KR20200041370A - 시알릴화 올리고당의 정제 방법 - Google Patents

시알릴화 올리고당의 정제 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20200041370A
KR20200041370A KR1020207008553A KR20207008553A KR20200041370A KR 20200041370 A KR20200041370 A KR 20200041370A KR 1020207008553 A KR1020207008553 A KR 1020207008553A KR 20207008553 A KR20207008553 A KR 20207008553A KR 20200041370 A KR20200041370 A KR 20200041370A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sialylated
sialylactose
fermentation broth
oligosaccharides
oligosaccharide
Prior art date
Application number
KR1020207008553A
Other languages
English (en)
Inventor
스테판 제네바인
마커스 헬프리히
베네딕트 엥겔스
Original Assignee
젠와인 바이오테크놀로지 게엠바하
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 젠와인 바이오테크놀로지 게엠바하 filed Critical 젠와인 바이오테크놀로지 게엠바하
Publication of KR20200041370A publication Critical patent/KR20200041370A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C07H1/08—Separation; Purification from natural products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/125—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols; containing starch hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/30—Dietetic or nutritional methods, e.g. for losing weight
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
    • C07H3/06—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Non-Alcoholic Beverages (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Dairy Products (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

목적하는 시알릴화 올리고당을 고순도로 다량 수득하기 위해 발효 브로스, 세포 용해물 또는 생체 촉매반응 혼합물로부터 시알릴화 올리고당을 정제하는 방법이 개시된다. 상기 방법은 재조합 박테리아 세포 또는 효모 세포를 사용한 미생물 발효로부터 시알릴화 모유 올리고당 (예컨대 3'-시알릴락토스, 6'-시알릴락토스 또는 시알릴화된 락토-N-테트라오스 유도체)을 경제적으로 대규모 정제하는 데에 특히 적합하다. 수득된 물질은 고순도이며, 의학적 영양 제품, 유아용 조제 분유, 식이 보조제, 일반 영양 제품 (예: 유제품 음료)과 같은 식품 또는 의학적 용도로 사용될 수 있다.

Description

시알릴화 올리고당의 정제 방법
본 발명은 시알릴화 올리고당(sialylated oligosaccharide)의 정제에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 발효 브로스(broth), 정제된 세포 용해물 또는 반응 혼합물로부터 시알릴화 올리고당, 특히 시알릴화 모유 올리고당 (sHMO)을 정제하는 것에 관한 것이다.
모유는 탄수화물, 지방, 단백질, 비타민, 미네랄 및 미량 원소의 복합 혼합물이다. 탄수화물이 단연코 가장 풍부한 분획이며, 이는 락토스와 더 복잡한 올리고당, 소위 모유 올리고당 (HMO)으로 더 분류될 수 있다. 락토스는 에너지 원으로 이용되는 반면에, 복합 올리고당은 유아에 의해 대사되지 않는다. 복합 올리고당 분획은 총 탄수화물 분획의 최대 10%를 차지하고 아마도 150종이 넘는 상이한 올리고당으로 구성된 것으로 생각된다. 이러한 복합 올리고당의 발생 및 농도는 사람에 특이적인 것이고, 따라서 사육 착유 동물 (dairy animal)과 같은 다른 포유동물의 젖에서는 다량으로 발견되지 않는다.
모유에 이러한 복합 올리고당의 존재는 오랫동안 알려져 왔으며, 이들 올리고당의 생리적 기능은 수십 년 동안 의학 연구의 대상이었다 (Gura, (Gura, T. (2014) Science 345: 747-749; Kunz, C. & Egge, H. (2017) In: Prebiotics and Probiotics in Human Milk. Eds. McGuire, M.K; McGuire, M.A. & Bode, L. Elsevier, London pp. 3-16). 더 풍부한 HMO의 일부에 대한 특정 기능이 이미 확인되었다 (Bode, L. (2012) Glycobiology 22: 1147-1162.; Bode, L. and Jantscher-Krenn, E. (2012) Adv. Nutr. 3: 383S-391 S; Morrow et al. (2004) J. Pediatr. 145: 297-303).
개별 HMO의 제한된 공급과 이들 분자를 충분한 양으로 공급할 수 없다는 점때문에 화학적 합성에 기초해 이러한 일부 복합 분자를 생산하기 위한 공정이 개발되고 있다. 그러나, HMO의 화학적 합성뿐만 아니라 효소적 합성 및 발효 기반 생산은 대단히 어려운 것으로 입증되었다. 식품 적용에 충분한 품질을 가지는 HMO의 대규모 생산은 지금까지 거의 달성되지 않았다. 특히 2'-푸코실락토스와 같은 HMO의 화학적 합성 (WO 2010/115935 A1)에는 여러 유해 화학물질이 필요하며, 이는 최종 생성물을 오염시킬 수 있다.
HMO 화학적 합성의 결점때문에 여러 효소 및 발효 기반 방법이 개발되기에 이르렀다 (Miyazaki et al., (2010) Methods in Enzymol. 480: 511-524; Murata et al., (1999) Glycoconj. J. 16: 189-195; Baumgartner et al. (2013) Microb. Cell Fact. 12: 40; Lee et al., (2012) Microb. Cell Fact. 11: 48; US 7,521,212 B1; Albermann et al., (2001) Carbohydr. Res. 334: 97-103; Fierfort, N. and Samain, E. (2008) J. Biotechnol. 134: 216-265). 그러나, 이들 공정은 올리고당의 복잡한 혼합물을 생산하는 경향이 있어, 목적하는 생성물이 락토스와 같은 출발 물질뿐만 아니라 중간체, 원치 않는 부산물 (예를 들어, 특정 글리코실트랜스퍼라제의 부차 활성으로 인한 부산물) 및 개별 단당류 및 폴리펩티드와 같은 기질로 오염된다.
올리고당 혼합물로부터 개별 올리고당을 정제하기 위한 최신 방법은 기술적으로 복잡하고, 규모 확장이 어려우며, 식품 적용에 비경제적이다. 유장 또는 당밀로부터 락토스 및 수크로스 이당류를 각각 정제하기 위해 산업적 규모의 공정이 개발되었지만, 이들 방법은 정교하고 낮은 수율을 제공하는 다중 결정화 단계를 포함한다. 그러나, 유장 및 당밀은 우선 "식품 등급"의 제품이고, 결코 재조합 박테리아 또는 재조합 효모 발효 공정으로부터 수득된 발효 브로스만큼 복잡하고 제어가 어렵지는 않다.
겔 여과 크로마토그래피는 미생물 발효에 의해 생산된 HMO와 같은 복합 올리고당을 정제하기 위한 최선의 방법이지만, 겔 여과 크로마토그래피는 확장의 어려움 및 연속 처리와의 비호환성이라는 단점을 포함한다. 따라서 겔 여과 크로마토그래피는 비경제적이며, 3'-시알릴락토스 또는 6'-시알릴락토스와 같은 HMO 또는 임의의 다른 시알릴화 올리고당을 인간 식품, 특히 영아 및 유아 영양 제품에 대해 충분한 품질 및 충분한 양으로 생산하는데 사용될 수 없다. 하지만, 시알릴화 올리고당은 예를 들어 신경 세포 발달의 향상과 관련되어 있기 때문에, 시알릴화 HMO (예컨대, 3'-시알릴락토스 (3'-SL), 6'-시알릴락토스 (6'-SL), 시알릴락토-N-테트라오스 a (LST-a), 시알릴락토-N-테트라오스 b (LST-b), 시알릴락토-N-테트라오스 c (LST-c), 3-푸코실-시알릴락토스 (F-SL), 디시알릴락토-N-테트라오스 (DS-LNT) 및 푸코실-LST b (F-LSTb))의 생산은 관심사이다.
재조합 DNA 또는 단백질은 최종 생성물을 오염시킬 수 있기 때문에, HMO의 발효 생산을 위해 재조합 미생물 (박테리아 또는 효모)을 사용하는 것이 또한 문제가 되며, 이는 오늘날 소비자 및 규제 당국에 의해 받아들여지지 않을 것이다. 특히 재조합 DNA 분자에 대한 검출 한계가 매우 낮다는 것을 고려할 때 (예를 들어, 현재 검출을 위한 최적의 표준으로 여겨지는 qPCR 기반 검출을 사용하는 경우), 올리고당 생성물에서 단일 DNA 분자 정도로 낮은 것도 검출될 수 있다. 또한 단백질은 알레르기 반응을 일으킬 위험이 있으므로 목적하는 올리고당 제품에서도 효과적으로 제거되어야 한다.
상기 종래 기술로부터 출발하여, 시알릴화 올리고당의 상업적 또는 산업적 규모 제조에 적용 가능하고 사람에게 적합한 순도를 갖는 생성물로 이어질 수 있는, 미생물 발효에 의해 생산된 시알릴화 올리고당, 특히 시알릴화 HMO를 정제하는 방법을 제공하는 것이 목적이다.
요약
제1 측면에서, 미생물 발효 또는 시험관 내 생체 촉매반응(in-vitro biocatalysis)에 의해 생산된 시알릴화 올리고당을 정제하는 방법이 제공된다.
제2 측면에서, 미생물 발효 또는 시험관 내 생체 촉매반응에 의해 생산된 시알릴화 올리고당 제제(preparation)가 제공된다.
제3 측면에서, 제2 측면에 따른 시알릴화 올리고당의 용도가 제공된다.
제4 측면에서, 미생물 발효 또는 시험관 내 생체 촉매반응에 의해 생산된 적어도 하나의 시알릴화 올리고당을 포함하는 영양 조성물이 제공된다.
제5 측면에서, 실질적으로 시알릴화 올리고당으로 이루어진 분무 건조된 GMO-비함유 분말이 제공된다.
도 1은 3'-시알릴락토스 및 6'-시알릴락토스의 화학 구조를 나타낸다.
도 2는 발효 브로스로부터 시알릴화 올리고당을 정제하는 방법의 일 실시양태를 예시하는 도식을 나타낸다.
도 3은 발효 브로스로부터 시알릴화 올리고당을 정제하는 방법의 일 실시양태를 예시하는 도식을 나타낸다.
도 4는 발효 브로스로부터 시알릴화 올리고당을 정제하는 방법의 일 실시양태를 예시하는 도식을 나타낸다.
도 5는 4-존 모의 이동층 크로마토그래피의 원리를 예시한다.
도 6은 8-존 모의 이동층 크로마토그래피의 원리를 예시한다.
도 7은 분무 건조된 6'-SL의 X-선 분말 회절 결과를 보여주는 그래프를 나타낸다.
도 8은 분무 건조된 3'-SL의 X-선 분말 회절 결과를 보여주는 그래프를 나타낸다.
상세한 설명
제1 측면에 따라, 미생물 발효에 의해 생산된 시알릴화 올리고당을 정제하기 위한 방법 또는 공정이 제공된다. 이 방법은 다음 단계로 구성된다:
i) 발효 브로스로부터 바이오매스를 분리하는 단계;
ii) 발효 브로스로부터 양이온을 제거하는 단계;
iii) 발효 브로스로부터 음이온성 불순물을 제거하는 단계; 및
iv) 정제될 시알릴화 올리고당의 분자량보다 낮은 분자량을 갖는 화합물을 제거하는 단계.
일 실시양태에서, 목적하는 시알릴화 올리고당은 미생물 발효에 의해 생산된다. 따라서, 목적하는 시알릴화 올리고당을 생산할 수 있는 세포는 이 세포가 목적하는 시알릴화된 올리고당을 생산하도록 허용되는 조건 하에서 배양된다. 목적하는 올리고당을 생산하기에 적합한 세포는 박테리아, 예컨대 대장균 (Escherichia coli), 락토바실러스 락티스 (Lactobacillus lactis), 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 슈도모나스 푸티타 (Pseudomonas putita), 또는 효모, 예컨대 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)를 포함한다.
세포는 목적하는 시알릴화 올리고당을 생산하고, 유전적으로 변형되지 않은 전구체 세포는 생산할 수 없도록 하고, 목적하는 올리고당의 생산 효능을 개선시키기 위해 유전자 조작될 수 있다. 대사 공학에 바람직한 숙주인 대장균은 이미 HMO (시알릴화 HMO뿐만 아니라 중성 HMO)의 발효에 사용되고 있다. 그러나 GRAS (generally recognized as safe: 일반적으로 안전한 것으로 인정됨) 상태를 가지는 효모 (사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 등), 젖산균, 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 바실러스 (Bacillus) 종과 같은 다른 숙주 균주 또한 마찬가지로 올리고당, 일반적으로 HMO, 특히 시알릴화 HMO의 생산을 위해 유전자 조작될 수 있다.
목적하는 시알릴화 올리고당의 생산을 위해, 세균 또는 효모 숙주 균주는 보통 하나 이상의 이종 글리코실트랜스퍼라제, 전형적으로 적어도 하나의 이종 시알릴트랜스퍼라제를 함유하며, CMP-실라산(CMP-silaic acid)의 합성을 위한 유전자 (예컨대, 시알산의 흡수 또는 데노보 합성에 관여하는 유전자 외에 CMP-시알산 합성 효소), 목적하는 sHMO에 적합한 락토스 임포터 (importer) 및/또는 엑스포터 (exporter)를 과발현한다. 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae)는 발효 브로스에 적당한 엑스포터가 없으면 이종적으로 생산된 올리고당을 경제적으로 유효한 양으로 분비하지 않는 것으로 알려져 있기 때문에, 효모를 sHMO의 생산 숙주로 사용하는 경우에 적합한 엑스포터의 발현이 특히 유리하다.
시알릴화 올리고당과 관련하여 용어 "목적하는"은 세포에 의해 생산될 시알릴화 올리고당을 의미한다. 목적하는 시알릴화 올리고당은 본원에 개시된 공정에 의해 정제되는 올리고당이다. 본원에 사용된 시알릴화 올리고당과 관련하여 "목적하는"이라는 용어는 또한 생산되는 시알릴화 올리고당과 세포에 의해 의도치않게 생산될 수 있는 다른 시알릴화 올리고당을 구별하기 위해 제공된다.
본원에 사용된 용어 "올리고당"은 3 내지 20개의 단당류 잔기로 구성된 선형 또는 분지형 당류를 지칭한다.
일 실시양태에서, 시알릴화 올리고당은 시알릴화 HMO이다. 본원에 사용된 용어 "시알릴화 HMO"라는 용어는 하나 이상의 시알산 잔기를 포함하는 모유 올리고당을 지칭한다.
본 방법은 발효 브로스로부터 바이오매스를 분리하는 단계를 포함한다. 이 단계는 시알릴화 올리고당을 정제하는 과정의 첫 번째 단계이다.
본원에 사용된 용어 "바이오매스"는 발효 단계 마지막에 발효 브로스에 존재하는 세포 전체를 지칭한다. 발효 단계 마지막에 발효 브로스에 존재하는 세포는 목적하는 시알릴화 올리고당을 생산할 수 있는 세포를 포함하며, 임의로 시알릴화 올리고당의 생산을 돕기 위해 보조 세포, 예를 들어 - 바람직하지 않은 부산물을 분해하는 세포가 발효 브로스에 존재한다. 따라서, 발효 단계 마지막에 발효 브로스에 존재하는 세포는 생성된 발효 브로스가 실질적으로 세포를 포함하지 않도록 발효 브로스로부터 분리된다.
발효 브로스로부터 바이오매스를 분리하기 위한 적합한 방법은 원심분리를 포함하며, 여기서 바이오매스는 펠렛으로 수득되고 발효 브로스는 상등액으로 수득된다. 추가적 및/또는 대안적인 실시양태에서, 바이오매스는 여과 수단에 의해 발효 브로스로부터 분리된다. 발효 브로스로부터 세포를 분리하기에 적합한 여과 방법은 정밀여과 및 한외여과를 포함한다.
정밀여과는 보통 입자 함유 유체를 특정 기공 크기의 막에 통과시켜 입자를 유체로부터 분리하는 물리적 여과 공정이다. 본원에 사용된 용어 "정밀여과"는 발효 브로스로부터 세포를 분리하는 물리적 여과 공정을 지칭한다.
한외여과는 다양한 막 여과이며 근본적으로 다르지 않다. 한외여과에서는, 압력 또는 농도 구배와 같은 힘으로 반투과성 막을 통한 분리가 이루어진다. 고 분자량의 세포, 현탁 고체 및 용질은 소위 잔류물에 보유되는 반면, 물 및 목적하는 시알릴화 올리고당과 같은 저 분자량 용질은 투과액 (여액)에서 막을 통과한다.
한외 여과막은 사용된 막의 분자량 컷오프 (MWCO)에 의해 정의된다. 한외여과는 교차류 (cross-flow) 또는 데드-엔드 모드 (dead-end mode)로 적용된다.
정밀여과 또는 한외여과에 적합한 필터는 SPIRA-CEL® DS MP005 4333 및 섬유 FS10-FC FUS1582 (Microdyn-Nadir GmbH, Wiesbaden, DE)이다.
전형적으로, 세포는 목적하는 시알릴화 올리고당을 세포 내 방식으로 합성하고 이를 발효 브로스에 분비한다. 이렇게 생산된 시알릴화 올리고당은 발효 브로스에서 종료되고, 이후 본원에 기술된 바와 같이 목적하는 시알릴화 올리고당을 정제하기 위한 추가 공정 단계를 거친다.
실시양태에서, 목적하는 시알릴화 올리고당이 생합성 후 세포 내에 남아있는 경우, 바이오매스는 발효 브로스로부터 분리되고, 상기 바이오매스는 목적하는 시알릴화된 올리고당을 정제하기 위해 사용된다. 이를 위해, 바이오매스의 세포는 용해되고, 생산된 용해물은 불용성 성분, 핵산, 지질 및 단백질이 용해물로부터 제거되어 정화된다. 세포 용해 및 세포 용해물로부터 불용성 성분, 핵산, 지질 및/또는 단백질을 제거하는 방법은 공지되었다. 이렇게 수득된 목적하는 시알릴화 올리고당을 함유하는 정화된 용해물은 목적하는 시알릴화 올리고당을 정제하기 위해 목적하는 시알릴화 올리고당을 함유하는 무세포 발효 브로스와 동일한 공정 단계에 적용된다.
시알릴화 올리고당을 정제하는 공정은 미생물 발효에 의해 생산된 시알릴화 올리고당을 정제하는데 사용되지만, 이 공정은 또한 시험관 내 효소 반응, 소위 시험관 내 생체 촉매반응에 의해 생산된 시알릴화 올리고당을 정제하는 데에도 사용될 수 있다. 목적하는 시알릴화 올리고당은 시험관 내에서 하나 이상의 효소 반응에 의해 수득되며, 무세포 발효 브로스 또는 정화된 용해물 대신 상기 반응 혼합물이 본원에 기재된 정제 공정에 적용되어 생체 촉매반응 종료시 반응 혼합물로부터 정제될 수 있다. 시험관 내 생체 촉매반응의 반응 혼잡물(reaction miscxture)로부터 시알릴화 올리고당을 정제하는 것은 반응 혼합물로부터 바이오매스의 제거를 필요로 하지 않는 것으로 이해된다.
무세포 발효 브로스, 정화된 용해물 또는 반능 혼합물(recation mixture)은 목적하는 시알릴화 올리고당뿐만 아니라 상당량의 불순물 및 목적하는 시알릴화 올리고당 이외의 다른 올리고당, 1가 염, 2가 염, 아미노산, 폴리펩티드, 단백질, 유기산, 핵산 및 단당류를 비롯한 원치않는 성분을 함유한다.
시알릴화 올리고당을 정제하기 위한 공정은 무세포 발효 브로스, 정화된 용해물 또는 반응 혼합물로부터 양으로 하전된 화합물을 제거하기 위한 양이온 교환 크로마토그래피의 단계를 포함한다.
양으로 하전된 화합물을 제거하기에 적합한 양이온 교환 수지는 Lewatit S2568 (H+) (Lanxess AG, Cologne, DE)을 포함한다.
시알릴화 올리고당을 정제하기 위한 공정은 무세포 발효 브로스, 정화된 용해물 또는 반응 혼합물로부터 바람직하지 않은 음으로 하전된 화합물을 제거하기 위한 음이온 교환 크로마토그래피의 단계를 포함한다.
적합한 음이온 교환 수지는 Lewatit S6368 A, Lewatit S4268, Lewatit S5528, Lewatit S6368A (Lanxess AG. Cologne, DE), Dowex AG 1x2 (Mesh 200-400), Dowex 1x8 (Mesh 100-200), Purolite Chromalite CGA100x4 (Purolite GmbH, Ratingen, DE), Dow Amberlite FPA51 (Dow Chemicals, MI, USA)를 포함한다.
시알릴화 올리고당을 정제하기 위한 공정은 정제될 시알릴화 올리고당보다 분자량이 낮은 화합물을 제거하는 단계를 포함한다. 정제될 시알릴화 올리고당보다 분자량이 낮은 화합물을 제거하기 위한 적합한 방법은 나노여과 및 투석여과를 포함한다.
투석여과는 막 투과성 성분을 제거 (세척)하기 위해 용액에 담수 첨가를 포함한다. 투석여과는 적절한 막을 사용함으로써 분자 크기 및 전하에 기초해 성분을 분리하는데 사용될 수 있으며, 여기서 하나 이상의 종은 효율적으로 유지되고 다른 종은 막 투과된다. 특히, 나노 여과막을 이용한 투석여과는 저 분자량 화합물을 염으로부터 분리하는데 효과적이다. 나노 여과막은 일반적으로 150 내지 300 달톤 범위의 분자량 컷오프를 가진다. 나노여과는 유장의 농축 및 탈염을 위해 유제품 산업에서 널리 사용되고 있다.
나노여과 및/또는 투석여과에 적합한 막은 Dow Filmtec NF270-4040, Trisep 4040-XN45-TSF (Microdyn-Nadir GmbH, Wiesbaden, DE), GE4040F30 및 GH4040F50 (GE Water & Process Technologies, Ratingen, DE)을 포함한다.
나노 여과막을 이용한 투석여과는 HMO를 함유하는 용액의 전기투석 처리 전에 상당량의 오염 물질을 제거하기 위한 전처리로서 효과적인 것으로 밝혀졌다. 그러나, 나노여과는 한외여과 단계 후 저 분자량 오염물을 제거하는데 효과적인 것으로 밝혀졌으며, 상기 제거는 이온 교환기 처리 전에 HMO 용액을 농축 및 탈염하는데 유리하다. HMO를 정제하는 동안 농축 및 투석여과에 나노 여과막을 사용하면 메일라드 (Maillard) 반응 및 알돌 반응으로 이어지는 열 노출이 감소하여 에너지 및 가공 비용이 절감되고 제품 품질이 개선된다.
정제 공정은 상기 목적하는 시알릴화 올리고당의 순도가 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상인 제제로 목적하는 시알릴화 올리고당을 제공한다. 이 공정은 식품 및 사료 용도에 적합한 순도를 가지는 시알릴화 올리고당 제제를 제공한다.
또한, 이 공정은 비용 효율적이고 확장이 용이하여 멀티톤 스케일 제조 공정의 기초로 적합하다.
시알릴화 올리고당을 정제하기 위한 공정은 또한 목적하는 시알릴화 올리고당이 가공 조제로서 사용될 수 있는 재조합 미생물 발효 균주로부터 유래된 재조합 DNA 및 재조합 단백질 없이 수득된다는 점에서 유리하다.
추가적 및/또는 대안적인 실시양태에서, 공정은 용액에서 당류의 농도를 증가시키기 위한 나노여과 단계를 추가로 포함한다.
추가적 및/또는 대안적인 실시양태에서, 공정은 전기투석 단계를 포함한다.
전기투석은 투석과 전기 분해를 결합시킨 것이며, 반투과성 막을 통한 선택적 전기 이동에 기초하여 용액 중 이온 농도를 분리하는 데 사용될 수 있다.
전기투석 (ED)은 투석과 전기 분해를 결합시킨 것이며, 반투과성 막을 통한 선택적 전기 이동에 기초하여 용액 중 이온을 분리 또는 농축하는 데 사용될 수 있다. 산업적 전기투석 응용은 1960년대 초로 거슬러 올라가며, 이때의 방법은 유아용 조제 분유(infant formula)에 포함시키기 위해 치즈 유장의 탈염에 사용되었다. 전기투석의 추가 응용은 와인, 포도 머스트, 사과 주스 및 오렌지 주스와 같은 음료의 pH 조정을 포함한다.
식수 생산을 위한 기수의 탈염 및 유아 식품 생산을 위한 우유 유장의 탈염이 오늘날 가장 널리 사용되는 전기투석 응용 분야이다 (Tanaka, Y. (2010) Ion Exchange Membrane Electrodialysis. Nova Science Publishers, Inc. New York).
전기투석의 기본 원리는 직류 발생기에 연결된, 이온 전도를 위한 전해질에 침지된 한 쌍의 전극을 포함하는 전해조로 구성된다. 직류 발생기의 음극에 연결된 전극은 애노드이고, 음극에 연결된 전극은 캐소드이다. 전해질 용액이 전류 흐름을 지원하며, 이는 음이온 및 양이온이 각각 애노드 및 캐소드로 이동함으로써 발생한다. 전기투석에 사용되는 막은 본질적으로 음 또는 양 전하기를 갖는 다공성 이온 교환 수지 시트이고, 따라서 각각 양이온 또는 음이온 막으로 기술된다. 이온 교환막은 일반적으로 디비닐벤젠과 가교 결합된 적합한 작용기 (양이온 막을 위한 설폰산 또는 음이온 막을 위한 사급 암모늄기)를 갖는 폴리스티렌으로 만들어진다. 전해질은 예를 들어 염화나트륨, 아세트산나트륨, 프로피온산나트륨 또는 설팜산일 수 있다. 이어, 전기투석 스택이 음이온 및 양이온성 막이 두 전극 블록 사이의 필터 프레스에서와 같이 평행한 방식으로 조립되어, 이온 고갈을 거치는 스트림이 이온 농축을 거치는 스트림으로부터 잘 분리된다 (두 용액은 또한 희석물 (이온 고갈을 거침) 및 농축물 (이온 농축을 거침)이라고도 한다). 전기투석 공정의 핵심은 두 전극 사이에 설치된 스페이서로 분리된 여러 음이온 교환막과 양이온 교환막으로 구성된 막 스택이다. 직류를 인가하면, 음이온 및 양이온은 막을 가로질러 전극쪽으로 이동하여 (탈염된) 희석물 스트림 및 농축물 스트림을 생성한다.
전기투석 동안 산성 조건을 적용함으로써, sHMO는 양성자화되어 비하전 상태를 나타낼 수 있다 (올리고당 중 시알산 부분에 있는 카보닐기의 양성자화). 대안으로서, 전기투석은 이극성 막을 사용하여 중성 조건 하에서 수행될 수 있다. 이 경우, 시알릴화 올리고당은 별도의 전기투석 농축 회로에서 더 농축될 수 있다. 따라서, 시알릴화된 올리고당은 전기투석 동안 더욱 풍부해질 수 있다.
이온 교환막의 기공 크기는 생성물이 두 스트림 사이의 높은 농도 차이에 의해 유발되는, 희석물 스트림으로부터 농축물 스트림으로 확산되는 것을 방지할 만큼 충분히 작다. 바이오매스로부터 분리 후, 단백질 및 특히 재조합 DNA 분자 (단편에서 전체 게놈에 이르는 크기 범위)는 목적하는 생성물로부터 정량적으로 제거되어야 한다. 경우에 따라, (HMO의 분자 크기와 비교하여) 이러한 큰 분자의 전기투석은 오랜 시간이 걸리며, 희석물로부터 농축물로의 목적하는 생성물의 상당한 손실이 반드시 수반된다.
추가적 및/또는 대안적인 실시양태에서, 시알릴화된 올리고당을 정제하기 위한 공정은 모의 층 이동(simulated bed moving) (SMB) 크로마토그래피 단계를 추가로 포함한다.
모의 이동층(simulated moving bed) (SMB) 크로마토그래피는 석유 화학 및 광물 산업에서 시작되었다. 오늘날, SMB 크로마토그래피는 제약 산업에서 라세미 혼합물로부터 거울상 이성질체를 분리하는 데 사용된다. 프럭토스-글루코스 용액으로부터 단당류인 프럭토스를 분리하고 사탕무 또는 사탕수수 시럽으로부터 이당류인 수크로스를 분리하기 위해 대규모 SMB 크로마토그래피가 이미 사용되어 왔다. 그러나, SMB 크로마토그래피는 화학적, 효소적 또는 발효-기반 합성 동안 시알릴화된 락토-N-테트라오스, 3'-시알릴락토스 또는 6'-시알릴락토스와 같은 시알릴화된 모유 올리고당의 정제에는 아직 사용되지 않았다. SMB는 소젖으로부터 시알릴락토스를 정제하는 데 사용되었지만, 소젖은 본원에서 HMO의 공급원으로 사용되는 미생물 발효 배지와는 완전히 다른 기질이다.
SMB 크로마토그래피는 정류와 같은 연속 화학 분리 공정과 유사한 연속 분리 공정으로 사용된다. 정류에서, 액상과 기상 사이에 향류 (countercurrent)가 설정되어 지속적인 공급물 적용과 지속적인 생성물의 배출이 가능하다. 향류 크로마토그래피는 이론상 종래 교류 시스템에 비해 우수한 분리를 달성하지만, 향류 시스템의 이동상 및 정지상은 반대 방향으로 이동해야 한다. SMB 크로마토그래피는 연속 크로마토그래피 분리 공정에서 고체 크로마토그래피 물질을 이동시키려고 할 때 마주치는 실질적인 어려움에 대한 해결책으로 개발되었다.
고전적인 SMB 개념에는 다음 4개의 외부 스트림이 있는 4개의 서로 다른 영역이 포함된다: 분리할 성분을 포함하는 공급 스트림, 탈착 또는 이동상 스트림, 추출물 및 라피네이트 스트림 (후자는 덜 효율적으로 보유되는 성분을 나타낸다). 이들 액체 스트림은 다음과 같은 작업을 통해 SMB 시스템을 4개의 상이한 존 (각 존 또는 섹션은 하나 이상의 컬럼을 포함할 수 있음)으로 나눈다: 존 I는 고상 재생에 필요하고, 존 II의 목적은 덜 강한 탈착성 물질의 탈착이며, 존 III의 목적은 강하게 흡착된 물질의 흡착이고, 마지막으로 존 IV의 목적은 덜 흡착성인 물질의 흡착이다 (도 5). 따라서, 더 강한 흡착 성분은 존 II에서 농축 파를 형성하고 추출 포트로 이송되는 반면, 덜 강한 흡착 성분은 라피네이트 포트쪽으로 이동한다.
원칙적으로, 존 I 및 IV는 고상의 재생 (재생 존)을 제공하는 반면 존 II 및 III은 시스템의 실제 분리 존 (분리 존)으로 간주될 수 있다. 4개의 액체 스트림 및 생성 존 외에, 시스템은 (폐 루프 작동을 위해) 이동상을 고정 존을 통해 한 방향으로 통과시키는, 이동상 (탈착성)을 위한 재순환 펌프를 포함한다. 그런 다음 시스템의 한 컬럼에서 다음 컬럼으로 순차적으로 공급물, 탈착제 및 생성물의 주기적인 이동과 연속적인 공급 또는 회수로 향류 흐름이 달성된다.
통상적인 4-존 폐 루프 4 SMB 시스템 외에도 3-존 개방 루프 시스템이 이용 가능하며, 새로운 용매가 저렴하다면, 예를 들어 물 또는 물/에탄올 혼합물이 이동상으로 사용되는 경우 보다 비용 효율적일 수 있다. 3-존 루프 구성에서 액상의 재생은 더 이상 필요하지 않고 따라서 존 IV는 더 이상 필요없다.
2 성분 혼합물 분리를 위한 통상적인 SMB 시스템 외에도, 8-존 폐 루프 시스템 (도 6) 및 5-존 개방 루프 시스템이 2 초과 성분 분리를 위해 개발되었다.
연속 작동 모드, 이동상의 재순환 및 또한 대형 컬럼 크기의 사용 가능성을 고려할 때, SMB 시스템은 원칙적으로 수백 톤의 생산량을 달성하도록 확장될 수 있다.
모의 이동층 크로마토그래피의 공정 단계는 이 공정 단계가 목적하는 시알릴화 올리고당과 구조적으로 밀접하게 관련된 올리고당을 추가로 제거할 수 있다는 점에서 유리하다.
추가적 및/또는 대안적인 실시양태에서, 공정은 착색제를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
착색제를 제거하기 위한 적합한 공정 단계는 무세포 발효 브로스 또는 정화된 용해물을 활성 탄소, 예컨대 활성탄으로 처리하는 단계를 포함한다.
브로스를 활성 탄소로 처리하면 바람직하지 않은 착색제가 제거되고 허용 가능한 외관을 가지는 목적하는 올리고당 제제가 제공된다.
추가적 및/또는 대안적인 실시양태에서, 시알릴화 올리고당을 정제하기 위한 공정은 목적하는 시알릴화 올리고당의 농도를 증가시키는 적어도 하나의 단계를 포함한다.
본 방법의 추가적 및/또는 대안적인 실시양태에서, 목적하는 시알릴화 올리고당을 함유하는 용액은 정제 단계 i) 내지 iv) 중 적어도 한 단계 후, 바람직하게는 정제 단계 iv) 후에, 진공 증발 (예를 들어, 낙하 필름 증발기 또는 플레이트 증발기를 사용) 또는 역삼투 또는 나노여과 (예를 들어 20Å 이하의 크기 배제 한계를 갖는 나노 여과막을 이용한 나노여과)를 사용하여:
a) 100 g/L 이상, 바람직하게는 200 g/L 이상, 더욱 바람직하게는 300 g/L 이상의 농도로; 및/또는
b) 80 ℃ 미만, 바람직하게는 50 ℃ 미만, 보다 바람직하게는 20 ℃ 내지 50 ℃, 보다 더 바람직하게는 30 ℃ 내지 45 ℃, 가장 바람직하게는 35 ℃ 내지 45 ℃의 온도에서 (특히 진공 증발 또는 역삼투에 관련됨); 및/또는
c) 80 ℃ 미만, 바람직하게는 50 ℃ 미만, 보다 바람직하게는 4 ℃ 내지 40 ℃의 온도 (특히 나노여과에 관련됨)에서 농축된다.
목적하는 시알릴화 올리고당의 농도를 증가시키기에 적합한 방법은 나노여과 및 용매의 증발을 포함한다.
본 발명에 따른 방법의 추가적 및/또는 대안적인 실시양태에서, 정제된 용액은 멸균 여과되고/거나, 바람직하게는 정제된 용액을 3 kDa 필터 또는 6 kDa 필터를 통해 여과함으로써 내독소 제거 처리된다.
발효 브로스, 세포 용해물 또는 생체 촉매반응의 반응 혼합물로부터 목적하는 올리고당을 정제하는 공정은 목적하는 올리고당의 수용액을 제공한다. 추가적 및/또는 대안적인 실시양태에서, 공정은 시알릴화 올리고당으로부터 용매를 제거하여 고농도의 목적하는 올리고당을 포함하는 목적하는 올리고당의 용액을 제공하거나 또는 목적하는 올리고당의 고체 제제를 수득하는 단계를 추가로 포함한다.
목적하는 올리고당의 고체 제제를 수득하기 위해 시알릴화 올리고당의 액체 제제로부터 용매를 제거하기 위한 적합한 방법은 결정화 및 동결 건조를 포함한다 (동결 건조 - sHMO 함유 수용액을 동결시킨 후 주위 압력을 감소시키는 방법, 재료 내 동결된 물은 고상에서 기상으로 직접 승화되며, 이는 일반적으로 흡습성 sHMO 분말로 이어진다).
대안적인 실시양태에서, 용매는 분무 건조에 의해 시알릴화 올리고당의 액체 제제로부터 제거될 수 있다. 본 발명자들은 놀랍게도 탄수화물이 전형적으로 분무 건조에 적합하지 않은 것으로 알려져 있지만, 목적하는 시알릴화 올리고당을 함유하는 액체 제제를 분무 건조시켜 본질적으로 목적하는 시알릴화 올리고당으로 구성된 분말을 수득할 수 있고 이것은 또한 락토스, 시알산, 푸코스 등을 포함한다는 것을 밝혀냈다.
정제 공정의 첫 번째 단계는 전형적으로 발효 브로스에서 바이오매스를 분리하는 것이다. 공정이 제제로부터 용매를 제거하는 단계를 포함하는 경우, 이 단계가 전형적으로 목적하는 올리고당을 정제하는 최종 단계이다. 추가 공정 단계의 순서는 특별히 제한이 없다.
도 2를 참조하면, 시알릴화 올리고당을 정제하기 위한 공정의 일 실시양태가 개략적으로 도시되며, 여기서 시알릴화 올리고당은 미생물 발효에 의해 생산된 sHMO이다. 발효 종료시, 교차류 여과에 의해 바이오매스를 발효 브로스로부터 분리한다. 여액 (무세포 발효 브로스)에 양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피를 실시한다. 이어서, 용출액을 농축시키고 활성 탄소로 처리한다. 생성된 용액에 SMB 크로마토그래피를 실시하고, 생성된 용액 중의 시알릴화 올리고당의 농도를 증가시킨다. 마지막으로, 3 kDa 컷오프로 여과한 다음 멸균 여과하여 고농도의 목적하는 sHMO를 함유하는 용액을 수득한다.
도 3은 고농도의 목적하는 sHMO를 함유하는 용액을 분무 건조하여 목적하는 sHMO를 분말로 수득한다는 점에서 도 2에 나타낸 실시양태와 상이한, 공정의 다른 실시양태를 도시한다.
예기치않게, 본 발명자들은 3'-시알릴락토스와 6'-시알릴락토스가 분무 건조될 수 있는 조건을 알아낼 수 있었다. 분무 건조될 수 없는 락토스 또는 시알산과 달리, 이러한 sHMO를 분무 건조된 분말로 수득할 수 있는 조건을 발견하였다. 분무 건조된 분말은 또한 다소 흡습성인 것으로 나타났다. 분무 건조의 이용은 결정화 또는 동결 건조와 같은 다른 공정에 비해 결정화의 경우에서와 같은 유기 용매를 피하면서, 매우 경제적이고 sHMO의 대규모 제조에 적합한 것 등의 몇 가지 장점을 갖는다.
도 4에 개략적으로 도시된 공정의 실시양태는 공정이 고순도의 sHMO 제제를 얻기 위한 SMB 크로마토그래피를 포함하지 않는다는 점에서 도 3에 도시된 실시양태와 상이하다.
제2 측면에 따라, 미생물 발효 또는 시험관 내 생체 촉매반응에 의해 생산된 시알릴화된 올리고당 제제가 제공된다.
제제의 시알릴화 올리고당은 본원에 기재된 공정에 의해 발효 브로스, 세포 또는 반응 혼합물로부터 정제된다.
추가적 및/또는 대안적인 실시양태에서, 시알릴화 올리고당은 시알릴화 HMO이다. 추가적 및/또는 대안적인 실시양태에서, 시알릴화 HMO는 3'-SL, 6'-SL, LST-a, LST-b, LST-c, F-SL, F-LST-b 및 DS-LNT로 구성된 군으로부터 선택된다.
시알릴화 올리고당 제제는 용매, 바람직하게는 물 중 시알릴화 올리고당의 용액으로서 액체 형태로 존재할 수 있다. 대안적인 실시양태에서, 시알릴화 올리고당 제제는 고체 형태, 바람직하게는 분말 형태로 존재한다. 분말은 입자 형태의 시알릴화된 올리고당을 포함하며, 여기서 시알릴화된 올리고당은 비정질 입자 형태 또는 결정질 입자 형태로 존재한다. 수분 함량이 10% 미만인 분무 건조된 분말로서 수득된 시알릴화 올리고당이 가장 바람직하다.
Figure pct00001
본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 수득할 수 있는 시알릴화 올리고당 제제는 목적하는 시알릴화 올리고당을 80 중량% 이상의 순도로 포함한다.
제3 측면에 따라, 영양 조성물, 바람직하게는 유아용 조제 분유의 제조를 위한, 상기 본원에 기재된 시알릴화 올리고당, 특히 시알릴화 HMO의 용도가 제공된다.
시알릴화 올리고당을 정제하는 공정은 사람이 소비하기에 충분한 순도로 존재하는 시알릴화 올리고당 제제를 제공한다.
상기 영양 조성물은 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 적어도 하나의 시알릴화 올리고당을 함유한다.
따라서, 제4 측면에 따라, 상기 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 적어도 하나의 시알릴화 올리고당, 바람직하게는 적어도 하나의 sHMO를 함유하는 영양 조성물이 제공된다. 영양 조성물 중 적어도 하나의 sHMO는 3'-SL, 6'-SL, LST-a, LST-b, LST-c, F-SL, DS-LNT 및 F-LSTb로 구성된 군으로부터 선택된다. 상기 적어도 하나의 시알릴화 올리고당은 미생물 발효 또는 시험관 내 생체 촉매반응에 의해 생산되었다.
추가의 실시양태에서, 영양 조성물은 의약 제형, 유아용 조제 분유, 유제품 음료 및 식이 보충제로 구성된 군으로부터 선택된다. 영양 조성물은 단백질, 탄수화물, 지방, 지방산, 바람직하게는 다중 불포화 지방산 (PUFA), 비타민, 미네랄과 같은 미량 영양소 및/또는 다량 영양소를 추가로 포함한다.
의약 제형으로서, 영양 조성물은 시알릴락토스가 인슐린의 분비를 증진시키고 따라서 혈당 수준을 증가시켜 당뇨병을 예방 또는 완화시킬 수 있기 때문에 당뇨병의 증상을 개선시키는 데 사용될 수 있다. 또한, 3'-SL을 함유하는 영양 조성물은 골관절염에 효과적일 수 있다.
유아용 조제 분유로서, 영양 조성물은 규정 (EU) 2016/127에 기재된 구성 요건을 충족시킨다. 유아용 조제 분유의 예시적인 조성은 표 2 및 표 3에 명시되어 있다.
Figure pct00002
Figure pct00003
추가적 및/또는 대안적인 실시양태에서, 영양 조성물은 미생물, 바람직하게는 프로바이오틱 미생물을 추가로 포함한다. 유아용 식품 용도로 사용되는 경우, 바람직한 미생물은 건강한 사람의 마이크로바이옴 (microbiome)에서 유래하거나 발견될 수 있는 것이다. 바람직하게는, 미생물은 비피더스균 (Bifidobacterium), 젖산균 (Lactobacillus), 장구균 (Enterococcus), 연쇄상구균 (Streptococcus), 포도상구균 (Staphylococcus), 펩토스트렙토코쿠스 (Peptostreptococcus), 류코노스톡균 (Leuconostoc), 클로스트리듐 (Clostridium), 진정세균 (Eubacterium), 베일로넬라 (Veilonella), 방추형균 (Fusobacterium), 박테리오이데스 (Bacterioides), 프로보텔라 (Prevotella), 에스케리키아 (Escherichia), 프로피온산균 (Propionibacterium) 및 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속으로부터 선택되나 이들에만 한정되지는 않는다. 추가적 및/또는 대안적인 실시양태에서, 미생물은 비피도박테리움 브레베 (Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 락티스 (Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 아니말리스 (Bifidobacterium animalis,), 비피도박테리움 비피둠 (Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 인판티스 (Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 알도레센티스 (Bifidobacterium aldolescentis), 락토바실러스 아시도필루스 (Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 살리바리우스 (Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei), 락토바실러스 가세리 (Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 레우테리 (Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 살리바리우스 (Lactobacillus salivarius), 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis), 락토바실러스 파라카세이 (Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 불가리쿠스 (Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 헬베티쿠스 (Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 페르멘툼 (Lactobacillus fermentum), 류코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides); 대장균 (Escherichia coli), 엔테로코쿠스 파에시움 (Enterococcus faecium), 및 스트렙토코쿠스 테르모필루스 (Streptococcus thermophilus (VSL#3)로 구성된 군으로부터 선택된다.
sHMO와 살아있는 유기체의 조합 외에도, 이들 올리고당은 또한 사멸 배양물과 조합하여 사용될 수 있다. 프로바이오틱스 분야에서는 때때로 사멸된 배양물 (예: 틴달화 (tyndalized) 박테리아)이 사용된다. 이러한 사멸된 배양물은 단백질, 펩티드, 올리고당, 세포 외벽 단편, 천연 생성물을 제공하여 면역계의 짧은 열 자극을 유발할 수 있는 것으로 여겨진다.
영양 조성물 중 적어도 하나의 시알릴화 올리고당, 특히 적어도 하나의 sHMO 및 프로바이오틱 마이크로오르판심의 조합은 장에서 적절한 마이크로바이옴을 확립 또는 재확립하는 데 특히 유리하며, 이와 관련된 건강상 이익이 촉진된다.
적어도 하나의 시알릴화 올리고당, 특히 하나의 sHMO와 GOS (갈락토올리고당) 및/또는 FOS (프럭토올리고당, 인슐린)와 같은 확립된 프리바이오틱스와의 조합이 보다 더 유리하다.
영양 조성물은 분말, 과립, 플레이크 및 펠렛을 포함하지만 이에 제한되지 않는 액체 형태 또는 고체 형태로 존재할 수 있다.
이에 따라, 2'-푸코실락토스, 3-푸코실락토스, 락토-N-테트라오스, 락토-N-네오테트라오스, 락토-N-푸코펜타오스 I, 3'-시알릴락토스 및 6'-시알릴락토스로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 5종의 HMO를 포함하는 영양 조성물이 제공된다.
추가적 및/또는 대안적인 실시양태에서, 상기 본원에 개시된 영양 조성물은 적어도 하나의 시알릴화된 HMO 및 적어도 하나의 중성 HMO 및 프로바이오틱 미생물을 함유한다.
제5 측면에 따라, 본질적으로 건조 중량으로 >80%의 순도를 가지는 시알릴화 올리고당으로 이루어지고 10 중량% 미만의 물을 포함하는 분무 건조된 GMO-비함유 분말이 제공된다.
일 실시양태에서, 분무 건조된 분말은 3'-시알릴락토스, 6'-시알릴락토스 및 3'-시알릴락토스와 6'-시알릴락토스의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 시알릴화 올리고당으로 본질적으로 이루어진 분말이다.
추가적 및/또는 대안적인 실시양태에서, 분무 건조된 분말은 본질적으로 3'-시알릴락토스, 6'-시알릴락토스 및 하나 이상의 중성 HMO의 혼합물로 이루어지며, 상기 하나 이상의 중성 HMO는 2'-푸코실락토스, 3-푸코실락토스, 락토-N-테트라오스, 락토-N-네오테트라오스, 락토-N-푸코펜타오스 I로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에 관해, 그리고 도면을 참조하여 본 발명을 기재할 것이나, 본 발명은 이에 제한되지 않고 청구범위에 의해서만 한정된다. 또한, 설명 및 청구범위에서 제1, 제2 등의 용어는 유사한 요소들을 구별하기 위해 사용되는 것이고 반드시 시간적으로, 공간적으로, 순위에 따라, 또는 임의의 다른 방식으로 순서를 기재하기 위한 것은 아니다. 그렇게 사용되는 용어는 적절한 상황 하에 호환적이며 본원에 기재된 본 발명의 실시양태는 본원에 기재되거나 예시된 것과 다른 순서로 작동할 수 있음이 이해되어야 한다.
청구범위에 사용된 "포함하는"이라는 용어는 그 용어 뒤에 열거된 수단으로 제한되는 것으로 해석되어서는 안되며; 다른 요소 또는 단계를 배제하지 않음에 유의해야 한다. 따라서 그것은 언급된 특징부, 정수, 단계, 또는 구성요소의 존재를 언급된 바와 같이 명시하는 것으로 해석되어야 하며, 하나 이상의 다른 특징부, 정수, 단계, 또는 구성요소, 또는 그의 그룹의 존재 또는 부가를 배제하지 않는다. 따라서, 표현 "수단 A 및 B를 포함하는 장치"의 범위는 구성요소 A 및 B로만 구성되는 장치로 제한되어서는 안된다. 그것은 본 발명에 관련하여 장치의 유일한 관련 구성요소가 A 및 B임을 의미한다.
본원 전반에 걸쳐 "일 실시양태" 또는 "실시양태"를 지칭하는 것은, 실시양태와 관련하여 기재된 특정 특징부, 구조, 또는 특징이 본 발명의 적어도 하나의 실시양태에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본원 전반에 걸쳐 다양한 곳에서의 구문 "일 실시양태에서" 또는 "실시양태에서"의 출현은 반드시 동일한 실시양태를 지칭하지는 않지만, 그럴 수도 있다. 추가로, 하나 이상의 실시양태에서, 본 개시내용으로부터 당업자에게 자명한 바와 같이, 특정 특징부, 구조, 또는 특징을 임의의 적합한 방식으로 조합할 수 있다.
마찬가지로, 개시내용을 간소화하고 하나 이상의 다양한 발명 양태의 이해를 도울 목적으로 본 발명의 예시적인 실시양태의 기재에서 본 발명의 다양한 특징부가 간혹 단일 실시양태, 도면, 또는 그의 설명으로 함께 그룹화됨이 인정되어야 한다. 그러나, 이러한 개시 방법은 청구된 발명이 각각의 청구항에 명시적으로 나열된 것보다 더 많은 특징부를 필요로 한다는 의도를 반영하는 것으로 해석되어서는 안된다. 오히려, 하기 청구범위가 반영하는 바와 같이, 발명 양태는 앞서 개시된 단일 실시양태의 모든 특징부보다 더 적은 특징부에 있다. 따라서, 상세한 설명 뒤에 이어지는 청구범위는 이에 의해 본 상세한 설명에 명시적으로 포함되며, 각각의 청구항은 본 발명의 별도의 실시양태로서 독립적이다.
추가로, 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 본원에 기재된 일부 실시양태는 다른 실시양태에 포함된 다른 특징부가 아닌 일부를 포함하지만, 상이한 실시양태의 특징부의 조합은 본 발명의 범위 내에 있도록 의도되며, 상이한 실시양태를 형성한다. 예를 들어, 하기 청구범위에서, 청구된 실시양태 중 임의의 것을 임의의 조합으로 사용할 수 있다.
추가로, 실시양태 중 일부는 컴퓨터 시스템의 프로세서에 의해, 또는 기능을 수행하는 다른 수단에 의해 시행될 수 있는 방법 또는 방법의 요소의 조합으로서 본원에 기재된다. 따라서, 이러한 방법 또는 방법의 요소를 실행하기 위해 필요한 지침이 있는 프로세서는 방법 또는 방법의 요소를 실행하기 위한 수단을 형성한다. 추가로, 본원에 기재된 장치 실시양태의 요소는 본 발명을 실행하는 목적으로 요소에 의해 수행되는 기능을 실행하기 위한 수단의 예이다.
본원에 제공된 상세한 설명 및 도면에는 다수의 특이적 상세사항이 기술되어 있다. 그러나 본 발명의 실시양태는 이들 특이적 상세사항 없이 실시될 수 있음이 이해된다. 다른 경우에, 본 상세한 설명의 이해를 모호하게 하지 않기 위해 주지된 방법, 구조, 및 기술은 상세하게 나타내지 않았다.
이제 본 발명의 몇몇 실시양태의 상세한 설명에 의해 본 발명을 기재할 것이다. 본 발명의 진정한 사상 또는 기술적 교시로부터 벗어나지 않으면서 당업자의 지식에 따라 본 발명의 다른 실시양태가 구성될 수 있음이 분명하며, 본 발명은 첨부된 청구범위의 조건에 의해서만 한정된다.
실시예 1: 재조합 미생물을 사용한 3'-시알릴락토스의 발효
Vibrio sp. JT-FAJ-16으로부터의 3'-시알릴트랜스퍼라제 유전자 게놈 통합을 포함해, 재조합 3'-시알릴락토스 합성 대장균 균주 (E. coli BL21(DE3) △lacZ)를 사용한 3'-시알릴락토스 유가 배양식 (fed-batch) 발효. 대장균으로부터의 글루코사민-6-포스페이트 신타제 GlmS, 시네코시스티스 에스피 (Synechocystis sp.)로부터의 N-아세틸글루코사민 2-에피메라제 Slr1975, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)로부터의 글루코사민 6-포스페이트-N-아세틸트랜스퍼라제 Gna1을 암호화하는 CMP-시알산 유전자의 생합성을 향상시키기 위해, 대장균으로부터의 포스포에놀피루베이트 신타제 PpsA, 모두 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni)로부터의 것인 N-아세틸뉴라미네이트 신타제 NeuB 및 CMP-시알산 합성효소 NeuA를 대장균 BL21 (DE3) 숙주 내로 염색체적으로 통합시켰다. 또한, 대장균으로부터의 락토스 퍼메아제 LacY를 코딩하는 유전자, 및 E. coli W로부터의 유전자 cscB (수크로스 퍼메아제), cscK (프럭토키나제), cscA (수크로스 하이드롤라제) 및 cscR (전사 조절제)을 BL21 게놈에 통합시켰다. 통합된 유전자의 전사가 구성적 프로모터인 테트라사이클린 프로모터 Ptet 또는 PTS 프로모터로부터 개시되었다. 유전자 galE (UDP-글루코스-4-에피메라제), galT (갈락토스-1-포스페이트 우리딜릴트랜스퍼라제), galK (갈락토키나제) 및 galM (갈락토스-1-에피머라제)로 구성된 기능성 gal-오페론을 E coli K12로부터 BL21 균주의 게놈으로 전달하였다. 분해를 방지하기 위해 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제 (NagA), 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제 (NagB) 및 N-아세틸글루코사민 특이적 PTS 단백질 IIABC (NagE)를 코딩하는 N-아세틸글루코사민 6-포스페이트 유전자를 염색체에서 삭제하였다. 또한, 만노스, 글루코스, 글루코사민 및 N-아세틸글루코사민에 대한 E coli PTS 시스템의 당 수송체를 암호화하는 오페론 manXYZ뿐만 아니라, N-아세틸뉴라미네이트 리아제, N-아세틸만노사민키나제, N-아세틸만노사민-6-포스페이트 에피머라제 및 시알산 수송체를 각각 암호화하는 유전자 nanA, nanK, nanE 및 nanT를 삭제하였다. N-아세틸갈락토사민-6-포스페이트 데아세틸라제 (AgaA)를 암호화하는 유전자도 삭제하였다.
3'-시알릴락토스 생산 균주를 7 g L-1 NH4H2PO4, 7 g L-1 K2HPO4, 2 g L-1 KOH, 0.3 g L-1 시트르산, 5 g L-1 NH4Cl, 1 ㎖ L-1 소포제 (Struktol J673, Schill + Seilacher), 0.1 mM CaCl2, 8 mM MgS04, 미량 원소 및 탄소원으로서 2% 수크로스를 포함하는 한정 미네랄 염 배지에서 성장시켰다.
미량 원소는 0.101 g L-1 니트릴로트리아세트산, pH 6.5, 0.056 g L-1 시트르산철암모늄, 0.01 g L-1 MnCl2×4H20, 0.002 g L-1 CoCl2×6H20, 0.001 g L-1 CuCl2×2H20, 0.002 g L-1 붕산, 0.009 g L-1 ZnS04×7H20, 0.001 g L-1 Na2Mo04×2H20, 0.002 g L-1 Na2Se03, 0.002 g L-1 NiS04×6H20로 이루어졌다.
수크로스 공급물 (500 g L-1)에 8 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl2, 미량 원소 및 5 g L-1 NH4Cl을 보충하였다. 3'-시알릴락토스 형성을 위해, 216 g L-1의 락토스 공급물을 사용하였다. 암모니아 용액 (25% v/v)을 사용하여 pH를 조절하였다. 출발 부피에 대해 수크로스 공급 속도를 5.5 - 7 mL L-1h-1로 하여 일정한 통기 및 교반하에 72 시간 동안 30 ℃에서 유가 배양식 발효를 수행하였다. 발효 시작 72 시간 후, 첨가된 락토스 대부분이 3'-시알릴락토스로 전환되었다. 발효 상등액에서 잔류 락토스를 제거하기 위해, 발효 용기에 β-갈락토시다제를 첨가하였다. 생성된 단당류를 생산 균주로 대사시켰다.
실시예 2: 재조합 미생물을 사용한 6'-시알릴락토스 sHMO의 발효
6'-시알릴락토스를 합성하는 균주는 시알릴트랜스퍼라제에도 불구하고 3'-시알릴락토스 생산 균주와 동일한 유전적 특징을 포함한다. 6'-시알릴락토스의 생산을 위해, 알파-2,6-시알릴트랜스퍼라제를 코딩하는 포토박테륨 레이오그나티 (Photobacterium leiognathi) JT-SHIZ-119로부터의 plsT6 유전자를 E coli BL21 (DE3) 게놈에 통합시켰다.
6'-시알릴락토스의 발효 생산을 위해, 균주를 7 g L-1 NH4H2PO4, 7 g L-1 K2HPO4, 2 g L-1 KOH, 0.3 g L-1 시트르산, 5 g L-1 NH4Cl, 1 ㎖ L-1 소포제 (Struktol J673, Schill + Seilacher), 0.1 mM CaCl2, 8 mM MgS04, 미량 원소 (0.101 g L-1 니트릴로트리아세트산, pH 6.5, 0.056 g L-1 시트르산철암모늄, 0.01 g L-1 MnCl2×4H20, 0.002 g L-1 CoCl2×6H20, 0.001 g L-1 CuCl2×2H20, 0.002 g L-1 붕산, 0.009 g L-1 ZnS04×7H20, 0.001 g L-1 Na2Mo04×2H20, 0.002 g L-1 Na2Se03, 0.002 g L-1 NiS04×6H20) 및 탄소원으로서 2% 수크로스를 포함하는 한정 미네랄 염 배지에서 성장시켰다.
수크로스 공급물 (500 g L-1)에 8 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl2, 미량 원소 및 5 g L-1 NH4Cl을 보충하였다. 6'-시알릴락토스 발효를 위해, 216 g L-1의 락토스 공급물을 사용하였다. 암모니아 용액 (25% v/v)을 사용하여 pH를 조절하였다. 출발 부피에 대해 수크로스 공급 속도를 5.5 - 7 mL L-1h-1로 하여 일정한 통기 및 교반하에 72 시간 동안 30 ℃에서 유가 배양식 발효를 수행하였다. β-갈락토시다제를 첨가하여 생산 공정 종료시 6'-시알릴락토스로 전환되지 않은 락토스를 분해시키고, 락토스 가수분해로 생산된 단당류를 생산 균주로 대사시켰다.
실시예 3: 발효 브로스로부터 6'-시알릴락토스 및 3'-시알릴락토스의 정제
한외여과 후에 와인딩 모듈 필터 (0.05 μm 컷오프) (CUT membrane technology, Erkrath, Germany) 및 교차류 필터 (150 kDa 컷오프) (Microdyn-Nadir, Wiesbaden, Germany)를 차례로 이용하여 발효 배지로부터 바이오매스를 분리하였다. 시알릴화 올리고당을 20 g L-1 초과로 함유하는 무세포 발효 배지 약 1 m3를 수득하였다.
이어서, 무세포 액체를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 탈이온화시켰다. 먼저, H+ 형태의 200 L 부피 강 양이온 교환기 (Lewatit S 2568 (Lanxess, Cologne, Germany))에서 양이온성 오염 물질을 제거하였다. 얻은 용액의 pH를 NaOH를 사용하여 7.0으로 설정하였다. 제2 단계에서, 염화물 음이온 형태의 강 음이온 교환기 Lewatit S 6368 S (Lanxess, Cologne, Germany)를 사용하여 음이온성 이온 및 바람직하지 않은 착색제를 용액으로부터 제거하였다. 이온 교환기의 베드 부피는 200 L이었다. 교차류식 필터 (150 kDa 컷오프) (Microdyn-Nadir, Wiesbaden, Germany)에서 제2 여과 단계를 채용해 용액의 산성화에 의해 생성된 침전물을 제거하였다. 당 농축을 위해, 용액을 Dow Filmtec NF270-4040 (Inaqua, Monchengladbach, Germany), 또는 대안적으로 Trisep 4040-XN45-TSF 멤브레인 (0.5 kDa 컷오프) (Microdyn-Nadir, Wiesbaden, Germany)에서 나노여과하였다. 후자를 이용하여, 발효 공정에서 유래하고 시알릴락토스 용액을 오염시키는 단당류 N-아세틸글루코사민을 생성물로부터 분리하였다. 이어 농축된 시알릴락토스 용액을 활성탄 (CAS: 7440-44-0, Carl Roth, Karlsruhe, Germany)으로 처리하여 메일라드 반응 생성물 및 알돌 반응 생성물과 같은 착색제를 제거하였다. 시알산 및-N-아세틸글루코사민과 같은 발효 공정에서 발생하는 부산물로부터 시알릴락토스를 분리하기 위해, 용액을 1 kDa 컷오프 멤브레인 GE4040F30 (GE water & process technologies, Ratingen, Germany)으로 여과하고, 0.6 내지 0.8 mS의 전도도로 투석여과하였다. 희석된 용액을 회전 증발기에서 약 300 g L-1의 농도로 농축시켰다. 최종 크로마토그래피 분리에서, 디-시알릴락토스 등의 다른 오염 당을 제거하였다. 이를 위해, 농축된 용액을 아세테이트 형태의 약 음이온 이온 교환 수지 (Amberlite FPA51, Dow Chemical, Michigan, USA)에 적용하였다. 시알릴락토스는 수지에 거의 결합하지 않지만, 디-시알릴락토스는 흡착된다. 이에 따라, 시알릴락토스는 10 mM 아세트산암모늄으로 용리된 반면, 디-시알릴락토스는 1M 아세트산암모늄으로 용리되었다. 아세트산암모늄을 제거하기 위해, 시알릴락토스를 10 배 과량의 에탄올로 침전시켰다. 고체 분획을 여과하고 건조시켰다.
20% 시알릴락토스 용액을 6 kDa 필터 (Pall Microza 한외여과 모듈 SIP-2013, Pall Corporation, Dreieich, Germany) 및 0.2 μm 멸균 필터에 차례로 통과시켜 생성물을 확정하였다.
용액의 일부를 다음 파라미터를 적용하여 Buechi 분무 건조기 (Buechi Mini 분무 건조기 B-290) (Buechi, Essen, Germany)로 분무 건조시켰다: 입구 온도: 130 ℃, 출구 온도 67-71 ℃, 가스 흐름 670 L/h, 아스피레이터 100%.
분무 건조된 6'-시알릴락토스의 순도는 91%인 반면, 3'-시알릴락토스 물질의 순도는 93%였다.
실시예 4: 광각 X-선 분말(power) 회절 (XDR)에 의한 분무 건조된 시알릴락토스의 분석
광각 X-선 분말(powder) 회절 (XRD)을 사용하여 동결 건조된 생성물의 형태를 연구하였다. 구리 애노드 (45 kV, 40 mA, 0.154 nm의 파장에서 Kα1 방출) 및 PIXcel3D 검출기가 장착된 X-선 회절계 Empyrean (Panalytical, Almelo, The Netherlands)를 사용하였다. 약 100 mg의 분무 건조된 샘플을 5-45 ° 2θ의 각도 범위에서 스텝 크기 0.04 ° 2θ 및 스텝 당 100 초의 계수 시간을 이용하여 반사 모드로 분석하였다.
분무 건조된 6'-시알릴락토스는 완전히 비정질 구조를 갖는 것으로 밝혀졌고 (도 7), 이에 반해 3'-시알릴락토스 샘플은 7 °및 31 °에서 2 개의 회절 피크를 나타내어 부분적으로 결정질 구조임을 제시하였지만, 3'-시알릴락토스 샘플은 또한 대부분 비정질 신호를 나타내었다 (도 8).
실시예 5: 시차 주사 열량 측정법 (DSC)에 의한 분무 건조된 시알릴락토스의 분석
Mettler Toledo 821e (Mettler Toledo, Giessen, Germany)에서의 시차 주사 열량 측정법 (DSC)을 사용하여 분무 건조된 생성물의 열 이벤트 (유리 전이 온도 (Tg), 추가로 발열 및 흡열 이벤트)를 결정하였다.
약 25 mg의 분무 건조된 생성물을 크림핑된 Al-도가니 (Mettler Toledo, Giessen, Germany)에서 분석하였다. 샘플을 10 K/분으로 0 ℃로 냉각시키고 10 K/분의 스캐닝 속도로 100 ℃로 재가열하였다. 샘플을 0 ℃로 냉각시킨 후, 제2 가열 사이클에서 샘플을 150 ℃로 가열하였다. 가열 스캔 동안 기준선의 흡열 이동 중간점을 Tg로 취하였다. 발열 및 흡열 피크를 이벤트의 피크 온도 및 정규화 에너지로 보고하였다.
분무 건조된 6'-시알릴락토스 샘플은 제1 가열 스캔에서 48 ℃의 Tg 값을 나타내었고, 제1 Tg 후 흡열 완화 피크와 함께 제2 가열 스캔에서 50 ℃의 Tg를 나타냈다. 6'-시알릴락토스에 비해, 3'-시알릴락토스는 두 가열 스캔 모두에서 22 ℃의 Tg 값을 나타내었으며, 이는 더 높은 온도에서 6'-시알릴락토스의 안정성이 더 높음을 의미한다.

Claims (23)

  1. 미생물 발효 또는 시험관 내 생체 촉매반응(in-vitro biocatalysis)에 의해 생산된 시알릴화 올리고당(sialylated oligosaccharide)을 정제하는 방법으로서,
    i) 발효 브로스(broth)로부터 바이오매스를 분리하는 단계;
    ii) 발효 브로스 또는 반응 혼합물로부터 양이온을 제거하는 단계;
    iii) 발효 브로스 또는 반응 혼합물로부터 음이온성 불순물을 제거하는 단계; 및
    iv) 발효 브로스 또는 반응 혼합물로부터 정제될 시알릴화 올리고당보다 분자량이 낮은 화합물을 제거하는 단계;
    를 포함하는 방법
  2. 제1항에 있어서,
    v) 시알릴화 올리고당의 농도를 증가시키는 단계;
    vi) 원치 않는 올리고당을 제거하는 단계;
    vii) 착색제를 제거하는 단계;
    viii) 내독소를 제거하는 단계;
    ix) 멸균 단계; 및
    x) 시알릴화 올리고당을 분무 건조 또는 결정화하는 단계;
    로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단계를 더 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 시알릴화 올리고당이, 바람직하게는 3'-SL, 6'-SL, LST-a, LST-b, LST-c, 3-F-SL, DS-LNT 및 F-LST-b로 구성된 군으로부터 선택된, 시알릴화 모유 올리고당인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 발효 브로스로부터 바이오매스를 제거하는 단계가, 발효 브로스를 한외여과, 바람직하게는 발효 브로스로부터 분자량이 500 kDa 이상인 화합물 및 바이오매스를 제거하는 한외여과, 보다 바람직하게는 발효 브로스로부터 분자량이 150 kDa 이상인 화합물 및 바이오매스를 제거하는 한외여과, 및 가장 바람직하게는 발효 브로스로부터 분자량이 100 kDa 이상인 화합물 및 바이오매스를 제거하는 한외여과에 적용함으로써 수행되는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 발효 브로스로부터 양이온을 제거하는 단계가 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 수행되는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 발효 브로스로부터 음이온성 불순물을 제거하는 단계가 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 수행되는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 정제될 시알릴화 올리고당보다 분자량이 낮은 화합물을 제거하는 단계가 교차류 여과(cross-flow filtration)에 의해 수행되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 정제될 시알릴화 올리고당의 농도가 나노여과 또는 용매 증발에 의해 증가되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 착색제를 제거하는 단계가 목적하는 시알릴화 올리고당을 함유하는 발효 브로스/용액을 활성 탄소로 처리함으로써 수행되는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 내독소를 제거하는 단계가 목적하는 올리고당을 함유하는 용액을 6 kDa 필터 또는 3 kDa 필터를 통해 여과함으로써 수행되는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 용액을 멸균하는 단계가 용액을 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과함으로써 수행되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, SMB 크로마토그래피 단계를 더 포함하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 전기투석 단계를 더 포함하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 정제된 시알릴화 올리고당의 제제.
  15. 제14항에 있어서, 시알릴화 올리고당이 80 중량% 이상의 순도로 제제 중에 존재하는, 제제.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 유체 또는 분말, 바람직하게는 입자가 비정질 또는 결정질 입자인 분말인, 제제.
  17. 영양 조성물, 바람직하게는 유아용 조제 분유(infant formula)를 제조하기 위한, 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 제제의 용도.
  18. 적어도 하나의 시알릴화 올리고당을 포함하는 영양 조성물로서, 상기 적어도 하나의 시알릴화 올리고당은 미생물 발효 또는 생체 촉매반응에 의해 생산되고, 상기 영양 조성물은 의약 제형, 식이 보충제, 유제품 음료 또는 유아용 조제 분유인, 영양 조성물.
  19. 적어도 5종의 HMO를 함유하는 영양 조성물로서, 상기 적어도 5종의 HMO는 2'-푸코실락토스, 3-푸코실락토스, 락토-N-테트라오스, 락토-N-네오테트라오스, 락토-N-푸코펜타오스 I, 3'-시알릴락토스 및 6'-시알릴락토스로 구성된 군으로부터 선택되는, 영양 조성물.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 적어도 하나의 시알릴화 HMO 및 적어도 하나의 중성 HMO 및 프로바이오틱 미생물을 함유하는, 영양 조성물.
  21. 순도가 건조 중량 기준으로 80 중량% 초과이고 물을 10 중량% 미만으로 가지는, 본질적으로 시알릴화 올리고당으로 이루어진 분무 건조된 GMO-비함유 분말.
  22. 제21항에 있어서, 제품이 3'-시알릴락토스, 6'-시알릴락토스, 및 3'-시알릴락토스와 6'-시알릴락토스의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는, 분무 건조된 분말 제품.
  23. 제22항에 있어서, 분무 건조된 분말이 본질적으로 3'-시알릴락토스, 6'-시알릴락토스 및 하나 이상의 중성 HMO의 혼합물로 구성되고, 상기 하나 이상의 중성 HMO는 2'-푸코실락토스, 3-푸코실락토스, 락토-N-테트라오스, 락토-N-네오테트라오스, 락토-N-푸코펜타오스 I로 구성된 군으로부터 선택되는, 분무 건조된 분말 제품.
KR1020207008553A 2017-08-29 2018-08-29 시알릴화 올리고당의 정제 방법 KR20200041370A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17188280.6A EP3450443A1 (en) 2017-08-29 2017-08-29 Process for purifying sialylated oligosaccharides
EP17188280.6 2017-08-29
PCT/EP2018/073178 WO2019043029A1 (en) 2017-08-29 2018-08-29 PROCESS FOR PURIFYING SIALYLATED OLIGOSACCHARIDES

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20200041370A true KR20200041370A (ko) 2020-04-21

Family

ID=59858873

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207008553A KR20200041370A (ko) 2017-08-29 2018-08-29 시알릴화 올리고당의 정제 방법

Country Status (11)

Country Link
US (2) US11912735B2 (ko)
EP (2) EP3450443A1 (ko)
JP (2) JP7330171B2 (ko)
KR (1) KR20200041370A (ko)
CN (2) CN111094311A (ko)
AU (2) AU2018322785B2 (ko)
BR (1) BR112020003502A2 (ko)
MX (1) MX2020002263A (ko)
PH (1) PH12020550069A1 (ko)
SG (1) SG11202001296UA (ko)
WO (1) WO2019043029A1 (ko)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10731193B2 (en) 2014-06-27 2020-08-04 Glycom A/S Oligosaccharide production
US11926858B2 (en) 2014-06-27 2024-03-12 Glycom A/S Oligosaccharide production
US10899782B2 (en) 2016-03-07 2021-01-26 Glycom A/S Separation of oligosaccharides from fermentation broth
EP3473644A1 (en) 2017-10-17 2019-04-24 Jennewein Biotechnologie GmbH Fermentative production of n-acetylneuraminic acid
EP3494804A1 (en) * 2017-12-08 2019-06-12 Jennewein Biotechnologie GmbH Spray-dried 3-fucosyllactose
EP3494807A1 (en) * 2017-12-11 2019-06-12 Jennewein Biotechnologie GmbH Spray-dried sialyllactose
EP3494805A1 (en) * 2017-12-08 2019-06-12 Jennewein Biotechnologie GmbH Spray-dried tetrasaccharides
EP3494806A1 (en) * 2017-12-08 2019-06-12 Jennewein Biotechnologie GmbH Spray-dried lacto-n-fucopentaose
US20220232870A1 (en) 2017-12-08 2022-07-28 Chr. Hansen HMO GmbH Spray-dried lacto-n-fucopentaose
PL3575404T3 (pl) 2018-05-28 2023-02-06 Chr. Hansen HMO GmbH Fermentacyjna produkcja sacharydów sialilowanych
FI3801037T3 (fi) * 2018-06-01 2023-01-13 Yksinkertainen menetelmä sialylaktooinin puhdistamiseen
EP3741770A1 (en) * 2019-05-21 2020-11-25 Jennewein Biotechnologie GmbH Purification of oligosaccharides from a fermentation broth by using filtration
CN114615896A (zh) * 2019-09-04 2022-06-10 杜邦营养生物科学有限公司 从包含人乳寡糖和相关组合物的溶液中去除消泡剂的方法
EP3822282A1 (en) * 2019-11-18 2021-05-19 DuPont Nutrition Biosciences ApS Process for removing an antifoam agent from a solution comprising a human milk oligosaccharide and related compositions
BR112022005578A2 (pt) 2019-09-24 2022-09-20 Prolacta Bioscience Inc Composições e métodos para tratamento de doenças inflamatórias e imunes
CN110672756B (zh) * 2019-11-07 2020-12-29 江南大学 一种奶粉中2’-岩藻糖基乳糖含量的检测方法
CN110672757B (zh) * 2019-11-07 2020-12-29 江南大学 一种检测奶粉中2’-岩藻糖基乳糖含量的预处理方法
GB2590375B (en) * 2019-12-11 2024-05-08 Mjn Us Holdings Llc Staged nutritional compositions containing human milk oligosaccharides and uses thereof
CN112986367B (zh) * 2019-12-13 2023-09-12 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 毛细管电泳分离检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的方法
BR112022014823A2 (pt) * 2020-01-29 2022-10-04 Dsm Ip Assets Bv Processo para recuperação e purificação de oligosacarídeos do leite humano
WO2021202883A1 (en) * 2020-04-01 2021-10-07 Zimitech, Inc. Methods for production of oligosaccharides
CN115803443A (zh) 2020-07-13 2023-03-14 格礼卡姆股份公司 寡糖的制造
CN116322371A (zh) * 2020-08-14 2023-06-23 普罗莱克塔生物科学公司 与细菌疗法一起使用的人乳寡糖组合物
CN116322922A (zh) 2020-10-30 2023-06-23 菲仕兰坎皮纳荷兰公司 用于从发酵液中纯化酸性母乳寡糖的方法
KR20230131228A (ko) 2021-01-12 2023-09-12 프롤랙타 바이오사이언스, 인코포레이티드 신바이오틱 치료 요법
CN112920234B (zh) * 2021-01-27 2022-03-29 南开大学 一种2′-岩藻糖基乳糖的富集纯化方法
DK181061B1 (en) * 2021-03-12 2022-10-31 Glycom As Purification of sialooligosaccharides
BE1029434B1 (nl) 2021-06-15 2023-07-31 Dsm Ip Assets Bv Scheiding van moedermelkoligosachariden uit een fermentatiebouillon
BE1029436B1 (nl) 2021-06-15 2023-07-31 Dsm Ip Assets Bv Scheiding van moedermelkoligosachariden uit een fermentatiebouillon
BE1029435B1 (nl) 2021-06-15 2023-07-31 Dsm Ip Assets Bv Scheiding van moedermelkoligosachariden uit een fermentatiebouillon
EP4355465A1 (en) 2021-06-15 2024-04-24 DSM IP Assets B.V. Separation of human milk oligosaccharides from a fermentation broth
CN116200316B (zh) * 2021-11-30 2024-08-06 虹摹生物科技(上海)有限公司 一种基因工程菌及其在制备唾液酸乳糖中的应用
CN118574859A (zh) * 2021-12-15 2024-08-30 因比奥斯公司 新型的用于寡糖的干燥方法
CN114539433B (zh) * 2021-12-29 2022-11-01 北京三元食品股份有限公司 一种乳低聚糖的制备方法及制备的低聚糖粉、食品
CN114773408B (zh) * 2022-04-26 2023-09-29 山东润德生物科技有限公司 一种从发酵液中制取唾液酸的方法
CN115286666A (zh) * 2022-08-31 2022-11-04 中科合生生物工程科技(珠海横琴)有限公司 一种寡糖的分离纯化方法及应用
WO2024130119A2 (en) 2022-12-16 2024-06-20 Prolacta Bioscience, Inc. Synbiotic compositions for short chain fatty acid production
CN116425810B (zh) * 2023-06-14 2023-08-11 山东合成远景生物科技有限公司 一种混合液中3-岩藻糖基乳糖的纯化方法

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59184197A (ja) * 1983-04-01 1984-10-19 Snow Brand Milk Prod Co Ltd シアル酸結合オリゴ糖の調製法
JPH08283162A (ja) * 1995-04-10 1996-10-29 Snow Brand Milk Prod Co Ltd ミネラル吸収促進剤
US6454946B1 (en) 1996-10-10 2002-09-24 Neose Technologies, Inc. Carbohydrate purification using ultrafiltration, reverse osmosis and nanofiltration
US6323008B1 (en) 1997-08-14 2001-11-27 Neose Technologies, Inc. Methods for producing sialyloligosaccharides in a dairy source
FR2796082B1 (fr) 1999-07-07 2003-06-27 Centre Nat Rech Scient Procede de production d'oligosaccharides
FR2907687B1 (fr) * 2006-10-30 2008-12-26 Applexion Procede de purification de sialyllactose par chromatographie
AU2008273417A1 (en) 2007-07-12 2009-01-15 Yotsuba Milk Products Co., Ltd. Method for producing composition containing sialic acid compound
NL2001377C2 (nl) 2008-03-14 2009-09-15 Friesland Brands Bv Werkwijze voor het isoleren van siaalzuur bevattende oligosachariden, alsmede de hiermee verkrijgbare siaalzuur bevattende oligosachariden bevatttende samenstellingen.
NZ595597A (en) 2009-03-25 2013-05-31 Pharmacosmos Holding As A stable iron oligosaccharide compound
WO2010115934A1 (en) 2009-04-07 2010-10-14 Glycom A/S Synthesis of 2'-o-fucosyllactose
US20120021467A1 (en) * 2010-07-22 2012-01-26 Thomson Biotech (Xiamen) PTE. LTD. Method of producing xylitol and arabinose at same time from hemicellulose hydrolysates
MX355780B (es) * 2010-12-31 2018-04-30 Abbott Lab Fórmula pediátrica sintética para estimular células nerviosas entéricas en el tracto gastrointestinal.
CN102154163A (zh) 2010-12-31 2011-08-17 朱莉 一种3′-唾液酸乳糖的制备方法
EP2479263B1 (en) 2011-01-20 2013-11-27 Jennewein Biotechnologie GmbH Novel Fucosyltransferases and their applications
WO2012112777A2 (en) 2011-02-16 2012-08-23 Glycosyn LLC Biosynthesis of human milk oligosaccharides in engineered bacteria
US9382564B2 (en) 2011-05-13 2016-07-05 Glycom A/S Diversification of human milk oligosaccharides (HMOs) or precursors thereof
ES2763958T3 (es) * 2012-12-18 2020-06-01 Abbott Lab Oligosacáridos de leche humana para mejorar los síntomas del estrés
EP2857410A1 (en) 2013-10-04 2015-04-08 Jennewein Biotechnologie GmbH Process for purification of 2´-fucosyllactose using simulated moving bed chromatography
PL2896628T3 (pl) 2014-01-20 2019-03-29 Jennewein Biotechnologie Gmbh Sposób wydajnego oczyszczania obojętnych oligosacharydów ludzkiego mleka (HMO) z fermentacji mikrobiologicznej
ES2715010T3 (es) 2014-03-31 2019-05-31 Jennewein Biotechnologie Gmbh Fermentación total de oligosacáridos
US10899782B2 (en) 2016-03-07 2021-01-26 Glycom A/S Separation of oligosaccharides from fermentation broth
US20220232870A1 (en) * 2017-12-08 2022-07-28 Chr. Hansen HMO GmbH Spray-dried lacto-n-fucopentaose

Also Published As

Publication number Publication date
US11912735B2 (en) 2024-02-27
CN111094311A (zh) 2020-05-01
JP2020531039A (ja) 2020-11-05
PH12020550069A1 (en) 2021-02-15
MX2020002263A (es) 2020-07-20
AU2018322785A1 (en) 2020-02-27
AU2018322785B2 (en) 2023-03-23
US20200308211A1 (en) 2020-10-01
BR112020003502A2 (pt) 2020-09-01
EP3676274A1 (en) 2020-07-08
EP3450443A1 (en) 2019-03-06
JP7330171B2 (ja) 2023-08-21
SG11202001296UA (en) 2020-03-30
CN117778496A (zh) 2024-03-29
AU2023203977A1 (en) 2023-07-13
US20240199673A1 (en) 2024-06-20
RU2020108730A (ru) 2021-09-30
WO2019043029A1 (en) 2019-03-07
JP2023153971A (ja) 2023-10-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2018322785B2 (en) Process for purifying sialylated oligosaccharides
CN111447845B (zh) 喷雾干燥的唾液酸乳糖
EP3486326A1 (en) Method for the purification of n-acetylneuraminic acid from a fermentation broth
EP3494805A1 (en) Spray-dried tetrasaccharides
EP3494806A1 (en) Spray-dried lacto-n-fucopentaose
EP3494804A1 (en) Spray-dried 3-fucosyllactose
US20230148644A1 (en) Spray-Dried Tetrasaccharides
RU2799091C2 (ru) Способ очистки сиалилированных олигосахаридов
RU2812853C2 (ru) Высушенные распылением тетрасахариды
RU2812864C2 (ru) Высушенная распылением лакто-n-фукопентаоза

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application