BR112020003502A2 - processo para purificar oligossacarídeos sialilados - Google Patents

Abstract

  É revelado um método para purificar oligossacarídeos sialilados a partir de um caldo de fermentação, lisado celular ou mistura de reação biocatalítica para obter grandes quantidades de oligossacarídeos sialilados desejados em alta pureza. O método é adequado em particular para a purificação econômica em larga escala de oligossacarídeos sialilados de leite humano (tal como 3'-sialil-lactose, 6'-sialil-lactose ou derivados de lacto-N-tetraose sialilados) a partir de fermentação microbiana, com o uso de células bacterianas recombinantes ou células de levedura. O material obtido é de alta pureza e pode ser usado para aplicação médica ou em alimentos, tais como produtos de nutrição médica, fórmula infantil, suplementos dietéticos, produtos de nutrição geral (por exemplo, bebidas lácteas).

Description

PROCESSO PARA PURIFICAR OLIGOSSACARÍDEOS SIALILADOS

[001] A presente invenção refere-se à purificação de oligossacarídeos sialilados. Mais especificamente, a presente invenção se refere à purificação de oligossacarídeos sialilados, em particular, de oligossacarídeos sialilados de leite humano (sHMOs), a partir de um caldo de fermentação, um lisado de célula limpo ou uma mistura de reação.

ANTECEDENTES

[002] O leite humano é uma mistura complexa de carboidratos, gorduras, proteínas, vitaminas, minerais e elementos-traço. Os carboidratos são, de longe, a fração mais abundante, que podem ser divididos, adicionalmente, em lactose e oligossacarídeos mais complexos, denominados oligossacarídeos de leite humano (HMOs). Enquanto a lactose é usada como uma fonte de energia, os oligossacarídeos complexos não são metabolizados pelo bebê. A fração de oligossacarídeos complexos representa até 10% da fração total de carboidrato e provavelmente consiste em mais de 150 oligossacarídeos diferentes. A ocorrência e concentração desses oligossacarídeos complexos são específicas a humanos e, desse modo, não podem ser encontrados em grandes quantidades no leite de outros mamíferos, tais como animais domesticados para fornecimento de leite.

[003] A presença desses oligossacarídeos complexos no leite humano é conhecida há muito tempo e as funções fisiológicas desses oligossacarídeos têm sido o assunto de pesquisa médica há muitas décadas (Gura, T. (2014) Science 345: 747-749; Kunz, C. & Egge, H. (2017) In: Prebiotics and Probiotics in Human Milk. Eds. McGuire, M.K; McGuire, M.A. & Bode, L. Elsevier, London pp. 3 a 16). Para alguns dos HMOs mais abundantes, funções específicas já foram identificadas (Bode, L. (2012) Glycobiology 22: 1147-1162.; Bode, L. and Jantscher-Krenn, E. (2012) Adv. Nutr. 3: 383S-391 S; Morrow et al. (2004) J.

Pediatr. 145: 297 a 303).

[004] O fornecimento limitado de HMOs individuais e a incapacidade de produzir quantidades suficientes dessas moléculas levaram ao desenvolvimento de processos com base em síntese química para gerar algumas dessas moléculas complexas. Entretanto, a síntese química de HMOs, bem como a síntese enzimática e a produção à base de fermentação mostraram ser extremamente desafiadoras. A produção em larga escala de HMOs com uma qualidade suficiente para aplicações em alimentos praticamente não foi alcançada até agora. Em particular, a síntese química de HMOs, tal como 2’-fucosil-lactose (WO 2010/115935 A1) exige diversas substâncias químicas nocivas, que podem contaminar o produto final.

[005] As desvantagens de síntese química de HMO levou ao desenvolvimento de diversos métodos enzimáticos e à base de fermentação (Miyazaki et al., (2010) Methods in Enzymol. 480: 511 a 524; Murata et al., (1999) Glycoconj. J. 16: 189-195; Baumgartner et al. (2013) Microb. Cell Fact. 12: 40; Lee et al., (2012) Microb. Cell Fact. 11: 48; US 7,521,212 B1; Albermann et al., (2001) Carbohydr. Res. 334: 97 a 103; Fierfort, N. and Samain, E. (2008) J. Biotechnol. 134: 216 a 265). Entretanto, esses processos tendem a gerar misturas complexas de oligossacarídeos, de modo que o produto desejado seja contaminado com material inicial, tal como lactose, bem como intermediários, subprodutos indesejados (por exemplo, subprodutos que se originam de atividades secundárias de determinadas glicosiltransferases) e substratos, tais como monossacarídeos e polipeptídeos individuais.

[006] Os métodos do estado da técnica para purificar oligossacarídeos individuais de misturas de oligossacarídeo são tecnicamente complexos, difíceis de serem realizados em grande escala e não econômico para aplicações em alimentos. Os processos em escala industrial têm sido desenvolvidos para purificar os dissacarídeos lactose e sacarose a partir de soro de leite ou melaços respectivamente, mas esses métodos envolvem múltiplas etapas de cristalização que são elaboradas e oferecem baixo rendimento. Entretanto, soro de leite e melaços são produtos de "grau alimentício” iniciais e nem próximo de ser tão complexo e desafiador do ponto de vista de regulamento quanto caldos de fermentação obtidos a partir de processos de fermentação de bactéria recombinante ou levedura recombinante.

[007] A cromatografia de filtração em gel é o melhor método para a purificação de oligossacarídeos complexos, tais como HMOs produzidos por meio de fermentação microbiana, mas as desvantagens de cromatografia de filtração em gel incluem sua falta de escalabilidade e sua incompatibilidade com processamento contínuo. A cromatografia de filtração em gel não é, portanto, econômica e não pode ser usada para produzir HMOs, tais como 3’-sialil-lactose ou 6’-sialil-lactose ou qualquer outro oligossacarídeo sialilado de qualidade suficiente e em quantidade suficiente para alimento humano, particularmente para produtos de nutrição de bebês e crianças. Entretanto, a produção de HMOs sialilados (tais como 3’-sialil-lactose (3'-SL), 6’-sialil-lactose (6'-SL), sialil-lacto-N- tetraose a (LST-a), sialil-lacto-N-tetraose b (LST-b), sialil-lacto-N-tetraose c (LST- c), 3-fucosil-sialil-lactose (F-SL), disialil-lacto-N-tetraose (DS-LNT) e fucosil-LST b (F-LSTb) é interessante, visto que oligossacarídeos sialilados são - por exemplo - associados a desenvolvimento neural aperfeiçoado.

[008] O uso de microrganismos recombinante (bactérias ou levedura) para produção fermentativa de HMOs também é problemático, visto que DNA recombinante ou proteínas podem contaminar o produto final, e isso não é aceitável por consumidores e por autoridades reguladoras atuais. Visto que os limites de detecção, em particular, para moléculas de DNA recombinante são muito baixos (por exemplo, ao usar detecção com base em qPCR, que é atualmente considerada como o padrão de excelência para detecção) até mesmo uma única molécula de DNA em um produto de oligossacarídeo pode ser detectada. Além disso, as proteínas representam o risco de causar reações alérgicas e, portanto, também devem ser removidas de maneira eficiente do produto de oligossacarídeo desejado.

[009] Iniciando a partir desta anterioridade, era um objetivo fornecer um processo para purificar oligossacarídeos sialilados, em particular, HMOs sialilados, que foram produzidos por meio de fermentação microbiana, em que o referido processo é aplicável para fabricação em escala comercial ou industrial de oligossacarídeos sialilados, e que pode levar a um produto que tem uma pureza que torna o produto adequado para consumo humano.

SUMÁRIO

[0010] Em um primeiro aspecto, é fornecido um método para purificar oligossacarídeos sialilados que foram produzidos por meio de fermentação microbiana ou biocatálise in-vitro.

[0011] Em um segundo aspecto, preparações de um oligossacarídeo sialilados são fornecidas que foram produzidas por meio de fermentação microbiana ou biocatálise in-vitro.

[0012] Em um terceiro aspecto, o uso dos oligossacarídeos sialilados é fornecido de acordo com o segundo aspecto.

[0013] Em um quarto aspecto, composições nutricionais que compreendem pelo menos um oligossacarídeo sialilado são fornecidas, em que o referido pelo menos um oligossacarídeo sialilado foi produzido por meio de fermentação microbiana ou biocatálise in-vitro.

[0014] Em um quinto aspecto, um pó livre de GMO seco por aspersão é fornecido que consiste, essencialmente, em um oligossacarídeo sialilado.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0015] A Figura 1 exibe as estruturas químicas de 3’-sialil-lactose e 6’-sialil- lactose.

[0016] A Figura 2 mostra um diagrama que ilustra uma modalidade do processo para purificar um oligossacarídeo sialilado a partir de caldo de fermentação.

[0017] A Figura 3 mostra um diagrama que ilustra uma modalidade do processo para purificar um oligossacarídeo sialilado a partir de caldo de fermentação.

[0018] A Figura 4 mostra um diagrama que ilustra uma modalidade do processo para purificar um oligossacarídeo sialilado a partir de caldo de fermentação.

[0019] A Figura 5 ilustra o princípio de uma cromatografia de leito móvel simulado de quatro zonas.

[0020] A Figura 6 ilustra o princípio de uma cromatografia de leito móvel simulado de oito zonas.

[0021] A Figura 7 mostra um gráfico que ilustra os resultados de uma difração de raios X em pó de 6'-SL seco por aspersão.

[0022] A Figura 8 mostra um gráfico que ilustra os resultados de uma difração de raios X em pó de 3'-SL seco por aspersão.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0023] De acordo com o primeiro aspecto, é fornecido um método ou processo para purificar oligossacarídeos sialilados que foram produzidos por meio de fermentação microbiana. O método compreende as etapas de: i) separar biomassa do caldo de fermentação; ii) remover cátions do caldo de fermentação; iii) remover impurezas aniônicas do caldo de fermentação; e iv) remover compostos que têm um peso molecular menor do que aquele do oligossacarídeo sialilado a ser purificado.

[0024] Em uma modalidade, os oligossacarídeos sialilados desejados são produzidos por meio de fermentação microbiana. Portanto, as células que têm a capacidade de produzir um oligossacarídeo sialilado desejado são cultivadas sob condições que são permissivas para que as células produzam o oligossacarídeo sialilado desejado. As células adequadas para produzir o oligossacarídeo desejado incluem bactérias, tais como Escherichia coli, Lactobacillus lactis, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Pseudomonas putita, ou leveduras, tais como Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris.

[0025] As células podem ser geneticamente modificadas para produzir um oligossacarídeo sialilado desejado que uma célula precursora não modificada geneticamente não tem a capacidade de produzir, ou para aperfeiçoar a eficácia de produção do oligossacarídeo desejado. Escherichia coli, que é um hospedeiro preferencial para engenharia metabólica, já foi empregado para a fermentação de HMOs (HMOs neutros bem como HMOs sialilados). Entretanto, outras cepas hospedeiras, tais como leveduras (como Saccharomyces cerevisiae), bactérias de ácido láctico, Corynebacterium glutamicum, espécies Bacillus, que têm status GRAS (generally recognized as safe, geralmente reconhecido como seguro), podem ser igualmente bem modificadas para a produção de oligossacarídeos HMOs, em geral, bem como HMOs sialilados, em particular.

[0026] Para a produção de um oligossacarídeo sialilado desejado, a cepa hospedeira bacteriana ou de levedura normalmente contém uma ou mais glicosiltransferases heterólogas, tipicamente, pelo menos uma sialiltransferase heteróloga, superexpressa genes para a síntese de ácido siálico-CMP (tal como uma sintetase de ácido siálico-CMP além de genes envolvidos na absorção ou síntese de-novo de ácido siálico), um importador de lactose e/ou um exportador adequado para o sHMO desejado. A expressão de um exportador adequado é particularmente vantajosa ao usar levedura como hospedeiros de produção para sHMOs, visto que é de conhecimento geral que S. cerevisiae não secreta o oligossacarídeo produzido de modo heterólogo em quantidades economicamente viáveis no caldo de fermentação sem possuir um exportador adequado.

[0027] O termo "desejado" relacionado ao oligossacarídeo sialilado se refere ao oligossacarídeo sialilado que deve ser produzido pela célula. O oligossacarídeo sialilado desejado é o oligossacarídeo a ser purificado pelos processos revelados na presente invenção. O termo "desejado" relacionado ao oligossacarídeo sialilado, conforme usado na presente invenção, também serve para distinguir entre o oligossacarídeo sialilado a ser produzido e outro oligossacarídeo sialilado que pode ser produzido de maneira não intencional pelas células.

[0028] O termo "oligossacarídeo", conforme usado na presente invenção, se refere a sacarídeos lineares ou ramificados que consistem em três a 20 resíduos de monossacarídeo.

[0029] Em uma modalidade, o oligossacarídeo sialilado é um HMO sialilado. O termo “HMO sialilado", conforme usado na presente invenção, se refere a oligossacarídeos de leite humano que compreende um ou mais resíduos de ácido siálico.

[0030] O método compreende a etapa de separar a biomassa do caldo de fermentação. Essa etapa é a primeira etapa no processo de purificação de oligossacarídeos sialilados.

[0031] O termo "biomassa", conforme usado na presente invenção, se refere à totalidade de células presentes no caldo de fermentação ao final da etapa de fermentação. As células que estão presentes no caldo de fermentação ao final da etapa de fermentação compreendem as células que têm a capacidade de produzir o oligossacarídeo sialilado desejado, opcionalmente, células auxiliares que estão presentes no caldo de fermentação para auxiliar a produção do oligossacarídeo sialilado tais como - por exemplo - células que degradam produtos secundários indesejados. Portanto, as células presentes no caldo de fermentação ao final da etapa de fermentação são separadas do caldo de fermentação de modo que o caldo de fermentação resultante seja substancialmente livre de células.

[0032] Os métodos adequados para separar a biomassa do caldo de fermentação incluem centrifugação em que a biomassa é obtida como pélete e o caldo de fermentação como sobrenadante. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a biomassa é separada do caldo de fermentação por meio de filtração. Os métodos de filtração adequados para separar as células do caldo de fermentação incluem microfiltração e ultrafiltração.

[0033] A microfiltração como tal é um processo de filtração físico em que um fluido contendo partícula passa através de uma membrana de tamanho de poro especial para separar as partículas do fluido. O termo "microfiltração", conforme usado na presente invenção, se refere a um processo de filtração físico em que células são separadas do caldo de fermentação.

[0034] A ultrafiltração é uma variedade de filtração de membrana e não é fundamentalmente diferente. Em ultrafiltração, forças como pressão ou gradientes de concentração levam a uma separação através de uma membrana semipermeável. Células, sólidos suspensos e solutos de alto peso molecular são retidos no chamado retentado, enquanto água e solutos de baixo peso molecular, tais como o oligossacarídeo sialilado desejado, passam através da membrana no permeado (filtrado).

[0035] As membranas de ultrafiltração são definidas pelo ponto de corte molar (MWCO) da membrana usada. A ultrafiltração é aplicada em modo de fluxo cruzado ou sem saída.

[0036] Os filtros adequados para microfiltração ou ultrafiltração são SPIRA- CEL® DS MP005 4333 e fibra FS10-FC FUS1582 (Microdyn-Nadir GmbH, Wiesbaden, DE).

[0037] Tipicamente, as células sintetizam o oligossacarídeo sialilado desejado de modo intracelular e secretam o mesmo no caldo de fermentação. O oligossacarídeo sialilado produzido desse modo termina no caldo de fermentação que é submetido, então, a etapas de processo adicionais para purificar o oligossacarídeo sialilado desejado, conforme descrito posteriormente na presente invenção.

[0038] Em modalidades, quando o oligossacarídeo sialilado desejado permanece de modo intracelular após sua biossíntese, a biomassa é separada do caldo de fermentação, e a referida biomassa é empregada para purificar o oligossacarídeo sialilado desejado. Para esse efeito, as células da biomassa são lisadas e o lisado resultante é limpo em que constituintes insolúveis, ácidos nucleicos, lipídeos e proteínas são removidos do lisado. Os métodos para lisar célula e para remover constituintes insolúveis, ácidos nucleicos, lipídeos e/ou proteínas de um lisado de célula são conhecidos. O lisado limpo obtido desse modo que contém o oligossacarídeo sialilado desejado é submetido, então, às mesmas etapas de processo que o caldo de fermentação livre de célula que contém o oligossacarídeo sialilado desejado a fim de purificar o oligossacarídeo sialilado desejado.

[0039] Apesar de o processo para purificar oligossacarídeos sialilados ser usado para purificar oligossacarídeos sialilados que foram produzidos por meio de fermentação microbiana, o referido processo também pode ser empregado para purificar oligossacarídeos sialilados que foram produzidos por uma reação enzimática in-vitro, denominada reação de biocatálise in-vitro. O oligossacarídeo sialilado desejado é obtido por meio de uma ou mais reações enzimáticas in- vitro, e pode ser purificado a partir da mistura de reação ao final da reação biocatalítica em que a referida mistura de reação é submetida - em vez do caldo de fermentação livre de célula ou lisado limpo - ao processo de purificação descrito na presente invenção. Entende-se que a purificação de oligossacarídeos sialilados da mistura de reação da biocatálise in-vitro não exige a remoção de biomassa da mistura de reação.

[0040] O caldo de fermentação livre de célula, lisado limpo ou mistura de reação contém o oligossacarídeo sialilado desejado bem como uma quantidade substancial de impurezas e constituintes indesejados incluindo outros oligossacarídeos além do oligossacarídeo sialilado desejado, sais monovalentes, sais divalentes, aminoácidos, polipeptídeos, proteínas, ácidos orgânicos, ácidos nucleicos e monossacarídeos.

[0041] O processo para purificar oligossacarídeos sialilados compreende a etapa de uma cromatografia de troca catiônica para remover compostos carregados positivamente do caldo de fermentação livre de célula, o lisado limpo ou a mistura de reação.

[0042] As resinas de troca catiônica adequadas para remover compostos carregados positivamente incluem Lewatit S2568 (H+) (Lanxess AG, Cologne, DE).

[0043] O processo para purificar oligossacarídeos sialilados compreende a etapa de uma cromatografia de troca aniônica para remover compostos indesejados carregados negativamente do caldo de fermentação livre de célula, lisado limpo ou mistura de reação.

[0044] As resinas de troca aniônica adequadas incluem Lewatit S6368 A, Lewatit S4268, Lewatit S5528, Lewatit S6368A (Lanxess AG. Cologne, DE), Dowex

AG 1 x2 (Mesh 200 a 400), Dowex 1 x8 (Mesh 100 a 200), Purolite Chromalite CGA100x4 (Purolite GmbH, Ratingen, DE), Dow Amberlite FPA51 (Dow Chemicals, MI, EUA).

[0045] O processo para purificar oligossacarídeo sialilado compreende a etapa de remover compostos que têm um peso molecular menor do que aquele do oligossacarídeo sialilado a ser purificado. Os métodos adequados para remover compostos que têm um peso molecular menor do que aquele do oligossacarídeo sialilado a ser purificado incluem nanofiltração e diafiltração.

[0046] A diafiltração envolve a adição de água fresca a uma solução a fim de remover (por lavagem) componentes permeáveis em membrana. A diafiltração pode ser usada para separar componentes com base em seu tamanho molecular e carga usando-se membranas apropriadas, em que uma ou mais espécies são retidas de modo eficiente e outras espécies são permeáveis em membrana. Em particular, a diafiltração com o uso de uma membrana de nanofiltração é eficaz para a separação de compostos de baixo peso molecular a partir de sais. As membranas de nanofiltração normalmente têm um ponto de corte molar na faixa de 150 a 300 Daltons. A nanofiltração é bastante usada na indústria de laticínios para a concentração e desmineralização de soro de leite.

[0047] As membranas adequadas para nanofiltração e/ou diafiltração incluem Dow Filmtec NF270-4040, Trisep 4040-XN45-TSF (Microdyn-Nadir GmbH, Wiesbaden, DE), GE4040F30 e GH4040F50 (GE Water & Process Technologies, Ratingen, DE).

[0048] A diafiltração com o uso de membranas de nanofiltração foi constatada ser eficiente como um pré-tratamento para remover quantidades significativas de contaminantes antes de tratamento de eletrodiálise da solução que contém o HMO. Entretanto, a nanofiltração foi constatada ser eficiente para a remoção de contaminantes de baixo peso molecular após uma etapa de ultrafiltração, em que a referida remoção é benéfica para concentrar e desmineralizar a solução de HMO antes de tratamento com trocador de íon. O uso de membranas de nanofiltração para a concentração e diafiltração durante a purificação de HMOs resulta em menos energia e custos de processamento, e melhor qualidade de produto devido à exposição térmica reduzida, que leva a reações de Maillard e reações aldólicas reduzidas.

[0049] O processo de purificação fornece o oligossacarídeo sialilado desejado em uma preparação em que a pureza do referido oligossacarídeo sialilado desejado é ≥ 80%, ≥85%, ≥90%, ≥95%. O processo fornece uma preparação do oligossacarídeo sialilado em que a pureza do oligossacarídeo sialilado é adequada para aplicações em alimentos e rações.

[0050] Além disso, o processo é economicamente rentável e fácil de ser produzido em larga escala, tornando o mesmo adequado como base para um processo de fabricação em escala de múltiplas toneladas.

[0051] O processo para purificar um oligossacarídeo sialilado também é vantajoso em que os oligossacarídeos sialilados desejados são obtidos livres de DNA recombinante e proteínas recombinantes derivadas de cepas de fermentação microbiana recombinante que podem ser usadas como auxiliares de processamento.

[0052] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o processo compreende, adicionalmente, uma etapa de nanofiltração para aumentar a concentração de sacarídeos na solução.

[0053] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o processo compreende uma etapa de eletrodiálise.

[0054] A eletrodiálise combina diálise e eletrólise, e pode ser usada para a separação de concentração de íons em soluções com base em sua eletromigração seletiva através de uma membrana semipermeável.

[0055] A eletrodiálise (ED) combina diálise e eletrólise e pode ser usada para a separação ou concentração de íons em soluções com base em sua eletromigração seletiva através de membranas semipermeáveis. As aplicações industriais de eletrodiálise datam do início dos anos 1960s, quando esse método foi usado para a desmineralização de soro de queijo para a inclusão em fórmula infantil. As aplicações adicionais de eletrodiálise incluem o ajuste do pH de bebidas tais como vinhos, mosto, suco de maçã e suco de laranja.

[0056] A dessalinização de água salobra para a produção de água potável e a desmineralização de soro de leite para a produção de alimento infantil são as aplicações mais difundidas de eletrodiálise atualmente (Tanaka, Y. (2010) Ion Exchange Membrane Electrodialysis. Nova Science Publishers, Inc. Nova Iorque).

[0057] O princípio básico de eletrodiálise consiste em uma célula eletrolítica que compreende um par de eletrodos submerso em um eletrólito para a condução de íons, conectado a um gerador de corrente direta. O eletrodo conectado ao polo positivo do gerador de corrente direta é o anodo, e o eletrodo conectado ao polo negativo é o catodo. A solução de eletrólito suporta, então, o fluxo de corrente, que resulta do movimento de íons negativos e positivos em direção ao anodo e catodo, respectivamente. As membranas usadas para eletrodiálise são essencialmente folhas de resinas de troca iônica porosas com grupos de carga negativa ou positiva e são, portanto, descrito como membranas catiônica ou aniônica, respectivamente. As membranas de troca iônica normalmente são produzidas a partir de poliestireno que porta um grupo funcional adequado (tal como ácido sulfônico para membranas catiônicas ou um grupo de amônio quaternário para membranas aniônicas) reticulado com divinilbenzeno. O eletrólito pode ser, por exemplo, cloreto de sódio, acetato de sódio, propionato de sódio ou ácido sulfâmico. A pilha de eletrodiálise é, então, montada de tal modo que as membranas aniônicas e catiônicas sejam paralelas como em uma prensa de filtro entre dois blocos de eletrodo, de modo que o fluxo submetido à depleção de íon seja bem separado do fluxo submetido a enriquecimento de íon (as duas soluções também são denominadas o diluído (submetido à depleção de íon) e concentrado (submetido a enriquecimento de íon). O cerne do processo de eletrodiálise é a pilha de membranas, que consiste em diversas membranas de troca aniônica e membranas de troca catiônica separadas por espaçadores, instalados entre dois eletrodos. Aplicando-se uma corrente elétrica direta, ânions e cátions migrarão através das membranas em direção aos eletrodos gerando um fluxo diluído (dessalinizado) e um fluxo concentrado.

[0058] Aplicando-se uma condição ácida durante a eletrodiálise, sHMOs podem ser protonados de modo que os mesmos pareçam não carregados (protonação do grupo carbonila da parte de ácido siálico do oligossacarídeo). Como uma alternativa, a eletrodiálise pode ser realizada sob condições neutras com o uso de membranas bipolares. Nesse caso, os oligossacarídeos sialilados podem ser até mesmo concentrados em um circuito de concentrado de eletrodiálise separado. Desse modo, o oligossacarídeo sialilado pode ser até mesmo enriquecido durante a eletrodiálise.

[0059] O tamanho de poro das membranas de troca iônica é pequeno o suficiente para evitar a difusão do produto a partir do fluxo diluído para o fluxo concentrado, motivada por grandes diferenças de concentração entre os dois fluxos. Após a separação de biomassa, proteínas e, em particular, moléculas de DNA recombinante (em tamanho na faixa de fragmentos a genomas inteiros) precisam ser removidas de modo quantitativo do produto desejado. Se possível de algum modo, a eletrodiálise de tais moléculas grandes (quando comparado ao tamanho molecular de HMOs) levará muito tempo, certamente acompanhada por perdas significativas do produto desejado a partir do diluído para o concentrado.

[0060] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o processo para purificar oligossacarídeos sialilados compreende, adicionalmente, uma etapa de cromatografia de leito móvel simulado (SMB).

[0061] A cromatografia de leito móvel simulado (SMB) originou nas indústrias petroquímica e mineral. Atualmente, a cromatografia de SMB é usada pela indústria farmacêutica para isolar enantiômeros de misturas racêmicas. A cromatografia de SMB em larga escala já foi usada para a separação do monossacarídeo frutose a partir de soluções de frutose-glicose e para a separação do dissacarídeo sacarose a partir de xaropes de açúcar de beterraba ou cana de açúcar. Entretanto, cromatografia de SMB ainda não foi usada para a purificação de oligossacarídeos sialilados de leite humano, tal como lacto-N- tetraose sialilado, 3’-sialil-lactose ou 6’-sialil-lactose durante síntese química, enzimática ou à base de fermentação. SMB foi usada para purificar sialil-lactoses a partir de leite bovino, mas o leite bovino é uma matriz completamente diferente quando comparado ao caldo de fermentação microbiana, que é usado na presente invenção como uma fonte de HMOs.

[0062] A cromatografia de SMB é usada como um processo de separação contínua análogo a processos de separação química contínua, tais como retificação. Na retificação, uma contracorrente é estabelecida entre as fases líquida e gasosa que permite a aplicação contínua de alimentação e a remoção contínua de produto. A cromatografia contracorrente deve alcançar, na teoria, separação superior quando comparado a sistemas de corrente cruzada convencionais, mas as fases móvel e estacionária em sistemas contracorrente precisarão mover em direções opostas. A cromatografia de SMB foi desenvolvida como uma solução para as dificuldades práticas encontradas ao tentar mover um material de cromatografia sólido em um processo de separação cromatográfica contínua.

[0063] O conceito de SMB clássico envolve quatro zonas diferentes com quatro fluxos externos: o fluxo de alimentação que contém os componentes a serem separados, a dessorção ou fluxo de fase móvel, o extrato, e o fluxo de rafinado (sendo que o último representa os componentes retidos de modo menos eficiente). Esses fluxos de líquido dividem o sistema de SMB em quatro zonas diferentes (cada zona ou seção pode compreender uma ou mais colunas) com as seguintes funções: a zona I é necessária para a regeneração da fase sólida, a finalidade da zona II é a dessorção do material dessorvido de modo menos forte, a função da zona III é a adsorção do material fortemente adsorvido, e por fim, a função da zona IV é a adsorção do material menos adsorvente (Figura 5). Desse modo, componentes adsorventes mais fortes estabelecem uma onda de concentração na zona II e são transportados para a porta de extrato enquanto componentes adsorventes menos fortes migram para a porta de rafinado.

[0064] Em princípio, as zonas I e IV servem para a regeneração da fase sólida (zonas de regeneração) enquanto as zonas II e III podem ser consideradas como as zonas de separação reais do sistema (zonas de separação). Além dos quatro fluxos de líquido e zonas resultantes, o sistema contém (para operação de circuito fechado) uma bomba de reciclagem para a fase móvel (desorbent), que passa a fase móvel através das zonas fixas em uma direção. O fluxo de contracorrente é alcançado, então, pela comutação periódica e suprimento contínuo ou remoção de alimentação, dessorvido, e produtos de modo sequencial de uma coluna para a próxima no sistema.

[0065] Além do sistema de SMB 4 clássico de circuito fechado de quatro zonas, os sistemas de circuito aberto de três zonas estão disponíveis, e podem ser economicamente mais rentáveis se o solvente fresco não for dispendioso, por exemplo, quando água ou misturas de água/etanol são usadas como a fase móvel. Na configuração de circuito de três zonas, a regeneração da fase líquida não é mais necessária, tornando a zona IV obsoleta.

[0066] Além dos sistemas de SMB clássicos para a separação de misturas de dois componentes, sistemas de circuito fechado de oito zonas (Figura 6) e sistemas de circuito aberto de cinco zonas têm sido desenvolvidos para a separação de mais de 2 componentes.

[0067] Dado o modo contínuo de operação, a reciclagem da fase móvel e também o potencial de uso de tamanhos de coluna grandes, os sistemas de SMB podem ser, em princípio, aumentados para alcançar volumes de produção de centenas de toneladas.

[0068] A etapa de processo de cromatografia de leito móvel simulado é vantajosa em que essa etapa de processo permite remoção adicional de oligossacarídeos que são estruturalmente bastante relacionados ao oligossacarídeo sialilado desejado.

[0069] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o processo compreende, adicionalmente, uma etapa de remoção de corantes.

[0070] As etapas de processo adequadas para remover corantes incluem tratar o caldo de fermentação livre de célula ou o lisado limpo com carbono ativado, tal como carvão ativado.

[0071] O tratamento do caldo com carbono ativado remove quaisquer corantes indesejados e fornece uma preparação do oligossacarídeo desejado que tem uma aparência aceitável.

[0072] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o processo de purificação oligossacarídeos sialilados compreende pelo menos uma etapa de aumentar a concentração do oligossacarídeo sialilado desejado.

[0073] Em modalidade adicional e/ou alternativa do processo, a solução que contém o oligossacarídeo sialilado desejado é concentrada após pelo menos uma dentre as etapas de purificação i) a iv), preferencialmente, após a etapa de purificação iv), com o uso de evaporação a vácuo (por exemplo, usando-se um evaporador de filme descendente ou um evaporador de placas) ou osmose reversa ou nanofiltração (por exemplo, nanofiltração com uma membrana de nanofiltração que tem um limite de exclusão de tamanho de ≤ 20 Å (2 nm) a) a uma concentração de ≥ 100 g/L, preferencialmente ≥ 200 g/L, mais preferencialmente ≥ 300 g/L; e/ou b) a uma temperatura de < 80°C, preferencialmente < 50°C, mais preferencialmente, 20 °C a 50 °C, ainda mais preferencialmente, 30 °C a 45 °C, com preferência máxima, 35 °C a 45 °C (especificamente relevante para evaporação a vácuo ou osmose reversa); e/ou c) a uma temperatura de < 80 °C, preferencialmente < 50°C, mais preferencialmente 4 °C a 40 °C (especificamente relevante para nanofiltração).

[0074] Os métodos adequados para aumentar a concentração do oligossacarídeo sialilado desejado incluem nanofiltração e evaporação de solvente.

[0075] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa do processo, de acordo com a invenção, a solução purificada é filtrada de modo estéril e/ou submetida à remoção de endotoxina, preferencialmente, por meio de filtração da solução purificada através de um filtro de 3 kDa ou filtro de 6 kDa.

[0076] O processo para purificar o oligossacarídeo desejado de um caldo de fermentação, um lisado de célula ou da mistura de reação de uma reação biocatalítica fornece uma solução aquosa do oligossacarídeo desejado. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o processo compreende, adicionalmente, uma etapa de remover o solvente do oligossacarídeo sialilado de modo que tanto uma solução do oligossacarídeo desejado seja fornecida que inclui uma alta concentração do oligossacarídeo desejado, ou de modo que uma preparação sólida do oligossacarídeo desejado seja obtida.

[0077] Os métodos adequados de remoção de solvente a partir da preparação líquida do oligossacarídeo sialilado para obter uma preparação sólida do oligossacarídeo desejado incluem cristalização e liofilização (secagem por congelamento - um processo em que o sHMO que contém solução aquosa é congelado e, então, reduzindo-se a pressão circundante, permite-se, então, que a água congelada no material sublime diretamente da fase sólida para a fase gasosa - isso normalmente leva a um pó de sHMO higroscópico.

[0078] Em uma modalidade alternativa, o solvente pode ser removido da preparação líquida do oligossacarídeo sialilado por meio de secagem por aspersão. Os inventores constataram, de maneira surpreendente, que uma preparação líquida que contém o oligossacarídeo sialilado desejado pode ser seca por aspersão para obter um pó que consiste, essencialmente, no oligossacarídeo sialilado desejado, embora seja de conhecimento geral que carboidratos não são tipicamente passíveis de secagem por aspersão, isso também inclui lactose, ácido siálico, fucose etc.

[0079] A separação da biomassa do caldo de fermentação é, tipicamente, a primeira etapa do processo de purificação. Visto que o processo compreende a etapa de remoção do solvente da preparação, essa etapa é tipicamente a etapa final de purificação do oligossacarídeo desejado. A ordem das etapas de processo adicionais não é particularmente limitada.

[0080] Referindo-se à Figura 2, uma modalidade do processo para purificar um oligossacarídeo sialilado é mostrada de maneira esquemática, em que o oligossacarídeo sialilado é um sHMO produzido por meio de fermentação microbiana. Ao final da fermentação, a biomassa é separada do caldo de fermentação por meio de filtração por fluxo cruzado. O filtrado (caldo de fermentação livre de célula) é submetido a uma cromatografia de troca catiônica e a uma cromatografia de troca aniônica. Subsequentemente, o eluato concentrado e tratado com carbono ativado. A solução resultante é submetida à cromatografia de SMB e a concentração do oligossacarídeo sialilado na solução resultante é aumentada. Por fim, uma filtração com um corte de 3 kDa é seguida por uma filtração estéril para obter uma solução que contém uma alta concentração do sHMO desejado.

[0081] A Figura 3 ilustra outra modalidade do processo, que difere da modalidade mostrada na Figura 2 em que a solução que contém uma alta concentração do sHMO desejado é seca por aspersão para obter o sHMO desejado em pó. De maneira inesperada, foi possível identificar condições em que 3’-sialil-lactose e 6’-sialil-lactose puderam ser secos por aspersão. Em contraste à lactose ou ácido siálico, que não podem ser secos por aspersão, constatou-se condições que permitiram a obtenção desses sHMOs como um pó seco por aspersão. O pó seco por aspersão também pareceu ser apenas um pouco higroscópico. O uso de secagem por aspersão tem diversas vantagens em relação a outros processos, como cristalização ou secagem por congelamento, tais como é altamente econômico, compatível com fabricação em larga escala de sHMOs, evita solventes orgânicos como no caso de cristalização.

[0082] A modalidade do processo ilustrado de maneira esquemática na Figura 4 difere da modalidade mostrada na Figura 3 em que o processo não compreende uma cromatografia de SMB para obter uma preparação de sHMO de alta pureza.

[0083] De acordo com o segundo aspecto, são fornecidas preparações de oligossacarídeos sialilados, em que os oligossacarídeos sialilados foram produzidos por meio de fermentação microbiana ou biocatálise in-vitro.

[0084] O oligossacarídeo sialilado da preparação foi purificado do caldo de fermentação, das células ou da mistura de reação pelo processo descrito na presente invenção.

[0085] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o oligossacarídeo sialilado é um HMO sialilado. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o HMO sialilado é selecionado a partir do grupo que consiste em 3'-SL, 6'-SL, LST- a, LST-b, LST-c, F-SL, F-LST-b e DS-LNT.

[0086] A preparação do oligossacarídeo sialilado pode estar presente em forma líquida como uma solução do oligossacarídeo sialilado em um solvente, preferencialmente em água. Em uma modalidade alternativa, a preparação do oligossacarídeo sialilado está presente em forma sólida, preferencialmente, em forma de um pó. O pó compreende o oligossacarídeo sialilado em forma de partículas em que o oligossacarídeo sialilado está presente em forma de partículas amorfas ou em forma de partículas cristalinas. De modo mais preferencial, o oligossacarídeo sialilado é obtido como um pó seco por aspersão com um teor de água menor do que 10%. Nome Estrutura 3’-sialil-lactose Neu5Ac(α2-3)Gal(βb1-4)Glc 6’-sialil-lactose Neu5Ac(α2-6)Gal(β1-4)Glc F-SL Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-4)Glc | Fuc(α1-3) LSTa Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc LSTb Neu5Ac(α2-6) | Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc LSTc Neu5Ac(α2-6)Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc DS-LNT Neu5Ac(α2-6) | Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc F-LSTb Neu5Ac(α2-6) | Fuc(α1-2)Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc

Tabela 1.: HMOs sialilados (oligossacarídeos sialilados de leite humano (sHMOs) que podem ser purificados pelo método descrito na presente invenção.

[0087] A preparação de oligossacarídeos sialilados obteníveis por meio de um processo, conforme descrito na presente invenção, compreende o oligossacarídeo sialilado desejado em uma pureza de ≥ 80% em peso.

[0088] De acordo com o terceiro aspecto, é fornecido o uso de um oligossacarídeo sialilado, conforme descrito anteriormente na presente invenção, especialmente de um HMO sialilado, para a preparação de uma composição nutricional, preferencialmente, de uma fórmula infantil.

[0089] O processo de purificação de oligossacarídeos sialilados fornece preparações dos oligossacarídeos sialilados em que o oligossacarídeo está presente em uma pureza suficiente para o consumo humano.

[0090] A referida composição nutricional contém pelo menos um oligossacarídeo sialilado que foi produzido por meio de um método, conforme revelado anteriormente na presente invenção.

[0091] Desse modo, de acordo com o quarto aspecto, são fornecidas composições nutricionais que contêm pelo menos um oligossacarídeo sialilado, preferencialmente, pelo menos um sHMO, que foi produzido por meio de um método, conforme revelado anteriormente na presente invenção. O pelo menos um sHMO na composição nutricional é selecionado a partir do grupo que consiste em 3'-SL, 6'-SL, LST-a, LST-b, LST-c, F-SL, DS-LNT e F-LSTb. O referido pelo menos um oligossacarídeo sialilado foi produzido por meio de fermentação microbiana ou biocatálise in-vitro.

[0092] Em uma modalidade adicional, a composição nutricional é selecionada a partir do grupo que consiste em formulações medicinais, fórmula infantil, bebidas lácteas e suplementos dietéticos. A composição nutricional compreende, adicionalmente, micro e/ou macronutrientes, tais como,

proteínas, carboidratos, gordura, ácidos graxos, preferencialmente, ácidos graxos polinsaturados (PUFAs), vitaminas, minerais.

[0093] Como uma formulação medicinal, a composição nutricional pode ser usada para melhorar os sintomas de diabetes, visto que sialil-lactoses aprimoram a secreção de insulina e aumenta, desse modo, nível de glicose no sangue para prevenir ou aliviar diabetes mellitus. Além disso, uma composição nutricional que contém 3'-SL pode ser eficaz contra osteoartrite.

[0094] Como fórmula infantil, a composição nutricional satisfaz as exigências composicionais estabelecidas no Regulamento (EU) 2016/127. As composições exemplificativas de fórmula infantil são especificadas na Tabela 2 e Tabela 3. Fórmula infantil: Leite desnatado Óleos vegetais (óleo de palma, óleo de colza, óleo de girassol) Oligossacarídeos de leite humano Leite desnatado em pó Óleo de Mortierella alpine Óleo de peixe Carbonato de cálcio Cloreto de potássio Vitamina C Cloreto de sódio Vitamina E Acetato de ferro Sulfato de zinco Niacina D-pantotenato de cálcio

Sulfato de cobre Vitamina A Vitamina B1 Vitamina B6 Sulfato de magnésio Iodato de potássio Ácido fólico Vitamina K Selenito de sódio Vitamina D Tabela 2: Componentes de uma fórmula infantil exemplificativa. por 100 mL de por 100 g pó fórmula infantil kJ 2.094 a 2.145 283 Energia kcal 500 a 512 67 a 68 Gorduras, dentre g 24,2 a 26,2 3,3 a 3,5 as quais: ácidos graxos g 8,7 a 9,4 1,2 a 1,3 saturados ácidos graxos g 10,4 1,4 monoinsaturados ácidos graxos poli- g 5,5 a 5,9 0,7 a 0,8 insaturados Carboidratos g 56 a 58 7,4 a 7,9 dentre os quais: Açúcares g 44 a 56 6 a 7,4 dentre os quais:

Lactose g 44 a 56 6 a 7,4 HMOs Dentre os g 4,22 a 4,81 0,57 a 0,65 quais 2'-FL g 1,85 a 2,22 0,25 a 0,30 3-FL mg 555,56 a 592,6 75 a 80 LNT g 1,11 0,15 LNnT mg 0 a 111,11 0 a 15 LNPF-I mg 0 a 740,74 0 a 100 3'-SL mg 148,15 a 170,37 20 a 23 6'-SL mg 207,4 a 222,22 28 a 30 Proteína g 11,11 a 11,85 1,5 a 1,6 Sal g 0,47 a 0,59 0,06 a 0,08 Vitaminas Vitamina A µg 357 a 358 47,3 a 48,2 Vitamina D µg 7,8 1,05 Vitamina E mg 8.1.5 1,1 Vitamina K µg 43,7 a 44,4 5,9 a 6,0 Vitamina C mg 115 a 118 15 a 16 Vitamina B1 mg 0,51 a 0,60 0,068 a 0,079 Vitamina B2 mg 1,3 a 1,7 0,18 a 0,23 Niacina mg 3,63 0,49 Vitamina B6 µg 526 a 600 71 a 81 Ácido fólico µg 160 a 164 21,6 a 21,7 Vitamina B12 µg 1,7 a 1,9 0,23 a 0,25 Biotina µg 22 a 30 3,0 a 3,9 Ácido pantotênico mg 4,6 a 5,4 0,62 a 0,72

Minerais Sódio mg 187 a 236 25,3 a 31,2 Potássio mg 673 a 675 88,8 a 91,2 Cloreto mg 327 a 33 43,1 a 44,9 Cálcio mg 460 a 504 62,1 a 66,5 Fósforo mg 335 a 352 45,2 a 46,5 Magnésio mg 49,3 a 56,3 6,66 a 7,43 Ferro mg 4,15 0,56 Zinco mg 3,7 a 3,8 0,49 a 0,51 Cobre µg 274 37 Manganês µg 96,3 13 Flúor µg 30,4 a 32,6 4,1 a 4,4 Selênio µg 11,1 a 12,3 1,5 a 1,6 Iodo µg 101,5 a 103,7 13,7 a 14 Tabela 3: Composição de fórmula infantil exemplificativa. A concentração final se baseia em uma preparação de 13,5 g do pó um 90 mL de água

[0095] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a composição nutricional compreende, adicionalmente, microrganismos, preferencialmente, microrganismos probióticos. No caso em que usado para aplicações para alimento infantil, microrganismos preferenciais são derivados de ou podem ser encontrados no microbioma de um ser humano saudável. Preferencialmente, mas sem limitação, os microrganismos são selecionados a partir do gênero Bifidobacterium, Lactobacillus, Enterococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Peptostreptococcus, Leuconostoc, Clostridium, Eubacterium, Veilonella, Fusobacterium, Bacterioides, Prevotella, Escherichia, Propionibacterium e Saccharomyces. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o microrganismo é selecionado a partir do grupo que consiste em Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium aldolescentis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus casei, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salivarius, Lactococcus lactis, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus fermentum, Leuconostoc mesenteroides; Escherichia coli, Enterococcus faecium e Streptococcus thermophilus (VSL#3).

[0096] Além da combinação de sHMOs com organismos vivos, esses oligossacarídeos também podem ser usados em combinação com culturas mortas. No campo de probióticos, por vezes, culturas exterminadas são usadas (por exemplo, bactérias tindalizadas). Acrereferida-se que essas culturas exterminadas forneçam proteínas, peptídeos, oligossacarídeos, fragmentos de parede externa de célula, produtos naturais, que podem levar a um estímulo a curto prazo do sistema imunológico.

[0097] A combinação de pelo menos um oligossacarídeo sialilado, em particular, pelo menos um sHMO, e microrganismos probióticos na composição nutricional é particularmente vantajosa em que estabelece ou restabelece um microbioma apropriado no intestino, e os benefícios para a saúde associados ao mesmo são facilitados.

[0098] Ainda mais vantajosa é a combinação de pelo menos um oligossacarídeo sialilado, em particular, um sHMO, com prebióticos estabelecidos, tais como GOS (Galacto-oligossacarídeos) e/ou FOS (Fruto- oligossacarídeos, Inulina).

[0099] A composição nutricional pode estar presente em forma líquida ou em forma sólida incluindo, mas sem limitação, pós, grânulos, flocos e péletes.

[00100] Desse modo, também é fornecida uma composição nutricional que compreende pelo menos 5 HMOs, em que os referidos pelo menos 5 HMOs são selecionados a partir do grupo que consiste em 2’-fucosil-lactose, 3- fucosillactose, Lacto-N-tetraose, Lacto-N-neotetraose, Lacto-N-fucopentaose I, 3’-sialil-lactose e 6’-sialil-lactose.

[00101] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, uma composição nutricional, conforme revelado anteriormente na presente invenção, contém pelo menos um HMO sialilado e pelo menos um HMO neutro e um microrganismo probiótico.

[00102] De acordo com o quinto aspecto, um pó livre de GMO seco por aspersão é fornecido o qual consiste, essencialmente, em um oligossacarídeo sialilado com uma pureza de > 80% em peso seco e tem menos de 10% de água em peso.

[00103] Em uma modalidade, o pó seco por aspersão é um pó que consiste essencialmente em um oligossacarídeo sialilado selecionado a partir do grupo que consiste em 3’-sialil-lactose, 6’-sialil-lactose, e uma mistura de 3’-sialil- lactose e 6’-sialil-lactose.

[00104] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o pó seco por aspersão consiste essencialmente em uma mistura de 3’-sialil-lactose, 6’-sialil- lactose e um ou mais HMOs neutros, em que os referidos um ou mais HMOs neutros são selecionados a partir do grupo que consiste em 2’-fucosil-lactose, 3- fucosillactose, lacto-N-tetraose, lacto-N-neotetraose, lacto-N-fucopentaose I.

[00105] A presente invenção será descrita em relação às modalidades particulares e com referência aos desenhos, mas a invenção não é limitada aos mesmos, mas apenas pelas reivindicações. Além disso, os termos primeiro, segundo e similares, na descrição e nas reivindicações, são usados para distinguir entre elementos similares e não, necessariamente, para descrever uma sequência, tanto de modo temporal, espacial, em ordenação ou em qualquer outro modo. Deve-se entender que os termos usados desse modo são alternáveis sob circunstâncias apropriadas e que as modalidades da invenção descritas na presente invenção têm a capacidade de operação em outras sequências além daquelas descritas ou ilustradas na presente invenção.

[00106] Deve-se notar que o termo "que compreende", usado nas reivindicações, não deve ser interpretado como sendo restrito aos meios listados posteriormente; o mesmo não exclui outros elementos ou etapas. O mesmo deve ser interpretado, desse modo, como especificando a presença dos recursos, números inteiros, etapas ou componentes estabelecidos conforme mencionados, mas não exclui a presença ou adição de um ou mais outros recursos, números inteiros, etapas ou componentes, ou grupos dos mesmos. Desse modo, o escopo da expressão "um dispositivo que compreende meios A e B" não deve ser limitado a dispositivos que consistem apenas em componentes A e B. Significa, em relação à presente invenção, que os únicos componentes relevantes do dispositivo são A e B.

[00107] A referência ao longo deste relatório descritivo a "uma modalidade" ou "uma modalidade" significa que um recurso, estrutura ou característica particular, descrita em conjunto com a modalidade, é incluída em pelo menos uma modalidade da presente invenção. Desse modo, ocorrências das expressões "em uma modalidade" ou "em uma modalidade", em vários locais ao longo deste relatório descritivo, não estão se referindo, necessariamente, à mesma modalidade, mas pode ser que estejam. Além disso, os recursos, estruturas ou características particulares podem ser combinadas em qualquer modo adequado, conforme será evidente a um técnico no assunto a partir desta revelação, em uma ou mais modalidades.

[00108] De modo similar, deve-se verificar que, na descrição de modalidades exemplificativas da invenção, vários recursos da invenção são, por vezes, agrupados em conjunto em uma única modalidade, figura ou descrição da mesma com a finalidade de simplificar a revelação e auxiliar o entendimento de um ou mais dentre os vários aspectos da invenção. Este método de revelação, entretanto, não deve ser interpretado como refletindo uma intenção de que a invenção reivindicada exige mais recursos do que são expressamente citados em cada reivindicação. Em vez disso, conforme as reivindicações a seguir refletem, aspectos da invenção se encontram em menos do que a totalidade dos recursos de uma única modalidade revelada anteriormente. Desse modo, as reivindicações que sucedem a descrição detalhada são expressamente incorporadas nesta descrição detalhada, sendo que cada reivindicação é autossuficiente como uma modalidade separada desta invenção.

[00109] Além disso, embora algumas modalidades descritas na presente invenção incluam alguns, mas não outros recursos incluídos em outras modalidades, combinações de recursos de diferentes modalidades se destinam a estar no escopo da invenção, e formam diferentes modalidades, conforme será entendido por técnicos no assunto. Por exemplo, nas reivindicações a seguir, qualquer uma das modalidades reivindicadas pode ser usada em qualquer combinação.

[00110] Além disso, algumas das modalidades são descritas na presente invenção como um método ou combinação de elementos de um método que pode ser implantado por um processador de um sistema de computador ou por outros meios de executar a função. Desse modo, um processador com as instruções necessárias para executar tal método ou elemento de um método forma um meio para executar o método ou elemento de um método. Além disso, um elemento descrito na presente invenção de uma modalidade de aparelho é um exemplo de um meio para executar a função realizada pelo elemento com a finalidade de executar a invenção.

[00111] Na descrição e desenhos fornecidos na presente invenção, inúmeros detalhes específicos são estabelecidos. Entretanto, entende-se que as modalidades da invenção podem ser praticadas sem esses detalhes específicos. Em outros casos, métodos, estruturas e técnicas bem conhecidas não foram mostrados em detalhes a fim de não obscurecer um entendimento desta descrição.

[00112] A invenção será descrita, a seguir, por meio de uma descrição detalhada de diversas modalidades da invenção. Está claro que outras modalidades da invenção podem ser configuradas de acordo com o conhecimento de técnicos no assunto sem se afastar do verdadeiro espírito ou ensinamento técnico da invenção, a invenção é limitada apenas pelos termos das reivindicações anexas. Exemplo 1: Fermentação de 3’-sialil-lactose com o uso de um microrganismo recombinante.

[00113] Uma fermentação em batelada alimentada de 3’-sialil-lactose que emprega uma cepa de E. coli que sintetiza 3’-sialil-lactose recombinante (E. coli BL21 (DE3) ∆lacZ), que contém uma integração genômica de um gene de 3'- sialiltransferase de Vibrio sp. JT-FAJ-16. Para aprimorar a biossíntese de genes de ácido siálico-CMP que codificam a glucosamina-6-fosfato sintase GlmS de E. coli, a N-acetilglucosamin2-epimerase Slr1975 de Synechocystis sp., a glucosamina 6-fosfato N-acetiltransferase Gna1 de Saccharomyces cerevisiae, a fosfoenolpiruvato sintase PpsA de E. coli, a N-acetilneuraminato sintase NeuB e a sintetase de ácido siálico-CMP NeuA, os últimos ambos de Campylobacter jejuni, foram integrados de modo cromossômico ao hospedeiro de E. coli BL21 (DE3). Além disso, o gene que codifica a lactose permease LacY a partir de E. coli, e os genes cscB (sacarose permease), cscK (frutoquinase), cscA (sacarose hidrolase) e cscR (regulador transcripcional) de E. coli W foram integrados ao genoma de BL21. A transcrição de genes integrados é iniciada a partir de promotores constitutivos, tanto o promotor tetraciclina Ptet ou o promotor PT5. Um gal-operon funcional, que consiste nos genes galE (UDP-glicose-4- epimerase), galT (galactose-1 -fosfato uridililtransferase), galK (galactoquinase) e galM (galactose-1-epimerase) foi transferido de E. coli K12 para o genoma da cepa BL21. Para evitar a degradação de genes de N-acetilglucosamina 6-fosfato que codificam para a N-acetilglucosamina-6-fosfato deacetilase (NagA), a glucosamina-6-fosfato deaminase (NagB) e a proteína PTS específica de N- acetilglucosamina IIABC (NagE) foram deletadas do cromossomo. Adicionalmente, o operon manXYZ, que codifica um transportador de açúcar do sistema PTS de E. coli para manose, glicose, glucosamina e N-acetilglucosamina foi deletado, bem como os genes nanA, nanK, nanE e nanT, que codificam a N- acetilneuraminato liase, a N-acetilmanosamina quinase, a N-acetilmanosamina- 6-fosfato epimerase e o transportador de ácido siálico, respectivamente. O gene que codifica a N-acetilgalactosamina-6-fosfato deacetilase (AgaA) também foi deletado.

[00114] A cepa de produção de 3’-sialil-lactose foi cultivada em um meio de sais minerais definido, que compreende 7 g L-1 de NH4H2PO4, 7 g L-1 de K2HPO4, 2 g L-1 de KOH, 0,3g L-1 de ácido cítrico, 5 g L-1 de NH4CI, 1 ml L-1 de antiespumante (Struktol J673, Schill + Seilacher), 0,1 mM de CaCI2, 8 mM de MgSO4, elementos- traço e 2% de sacarose como fonte de carbono.

[00115] Os elementos-traço consistia em 0,101 g L-1 de ácido nitrilotriacético, pH 6,5, 0,056 g L-1 de citrato de ferro e amônio, 0,01 g L-1 de MnCI2 x 4 H2O, 0,002 g L-1 de CoCI2 x 6 H2O, 0,001 g L-1 de CuCI2 x 2 H2O, 0,002 g L-1 de ácido bórico, 0,009 g L-1 de ZnSO4 x 7 H2O, 0,001 g L 1 de Na2MoO4 x 2 H2O, 0,002 g L-1 de Na2SeO3, 0,002 g L-1 de NiSO4 x 6 H2O.

[00116] A alimentação de sacarose (500 g L-1) foi suplementada com 8 mM de MgSO, 0,1 mM de CaCI2, elementos-traço e 5 g L-1 de NH4CI. Para a formação de 3’-sialil-lactose, uma alimentação de lactose de 216 g L-1 foi empregada. O pH foi controlado usando-se solução de amônia (25% v/v). A fermentação em batelada alimentada foi conduzida a 30 °C sob aeração e agitação constantes durante 72 horas aplicando-se uma taxa de alimentação de sacarose de 5,5 a 7 ml L-1 h-1, referindo-se ao volume inicial. 72 horas após o início da fermentação, a maior parte da lactose adicionada foi convertida em 3’-sialil-lactose. A fim de remover lactose residual no sobrenadante de fermentação, β-galactosidase foi adicionada ao recipiente de fermentação. Os monossacarídeos resultantes foram metabolizados pela cepa de produção. Exemplo 2: Fermentação de 6’-sialil-lactose um sHMO com o uso de um microrganismo recombinante.

[00117] A cepa que sintetiza 6’-sialil-lactose compreende os mesmos recursos genéticos que a cepa de produção de 3’-sialil-lactose, apesar da sialiltransferase. Para a produção de 6'-sialilactose, o gene plsT6 de Photobacterium leiognathi JT-SHIZ-119 que codifica uma alfa-2,6- sialiltransferase foi integrado ao genoma de E. coli BL21 (DE3).

[00118] Para a produção fermentativa de 6’-sialil-lactose, a cepa foi cultivada em um meio de sais mineral definido, que compreende 7 g L-1 de NH4H2PO4, 7 g L-1 de K2HPO4, 2 g L-1 de KOH, 0,3g L-1 de ácido cítrico, 5 g L-1 de NH4CI, 1 ml L-1 de antiespumante (Struktol J673, Schill + Seilacher), 0,1 mM de CaCI2, 8 mM MgSO4, elementos-traço (0,101 g L-1 de ácido nitrilotriacético, pH 6,5, 0,056 g L-1 de citrato de ferro e amônio, 0,01 g de MnCI2 x 4 H2O, 0,002 g L-1 de CoCI2 x 6 H2O, 0,001 g L-1 de CuCI2 x 2 H2O, 0,002 g L-1 de ácido bórico, 0,009 g L-1 de ZnSO4 x 7 H2O, 0,001 g L-1 de Na2MoO4 x 2 H2O, 0,002 g L-1 de Na2SeO3, 0,002 g L-1 de NiSO4 x 6 H2O) e 2% de sacarose como fonte de carbono.

[00119] A alimentação de sacarose (500 g L-1) foi suplementada com 8 mM de MgSO, 0,1 mM de CaCI2, elementos-traço, e 5 g L-1 de NH4CI. Para a formação de 6’-sialil-lactose, uma alimentação de lactose de 216 g L-1 foi empregada. O pH foi controlado usando-se solução de amônia (25% v/v). A fermentação em batelada alimentada foi conduzida a 30 °C sob aeração e agitação constantes durante 72 horas aplicando-se uma taxa de alimentação de sacarose de 5,5 a 7 ml L-1 h-1, referindo-se ao volume inicial. A lactose que não foi convertida em 6’- sialil-lactose ao final do processo de produção foi degradada pela adição de β- galactosidase e monossacarídeos a partir de hidrólise de lactose foram metabolizados pela cepa de produção. Exemplo 3: Purificação de 6’-sialil-lactose e 3’-sialil-lactose a partir de caldo de fermentação

[00120] A biomassa foi separada do meio de fermentação por meio de ultrafiltração seguida de uso sequencial de um filtro de módulo de bobinagem (0,05 μm de corte) (CUT membrane technology, Erkrath, Alemanha), e um filtro de fluxo cruzado (150 kDa de corte) (Microdyn-Nadir, Wiesbaden, Alemanha). Um meio de fermentação livre de célula de aproximadamente 1 m3 foi obtido que contém mais do que 20 g L-1 de oligossacarídeos sialilados.

[00121] O líquido livre de célula foi, então, deionizado por meio de cromatografia de troca iônica. Primeiro, contaminantes catiônicos foram removidos em um trocador catiônico forte em um volume de 200 l (Lewatit S 2568 (Lanxess, Cologne, Alemanha) em forma de H+. Com o uso de NaOH, o pH da solução obtida foi definido para 7,0. Em uma segunda etapa, íons aniônicos e corantes indesejados foram removidos da solução com o uso do trocador aniônico forte Lewatit S 6368 S (Lanxess, Cologne, Alemanha) na forma de cloreto. O trocador de íon tinha um volume de leito de 200 L. Com o uso de uma segunda etapa de filtração no filtro de fluxo cruzado (150 kDa de corte) (Microdyn-Nadir, Wiesbaden, Alemanha), precipitados originários de acidificação da solução foram removidos. Para a concentração do açúcar, a solução foi nanofiltrada em um Dow Filmtec NF270-4040 (Inaqua, Monchengladbach, Alemanha) ou, de modo alternativo, em uma membrana Trisep 4040-XN45-TSF (0,5 kDa de corte) (Microdyn-Nadir, Wiesbaden, Alemanha). Com o uso do último, o monossacarídeo N-acetilglucosamina, originário do processo de fermentação e que contamina a solução de sialil- lactose, foi separado do produto. A solução de sialil-lactose concentrada foi, então, tratada com carvão ativado (CAS:7440-44-0, Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha) para remover corantes, tais como produtos de reação de Maillard e produtos de reação aldólica. A fim de separar a sialil-lactose de subprodutos que se originam do processo de fermentação como ácido siálico e N- acetilglucosamina, a solução foi filtrada com uma membrana de 1 kDa de corte GE4040F30 (GE water & process technologies, Ratingen, Alemanha), e diafiltrada a uma condutividade de 0,6 a 0,8 mS. A solução diluída foi concentrada em um evaporador rotativo a uma concentração de cerca de 300 g L-1. Em uma separação cromatográfica final, outros açúcares contaminantes, como di-sialil- lactose, foram removidos. Portanto, a solução concentrada foi aplicada a uma resina de troca iônica de ânion fraco na forma de acetato (Amberlite FPA51, Dow Chemical, Michigan, USA). Enquanto a sialil-lactose dificilmente se liga à resina, o di-sialil-lactose é adsorvido. Desse modo, a sialil-lactose é eluída com 10 mM de acetato de amônio, enquanto a di-sialil-lactose é eluída com 1 M de acetato de amônio. Para a remoção do acetato de amônio, a sialil-lactose foi precipitada com um excesso de 10 vezes de etanol. A fração sólida foi filtrada e seca.

[00122] O produto foi finalizado passando-se uma solução de 20% de sialil- lactose de modo sequencial através de um filtro 6 kDa (Pall Microza ultrafiltration module SIP-2013, Pall Corporation, Dreieich, Alemanha) e um filtro estéril de 0,2 μm.

[00123] Uma parte da solução foi seca por aspersão com o uso de um secador por aspersão Büchi (Büchi Mini Spray Dryer B-290) (Büchi, Essen, Alemanha), aplicando os seguintes parâmetros: Temperatura de entrada: 130 °C, Temperatura de saída 67 °C a 71 °C, fluxo de gás de 670 L/h, aspirador 100%.

[00124] A 6’-sialil-lactose seca por aspersão tinha uma pureza de 91%, enquanto o material de 3’-sialil-lactose tinha uma pureza de 93%. Exemplo 4: Análise das sialil-lactoses secas por aspersão por difração de raios X de pó em ângulo amplo (XDR)

[00125] A difração de raios X de pó em ângulo amplo (XRD) foi usada para estudar a morfologia de produtos liofilizados. O difratômetro de raios X Empyrean (Panalytical, Almelo, Holanda) equipado com um anodo de cobre (45 kV, 40 mA, Κα1 emissão a um comprimento de onda de 0,154 nm) e um detector PIXcel3D foi usado. Aproximadamente 100 mg das amostras secas por aspersão foram analisados em modo de reflexão na faixa angular de 5 a 45° 2Θ, com um tamanho de passo de 0,04° 2Θ e um tempo de contagem de 100 segundos por passo.

[00126] Constatou-se que a 6’-sialil-lactose seca por aspersão tinha uma estrutura completamente amorfa (Figura 7), enquanto a amostra da 3’-sialil- lactose mostra dois picos de difração, a 7° e 31°, que indicam uma estrutura parcialmente cristalina, entretanto, a amostra de 3’-sialil-lactose também fornece, de modo predominante, um sinal amorfo (Figura 8). Exemplo 5: Análise das sialil-lactoses secas por aspersão por Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)

[00127] A calorimetria exploratória diferencial (DSC) em um Mettler Toledo 821e (Mettler Toledo, Giessen, Alemanha) foi usada para determinar eventos térmicos dos produtos secos por aspersão (temperatura de transição vítrea (Tg), eventos exo e endotérmicos adicionais).

[00128] Aproximadamente 25 mg do produto seco por aspersão foram analisados em Al-cadinhos corrugados (Mettler Toledo, Giessen, Alemanha). As amostras foram resfriadas a 0 °C com 10 K/min e reaquecidas a 100 °C com uma taxa de varredura de 10 K/min. Após resfriar as amostras a 0 °C em um segundo ciclo de aquecimento, as amostras foram aquecidas a 150 °C. O ponto intermediário da mudança endotérmica da linha de base durante a análise de aquecimento foi obtido como Tg. Os picos exotérmicos e endotérmicos são relatados por meio da temperatura de pico e da energia normalizada do evento.

[00129] A amostra de 6’-sialil-lactose seca por aspersão exibiu um valor de Tg de 48°C na primeira análise de aquecimento, e uma Tg de 50 °C na segunda análise de aquecimento com um pico de relaxamento endotérmico após a primeira Tg. Quando comparado à 6’-sialil-lactose, mostrou os valores de Tg de 3’-sialil-lactose de 22 °C em ambas análises de aquecimento, indicando uma maior estabilidade da 6’-sialil-lactose a temperaturas mais altas.

Claims (23)

REIVINDICAÇÕES

1. Um método para purificar oligossacarídeos sialilados que foram produzidos por fermentação microbiana ou biocatálise in-vitro, o método compreendendo as etapas de i) separar biomassa do caldo de fermentação; ii) remover cátions do caldo de fermentação ou mistura de reação; iii) remover impurezas aniônicas do caldo de fermentação ou mistura de reação; e iv) remover compostos que têm um peso molecular menor do que aquele do oligossacarídeo sialilado a ser purificado do caldo de fermentação ou mistura de reação.

2. O método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo adicionalmente uma ou mais etapas selecionadas a partir do grupo que consiste em v) aumentar a concentração do oligossacarídeo sialilado; vi) remover oligossacarídeos não desejados; vii) remover corantes; viii) remover endotoxinas; ix) esterilizar; e x) secar por aspersão ou cristalizar o oligossacarídeo sialilado.

3. O método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o oligossacarídeo sialilado é um oligossacarídeo sialilado de leite humano, selecionado preferencialmente a partir do grupo que consiste em 3'-SL, 6'-SL, LST-a, LST-b, LST-c, 3-F-SL, DS-LNT e F-LST-b.

4. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a remoção de biomassa do caldo de fermentação é realizada submetendo o caldo de fermentação a uma ultrafiltração, preferencialmente a uma ultrafiltração que remove a biomassa e compostos que têm um peso molecular de ≥ 500 kDa do caldo de fermentação, mais preferencialmente a uma ultrafiltração que remove a biomassa e compostos que têm um peso molecular de ≥ 150 kDa do caldo de fermentação, e ainda mais preferencialmente a uma ultrafiltração que remove a biomassa e compostos que têm um peso molecular de ≥ 100 kDa do caldo de fermentação.

5. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a remoção de cátions do caldo de fermentação é realizada por cromatografia de troca catiônica.

6. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a remoção de impurezas aniônicas do caldo de fermentação é realizada por cromatografia troca aniônica.

7. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a remoção de compostos que têm um peso molecular menor do que aquele do oligossacarídeo sialilado a ser purificado é realizada por filtração por fluxo cruzado.

8. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a concentração do oligossacarídeo sialilado a ser purificado é aumentada por nanofiltração ou evaporação do solvente.

9. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 87, em que a remoção de corantes é realizada tratando o caldo/solução de fermentação que contém o oligossacarídeo sialilado desejado com carbono ativado.

10. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que a remoção de endotoxinas é realizada por filtração da solução que contém o oligossacarídeo desejado através de um filtro de 6 kDa ou um filtro de 3kDa.

11. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que a esterilização da solução é realizada por filtração da solução através de um filtro de 0,2 μm.

12. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 em que compreende adicionalmente uma etapa de cromatografia SMB.

13. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 em que compreende adicionalmente uma etapa de eletrodiálise.

14. Uma preparação de um oligossacarídeo sialilado, em que o referido oligossacarídeo sialilado foi purificado por um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13.

15. A preparação de acordo com a reivindicação 14, em que o oligossacarídeo sialilado está presente na preparação em uma pureza de ≥ 80% em peso.

16. A preparação de acordo com a reivindicação 14 ou 15, em que a preparação é um fluido ou um pó, preferencialmente de um pó em que as partículas são partículas amorfas ou cristalinas.

17. Uso da preparação de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16 para produzir uma composição nutricional, preferencialmente uma fórmula infantil.

18. Uma composição nutricional compreendendo pelo menos um oligossacarídeo sialilado, em que o referido pelo menos um oligossacarídeo sialilado foi produzido por fermentação microbiana ou biocatálise, e em que a referida composição nutricional é uma formulação medicinal, um suplemento dietético, uma bebida láctea ou uma fórmula infantil.

19. Uma composição nutricional que contém pelo menos 5 HMOs, em que os referidos pelo menos 5 HMOs são selecionados a partir do grupo que consiste em 2'-fucosil-lactose, 3-fucosil-lactose, lacto-N-tetraose, lacto-N-neotetraose, lacto-N-fucopentaose I, 3'-sialil-lactose e 6'-sialil-lactose.

20. Uma composição nutricional de acordo com a reivindicação 18 ou 19,

em que a composição nutricional contém pelo menos um HMO sialilado e pelo menos um HMO neutro e um microrganismo probiótico.

21. Um pó livre de GMO seco por aspersão em que consiste essencialmente em um oligossacarídeo sialilado com uma pureza de > 80% em peso seco e que possui menos do que 10% de água em peso.

22. O produto de pó seco por aspersão de acordo com a reivindicação 21, em que o produto é selecionado a partir do grupo que consiste em 3'-sialil- lactose, 6'-sialil-lactose, e uma mistura de 3'-sialil-lactose e 6'-sialil-lactose.

23. O produto de pó seco por aspersão de acordo com a reivindicação 22, em que o pó seco por aspersão consiste essencialmente em uma mistura de 3'- sialil-lactose, 6'-sialil-lactose e um ou mais HMOs neutros, os referidos um ou mais HMOs neutros sendo selecionados a partir do grupo que consiste em 2'- fucosil-lactose, 3-fucosil-lactose, lacto-N-tetraose, lacto-N-neotetraose, lacto-N- fucopentaose I.