DE69738275T2

DE69738275T2 - Aminoindanderivate

Info

Publication number: DE69738275T2
Application number: DE69738275T
Authority: DE
Inventors: Michel Chorev; Tamar Goren; Yacov Herzig; Jeffrey Sterling; Marta Weinstock-Rosin; Moussa B.H. Youdim
Original assignee: Teva Pharmaceutical Industries Ltd; Technion Research and Development Foundation Ltd; Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Technion Research and Development Foundation Ltd; Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 1996-12-18
Filing date: 1997-12-18
Publication date: 2008-08-28
Anticipated expiration: 2017-12-19
Also published as: PT966435E; WO1998027055A1; EP1535902B1; DK0966435T3; CA2275425C; US6462222B1; US6538025B2; EP1535902A1; ES2241064T3; EP0966435A4; JP4222632B2; HUP0101130A3; US6303650B1; DE69732984T2; AU5726898A; USRE39616E1; HK1076098A1; EP0966435A1; CA2275425A1; IL130528A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Zwischenverbindungen, welche nützlich für die Herstellung von neuen Verbindungen sind, die Verbindungen enthaltende Arzneimittel und ihre Verwendung bei der Behandlung verschiedener Störungen des ZNS.
Demenz kommt in mehreren Formen, einschließlich statischer Demenz, alzheimerartiger Demenz, seniler Demenz, präseniler Demenz und progressiver Demenz, vor. Eines der gemeinsamen pathologischen Merkmale mehrerer Demenzarten ist das Fehlen des Neurotransmitters Acetylcholin. Dies hat zur Entwicklung von Acetylcholinesterase-Inhibitoren, wie zum Beispiel der Verbindung Tacrin, zur Verwendung bei der Behandlung von Demenzen geführt. Eine Zusammenfassung der unterschiedlichen Ansätze zur Behandlung und des bei der Behandung der Alzheimerkrankheit gemachten Fortschritts kann in Drugs of the Future (1995), 20 (11): 1145–1162 gefunden werden.
Vor kurzem sind Verbindungen entwickelt worden, die zusätzlich zur Hemmung der Acetylcholinesterase eine hemmende Aktivität gegen Monoaminoxidase Typ A (MAO-A) besitzen. Der wahrgenommene Vorteil, die anti-MAO-A-Aktivität aufzuweisen, wird mit der anti-depressiven Wirkung angegeben ( Europäische Patentveröffentlichungen Nr. 614,888 und 664,291 ).
Die US Patente Nr. 5,387,133 , 5,453,446 , 5,457,133 und 5,519,061 offenbaren alle, dass die Verbindung (R)-N-Propargyl-1-aminoindan, ein hoch selektiver Monoaminoxidase Typ B (MAO-B)-Inhibitor, bei der Behandlung von Demenzen der Alzheimerart und Gedächtnisstörungen wirksam ist. Es gibt darin keinen Hinweis, dass die Verbindung eine Acetylcholinesterase-hemmende Aktivität aufweisen könnte. Außerdem ist die Verbindung als MAO-A-Inhibitor nur sehr schwach aktiv.
Die Internationale PCT Offenlegungsschrift Nr. WO95/18617 offenbart verschiedene Aminoindanderivate, die bei einer Vielfalt von Störungen des ZNS, einschließlich Demenzen der Alzheimerart, aktiv sind. Es gibt darin keinen Hinweis, dass eine der offenbarten Verbindungen eine Acetylcholinesterase-hemmende Aktivität aufweisen könnte.
Die vorliegende Patentschrift beschreibt Verbindungen der Formel I
wobei, falls a gleich 0 ist, b gleich 1 oder 2 ist; wobei, falls a gleich 1 ist, b gleich 1 ist, m gleich 0 bis 3 ist, X O oder S ist, Y Halogen ist, R₁ Wasserstoff oder C_1-4-Alkyl ist, R₂ Wasserstoff, C_1-4-Alkyl oder gegebenenfalls substituiertes Propargyl ist; und R₃ und R₄ jeweils unabhängig Wasserstoff, C_1-8-Alkyl, C_6-12-Aryl, C_6-12-Aralkyl oder C_6-12-Cycloalkyl, welche gegebenenfalls substituiert sind, sind.
Die vorliegende Patentschrift beschreibt die Verbindungen selbst, die Verbindungen enthaltende Arzneimittel, und ihre Verwendung bei der Behandlung von Depression, Aufmerksamkeits-Defizit-Syndrom (ADD), hyperkinetischem Syndrom des Kindesalters (ADHD), Tourette Syndrom, Alzheimerkrankheit und anderen Demenzen, wie zum Beispiel seniler Demenz, präseniler Demenz, progressiver Demenz, Demenz der Parkinsonart, vaskulärer Demenz und Lewykörperchendemenz.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Patentschrift beschreibt die Verwendung der Verbindungen der Formel I bei der Behandlung einer neurotraumatischen Störung. Wie hierin verwendet, soll der Begriff „neurotraumatische Störung" am Nervensystem (sowohl zentral als auch pheripher) verursachte Schädigung auf Grund ischämischer Schädigung, wie zum Beispiel die, welche bei Schlaganfall, Hypoxie oder Anoxie, neurodegenerativen Krankheiten, Parkinsonkrankheit, Alzheimerkrankheit, Huntingtonkrankheit, neurotoxischer Verletzung, traumatischer Kopfverletzung, traumatischer Rückenmarksverletzung, peripherer Neuropathie oder jeder Form von Nervenschädigung vorkommt, einschließen.
Eine zusätzliche Ausführungsform der vorliegenden Patentschrift beschreibt die Verwendung der Verbindungen der Formel I bei der Behandlung von Gedächtnisstörung oder Depression.
Die vorliegende Patentschrift beschreibt die racemischen Verbindungen selbst und optisch aktive Enantiomere davon.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Verbindung mit der Struktur
bereit, wobei R₂ für Boc steht und R₃ für H steht; und wobei R₁ für OH oder den Rest
steht, und racemische Gemische, Enantiomere und Salze davon.
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind aus den abhängigen Ansprüchen ersichtlich.
Die vorliegende Patentschrift beschreibt Verbindungen der Formel I:
wobei, falls a gleich 0 ist, b gleich 1 oder 2 ist; wobei, falls a gleich 1 ist, b gleich 1 ist, m gleich 0 bis 3 ist, X O oder S ist, Y Halogen ist, R₁ Wasserstoff oder C_1-4-Alkyl ist, R₂ Wasserstoff, C_1-4-Alkyl oder gegebenenfalls substituiertes Propargyl ist, und R₃ und R₄ jeweils unabhängig Wasserstoff, C_1-8-Alkyl, C_6-12-Aryl, C_6-12-Aralkyl oder C_6-12-Cycloalkyl sind, die jeweils gegebenenfalls substituiert sind.
In einer Ausführungsform ist a gleich 0 und ist b gleich 1. In einer anderen Ausführungsform ist a gleich 0, ist b gleich 1 und ist X O.
In einer Ausführungsform ist X O. In einer zusätzlichen Ausführungsform ist X gleich S.
In einer Ausführungsform ist R₂ ausgewählt aus Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder gegebenenfalls substituiertem Propargyl.
In einer anderen Ausführungsform ist R₂ Propargyl.
In einer weiteren Ausführungsform ist die Verbindung ausgewählt aus (rac) 6-(N-Methyl, N-ethylcarbamyloxy)-N'-propargyl-1-aminoindan HCl; (rac) 6-(N,N-Dimethyl, carbamyloxy)-N'-methyl-N'-propargyl-1-aminoindan HCl; (rac) 6-(N-Methyl, N-ethylcarbamyloxy)-N'-propargyl-1-aminotetralin HCl; (rac) 6-(N,N-Dimethyl-thiocarbamyloxy)-1-aminoindan HCl; (rac) 6-(N-Propylcarbamyloxy)-N'-propargyl-1-aminoindan HCl; (rac) 5-Chlor-6-(N-methyl, N-propylcarbamyloxy)-N'-propargyl-1-aminoindan HCl; (S)-6-(N-Methyl, N-propylcarbamyloxy)-N'-propargyl-1-aminoindan HCl; und (R)-6-(N-Methyl, N-ethylcarbamyloxy)-N'-propargyl-1-aminoindan hemi-(L)-tartrat.
In einer weiteren Ausführungsform ist R₁ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl, und R2 ist Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder gegebenenfalls substituiertes Propargyl. In einer weiteren Ausführungsform ist die Propargylgruppe mit einem C_1-4-Alkylrest am Methylenrest (R₆ in Schema I) substituiert.
Der Begriff „Halogen" wird verwendet, um Fluor, Chlor, Brom oder Iod zu bezeichnen.
In einer Ausführungsform kann, falls m größer als 1 ist, jedes Y gleich oder unterschiedlich sein.
In einer zusätzlichen Ausführungsform befindet sich der Rest OC(X)NR₃R₄ an der 4-, 6- oder 7-Position des Indanrings, wobei vom amino-substituierten Kohlenstoffatom aus gezählt wird.
In einer anderen Ausführungsform ist mindestens ein Rest aus R₃ und R₄ Methyl und der andere ist Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Hexyl, Phenyl, Benzyl oder Cyclohexyl.
In der erfindungsgemäßen Anwendung schließen pharmazeutisch verträgliche Salze die Esylat-, Mesylat-, Maleat-, Fumarat-, Tartrat-, hemi-Tartrat-, Hydrochlorid-, Hydrobromid-, p-Toluolsulfonat-, Benzoat-, Acetat-, Phosphat- und Sulfatsalze ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Die vorliegende Patentschrift beschreibt weiterhin ein Arzneimittel, welches eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung der Formel I oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst. Die „therapeutisch wirksame Menge" einer Verbindung der Formel I oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon kann gemäß Verfahren bestimmt werden, die Fachleuten wohlbekannt sind, Hinweise auf derartige Mengen werden nachstehend gegeben.
Diese Zusammensetzungen können als oral, parenteral, rektal oder transdermal zu verabreichende Medikamente hergestellt werden.
Geeignete Formen zur oralen Verabreichung schließen Tabletten, komprimierte oder beschichtete Pillen, Dragees, Beutel, Hart- oder Weichgelatinekapseln, sublinguale Tabletten, Sirupe und Suspensionen ein. In einer Ausführungsform ist der pharmazeutisch verträgliche Träger ein Feststoff und das Arzneimittel ist eine Tablette. Die therapeutisch wirksame Menge kann eine Menge von etwa 0,5 mg bis etwa 2000 mg sein, vorzugsweise von etwa 1 mg bis etwa 1000 mg.
In einer anderen Ausführungsform ist der pharmazeutisch verträgliche Träger eine Flüssigkeit, und das Arzneimittel ist eine injizierbare Lösung. Die therapeutisch wirksame Menge kann eine Menge von etwa 0,5 mg bis etwa 2000 mg sein, vorzugsweise von etwa 1 mg bis etwa 1000 mg. Das verabreichte Volumen kann eine Menge zwischen 0,5 und 10 ml sein.
In einer weiteren anderen Ausführungsform ist der Träger ein Gel, und das Arzneimittel ist ein Zäpfchen. Zur parenteralen Verabreichung stellt die Erfindung Ampullen und Fläschchen bereit, die eine wässrige oder nicht wässrige Lösung oder Emulsion einschließen. Zur rektalen Verabreichung werden Zäpfchen mit hydrophilen oder hydrophoben Vehikeln bereitgestellt. Zur topischen Anwendung als Salben und zur transdermalen Abgabe werden geeignete, auf dem Fachgebiet bekannte Abgabesysteme bereitgestellt. Für orale oder Zäpfchen-Formulierungen gelten 0,5–2000 mg pro Dosierungseinheit und vorzugsweise 1–1000 mg pro Dosierungseinheit.
Diese Zusammensetzungen können allein verwendet werden, um die vorstehend aufgelisteten Störungen zu behandeln oder, in einer anderen Ausführungsform, zum Beispiel im Fall der Alzheimerkrankheit, können sie als ein Zusatz zu den herkömmlichen Behandlungen, wie zum Beispiel Haloperidol, Tacrin oder Deprenyl, verwendet werden.
Die Erfindung wird durch die experimentellen Details, die folgen, besser verstanden werden. Allerdings ist für einen Fachmann ersichtlich, dass die spezifischen Verfahren und erörterten Ergebnisse lediglich für die Erfindung veranschaulichend sind, wie in den danach folgenden Ansprüchen ausführlicher beschrieben.
Beispiele:
Verbindungen der allgemeinen Formel I können, wie in Schema I gezeigt, aus den entsprechenden Carbamoylderivaten von Aminoindan III durch Umsetzen des Letzteren mit Propargylverbindungen, die eine geeignete Abgangsgruppe an der 3-Position tragen, z. B. einem Halogenidrest, Mesylat, Tosylat usw., unter basischen Bedingungen, die von einer anorganischen Base, z. B. K₂CO₃, NaOH, oder einer organischen Base, z. B. einem tertiären Amin, bereitgestellt werden, in einem polaren organischen Lösungsmittel, z. B. CH₃CN, DMF usw., bei 15–40°C, vorzugsweise bei 20–25°C, für einen Zeitraum in dem Bereich von 5–48 Stunden, vorzugsweise 20–30 Stunden, hergestellt werden. Die nach einer geeigneten Aufarbeitung und Reinigung erhaltenen Produkte liegen in Form von freien Basen vor. Vorzugsweise werden diese in ihre pharmazeutisch verträglichen Salze, z. B. HCl, Mesylat, hemi-Tartrat, usw., umgewandelt.
Wie in Schema I gezeigt, können Verbindungen der allgemeinen Formel III durch Boc-Entschützung der Verbindungen der allgemeinen Formel IV hergestellt werden. Verbindungen der allgemeinen Formel IV wiederum können durch Carbamylieren einer Verbindung der allgemeinen Formel V auf eine herkömmliche Weise, z. B. durch Umsetzen der Verbindung der Formel V mit einem geeigneten Carbamylhalogenid oder durch ein Alkylisocyanat, hergestellt werden. Letztendlich können Verbindungen der allgemeinen Formel V durch die Boc-Schützung der geeigneten Hydroxyamine durch Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, hergestellt werden. Wie in Schema I gezeigt, können N,N-Dialkylaminoindanderivate durch die direkte Carbamylierung des entsprechenden N,N-Dialkylhydroxyaminoindans oder durch Alkylierung einer Verbindung der Formel III hergestellt werden.
Obwohl Schema I die Herstellung von Carbamoylderivaten zeigt, ist das gleiche Verfahren und die vorstehende Beschreibung für die Herstellung der erfindungsgemäßen Thiocarbamate relevant.
Ausgangsmaterialien
6- und 7-Hydroxy-1-aminoindane können durch Demethylierung der jeweiligen 6- und 7-Methoxy-1-aminoindane hergestellt werden. Die Letzteren können aus den entsprechenden 1-Indanonen erhalten werden, entweder durch ihre Umwandlung in die Oxime, gefolgt von einer Reduktion, oder durch ihre reduktive Aminierung (NaCNBH₃ und NH₄OAc).
6-Hydroxyaminoindan kann auch aus Aminoindan über eine regioselektive Friedel-Crafts-Acylierung eines geeigneterweise N-geschützten Aminoindans, gefolgt von einer Baeyer-Williger-Oxidation und schließlich Hydrolyse hergestellt werden. 6-Hydroxy-(R)-1-aminoindan kann daher durch das im nachstehenden Beispiel beschriebene Verfahren und Schema II, wobei „R" ein gegebenenfalls substituiertes Alkyl ist, hergestellt werden.
N-Methyl-6-hydroxy-1-aminoindan wurde durch Demethylierung von 6-Methoxy-N-methyl-1-aminoindan hergestellt, das aus 6-Methoxy-1-aminoindan durch reduktive Alkylierung (z. B. Ethylformiat, gefolgt von einer LiAlH₄-Reduktion) hergestellt wurde, oder, in einer anderen Ausführungsform, durch reduktive Aminierung (MeNH₂, HCl, NaCNBH₃) von 6-Methoxy-1-indanon. N-Ethyl-6-hydroxy-1-aminoindan wurde durch Acetylierung von 6-Hydroxy-1-aminoindan (Ac₂O, KOH), gefolgt von einer Reduktion (LiAlH₄), erhalten. N,N-Dimethyl-6-hydroxy-1-aminoindan wurde durch Demethylierung des entsprechenden 6-Methoxyanalogs hergestellt, welches durch reduktive Alkylierung (Formaldehyd, Ameisensäure) von 6-Methoxy-1-aminoindan hergestellt wurde. 4-Hydroxy-1-aminoindan kann aus 4-Hydroxyindanon durch Umwandlung des Letzteren in das Oxim, gefolgt von einer Reduktion, hergestellt werden. 4-Hydroxyindanon kann aus Dihydrocumarin hergestellt werden.
7-Hydroxy-1-aminotetralin und 7-Hydroxy-2-aminotetralin wurden durch Demethylierung der entsprechenden 7-Methoxyanaloga hergestellt. Die Letzteren wurden durch reduktive Aminierung (wie vorstehend) der entsprechenden 7-Methoxy-1- und -2-Tetralone hergestellt.
7-Methoxy-2-tetralon wurde aus 2,7-Dimethoxytetralin gemäß Copinga et al. hergestellt.
Herstellung von 6-Hydroxy-(R)-1-aminoindan (wie in Schema 11 gezeigt)
N-Trifluoracetyl-(R)-1-aminoindan
Zu einer gekühlten (0–5°C) Lösung aus Trifluoressigsäureanhydrid (194,6 g, 0,926 mol) in Toluol (680 ml) wurde tropfenweise eine Lösung aus (R)-1-Aminoindan (Base) (113,32 g, 0,85 mol) in Toluol (50 ml) gegeben und unter Eiskühlung 3 1/2 Stunden lang gerührt. Eine Lösung aus KOH (67,25 g, 1,2 mol) in Wasser (1000 ml) wurde dann unter Kühlung zugegeben. Das Umsetzungsgemisch wurde weitere 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und filtriert.
Der Feststoff wurde durch Filtration gesammelt, mit Wasser (680 ml) gewaschen und bei 60°C im Vakuum getrocknet, um 152 g (78%) eines weißen Feststoffes, Schmpkt: 153–154°C, zu ergeben. Die Lösung wurde im Vakuum eingedampft, und die Kristalle wurden filtriert und mit Wasser gewaschen. Der Feststoff wurde bei 60°C im Vakuum getrocknet. Die zweite Ernte (25 g) wurde aus einem Gemisch aus Hexan und Ethylacetat kristallisiert, um 18 g (9%) eines weißen Feststoffes, Schmpkt: 153–154°C, zu ergeben. Die Gesamtausbeute war 170 g (87%).
6-Chloracetyl-N-trifluoracetyl-(R)-1-aminoindan
Zu einer Suspension von AlCl₃ (89,2 g, 0,67 mol) in 1,2-Dichlorethan (600 ml) wurde tropfenweise Chloracetylchlorid (55,7 ml, 78,9 g, 0,7 mol) 20 Minuten lang bei 0–5°C unter Stickstoff gegeben, und dann ließ man es auf 20–25°C erwärmen. Zu diesem Gemisch wurde N-Trifluoracetyl-(R)-1-aminoindan (34,4 g, 0,15 mol) 3 Stunden lang bei 20–25°C gegeben. Das so erhaltene Gemisch wurde dann zusätzliche 30 Minuten lang gerührt und in ein Gemisch aus eiskaltem Wasser (1,5 l) und 1,2-Dichlorethan (1 l) gegossen. Das Gemisch wurde 5 Minuten lang gerührt, und die Schichten wurden abgetrennt. Die wässrige Schicht wurde mit 1,2-Dichlorethan (2 × 750 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser (2 × 900 ml) und 5%iger wässriger NaHCO₃-Lösung (3 × 900 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (Na₂SO₄), und das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt, um einen Feststoff zu geben, welcher aus Ethanol umkristallisiert wurde, um 15 g (48%) eines weißen Feststoffes, Schmpkt: 166–167°C, zu ergeben.
6-Chloracetoxyl-N-trifluoracetyl-(R)-1-aminoindan
6-Chloracetyl-N-trifluoracetyl-(R)-1-aminoindan (30,57 g, 0,1 mol) wurde in wasserfreiem Dichlormethan (210 ml) gelöst, und 3-Chlorperoxybenzoesäure (70%, 44,87 g, 0,26 mol) wurde auf einmal zugegeben. Die Suspension wurde auf 0°C gekühlt und 5–10 Minuten lang wurde tropfenweise Trifluoressigsäure (11,4 g, 0,1 mol) zugegeben. Der Umsetzungskolben wurde vor Licht geschützt, und das Gemisch wurde 3–5 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Umsetzungsgemisch wurde in Wasser (300 ml) gegossen. Das Gemisch wurde mit einer Ammoniumhydroxidlösung neutralisiert. Die Schichten wurden abgetrennt. Die wässrige Schicht wurde mit Dichlormethan (200 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden getrocknet (Na₂SO₄) und das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt, um einen Feststoff zu ergeben, welcher aus Ethanol umkristallisiert wurde, um 15 g (48%) eines weißen Feststoffes, Schmpkt.: 169–170°C, zu ergeben.
6-Hydroxy-(R)-1-aminoindan
Eine Suspension von 6-Chloracetoxy-N-trifluoracetyl-(R)-1-aminoindan (25,4, 0,11 mol) und K₂CO₃ (38,0 g, 0,275 mol) in einem Gemisch aus Methanol (275 ml) und Wasser (175 ml) wurde 1,5 Stunden lang bei 70°C gerührt. Methanol wurde im Vakuum entfernt und die wässrige Phase wurde mit 10%iger Salzsäure neutralisiert. Das Gemisch wurde filtriert und der Feststoff wurde mit Wasser gewaschen. Die Stammlösung wurde unter verringertem Druck auf ein kleines Volumen eingedampft. Die Suspension wurde neutralisiert, filtriert, und die braunen Feststoffe wurden aus Methanol (zweimal) kristallisiert, um 7,0 g (43%) eines weißen Feststoffes, Schmpkt: 200–203°C, zu ergeben.
Die Herstellung des entsprechenden S-Enantiomers kann auf die gleiche Weise unter Verwendung von (S)-1-Aminoindan als Ausgangsmaterial durchgeführt werden.
Aufspaltung von Enantiomeren:
Die R- und S-Enantiomere jeder Verbindung können durch Antipodentrennung der entsprechenden racemischen Gemische erhalten werden. Eine derartige Aufspaltung kann mit jedem herkömmlichen, einem Fachmann bekannten Aufspaltungsverfahren, wie zum Beispiel jenen in U.S. Patent Nr. 4,833,273 , erteilt am 23. Mai 1989 (Goel), und J. Jacques, A. Collet und S. Wilen „Enantiomers, Racemates and Resolutions" Wiley, New York (1981) beschriebenen, erreicht werden. Zum Beispiel kann die Aufspaltung mit präparativer Chromatographie an einer chiralen Säule durchgeführt werden. Ein anderes Beispiel eines geeigneten Aufspaltungsverfahrens ist die Bildung von diastomeren Salzen mit einer chiralen Säure, wie zum Beispiel Wein-, Äpfel-, Mandelsäure oder N-Acetylderivaten von Aminosäuren, wie zum Beispiel N-Acetylleucin, gefolgt von Umkristallisation, um das diastereomere Salz des gewünschten Enantiomers zu isolieren.
In einer anderen Ausführungsform können ausgewählte Ausgangsmaterialien, Zwischenprodukte oder Endprodukte in ihre jeweiligen Enantiomere durch das in der Internationalen PCT-Anmeldung Offenlegungsschrift Nr. WO/96US/21640 beschriebene Verfahren aufgespalten werden, wobei die aufzuspaltende Verbindung erst in ihr N-Benzylderivat umgewandelt wird. Das N-Benzylderivat wird dann unter Verwendung von R- oder S-Mandelsäure aufgespalten. Das aufgespaltene Produkt wird in seine Base umgewandelt und unter sauren Bedingungen reduziert, um das gewünschte Enantiomer bereitzustellen. Vorzugsweise wird das Ausgangsmaterial vor der Boc-Schätzung und Carbamylierung aufgespalten.
Die R- und S-Enantiomere der Ausgangsmaterialien können auch aus den R- und S-Enantiomeren des Aminoindans über eine regioselektive Friedel-Crafts-Acylierung eines geeigneterweise N-geschützten optischen Isomers von Aminoindan, gefolgt von einer Baeyer-Williger-Oxidation und schließlich Hydrolyse hergestellt werden, wobei dadurch die Notwendigkeit der Antipodentrennung umgangen wird.
Referenzen

1. Y. Oshiro et al., J. Med. Chem., 34: 2004 (1991);
2. R. F. Borch et al., J. Am. Chem. Soc., 93:, 2897 (1971);
3. J. G. Cannon et al., J. Med. Chem., 28: 515 (1985);
4. S. C. Copinga et al., J. Med. Chem., 36: 2891 (1993); und
5. K. Teranishi et al., Synthesis, 1018 (1994).

Herstellung erfindungsgemäßer Verbindungen, wie in Schema I gezeigt
A: Boc-Schätzung und Carbamylierung
1. Boc-Schätzung
6-Hydroxy-N-Boc-aminoindan
Eine Lösung aus 6-Hydroxyaminoindan (16 g, 107 mmol), di-t-Butyldicarbonat (23,8 g, 109,2 mmol) und Et₃N (16,74 ml, 120 mmol) in THF (375 ml) wurde 20 Std. lang bei Raumtemperatur (RT) gerührt. Das Umsetzungsgemisch wurde unter verringertem Druck zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde in CH₂Cl₂ (200 ml) gelöst, mit Wasser (200 ml) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und unter verringertem Druck zur Trockene eingedampft. Das rohe Produkt wurde durch Säulenchromatographie (Hexan/EtOAc 2:1) gereinigt, um 23 g eines Feststoffes (86%) zu ergeben.
2. Carbamylierung
6-(N-Me, N-Et-Carbamyloxy)-N-Boc-aminoindan
Zu einer gerührten und Eis-gekühlten Lösung von N-Boc-6-Hydroxyaminoindan (7,5 g, 30 mmol) in Acetonitril (75 ml) wurde (N-Me, N-Et)-Carbamoylchlorid (6,3 g, 51,8 mmol) gegeben, gefolgt von einer tropfenweise Zugabe von NaH (60% in Öl, 1,56 g, 39 mmol). Das Umsetzungsgemisch wurde unter Argon 2 Std. lang bei RT gerührt. Nach dem Eindampfen des Lösungsmittels im Vakuum wurde Wasser (100 ml) zugegeben und mit Ether (3 × 100 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde mit verdünnter NaOH (pH 10–11) gewaschen, getrocknet und im Vakuum zur Trockene eingedampft. Reinigung durch Säulenchromatographie (Hexan:EtOAc 2:1) lieferte 7,8 g (77%) eines Öls.
Auf diese Weise wurden die Zwischenprodukte der Tabellen 1 und 2 hergestellt. In Tabelle 1 und allen weiteren Tabellen bezeichnet die Überschrift „Position" die Ringposition der Carbamylgruppe, außer es ist anders angegeben. Tabelle 1 N-Boc geschützte Carbamyloxyaminoindane
Tabelle 2 N-Boc geschützte Carbamyloxyaminotetraline
B: Boc-Entschützung
6-(N-Me, N-Et-Carbamyloxy)aminoindan HCl (Verbindung 3)
6-(N-Me, N-Et-Carbamyloxy)-N-Boc-aminoindan (7,8 g, 23,3 mmol) wurde in Dioxan (80 ml) gelöst und eine 20%ige Lösung von gasf. HCl in Dioxan (80 ml) wurde zugegeben. Nach 2 Stunden langem Rühren bei RT wurde das Lösungsmittel im Vakuum eingedampft und der Rückstand wurde mit trockenem Ether (200 ml) behandelt und das Gemisch 4 Std. lang bei RT gerührt und filtriert, um 6,15 g (0,7 mmol, 97%) 6-(N-Me, N-Et-Carbamyloxy)aminoindan Hydrochlorid zu ergeben.
Auf diese Weise wurden die folgenden Verbindungen der allgemeinen Formel I, wie in den Tabellen 3, 3a und 4 gezeigt, hergestellt. Spektraldaten, welche sich auf diese Verbindungen beziehen, werden in den Tabellen 7, 7a und 8 angegeben. Tabelle 3 Carbamyloxyaminoindan HCl-Salze

* R-Enantiomer
** S-Enantiomer
*** 5-Chlor

C: Propargylierung und Salzbildung
Die in Schritt B hergestellten Verbindungen können gegebenenfalls propargyliert werden, um weitere Verbindungen der allgemeinen Formel I bereitzustellen.
6-(N-Me, N-Et-Carbamyloxy)-N-propargylaminoindan HCl (Verbindung 25)
Zu einem gerührten Gemisch aus 6-(N-Me, N-Et-Carbamyloxy)aminoindan HCl (5,2 g, 19,2 mmol), Kaliumcarbonat (5,31 g, 38,4 mmol) in Acetonitril (250 ml) wurde eine Lösung aus Propargylbromid (2,06 g, 17,28 mmol) in Acetonitril (10 ml) gegeben. Das Umsetzungsgemisch wurde unter Stickstoff 25 Std. lang bei RT gerührt und filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum zur Trockene eingedampft, und der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie (EtOAc) gereinigt, um 3,6 g (13,2 mmol, 69%) der freien Base als ein gelbes Öl zu ergeben.
Die freie Base wurde in trockenem Ether (150 ml) gelöst und HCl/Ether (15 ml) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde 1 Std. lang bei RT gerührt, filtriert und der Feststoff wurde aus iPrOH/Ether umkristallisiert, um 3,5 g (11,3 mmol, 59%) der Titelverbindung als einen weißen Feststoff zu ergeben.
6-(N,N-Dimethylcarbamyloxy)-N-propargylaminoindanmesylat (Verbindung 24)
Zu einem gerührten Gemisch aus 6-(N,N-Dimethylcarbamyloxy)aminoindan HCl (1,88 g, 7,33 mmol), K₂CO₃ (2,03 g, 14,66 mmol) und Acetonitril (70 ml) wurde tropfenweise unter Stickstoff über 5 min hinweg eine Lösung aus Propargylbromid (0,79 g, 6,6 mmol) in CH₃CN (5 ml) gegeben. Das Gemisch wurde unter N₂ 24 Std. lang gerührt, filtriert, und das Lösungsmittel wurde bei verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in Wasser (150 ml) und Toluol (150 ml) aufgenommen. Dieses Gemisch wurde während des Einstellens des pH-Wertes der wässrigen Schicht auf 3,75 durch die Zugabe von 20%iger wässriger HCl gerührt. Die wässrige Schicht wurde abgetrennt und mit Toluol (2 × 100 ml) extrahiert, und durch die Zugabe von 10% wässr. NaOH-Lösung vorsichtig auf pH 7,5 gebracht. Sie wurde dann mit Toluol (100 ml + 4 × 70 ml) extrahiert. Die vereinigten Toluolschichten wurden getrocknet (Na₂SO₄), filtriert, und das Lösungsmittel unter verringertem Druck entfernt, um 1,06 g (62%) eines gelben Öls zu ergeben.
Zu einer gerührten Lösung der freien Base (1,65 g, 6,4 mmol) in wasserfr. Ether (60 ml) wurde tropfenweise eine Lösung aus Methansulfonsäure (0,7 g, 7,29 mmol) in Ether (10 ml) gegeben. Die so erhaltene Suspension wurde 30 min lang bei 25°C gerührt und dann ließ man sie zusätzliche 30 min lang absetzen. Der Ether wurde dann abdekantiert und der Rückstand wurde unter Vakuum getrocknet. Er wurde dann aus iPrOH/Ether umkristallisiert, um 2,05 g eines weißen Feststoffes (90,3%) zu ergeben.
Auf diese Weise wurden die folgenden Verbindungen der allgemeinen Formel I, wie in den Tabellen 5, 5a und 6 gezeigt, hergestellt. Analytische Daten, welche sich auf diese Verbindungen beziehen, werden in den Tabellen 9, 9a und 10 angegeben. Tabelle 5 Carbamyloxy-N-proparglyaminoindane

* R-Enantiomer
** S-Enantiomer
*** substituierte Propargylderivate, wobei R₆ in Schema I Methyl ist
**** Y: 5-Cl

Biologische Beispiele
Beispiel 1
Acetylcholinesterase-Hemmung in Mäusen
1.1 In vitro Messung der Acetylcholinesterase (AChE)-Hemmung
Menschliche Erythrozyten-Acetylcholinesterase (Typ XIII, Sigma Israel) wurde in einer Stammlösung von 1 U/ml, die Triton (1%) und Rinderserumalbumin (0,05%) in Phosphatpuffer (pH 8) enthält, hergestellt. Das Enzym (0,05 U) wurde mit 3–5 unterschiedlichen Konzentrationen der Testverbindung (in dreifacher Ausführung) für einen 15 bis 60 Minuten langen Zeitraum bei 37°C inkubiert. Das Substrat Acetylthiocholin (0,075 M) und 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) (DTNB, 0,01 M) wurde dann zugegeben und die Geschwindigkeit der Substrathydrolyse, die ein gelbes Produkt ergibt, wurde spektrophotometrisch bei 412 nm kontrolliert (Ellman et al., Biochem Pharmacol. (1961), 7: 88–95). Die prozentuale Hemmung der AChE durch jede Arzneistoffkonzentration wird im Vergleich zu jener des Enzyms in Abwesenheit des Arzneistoffes berechnet. Die Konzentration jedes Arzneistoffes, der zur Zeit der Spitzenaktivität AChE um 50% (IC₅₀) hemmt, wurde berechnet und wird in nachstehender Tabelle 11 angegeben.
1.2 Ex vivo Messung der Acetylcholinesterase (AChE)-Hemmung
Testarzneistoffe oder Salzlösung wurden männlichen Mäusen (Sabra Stamm, 28–35 g) subcutan verabreicht. Mindestens 4–5 Mäuse wurden pro Dosis verwendet, und ein Minimum von 3 Dosen pro Arzneistoff wurde getestet. Die Mäuse wurden 15, 30, 60, 70, 90, 120 oder 180 Minuten nach der Arzneistoffverabreichung eingeschläfert, die Gehirne schnell entnommen (abzüglich des Cerebellums), gewogen und in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 8,0, der Triton (1 mg/100 g Gewebe) enthält, homogenisiert und, um Zelltrümmer zu entfernen, zentrifugiert. Aliquote (25 μl) des Überstands wurden dann mit Acetylthiocholin und DTNB inkubiert. AChE-Aktivität wurde wie vorstehend beschrieben gemessen. Die%-Hemmung des gesamten AChE's im Gehirn wurde für jede Arzneistoffdosis durch Vergleich mit der Enzymaktivität von 3 mit Salzlösung behandelten Mäusen zur Kontrolle, die zur gleichen Zeit mitlief, berechnet.
Die Dosis jedes Arzneistoffes, der bei Spitzenaktivität AChE um 50% (IC₅₀) hemmt, wurde berechnet, und wird in Tabelle 11 angegeben.
1.3 Akute Toxizität in Mäusen
Arzneistoffe wurden in mindestens 3 Dosen subcutan an ein Minimum von 10 Mäusen pro Dosis verabreicht. Die Dosis, die innerhalb von 6 Stunden nach der Verabreichung für 50% der Mäuse tödlich war (LD₅₀), wurde für jeden Arzneistoff berechnet und wird in Tabelle 11 angegeben. Das therapeutische Verhältnis wurde als LD₅₀ dividiert durch ED₅₀ der ex vivo Acetylcholinesterase-Hemmung berechnet.
Beispiel 2
2.1 Hemmung der MAO-Aktivität in vitro
Die Quelle des MAO-Enzyms war ein Homogenat aus Rattenhirn in 0,3 M Saccharose, das 15 Minuten lang bei 600 g zentrifugiert wurde. Der Überstand wurde geeigneterweise in 0,05 M Phosphatpuffer verdünnt und 20 Minuten lang bei 37°C mit Verdünnungsreihen der Testverbindungen vorinkubiert. Dann wurden ¹⁴C-markierte Substrate (2-Phenylethylamin, hierin nachstehend PEA; 5-Hydroxytryptamin, hierin nachstehend 5-HT) zugegeben, und die Inkubation weitere 20 Minuten lang (PEA) oder 30 – 45 Minuten lang (5-HT) fortgesetzt. Verwendete Substratkonzentrationen waren 50 μM (PEA) und 1 mM (5-HT). Im Fall von PEA wurde die Enzymkonzentration so gewählt, dass nicht mehr als 10% des Substrats während des Verlaufs der Umsetzung metabolisiert wurde. Desaminierte Produkte wurden in Toluol-Ethylacetat (1:1 Vol./Vol.), das 0,6% (Gew./Vol.) 2,5-Diphenyloxazol (ppo) enthält, vor der Bestimmung durch Flüssigkeitsszintillationszählung, extrahiert. Radioaktivität im Eluat zeigt die Herstellung neutraler und saurer Metaboliten an, die als ein Resultat der MAO-Akivität gebildet werden. Die MAO-Aktivität in der Probe wurde in Prozenten der Kontrollaktivität bei Abwesenheit von Inhibitoren nach Abzug geeigneter Leerwerte angegeben. Die unter Verwendung von PEA als Substrat bestimmte Aktivität wird als MAO-B und die unter Verwendung von 5-HT bestimmte als MAO-A bezeichnet.
Konzentrationen des Inhibitors, die 50% Hemmung des Substratmetabolismus (IC₅₀) erzeugen, wurden aus den Hemmkurven berechnet und werden in Tabelle 11 gezeigt.
2.2 Hemmung der MAO-Aktivität ex vivo
Männlichen Sabra-Mäusen, die 45–50 g wiegen, wurden Testverbindungslösungen (hergestellt in 0,9% Salzlösung) injiziiert. Jede Dosis wurde an zwei oder drei Mäuse verabreicht. Die Mäuse wurden zwei Stunden nach der Arzneimittelverabreichung oder zu einer Zeit, die dem Zeitpunkt der Spitzenhemmung von AChE (siehe Tabelle 11) entspricht, eingeschläfert. Das Gehirn und die Leber wurden rasch zerlegt und in geeigneten Fläschchen auf Eis gelagert. Die Gewebe wurden gewogen, auf 1/20 in 0,3 M Saccharose verdünnt und vor der Durchführung der vorstehend beschriebenen MAO-Analyse bei –20°C gelagert. Die in Tabelle 11 angegebenen Ergebnisse beziehen sich auf Messungen, welche nur an Gehirngewebe gemacht wurden.
2.3 Hemmung der MAO-Aktivität, die auf eine subakute Verabreichung an Ratten folgt
Die Experimente wurden an männlichen Sprague-Dawley Ratten durchgeführt. Die Verfahren wurden wie in den Beispielen 2.1 und 2.2 beschrieben wiederholt, jedoch wurde die tägliche Arzneimittelverabreichung 14 Tage lang fortgesetzt. Am Ende dieses Zeitraums wurden die Tiere eingeschläfert und die MAO-Spiegel in Gehirn, Leber und in den Eingeweiden bestimmt. Die Verbindungen 24, 25, 37 und 39 wurden subcutan und/oder durch den Mund mit einer Dosis von 6 mg/kg (sc) und 10 mg/kg (po) (Verbindung 24), 25 und 50 mg/kg (Verbindung 25), 45 mg/kg (Verbindung 37) und 40 mg/kg (Verbindung 39) verabreicht.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 11a gezeigt, aus der gesehen werden kann, dass diese Verbindungen Selektivität bei der Hemmung der MAO-Enzym-Unterarten mit Präferenz im Gehirn vor der Peripherie zeigten. Tabelle 11

Tabelle 11a. Wirkung der Verbindungen 24, 25, 37 und 39 auf die MAO-Aktivität nach chronischer subakuter Behandlung von Ratten
Beispiel 3
Wirkung der Arzneistoffbehandlung, die auf eine geschlossene Kopfverletzung (CHI) in Mäusen folgt
Das Verfahren für eine geschlossene Kopfverletzung, dem gefolgt wurde, war wie in Shohami et al. (J Neurotrauma, (1993), 10 (2): 109–119) für Ratten beschrieben, mit Änderungen, wie beschrieben.
Tiere: Männliche Sabra-Mäuse (Stamm der Hebrew University), die 34–40 g wiegen, wurden verwendet. Sie wurden in 10-er Gruppen pro Käfig gehalten, in einem 12 Std.: 12 Std. Licht: Dunkel-Zyklus. Futter und Wasser wurde ad libitium bereitgestellt.
Trauma wurde unter Etheranästhesie induziert. Ein Longitudinalschnitt wurde in der Haut, welche den Schädel bedeckt, durchgeführt und die Haut zurückgezogen, um den Schädel freizulegen. Der Kopf wurde manuell auf der unteren Ebene der Schlagvorrichtung befestigt. Ein Gewicht von 333 g wurde durch eine elektrische Einrichtung aus einer Entfernung von 3 cm an die linke Hemisphäre, 1–2 mm lateral zur Mittellinie der mittleren Frontalebene, abgegeben. Testverbindungen wurden subcutan injiziert, einmal 15 min nach CHI bei einer der ED₅₀ der Acetylcholinesterase entsprechenden Dosierung.
3.1 Bewertung der motorischen Funktion

Motorische Funktion und Reflexe wurden in den verletzten Mäusen zu verschiedenen Zeiten nach der geschlossenen Kopfverletzung (CHI) evaluiert, unter Verwendung einer neurologischen Punktebewertung des Schweregrads (NSS), wie in nachstehender Tabelle 12 gezeigt, welche von der für Ratten beschriebenen (Shohami et al., supra.) modifiziert wird. Ein Punkt wurde für das Fehlen eines getesteten Reflexes vergeben oder für die Unfähigkeit, die in der Tabelle umrissenen Aufgaben auszuführen. Die maximale Punktebewertung, die bei 1 Stunde post-CHI erreicht werden konnte, ist 25 Punkte und 21 zu späteren Zeiten. Der Unterschied in der NSS bei 1 Std. und zu jeder anderen Zeit spiegelt die Erholung wider und wird als ΔNSS bezeichnet. Eine NSS-Punktebewertung von 15–19 bei 1 Std. zeigt eine schwerwiegende Verletzung an, 11–14 eine moderate Verletzung und weniger als 10 eine leichte Verletzung. Die nach Behandlung mit einer Testverbindung oder Kontrolle aufgezeichnete NSS wird in Tabelle 13 gezeigt. Tabelle 12 Neurologische Punktebewertung des Schweregrads für Mäuse nach geschlossener Kopfverletzung

Parameter	Punkte bei 1 Stunde	Punkte zu jeder anderen Zeit
Unfähigkeit, einen Kreis (30 cm Durchmesser) zu verlassen, wenn man sie in seiner Mitte zurückließ
30 min lang	1
60 min lang	1
> 60 min lang	1	1
Verlust des Stellreflexes
10 Sekunden lang	1
20 Sekunden lang	1
> 30 Sekunden lang	1	1
Hemiplegie – Unfähigkeit der Maus, erzwungenen Positionsänderungen zu widerstehen	1	1
Beugung der Hinterextremität, wenn man sie am Schwanz hochgehebt	1	1
Unfähigkeit, gerade zu gehen, wenn man sie auf den Boden setzt	1	1
Reflexe
Ohrenreflex	1	1
Lidreflex	1	1
Moro-Reflex	1	1
Klinischer Grad
Verlust des Suchverhaltens	1	1
Prostration	1	1
Verlust von Reflexen
linke Vorderextremität	1	1
rechte Vorderextremität	1	1
linke Hinterextremität	1	1
rechte Hinterextremität	1	1
Funktioneller Test
Misslingen der auf dem Balken-Gleichgewicht-halten-Aufgabe (0,5 cm breit)
20 Sekunden lang	1	1
40 Sekunden lang	1	1
> 60 Sekunden lang	1	1
Misslingen der Rundstock-Gleichgewicht-halten-Aufgabe (0,5 cm Durchmesser)
10 Sekunden lang	1	1
Misslingen der auf dem Balken-gehen-Aufgabe
3 cm breit	1	1
2 cm breit	1	1
1 cm breit	1	1
Maximale Punkte	25	21

Ergebnisse Bewertung der motorischen Funktion Tabelle 13. Änderung der neurologischen Punktebewertung des Schweregrads nach geschlossener Kopfverletzung bei Mäusen

Arzneistoff/Dosis	N	ΔNSS, 24 Std. post-CHI	ΔNSS, 7 Tage post-CHI	ΔNSS, 14 Tage post CHI
Salzlösung, 1 ml/kg	51	4,75 ± 0,17	5,83 ± 0,36	5,96 ± 0,4
1 (1,3 mg/kg)	10	5,50 ± 0,34*	7,31 ± 0,42*	9,21 ± 0,47
24 (6,5 mg/kg)	12	6,11 ± 0,23*	8,67 ± 0,41*	9,67 ± 0,66*
25 (46 mg/kg)	10	5,00 ± 0,42	7,42 ± 0,62*	9,01 ± 0,69*
25¹ (45 mg/kg	10	4,90 ± 0,43	7,70 ± 0,33*	8,80 ± 0,33*
10 (15 mg/kg)	11	5,36 ± 0,39	6,64 ± 0,41*	6,73 ± 0,52
37 (30 mg/kg)	12	5,50 ± 0,26	6,92 ± 0,38	8,25 ± 0,62
39 (30 mg/kg)	14	5,36 ± 0,25	6,71 ± 0,45	7,64 ± 0,48

1. verabreicht 60 min vor CHI
* wesentlich verschieden von der Salzlösungs-Kontrolle (p < 0,05)

3.2 Bewertung des Referenz-Gedächtnis
Morris-Wasser-Labyrinth-Test: das Wasser-Labyrinth besteht aus einem kreisförmigen Aluminiumbassin, 1 m im Durchmesser und 60 cm tief, bis zu einer Tiefe von 17,5 cm mit Wasser gefüllt. Die versteckte Zielplattform ist ein, an einem festgelegten Standort im Bassin, 1 cm unter die Wasseroberfläche gesetztes umgedrehtes Glasgefäß (15 cm Durchmesser × 16,5 cm Höhe). Die Wassertemperatur wird bei 24°C gehalten und das Bassin wird immer in die gleiche Position im Raum gesetzt, um die gleichen Extra-Labyrinth-Hinweise bereitzustellen. Vor der CHI (wie im vorstehenden Beispiel 3 beschrieben) wurde den Mäusen 3 Versuche pro Tag an 5 aufeinanderfolgenden Tagen gegeben, um eine Grundausführung, die Plattform vom gleichen Start-Standort aus zu finden – gemessen als die Latenzzeit – zu etablieren. 24 Std. nach CHI beginnend, wurden Mäuse wieder täglich 2 Wochen lang in 3 Versuchen pro Tag getestet.
Die 1, 2 und 3 zeigen die Verringerung der Latenzzeit für Mäuse, die mit den Verbindungen 24 (6,5 mg/kg), 25 (46 mg/kg), 1 (1,3 mg/kg), 10 (15 mg/kg), 37 (30 mg/kg) oder 39 (30 mg/kg) behandelt wurden, im Vergleich zu mit Salzlösung behandelten Kontrollen nach CHI. Es scheint, dass Mäuse post-CHI sofort den Standort des Ziels vergessen. Nach Behandlung mit Testverbindungen ist das Gedächtnis im Vergleich zu mit Kochsalzlösung behandelten Mäusen verbessert. In den Abbildungen zeigt der Pfeil die Zeit der CHI.
Beispiel 4:
Wirkung auf Mäuse, die eine hypobare hypoxische Episode erfahren haben
Das hypobare hypoxische Modell ist ein anerkanntes Modell zur Bewertung der Aktivität von Verbindungen, von denen geglaubt wird, dass sie neuroschützende Aktivität besitzen. Das Modell beruht auf dem in Nakanishi, M., et al., Life Sci., (1973), 13: 467, Oshiro et al., J. Med. Chem., (1991), 34: 2004–2013 und US Patent 4,788,130 beschriebenem Modell.
Ein 12 Liter Exsikkator (Exsikkator A) und ein 2,5 Liter Exsikkator (Exsikkator B) wurden separat mit einer Vakuumpumpe verbunden. Exsikkator B wurde getrennt und man ließ ihn mit Raumluft äquilibrieren, während Exsikkator A auf einen Druck von 100 mm Hg evakuiert wurde. Vier männliche ICR Albinomäuse (22–28 g) wurden in Exsikkator B gesetzt. Exsikkator B wurde dann zur Raumluft hin geschlossen und mit Exsikkator A verbunden. Der Druck innerhalb von Exsikkator B wurde unter Verwendung eines Quecksilbermanometers kontrolliert, und an dem Punkt, wo der Druck in Exsikkator B 200 mm Hg (gewöhnlich innerhalb von 14 Sekunden) erreichte, wurden die zwei Exsikkatoren von der Vakuumpumpe getrennt und die Pumpe ausgeschaltet. Die Überlebenszeit von dem Zeitpunkt der Hypoxieinduktion bis zum Zeitpunkt des Atmungsstillstands wurde für jede Maus für maximal 15 Minuten aufgezeichnet, nach dieser Zeit wurde wieder Raumluft in Exsikkator B eingeführt. Überlebende wurden auf Zeichen von Lethargie oder Vitalität kontrolliert.
Die Wirkung der Arzneistoffbehandlung wurde in Prozent der Überlebenszeit der mit Arzneistoff behandelten Gruppe in Bezug auf die mit Salzlösung injizierte oder mit Vehikel injizierte Kontrollgruppe bewertet. Kontrollgruppen ließ man zweimal, vor und nach jeder Versuchsgruppe, durchlaufen, und, um ein konstantes Restvolumen an Sauerstoff in allen Tests zu gewährleisten, bestanden sie aus 8 Mäusen in Gruppen zu 4 Mäusen. Die Wirkung jeder Dosis des Testarzneistoffes wurde doppelt bestimmt, d. h. zwei Gruppen von 4 Mäusen. Der Bereich der Überlebenszeit der Kontrollmäuse war von 108–180 Sekunden.
Positive Referenzarzneistoffe waren Natriumpentobarbital bei einer Dosis von 40 mg/kg und Diazepam 10 mg/kg 0,5 Std. vor der Hypoxie gegeben, Physostigmin 0,2 und 0,4 mg/kg und Neostigmin 0,2 mg/kg sc 30 min vor der Hypoxie gegeben. Methylatropin 1 mg/kg wurde sc 10 min vor Physostigmin gegeben.
Testarzneistoffe wurden in 0,9% Salzlösung gelöst und sc in den Nackenspalt bei einer Dosis, die in Übereinstimmung mit dem Körpergewicht ist, 60–90 min vor der Hypoxie injiziert. Das Injektionsvolumen war 0,2–0,3 ml pro Maus (10 ml/kg). Die Anfangsdosis war etwa ein Drittel der berichteten LD₅₀ für die Hemmung der Acetylcholinesterase. Falls kein Schutz erhalten werden konnte, wurde die Dosis weiter bis zur nächsten nicht toxischen Dosis gesteigert. Im Fall des Schutzes wurde die Dosis, in dem Ansatz, den „schützenden" Dosisbereich ausfindig zu machen, weiter reduziert.

In Tabelle 14 werden Prozent-Überlebenszeiten im Vergleich zu der mit Salzlösung behandelten Kontrolle gezeigt. Tabelle 14. Überlebenszeit von Mäusen, die eine hypobare hypoxische Episode erfahren haben

Verbindung	Dosis mg/kg	Zeitpunkt der Dosis (vor der Hypoxie)	Schutz (% der Kontrolle)	p
Kontrolle (Salzlösung)			100
Nembutal	40	30	253 ± 200	< 0,005
Diazepam	10	30	316 ± 78	< 0,003
Neostigmin	0,2	30	141 ± 32	< 0,01
Physostigmin	0,2 0,4	30 30	453 ± 222 552 ± 210	< 0,001 < 0,001
Physostigmin und Atropinmethylnitrat	0,4 1,0	30 40	296 ± 193	< 0,05
1	8 4 2	60 60 60	637 ± 116 470 ± 200 120 ± 51	0,007 0,001 NS
24	50 21	60 60	738 ± 00 269 ± 166	< 0,001 < 0,02
25	100 75 50 25	60 60 60 60	761 ± 91 559 ± 225 380 ± 231 84 ± 35	0,001 0,001 0,01 NS
27	50 3 15 8	60 60 60 60	455 ± 23 287 ± 119 143 ± 56 119 ± 45	< 0,001 < 0,001 < 0,05 NS
29	77 51 25 25	60 60 60 30	508 ± 206 638 ± 10 131 ± 56 273 ± 183	< 0,001 < 0,001 NS < 0,02
10	50 25 10	90 90 90	705 ± 101 700 ± 201 304 ± 129	< 0,001 < 0,001 < 0,001
12	20 15 10 7	60 60 60 60	725 ± 128 649 ± 221 386 ± 238 248 ± 97	< 0,001 < 0,001 < 0,01 < 0,001

Beispiel 5
Neurologische Punktebewertung und Größe des Gehirninfarkts bei männlichen Wistar-Ratten, nach Okklusion der mittleren Gehirnarterie (MCA-O)
Eine Modifikation des von Tamura et al. beschriebenen Verfahrens wurde verwendet (Tamura A, Graham Dl, McCulloch J, Teasdale GH (1981) J. Cereb. Blond Flow and Metab., 1: 53–60). Männliche Wistar-Ratten (Olac England-Jerusalem), jede 300–400 g, wurden mit einer Lösung aus Equitesin, die bei einer Dosis von 3 ml/kg i.p. verabreicht wurde, betäubt. Equitesin besteht aus 13,5 ml Natriumpentothal-Lösung (60 mg/ml), 3,5 g Chloralhydrat, 1,75 g MgSO₄, 33 ml Propylenglycol, 8,3 ml absolutem Alkohol, aufgefüllt auf 83 ml mit destilliertem Wasser.
Der chirurgische Eingriff wurde unter Verwendung eines mit großer Vergrößerung arbeitenden Mikroskops, Modell SMZ-2B, Typ 102 (Nikon, Japan), durchgeführt. Um die mittlere Gehirnarterie freizulegen, wurde ein Schnitt in den Schläfenmuskel gemacht. Die Spitze des Kronenfortsatzes des Unterkiefers wurde ebenso herausgeschnitten und mit einer feinen Knochenzange entfernt. Kraniektomie wurde mit einem Dentalbohrer an der Verbindung zwischen der Medianwand und dem Dach der inferotemporalen Fossa gemacht.
Die Dura mater wurde vorsichtig unter Verwendung einer Nadel des Kalibers 27 geöffnet. Die MCA wurde dauerhaft okkludiert durch mikrobipolare Koagulation bei niedriger Stromeinstellung, beginnend 2–3 mm medial zur Riechbahn zwischen ihrer kortikalen Verzweigung zum Nasencortex und den Rami laterales. Nach der Koagulation wurde die MCA mit einer Mikroschere abgetrennt und, um vollständige Okklusion zu sichern, geteilt. Im Anschluß daran, wurde der Schläfenmuskel vernäht und über die Kraniektomiestelle gelegt. Die Haut wurde mit einem durchgehenden 3-0 Seidenfaden vernäht. Eine Scheinkranektomieoperation wurde an einer Parallelgruppe Ratten durchgeführt, jedoch ohne Kauterisierung der MCA.
Während der gesamten chirurgischen Operation (20–25 min) wurde in beiden Gruppen mit Hilfe eines Körpertemperaturregulators (Kyoristsu, Japan), welcher aus einem selbstregulierenden, mit einem rektalen Thermistor verbundenen Heizkissen besteht, die Körpertemperatur bei 37 bis 38°C gehalten. 24 und 48 Stunden nach dem chirurgischen Eingriff wurde eine neurologische Punktebewertung vorgenommen, um den Schweregrad der Verletzung bei den mit Arzneistoff behandelten Ratten in Bezug auf ihre nicht behandelten Kontrollen zu bewerten.
Arzneimittel wurden gemäß dem folgenden Plan als s.c. Injektion verabreicht:
Verbindung 24: 7,8 mg/kg 15 Minuten vor MCA-O und 6,5 mg/kg 2 Stunden nach MCA-O.
Verbindung 25: 43 mg/kg 90 Minuten vor MCA-O und 30 mg/kg 3 Stunden nach MCA-O.
Nach 48 Stunden durch dauerhafte morphometrische Okklusion induzierter Ischämie wurden die Tiere mit Equitesin anästhesiert und die Messung des Infarktvolumens wurde wie folgt durch Färben mit TTC (2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid) durchgeführt. 1% TTC in Salzlösung wurde unmittelbar vor Verwendung hergestellt und vor Lichtexposition durch eine Aluminiumfolienverpackung geschützt. MCA-O Ratten wurden tief anästhesiert und eine Schmetterlingsnadel des Kalibers 23 mit einem verlängerten Schlauch und einer 20 ml Spritze wurde über Thorakotomie in das Ventrikel eingeführt. Das rechte Atrium wurde eingeschnitten, um das Ausfließen von Salzlösung zu ermöglichen. Heparin 50 I.U. in Salzlösung wurde abgegeben, bis das Perfusat blutlos war. Eine mit 30 ml TTC gerollte Spritze wurde gegen die Salzlösungsspritze ausgetauscht, und TTC wurde mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/min in das linke Ventrikel injiziert. Beide Perfusatlösungen wurden bei 37,5°C verabreicht. Die Gehirne wurden entfernt und in 20 ml in fest verschlossenen Glasfläschchen enthaltenem 1% TTC eingetaucht. Diese wurden ferner 2 Stunden lang in ein bei 37°C gehaltenes Wasserbad gesetzt. Die TTC-Lösung wurde abdekantiert, die Gehirne entfernt, trocken gewischt und 3 Tage lang in gepufferte 10%ige Formalinlösung gesetzt. Sechs koronale Schnitte, jeder 2 mm dick, 3, 5, 7, 9, 11 und 13 mm distal vom Frontalpol wurden mit einer Hirnmatrix (Harvard Apparatus, South Natick, MA) erhalten. Infarktbereiche wurden mit einem Videobildgeber und -analysator von beiden Seiten der koronalen Schnitte gemessen und in mm² angegeben. Das Volumen der infarzierten Region in mm² wurde über die Summe der ischämischen Bereiche aller sechs Schnitte berechnet. Das Volumen der infarzierten Region für die Salzlösungskontrolle und die Verbindungen 24 oder 25 werden in Tabelle 15a angegeben.
Neurologische Punktebewertung
Die neurologische Punktebewertung wurde auf eine Weise gemessen, die etwas anders als die in Beispiel 3 angegebene ist. Dieses Verfahren besteht aus der Gesamtsumme einer Reihe von Bewertungen, die der Ausführung spezifischer lokomotorischer Aktivitäten einer angegebenen Ratte zugeordnet sind. Die Skala verläuft von 0 (ganz normale Ratten) bis 13 (vollauf behinderte Ratten). Die meisten Parameter werden entweder mit 0 (normal) oder 1 (behindert) bewertet, andere werden abgestuft. Die folgenden Tests wurden in der vorliegenden Untersuchung verwendet:

Allgemeine Beobachtungstests: Hypoaktivität, Sedierung, Piloarrektion.
Motorischer Reflex. Ratten wurden am Schwanz etwa 15 cm über den Boden gehoben. Normale Ratten nehmen eine Körperhaltung ein, bei der sie die beiden vorderen Extremitäten gegen den Boden ausstrecken und die hinteren Extremitäten in trapezähnlicher Weise zu den Seiten ausbreiten. Eine schwerwiegende MCAO verursacht eine stetige Beugung der kontralateralen Extremität.
Motorische Fähigkeit. Diese wird als die Fähigkeit verstanden, einen Stab mit 1 cm im Durchmesser durch die kontralaterale Extremität 5–15 Sek. lang zu greifen, wenn die Ratte durch die Achselhöhle am Stab hängen gelassen wird.
Motorische Koordination. Normale Ratten sind in der Lage, auf einem 5 cm breiten, in einer moderaten Schräge gesetzten Balken auf und ab zu gehen. Das Misslingen des Gehens auf dem Balken in irgendeine Richtung deckt gewisse motorische mangelhafte Koordination, Fehlen von Gleichgewicht und Extremitätenschwäche auf.
Gang. Die Fähigkeit, eine normale Position entweder der kontralateralen Hinter- oder kontralateralen Vorderextremität wiederherzustellen, wenn man sie vorsätzlich vertreibt, während sie auf einem schmalen Balken ist.
Gleichgewicht. Die Fähigkeit, zu greifen und das Gleichgewicht auf einem schmalen, 2 cm breiten Balken zu halten.
Lokomotorische Aktivität. Die Gesamtbewegungen über einen Zeitraum von 15 min hinweg in einem automatischen Aktivitätskäfig.

Zu jedem der vorstehenden Parameter zugeordnete Bewertungen werden in Tabelle 15 angegeben. Tabelle 15. Jedem der 10 Parameter der Körperhaltung und Lokomotion zugeordnete neurologische Punktebewertungen

Parameter	Punktebewertung
a. Aktivität im eigenen Käfig	normal = 0	hypoaktiv = 1
b. Sedierung	keine = 0	merklich = 1
c. Piloarrektion	keine = 0	merklich = 1
d. Ausstrecken der kontralateralen Vorderextremität in Richtung Boden, wenn man sie am Schwanz hochhebt	gut = 0	gebeugte Extremität = 1
e. Spreizen der kontralateralen Hinterextremität, wenn man sie am Schwanz hochhebt (trapezoide Körperhaltung)	gut = 0	gebeugte Extremität = 1
f. Greifen einer Stange mit der kontralateralen Extremität für 5–15 sec, wenn man sie an der Achselhöhle aufhängt	gut = 0	schlecht = 1
g. Gehen auf einem 5 cm breiten Balken	gut = 0	schlecht = 1
h. Wiederherstellung der Ausgangsposition der Hinter-und/oder Vorderextremität, wenn man sie vorsätzlich vertreibt	gut = 0	schlecht = 1 (eine Extremität) 2 (zwei Extremitäten)
i. Greifen & Gleichgewicht auf einem 2 cm breiten Balken	gut = 0	schlecht = 1
j. Motorische Aktivität in Bezug auf die Kontrolle (15 min in einem Aktivitätskäfig)	0–25% der Kontrolle = 3
	26–50% der Kontrolle = 2
	51–75% der Kontrolle = 1
	76–100% der Kontrolle = 0
k. Tendenz, sich auf die kontralaterale Seite zu neigen	1
l. Kontralaterales Kreisen, wenn man sie am Schwanz zieht	1
m. Spontanes kontralaterales Kreisen	1

Tabelle 15a zeigt die Wirkung der Verbindungen 24 und 25 in diesem Modell, wobei die Änderung in NSS, 24 und 48 Stunden nach der Verletzung gemessen, verglichen werden. Tabelle 15a

Verbindung ΔNSS* mittleres Infarktvolumen ± SD mm²

Salzlösung 0,745 211 ± 75

24 1,625 152 ± 45

25 1,78 189 ± 54

* Unterschied in ΔNSS, gemessen bei 24 Stunden und 48 Stunden. Hieraus kann gesehen werden, dass die Verbindungen 24 und 25 eine länger anhaltende Wirkung aufweisen als die mit Salzlösung behandelte Kontrolle.

Claims

Verbindung der Struktur:
wobei R₂ Boc ist und R₃ Wasserstoff ist; und wobei R₁ OH oder die Gruppe
ist und racemische Gemische, Enantiomere oder Salze davon.
Verbindung nach Anspruch 1 umfassend 6-Hydroxy-1-N-Boc-aminoindan und racemische Gemische oder Enantiomere davon.
Verbindung nach Anspruch 1 der Struktur:
und racemische Gemische, Enantiomere oder Salze davon.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Enantiomer das R-Enantiomer ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Enantiomer das S-Enantiomer ist.