CN117778496A - 纯化唾液酸化的低聚糖的方法 - Google Patents

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Abstract

公开了一种从发酵液、细胞裂解物或生物催化的反应混合物中纯化唾液酸化的低聚糖以获得大量高纯度的所需的唾液酸化的低聚糖的方法。所述方法特别适于从使用重组细菌细胞或酵母细胞的微生物发酵中大规模、经济地纯化唾液酸化的人乳低聚糖(例如3’‑唾液酸乳糖、6’‑唾液酸乳糖或唾液酸化的乳‑N‑四糖衍生物)。所得的材料具有高纯度且可用于食品或医药应用，例如医药营养产品、婴儿配方物、膳食补充剂、一般营养产品(例如乳制饮料)。

Description

纯化唾液酸化的低聚糖的方法
本发明涉及唾液酸化的低聚糖的纯化。更具体而言，本发明涉及从发酵液、澄清化的细胞裂解物或反应混合物中纯化唾液酸化的低聚糖，特别是唾液酸化的人乳低聚糖(sHMO)。
背景技术
人乳是碳水化合物、脂肪、蛋白质、维生素、矿物质和微量元素的复杂混合物。碳水化合物是迄今为止最丰富的级分，其可进一步分成乳糖和更复杂的低聚糖——所谓的人乳低聚糖(HMO)。尽管乳糖用作能量来源，但是复杂的低聚糖不被婴儿代谢。复杂的低聚糖级分占总碳水化合物级分的最高达10％，可能由多于150种不同的低聚糖组成。这些复杂的低聚糖的存在和浓度是人类特有的，并且因此不能在其他哺乳动物(例如驯养的产奶动物)的乳中大量发现。
这些复杂的低聚糖在人乳中的存在已经已知很长时间，并且这些低聚糖的生理功能已成为医学研究的主题持续数十年(Gura，T.(2014)Science345：747-749；Kunz，C.&Egge，H.(2017)在：Prebiotics and Probiotics in Human Milk.编辑McGuire，M.K；McGuire，M.A.&Bode，L..Elsevier，London第3-16页)。对于一些较丰富的HMO，已鉴定出特定的功能(Bode，L.(2012)Glycobiology 22：1147-1162.；Bode，L.和Jantscher-Krenn，E.(2012)Adv.Nutr.3：383S-391S；Morrow等人(2004)J.Pediatr.145：297-303)。
各HMO的有限供应以及不能获取足够量的这些分子，导致基于化学合成的方法的发展，以产生这些复杂分子中的一些。然而，HMO的化学合成，以及酶促合成和基于发酵的制备均已证明极具挑战性。迄今为止，很难实现具有足以用于食品应用的质量的HMO的大规模制备。特别地，HMO如2’-岩藻糖基乳糖(WO 2010/115935 A1)的化学合成需要几种有毒的化学物质，其可能污染最终产物。
HMO化学合成的缺点导致了几种酶促方法和基于发酵的方法的发展(Miyazaki等人，(2010)Methods in Enzymol.480：511-524；Murata等人，(1999)Glycoconj.J.16：189-195；Baumgartner等人(2013)Microb.Cell Fact.12：40；Lee等人，(2012)Microb.CellFact.11：48；US 7,521,212 B1；Albermann等人，(2001)Carbohydr.Res.334：97-103；Fierfort，N.和Samain，E.(2008)J.Biotechnol.134：216-265)。然而，这些方法倾向于产生低聚糖的复杂混合物，使得所需产物被起始物料如乳糖，以及中间体、不需要的副产物(例如源自某些糖基转移酶的副活性的副产物)和底物如各单糖和多肽污染。
从低聚糖混合物中纯化各低聚糖的现有技术方法在技术上是复杂的，难以扩大规模并且对于食品应用而言是不经济的。已经开发了工业规模的方法以从乳清或糖蜜中分别纯化二糖乳糖和蔗糖，但是这些方法涉及复杂且产率低的多个结晶步骤。然而，乳清和糖蜜是″食品级″产品，其复杂性和监管挑战性远不及由重组细菌或重组酵母发酵方法获得的发酵液。
凝胶过滤色谱法是用于纯化复杂的低聚糖如通过微生物发酵产生的HMO的最佳方法，但是凝胶过滤色谱法的缺点包括其缺乏可扩展性以及其与连续处理不兼容。因此，凝胶过滤色谱法是不经济的，并且不能制备具有用于人类食品、特别是用于婴儿和幼儿营养产品的足够质量和足够用量的HMO，如3’-唾液酸乳糖或6’-唾液酸乳糖或任何其他唾液酸化的低聚糖。然而，唾液酸化的HMO(如3’-唾液酸乳糖(3’-SL)、6’-唾液酸乳糖(6’-SL)、唾液酸乳-N-四糖a(LST-a)、唾液酸乳-N-四糖b(LST-b)、唾液酸乳-N-四糖c(LST-c)、3-岩藻糖基-唾液酸乳糖(F-SL)、二唾液酸乳-N-四糖(DS-LNT)和岩藻糖基-LST b(F-LSTb)的制备引起关注，这是因为唾液酸化的低聚糖例如与改善的神经元发育有关。
重组微生物(细菌或酵母)用于HMO的发酵制备的用途也是有问题的，因为重组DNA或蛋白质可污染最终产物，这在当今不会被消费者和监管机构所接受。鉴于特别是对于重组DNA分子的检测限非常低(例如，当使用基于qPCR的检测——当前被认为是检测的金标准——时)，甚至可以检测到低聚糖产物中的那么小的单个DNA分子。此外，蛋白质还具有引起过敏反应的风险，因此也应从所需的低聚糖产物中有效去除。
从该现有技术出发，一个目的是提供一种纯化通过微生物发酵产生的唾液酸化的低聚糖、特别是唾液酸化的HMO的方法，其中所述方法适用于商业规模或工业规模制备唾液酸化的低聚糖，并且其可产生具有使产物适于人类食用的纯度的产物。
发明内容
在第一方面，提供一种纯化唾液酸化的低聚糖的方法，所述唾液酸化的低聚糖通过微生物发酵或体外生物催化产生。
在第二方面，提供唾液酸化的低聚糖的制剂，所述唾液酸化的低聚糖通过微生物发酵或体外生物催化产生。
在第三方面，提供根据第二方面的唾液酸化的低聚糖的用途。
在第四方面，提供包含至少一种唾液酸化的低聚糖的营养组合物，其中所述至少一种唾液酸化的低聚糖通过微生物发酵或体外生物催化产生。
在第五方面，提供喷雾干燥的不含GMO的粉末，其基本上由唾液酸化的低聚糖组成。
附图说明
图1显示了3’-唾液酸乳糖和6’-唾液酸乳糖的化学结构。
图2示出了说明从发酵液中纯化唾液酸化的低聚糖的方法的实施方案的图。
图3示出了说明从发酵液中纯化唾液酸化的低聚糖的方法的实施方案的图。
图4示出了说明从发酵液中纯化唾液酸化的低聚糖的方法的实施方案的图。
图5示出了四区模拟移动床色谱法的原理。
图6示出了八区模拟移动床色谱法的原理。
图7示出了说明喷雾干燥的6’-SL的X射线粉末衍射结果的图。
图8示出了说明喷雾干燥的3’-SL的X射线粉末衍射结果的图。
具体实施方式
根据第一方面，提供一种纯化通过微生物发酵产生的唾液酸化的低聚糖的方法或工艺。所述方法包括以下步骤：
i)从发酵液中分离生物质；
ii)从发酵液中去除阳离子；
iii)从发酵液中去除阴离子杂质；以及
iv)去除分子量低于待纯化的唾液酸化的低聚糖的分子量的化合物。
在一个实施方案中，所需的唾液酸化的低聚糖通过微生物发酵产生。因此，在容许细胞产生所需的唾液酸化的低聚糖的条件下培养能够产生所需的唾液酸化的低聚糖的细胞。用于产生所需的低聚糖的合适细胞包括细菌，例如大肠杆菌(Escherichia coli)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putita)，或酵母，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。
可以对细胞进行基因改造以产生所需的唾液酸化的低聚糖(在基因上未经修饰的前体细胞不能够产生所需的唾液酸化的低聚糖)或提高所需低聚糖的生产效力。大肠杆菌是用于代谢工程的优选宿主，已被用于HMO(中性HMO以及唾液酸化的HMO)的发酵。然而，其他宿主菌株——例如酵母(如酿酒酵母)、乳酸菌、谷氨酸棒状杆菌、芽孢杆菌(Bacillus)属种——同样也可以进行精心改造，以产生低聚糖，通常是HMO，以及特别是唾液酸化的HMO，所述其他宿主菌株具有GRAS状态(一般认为是安全的)。
对于所需的唾液酸化的低聚糖的产生，细菌或酵母宿主菌株通常含有一种或多种异源糖基转移酶，通常是至少一种异源唾液酸转移酶，过量表达用于合成CMP-唾液酸(例如CMP-唾液酸合成酶，除了唾液酸摄取或从头合成中涉及的基因之外)、乳糖输入蛋白和/或所需sHMO的合适输出蛋白的基因。当使用酵母作为sHMO的产生宿主时，合适的输出蛋白的表达是特别有利的，这是因为已知酿酒酵母(S.cerevisiae)在不具有合适的输出蛋白的情况下不会以经济可行的量将异源产生的低聚糖分泌到发酵液中。
关于唾液酸化的低聚糖的术语″所需的″是指应由细胞产生的唾液酸化的低聚糖。所需的唾液酸化的低聚糖是通过本文公开的工艺待纯化的低聚糖。如本文所用，关于唾液酸化的低聚糖的术语″所需的″还用于区分待产生的唾液酸化的低聚糖与细胞可能无意产生的其他唾液酸化的低聚糖。
如本文所用，术语″低聚糖″是指直链或支链的糖类，其由3至20个单糖残基组成。
在一个实施方案中，唾液酸化的低聚糖是唾液酸化的HMO。如本文使用，术语″唾液酸化的HMO″是指包含一个或多个唾液酸残基的人乳低聚糖。
所述方法包括从发酵液中分离生物质的步骤。该步骤是纯化唾液酸化的低聚糖的工艺中的第一步。
如本文所用，术语″生物质″是指在发酵步骤结束时存在于发酵液中的全部细胞。在发酵步骤结束时存在于发酵液中的细胞包括能够产生所需的唾液酸化的低聚糖的细胞，任选地，存在于发酵液中帮助产生唾液酸化的低聚糖的辅助细胞，例如降解不需要的副产物的细胞。因此，将在发酵步骤结束时存在于发酵液中的细胞从发酵液中分离，使得所得的发酵液基本上不含细胞。
从发酵液中分离生物质的合适方法包括离心，其中以颗粒形式获得生物质，以上清液形式获得发酵液。在另外的和/或替代的实施方案中，将生物质通过过滤从发酵液中分离。用于从发酵液中分离细胞的合适的过滤方法包括微滤和超滤。
微滤本身是一种物理过滤工艺，其中使含有颗粒的流体通过具有特定孔径大小的膜以从流体中分离出颗粒。如本文所用，术语″微滤″是指其中将细胞从发酵液中分离出的物理过滤工艺。
超滤是各种膜过滤，并且没有根本不同。在超滤中，诸如压力或浓度梯度之类的力导致通过半透膜的分离。高分子量的细胞、悬浮固体和溶质保留在所谓的渗余物中，而水和低分子量的溶质如所需的唾液酸化的低聚糖则通过膜进入渗透液(滤液)中。
超滤膜由所用膜的截留分子量(MWCO)限定。超滤以错流或死端模式而应用。
用于微滤或超滤的合适的过滤器为DS MP005 4333和纤维FS10-FC FUS1582(Microdyn-Nadir GmbH，Wiesbaden，DE)。
通常，细胞在细胞内合成所需的唾液酸化的低聚糖，并将其分泌到发酵液中。如此产生的唾液酸化的低聚糖最终出现在发酵液中，然后将所述发酵液进行如下文所述的纯化所需的唾液酸化的低聚糖的其他工艺步骤。
在其中所需的唾液酸化的低聚糖在其生物合成后保留在细胞内的实施方案中，将生物质从发酵液中分离，并将所述生物质用于纯化所需的唾液酸化的低聚糖。为此，将生物质的细胞裂解，并将所得裂解物通过从裂解物中去除不溶性成分、核酸、脂质和蛋白质进行澄清化。裂解细胞并从细胞裂解物中去除不溶性成分、核酸、脂质和/或蛋白质的方法是已知的。然后将如此获得的包含所需的唾液酸化的低聚糖的澄清化的裂解物进行与包含所需的唾液酸化的低聚糖的不含细胞的发酵液相同的工艺步骤，以便纯化所需的唾液酸化的低聚糖。
尽管纯化唾液酸化的低聚糖的工艺用于纯化通过微生物发酵产生的唾液酸化的低聚糖，但是所述工艺也可用于纯化通过体外酶促反应(所谓的体外生物催化反应)产生的唾液酸化的低聚糖。所需的唾液酸化的低聚糖通过一种或多种体外酶促反应获得，并且可在生物催化反应结束时通过对反应混合物——代替不含细胞的发酵液或澄清化的裂解物——进行本文所述的纯化工艺而从所述反应混合物中纯化。应理解，从体外生物催化的反应混合物中纯化唾液酸化的低聚糖不需要从反应混合物中去除生物质。
不含细胞的发酵液、澄清化的裂解物或反应混合物含有所需的唾液酸化的低聚糖以及大量杂质和不需要的成分，包括除所需的唾液酸化的低聚糖之外的其他低聚糖、一价盐、二价盐、氨基酸、多肽、蛋白质、有机酸、核酸和单糖。
纯化唾液酸化的低聚糖的工艺包括以下步骤：进行阳离子交换色谱法以从不含细胞的发酵液、澄清化的裂解物或反应混合物中去除带正电荷的化合物。
用于去除带正电荷的化合物的合适的阳离子交换树脂包括Lewatit S2568(H+)(Lanxess AG，Cologne，DE)。
纯化唾液酸化的低聚糖的工艺包括以下步骤：进行阴离子交换色谱法，以从不含细胞的发酵液、澄清化的裂解物或反应混合物中去除不需要的带负电荷的化合物。
合适的阴离子交换树脂包括Lewatit S6368 A、Lewatit S4268、Lewatit S5528、Lewatit S6368A(Lanxess AG.Cologne，DE)、Dowex AG 1x2(网目200-400)、Dowex 1x8(网目100-200)、Purolite Chromalite CGA100x4(Purolite GmbH，Ratingen，DE)、DowAmberlite FPA51(DOw Chemicals，MI，USA)。
纯化唾液酸化的低聚糖的工艺包括去除分子量低于待纯化的唾液酸化的低聚糖的分子量的化合物的步骤。除去分子量低于待纯化的唾液酸化的低聚糖的分子量的化合物的合适方法包括纳滤和渗滤。
渗滤包括向溶液中加入淡水，以去除(洗掉)可渗透膜的组分。渗滤可用于基于组分的分子大小和电荷通过使用合适的膜来分离组分，其中一种或多种物质被有效地保留，而其他物质是膜可渗透的。具体地，使用纳滤膜的渗滤有效地用于从盐中分离低分子量化合物。纳滤膜的截留分子量通常为150-300道尔顿。纳滤在乳品行业中广泛用于乳清的浓缩和去矿化。
用于纳滤和/或渗滤的合适的膜包括Dow Filmtec NF270-4040、Trisep4040-XN45-TSF(Microdyn-Nadir GmbH，Wiesbaden，DE)、GE4040F30和GH4040F50(GE Water&Process Technologies，Ratingen，DE)。
发现使用纳滤膜的渗滤可有效地作为预处理，以在含有HMO的溶液的电渗析处理之前去除大量的污染物。然而，发现纳滤可在超滤步骤之后有效地去除低分子量污染物，其中所述去除对于在离子交换剂处理之前对HMO溶液进行浓缩和去矿化是有益的。在纯化HMO的过程中使用纳滤膜进行浓缩和渗滤会使能量和加工成本更低，并由于减少的热暴露而使产品质量更好，从而导致美拉德反应和羟醛反应减少。
所述纯化工艺提供在制剂中的所需的唾液酸化的低聚糖，其中所述所需的唾液酸化的低聚糖的纯度为≥80％、≥85％、≥90％、≥95％。所述工艺提供唾液酸化的低聚糖的制剂，其中唾液酸化的低聚糖的纯度适于食品和饲料应用。
此外，所述工艺具有成本效益并且易于扩展，使其适合作为多吨规模制造方法的基础。
纯化唾液酸化的低聚糖的工艺还是有利的，因为获得的所需的唾液酸化的低聚糖不含重组DNA和重组蛋白质，所述重组DNA和重组蛋白质衍生自可用作加工助剂的重组微生物发酵菌株。
在另外的和/或替代的实施方案中，所述工艺还包括纳滤步骤，以增加溶液中糖类的浓度。
在另外的和/或替代的实施方案中，所述工艺包括电渗析步骤。
电渗析将渗析和电解组合，可用于基于离子通过半透膜的选择性电迁移来分离或浓缩溶液中的离子。
电渗析(ED)将渗析和电解组合，可用于基于离子通过半透膜的选择性电迁移来分离或浓缩溶液中的离子。工业电渗析应用追溯到20世纪60年代初，当时该方法用于干酪乳清的去矿化，以包含在婴儿配方物中。电渗析的其他应用包括饮料pH的调整，所述饮料为例如葡萄酒、葡萄汁、苹果汁和橙汁。
用于饮用水制备的微咸水脱盐以及用于婴儿食品制备的牛奶乳清的去矿化是现今电渗析最广泛的应用(Tanaka，Y.(2010)Ion Exchange MembraneElectrodialysis.Nova Science Publishers，Inc.New York)。
电渗析的基本原理由一个电解池组成，所述电解池包括一对浸没在电解质中用于传导离子的电极，其与直流发电机连接。连接到直流发电机的正极的电极是阳极，连接到负极的电极是阴极。然后电解质溶液支持电流，其由负离子和正离子分别朝着阳极和阴极移动而产生。用于电渗析的膜基本上是具有负或正电荷基团的多孔离子交换树脂片，因此分别描述为阳离子或阴离子膜。离子交换膜通常由与二乙烯基苯交联的带有合适的官能团(例如用于阳离子膜的磺酸或用于阴离子膜的季铵基团)的聚苯乙烯制成。电解质可为，例如，氯化钠、乙酸钠、丙酸钠或氨基磺酸。然后以如下方式组装电渗析堆，使阴离子膜和阳离子膜在两个电极块之间就像在压滤机中一样平行，以使经历离子消减的物流与经历离子富集的物流充分分离(两种溶液也称为稀释液(经历离子消减)和浓缩液(经历离子富集)。电渗析工艺的核心是膜堆，其由几个用垫片隔开的阴离子交换膜和阳离子交换膜组成，安装在两个电极之间。通过施加直流电流，阴离子和阳离子将跨膜朝着电极迁移，从而产生(脱盐的)稀释液流和浓缩液流。
通过在电渗析过程中施加酸性条件，可将sHMO质子化，使得其看起来不带电荷(低聚糖唾液酸部分的羰基质子化)。或者，可在中性条件下使用双极膜进行电渗析。在这种情况下，唾液酸化的低聚糖甚至可在单独的电渗析浓缩液回路中浓缩。因此，唾液酸化的低聚糖甚至可在电渗析过程中富集。
离子交换膜的孔径足够小，以防止由两个物流之间的高浓度差驱动产物从稀释液流扩散到浓缩液流中。从生物质中分离后，蛋白质以及特别是重组DNA分子(大小从片段到整个基因组)必须从所需产物中定量去除。如果可能的话，这类大分子(与HMO的分子大小相比)的电渗析将花费很长时间，必定伴随着所需产物从稀释液进入到浓缩液的大量损失。
在另外的和/或替代的实施方案中，纯化唾液酸化的低聚糖的工艺还包括模拟床移动(sMB)色谱法的步骤。
模拟移动床(SMB)色谱法起源于石油化学工业和矿产工业。现今，SMB色谱法被制药工业所使用，以从外消旋混合物中分离对映异构体。大规模SMB色谱法已用于从果糖-葡萄糖溶液中分离单糖果糖，以及用于从甜菜或甘蔗糖浆中分离二糖蔗糖。然而，SMB色谱法尚未用于在化学合成、酶促合成或基于发酵的合成过程中纯化唾液酸化的人乳低聚糖，例如唾液酸化的乳-N-四糖、3’-唾液酸乳糖或6’-唾液酸乳糖。SMB已用于从牛乳中纯化唾液酸乳糖，但是与微生物发酵液(其在本文中用作HMO的来源)相比，牛乳是完全不同的基质。
SMB色谱法用作连续分离工艺，与连续化学分离工艺如精馏类似。在精馏中，在液相和气相之间建立逆流，从而可以连续施加进料和连续取出产物。与常规错流系统相比，逆流色谱法在理论上应实现更优异的分离，但是逆流系统中的移动相和固定相会需要向相反的方向移动。SMB色谱法发展为解决在连续色谱分离过程中试图移动固体色谱材料时遇到的实际困难的方案。
经典SMB概念涉及四个带有四个外部物流的不同区域：包含待分离的组分的进料流、解吸或流动相流、提取物，和萃余液流(萃余液流代表保留效率较低的组分)。这些液流将SMB系统分成四个具有以下任务的不同区域(每个区域或部分可包括一个或多个柱)：区域I需要用于固相的再生，区域II的目的是解吸较不强解吸的材料，区域III的任务是强吸附材料的吸附，最后区域IV的任务是较不易吸附材料的吸附(图5)。因此，较强的吸附组分在区域II中建立浓度波，并被传送到提取物端口，而较不强吸附的组分朝着萃余液端口迁移。
原则上，区域I和IV用于固相的再生(再生区域)，而区域II和III可被视为该系统的实际分离区域(分离区域)。除了四个液流和所得区域之外，该系统还包括(对于闭环操作)用于流动相(解吸剂)的循环泵，使流动相在一个方向上通过固定的区域。然后通过在系统中顺序地从一个柱子到下一个柱子定期转换和连续供应或取出进料、解吸剂和产物来实现逆流流动。
除了经典的四区闭环4SMB系统之外，还可使用三区开环系统，如果新鲜溶剂廉价(例如当水或水/乙醇混合物用作流动相时)，所述三区开环系统可更具成本效益。在三区环路配置中，不再需要液相的再生，从而废弃区域IV。
除了用于分离两组分混合物的经典SMB系统之外，还开发了八区闭环系统(图6)和五区开环系统用于分离超过2种的组分。
考虑到连续的操作模式、流动相的回收利用以及使用大的柱尺寸的潜力，SMB系统原则上可放大以实现数百吨的生产量。
模拟移动床色谱法的工艺步骤是有利的，这是因为该工艺步骤还允许去除与所需的唾液酸化的低聚糖在结构上密切相关的低聚糖。
在另外的和/或替代的实施方案中，所述工艺还包括去除着色剂的步骤。
去除着色剂的合适工艺步骤包括用活性炭如活性木炭处理不含细胞的发酵液或澄清化的裂解物。
用活性炭处理发酵液去除任何不需要的着色剂，并提供具有可接受外观的所需低聚糖的制剂。
在另外的和/或替代的实施方案中，纯化唾液酸化的低聚糖的工艺包括至少一个增加所需的唾液酸化的低聚糖的浓度的步骤。
在所述工艺的另外的和/或替代的实施方案中，在纯化步骤i)至iv)中的至少一个之后，优选在纯化步骤iv)之后，使用真空蒸发(例如通过使用降膜蒸发器或板式蒸发器)或反渗透或纳滤(例如用尺寸的纳滤膜进行纳滤)将含有所需的唾液酸化的低聚糖的溶液
a)浓缩至浓度≥100g/L，优选≥200g/L，更优选≥300g/L；和/或
b)在温度<80℃，优选<50℃，更优选为20℃至50℃，甚至更优选为30℃至45℃，最优选为35℃至45℃(与真空蒸发或反渗透特别相关)下浓缩；和/或
c)在温度<80℃，优选<50℃，更优选为4℃至40℃(与纳滤特别相关)下浓缩。
增加所需的唾液酸化的低聚糖的浓度的合适方法包括纳滤和溶剂蒸发。
在本发明工艺的另外的和/或替代的实施方案中，对纯化的溶液进行无菌过滤和/或进行内毒素去除，优选通过用3kDa过滤器或6kDa过滤器过滤纯化的溶液。
从发酵液、细胞裂解物或生物催化反应的反应混合物中纯化所需的低聚糖的工艺提供所需的低聚糖的水溶液。在另外的和/或替代的实施方案中，所述工艺还包括以下步骤：从唾液酸化的低聚糖中去除溶剂，从而提供所需的低聚糖的溶液，其包含高浓度的所需的低聚糖，或从而获得所需的低聚糖的固体制剂。
从唾液酸化的低聚糖的液体制剂中去除溶剂以获得所需的低聚糖的固体制剂的合适方法包括结晶和冻干(冷冻干燥——一种这样的工艺：其中将含sHMO的水溶液冷冻，然后通过降低周围压力，使材料中的冷冻水从固相直接升华到气相——这通常导致吸湿性sHMO粉末。
在另一个实施方案中，可通过喷雾干燥从唾液酸化的低聚糖的液体制剂中去除溶剂。本发明人惊奇地揭示，尽管众所周知碳水化合物通常不适合喷雾干燥，但是可对含有所需的唾液酸化的低聚糖的液体制剂进行喷雾干燥以获得基本上由所需的唾液酸化的低聚糖组成的粉末，其还包括乳糖、唾液酸、岩藻糖等。
从发酵液中分离生物质通常是纯化工艺的第一步。如果所述工艺包括从制剂中去除溶剂的步骤，则该步骤通常是纯化所需的低聚糖的最后步骤。附加工艺步骤的顺序没有特别限制。
参考图2，示意性地示出了纯化唾液酸化的低聚糖的工艺的实施方案，其中唾液酸化的低聚糖为通过微生物发酵产生的sHMO。在发酵结束时，通过错流过滤将生物质从发酵液中分离。对滤液(不含细胞的发酵液)进行阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法。随后，将洗出液浓缩并用活性炭处理。将所得溶液进行SMB色谱法，并增加在所得溶液中唾液酸化的低聚糖的浓度。最后，以3kDa截留分子量进行过滤，随后进行无菌过滤，以获得含有高浓度的所需sHMO的溶液。
图3示出了所述工艺的另一个实施方案，其与图2所示的实施方案的不同之处在于将含有高浓度的所需sHMO的溶液喷雾干燥以获得粉末形式的所需sHMO。出乎意料的是，我们可以确定可将3’-唾液酸乳糖和6’-唾液酸乳糖喷雾干燥的条件。与乳糖或唾液酸——其不能喷雾干燥——相比，可发现允许以喷雾干燥的粉末形式获得这些sHMO的条件。喷雾干燥的粉末也似乎仅是略吸湿的。相对于其他工艺如结晶或冷冻干燥，使用喷雾干燥具有数个优势，例如非常经济、与sHMO的大规模生产兼容、在结晶的情况下避免有机溶剂。
图4中示意性示出的工艺的实施方案与图3中示出的实施方案的不同之处在于所述工艺不包括用于获得高纯度的sHMO制剂的SMB色谱法。
根据第二方面，提供唾液酸化的低聚糖的制剂，其中唾液酸化的低聚糖通过微生物发酵或体外生物催化产生。
制剂的唾液酸化的低聚糖通过本文所述的工艺从发酵液、细胞或反应混合物中纯化。
在另外的和/或替代的实施方案中，唾液酸化的低聚糖是唾液酸化的HMO。在另外的和/或替代的实施方案中，唾液酸化的HMO选自3’-SL、6’-SL、LST-a、LST-b、LST-c、F-SL、F-LST-b和DS-LNT。
唾液酸化的低聚糖的制剂可以液体形式作为唾液酸化的低聚糖在溶剂中、优选在水中的溶液存在。在另一个实施方案中，唾液酸化的低聚糖的制剂以固体形式、优选以粉末形式存在。该粉末包含颗粒形式的唾液酸化的低聚糖，其中唾液酸化的低聚糖以无定形颗粒形式或以结晶颗粒形式存在。最优选地，以含水量小于10％的喷雾干燥粉末形式获得的唾液酸化的低聚糖。
表1.：可通过本文所述的方法纯化的唾液酸化的HMO(唾液酸化的人乳低聚糖(sHMO))。
通过本文所述的工艺可获得的唾液酸化的低聚糖的制剂包含纯度≥80重量％的所需的唾液酸化的低聚糖。
根据第三方面，提供如本文之前所述的唾液酸化的低聚糖、尤其是唾液酸化的HMO用于制备营养组合物、优选婴儿配方物的用途。
纯化唾液酸化的低聚糖的工艺提供唾液酸化的低聚糖的制剂，其中低聚糖以足以用于人类食用的纯度存在。
所述营养组合物包含至少一种通过如本文之前公开的方法产生的唾液酸化的低聚糖。
因此，根据第四方面，提供包含至少一种通过如本文之前公开的方法产生的唾液酸化的低聚糖、优选至少一种sHMO的营养组合物。营养组合物中的至少一种sHMO选自3’-SL、6’-SL、LST-a、LST-b、LST-c、F-SL、DS-LNT和F-LSTb。所述至少一种唾液酸化的低聚糖通过微生物发酵或体外生物催化产生。
在另一个实施方案中，营养组合物选自药物制剂、婴儿配方物、乳制饮料和膳食补充剂。营养组合物还包含微量营养素和/或大量营养素，例如蛋白质、碳水化合物、脂肪、脂肪酸(优选多不饱和脂肪酸(PUFA))、维生素、矿物质。
作为药物制剂，营养组合物可用于改善糖尿病的症状，这是因为唾液酸乳糖提高了胰岛素的分泌并因此增加了血糖水平用于预防或减轻糖尿病。此外，含有3’-SL的营养组合物可有效抵抗骨关节炎。
作为婴儿配方物，营养组合物符合法规(EU)2016/127中规定的组成要求。表2和表3中具体指明了婴儿配方物的示例性组成。
婴儿配方物：脱脂乳
植物油(棕榈油、菜子油、葵花油)
人乳低聚糖
脱脂乳粉
高山被孢霉(Mortierella alpine)油
鱼油
碳酸钙
氯化钾
维生素C
氯化钠
维生素E
乙酸铁
硫酸锌
烟酸
D-泛酸钙
硫酸铜
维生素A
维生素B1
维生素B6
硫酸镁
碘酸钾
叶酸
维生素K
亚硒酸钠
维生素D
表2：示例性婴儿配方物的组分
表3：示例性婴儿配方物的组成。最终浓度基于13.5g粉末和90ml水的制剂计
在另外的和/或替代的实施方案中，营养组合物还包含微生物，优选益生菌微生物。在用于婴儿食品应用的情况下，优选的微生物源自健康人类的微生物组或可见于健康人类的微生物组。优选地，但不限于，所述微生物选自双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、真细菌属(Eubacterium)、韦荣氏球菌属(Veilonella)、梭杆菌属(Fusobacterium)、拟杆菌属(Bacterioides)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、埃希氏菌属(Escherichia)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)和酵母菌属(Saccharomyces)。在另外的和/或替代的实施方案中，微生物选自短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium aldolescentis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)；大肠杆菌(Escherichia coli)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)(VSL#3)。
除了sHMO与活生物体的组合外，这些低聚糖还可以与死的培养物组合使用。在益生菌领域，有时使用杀死的培养物(例如间歇杀灭的(tyndalized)细菌)。认为这些杀死的培养菌提供蛋白质、肽、低聚糖、细胞外壁片段、天然产物，它们可导致免疫系统的短暂热刺激。
在营养组合物中，至少一种唾液酸化的低聚糖——特别是至少一种sHMO——和益生菌微生物的组合是特别有利的，这是因为在肠道中建立或重新建立了合适的微生物组，并促进了与之相关的健康益处。
甚至更有利的是至少一种唾液酸化的低聚糖——特别是一种sHMO——与已建立的益生菌如GOS(低聚半乳糖)和/或FOS(低聚果糖，菊粉)的组合。
营养组合物可以液体形式或固体形式存在，所述固体形式包括，但不限于，粉末、颗粒、薄片和丸粒。
因此，还提供包含至少5种HMO的营养组合物，其中所述至少5种HMO选自2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、乳-N-岩藻五糖I、3’-唾液酸乳糖和6’-唾液酸乳糖。
在另外的和/或替代的实施方案中，如本文之前公开的营养组合物包含至少一种唾液酸化的HMO和至少一种中性的HMO以及益生菌微生物。
根据第五方面，提供一种喷雾干燥的不含GMO的粉末，其基本上由纯度＞80％(基于干重计)的唾液酸化的低聚糖组成，并且具有小于10重量％的水。
在一个实施方案中，喷雾干燥的粉末为基本上由选自以下的唾液酸化的低聚糖组成的粉末：3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖，以及3’-唾液酸乳糖和6’-唾液酸乳糖的混合物。
在另外的和/或替代的实施方案中，喷雾干燥的粉末基本上由3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖和一种或多种中性HMO的混合物组成，其中所述一种或多种中性HMO选自2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、乳-N-岩藻五糖I。
将相对于特定实施方案并参考附图来描述本发明，但是本发明不限于此，而是仅由权利要求书来限定。此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二等用于区分相似元素，而不必用于描述时间、空间、等级或任何其他方式上的顺序。应当理解，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，并且本文中描述的本发明的实施方案能够以不同于本文中描述或示出的其他顺序操作。
应当注意，权利要求书中使用的术语″包括″不应解释为限于其后列出的装置；其不排除其他要素或步骤。因此，应将其解释为具体指明所提及的所述特征、整数、步骤或组件的存在，但并不排除一个或多个其他特征、整数、步骤或组件或其组合的存在或加入。因此，表述″包括装置A和B的设备″的范围不应限于仅由组件A和B组成的设备。其意昧着就本发明而言，设备的相关组件仅是A和B。
在整个说明书中，对″一个实施方案″或″实施方案″的引用意指与该实施方案相关的所描述的特定特征、结构或特性包含在本发明的至少一个实施方案中。因此，在整个说明书多处出现的短语″在一个实施方案中″或″在实施方案中″并必均是指同一实施方案，但是可以均是指同一实施方案。此外，在一个或多个实施方案中，特定特征、结构或特性可以任何适当的方式组合，这对于本领域普通技术人员而言根据本公开内容将是显而易见的。
类似地，应当理解，在本发明的示例性实施方案的描述中，有时将本发明的多个特征组合在单个实施方案、图或其描述中，用于简化公开内容并帮助理解多个本发明方面中的一个或多个。然而，公开内容的该方法不应解释为反映了这样一种意图，即所要求保护的发明需要比各权利要求中明确叙述的特征更多的特征。相反，如随后的权利要求所反映的，本发明方面在于比单个前述公开的实施方案的所有特征更少。因此，详细说明书之后的权利要求书在此明确地并入该详细说明书中，其中每个权利要求本身代表本发明的一个单独的实施方案。
此外，尽管本文所述的一些实施方案包括在其他实施方案中所包括的一些特征但不包括其他特征，但是不同实施方案的特征的组合也意在落入本发明的范围内，并且形成不同的实施方案，如本领域技术人员所理解的。例如，在随后的权利要求书中，任何所要求保护的实施方案可以任何组合使用。
此外，一些实施方案在本文中被描述为可由计算机系统的处理器或由执行该功能的其他装置实现的方法或方法的要素的组合。因此，具有用于执行这种方法或方法要素的必要指令的处理器形成用于执行该方法或方法要素的装置。此外，设备实施方案的本文所述的要素是用于执行由该要素为了执行本发明而实施的功能的装置的实例。
在本文所提供的说明书和附图中，阐述了许多具体细节。然而，应当理解，可以在没有这些具体细节的情况下实践本发明的实施方案。在其他情况下，未详细示出公知的方法、结构和技术，以免混淆对本说明书的理解。
现在将通过本发明的几个实施方案的详细描述来描述本发明。显然，在不脱离本发明的真实精神或技术教导的情况下，可以根据本领域技术人员的知识来配置本发明的其他实施方案，本发明仅由所附权利要求书的条款限定。
实施例1：使用重组微生物发酵3’-唾液酸乳糖。
使用重组的合成3’-唾液酸乳糖的大肠杆菌(E.coli)菌株(大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZ)进行3’-唾液酸乳糖补料分批发酵，所述大肠杆菌菌株包含来自弧菌属种(Vibriosp.)JT-FAJ-16的3’-唾液酸转移酶基因的基因组整合。为了增强CMP-唾液酸的生物合成，将编码来自大肠杆菌的葡糖胺-6-磷酸合酶GlmS、来自集胞藻属种(Synechocystis sp.)的N-乙酰葡糖胺2-表异构酶Slr1975、来自酿酒酵母的葡糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶Gna1、来自大肠杆菌的磷酸烯醇丙酮酸合酶PpsA，N-乙酰神经氨酸合酶NeuB和CMP-唾液酸合成酶NeuA(N-乙酰神经氨酸合酶NeuB和CMP-唾液酸合成酶NeuA二者均来自空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni))的基因均通过染色体整合到大肠杆菌BL21(DE3)宿主中。此外，将来自大肠杆菌的编码乳糖通透酶的基因LacY，以及来自大肠杆菌W的基因cscB(蔗糖通透酶)、cscK(果糖激酶)、cscA(蔗糖水解酶)和cscR(转录调节因子)整合到BL21基因组中。整合基因的转录从组成型启动子(四环素启动子Ptet或PT5启动子)开始。将由基因galE(UDP-葡萄糖-4-表异构酶)、galT(半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(galactose-1-phosphateuridylyltransferase))、galK(半乳糖激酶)和galM(半乳糖-1-表异构酶)组成的功能性gal-操纵子从大肠杆菌K12转移至BL21菌株的基因组。为防止N-乙酰葡糖胺-6-磷酸的降解，将编码N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱乙酰基酶(NagA)、葡糖胺-6-磷酸脱氨酶(NagB)和N-乙酰葡糖胺特异性PTS蛋白IIABC(NagE)的基因从染色体中删除。此外，将编码大肠杆菌PTS系统中用于甘露糖、葡萄糖、葡糖胺和N-乙酰葡糖胺的糖转运蛋白的操纵子manXYZ，以及分别编码N-乙酰神经氨酸裂解酶、N-乙酰甘露糖胺激酶、N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸表异构酶和唾液酸转运蛋白的基因nanA、nanK、nanE和nanT删除。还将编码N-乙酰半乳糖胺-6-磷酸脱乙酰基酶(AgaA)的基因删除。
将产生3’-唾液酸乳糖的菌株在限定的矿物盐培养基中培养，该培养基包含7g L- 1NH4H2PO4、7g L-1K2HPO4、2g L-1KOH、0.3g L-1柠檬酸、5g L-1NH4Cl、1ml L-1消泡剂(StruktolJ673，Schill+Seilacher)、0.1mM CaCl2、8mM MgSO4、微量元素和2％的蔗糖作为碳源。
微量元素由0.101g L-1次氮基三乙酸(pH 6.5)、0.056g L-1柠檬酸铁铵、0.01g L- 1MnCl2x4H2O、0.002g L-1COCl2x6H2O、0.001g L-1CuCl2x2H2O、0.002g L-1硼酸、0.009g L- 1ZnSO4x7H2O、0.001g L-1Na2MoO4x2H2O、0.002g L-1Na2SeO3、0.002g L-1NiSO4x6H2O组成。
对蔗糖进料(500g L-1)补充8mM MgSO4、0.1mM CaCl2、微量元素和5g L-1NH4CI。为了形成3’-唾液酸乳糖，使用了216g L-1的乳糖进料。通过使用氨溶液(25％v/v)控制pH。补料分批发酵在30℃下在恒定通气和搅拌下通过采用5.5-7mL L-1h-1(参照起始体积计)的蔗糖进料速率进行72小时。在发酵开始后72小时，大部分加入的乳糖转化为3’-唾液酸乳糖。为了去除发酵上清液中的残留乳糖，将β-半乳糖苷酶加入到发酵容器中。所得单糖被生产菌株代谢。
实施例2：使用重组微生物发酵sHMO 6’-唾液酸乳糖。
合成6’-唾液酸乳糖的菌株包含与产生3’-唾液酸乳糖的菌株相同的遗传特征，尽管都是唾液酸转移酶。为了产生6’-唾液酸乳糖，将来自鳆发光杆菌(Photobacteriumleiognathi)JT-SHIZ-119的编码α-2,6-唾液酸转移酶的plsT6基因整合到大肠杆菌BL21(DE3)基因组中。
为了发酵生产6’-唾液酸乳糖，将菌株在限定的矿物盐培养基中培养，该培养基包含7g L-1NH4H2PO4、7g L-1K2HPO4、2g L-1KOH、0.3g L-1柠檬酸、5g L-1NH4Cl、1mL L-1消泡剂(Struktol J673，Schill+Seilacher)、0.1mM CaCl2、8mM MgSO4、微量元素(0.101g L-1次氮基三乙酸(pH 6.5)、0.056g L-1柠檬酸铁铵、0.01g L-1MnCl2x4H2O、0.002g L-1CoCl2x6H2O、0.001g L-1CuCl2x2H2O、0.002g L-1硼酸、0.009g L-1 ZnSO4x7H2O、0.001g L-1Na2MoO4x2H2O、0.002g L-1Na2SeO3、0.002g L-1NiSO4x6H2O)和2％的蔗糖作为碳源。
对蔗糖进料(500g L-1)补充8mM MgSO4、0.1mM CaCl2、微量元素和5g L-1NH4CI。为了形成6’-唾液酸乳糖，使用了216g L-1的乳糖进料。通过使用氨溶液(25％v/v)控制pH。补料分批发酵在30℃下在恒定通气和搅拌下通过采用5.5-7mL L-1h-1(参照起始体积计)的蔗糖进料速率进行72小时。将在生产过程结束时未转化为6’-唾液酸乳糖的乳糖通过添加β-半乳糖苷酶而降解，来自乳糖水解的单糖被生产菌株代谢。
实施例3：从发酵液中纯化6’-唾液酸乳糖和3’-唾液酸乳糖
通过超滤，随后通过依次使用卷绕模块过滤器(截留值为0.05μm)(CUT membranetechnology，Erkrath，Germany)和错流过滤器(截留分子量为150kDa)(Microdyn-Nadir，Wiesbaden，Germany)从发酵培养基中分离生物质。获得了大约1m3不含细胞的发酵培养基，其含有超过20g L-1唾液酸化的低聚糖。
然后通过离子交换色谱法对不含细胞的液体进行去离子化。首先，在H+形式的体积为200L的强阳离子交换剂(Lewatit S 2568(Lanxess，Cologne，Germany)上去除阳离子污染物。使用NaOH，将所得溶液的pH设置为7.0。在第二步中，使用氯化物形式的强阴离子交换剂Lewatit S6368S(Lanxess，Cologne，Germany)从溶液中去除阴离子离子和不需要的着色剂。离子交换剂的床体积为200L。使用在错流过滤器(截留分子量为150kDa)(Microdyn-Nadir，Wiesbaden，Germany)上的第二过滤步骤，去除由酸化溶液所产生的沉淀物。为了浓缩糖，将溶液在Dow Filmtec NF270-4040(Inaqua，Germany)，或者在Trisep 4040-XN45-TSF膜(截留分子量为0.5kDa)(Microdyn-Nadir，Wiesbaden，Germany)上进行纳滤。使用Trisep 4040-XN45-TSF膜，将由发酵工艺所产生并污染唾液酸乳糖溶液的单糖N-乙酰葡糖胺从产物中分离。然后将浓缩的唾液酸乳糖溶液用活性木炭(CAS：7440-44-0，Carl Roth，Karlsruhe，Germany)处理以去除着色剂，例如美拉德反应产物和羟醛反应产物。为了将唾液酸乳糖与发酵工艺产生的副产物(如唾液酸和N-乙酰葡糖胺)分离，将溶液用截留分子量为1kDa的膜GE4040F30(GE water&process technologies，Ratingen，Germany)过滤并渗滤至电导率为0.6至0.8mS。将稀释的溶液在旋转蒸发仪上浓缩至浓度为约300g L-1。在最终的色谱分离中，去除其他污染性糖，例如二唾液酸乳糖。为此，将浓缩的溶液施加于乙酸盐形式的弱阴离子离子交换树脂(Amberlite FPA51，DowChemical，Michigan，USA)。虽然唾液酸乳糖几乎不与树脂结合，但是二唾液酸乳糖被吸附。因此，唾液酸乳糖用10mM乙酸铵洗脱，而二唾液酸乳糖用1M乙酸铵洗脱。为了去除乙酸铵，用10倍过量的乙醇沉淀唾液酸乳糖。将固体级分过滤并干燥。
通过使20％的唾液酸乳糖溶液依次通过6kDa过滤器(Pall Microza超滤模块SIP-2013，Pall Corporation，Dreieich，Germany)和0.2μm无菌过滤器来最终确定产物。
使用Büchi喷雾干燥器(Büchi Mini Spray Dryer B-290)(Büchi，Essen，Germany)，应用以下参数对一部分溶液进行喷雾干燥：入口温度：130℃，出口温度67℃-71℃，气体流量670L/h，吸气器100％。
喷雾干燥的6’-唾液酸乳糖的纯度为91％，而3’-唾液酸乳糖材料的纯度为93％。
实施例4：通过广角X射线粉末衍射(XDR)分析喷雾干燥的唾液酸乳糖
使用广角X射线粉末衍射(XRD)研究冻干产品的形态。使用配备有铜阳极(45kV，40mA，波长为0.154nm的Kα1发射)和PIXcel3D检测器的X射线衍射仪Empyrean(Panalytical，Almelo，The Netherlands)。在反射模式下，在5-45°2θ的角范围内，以0.04°2θ的步长和每步100秒的计数时间，分析了大约100mg喷雾干燥的样品。
发现喷雾干燥的6’-唾液酸乳糖具有完全无定形的结构(图7)，而3’-唾液酸乳糖的样品在7°和31°处显示出两个衍射峰，表明部分结晶的结构，然而，还有3’-唾液酸乳糖样品主要产生无定形信号(图8)。
实施例5：通过差示扫描量热法(DSC)分析喷雾干燥的唾液酸乳糖
使用在Mettler Toledo 821e(Mettler Toledo，Giessen，Germany)中差示扫描量热法(DSC)测定喷雾干燥产品的热事件(玻璃化转变温度(Tg)，进一步的放热和吸热事件)。
在卷边Al坩埚(Mettler Toledo，Giessen，Germany)中分析了约25mg喷雾干燥的产品。将样品以10K/min冷却至0℃，并以10K/min的扫描速度重新加热至100℃。在第二个加热周期中将样品冷却至0℃之后，将样品加热至150℃。将加热扫描过程中基线的吸热位移的中点作为Tg。通过峰值温度和事件的归一化能量记录放热和吸热峰。
喷雾干燥的6’-唾液酸乳糖的样品在第一次加热扫描中表现出48℃的Tg值，在第二次加热扫描中表现出50℃的Tg，在第一次Tg之后具有吸热弛豫峰。与6’-唾液酸乳糖相比，3’-唾液酸乳糖在两次加热扫描中均显示出22℃的Tg值，表明6’-唾液酸乳糖在较高温度下具有更高的稳定性。

Claims (10)

1.一种包含至少一种唾液酸化的低聚糖的营养组合物，其中所述至少一种唾液酸化的低聚糖通过微生物发酵产生，并且其中所述营养组合物是药物制剂、膳食补充剂、乳制饮料或婴儿配方物。
2.根据权利要求1所述的的营养组合物，其中所述至少一种唾液酸化的低聚糖是至少一种唾液酸化的人乳低聚糖(HMO)。
3.根据权利要求2所述的的营养组合物，其中所述至少一种唾液酸化的HMO选自3’-SL、6’-SL、LST-a、LST-b、LST-c、F-SL、DS-LNT和F-LSTb。
4.根据权利要求2所述的营养组合物，其包含至少5种HMO，其中所述至少5种HMO选自2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、乳-N-岩藻五糖I、3’-唾液酸乳糖和6’-唾液酸乳糖。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的营养组合物，其中所述营养组合物包含至少一种唾液酸化的HMO和至少一种中性的HMO以及益生菌微生物。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的营养组合物，其中所述营养组合物包含至少一种唾液酸化的HMO和低聚半乳糖(GOS)和/或低聚果糖(FOS)。
7.一种喷雾干燥的不含GMO的粉末，其基本上由以干重量计的纯度＞80％的唾液酸化的低聚糖组成，并且具有小于10重量％的水。
8.根据权利要求7所述的喷雾干燥的不含GMO的粉末，其中所述喷雾干燥的不含GMO的粉末是通过微生物发酵生产的。
9.根据权利要求7所述的喷雾干燥的粉末，其中唾液酸化的低聚糖选自3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖，以及3’-唾液酸乳糖和6’-唾液酸乳糖的混合物。
10.根据权利要求9所述的喷雾干燥的粉末，其中所述喷雾干燥的粉末基本上由3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖和一种或多种中性HMO的混合物组成，所述一种或多种中性HMO选自2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、乳-N-岩藻五糖I。
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