JP2010018626A - N−プロパルギル−1−アミノインダン、これらの塩、組成物、及びこれらの使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】R(+)−N−プロパルギル−1−アミノインダン又はその薬学的に許容しうる塩を使用する、パーキンソン症、記憶障害、痴呆、鬱病、運動高進症候群、感情の病気、神経退行性疾患、神経毒性傷害、脳虚欠症、頭部外傷傷害、脊髄外傷傷害、精神分裂症、注意力欠損症、多重硬化症、又は禁断症状に悩まされている患者を治療する方法であり、更に患者の神経のダメージを防止する方法。R(+)−N−プロパルギル−1−アミノインダンその塩、及びラセミ体のN−プロパルギル−1−アミノインダンを製造する方法。
【選択図】なし
Description
I.
本発明は、モノアミンオキシダーゼ酵素(これ以後MAOと称する。)の選択的不可逆的な阻害剤の分野に属し、モノアミンオキシダーゼ酵素のB−型(これ以後MAO−Bと称する。)の選択的不可逆的阻害剤であるN−プロパルギル−1−アミノインダンのR(+)エナンチオマー(これはまた、ここではPAIと称する。)を提供する。本発明はまた、[R](+)−PAIを含有する薬学的組成物であって、特に、パーキンソン病、記憶障害、痴呆、鬱病、活動高進症候群、感情の病気、神経退行性疾患、神経毒性傷害、脳虚血症、頭の外傷性傷害、脊髄の外傷性傷害、精神分裂症、注意力欠損症、多発性硬化症、及び禁断症状の治療に有効なものも提供する。
パーキンソン症は、脳内のシナプス前部のドーパミン作用性ニューロンの退化と、これに続く、遊離される神経伝達物質であるドーパミンの量の減少の結果起こると広く考えられている。従って、不十分なドーパミンの遊離は、自発的な筋肉のコントロールの傷害の始まりに導く(該傷害の始まりは、パーキンソン症の兆候である。)。
例1
ラセミ体のN−プロパルギル−1−アミノインダン塩酸塩
10.0gのラセミ体の1−アミノインダン及び10.4gの炭酸カリウムを75mlのアセトニトリルに加えた。得られた懸濁液を60℃に加熱し、4.5gの塩化プロパルギルを滴下した。
S−(−)−N−プロパルギル−1−アミノインダン塩酸塩
遊離の塩基の形態の状体化合物を、10%イソプロパノール/90%ヘキサンで溶出するChiracel OJ(セルローストリス[p−メチルベンゾエート])の分取HPLCカラムで、例1の遊離の塩基のラセミ混合物を分割し、最初に溶出された主要ピークを集めることによって単離した。得られたオイルを、該オイルの10%ジエチルエーテル溶液をHClガスで処理することによって表題化合物に変換し、生じた沈殿を吸引濾過によって集めた。[α]D−29.2°(1%、エタノール)、m.p.=182〜184℃。他のクロマトグラフ及びスペクトル特性は、例1の塩酸塩と一致した。
R(+)−N−プロパルギル−1−アミノインダン塩酸塩
表題化合物を、分取HPLCからの第二の溶出ピークを集めること以外、上記例2と同様に調製した。[α]D+29.1°(0.8%、エタノール)、m.p.=179〜181℃。他のクロマトグラフ及びスペクトル特性は、例1の塩酸塩と一致した。
R(+)−N−プロパルギル−1−アミノインダン塩酸塩
12.4gのR(−)−1−アミノインダン及び12.9gの炭酸カリウムを95mlのアセトニトリルに加えた。得られた懸濁液を60℃に加熱し、5.6gの塩化プロパルギルを滴下した。この混合物を60℃で16時間撹拌し、この後、ほとんどの揮発性物を減圧蒸留によって除去した。残渣を10%水酸化ナトリウム水溶液と塩化メチレンに分配した。
S(−)−N−プロパルギル−1−アミノインダン塩酸塩
出発物質としてS(+)−1−アミノインダンを使用した以外例4の方法によって調製した。生成物は、[α]D−30.3°(2%、エタノール)、m.p.=183〜5℃。スペクトル特性は、例1の化合物に対して報告したものと一致した。
ジ(R(+)−N−プロパルギル−1−アミノインダン) L−酒石酸塩
酒石酸(4.4g)の48mlの沸騰したメタノール溶液にR(+)−N−プロパルギル−1−アミノインダンの遊離の塩基(5.0g)のメタノール(48ml)溶液を加えた。この溶液を加熱還流し、284mlのt−ブチルメチルエーテルを20以上かけて加えた。この混合物を更に30分加熱し、冷却し、生じた沈殿を吸引濾過によって単離して6.7gの表題化合物を得た。m.p.=175〜177℃;[α]D(1.5、H2O)=+34.3°。
例6
BR(+)−N−プロパルギル−1−アミノインダン メシレート
a)ベンゼンスルホン酸プロパルギル(78.4g)及びラセミ体のアミノインダン(63.2g)のトルエン(240mL)溶液に、20℃で15%水酸化ナトリウム水溶液(108mL)を滴下した。5時間撹拌した後、追加のトルエン(80mL)及び水(200mL)を撹拌しながら加えた。有機層を分離し、10%水酸化ナトリウム、次いで水で洗浄した。この混合物のpHを10%硫酸水溶液を加えて3.2に調節した。水層を分離し、そのpHを10%水酸化ナトリウムで7.3に調整し、pHを一定に維持しながらトルエンで3回抽出した。有機層を合わせ、減圧下に濃縮して40.7gの黄色のオイルを得た。
R(+)−N−プロパルギル−1−アミノインダン塩酸塩
例4で得た遊離の塩基の形態のR(+)−N−プロパルギル−1−アミノインダン(1.2g)、炭酸カリウム(0.97g)及び沃化メチル(1g)を15mLのアセトンに加え、得られた懸濁液を窒素雰囲気下で8時間加熱還流した。この後、揮発物を減圧下に除去し、残渣を10%水酸化ナトリウム(30ml)及び塩化メチレン(30ml)の間に分配した。有機層を乾燥し、溶媒を減圧下に除去した。残渣を、40%酢酸エチル/60%ヘキサンで溶出するシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにかけた。遊離の塩基として表題化合物を含有するフラクションを合わせ、溶媒をエーテルに置き換えた。エーテル溶液をHClガスで処理した。揮発物を減圧下に除去し、残渣をイソプロパノールから再結晶して400mgの表題化合物を白色の結晶性の固体として得た。m.p.=134〜136℃、[α]D+31.40(エタノール)。
例8
S(−)−N−メチル−N−プロパルギル−1−アミノインダン塩酸塩
表題化合物を、例5で得たS(−)−N−プロパルギル−1−アミノインダン(遊離の塩基)を出発物質として使用した以外上記例7と同様に調製した。表題化合物の物理的及びスペクトル特性は、[α]D−34.9°(エタノール)以外すべて例7のそれと一致した。
錠剤組成物
N−プロパルギル−1(R)−アミノインダン塩酸塩 7.81mg*
予めゼラチン化された澱粉NF 47.0mg
ラクトースNF含水 66.0mg
微結晶性セルロースNF 20.0mg
ナトリウムスターチグリコレートNF 2.99mg
タルクUSP 1.5mg
ステアリン酸マグネシウムNF 0.7mg
*N−プロパルギルアミノインダン塩基の5.0mgに等しい。
錠剤組成物
N−プロパルギル−1(R)−アミノインダン塩酸塩 1.56mg*
ラクトース含水 50.0mg
予めゼラチン化された澱粉 36.0mg
微結晶性セルロース 14.0mg
ナトリウムスターチグリコレート 2.14mg
タルクUSP 1.0mg
ステアリン酸マグネシウムNF 0.5mg
*N−プロパルギルアミノインダン塩基の1.0mgに等しい。
カプセル組成物
N−プロパルギル−1(R)−アミノインダン塩酸塩 5.0mg
予めゼラチン化された澱粉 10.0mg
澱粉 44.0mg
微結晶性セルロース 25.0mg
エチルセルロース 1.0mg
タルク 1.5mg
顆粒化に必要な純水を加えた。
注射組成物
N−プロパルギル−1(R)−アミノインダン塩酸塩 5.0mg
デキストロース無水 44.0mg
HCl、pH5まで加える
1mlに必要な純水を加えた。
注射組成物
N−プロパルギル−1(R)−アミノインダン塩酸塩 1.0mg
塩化ナトリウム 8.9mg
HCl、pH5まで加える
1mlに必要な純水を加えた。
注射組成物
N−プロパルギル−1(R)−アミノインダン塩酸塩 2.0mg
塩化ナトリウム 8.9mg
HCl、pH5まで加える
1mlに必要な純水を加えた。
シロップ組成物
N−プロパルギル−1(R)−アミノインダン塩酸塩 5.0mg
蔗糖 2250.0mg
サッカリンナトリウム 5.0mg
メチルパラベン 6.0mg
プロピルパラベン 1.0mg
香料 20.0mg
グリセリンUSP 500mg
アルコール95%USP 200mg
5.0mlに必要な純水。
舌下錠
N−プロパルギル−1(R)−アミノインダン塩酸塩 2.5mg
微結晶セルロース 20.0mg
ラクトース含水 5.0mg
予めゼラチン化された澱粉 3.0mg
ポビドン 0.3mg
着色剤 q.s.
香料 q.s.
甘味料 q.s.
タルク 0.3mg
賦形剤及び活性成分を混合し、ポピドンのエタノール溶液で顆粒化した。乾燥し、秤量した後、これをタルクと混合し、圧縮した。
PAI舌下錠
N−プロパルギル−1(R)−アミノインダン塩酸塩 5.0mg
微結晶性セルロース 15.0mg
予めゼラチン化された澱粉 12.0mg
エチルセルロース 0.3mg
タルク 0.3mg
顆粒化のために必要な純水を添加した。
錠剤組成物
N−プロパルギル−1(R)−アミノインダン塩酸塩 5.0mg
レボドパ 100.0mg
カルビドパ 25.0mg
予めゼラチン化された澱粉 24.0mg
澱粉 40.0mg
微結晶性セルロース 49.5mg
Col. D & C イエローNo.10 0.5mg
Col. D & C イエローNo.6 0.02mg
顆粒化のために必要なアルコールUSPを添加した。
錠剤組成物
N−プロパルギル−1(R)−アミノインダン メシレート 7.81mg*
予めゼラチン化された澱粉NF 47.0mg
ラクトースNF含水 66.0mg
微結晶性セルロースNF 20.0mg
ナトリウムスターチグリコレートNF 2.99mg
タルクUSP 1.5mg
ステアリン酸ナトリウムNF 0.7mg
*N−プロパルギルアミノインダン塩基の5.0mgに等しい。
錠剤組成物
N−プロパルギル−1(R)−アミノインダン メシレート 1.56mg*
ラクトース含水 50.0mg
予めゼラチン化された澱粉 36.0mg
微結晶性セルロース 14.0mg
ナトリウムスターチグリコレート 2.14mg
タルクUSP 1.0mg
ステアリン酸ナトリウムNF 0.5mg
*N−プロパルギルアミノインダン塩基の1.0mgに等しい。
カプセル組成物
N−プロパルギル−1(R)−アミノインダン メシレート 5.0mg
予めゼラチン化された澱粉 10.0mg
澱粉 44.0mg
微結晶性セルロース 25.0mg
エチルセルロース 1.0mg
タルク 1.5mg顆粒化に必要な純水を添加した。
in vitroでのMAO活性の阻害実験プロトコール
MAO酵素源は、ラット脳の0.3M蔗糖ホモジネートである。これを600gで15分遠心した。上清を0.05Mホスフェートバッファに適切に希釈し、一連の化合物([R](+)PAI、[S](−)PAI及びラセミ体のPAI)の希釈物と37℃で20分前インキュベートした。次に、14Cで標識された基質(2−フェニルエチルアミン(これ以後PEAと称する);5−ヒドロキシトリプタミン、これ以後5−HTと称する。))を加え、インキュベーションを更に20分(PEA)、又は30〜45分(5−HT)間続けた。使用した基質の濃度は、50uM(PEA)及び1mM(5−HT)である。PEAの場合は、酵素の濃度は、基質の10%以上の基質が反応の経路で代謝されないように選択される。次に、反応をトラニルシプロミンを添加することによって停止し(1mMの最終濃度まで)、pH6.3に緩衝させたアンバーライトCG−50の短いカラムでインキュベート物を濾過した。このカラムを1.5mlの水で洗浄し、溶出物を貯蔵し、放射活性体の含量を液体シンチレーションスペクトル法によって決定した。アミン基質は、カラムに全て保持されるので、溶出物の放射活性は、MAO活性の結果形成された中性及び酸性代謝産物を示す。サンプル内でのMAOの活性は、適切なブランク値を差し引いた後に、阻害剤の存在しない対照の活性に対するパーセンテージとして表した。基質としてPEAを使用して決定された活性をMAO−Bと称し、5−HTを用いて決定された活性をMAO−Aと称する。
[R](+)PAI、[S](−)PAI及びラセミ体のPAIの阻害活性を、別々にin vitroで試験し、典型的な実験の結果を図1及び2に示した。全ての実験は、3回繰り返した。基質の代謝の50%阻害をもたらす阻害剤の濃度(IC−50)を阻害曲線から計算し、表1Bに示した。このデータから以下のことがわかる。
in vivoでのMAO活性の阻害:短期治療
実験プロトコール
250±20gの重量のラット(雄Sprague-Dawley由来)を、腹腔内注射(ip)又は経口(oral gavage)(po)によってPAIのエナンチオマーの1つ又はラセミ体で処理し、1時間及び2時間後にそれぞれ断頭した。3匹のラットのグループを阻害剤の各投与量レベルに対して使用し、先に示した一般的な技術を用いて脳及び肝臓内でのMAO活性を決定した。各インキュベーション内のタンパクの量をFolin-Lowry法を用いて決定し、酵素活性を、タンパクの各mgに対するインキュベーションの時間当たりの代謝された基質のnmolとして計算した。阻害剤で処理された動物から得た組織内のMAOの活性は、ビヒクル(vehicle)(経口投与に対しては水、ip注射に対しては0.9%の塩水)を投与し、上記のように殺した対照動物のグループにおける酵素活性に対するパーセンテージとして表した。
阻害医薬で使用されたいずれの投与量レベルにおいても、いずれの明確な挙動変化をもたらさなかった。結果を図4から図11に示した。i.p.投与後、[R](+)PAIは0.5mg/kgの投与量で脳のMAO−Bの90%を阻害した。同じ投与量は、僅か20%のMAO−A活性の阻害をもたらしたのみであった。経口投与では、同じ投与量の[R](+)PAIは、MAO−Bの80%の阻害をもたらしたが、MAO−Aの検出しうる阻害をもたらさなかった。実質的に同様な結果が、脳MAOに対するように肝臓MAOの阻害に対しても見られる。MAO−A及びMAO−Bの50%阻害をもたらす投与量(IC−50)を、阻害曲線から計算し、表2に示した。これらのデータは、(a)[R](+)PAIのMAO阻害活性がラットにおいてin vivoで維持されること;(b)MAO−Aとは対照的に[R](+)PAIによるMAO−Bの阻害に対する選択性をin vivoで維持すること;(c)(−)−エナンチオマーとは対照的に(+)−エナンチオマーの非常に強い活性がin vivoで維持されること;(d)化合物が、経口投与された後に効果的に吸収されること;及び(e)化合物が、血液脳関門を効果的に通過すし、効果的に脳のMAOを阻害することを示している。[R](+)PAIがMAO−Bの阻害に対してラセミ化合物よりも約2倍活性であるという事実は、MAO−Bの阻害に対して[S](−)PAIが非常に低い活性であることの反映である。
in vivoにおけるMAO活性の阻害:長期治療実験プロトコール
ラット(例23で特定したとおりのもの、各投与量レベルに対して4匹)を、経口投与で1日毎に一回投与量で21日間3種類の投与量レベル(0.05、0.1及び0.5mg/kg)で[R](+)PAI又はラセミ混合物で処理し、最後の投与の後2時間で断頭した。MAOタイプA及びBの活性を脳及び肝臓で例23で説明したように決定した。
化合物[R](+)PAIの0.1mg/kgの一日あたりの投与量で、良好な程度の選択的阻害がもたらされた。これは、脳MAO−Bに対して80%以上の阻害であり、脳MAO−Aに対しては20%以下の阻害であった。一日あたり0.5mg/kgのより高い投与量では、MAO−Aはまだ50%以下の阻害であった(図12及び13)。肝臓MAOは、同程度の選択的阻害を示した(図14及び15)。化合物[R](+)PAIは、更に約2倍のファクターによってラセミ混合物よりも強力であった。脳MAOの場合、[R](+)PAIはMAO−Bの阻害に対してラセミ混合物よりもよりよい程度の選択性を有していた。
MAO阻害の不可逆性実験プロトコール
化合物[R](+)PAI(1mg/kg)の一回投与量をi.p.注射により4匹のラットのグループに投与し、この動物を2、6、18、24、48及び72時間後に殺した。MAO−Bの活性を先に開示したように全脳組織で決定した。
結果を図16に示す。MAO−Bの最大阻害には、注射の後6時間で到達した。MAO活性は、注射の後72時間で対照の活性の30%まで戻ったのみであった。この実験は、[R](+)PAIによるMAOの阻害の不可逆性を示す。
意識のあるラットにおけるチラミンの昇圧効果の強さ実験プロトコール
ラットを、ペントバルビタール(30mg/kg)及びクロラール水和物(120mg/kg)の混合物を腹腔内投与により麻酔にかけた。左頚動脈及び頚静脈に細いポリテン管(動脈)又はポリエチレン管に接続された細いシリコンゴム管(静脈)をカニューレ挿入し、その遠位末端を皮下で首の後ろの固定位置に導いた。該管をヘパリン化した生理食塩水で見たし、細いスチール製の棒で栓をした。動物を筋肉内注射によってクロラムフェニコールで処理し、手術から一夜回復させた。次の日に、ラットを自由に動くことができる高い壁の容器に置いた。静脈内のカテーテルを、100cmの長さの、生理食塩水を満たした細い穴のあいたポリエチレン管を介して圧力変換器に接続し、静脈内のカテーテルを同じ長さの管を介して1mlのシリンジに接続した(シリンジを含めた該管にはチラミン塩酸塩の塩水溶液(1mg/ml)が含まれる。)。30から40分間の平衡化の後、チラミン注射物(50又は100μg)を注入し、血圧の応答を記録した。対照の値に血圧が戻った後、注射の間に少なくとも15分のインターバルを確保した。対照の圧力応答を確認し、次いで1の薬剤を腹腔内的に注射し、チラミンの応答を次の4時間にわたって記録した。血圧応答曲線に従って領域を評価し、治療前、及び化合物を注射した後1から3時間までに対する治療後のこの領域の比を、対照の期間で得られた3から4つの値の平均を用いて決定した。
結果を表3に示した。1mg/kgの投与量(これは脳及び肝臓でMAO−Bの完全な阻害を起こし、これらの組織でMAO−Aの40から50%の阻害を起こす。)で化合物[R](+)PAIはチラミンの昇圧応答の十分な増加を起こさなかった。[R](+)PAIのより高い投与量である5mg/kg(これは脳及び抹消でMAO−Aのより広範な阻害を起こす。)では、チラミンの昇圧応答の十分な増加があった。これは、程度としては、デプレニルの同じ投与量でもたらされるものと同様であり、クロルギリン(肝臓MAO−A活性を85%以上阻害する投与量において)によって誘導されるものよりも低い。
[R](+)PAIによるMPAIで誘導されるドーパミン作用性毒性の抑制
1−メチル−フェニル−1,2,3,6−テトラヒドロピリジン(MPTP)は、マウスを含めた幾つかの哺乳動物種において黒質線状体ドーパミン作動性ニューロンを損傷する神経毒であり、ヒト及び霊長類のパーキンソン症候群を引き起こす。その神経毒性のメカニズムにおける重要な初期段階には、MPTPの、その毒性代謝物である1−メチル−4−フェニルピリジニウムイオン(MPP+)への変換が含まれる。この反応は、酵素MAO−Bによって触媒され、おそらく、ドーパミン作動性ニューロンの外側、主にグリアで起こる。MPTPが、MAO−Bの基質及び不可逆的な阻害剤の両方であることが知られている。デプレニル若しくはパルギリンのようなMAO−B阻害剤で実験動物を予め処理することにより、MPTPのMPP+への酸化的変換がブロックされるので黒質線状体ニューロンが保護され、MPTPにより誘導される黒質線状体ニューロンの損傷が防止される。パーキンソン症における進行性の黒質線状体の退化は、環境によって誘導される外来性のMPTP様の神経毒にさらされることに起因する。このような場合に、MAO−B阻害剤での持続的な治療がこのような未だ推定のMPTM毒性のダメージ効果を緩和し、これにより病気の進行を抑えるか、又は遅らせるであろうことを期待して、パーキンソン症のかなり初期の段階からMAO−B阻害剤で持続的な治療を開始することが特に強く指摘されている。有効なMAO−B阻害薬は現在、in vivoでの黒質線状体ドーパミン作動性ニューロンのMPTPにより誘導される損傷をブロックする該医薬の能力によって判定されている。従って、PAIの(−)及び(+)エナンチオマーを、マウスにおいてMTPTで誘導される線状体のドーパミンの消耗を防止するか、又は低下させるこれらの能力に対して試験した。
雄C57黒色マウス(20〜25g重量)に、(a)MPTP−HCl(30mg/kgを蒸留水で溶解したもの、s.c.)若しくはビヒクルのみを注射するか、又はPAIの(−)若しくは(+)異性体(2.5mg/kg、i.p.)若しくはデプレニル(5mg/kg、i.p.)で前処理した後1時間にこれらを注射し、(b)5日後に断頭した。脳を取り出し、氷で冷却したガラスプレート上で死体の線状体を切り裂き、ドライアイスで凍結した。線状体組織を0.1M過塩素酸中でホモジネートし、内部標準としてジヒドロキシベンジルアミンを含有するタンパクを取り除いたアリコートを、HPLCを用いて電気化学的な検出によりドーパミン及びその主要代謝物である3,4−ジヒドロキシ−フェニル酢酸(DOPAC)に対してアッセイした。
表4にこの実験結果を示した。MPTPでの治療は、線条体ドーパミン(DA)及びDOPACの注目すべき消耗をもたらした。PAIの(−)及び(+)エナンチオマー、又はデプレニルでの処置は、洗浄DAの濃度に影響しなかった。PAIの(−)異性体での処理は、MPTPで誘導される線条でのDA及びDOPACレベルに影響を及ぼさなかった。MPTPの前に与えられたPAIの(+)−異性体は、該トキシンによってもたらされる線条のDA及びDOPACレベルの減少を完全に停止させた。2.5mg/kgの投与量で、(+)PAIは、その保護効果が(−)デプレニル(5mg/kg)と等しかった。
老齢のラットにおいてアンフェタミンで誘導されるステレオタイプな挙動に関するPAIエナンチオマーの影響
アンフェタミンは、内因性のドーパミンの代謝によってステレオタイプな挙動を誘導することが知られている(Sulser, F., and Sanders-Bush, E., Ann. Rev. Pharmacol., 11, 209-230 (1971))。アンフェタミンはMAO−Bで代謝されない。効果的な阻害剤及びアンフェタミンの投与によるMAO−Bの阻害は、阻害されたMAO−Bによって分解を受けないドーパミンの遊離を引き起こす。従って、シナプスのドーパミンの増加は、アンフェタミンの影響によるステレオタイプの挙動を起こす薬効の増加を導くアンフェタミン及び効果的なMAO−B阻害剤の投与の後に期待される。広範囲のこの挙動は、1分間に頭を横方向に動かした数によって評価した。
試験化合物を、低酸素症を課す(92%窒素+8%酸素で6時間)24時間前に飲料水に0.5mg/kg/日の投与量で投与した。この後、アンフェタミンを0.5mg/kgの投与量でs.c.で注射した。45分後横方向の頭の移動をカウントした。
記憶の改善若しくは回復に関する[R](+)PAIの効果
生まれたてのラットの子を短時間無酸素症の症状にかけ、次いで長期間永続する記憶障害を発現する通常の方法でこれらを成長させた(Speiser, et al., Behav. Brain Res., 30, 89-94 (1988))。この記憶障害は受動回避試験で劣った能力として表される。
若年のラットを出生後に例27で説明したように無酸素症に罹らせた。[R](+)PAI及び[S](−)PAIを以下のプロトコールの1つに従って投与した。
養母に飲料水中で各異性体を1〜1.5mg/kg/日の投与量で21日に乳離れするまで与えた。この後、乳離れした子供を直接同じ投与量で20日間処置した。処置を40日でやめ、試験を60日目、即ち薬物の最後の投与の後20日目に行った。
投与量を0.5mg/kg/日に減少し、これを21日に乳離れするまで養母に投与し、次いで試験が行われる60日目まで若いラットに直接に投与した。
装置は、暗室を隣接した明るい部屋と2つの部屋を分離するスライドするドアーよりなる。訓練では、ラットを明るい部屋に30秒置き、次いでドアーを開く。ラットが潜伏期で暗室に移動し、この潜伏期を記録する。暗室にラットが入ったときにドアーを閉め0.3mAのフットショックを3秒間送る。
子供のラットにおける無酸素症で誘導される運動高進症候群の[R](+)PAIの効果
出生後無酸素にさらされ、次いで通常の条件で育てられたたラットは、10〜42日齢に開放された場所で運動の活発さが増加することが示される(Hertshkowitz, et al., Dev. Brain Res., 7, 145-155 (1983))。
出生後すぐにラットの子供を無酸素状態にした。ラットの子供をガラス製の容器に入れ、100%窒素に25分間さらした。胸部に間欠マッサージを緩やかに加えることによって該ラットを甦生させ、次いで該ラットのそれぞれの母親に戻した。対照のラットを、窒素の代わりに空気を用いて同様に処置した。
10種類のPAIの塩の安定性の差
安定性は、治療薬として最適な塩を選択する場合の重要なファクターである。種々の塩は、医薬の物理化学的及び生物学的特性を変化し得、その全体としての特性に劇的な影響を有する。(Berge. S.M., et al., J. Pharm. Sci. 66, 1 (1977); Gould, P.L., Int. J. Pharmaceutics, 33, 201 (1986))。
PAI塩の合成
適切な酸(1mol等量)の2−プロパノール溶液を、PAI(1mol等量)の2−プロパノール溶液に撹拌しながら加えた(Ar、BHT)。生成した塩を、濾過し、2−プロパノール及びエーテルで洗浄し、低圧下に乾燥した。収率は70から90%であった。PAIアセテートを製造する場合の以外には、溶媒としてエーテルを使用することが含まれる。
Lichrosphere 60 RP セレクト B 5m 125×4mm(メルク)のカラム、210nmにセットしたL−4200UV−Vis検出器(メルク−日立)を備えたHPLC(Jasco BIP-1)、及びD−2500クロマト積分計(メルク−日立)を使用してクロマトグラフィーによる分離を行った。溶出液及び希釈液は、80%蒸留水/20%アセトニトリル(HPLCグレード)、及びアンモニア水でpH2.5に調整された0.07M過塩素酸よりなる。使用した流速は、1ml/分であり、適切なPAI塩の溶液の濃度は250μg/mlであり、溶液の20μlをクロマトグラフシステムに注入した。
マウスにおけるハロペリドールで誘導されるカタレプシーの回復
雄ICRマウス、各25〜30gを以下の薬剤での何れかで前処置した:生理食塩水、[R](+)PAIメシレート、又はラセミ体PAIメシレート。全薬物は、0.2mLの容積でi.p.で投与した。2時間後、ハロペリドールを、0.1〜0.2mLの容積で、6mg/kgの投与量で、s.c.で注射した。運動調整試験をハロペリドールを投与した後3時間、即ち推定保護薬剤を投与した後5時間で行った。
薬剤、α−MpTはチロシンからのL−ドーパの生成、そして結果として、ドーパミン自身の形成を阻害すると仮定されている。CNSドーパミンの欠如は活動低下として現れる。6月齢の雄Wistarラット(Harlan Orkack, UKより入手)を飽和食塩水、[R](+)PAIメシレート又はRacPAIメシレートで、指示された投与量で前処理した。2時間後、該マウスにi.p.でα−MpTを0.3〜0.5mL中100mg/kgの投与量で投与した。この後、10時間コンピュータを導入した活動かご(active cage)内で運動活性を記録した。結果を表12及び図18に示した。2mg/kgで[R](+)PAIメシレートは飽和食塩水で処理されたラットの約90%まで活性のレベルを回復した。いずれの場合にも、用量−効果曲線のプロフィールはベル型であり、これは2〜5mg/kgのピークを越えて投与量が増加するにつれて効果が減少することを示唆する。5mg/kgでRacPAIメシレートは、2mg/kgでの[R](+)PAIメシレートの活性のレベルに比較しうる活性のレベルを顕在化し得ない。
ラットに、試験薬物をi.p.で示された投与量で与えた。2時間後これらにハロペリドールを与え、活動かごに迅速においた。全運動活性を本文で示したように10時間自動的に記録した。
1.外傷の誘導
頭部の外傷を、左大脳半球、即ち中央冠平面内の1〜2mmの側部から中線までを覆う露出した頭蓋骨上に落とすようによく較正された重り落下装置によって、エーテル麻酔下で雄ラットに誘導した。
外傷の誘導の後1時間に、これらの精神医学的な結果を評価する一連の基準によって該ラットを試験した(基準は、Shohami, et al., J. Neurotrauma, 10, 113 (1993)に開示されている)。精神医学的な重篤度スコア(NSS;Neurological Severity Score)と呼ばれるこれらの基準は、一連の反射作用及び運動機能より成る。ポイントをこれらの基準の欠損を下に与えた。24時間でラットを再評価した。
脳を、運動機能の2回目の評価の後取り除き、組織の一片(〜20mg)を秤量し、湿重量(WW)を得た。24時間95℃でデシケータオーブン内で乾燥した後、再度秤量し、乾燥重量(DW)を得た。組織内の水のパーセンテージを(WW−DW)×100/WWとして計算した。
[R](+)PAIメシレートを水に溶解し、ラットに0.1mg/kgの投与量で頭部の外傷の誘導の後0、4、8及び12時間で腹腔内投与した。対照のラットを同じ時間水で処置した。
ラットの「臨床状態」を測定するNSSは、頭部の外傷の後3時間で処置及び未処置のグループでほぼ同一であったが、[R](+)PAIメシレートで処理されたラットでは24時間で十分に低下した(表13)。これらの結果は、PAIメシレートが、ラットの頭部外傷をとじた後の運動機能の回復を改善するのに効果がある。
小脳細胞培養物のNMDAで誘導される細胞死の霜害に関するPAIメシレートの効果
手順:機械的に解離された新生児ラットの小脳の培養物
6又は7日齢のラットの子供から小脳を無菌で解離し、3mlの富化培地(該培地は、高グルコース濃度(1g/l)、2mM(v/v)L−グルタミン、抗生物質の細胞分裂阻止性の混合物を含有し、15%(v/v)の熱で不活性化したウシ胎児血清で富化されたのダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)で構成される。)を含有する15mlの無菌のプラスチック製の円錐形の管に置いた。次に、45μmの孔径のナイロン製のふるいを挿入した5mlのシリンジに取り付けられた無菌の13ゲージの10cmの長さのステンレス鋼製の針に20〜25個通した後、小脳を解離した。解離された細胞を200gで5分間遠心し、上清を捨て、細胞を富化培地に再懸濁させた。該細胞の生育力をトリパンブルー排除試験によって決定した。次に該細胞を、ポリL−リジンでコートされた表面(ポリL−リジンコートされたガラスのカバーガラスを、15μg/mlのポリ−L−リジンを含有する無菌の蒸留水溶液中に浸漬し、使用直前に無菌の水で洗浄し、乾燥することによって、プレート化する前の少なくとも1時間に調製した。)上に200mm2の密度で置き、富化培地で覆い、空気中5%CO2の雰囲気下及び100湿度において37℃でインキュベートした。培養の4日後に、培地を所望の試験化合物を含有する培地に置き換えた。実験を全く同一に行い、2又は3回繰り返した。試験化合物の毒性用量−応答を決定した後、4つのグループを比較した。(I)対照(富化培地のみ)、(II)試験化合物(各濃度に対して1のサブグループ(2種類の濃度を試験した。))、(III)細胞毒性抗原投与としてN−メチル−D−アスパルテート(NMDA、1mMの濃度に3時間さらした。)、(IV)試験化合物とNMDA(2種類の濃度の試験化合物の各々に対して1のサブグループ)、(V)溶媒(これには試験化合物が溶解される。)の影響を試験するための対照グループ、及び(VI)スペルミン(培養培地に0.01μMで溶解)とNMDAの追加の「陽性対照」グルプ。神経細胞の生存率を、24時間後に位相差顕微鏡及びトリパンブルー染色により評価した。
グルタミン酸(Glu)が、癲癇及び発作を含めた幾つかの神経医学的な疾患、並びに最も適切には、パーキンソン症、アルツハイマー症及び外傷性の脳傷害のような脳の神経退化症において発現される神経毒性を有することがうまく確立された。Gluの神経毒性効果は、膜に結合したN−メチル−D−アスパルテート(NMDA)受容体のようなGlu受容体によって媒介される。
ラット視神経の段階的な挫傷後の[R](+)PAIメシレートの効果
[R](+)PAIメシレートの神経保護効果を、生育したラットの視神経の圧挫傷害の後迅速に適用するために決定した。短期間の効果は代謝的に測定され、長期の効果は電気生理学的に測定された。
1.代謝測定
a)一般
方法は、Yoles, et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 33, 3586-91 (1992)に開示されている。短期間で、代謝測定は、電子伝達系の活性に依存するミトコンドリアのNADH/NAD比によってモニターされ、これによってエネルギー産生のレベルが示される。傷害の結果としてエネルギーを産生する神経の能力の変化は、傷害の前後での人工的な一時的無酸素傷害に対する応答において、NADHのレベルを比較することによって決定される。
ミトコンドリア内のNADHレドックス状態のモニターは、酸化された形態NAD+と異なり、NADHが蛍光を発し、この時450nmの光を発するという事実に基づく。光ファイバーのフレキシブルなY字型の束(光ガイド)を使用し、視神経への光と視神経からの光を伝達した。神経から放出される光を2種類の波長:366nm(反射光)及び450nm(蛍光)で測定した。反射光の変化を血流力学的効果、及び動脈血圧及び神経容積を変化する二次視神経の変動に起因する組織の吸収の変化で補正した。蛍光測定は、蛍光(1:1の比)から反射光(366nm)を差し引き、補正された蛍光シグナルを得ることによるNADHレドックス状態の測定に対して十分に正確であることが見出されている。
動物の利用は、研究における動物の使用に関するARVO Resolutionに従った。300〜400gの体重の雄Spra-gue-Dawley (SPD)ラットをナトリウムペンタバルビトン(50mg/kg、腹腔的)で麻酔した。動物の頭をヘッドホルダーによって適切に保持し、側部外眼角切開を双眼手術顕微鏡化で行い、結膜を、結膜に対して側部に切り込みを入れた。後引筋肉芽細胞を分離した後、視神経を確認し、3〜3.5mmの長さをおおまかに切開して(blunt dissection)眼球の近傍に露出させた。硬膜を無傷で残し、神経を傷つけないように注意した。特別な光ガイドホルダーを、該ライトガイドが傷害部位に対して視神経の1mm遠位の表面に位置するように視神経の回りに移植した。麻酔したままで、動物を外科手術から回復させ、次いで無酸素条件にさらした。無酸素状態は、100%窒素の雰囲気で2分間ラットを呼吸させ、この後空気中に戻すことによって達成した。視神経の代謝活性を評価するために、無酸素に対する応答での反射光及び蛍光強度の相対的変化を挫傷の前後で測定した。
この方法は、Assia, et al., Brain Res., 476, 205-212 (1989)に開示されている。動物の調製及び視神経の損傷は、代謝試験と同様であることが好ましい。損傷の後すぐに、動物に[R](+)PAIメシレート(0.5mg/kg)を含む水及びこれを含まない水を一回注射した。損傷及び処置の後14日目に視神経を摘出し、電気生理学的に測定した。電気生理学的な測定のための視神経の除去の前に、ラットを、70mg/kgのペンタバルビトンで深い麻酔にかけた。皮膚を頭蓋骨から除き、視神経を眼球から引き剥がした。ほぼ全体の断頭を行い、頭蓋骨を骨鉗子で開いた。大脳を横に置き換え、視神経の頭蓋内の部分を露出させた。切開は神経のレベルであり、該神経を、NaCl(126mM)、KCl(3mM)、NaH2PO4(1.25mM)、NaHCO3(26mM)、MgSO4(2mM)、CaCl2(2mM)、及びD−グルコース(10mM)よりなる新鮮な塩溶液を含むバイアルに移し、室温で95%O2及び5%CO2にさらした。神経をこの溶液に保持した。ここで、電気的な活性は少なくとも3〜4時間安定なままである。室温で採集から0.5時間の後、電気生理学的な記録を挫傷領域に対して遠位の視神経から得た。次に、神経末端を、37℃で浸漬溶液に浸漬した2つの吸引Ag−AgCl電極に接続した。刺激パルスを最も近い端で電極から加え、活動電位を遠位の電極で記録した。Grass SD9刺激機を超最大電気刺激に使用した。測定されたシグナルは、Modelec PA36予備増幅器、次いで筋電計(MedelecMS7, AA7T増幅器)に伝達される。8つの平均された化合物の活動電位(CAPs)の最大増幅が記録され、ポラロイド(登録商標)カメラで写真に撮った。CAP値は、参照として提供される反対側の損傷されていない神経で測定した。
結果は、視神経の傷害の後に迅速に適用された[R](+)PAIメシレートが、傷害で誘導されるエネルギー生成の減少をブロックすることを示している。[R](+)PAIメシレートはまた、電気生理学的なモニターで測定される長期間の効果を有する。
[R](+)PAI及び[S](−)PAIの塩の抗痙攣特性の比較
[R](+)PAI及び[S](−)PAIのHCl塩の両方とも、有為な抗痙攣活性を有する。最大電気ショック試験(MES試験)においてマウス(i.p.投与)で、[S](−)PAIHClは[R](+)PAIHCl(ED50=79mg/kg)よりも大きい抗痙攣活性(ED50=57mg/kg)を有していた。同様の結果がラットで観測された(p.o.投与)。4匹のラットのうち4匹が、50mg/kgの[S](−)PAIHClを投与されたときMES試験での発作から防御された。一方、同量の[R](+)PAIHClの投与の後、4匹のマウス内3匹のが防御された。パーキンソン症に対する効果に関して、増強された抗痙攣活性は、有害な副作用である。同様な傾向が、メシレート塩で起こる。[S](−)PAIメシレートは、MES試験で[R](+)PAIメシレートよりも大きな抗痙攣活性を有する。100mg/kgの投与量で、[S](−)PAIメシレートは、3匹のマウスのうち3匹を防御し、一方、3匹のマウスのうち1匹のみが[R](+)PAIメシレートで防御された。
TD50(中央毒性投与量)
本試験はローターロッド運動失調試験によって精神医学的欠損を測定する。マウスを6rpmで回転するギザキザをつけた棒に置きいた。次に、マウスがその平衡を維持する能力を有するか否か、及び3回の試験の各々で1分間棒上に止まることができるか否かを決定する。
本試験は、各動物の最小の発作の閾値を測定する。メトラゾールを0.185mg/mlでマウスの尾静脈に注入した。次に、注入の開始から最初のひきつり(最初の焦点発作)及びクローヌスの開始(間代性の発作)の様相まで時間を記録した。痙攣前は、これらの徴候を引き起こすのにより少ないメトラゾールを必要とし、従ってより短い時間で終点を示す。
腸平滑筋調製物の収縮に関する[R](+)PAI及び[S](−)PAIの抹消効果
PAIのエナンチオマーの塩酸塩の抹消効果を、単離されたウサギ又は天竺ネズミの小腸で決定した。これらの観測は、ヒトにおけるこれらの相対的抹消副作用に関する有益な情報を提供する。経口投与された薬剤と患者の最初の接点は、胃腸間であり、この場所で、薬剤の濃度は吸収及び分布の後よりも高くなる。PAI塩酸塩(MW=208)の場合は、約100mlの液体容積内に含まれる10mgの経口投与量は、約0.5mMの濃度に等しい。対照的に、[R](+)PAI塩酸塩の治療の血漿濃度はナノモルオーダーである。
ウサギ空腸の伸張物を器官浴にマウントし、ノルエピネフリンで阻害されるが、チラミンでは阻害されない周期的な収縮を観測した。しかし、空腸がPAIのようなモノアミンオキシダーゼ阻害剤で前処理されると、チラミンは自発的な収縮の弛緩を起こす。弛緩の程度は、阻害剤の相対的な強さと相関しうる。
[S](−)PAIは、脳MAO−Bの阻害剤としては、[R](+)PAIよりも強さが非常に低い。従って、[S](−)PAIは脳のドーパミンの分解を阻害するための有効な薬剤ではないが、小腸においてチラミンで喚起されるノルエピネフリンの放出を強めることができる。小腸におけるその活性は、分解されないチラミンの吸収と作用を増強することが予想されるので、望まない副作用でである。従って、[S](−)PAIは、これが[R](+)PAIと供に用いられる場合、ラセミ体のPAIで見出されるような不活性な物質ではない。
器官浴の生理学的溶液中でマウントされた天竺ネズミの回腸の伸張物は、天然の胃腸管神経伝達物質であるアセチルコリンの酵素的に安定な類似体であるベタネコール(bethane-chol)で処理したとき、投与量依存的に収縮する。これらの収縮は、PAIの存在下で弱められる。データはグラム−伸張(gram-tension)で表した。
[S](−)PAIは、[R](+)に関してMAO−B阻害剤としてほとんど不活性である。従って、脳のドーパミンの分解を阻害することについて効果的でない。しかし、これは、ベタネコールで誘導される小腸の収縮の阻害に関して[R](+)PAIよりも効果的である。従って、[S](−)PAIは、これが[R](+)PAIと共に使用された場合、ラセミ体のPAIで見出されるように不活性な物質ではない。
ヒスタミンの固定した投与量(40μM)は、器官浴の生理学的溶液中にマウントされた天竺ネズミの回腸の伸張物の持続的な収縮を起こす。PAIHClの2種類のエナンチオマーの各々を増加して添加すると、筋の投与量依存性の弛緩を起こす。結果を、ヒスタミンの添加前のベースライン(これを100%弛緩とした。)に関してのパーセント弛緩として表した。
[S](−)PAIは、脳においてMAO−Bの阻害剤として[R](+)PAIに関して不活性である。従って、脳のドーパミンの分解を阻害するためには有効でないが、腸平滑筋の弛緩を起こす(R)異性体よりも活性である。従って、[S](−)PAIは、(R)異性体と供に摂取される場合、ラセミ体のPAIで見出されるような不活性な物質ではない。
ベタネコールの固定した投与量(0.8μM)は、器官浴の生理学的溶液中にマウントされた天竺ネズミの回腸の伸張物の持続的な収縮を起こす。PAIHClの2種類のエナンチオマーの各々を増加して添加すると、筋の投与量依存性の弛緩を起こす。結果を、ヒスタミンの添加前のベースライン(これを100%弛緩とした。)に関してのパーセント弛緩として表した。
[S](−)PAIは、脳においてMAO−Bの阻害剤として[R](+)PAIに関して不活性である。従って、脳のドーパミンの分解を阻害するためには有効でないが、腸平滑筋の弛緩を起こす(R)異性体よりも活性である。従って、[S](−)PAIは、(R)異性体と供に摂取される場合、ラセミ体のPAIで見出されるような不活性な物質ではない。
Claims (2)
- R(+)−N−プロパルギル−1−アミノインダン又はその薬学的に許容しうる塩を、脳虚血症、頭部の外傷性障害、脊髄の外傷性障害、精神分裂症、注意力欠損症、多発性硬化症、嗜癖物質からの禁断症状、又は視神経の構造上の損傷の治療のための活性化合物として含む薬学的組成物。
- 該嗜癖物質がコカイン又はアルコールである請求項1に記載の薬学的組成物。
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