性仅有很小程度的差别，所以R(+)PAI的显著作用就更为重要了(参见表1B)。
本发明还提供了单独使用药物活性PAI-对映体(没有L-DOPA)治疗下述疾病的方法：帕金森病、记忆紊乱、痴呆、抑郁症、机能亢进综合征、情感性疾病、神经变性疾病、神经中毒性损伤、脑缺血、头损伤、脊柱损伤、精神分裂症、注意力缺乏、多发性硬化或脱瘾综合征(参见Youdim等人综述，在《实验药理学手册》(Handbook ofExperimental Pharmacology)，Trendelenberg和Wiener编，90/I第3章(1988))。
本发明进一步提供了单独使用药物活性PAI-对映体治疗帕金森病的方法。本发明还提供了包含R(+)PAI和增效剂如左旋多巴的药物组合物。已就(-)-司立吉林研究了这种增效剂的应用，将(-)-司立吉林单独给药早期帕金森病患者表明是有效的，当与一种维他命E的衍生物α-生育酚一起给药时对这些患者还可具有协同效应(《帕金森病研究组》(The Parkinson′s Study Group)，New England《药物杂志》(J.Med.)，321(20)，1364-1371(1989))。
除了在治疗帕金森病中的用途之外，(-)-司立吉林还表明能用于治疗早老性痴呆(DAT)患者(Tariot等，《精神药理学》(Psychopharmacology)，91，489-495(1987))及治疗抑郁症(Mendelewicz和Youdim，《英国精神病学杂志》(Brit.J.Psychiat.)142，508-511(1983))。本发明R(+)PAI化合物特别是其甲磺酸盐已表明能恢复记忆。因此，R(+)PAI有可能用于治疗记忆紊乱、痴呆特别是早老性痴呆及儿童机能亢进综合征。
最后，本发明提供了具有优越药物性质的高度稳定的R(+)PAI盐。甲磺酸盐特别稳定，比相应的外消旋体盐显示出意想不到的较高的选择性并显示出非常少的副作用。
                   发明简述
本发明提供了R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚，结构为
Figure A9619571000121
本发明进一步提供了R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚的药物上可接受的盐。
本发明还提供了药物组合物，它包含治疗有效量的R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐和一种药物上可接受的载体。
本发明还提供了治疗帕金森病的方法，它包括对患者给药有效量的本发明R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，以治疗患者的帕金森病。
本发明还提供了治疗患者记忆紊乱的方法，它包括对患者给药有效量的本发明R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，以治疗患者的记忆紊乱。
本发明还提供了治疗患者痴呆的方法，它包括对患者给药有效量的本发明R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，以治疗患者的痴呆。在一个实例中，痴呆为早老性痴呆(DAT)。
本发明还提供了治疗患者抑郁症的方法，它包括对患者给药有效量的本发明的R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，以治疗患者的抑郁症。
本发明还提供了治疗患者机能亢进综合征的方法，它包括对患者给药有效量的本发明的R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，以治疗患者的机能亢进综合征。
本发明还提供了治疗患者情感性疾病的方法，它包括对患者给药有效量的本发明R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，以治疗患者的情感性疾病。
本发明还提供了治疗患者神经变性疾病的方法，它包括对患者给药有效量的本发明R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，以治疗患者的神经变性疾病。
本发明还提供了治疗患者神经中毒性损伤的方法，它包括对患者给药有效量的本发明的R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，以治疗患者的神经中毒性损伤。
本发明还提供了治疗患者脑缺血的方法，它包括对患者给药有效量的本发明的R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，以治疗患者的脑缺血。
本发明还提供了治疗患者头损伤的方法，它包括对患者给药有效量的本发明R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，以治疗患者的头损伤。
本发明还提供了治疗患者脊柱损伤的方法，它包括对患者给药有效量的本发明R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，以治疗患者的脊柱损伤。
本发明还提供了治疗患者精神分裂症的方法，它包括对患者给药有效量的本发明R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，以治疗患者的精神分裂症。
本发明还提供了治疗患者注意力缺乏疾病的方法，它包括对患者给药有效量的本发明R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，以治疗患者的注意力缺乏疾病。
本发明还提供了治疗患者多发性硬化的方法，它包括对患者给药有效量的本发明R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，以治疗患者的多发性硬化。
本发明还提供了预防患者神经损伤的方法，它包括对患者给药有效量的本发明R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，以预防患者的神经损伤。
本发明还提供了治疗患者瘾物脱瘾综合征的方法，它包括对患者给药有效量的本发明R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，以治疗患者的脱瘾综合征。
本发明还提供了制备R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚的方法，它包括在有机碱或无机碱存在下将R(-)-氨基二氢化茚与炔丙基溴或炔丙基氯接触，以形成R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚，并分离由此形成的R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚。
本发明还提供了制备外消旋N-炔丙基-1-氨基二氢化茚的方法，它包括在有机碱或无机碱存在下，将外消旋的1-氨基二氢化茚与炔丙基溴或炔丙基氯接触，以形成外消旋的N-炔丙基-1-氨基二氢化茚，并分离由此形成的外消旋N-炔丙基-1-氨基二氢化茚。
最后，本发明提供了制备R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚盐的方法，它包括将外消旋的N-炔丙基-1-氨基二氢化茚与光学活性的酸接触，以形成两种非对映的N-炔丙基-1-氨基二氢化茚盐，并从由此形成的非对映的N-炔丙基-1-氨基二氢化茚盐中分离出R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚。附图简述
图1是说明体外抑制MAO-A活性的实施例22的结果曲线图。
图2是说明体外抑制MAO-B活性的实施例22的结果曲线图。
图3是说明人皮层组织MAO活性的实施例22的结果曲线图。
图4是说明对脑中MAO-A急性抑制(腹膜注射)的实施例23的结果曲线图。
图5是说明对脑中MAO-B急性抑制(腹膜注射)的实施例23的结果曲线图。
图6是说明对肝中MAO-A急性抑制(腹膜注射)的实施例23的结果曲线图。
图7是说明对肝中MAO-B急性抑制(腹膜注射)的实施例23的结果曲线图。
图8是说明对脑中MAO-A急性抑制(口服)的实施例23的结果曲线图。
图9是说明对脑中MAO-B急性抑制(口服)的实施例23的结果曲线图。
图10是说明对肝中MAO-A急性抑制(口服)的实施例23的结果曲线图。
图11是说明对肝中MAO-B急性抑制(口服)的实施例23的结果曲线图。
图12是说明对脑中MAO-A慢性抑制(口服)的实施例24的结果曲线图。
图13是说明对脑中MAO-B慢性抑制(口服)的实施例24的结果曲线图。
图14是说明对肝中MAO-A慢性抑制(口服)的实施例24的结果曲线图。
图15是说明对肝中MAO-B慢性抑制(口服)的实施例24的结果曲线图。
图16是经腹膜注射R(+)PAI后，说明大鼠脑中MAO-B活性与时间函数关系的实施例25的结果曲线图。
图17是小鼠经皮下给药6mg/kg氟哌啶醇后显示其正常运动(normokinesia)恢复的实施例32结果的曲线图。小鼠腹膜内接受所示剂量的每种试验药物。2小时后接受氟哌啶醇。在接受氟哌啶醇后3小时进行运动评分。这些分数组成为：沿圆木水平移动的能力、沿圆木竖直下降的能力和僵住症的缩短。氟哌啶醇不存在时，最高分为12，单独使用氟哌啶醇时，为6.6±0.03。通过Student′s“t”试验计算此统计学显著性：*p≤0.05；**p≤0.01；单独使用氟哌啶醇时***p≤0.001。(R)-PAI的分数在5mg/kg(p≤0.05)、10mg/kg(p≤0.01)和15mg/kg(p≤0.05)(n＝5.6)时显著不同于外消旋PAI。所示剂量为PAI的游离碱(不是甲磺酸盐)。
图18是大鼠经腹膜注射100mg/kgα-甲基-对-酪氨酸治疗后显示运动活性恢复的实施例32结果的曲线图。大鼠腹膜内接受所示剂量的试验药物。2小时后接受α-Mpt并立即将它们放在活动笼中。在10小时期间内记录全部的运动活性。以盐水处理的对照大鼠仅得分15，862±1424。单独使用α-Mpt时，得分8，108±810。Student′s“t”试验的统计学显著性为：*p≤0.05；**p≤0.01；单独用α-Mpt ***p≤0.001。在2mg/kg(p≤0.01)(n＝6)(R)-PAI的分数显著不同于外消旋PAI。所示剂量为PAI游离碱，不是甲磺酸盐。
图19表明对2分钟缺氧症的NADH应答，损伤后30分钟测量并间隔半小时测一次的曲线图。
图20：在MCA-O和[R](+)PAI甲磺酸盐治疗大鼠后48小时用MRI T2-扫描评价缺血性脑损伤：如实施例38中所述将脑中动脉手术闭合。按下述方式给药[R](+)PAI甲磺酸盐：手术后立即腹膜内给药1.0mg/kg；术后2小时腹膜内给药0.5mg/kg；术后24小时腹膜内给药1.0mg/kg。手术后48小时用MRI测定梗塞体积(mm3)。
图21：接受MCA-O和[R](+)PAI甲磺酸盐治疗的Wistar大鼠的神经病学评价：脑中动脉被手术闭合，并按图20中方式给药[R](+)PAI甲磺酸盐。术后24小时根据实施例38所述进行神经病学评分。发明详述本发明提供了R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚，结构为
Figure A9619571000171
正如下述实验实施例中所证实的，R(+)PAI作为MAO-B的抑制剂比S(-)PAI活性高近7,000倍。就本领域已知的MAO-B抑制剂来说，它们在MAO-A和MAO-B间选择性低，且作为R或S构型功能的效率没有显示出可预知的趋势，所以R(+)PAI的选择性是出人意料的。
通过光学拆分PAI的R-和S-对映体的外消旋混合物可获得R(+)PAI。使用本领域技术熟知的任何一种常规拆分方法均可实现这种拆分，如J.Jacques，A.Collet和S.Wilen在“对映体、外消旋体和拆分”(Enantiomers，Racemates and Resolutions)Wiley，New York(1981)中所述的方法。例如，通过在手性柱上的制备型色谱可进行拆分。另一个合适的拆分方法例子是用手性酸如酒石酸、苹果酸、扁桃酸或氨基酸的N-乙酰基衍生物象N-乙酰亮氨酸形成非对映盐，然后重结晶以分离出所需R对映体的非对映体盐。
例如根据GB1,003,676和GB1,037,014中所述方法可制备PAI的R和S对映体的外消旋混合物。也可将1-氯二氢化茚与炔丙基胺反应制备PAI的外消旋混合物。或者，可将炔丙基胺与2，3-二氢-1-茚酮反应形成相应的亚胺，然后用合适的试剂如硼氢化钠还原亚胺的碳-氮双键来制备这种外消旋体。
根据本发明，也可在有机碱或无机碱存在下并且有或没有适宜溶剂时，将1-氨基二氢化茚的光学活性R-对映体与炔丙基溴或炔丙基氯反应直接制备PAI的R-对映体。
用于上述反应中合适的有机碱或无机碱包括，例如三乙胺、吡啶、碱金属碳酸盐或碳酸氢盐。如果反应是在溶剂存在时进行的，那么溶剂可选自如甲苯、二氯甲烷和乙腈。制备R(+)PAI的一个方法是使用碳酸氢钾为碱、乙腈为溶剂将R-1-氨基二氢化茚与炔丙基氯反应。
上述1-氨基二氢化茚的反应通常会产生未反应的伯胺、所需的仲胺和叔胺N，N-二炔丙基氨基产物的混合物。所需仲胺即N-炔丙基-1-氨基二氢化茚，可通过常规分离方法如色谱法、蒸馏和选择性萃取从混合物中分离出来。
R-1-氨基二氢化茚原料可由本领域已知方法来制备，这些方法包括例如Lawson和Rao在《生物化学》(Biochemistry)，19，2133(1980)中所述方法，该方法在此引作参考，以及欧洲专利No.235,590中的方法。
也可通过R和S对映体的外消旋混合物的拆分来制备R-1-氨基二氢化茚，此方法包括如使用手性酸形成非对映体盐或任何其它已知方法，如同上所述的J.Jacques等人报道的方法。或者，可将2，3-二氢-1-茚酮与光学活性胺反应，然后用适当催化剂如钯/炭、氧化铂或阮内镍的氢化使所得亚胺的碳氮双键还原来制备R-1-氨基二氢化茚。合适的光学活性胺包括，例如苯乙胺的一种对映体或一种氨基酸如缬氨酸或苯丙氨酸的酯。随后通过非剧烈条件下的氢化作用可裂解苄基上的N-C键。
制备R-1-氨基二氢化茚的另一种方法是如上所述的2，3-二氢化茚-1-酮肟醚的氢化作用，其中醚的烷基部分含光学纯手性中心。或者，可用一种手性还原剂如氢化铝锂和麻黄碱的复合物来还原含碳氮双键的2，3-二氢化茚-1-酮的非手性衍生物如亚胺或肟。
本发明还提供了R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚的药物上可接受盐。
在实施本发明中，药物上可接受盐包括甲磺酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、乙磺酸盐(esylate)、对-甲苯磺酸盐、苯甲酸盐、乙酸盐、磷酸盐和硫酸盐，但不限于这些。
在一个实例中，盐选自R(+)-N-炔丙基-l-氨基二氢化茚甲磺酸盐、R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚乙磺酸盐和R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚硫酸盐。
正如下述实验实施例所证明的，此甲磺酸盐对热降解高度稳定，且与外消旋体盐相比，显示出对MAO-B具有意想不到的高度选择性。
在制备化合物R(+)PAI的药物上可接受的酸加成盐时，可通过常规方法在合适溶剂存在下将游离碱与所需酸反应。相似地，用已知方法可将酸加成盐转化成游离盐形式。
一种制备(R)-PAI甲磺酸盐的优选方法包括：(a)向苯磺酸炔丙酯(或甲苯磺酸酯或甲磺酸酯)的甲苯溶液中加入15％氢氧化钠水溶液；(b)搅拌5小时；(c)再加入甲苯和水；(d)分离并用10％氢氧化钠洗涤有机相，然后用水稀释；(e)加入10％硫酸水溶液调节混合物pH至3.2；(f)分离水相并用10％氢氧化钠调节pH至7.3；(g)保持pH不变用甲苯萃取三次；(h)真空浓缩合并的有机相，得到黄色油状物；(i)将此油状物和L-酒石酸溶解于异丙醇中；(j)加热回流1小时；(k)冷却至室温并过滤收集沉淀；(l)从甲醇/异丙醇(1∶1)中重结晶粗的二-炔丙基氨基二氢化茚酒石酸盐得到二(R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚)酒石酸盐；(m)将此酒石酸盐和甲磺酸溶解于异丙醇中，加热回流30分钟；(n)冷却至室温，并收集沉淀的R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚。
本发明还提供了药物组合物，它包含一种治疗有效量的R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐和一种药物上可接受载体。根据本领域技术人员熟知的方法可确定“治疗有效量”的R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐。
可能用于该组合物的盐包括盐酸盐、磷酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐和硫酸盐。
这些组合物可被制备成口服给药、非肠道给药、直肠给药或透皮给药的药物。
在一个实例中，药物上可接受的载体是固体，药物组合物为片剂。治疗有效量可约为0.1mg至约100mg。治疗有效量还可以约为1mg至约10mg。
用于口服给药的合适剂型包括片剂、压缩的或包衣丸剂、糖衣丸、香囊、硬或软明胶胶囊、舌下含片、糖浆和悬浮剂。
在另一实例中，药物上可接受载体是液体，药物组合物是注射液。治疗有效量可约从0.1mg/ml至约100mg/ml。治疗有效量还可约从1mg/ml至约10mg/ml。在一实例中，给药剂量在0.5ml至1.0ml之间。
在另一实例中，载体是凝胶，药物组合物是栓剂。
本发明提供了含水溶液或非水溶液或乳液的安瓿或小瓶用于非肠道给药。提供了含有亲水性或疏水性载体的栓剂用于直肠给药。软膏剂用于表面施用，还提供了本领域已知的合适的递送系统用于透皮给药。
在优选实例中，药物上可接受的盐是甲磺酸盐。
这些组合物可单独用来治疗前述疾病，或者，例如在治疗帕金森病时可将它们用作传统L-DOPA疗法中的辅助药。
上述组合物中活性成份R-PAI的优选剂量在下述范围内。口服或栓剂制剂，每天每剂量单位0.1-100mg，优选每天每剂量单位1-10mg。注射制剂，每天每剂量单位0.1-100mg/ml，优选每天每剂量单位1-10mg/ml。
在一实例中，药物组合物还包含治疗有效量的左旋多巴。在另一实例中，药物组合物还包含有效量的脱羧酶抑制剂。
与(R)-PAI或其药物上可接受盐结合给药的脱羧酶抑制剂的量为能有效确保患者对L-DOPA的摄取。
脱羧酶抑制剂可以是L-卡别多巴。在一实例中，R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚的治疗有效量约为0.1mg至约100mg，左旋多巴的治疗有效量约为50mg至约250mg，L-卡别多巴的有效量为10mg至约25mg。
脱羧酶抑制剂也可以是羟苄丝肼。在一实例中，R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚的治疗有效量约为0.1mg至约100mg，左旋多巴的治疗有效量约为50mg至约200mg，羟苄丝肼的有效量约为12.5mg至约50mg。
本发明还提供了治疗帕金森病患者的方法，包括对患者给药有效量的本发明的R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，以治疗患者的帕金森病。
结合使用(R)-PAI与其它药物如多巴胺激动剂、溴麦角环肽、硫丙麦角林、麦角乙脲以及儿茶酚胺氧化酶甲基转移酶抑制剂来治疗帕金森病的方法也属于本发明范围。
在优选实例中，药物上可接受盐是甲磺酸盐。
给药可包括口服给药、直肠给药、透皮给药或非肠道给药。
在一实例中，本发明方法进一步包括对患者给药治疗有效量的左旋多巴。在另一实例中，本发明方法进一步包括对患者给药有效量的脱羧酶抑制剂。
脱羧酶抑制剂可以是L-卡别多巴。或者，脱羧酶抑制剂可以是羟苄丝肼。
本发明还提供了治疗患者记忆紊乱的方法，它包括对患者给药有效量的本发明R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，以治疗患者记忆紊乱。
本发明还提供了治疗患者痴呆的方法，它包括对患者给药有效量的本发明的R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，以治疗患者痴呆。在一实例中，痴呆为早老性(DAT)。
本发明还提供了治疗患者抑郁症的方法，它包括对患者给药有效量的本发明的R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，给药量能有效治疗患者的抑郁症。
本发明还提供了治疗患者机能亢进综合征的方法，它包括对患者给药有效量的本发明R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，以治疗患者的机能亢进综合征。
给药可包括口服给药、直肠给药或非肠道给药。
本发明还提供了治疗患者情感性疾病的方法，它包括对患者给药有效量的本发明R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，以治疗患者的情感性疾病。
本发明还提供了治疗患者神经变性疾病的方法，它包括对患者给药有效量的本发明的R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，给药量能有效治疗患者的神经变性疾病。
本发明还提供了治疗患者神经中毒性损伤的方法，它包括对患者给药有效量的本发明R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，以治疗患者的神经中毒性损伤。
本发明还提供了治疗患者脑缺血的方法，它包括对患者给药有效量的本发明R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，以治疗患者的脑缺血。
本发明提供了治疗患者脑缺血或中风的方法，它包括对患者给药有效量的R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，以治疗患者的脑缺血或中风。
在用于治疗脑缺血或中风的方法实例中，R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚的药物上可接受盐选自：甲磺酸盐、乙磺酸盐、硫酸盐和盐酸盐。优选药物上可接受盐为R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚的甲磺酸盐。
使用本领域技术人员已知技术如滴定可以确定有效量。在本发明一实例中，有效量为每kg患者体重约0.5mg至约2.5mg。利用本领域已知技术给药R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐。例如，可静脉内、口服、直肠、透皮或非肠道给药。
患病主体优选是哺乳动物，如狗、猫、小鼠、大鼠、家兔、猪、马、山羊、绵羊、牛、猿或猴。在一具体实例中患者是人。
在本发明一实例中，有效量为每天约0.01mg至50.0mg。在一更具体实例中，有效量为每天0.1至10.0mg。
在上述方法一实例中，脑缺血面积被减少了约35％。
本发明还提供了治疗患者头损伤的方法，它包括对患者给药有效量的本发明的R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，以治疗患者脑损伤。
本发明还提供了治疗患者脊柱损伤的方法，它包括对患者给药有效量的本发明R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，以治疗患者的脊柱损伤。
本发明还提供了治疗患者神经损伤的方法，它包括对患者给药有效量的R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，以治疗患者神经损伤。
在头损伤、脊柱损伤或神经损伤的治疗中，R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚的药物上可接受盐选自：甲磺酸盐、乙磺酸盐、硫酸盐和盐酸盐。优选药物上可接受盐是R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚的甲磺酸盐。
使用本领域已知技术如滴定法可确定有效量。在本发明一实例中，有效量为每kg患者体重约0.5mg至约2.5mg。使用本领域已知技术给药R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐。例如可静脉内、口服、直肠、透皮或非肠道给药。
患者优选为哺乳动物，如狗、猫、小鼠、大鼠、家兔、猪、马、山羊、绵羊、牛、猿或猴。在一具体实例中患者为人。
在本发明一实例中，有效量为每天约0.01mg至50.0mg，在一更具体实例中，有效量为每天0.1mg至10.0mg。
本发明还提供了治疗患者精神分裂症的方法，它包括对患者给药有效量的本发明R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，以治疗患者的精神分裂症。
本发明还提供了治疗患者注意力缺乏疾病的方法，它包括对患者给药有效量的本发明R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，以治疗患者注意力缺乏疾病。
本发明还提供了治疗患者多发性硬化的方法，它包括对患者给药有效量的本发明R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，以治疗患者多发性硬化。
本发明还提供了预防患者神经损伤的方法，它包括对患者给药有效量的本发明R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，以预防患者的神经损伤。
在一实例中，神经损伤为结构性神经损伤。在另一实例中，结构性神经损伤为视神经损伤。
本发明还提供了治疗患者瘾物脱瘾综合征的方法，它包括对患者给药有效量的本发明R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受盐，以治疗患者脱瘾综合征。
这里使用的术语“脱瘾综合征”指身体和/或心理综合征，包括药物瘾、抑郁、易怒、无反应性、无运动力(amotivation)、食欲改变、恶心、颤抖和睡眠不规律。
这里使用的术语“瘾物”包括：如(a)上瘾的鸦片制剂如鸦片、海洛因和吗啡，(b)精神兴奋剂如可卡因、苯异丙胺和去氧麻黄碱，(c)酒精，(d)尼古丁，(e)巴比妥酸盐和(f)麻醉剂如芬太尼、可待因、苯乙哌啶和二甲基吗啡。
在一实例中，瘾物是可卡因。在另一实例中瘾物是酒精。
本发明还提供了制备R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚的方法，它包括在有机碱或无机碱存在下将R(-)-氨基二氢化茚与炔丙基溴或炔丙基氯接触，以形成R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚，分离由此形成的R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚。
本发明还提供了制备外消旋N-炔丙基-1-氨基二氢化茚的方法，它包括在有机碱或无机碱存在下，将外消旋1-氨基二氢化茚与炔丙基溴或炔丙基氯接触，以形成外消旋N-炔丙基-1-氨基二氢化茚，分离由此形成的外消旋N-炔丙基-1-氨基二氢化茚。
最后，本发明提供了制备R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚的盐的方法，它包括将外消旋N-炔丙基-1-氨基二氢化茚与光学活性酸接触，以形成两个非对映的N-炔丙基-1-氨基二氢化茚盐，从由此形成的非对映N-炔丙基-1-氨基二氢化茚盐中分离出R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚盐。
在一实例中，分离包括使用分级结晶法分离。
下面给出实验细节用来帮助理解本发明，而且不以任何方式限制也不应被解释为限制后面权利要求书中所描述的本发明范围。
实验详述实施例1
外消旋N-炔丙基-1-氨基二氢化茚盐酸盐
将10.0g外消旋的1-氨基二氢化茚和10.4g碳酸钾加入至75ml乙腈中。将所得悬浮液加热至60℃，并滴加4.5g炔丙基氯。
将该混合物在60℃搅拌16小时，然后真空蒸馏除去大多数挥发性物质。残余物在10％氢氧化钠水溶液和二氯甲烷之间分配。
干燥有机相，蒸馏除去溶剂。残余物在硅胶上进行快速色谱分离，用40％乙酸乙酯/60％己烷洗脱。含标题化合物的级分作为游离碱被合并，并用乙醚置换洗脱液。用气体HCl处理该乙醚溶液，抽滤分离所形成沉淀物并从异丙醇中重结晶，得到7.3g标题化合物，熔点m.p.182-4℃。
色谱和光谱数据与1970年5月19日授权的美国专利No.3,513,244中数据一致，实际样品数据如下：NMR δ(CDCl3)：2.45(2H，m)，2.60(1H，t)，2.90(1H，m)，3.45(1H，m)，3.70(2H，d)，4.95(1H，t)，7.5(4H，m)ppm。实施例2
S-(-)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚盐酸盐
通过在Chiracel OJ(三[对-甲基苯甲酸]纤维素)制备型HPLC柱上拆分实施例1游离碱的外消旋混合物，用10％异丙醇/90％己烷洗脱，并收集第一洗脱主峰，分离游离碱形式的标题化合物。将得到的油状物以含HCl气体的油状物的10％乙醚溶液处理，使其转化为标题化合物(盐酸盐)，抽滤收集所得沉淀物。[α]D-29.2°(1％，乙醇)，m.p.182-184℃。其它色谱和光谱性质与实施例1的盐酸盐相同。实施例3
R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚盐酸盐
按上述实施例2的方法制备标题化合物，除了从制备型HPLC上收集第2洗脱峰：[α]D+29.1°(0.8％，乙醇)，m.p.179-181℃。其它色谱和光谱性质与实施例1的盐酸盐相同。实施例4
R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚盐酸盐
12.4g R-(-)-1-氨基二氢化茚和12.9g碳酸钾被加至95ml乙腈中。将所得悬浮液加热至60℃，并滴加5.6g炔丙基氯。将该混合物于60℃搅拌16小时，然后真空蒸馏除去多数挥发性物质。将残余物在10％氢氧化钠水溶液和二氯甲烷之间分配。
干燥有机相，真空除去溶剂。将残余物在硅胶上进行快速色谱分离，用40％乙酸乙酯/60％己烷洗脱。将含标题化合物游离碱的级分合并，并用乙醚置换溶剂。用气体HCl处理该乙醚溶液，抽滤分离出所得沉淀物，并从异丙醇重结晶，得到6.8g标题化合物，m.p.183-185℃，[α]D+30.9°(2％乙醇)。光谱性质与实施例1化合物的相同。实施例5
S-(-)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚盐酸盐
按实施例4的方法制备标题化合物，除了用S-(+)-1-氨基二氢化茚作起始原料。产物给出：[α]D-30.3(2％乙醇)，m.p.183-5℃。光谱性质与实施例1化合物的性质相同。实施例6A
二(R-(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚)L-酒石酸盐
向酒石酸(4.4g)的48ml沸腾的甲醇溶液中加入R-(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚游离碱(5.0g)的甲醇(48ml)溶液。该溶液被加热至回流，并在20分钟内加入284ml叔-丁基甲基醚。再将混合物加热30分钟，冷却，抽滤分离出所得沉淀物，得到6.7g标题化合物：m.p.175-177℃；[α]D(1.5，H2O)＝+34.3；元素分析C28H32O6N2计算值：C，68.26，H，6.56，N，5.69。实测值：C，68.76，H，6.57，N，5.61。实施例6B
R-(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚甲磺酸盐
(a)在20℃向苯磺酸炔丙酯(78.4g)溶液和外消旋氨基二氢化茚(63.2g)的甲苯(240ml)溶液中滴加15％的氢氧化钠水溶液(108ml)。搅拌5小时后，在搅拌下，加入甲苯(80ml)和水(200ml)。分离出有机相，并用10％氢氧化钠水溶液洗涤，然后用水稀释。通过加入10％硫酸水溶液将此混合物pH调至3.2。分离出水相，并用10％氢氧化钠调节pH至7.3，保持pH不变时用甲苯萃取三次。真空浓缩合并的有机相，得到40.7g黄色油状物。
(b)将上述粗的外消旋炔丙基氨基二氢化茚和L-酒石酸(10g)溶解于异丙醇中(1L)，并加热至回流1小时。然后搅拌下将该反应冷却至室温，过滤收集沉淀物。从1L 1∶1甲醇/异丙醇中重结晶粗的二炔丙基氨基二氢化茚酒石酸盐，得到二(R-(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚)-L-酒石酸盐，其物理性质和光学性质与实施例6A化合物的相同。
(c)将二(R-(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚)酒石酸盐(15g)和甲磺酸(6g)的异丙醇(150ml)溶液加热至回流30分钟。将此反应冷却至室温，抽滤分离出所得沉淀物，得到标题化合物(11.1g)，m.p.157℃，[α]D＝22°。实施例7
R-(+)-N-甲基-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚盐酸盐
将实施例4中游离碱形式的R-(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚(1.2g)、碳酸钾(0.97g)和碘代甲烷(1g)加到15ml丙酮中，将所得悬浮液在N2下加热回流8小时。然后，减压除去挥发性物质，将残余物在10％氢氧化钠水溶液(30ml)和二氯甲烷(30ml)之间进行分配。干燥有机相，真空除去溶剂。残余物在硅胶上进行快速色谱分离，用40％乙酸乙酯/60％己烷洗脱。将含标题化合物游离碱的级分合并，并用乙醚置换溶剂。用气体HCl处理此乙醚溶液。真空除去挥发性物质，残余物从异丙醇中重结晶，得到400mg为白色结晶固体的标题化合物，m.p.134-136℃，[α]D+3 1.40(乙醇)。NMR δ(CDCl3)：2.55(2H，m)；2.7(1H，br.s)；2.8(3H，s)；3.0(1H，m)；3.4(1H，m)；3.9(2H，br.s)；5.05(1H，m)；7.7(4H，m)ppm。实施例8
S-(-)-N-甲基-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚盐酸盐
按上述实施例7的方法制备标题化合物，除了使用实施例5的S-(-)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚(游离碱)为起始原料。除了[α]D-34.9℃(乙醇)外，标题化合物的所有物理性质和光谱性质与实施例7中的相同。实施例9
片剂组合物
N-炔丙基-1(R)-氨基二氢化茚盐酸盐    7.81mg*
预胶凝的淀粉NF                      47.0mg
水合乳糖NF                          66.0mg
微晶纤维素NF                        20.0mg
羟基乙酸淀粉钠NF                    2.99mg
滑石USP                             1.5mg
硬脂酸镁NF                          0.7mg
*相当于5.0mg的N-炔丙基氨基二氢化茚碱。实施例10
片剂组合物
N-炔丙基-1(R)-氨基二氢化茚盐酸盐    1.56mg*
水合乳糖                            50.0mg
预胶凝的淀粉                        36.0mg
微晶纤维素                          14.0mg
羟基乙酸淀粉钠                      2.14mg
滑石USP                             1.0mg
硬脂酸镁NF                          0.5mg
*相当于1.0mg的N-炔丙基氨基二氢化茚碱。实施例11
胶囊组合物
N-炔丙基-1(R)-氨基二氢化茚盐酸盐    5.0mg
预胶凝的淀粉                        10.0mg
淀粉                                44.0mg
微晶纤维素                          25.0mg
乙基纤维素                          1.0mg
滑石                                1.5mg
加入成粒所需的净化水。实施例12
注射剂组合物
N-炔丙基-1(R)-氨基二氢化茚盐酸盐    5.0mg
无水葡萄糖                          44.0mg
加HCl至pH5
根据需要加入净化水至1ml。实施例13
注射剂组合物
N-炔丙基-1(R)-氨基二氢化茚盐酸盐    1.0mg
氯化钠                              8.9mg
加入HCl至pH5
根据需要加入净化水至1ml。实施例14
注射剂组合物
N-炔丙基-1(R)-氨基二氢化茚盐酸盐    2.0mg
氯化钠                              8.9mg
加入HCl至pH5
根据需要加入净化水至1ml。实施例15
糖浆组合物
N-炔丙基-1(R)-氨基二氢化茚盐酸盐    5.0mg
蔗糖                                2250.0mg
糖精钠                              5.0mg
羟苯甲酸甲酯                        6.0mg
对羟苯甲酸丙酯                      1.0mg
香料                                20.0mg
甘油USP                             500mg
乙醇95％ USP                        200mg
根据需要加净化水至5.0ml。实施例16
含片
N-炔丙基-1(R)-氨基二氢化茚盐酸盐    2.5mg
微晶纤维素                          20.0mg
水合乳糖                            5.0mg
预胶凝的淀粉                        3.0mg
聚乙烯吡咯烷酮                      0.3mg
着色剂                              适量
香料                                适量
甜味剂                              适量
滑石                                0.3mg
将赋形剂与活性成份混合，并与聚乙烯吡咯烷酮的乙醇溶液一起成粒。干燥称重后，与滑石粉混合并压片。实施例17
PAI含片
N-炔丙基-1(R)-氨基二氢化茚盐酸盐    5.0mg
微晶纤维素                          15.0mg
预胶凝的淀粉                        12.0mg
乙基纤维素                          0.3mg
滑石                                0.3mg
加入所需净化水用于成粒。实施例18
片剂组合物
N-炔丙基-1(R)-氨基二氢化茚盐酸盐    5.0mg
左旋多巴                            100.0mg
肼甲多巴                            25.0mg
预胶凝的淀粉                        24.0mg
淀粉                                40.0mg
微晶纤维素                          49.5mg
Col.D&C黄No.10                      0.5mg
Col.D&C黄No.6                       0.02mg
根据需要加入醇USP，用于成粒。实施例19
片剂组合物
N-炔丙基-1(R)-氨基二氢化茚甲磺酸盐  7.81mg*
预胶凝的淀粉NF                      47.0mg
水合乳糖NF                          66.0mg
微晶纤维素NF                        20.0mg
羟基乙酸淀粉钠NF                    2.99mg
滑石USP                             1.5mg
硬脂酸镁NF                          0.7mg
*相当于5.0mg的N-炔丙基氨基二氢化茚碱。实施例20
片剂组合物
N-炔丙基-1(R)-氨基二氢化茚甲磺酸盐    1.56mg*
水合乳糖                              50.0mg
预胶凝的淀粉                          36.0mg
微晶纤维素                            14.0mg
羟基乙酸淀粉钠                        2.14mg
滑石USP                               1.0mg
硬脂酸镁NF                            0.5mg
*相当于1.0mg N-炔丙基氨基二氢化茚碱。实施例21
胶囊组合物
N-炔丙基-1(R)-氨基二氢化茚甲磺酸盐    5.0mg
预胶凝的淀粉                          10.0mg
淀粉                                  44.0mg
微晶纤维素                            25.0mg
乙基纤维素                            1.0mg
滑石                                  1.5mg
根据成粒需要加入净化水。
下面的实施例和附表、附图涉及本发明所进行的生物实验。实施例22
体外MAO活性的抑制
实验方案
MAO酶源是0.3M蔗糖中的大鼠大脑匀浆物，将其在600g离心15分钟。用0.05M磷酸缓冲液将上清液适当稀释，并与下列化合物的稀释溶液：R(+)-PAI、S-(-)-PAI和外消旋PAI，于37℃预温育20分钟。然后加入14C标记的底物(2-苯乙胺，此后写为PEA；5-羟色胺，此后写为5-HT)，再继续温育20分钟(PEA)或30-45分钟(5-HT)。所用底物浓度为50μM(PEA)和1mM(5-HT)。对于PEA，选择酶浓度，使得反应过程中不多于10％的底物被代谢。然后加入反苯环丙胺(最终浓度为1mM)使反应停止，温育物通过一个缓冲至pH 6.3的小Amberlite  CG-50柱过滤。用1.5ml水洗涤柱子，合并洗脱液，通过液体闪烁光谱测定该物质放射性。由于胺底物被全部保留在柱子上，洗脱液中放射性表示由于MAO活性形成的中性和酸性代谢物的产生。样品中MAO活性被表示为不存在抑制剂的对照样活性减去合适的空白值后的百分比。使用PEA作底物测定的活性是MAO-B的活性，使用5-HT测定的是MAO-A。
结果
体外单独测试R(+)-PAI、S(-)-PAI和外消旋PAI的抑制活性，典型的实验结果示于图1和图2。将整个实验重复三次。从抑制曲线计算出对底物代谢产生50％抑制作用时抑制剂浓度(IC50)，并示于表1B中。从这些数据可见：
(a)抑制MAP-B时，R(+)-PAI是外消旋体活性的2倍；
(b)R(+)-PAI对MAO-B的抑制活性比对MAO-A高29倍；
(c)抑制MAO-B时S(-)-PAI的活性仅是R(+)-PAI的1/6,800，在MAO-B和MAO-A间几乎未显示出什么选择性或没有选择性。
               表1A
外消旋PAI及其R(+)和S(-)对映体在大鼠脑匀浆中
体外抑制MAO-A和MAO-B的IC-50(nM)值
                  IC-50(nM)
       MAO-A                      MAO-BS(-)PAI   R(+)PAI  外消旋体 S(-)PAI  R(+)PAI  外消旋体26000      73       140     17000     2.5       5
用R(+)和S(-)MAPI(N-甲基-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚)作同样的实验，结果示于表1B。MPAI的每种对映体在抑制MAO-A和MAO-B时的选择性均低于R(+)PAI。并且，R(+)-MPAI在抑制MAO-B时活性仅为S(-)-MPAI活性的5倍，相反，在此项分析测定中R(+)-PAI活性约是S(-)-PAI活性的7000倍。
                  表1B
MPAI的R(+)和S(-)对映体在大鼠脑匀浆中体
外抑制MAO-A和MAO-B的IC-50(nM)
               IC-50(nM)
          MAO-A               MAO-B化合物：S(-)MPAI  R(+)MPAI  S(-)MPAI  R(+)MPAI
       70        3         50        10
还用验尸后6小时得到的人大脑皮层组织按上述方法处理，进行了一些实验。这项实验结果示于图3，其中R(+)-PAI、S(-)-PAI和外消旋体PAI如此处所定义。实施例23
体内MAO活性的抑制：急性处理
实验方案
用PAI的一种对映体或外消旋体形式经腹膜内注射(ip)或口腔管饲(po)处理体重250±20g的大鼠(雄性Sprague-Dawley衍生)，1小时或2小时后分别断头。每三只大鼠一组用于抑制剂每种剂量水平，使用上述通用技术确定脑和肝中MAO活性。用Folin-Lowry法确定每个温育中的蛋白量，计算酶活性为温育每小时每mg蛋白所代谢的底物nmol数。经抑制剂处理的动物组织中的MAO活性被表示为对照动物组中酶活性的百分比，其中对照动物组已被给药载体(口腔给药时为水，腹膜内注射时为0.9％盐水)并按上述方法处死。
结果
所用的抑制剂剂量水平均未产生任何明显的行为改变。结果示于图4至11。腹膜内给药后，化合物R(+)PAI在剂量为0.5mg/kg时对脑MAO-B活性产生了90％的抑制作用。同样剂量下仅对MAO-A活性产生20％的抑制作用。口服给药时，同样剂量的R(+)PAI对MAO-B产生80％的抑制，对MAO-A没有明显抑制作用。观察到对肝MAO抑制作用与脑中MAO的结果基本相似。从抑制作用曲线计算出对MAO-A和MAO-B产生50％抑制作用时的剂量(IC-50)，并示于表2。这些数据表明：(a)在大鼠体内仍保持R(+)PAI对MAO的抑制活性；(b)在体内仍保持R(+)PAI对MAO-B的选择性抑制作用，对MAO-A的情况相反；(c)在体内仍保持(+)对映体比(-)-对映体高得多的活性；(d)口服给药后化合物被有效吸收；和(e)化合物有效地穿过血脑屏障，并有效抑制脑MAO。在抑制MAO-B时R(+)-PAI的活性约是外消旋体化合物的2倍，这一事实是S(-)-PAI抑制MAO-B时相当低活性的反映。
                 表2
在大鼠腹膜内(I.P.)注射或口服给药(P.O.)之后，
R(+)PAI，S(-)PAI或外消旋-PAI抑制MAO-A
        和MAO-B的IC-50值(mg/kg)IC-50(mg/kg)MAO-A                               MAO-B化合物：S(-)PAI  R(+)PAI  外消旋体  S(-)PAI  R(+)PAI  外消旋体I.P.脑    ＞10     1.2      2.5       ＞10    0.07      0.22I.P.肝    ＞10     5        5         ＞10    0.06      0.11P.O.脑    ＞10     ＞5      ＞5       ＞10    0.17      0.29P.0.肝    ＞10     ＞5      ＞5       ＞10    0.05      0.09(Rac＝外消旋PAI)实施例24
体内MAO活性的抑制：慢性处理
实验方案
用R(+)PAI或外消旋混合物在3个剂量水平(0.05、0.1和0.5mg/kg)口服给药大鼠(按实施例23中所述方法，每一剂量水平4只动物)进行处理，每天一剂，给药21天，最后一次给药后2小时断头。根据实施例23所述方法确定脑和肝中MAO-A和B型的活性。
结果
化合物R(+)PAI日剂量为0.1mg/kg时产生高度选择性抑制作用，对脑MAO-B的抑制作用高于80％，对脑MAO-A的抑制作用为20％或更低。日剂量较高即为0.5mg/kg时，所抑制的MAO-A仍低于50％(图12和13)。肝MAO情况也显示出类似程度的选择性抑制作用(图14和15)。再次表明化合物R(+)PAI比外消旋体混合物更有效，约是外消旋混合物的2倍。在脑MAO情况中，R(+)PAI对MAO-B抑制作用的选择性程度优于外消旋体混合物。
这些结果表明，用这些化合物慢性处理后仍可保持对MAO-B抑制作用的选择性。当与其它不可逆抑制剂一起使用时，慢性处理对酶的抑制程度比单一剂量给药后要高。化合物R(+)PAI表明比外消旋混合物对脑MAO-B的抑制作用选择性程度更高。实施例25
MAO抑制的不可逆性
实验方案
通过腹膜内注射对大鼠给药单一剂量化合物R(+)PAI(1mg/kg)，每四只大鼠一组，且2、6、18、24、48、72小时后杀死动物。根据上述方法确定整个脑组织中的MAO-B活性。
结果
结果示于图16。注射后6小时获得对MAO-B的最大抑制作用。注射后72小时MAO活性仅恢复至对照活性的30％。这项实验证明了R(+)PAI对MAO抑制作用的不可逆性。实施例26
清醒大鼠中酪胺加压效应的强化作用
实验方案
用戊巴比妥(30mg/kg)和水合氯醛(120mg/kg)腹膜内注射使大鼠麻醉。在左颈动脉和颈静脉插有细的多线管(动脉)或与聚乙烯管相连的细的硅橡胶管(静脉)，在皮下将管子末端拉至脖后的一个锚固点。管中充满肝素化盐水溶液，并用一根细钢丝塞住。用20mg氯霉素肌内注射处理动物，并使它们手术后恢复一昼夜。第二天，将大鼠放在允许自由活动的高高围起的容器中。通过一根100cm长充满盐水的精制聚乙烯管将动脉导管与压力换能器相连，通过一根相似长度的管子将静脉导管与1ml注射器相连，管子和注射器中均装有盐酸酪胺的盐水溶液(1mg/ml)。平衡30至40分钟后，进行酪胺注射(50或100μg)，记录血压响应。注射至少保持15分钟的间隔，每次注射待血压恢复至对照值后进行。确定对照增压响应，然后再腹膜内注射一种药物，在后4小时内重复酪胺响应。评价血压响应曲线下的面积，并用控制期(controlperiod)获得的3至4个值的平均值确定出处理后与处理前面积的比值以及注射化合物后1小时与3小时的面积之比。
结果
结果示于表3。化合物R(+)PAI在剂量为1mg/kg(此剂量引起脑和肝中MAO-B的完全抑制，MAO-A在这些组织中有40至50％抑制)时没有明显增强酪胺加压响应。在R(+)PAI剂量较高时即5mg/kg(此剂量能引起脑和外周更广泛的MAO-A抑制)，产生对酪胺加压响应明显的增强作用，这与相同剂量司立吉林产生的程度相似，小于氯吉灵产生的效果(在该剂量它能抑制多于85％的肝MAO-A活性)。
                 表3
清醒大鼠中MAO抑制剂对酪胺加压效应的强化作用抑制剂      剂量   大鼠只数  加压响应曲线下     SEM*
       (mg/kg)   (n)     面积之比；后/前盐水                  12          1.25          0.28氯吉灵       2        6           10.39         2.13(-)司立吉林  1        2           1.15(+)司立吉林  5        3           2.36          0.16R(+)PAI      1        3           1.38          0.7R(-)PAI      5        3           3.49          0.98*SEM＝平均标准偏差
从这项实验中可得出以下结论：化合物R(+)PAI在能有效抑制MAO-B的剂量时不增强酪胺的加压效应。实施例27
R(+)PAI对MPTP-诱导的多巴胺能毒性的抑制
1-甲基-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)是一种神经毒素，其损害一些包括小鼠在内的哺乳动物物种的黑质纹状体多巴胺能神经，并导致人和灵长类动物的帕金森综合征。在其神经毒性机理中，关键引发步骤包括MPTP转变为其毒性代谢物1-甲基-4-苯基吡啶鎓离子(MPP+)。该反应由酶MAO-B催化，大概发生于多巴胺能神经外，主要是在神经胶质中。已知MPTP即是MAO-B的底物又是它的不可逆抑制剂。用MAO-B抑制剂如司立吉林或巴吉林预处理实验动物可防止和预防MPTP诱导的对黑质纹状体神经的损害，因为MPTP向MPP+的氧化转化被阻断。帕金森病中黑质纹状体的进行性变性可能是由于暴露于来自环境的外生MPTP类神经毒素的结果。在这种情况下，还有一个明显的现象就是从帕金森病极早期就开始使用MAO-B抑制剂长久治疗，以希望它会中和这种还属假定的MPTP-毒素的损害效应，并由此阻止或减缓疾病的发展。目前判定成功MAO-B抑制剂药物是通过体内对MPTP-诱发的黑质纹状体多巴胺能神经损害的阻断能力确定的。因此，测试了PAI(-)和(+)对映体在抑制或缓和小鼠中MPTP-诱发的纹状体多巴胺缺失中的效能。
实验方案
对雄性C57黑色小鼠(20-25g重)(a)注射MPTP·HCl(溶于蒸馏水中30mg/kg，皮下注射)，或单独注射载体，或预处理后1小时注射PAI的(-)或(+)异构体(2.5mg/kg，腹膜内注射)或司立吉林(5mg/kg，腹膜内注射)，(b)5天后断头。移出脑，并在冰冷玻片上解剖纹状体(corpora striata)，于干冰中冷冻。在0.1M高氯酸中使纹状体组织匀浆化，使用带电化学检测的HPLC来分析脱蛋白等分试样中的多巴胺和其主要代谢物3，4-二羟基-苯乙酸(DOPAC)，其中等分试样含二羟基苄胺作为内标。
结果
表4示出此项实验的结果。单独用MPTP处理时纹状体多巴胺(DA)和DOPAC显著缺失。用PAI(-)和(+)对映体处理或用(-)司立吉林处理不影响纹状体DA浓度。用PAI(-)异构体预处理不影响纹状体中MPTP-诱导的DA和DOPAC水平。在MPTP之前使用PAI(+)-异构体能完全消除由毒素产生的纹状体DA和DOPAC水平的减少。在剂量为2.5mg/kg时，(+)PAI的保护效应与(-)司立吉林(5mg/kg)是等效的。
                   表4
小鼠中体内通过MAO-B抑制剂PAI的(-)和(+)对映体
预处理对MPTP诱导的纹状体DA和DOPAC缺失产生的效应
                   DA         DOPAC
                            (ng/mg蛋白)对照                162.8±7.2   8.4±0.5MPTP                53.1±6.2    3.2±0.3(-)PAI              174.0±4.8   7.5±0.2(-)PAI+MPTP         53.4±6.9    7.0±0.6(+)PAI              185.0±6.9   3.3±0.3(+)PAI+MPTP         177.8±14.4  6.0±0.3(-)司立吉林         170.6±7.1   5.6±0.3(-)司立吉林+MPTP    197.0±8.0   6.4±0.5
上述DA和DOPAC的值是以平均值±S.E.M.来表示的，每组中大鼠数目n＝7-11。
这些结果表明，R(+)PAI是极好的MAO-B体内抑制剂，对于治疗帕金森病具有很大潜力。
虽然参照前述实施例和附表及附图已对本发明进行了描述，但本发明并不限于此。对本发明的各种修改和应用是可能的。例如，(R)-PAI可以以协同作用方式与α-生育酚(维它命E衍生物)联合用于帕金森病的治疗。实施例28
PAI对映体对苯异丙胺诱发的衰老大鼠刻板症行为的效应
已知苯异丙胺通过外生多巴胺的运动诱导刻板症行为(Sulser，F.，和Sanders-Bush，E.，《(药理学年度综述》(Ann.Rev.Pharmacol.)，11，209-230(1971))。苯异丙胺不被MAO-B代谢。有效抑制剂对MAO-B的抑制作用和给药苯异丙胺能引起多巴胺的释放，多巴胺不会被受抑制的MAO-B分解。因此，在给药苯异丙胺和导致苯异丙胺效应的刻板症强化性行为的增多有效的MAO-B抑制剂后突触多巴胺会增加。根据1分钟内头侧向移动的次数评价这种行为的程度。
实验方案
在实施缺氧状态(92％ N2+8％ O2 6小时)前24小时，将测试化合物以0.5mg/kg/天的剂量放在饮用水中给药。然后，皮下注射剂量为0.5mg/kg的苯异丙胺。45分钟后计数头侧向移动次数。
结果
这些实验的结果示于表5。
                   表5
PAI异构体对苯异丙胺诱导的衰老大鼠刻板症
行为的效应(对照组和缺氧损伤组)
                    刻板症组                 药物处理行为评价对照(6)        -        87±10对照(5)       (+)PAI    127±16*对照(4)       (-)PAI    94±18缺氧损伤(5)    -        93±12缺氧损伤(6)   (+)PAI    143±6*括号中的数字为测试的动物只数。*p＜0.001相对于相应的未处理的缺氧组或未处理的对照组。
表5中结果表明，在缺氧损伤的大鼠和对照大鼠中(+)PAI均能显著强化苯异丙胺诱导的刻板症行为。(-)PAI在这方面完全无活性。这些体内行为结果确证了先前的生物化学发现，(+)PAI是脑中MAO-B的有效的抑制剂，而(-)PAI在这方面没有活性。实施例29
R(+)-PAI对改善或恢复记忆的效应
使新生大鼠短期缺氧，然后恢复正常方式生长，形成长期记忆损伤(Speiser等，《大脑行为研究》(Behav.Brain Res.)30，89-94(1988))。这种记忆损伤表现为在被动回避试验中差的行动行为。
在被动回避试验中研究了R(+)-PAI和S(-)-PAI改善或恢复记忆的效应。如果药物是有效的，那么它会增长进入暗室或暗盒的反应潜伏期，在暗室中被测大鼠已先经受过电击。最大反应潜伏期是300秒。
实验方案
将实施例27的方法使幼龄大鼠出生后缺氧。根据下面方案之一给药R(+)-PAI或S(-)-PAI。
方案A-将每种异构体以1-1.5mg/kg/天的剂量于饮用水中给哺乳母亲服用，直至第21天断奶。然后用相同剂量直接处理断奶后代20天。第40天停止处理，第60天进行试验，也就是在最后一次给药后20天进行试验。
方案B-将剂量减至0.5mg/kg/天，对哺乳母亲给药直至第21天断奶，然后直接对幼龄大鼠给药至第60天，进行试验。
被动回避试验-装置由一个亮盒子邻接一个暗盒子和一个分开两个盒子的滑动门组成。试验中，将大鼠放置于亮盒子中30秒，然后打开门。大鼠移向暗盒子时有一个潜伏期，记录此潜伏期。在大鼠进入暗盒时，关闭门，并以0.3mA电击足部3秒钟。
重复这项试验，记录从亮室进入暗室的潜伏期来确定48小时后(记忆)保留，随机最大值(arbitrary maximum)为300秒。
结果
这些实验结果示于表6。
               表6
PAI异构体对幼龄大鼠(60日龄)被动回避反应的效应方案A组          处理      电击前    电击后对照         -        49±13    201±111对照        (+)PAI    49±19    220±100(+9％)*对照        (-)PAI    48±13    192±116缺氧损伤     -        45±11    183±109缺氧损伤    (+)PAI    49+10     239±99(19％)*缺氧损伤    (-)PAI    55±27    179±123方案B组          处理      电击前    电击后对照         -        53±20    104±101对照        (+)PAI    48±11    128±119(+23％)*缺氧损伤     -        45±8     119±105缺氧损伤    (+)PAI    52+12     137±126(+15％)*缺氧损伤    (-)PAI    48±19    112±112
数字表示被测大鼠进入暗室时潜伏期的秒数，大鼠已先在暗室经受过电击。
*示出的百分数的增加是针对相应的缺氧组或对照组。
实验结果表明，(+)PAI而不是(-)PAI对缺氧损伤的大鼠和对照大鼠的记忆改善是有效的。此项试验中有活性的药物被认为具有治疗各种记忆损伤疾病、痴呆特别是早老性痴呆的潜力。实施例30
R(+)-PAI对幼龄大鼠中缺氧诱导的机能亢进综合征的效应
大鼠出生后被置于缺氧环境然后再在正常条件下生长，在10-42天时，在开放环境中显示出活动性增加(Hertshkowitz等，《大脑研究进展》(Dev.Brain Res.)，7，145-155(1983))。研究R(+)PAI和S(-)PAI对这种机能亢进综合征的效应。
实验方案
在大鼠出生后第一天使其缺氧。它们被放置于玻璃箱内暴露于100％N2中25分钟。在其胸部轻轻施加间歇性信号使它们复苏，然后返回到各自的母亲身边。对照大鼠接受同样的处理，但其中以空气代替氮气。
将R(+)-PAI或S(-)-PAI(0.5mg/kg/天)在饮用水中给药哺乳母亲，这样会通过奶汁转移给乳儿。
在6个完全计算机化的笼(28×28cm)中通过记录给定时间内交叉(Crossings)次数测量运动情况。4cm间隔处栅形红外光束的交叉引发电脉冲，其安装计数器。对第15天和20天的大鼠记录它们15分钟内的运动性。
结果
此项实验结果示于表7。
                    表7
每种对映体对缺氧诱导的机能亢进综合征的效应组           处理     15日龄大鼠       20日龄大鼠对照          -       414±192(11)     808±212(12)对照        (+)PAI    254±149(11)c    719±110(13)缺氧损伤     -        482±119(7)      858±96(9)缺氧损伤    (+)PAI    276+186(15)a     737±150(16)c缺氧损伤    (-)PAI    334±196(5)      778±232(6)
括号中的数字是测试的动物数目。
-数字为15分钟内活动笼中红外光束栅格交叉次数。
a与未进行缺氧处理的组相比，p＜0.001。
b与未进行缺氧处理的组相比，p＜0.05。
c与对照组相比，p＜0.05。
这些结果表明，用剂量0.5mg/kg的R(+)PAI给药哺乳母亲并转移到喂奶后代，这种慢性口服治疗显著改善了机能亢进综合征。因此，R(+)-PAI是能用于治疗儿童机能亢进的潜在药物。实施例31
10种PAI盐之间的稳定性差异
在选择作为治疗药物的最佳盐时，稳定性是一个重要因素。不同的盐可改变药物的物理化学和生物学特性，并可对其整个性质具有显著影响(Berge，S.M.等，《药物科学杂志》(J.Pharm.Sci.)，66，1(1977)；Gould，P.L，《国际药物学杂志》(Int.J.Pharmaceutics)33.，201(1986))。
实验
PAI盐的合成
在搅拌下向2-丙醇(Ar，BHT)中的PAI(1mol-eq)溶液中加入合适的酸(1mol-eq)的2-丙醇溶液。过滤所形成的盐，用二丙醇和乙醚洗涤，低压下干燥。产率为70至90％。有一例外，在制备PAI乙酸盐时使用乙醚作溶剂。
分析方法
使用Lichrosphere 60 RP选择B5μ125×4mm(Merck)柱、装配有设置于210nm的L-4200 UV-Vis检测器(Merck-Hitachi)的HPLC(Jasco BIP-1)和D-2500色谱积分仪(Merck-Hitachi)进行色谱分离。洗脱剂和稀释剂为80％蒸馏水/20％乙腈(HPLC级)和以氨水溶液调节至pH 2.5的0.07M高氯酸。使用流速为1ml/min，适宜的PAI盐溶液浓度为250μg/ml，并向色谱系统中注射20μl溶液。
用自动装置(Mettler FP 80)测量熔点范围，在Mettler TA 3000系统上以10℃/min的速率在应用范围内进行热解重量分析。使用饱和PAI盐水溶液上清液的合适的稀释液确定溶解度，在UVIKON 941(Kontron)UV-Vis光谱仪上测量。使用标准设备通过元素分析C.H.N.和S的测定得出盐形式(一价或二价盐)。在1％ PAI盐的水溶液中测量出pH。
结果
各种盐的特性总结于表8中。
                     表8
              PAI盐的理化性质PAI-盐      pH    溶解性    熔点范围  重量损失％  盐形式
              mg/ml       (℃)酒石酸盐    5.5    33      176.2-177.3    LT0.1   二价492甲磺酸盐    4.3    635     156.8-157.6    0.1     一价267马来酸盐    4.0  NLT1000   87.2-87.8      0.1     一价287硫酸盐      3.9    485     159.4-161.1    3.2     二价440氯化物      4.2    238     177.0-180.0    LT0.5   一价207甲苯磺酸盐  4.4   60-70    129.3-129.9    LT0.1   一价343富马酸盐    3.5    95      125.4-126.2    0.2     一价287磷酸盐      7.0  NLT720    109.5-110.4    n.a.    n.a.n.a.乙基磺酸盐  2.4  NLT300    n.a.           n.a.    一价279乙酸盐      6.1  NLT720    69.2-69.7      0.4     一价231n.a.＝没有得到
在几组加速条件下进行对比稳定性研究：(I)于80℃加热72、96或144个小时；(II)在异丙醇中回流30小时。用HPLC测量产生的降低产物并用TLC进行确证。结果示于表9中，其中相对保留时间(相对于PAI峰；RRT)为峰面积相对于总积分峰面积的百分比。
                 表9
短期条件下PAI盐中产生的降解产物盐           80C/72h    80C/144h   异丙醇中回流/30h
      RRTa  ％b  RRT   ％    RRT     ％硫酸盐    NDc   ND    ND    ND    0.47    0.22
                               0.60    0.72磷酸盐    0.60   0.22  0.60  0.57  0.60    2.62
                               0.74    0.21
                               1.84    0.20
                               1.98    0.73氯化物    ND     ND    ND    ND    2.23    0.71甲磺酸盐  ND     ND    ND    ND    0.60    0.08马来酸盐  0.60   0.41  n.a.        0.60    2.17
      1.27   0.50              0.65    1.35
      1.48   0.33              1.29    0.59
      1.81   0.10              1.42    1.30
      3.07   1.44              1.50    0.16
      4.16   0.10              1.83    0.18
      4.84   7.76              1.98    0.23
                               4.09    0.65乙酸盐    0.44   0.10  n.a.        0.60    6.74
      0.60   2.56              0.74    0.35
      0.73   0.13              1.76    0.33
      1.29   0.71              1.84    0.16
      1.55   1.06              1.99    4.17
      1.75   21.85             3.60    0.27
      1.96   3.33
      2.15   0.08
      2.32   0.15
      2.83   0.15
      3.54   1.82乙磺酸盐dND     ND    0.85   0.26 ND     ND
                   1.96   0.31定量限度＝0.08％n.a.＝未得到a相对保留时间(相对于PAI峰)b相对于总积分峰面积的面积百分比c未检测到杂质d乙磺酸盐
目测盐的颜色和形状。观察结果示于表10。
               表10
               破坏性条件下PAI盐的外观盐        80℃/72h    80℃/96h  80℃/144h 异丙醇中回流/30h硫酸盐    灰白色粉末    n.a.    灰白色粉末  棕色粉末磷酸盐    带棕色的粉末  n.a.    棕色粉末    棕色粉末氯化物    白色粉末      n.a.    白色粉末    灰白色粉末甲磺酸盐  白色粉末      n.a.    白色粉末    白色粉末马来酸盐  棕色熔化物    棕色    n.a.        棕色熔化物乙磺酸盐  带棕色的      n.a.    黑褐色      黑褐色熔化物
      熔化物                熔化物n.a.＝未得到
这些研究表明，硫酸盐、乙磺酸盐和甲磺酸盐比其它盐具有明显的优点：好的溶解性和化学稳定性。这些盐中，甲磺酸盐是优选的，因为甚至在破坏性条件下它还具有优良的稳定性。实施例32
小鼠中氟哌啶醇诱发的僵住症的逆转
对每只重25-30g雄性ICR小鼠用下列任何一种药物进行预处理：盐水，(R)-PAI甲磺酸盐或外消旋体PAI甲磺酸盐。所有药物均以腹膜内给药0.2ml。2小时后， 以6mg/kg剂量皮下注射氟哌啶醇0.1-0.2ml。给药氟哌啶醇后3小时也就是给予假设保护性药物5小时后，进行运动协调性试验。
按下面3个不同参数定量运动协调性试验和僵硬性：(a)沿80cm长水平圆木行走的能力；(b)沿80cm长竖直圆木脸朝下爬行的能力；(c)处于非自然坐姿固定不动的时间，这时小鼠腹部被迫贴住一面“墙壁”。每项测试中，与未经氟哌啶醇处理的小鼠表现完全相同者给予4分，或全部测试中总分12分。表现差者约1分至3分。评分结果示于表9A。在拮抗氟哌啶醇诱导的僵住症中各种药剂的效应示于表11。在氟哌啶醇后3小时，7.5-15mg/kg(R)-PAE甲磺酸盐显示出拮抗氟哌醇的保护作用，在7 5-10mg/kg作用后达到峰值(活动力分数≈盐水对照的94％)。外消旋的PAI甲磺酸盐在7.5-15mg/kg范围内能赋予部分保护作用，在5mg/kg时不起作用。从图17可见，无论是(R)-PAI甲磺酸盐还是外消旋体PAI的量效曲线，大于10mg/kg时剂量的上升带来效应的降低，但外消旋混合物始终效力较低。这就意谓着，外消旋PAI甲硫酸盐剂量为(R)-PAI甲硫磺盐2倍时，活性总低于(R)对映体。
大鼠中α-MpT-诱发的运动减少症的逆转
药物α-MpT被认为抑制从酪氨酸形成L-DOPA，由此抑制多巴胺自身的形成。CNS多巴胺的缺乏表现为活动减退。按所示剂量用盐水、(R)-PAI甲磺酸盐或Rac PAI甲磺酸盐预处理6月龄雄性Wistar大鼠(来自Harlan Orkack，UK)。2小时后对它们腹膜内注射剂量为100mg/kg的α-MpT 0.3-0.5ml。对照组注射盐水。随后，在计算机化活动笼中记录运动性10小时。结果示于表12和图18。在2mg/kg时，(R)-PAI使运动水平恢复至盐水处理大鼠的约90％，但Rac PAI甲磺酸盐是无活性的。在任何一种情况中，量效曲线都呈钟形，表明在剂量大于2-5mg/kg峰值时随剂量增加效应下降。5mg/kg的Rac PAI甲磺酸盐不能获得可与2mg/kg的(R)-PAI甲磺酸盐可比的活动水平。
从这些测定结果可见，在使氟哌啶醇处理的小鼠和α-Mpt处理的大鼠恢复正常运动时(R)-PAI甲磺酸盐和Rac PAI甲磺酸盐的活性曲线是不相似的。在研究的所有剂量内(R)-PAI甲磺酸盐总比相应剂量的Rac PAI甲磺酸盐有效。同样，Rac PAI甲磺酸盐的峰活性也比(R)-PAI甲磺酸盐的峰活性低。因此，给定剂量的Rac PAI甲磺酸盐效力总低于半剂量的(R)-PAI。相对于(R)-PAI甲磺盐来说加倍剂量的Rac PAI甲磺酸盐不产生等同于(R)-PAI甲磺盐的效应。
从药理学上讲，不能认为Rac PAI甲磺酸盐由50％作为活性成分的(R)-PAI甲磺盐和50％作为稀释剂的惰性成分组成。Rac PAI甲磺酸盐中(S)-PAI的存在对(R)-PAI的活性有副作用，使得效力降低多于2倍。这种降低可能是由于(S)-PAI对行为参数的直接副作用。
                  表11
    用(R)-PAI甲磺酸盐和外消旋体甲
 磺酸盐逆转小鼠中氟哌啶醇诱发的僵化症
小鼠腹膜内接受所示剂量的每种测试药物。2小时后根据本文所述接受氟哌啶醇。示出的剂量是游离碱。
           (R)-PAI甲磺酸盐        Rac PAI甲磺酸盐剂量    得分+SE       n 占对照的 得分+SE     n 占对照的mg/kg                    百分数                 百分数1.8     7.2±1        6    60    7.0±0.6    6    593.0     6.4±0.5      6    60    5.9±0.7    6    495.0     8.7±0.9*     6    73    6.4±0.4    6    537.5     11.0±0.4*** 5    92    9.4±0.8++  6    7810      11.3±0.3*** 6    94    9.2±0.6*** 6    7715      10.8±0.5*** 5    90    8.8±0.8*  6    73对照盐水    12±0         12   100单独用氟哌啶醇6.6±0.3      16   59由Student′s“t”试验相对于单独使用氟哌啶醇的统计学显著性：*p≤0.05；**p≤0.01；***p≤0.001。(R)-PAI的得分显著不同于外消旋体PAI的得分，在5mg/kg时p≤0.05；10mg/kg时p≤0.01；15mg/kg时p≤0.05。
                  表11A
氟哌啶醇诱发的小鼠僵住症及各种药物恢复效果的评分表竖直圆木：不能用四肢抓住圆木               1能抓住但下滑                     2能抓住，有时下滑，有时下爬       3能抓住，用四肢下爬               4水平圆木：不能抓住，从圆木上掉下           1能抓住，沿圆木走不能多于2步      2能抓住，沿圆木走一半长度         3能抓住，沿圆木走全长度           4面对墙壁固定不动坐姿：固定时间＞5min                   1固定时间3-5min                   2固定时间1-3min                   3固定时间0.1min                   4
当行为处于两个范围之间时如2和3之间，使用分数表示，如2.5。
                    表12
     用α-甲基-对-酪氨酸(α-MpT)于腹膜内
      100mg/kg处理的大鼠中运动活力的恢复
大鼠腹膜内接受所示剂量的测试药物。2小时后它们接受α-MpT并立即将其放置于活动笼中。根据本文所述自动记录总运动活力10小时。
               (R)-PAI甲磺酸盐                Rac PAI甲磺酸盐剂量    得分+SE           n    占对照的  得分+SE        n   占对照的mg/kg                          百分数                       百分数2       14,132**±1457   7      89      9,035±829     6    575       12,893*±1,869   7      81      10,926*±820 8    697.5     6,679±414        4      42      9,698±557     4    61对照盐水    15,862±1,424     5      100单独用α-Mpt  8,108***±810    6      51由Student′s“t”试验得统计学显著性，*p≤0.01；***p≤0.001试验药物+α-Mpt对单独使用α-MpT，单独使用α-Mpt对对照盐水在2mg/kg(R)-PAI相对于外消旋PAI的得分显著不同，p≤0.01。实施例33
大鼠封闭性头损伤后(R)-PAI甲磺酸盐的效应
方法
1.损伤诱发
使用一个校准好的降落重物装置对乙醚麻醉的雄性大鼠诱发头损伤，重物降落到处于半球冠状平面中暴露出的头颅骨上，砸在左半脑，中线旁1-2mm。
2.运动功能的评价
损伤诱发1小时后，用评价大鼠神经病学结果的一套标准对大鼠进行测试(标准由Shohami等人描述于《神经外伤杂志》(J.Neurotrauma)，10，113(1993))。这些标准指神经病严重性评分(NeurologicalSeverity Score)(NSS)，由一系列反应功能和运动功能组成。根据这些标准的缺乏项给出分数。在24小时对大鼠重新评估。
3.脑水肿评价
第二次评价运动功能(24h)之后将脑移出。取一小片组织(～20mg)称重，得湿重值(WW)。在干燥箱中于95℃干燥24h后，再称重得干重值(DW)。计算组织中水百分含量为(WW-DW)×100/WW。
4.药物治疗
将(R)-PAI甲磺酸盐溶解水中。在诱发头损伤后0、4、8、12h对大鼠腹膜内注射，剂量为0.1mg/kg。在同一时间用水处理对照大鼠。
结果
头损伤后1小时经治疗组和未治疗组的测量大鼠“临床”状态的NSS几乎相同，但是在24小时(R)-PAI甲磺酸盐治疗的大鼠中NSS明显较低(表13)。这些结果表明PAI甲磺酸盐在大鼠封闭性头损伤后对改善运动功能是有效的。
损伤后24小时，在脑半球中发现严重水肿(对照大鼠脑中含85.4％的水相对于未损伤脑组织中含78.5％)。正如其对含水量百分数的效应所证实的，PAI甲磺酸盐对减少水肿是有效的。
总之，这里报道的结果证明，(R)-PAI甲磺酸盐在模仿人神经损伤和诱发封闭头颅骨损伤的模型中具有神经保护性质。
                        表13
              NSS     ΔNSS(1h-24h)     ％脑中水的百分含量
    1h     2h
对照(n＝6)(R)-PAI甲磺酸盐(n＝6)     15.616.7     12.310.2     4.3±0.56.5±0.7*     85.4±0.482.1±0.6**
*  p＜0.05(Whitney U-试验)** p＜0.005(t-试验)实施例34
PAI甲磺酸盐在预防NMDA诱发的小脑细胞培养物细胞死亡中的效应
体外测定结果
方法：机械分离的新生大鼠小脑培养物。从6或7日龄的大鼠中无菌解剖出小脑，并将其放于含3ml滋养培养基的15ml无菌塑料锥形试管中(培养基由Dulbecco ′改性的Eagle培养基(DEME)组成，含高浓度葡萄糖(1g/l)、2mM(v/v)L-谷氨酰胺、抗菌素抗有丝分裂的混合物，并富集15％(v/v)热灭活胎牛血清)。然后，将小脑培养物通过一个无菌的13号(gauge)、10cm长的不锈钢针头20-25次后，针头上连接一个5ml注射器，其中插有45μm孔大小的尼龙筛，分离出小脑细胞。被分离的细胞在200g离心5分钟，弃去上清液，并将细胞重新悬浮于滋养培养基中。通过锥虫蓝排除试验(trypan blue exclusion)测定细胞存活力。然后将细胞以200/mm2的密度在聚L-赖氨酸涂布的表面上铺平板(至少在铺平板前1小时制备聚L赖氨酸涂布的盖玻片，将盖玻片浸泡于含15μg/ml聚L赖氨酸的灭菌蒸馏水溶液中，使用前用无菌水洗涤并干燥)，覆盖滋养培养基，并于37℃ 5％ CO2的空气中100％湿度条件下温育。培养4天后，培养基用含待测化合物的培养基置换。重复进行实验2或3次。在确定测试化合物毒性剂量-响应后，对比四个组：(I)对照组(只有滋养培养基)，(II)测试化合物(每种浓度一个小组(测试2个浓度))，(III)N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA，暴露于1mM浓度3小时)为细胞毒攻击物(Challenge)；(IV)测试化合物加上NMDA(2种浓度的测试化合物，每个浓度为一小组)，(V)测试溶剂效果的对照组(其中溶解有测试化合物)，(VI)另一组精胺(在培养基中溶解0.01μM)加NMDA的“阳性对照”组。使用相差显微镜并锥虫蓝染色24小时后评价神经细胞存活力。
结果
已确定了谷氨酸(Glu)具有神经毒性，其在几种神经疾病中表现出这种性质，这些神经疾病包括癫痫和中风，特别是在脑神经变性疾病如帕金森病、早老性痴呆和外伤性脑损伤中也表现出这种性质。Glu的毒害神经效应由结合谷氨酸受体如N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体的膜介导。
表14所示结果证明，10μM的(R)-PAI甲磺酸盐使暴露于1μMNMDA后的小脑细胞存活力增加了27％。这些体外试验结果支持实施例33和35中示出的(R)-PAI甲磺酸盐的体内效应，表明此药具有抗毒害神经浓度NMDA的神经保护性质。
                   表14
         (R)-PAI甲磺酸盐对预防NMDA-
      诱导的小脑细胞死亡的神经保护效应实验组        存活细胞 保护作用的百分数小脑培养物(毒性TD25＝30μM；TD50＝85μM；TD100＝320μM)对照             100溶剂             97NMDA             10溶剂+NMDA        10           0化合物+NMDA：1)0.01μM+″     12           22)1.00μM+″     22           123)10.00μM+″    37           27精胺+NMDA        75           65
以未治疗对照组的百分数表示的数值代表培养物实验中2组重复实验的平均值，4只缺血动物的平均值±SME。保护作用的百分数值是减去溶剂效应后测试化合物的效应。实施例35
大鼠视神经分级压碎后(R)-PAI甲磺酸盐的效应
在成年大鼠视神经压碎损伤后立即施用(R)-PAI甲磺酸盐，测定它的神经保护效应。根据代谢情况测定短期效应，电生理学方法确定长期效应。
方法
1.代谢测定
a)一般方法
测定方法由Yoles等人描述于Investigative Ophthalmology & VisualScience(眼科学及视科学研究)，33，3586-91(1992)。短期情况时，根据线粒体NADH/NAD比值监测代谢测定情况，此比值依赖于电子传递系统的活性，因此表明能量产生水平。通过对比损伤前后在应答人工瞬时缺氧损伤时NADH的水平，确定作为损伤结果，神经产生能量的能力变化。
b)表面荧光-反射光测定法
NAD与氧化形式NAD+不同，当在450nm下照射时会发荧光，根据这一事实来监测线粒体内NADH的氧化还原状态。一束挠性Y-形光纤(光导)被用于传递光至视神经并从视神经传出。在2个波长下测量发自神经的光：366nm(反射光)和450nm(荧光)。反射光的变化与由血液动态效应引起的组织吸收作用的变化有关，与视神经的移动有关，视神经的移动从属于动脉血压和神经体积的变化。通过从荧光(1∶1比率)中减去反射光(366nm)。获得校正的荧光信号，发现荧光测量足以校准NADH氧化还原状态的测定。
c)动物准备
动物的使用与利用动物进行研究的ARVO分辨法(Resolution)一致。用戊巴比通钠(50mg/kg腹膜内)麻醉重300-400g的雄性Sprague-Dawley(SPD)大鼠。动物的头被放置在头支架中，在双目手术显微镜下进行侧边眦切手术，切开角膜旁的结膜。分离出缩球肌后，钝器解剖找出视神经，长3-3.5mm的视神经暴露于眼球附近。保持硬脑膜完整并注意不要损伤神经。在视神经周围植入一个特定的光导支架，这样将光导放置于视神经表面距损伤位点1mm远。使仍处于麻醉中的动物从外科手术中恢复30分钟，然后置于缺氧环境中。使大鼠在100％ N2中呼吸2分钟达到缺氧状态，之后将其返回至空气中。为评价视神经的代谢活性，在压碎性损伤前后测量反射光和荧光强度在应答缺氧时的相对变化。
d)压碎损伤和代谢测定的实验方案
在校准的横剖式钳(cross-section forceps)的帮助下，在眼睛和光导支架之间的神经上施以相当于120g的压力30秒使之承受中度压碎性损伤。损伤之后立即对动物腹膜内注射含有(R)-PAI甲磺酸盐(2mg/kg)和不含(R)-PAI甲磺酸盐的水。为评价能量产生系统的活性，对所有动物测定损伤前、损伤后30分钟和之后间隔1小时直至4小时对2分钟缺氧的NADH应答(参见图19)。
2.电生理测定
该方法由Assia等描述于《大脑研究》，(Brain Res.)，476，205-212(1989)。优选按代谢研究中的方法进行动物准备和视神经损伤。损伤后立即对动物一次性注射含(R)-PAI甲磺酸盐(0.5mg/kg)的水或不含(R)-PAI甲磺酸盐的水。损伤并治疗后14天，切下视神经并进行电生理测定。在除去用于电生理测定的视神经之前，用70mg/kg戊巴比通使大鼠深度麻醉。从头颅骨上除去皮肤，从眼球上分离出视神经。进行次全断头术并用咬骨钳打开头颅骨。将大脑移置旁边，暴露出视神经的颅内部分。在神经水平上进行解剖，其中神经被转移至含新盐溶液的小瓶中，所述新盐溶液由NaCl(126mM)、KCl(3mM)、NaH2PO4(1.25mM)、NaHCO3(26mM)、MgSO4(2mM)、CaCl2(2mM)和D-葡萄糖(10mM)组成，并于室温下用95％ O2和5％ CO2充气。将神经保持在这种溶液中，其中电活性保持稳定至少达3-4小时。室温下恢复0.5小时后，从压碎损伤远侧的神经获得电生理记录。然后该神经末梢与37℃下浸入电解液中的两个负压(suction)Ag-AgCl电极相连。通过近端的电极施加刺激脉冲，由远侧电极记录作用电位。Grass SD9刺激器用于超强电刺激(0.5pps)。检测出的信号被传递至Medelec PA36预放大器，然后到达肌电图描记器(Medelec MS7，AA7T放大器)。溶液、刺激器和放大器具有一个共同部分。记录8个平均化合物作用电位(CAPs)的最大幅值，并用Polaroid照相机拍照。对侧未损伤神经中测定的CAP值用作参比。
结果
结果表明，视神经损伤后立即施用(R)-PAI甲磺酸盐能阻断损伤诱发的能量产生的减少。通过电生理监测表明(R)-PAI甲磺酸盐还具有长期效应。
CAP(化合物作用电位)幅值与所测神经片段中的传导纤维数目直接相关。
(R)-PAI甲磺酸盐能显著减缓损伤诱导的损伤神经末梢片段的活性丧失，表明(R)-PAI甲磺酸盐是神经保护剂，或至少能降低变性作用。
                        表15
                     电生理测定
  组     CAP幅值(μV)(平均值±标准偏差)
  载体N＝13 441±95
  (R)-PAI甲磺酸盐N＝7 2104±313*
实施例36
R-PAI和S-PAI盐的抗惊厥性质的比较
(R)-PAI和(S)-PAI盐酸盐均具有显著的抗惊厥活性。在小鼠(腹膜内给药)最大电击试验中(MES试验)，(S)-PAI盐酸盐具有的抗惊厥活性(ED50＝57mg/kg)高于(R)-PAI盐酸盐(ED50＝79mg/kg)。在大鼠中发现了类似结果(口服给药)。在MES试验中当给药50mg/kg的(S)-PAI盐酸盐时4只大鼠中的4只被保护不发作癫痫，而给药同样剂量的(R)-PAI盐酸盐时，4只小鼠中的3只被保护。从治疗帕金森病的效能来说，增强的抗惊厥活性是有害的副作用。甲磺酸盐会产生同样的趋势。在MES试验中(S)-PAI甲磺酸盐具有的抗惊厥活性高于(R)-PAI甲磺酸盐。在剂量为100mg/kg时，(S)-PAI甲磺酸盐保护三只小鼠中的三只，而(R)-PAI甲磺酸盐仅保护三只小鼠中的一只。
MES试验是表明治疗人部分和全身性癫痫发作的效能的经典模型。作用的药物机制是借助于它们抑制疾病发作传播的能力。但是，一些抑制癫痫发作传播的药剂具有降低发作阈的副作用。因此，这些药剂具有预惊厥(proconvulsive)和抗惊厥两种副作用。
这里的结果表明，(S)-PAI甲磺酸盐具有预惊厥(proconvulsive)活性。在计时可拉佐静脉内输注(Timed Intravenous Infusion ofMetrazol)试验中，141mg/kg的(S)-PAI甲磺酸盐减少诱发第一次病灶性发作和阵挛发作共同出现所需的时间以及由此所需的可拉佐的量。传统使用的治疗部分和全身癫痫发作的其它药剂如苯妥英和酰胺咪嗪没有显示出这种效应。(H.J.Kupferberg Epilepsia(癫痫)，.30，S51-S56(1989))。同样，(S)-PAI甲磺酸盐显示出明显高于(R)-PAI甲磺酸盐的急性神经毒性。在300mg/kg时(R)-PAI甲磺酸盐对旋转圆木(rotorod)运动失调试验中的小鼠未显示出任何神经毒性。就(S)-PAI甲磺酸盐而言，四只小鼠中的四只显示出神经中毒和痉挛状态。
方法
TD50(半数中毒量)。此项试验通过旋转圆木运动失调试验测定神经病学缺损。将一只小鼠放在以6 rpm速率转动的有凸边的圆木上。然后确定小鼠是否在三次试验中每次都具有保持平衡的能力并能在圆木上停留1分钟。
计时可拉佐静脉内输注试验。此项试验测定每只动物的最小癫痫发作阈。在小鼠尾静脉输注0.185mg/ml的可拉佐。然后从输注开始记录时间(秒)，直至出现第一次抽搐(第一次病灶性癫痫发作)和阵挛发作(阵挛性癫痫发作)。要产生这些症状预惊厥(proconvulsive)需要较少的可拉佐，从而在较短的时间显示出终点。实施例37
(R)-PAI和(S)-PAI对肠平滑肌标本(preparation)的收缩性的外周效应
在分离的家兔或荷兰猪的小肠中测定PAI对映体盐酸盐的外周效应。这些观察结果为其在人体中相关的外周副作用提供了有用信息。口服给药患者的第一接触点是胃肠道，其中药物浓度远远高于吸收和分布后的浓度。在PAI盐酸盐(MW＝208)情况中，含于约100ml液体中的10mg口服剂量相当于约0.5mM浓度。相反，(R)-PAI盐酸盐的治疗血浆浓度在nmol范围内。
确定PAI对映体在分离的家兔空肠和荷兰猪回肠中的效应，以便发现(S)-PAI与(R)-PAI一起摄入(正如在外消旋PAI中发现的)是否会产生给药纯(R)-PAI时没有的副作用。从效能和对酶这种形式的高度选择性而言，(R)-PAI是优选的抑制脑中MAO-B的对映体。在这方面(S)-PAI强度远远低于(R)-PAI，并且对MAO-B也没有选择性。原则上，如果在推荐的(R)-PAI剂量时(S)-PAI是惰性的，那么其在PAI外消旋体中的存在是可以的或者是可忽略的。表16-19中的结果表明，(S)-PAI不是惰性物质。相反，在荷兰猪回肠中，它是比(R)-PAI更强的松弛剂。因此不能忽略不计它的外周效应。这些数据表明，给药纯(R)-PAI比给药含相同剂量(R)-PAI的外消旋PAI具有较小的外周副作用。
                 表16
   在家兔空肠标本中PAI盐酸盐的两种
  对映体中每一种产生的酪胺强化作用
置于器官浴中的一段空兔空肠呈现出节律性收缩，其由去甲肾上腺素抑制但不被酪胺抑制。但是如果空肠用单胺氧化酶抑制剂如PAI进行预处理，那么酪胺引起自发收缩的松弛。松驰程度可能与抑制剂的相对强度有关药物浓度(μM)              松弛百分率单独用酪胺          40         0去甲肾上腺素        0.002      100单独用(R)PAI        0.2-4.0    0单独用(S)PAI        0.2-4.0    0酪胺                40(R)PAI后            0.2        67
                2          88
                40         85-90(S)PAI后            0.2        0
                2          35
                40         33-50
结果
作为脑MAO-B抑制剂，(S)-PAI比(R)-PAI强度弱得多。因此，(S)-PAI对于预防脑多巴胺的降解是无用药物，但能够强化小肠中酪胺唤起的去甲肾上腺素的释放。由于期望它增加未降解酪胺的吸收和作用，所以它在小肠中的活性是不希望有的副作用。因此，正如在外消旋体中所发现的，当(S)-PAI与(R)-PAI一起使用时，(S)-PAI并不是一种惰性物质。
                   表17
在400μM的PAI盐酸盐两种对映体之一存在下对
乌拉胆碱诱发的荷兰猪回肠标本收缩的拮抗作用
置于器官浴生理溶液中的一段荷兰猪回肠当用乌拉胆碱处理时，呈剂量依赖性地收缩，乌拉胆碱是天然胃肠道神经传递质乙酰胆碱的酶解稳定类似物。在PAI存在时，这种收缩减缓。数据以克-张力来表示。乌拉胆碱(μM)      克-张力
  对照  (R)PAI  对照 (S)PAI)0.8   0.5    0.2    0.6    02     1.5    0.3    2.0    04     2.2    0.7    3.0    08     4.0    1.0    3.8    0.620    5.6    2.0    3.8    1.240    6.2    2.8    3.8    1.780    6.2    3.1    3.8    2.6200   6.2    4.3    3.8    2.6
结果
与(R)-PAI相比，作为MAO-B抑制剂，(S)-PAI几乎没有活性，因此在预防脑多巴胺降解中是无效的。但是，在预防乌拉胆碱诱导的小肠收缩中比R(PAI)有效。所以，正如在外消旋PAI中发现的，(S)-PAI当与R(PAI)一起使用时不是一种惰性物质。
                  表18
    PAI盐酸盐两种对映体之一对组胺诱发
      的荷兰猪回肠标本收缩的拮抗作用
固定剂量的组胺(40nM)引起置于器官浴生理溶液中的一段荷兰猪回肠持续收缩。提高PAI盐酸盐两种对映体之一的加入量，导致肌肉的剂量依赖性松弛。加入组胺前基线为100％松弛，用与该基线相比松弛的百分率来表示结果。PAI浓度    松弛百分率μM  (R)PAI     (S)PAI
2     0          11
4     0          15
10    0          30
20               20
30    31         33
40    37         36
100   81         71
200              90
300   92
400   100        98
700   100
1000             100
结果
作为脑中MAO-B抑制剂，与(R)-PAI相比，(S)-PAI是无活性的，因此不能用于预防脑中多巴胺的降解，但在引起肠平滑肌收缩中比(R)异构体活性高。所以，正如在外消旋PAI中发现的，(S)-PAI当与(R)异构体一起使用时不是一种惰性物质。
               表19
   PAI盐酸盐两种对映体之一对乌拉胆碱
   诱发的荷兰猪回肠标本收缩的拮抗作用
固定剂量的乌拉胆碱(0.8μM)引起置于器官浴生理溶液中的一段荷兰猪回肠持续收缩。提高PAI盐酸盐两种对映体之一的加入量，导致肌肉的剂量依赖性松弛。加入组胺前基线为100％松弛，用与该基线相比松弛的百分率来表示结果。PAI浓度    松弛的百分率
μM    (R)PAI     (S)PAI
20      25        40-50
60      25-50     60-70
100     50-70     100
300     100       100
结果
作为脑中MAO-B抑制剂，与(R)-PAI相比，(S)-PAI是无活性的，因此不能用于预防脑中多巴胺的降解，但是在引起肠平滑肌松弛中比(R)异构体活性高。所以，正如在外消旋PAI中发现的，(S)-PAI当与(R)异构体一起使用时，不是一种惰性物质。实施例38
在用作中风模型的大鼠中[R](+)PAI甲磺酸盐对中脑动脉闭塞的某些效应
方法
1.1.大鼠中脑动脉闭塞(MCAO)
使用Tamura等人所述方法的改进方法。用Equitesine溶液以3ml/kg的剂量对每只重300-400g的雄性Wistar大鼠(Olac England-Jerusalem)腹膜内给药，使其麻醉。Equitesine由13.5ml硫喷妥钠溶液(60mg/ml)、3.5g水合氯醛、1.75g MgSO4、33ml 1，2-丙二醇、8.3ml无水乙醇组成，以蒸馏水调至83ml。用型号SMZ-2B，型102(Nikon，Japan)的高度放大手术显微镜进行外科手术。为暴露出左侧中脑动脉，在颞肌中进行刀切。并切除下颌骨喙状突起的顶端，用一把精制咬骨钳除去。用牙钻在下颞窝中壁和顶部间的接界处。进行颅骨切除术。用一个27号针头仔细打开硬脑膜。通过设置低动力下的微二级凝固(microbipolar coagulation)，使MCA永久闭合，起始于距嗅觉通道内侧2-3mm，所述嗅觉通道位于其嗅觉皮层的皮层分支和侧边纹状体动脉之间。
凝固后，用小剪刀切断MCA，并分离以确保完全闭合。之后，将颞肌缝合并放在颅骨切除位点上，用3-0丝质缝线缝合皮肤。在一平行组大鼠上进行伪颅骨切除手术，但大鼠MCA没有烧灼。在各组的整个外科手术(20-25分钟)中，借助于体温调节器(kyoristsn，日本)使体温保持在37至38℃，该调节器由连接于直肠热敏电阻器的自动调节热垫片组成。手术后24小时，记录神经病学评分，以评价药物治疗大鼠相对于未治疗对照组的损伤严重性。术后48小时，用Equitesine使动物麻醉，按MRI方法观察损伤严重性。确定缺血后损伤的脑组织体积。
1.2.药物服法
按下面的程序，通过腹膜内注射给药0.3-0.4ml蒸馏水中的[R](+)PAI甲磺酸盐：
手术后立即给药1mg/kg
手术后2小时给药0.5mg/kg
手术后20-24小时1mg/kg
1.3.缺血性脑损伤的MRI扫描
使用4.7T BIOSPEC系统(BRUKER)(参见T.Back等，“DiffusionNuclear Magnetic Resnonance Imaging in Experimental Stroke：Correlation with Cerebral Metabolites(实验性中风的扩散核磁共振影像：与脑代谢物相关)”，Stroke(中风)(1994年2月)25：494-500)进行所有实验。MCAO或伪手术后(Sham operation)48小时，对每只动物进行快速多切片T1称重成像(TR/TE)，(500/25)用于定位。然后进行多切片T2-称重成像(3000/80)(5个连续切片，3mm厚)。
利用闭合后或伪手术后48小时在T2称重的MRI中观察到的高强度来评估梗塞区面积的大小和严重性。确定每组大鼠的下面MRI参数：
c.缺血面积(mm2)
d.缺血半球的面积(mm2)
e.未受影响的半球面积(mm2)
连续切片的使用允许将面积单位转换为体积单位，即简单地将面积值乘以切片厚度。
1.4.神经病学评分
神经病学评分由对给定大鼠特定运动活性的表现作出的一系列分数的总分组成。等级值为0(完全正常的大鼠)至13(完全残废的大鼠)多数参数值以0(正常)或1(残废)评定；其它参数按分数分级。本实验中进行以下测试：
一般观察测试：活动减退；镇静状态；立毛
运动反射。提起大鼠尾巴距地面15cm。正常大鼠表现出一种姿势，它们将两个前肢伸向地面并将后肢向两侧伸展，呈类似斜方形的形状当MACO严重时，引起对侧肢一致的屈曲。
运动能力。当通过腋窝将大鼠吊在圆木上时，观察大鼠用对侧肢抓住1cm直径圆木5-15秒的能力。
运动协调性，正常大鼠能够沿一个中等斜面上5cm宽的梁上下爬行。不能沿梁向每个方向爬行则表明有些运动的不协调性、缺乏平衡能力和肢无力。
步态。当将大鼠故意放置于窄梁上时，大鼠的每个后部对侧肢恢复正常位置的能力。
平衡能力。在2cm宽的窄梁上抓紧和平衡的能力。
运动性。在一个自动化活动笼中15分钟内总的运动情况。
表20中列出了上述每种参数的评级评分。
表20姿式和运动的10项参数中每项的神经病学评分
参数                                    得分a.  在笼中的运动性                          正常＝0
                                        活动减退＝1b.  镇静状态                                无＝0
                                        明显(活动)＝1c.  立毛                                    无＝0
                                        明显(立毛)＝1d.  当吊起尾巴时对侧前肢向地面伸展          好＝0
                                        肢弯曲＝1e.  当吊起尾巴时对侧后肢展开(斜四边形姿式)  好＝0
                                        肢弯曲＝1f.  当通过腋窝悬起时对侧肢抓住圆木5-15秒    好＝0
                                        差＝1g.  沿5cm宽的梁走                           好＝0
                                        差＝1h.  当有意放置时对侧后肢或前肢原始姿式的恢复好＝0
                                        差＝1(1肢)
                                          ＝2(2肢)i.  在2cm宽的梁上抓紧程度和平稳性           好＝0
                                        差＝1j.  与对照相比的运动活力(在自动化活动       ≤25％的对照  3
笼中15分钟)                             对照的26-50％ 2
                                        对照的51-75％ 1
                                        对照的76-100％0
2.结果
2.1.  梗塞区大小
MRI研究结果示于表21和图20。[R](+)PAI甲磺酸盐处理的大鼠(n＝9)中梗塞区大小显著小于未处理大鼠(n＝10)。前者梗塞区大小约为未处理动物的60％。
                    表21用MRI T2-扫描进行的缺血性脑损伤评价-在Wistar大鼠中
MCA-闭合后48小时和用[R](+)PAI甲磺酸盐处理后
                    MCA-O               MCA-O+[R](+)PAI甲磺酸盐*
 动物只数 梗塞区大小(mm3)  动物只数 梗塞区大小(mm3)
    1     252     1     94.4
    2     272     2     139
    3     314     3     240
    4     273     4     137
    5     201     5     137
    6     221     6     174
    7     358     7     164
    8     265     8     171
    9     341     9     215
    10     236
 MEAN±SD 273.3±50.9  MEAN±SD 163.5±43.9
             t＝5.0475
             f＝17
             p＜0.001
[R](+)PAI甲磺酸盐使梗塞区大小显著减少40％
* 给药[R](+)PAI甲磺酸盐：
   MCA-闭合后时间：
0        -1.0mg/kg ip；
2小时    -0.5mg/kg ip；
24小时   -1.0mg/kg ip；
2.2.神经病学评分
通过盲目(blinded)观察者确定5只[R](+)PAI甲磺酸盐处理大鼠和6只未处理大鼠的神经病学评分。结果示于表22和图21，表22中与MRI试验测定的每只动物梗塞区大小进行了比较，同样图21也如此。可以看出，神经病学评分最低的动物是那些经[R](+)PAI甲磺酸盐处理的动物。与未处理大鼠相比，[R](+)PAI甲磺酸盐处理的MCAO大鼠神经病学评分减少了54％，梗塞区大小减少了36％。
                  表22参照缺血性梗塞区大小，  MCA闭合大鼠和[R](+)PAI
   甲磺酸盐处理的大鼠的神经病学评分
                   MCA-O           MCA-O+[R](+)PAI甲磺酸盐***
   动物数目    神经病学得分* 梗塞区大小**(mm3)    动物数目    神经病学得分* 梗塞区大小**(mm3)
    1     5.0     201     1     1.0     137
    2     5.0     221     2     2.0     174
    3     6.0     358     3     4.0     164
    4     6.0     265     4     4.0     171
    5     8.25     341     5     2.88     215
    6     5.75     236
 平均值+SD  6.0±1.19   270±65  平均值+SD  2.78±1.3   172±28
神经病学得分    梗塞区大小
t＝4.25         t＝3.34
f＝9            f＝9
p＜0.01         p＜0.01
[R](+)PAI甲磺酸盐组神经病学评分减少了53.7％，梗塞区大小减少了36.3％。
*   MCA闭合后24小时进行测定
**  通过MCA闭合后48小时的MRA T2-扫描进行评价
*** 给药[R](+)PAI甲磺酸盐：
MCA-闭合后时间：
0        -腹膜内1.0mg/kg；
2小时    -腹膜内1.5mg/kg；
24小时   -腹膜内1.0mg/kg。实施例38的参考文献
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Claims (41)

1.一种治疗患者脑缺血或中风的方法，它包括对患者给药有效量的治疗患者脑缺血或中风的R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受的盐。
2.权利要求1的方法，其中R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚的药物上可接受的盐选自：甲磺酸盐、乙基磺酸盐、硫酸盐和盐酸盐。
3.权利要求2的方法，其中药物上可接受的盐是R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚的甲磺酸盐。
4.权利要求1的方法，其中有效量为每公斤患者体重约0.5毫克至每公斤患者体重约2.5毫克。
5.权利要求1的方法，其中R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受的盐是经静脉内、口服、直肠、透皮或非肠道给药。
6.权利要求1的方法，其中患者是人而有效量约为每天0.01毫克至50.0毫克。
7.权利要求6的方法，其中有效量约为每天0.1毫克至10.0毫克。
8.权利要求6的方法，其中R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受的盐是经静脉内给药。
9.权利要求1的方法，其中脑缺血面积减小了约35％。
10.一种治疗患者头损伤的方法，它包括对患者给药有效量的治疗患者头损伤的R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受的盐。
11.权利要求10的方法，其中R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚的药物上可接受的盐选自：甲磺酸盐、乙基磺酸盐、硫酸盐和盐酸盐。
12.权利要求11的方法，其中药物上可接受的盐是R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚的甲磺酸盐。
13.权利要求10的方法，其中有效量为每公斤患者体重约0.5毫克至每公斤患者体重约2.5毫克。
14.权利要求10的方法，其中R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受的盐是经静脉内、口服、直肠、透皮或非肠道给药。
15.权利要求10的方法，其中患者是人而有效量约为每天0.01毫克至50.0毫克。
16.权利要求15的方法，其中有效量约为每天0.1毫克至10.0毫克。
17.权利要求15的方法，其中R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受的盐是经静脉内给药。
18.一种治疗患者脊柱损伤的方法，它包括对患者给药有效量的治疗患者脊柱损伤的R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受的盐。
19.权利要求18的方法，其中R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚的药物上可接受的盐选自：甲磺酸盐、乙基磺酸盐、硫酸盐和盐酸盐。
20.权利要求19的方法，其中药物上可接受的盐是R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚的甲磺酸盐。
21.权利要求18的方法，其中有效量为每公斤患者体重约0.5毫克至每公斤患者体重约2.5毫克。
22.权利要求10的方法，其中R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受的盐是经静脉内、口服、直肠、透皮或非肠道给药。
23.权利要求18的方法，其中患者是人而有效量约为每天0.01毫克至50.0毫克。
24.权利要求23的方法，其中有效量约为每天0.1毫克至10.0毫克。
25.权利要求23的方法，其中R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受的盐是经静脉内给药。
26.一种治疗患者神经外伤的方法，它包括对患者给药量的治疗患者神经外伤的R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可的盐。
27.权利要求26的方法，其中R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚的药物上可接受的盐选自：甲磺酸盐、乙基磺酸盐、硫酸盐和盐酸盐。
28.权利要求27的方法，其中药物上可接受的盐是R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚的甲磺酸盐。
29.权利要求26的方法，其中有效量为每公斤患者体重约0.5毫克至每公斤患者体重约2.5毫克。
30.权利要求26的方法，其中R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受的盐是经静脉内、口服、直肠、透皮或非肠道给药。
31.权利要求26的方法，其中患者是人而有效量约为每天0.01毫克至50.0毫克。
32.权利要求31的方法，其中有效量约为每天0.1毫克至10.0毫克。
33.权利要求31的方法，其中R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受的盐是经静脉内给药。
34.一种治疗患者神经变性疾病的方法，它包括对患者给药有效量的治疗患者神经变性疾病的R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受的盐。
35.一种治疗患者神经中毒性损伤的方法，它包括对患者给药有效量的治疗患者神经中毒性损伤的R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受的盐。
36.一种治疗患者脑缺血的方法，它包括对患者给药有效量的治疗患者脑缺血的R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受的盐。
37.一种治疗患者头损伤的方法，它包括对患者给药有效量的治疗患者头损伤的R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受的盐。
38.一种治疗患者脊柱损伤的方法，它包括对患者给药有效量的治疗患者脊柱损伤的R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受的盐。
39.一种预防神经损伤的方法，它包括对患者给药有效量的预防患者神经损伤的R(+)-N-炔丙基-1-氨基二氢化茚或其药物上可接受的盐。
40.权利要求39的方法，其中的神经损伤是结构性神经损伤。
41.权利要求39的方法，其中的结构性神经损伤是视神经损伤。
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