CN115286666A - 一种寡糖的分离纯化方法及应用 - Google Patents

一种寡糖的分离纯化方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种寡糖的分离纯化方法及应用，采用酶解法、化学沉淀法和膜法相结合。该方法条件温和、工艺简单、耗时短，且生成的沉淀可以用于肥料等领域。且该方法不会影响目的寡糖的收率。

Description

一种寡糖的分离纯化方法及应用
技术领域
本发明涉及系列唾液酸化乳N四糖的高效制备方法，同时提供了寡糖的分离纯化方法。
背景技术
寡糖又称为低聚糖，是指2～10个单糖通过糖苷键连接而成的直链或者支链的一类糖，寡糖典型之一的母乳低聚糖(human milk oligosaccharides，HMOs)，作为母乳中仅次于脂质和乳糖的第三大固体物质，浓度高达9-24g/L。其在食品行业尤其是婴幼儿配方奶粉具有广阔的市场前景，但由于从哺乳动物母乳中分离纯化母乳低聚糖过程复杂且产量少，导致现在寡糖多是基于化学法或者酶法、细胞工厂发酵来获得。而化学法需要严谨的设计，包括保护基团、选择催化剂和合适的反应条件。酶法和细胞工厂发酵通常是在温和的条件下进行的，不需要某些复杂的步骤，通常是在细胞体内或者体外，通过各种酶的作用来实现寡糖的合成，这些酶通常包括各种糖基转移酶、糖苷水解酶以及磷酸化酶。而糖基转移酶的作用是高效而专一的地把糖基从糖核苷酸供体上催化到受体上。但是由于糖核苷酸价格昂贵，且生成的核苷酸磷酸通常会使糖基化路径受到十分明显的反馈抑制作用，因此，在这类体系中，需要加入糖核苷酸再生系统。尤其在酶法合成寡糖的糖核苷酸再生系统中，会产生大量的磷酸根，而细胞工厂发酵生产母乳低聚糖的发酵培养基中会加入磷酸盐。基于此发酵液或者反应液中会存在大量的磷酸根多价阴离子，这些磷酸根的存在对寡糖的分离提出了巨大的挑战。
就目前的化学合成、酶促合成和基于发酵的制备方法，实际上也面临着难以实现具有足以用于食品应用质量的寡糖尤其是HMOs产物的大规模制备。原因是化学合成需要几种有毒的化学物质，其可能污染最终产物。然而，酶促方法和基于发酵方法倾向于产生低聚糖的复杂混合物，使得所需产物被起始物料如乳糖，以及中间体、不需要的副产物(例如源自某些糖基转移酶的副活性的副产物)和底物如各单糖和多肽污染。具体来说，母乳低聚糖在基因工程菌或者酶法生物合成过程中均是使用糖基转移酶从头合成，例如，合成含有5个糖单元的母乳低聚糖，意味着需要从从二糖开始，在糖基转移酶作用下依次合成三糖、四糖和五糖，该生物合成过程中会获得含有目的寡糖的化合物，即反应混合物或者细胞发酵液，其中包含着少量的残留底物以及中间过程的产物(非目的寡糖)，以及一些无机离子。且这些非目的寡糖的结构和物理化学性质往往和目的寡糖非常相近，且相邻反应过程得到的寡糖分子量只相差一个糖单元。此外，值得一提的是，特别是含有重组微生物(细菌或真核微生物，如巴氏酵母)的基因工程发酵液比乳源产品流更是复杂得多。例如，乳清的组成为～94％的水、4-5％的乳糖、0.5-1％的蛋白质和仅有的很少的已经确定的矿物质(如钙、钾和磷)，还有一些维生素，仅在乳品流中浓缩和脱矿质的简单的基质。相比之下，从重组微生物发酵工艺中获得的糖溶液的基质非常复杂，首先是根据规定要求分离重组生物质并使其失活，获得的澄清液是包含不同盐类和离子的不确定基质，还含有重金属和微量元素，其次此类液体的挑战是除去细胞碎片、膜碎片如脂类、蛋白质、源自微生物细胞代谢的分子。因此，与乳清和乳品流相比，通过重组加工助剂(如基因修饰细菌)生产的寡糖的回收更具挑战性，因为其内的污染物在分子量、带电分子(单电荷和多电荷)和着色分子方面差异性都非常高。
基于上述，不难发现生物酶法和基于发酵方法倾向于产生低聚糖的复杂混合物的主要原因是，生物酶法反应液或者发酵方法的发酵液中，除了所期待的目标寡糖以外，至少存在着以下所不期望存在的物质：
1)寡糖的产物类似物；所述产物类似物包括，分子量低于待纯化的低聚糖或者唾液酸化的低聚糖的分子量的化合物，所述化合物包括发酵或者酶法反应所需要的糖类底物以及在各类糖基转移酶作用下生成的各级寡糖中间产物；例如在LST-a的酶法合成中，可能会出现乳糖、N-乙酰神经氨酸(唾液酸)、N乙酰氨基葡萄糖、半乳糖四种底物的残留，以及LNTⅡ(乳糖-N-三糖)和LNT(乳糖-N-四糖)两个中间产物的残留。
2)去除多价阴离子；比较典型的多价阴离子包括磷酸根离子和硫酸根离子。在发酵法生成寡糖体系中，所述多价阴离子，有尤其是磷酸根离子和硫酸根离子都是来源于发酵培养基；在酶法反应体系中，所述多价阴离子主要是指磷酸根离子。且还需要强调的是，出于成本考虑酶法合成寡糖的体系中，大多需要加入糖核苷酸再生系统，而细胞工厂发酵生产母乳低聚糖的发酵培养基中会加入磷酸盐。基于此，上述两类合成体系中，结束时会产生大量的磷酸根，这些磷酸根的存在对寡糖的分离提出了巨大的挑战。基于此，反应液中的磷酸根离子/多价阴离子的浓度/含量一般不低于150mM，就占比来说酶法合成中酸根离子/多价阴离子的比例不低于70％。
3)可溶性蛋白；在发酵法或者酶法反应结束，经过离心后在溶液中仍存可溶性蛋白；其中发酵法中可溶性蛋白主要是指在发酵过程中分泌于胞外的可溶性蛋白以及在纯化中为了去除产物类似物而加入的水解酶或者裂解酶。酶法反应体系中可溶性蛋白主要是指在酶促反应体系中加入了酶液作为催化剂以及为了去除产物类似物而加入的水解酶或者裂解酶。
4)阳离子；所述阳离子包括在发酵培养基中加入的阳离子或者酶法反应体系中原料以钠盐的形式存在，以及在过程中加入的pH调节剂和纯化过程沉淀反应残留的微量的金属离子。典型的阳离子包括钠离子、镁离子、钾离子等。
5)阴离子，所述阴离子包括在发酵培养基中加入的一价阴离子或者酶法反应体系中原料以氯离子盐的形式存在，以及在过程中加入的pH调节剂和纯化过程沉淀反应残留的微量的阴离子。典型的阴离子包括氯离子、磷酸根离子、硫酸根离子等。
因此，如何有效、可放大的分离目的寡糖的方法对于HMOs产品的商业化进程也有着重要的影响。从低聚糖混合物中纯化各低聚糖的现有技术方法在技术上是复杂的，难以扩大规模并且对于食品应用而言经济性不高。目前从这些含有磷酸盐的生物酶法反应液和发酵液中纯化母乳低聚糖时，如专利文献一中所述，大部分采用阴离子交换树脂来吸附磷酸根(CN201980036628.8)。一方面，离子交换树脂对无机离子有良好的去除能力。但是如果磷酸根浓度很高，工业生产中就需要的大量树脂进行吸附，这意味着树脂的再生需要大量的再生剂和产生巨大的废水量。
专利文献一：CN201980036628.8，纯化唾液酸乳糖的简单方法。
发明内容
1.要解决的问题
在第一方面，本发明的目的之一在于提供一种纯化通过微生物发酵产生或者酶法反应产生的寡糖的分离纯化方法，该方法可以有效的实现目的寡糖的分离，适用于商业规模或工业规模，并且其可产生具有使产物适于人类食用的纯度的产物；
本发明的目的之二在于提供一种寡糖的分离纯化方法，该方法可以有效、环保的实现高浓度多价阴离子，尤其是磷酸根离子的去除，该方法经济有效且环保，适用于商业规模或工业规模，并且其可产生具有使产物适于人类食用的纯度的产物；
在第二方面，本发明的目的在于提供一种根据第一方面所得的寡糖；
在第三方面，本发明的目的在于提供根据第一方面所得的寡糖，或者，根据第二方面所述的寡糖的用途。
2.技术方案
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
[1]根据第一方面，本发明提供了一种寡糖的分离纯化方法，所述方法包括以下步骤：
对发酵液或者反应液进行分离纯化处理，所述处理包括以下步骤：
a)去除产物类似物；
b)去除多价阴离子；
c)去除可溶性蛋白、阳离子、阴离子。
[1.1]根据本发明第一方面任一实施方案的，
所述a)中，利用水解酶对发酵液或者反应液进行处理，去除所述产物类似物；或者，
所述a)中，利用裂解酶对发酵液或者反应液进行处理，去除所述产物类似物；或者
所述a)中，利用水解酶、裂解酶对发酵液或者反应液进行处理，去除所述产物类似物。
[1.2]根据本发明第一方面任一实施方案的寡糖的分离纯化方法，所述水解酶为糖苷水解酶，所述水解酶的终浓度为1～50U/mL或500～5000ALU/L(例如的β半乳糖苷酶，终浓度)；所述裂解酶为N乙酰神经氨酸醛缩酶或者唾液酸裂解酶；所述裂解酶的终浓度为1～50U/mL。
[1.3]根据本发明第一方面任一实施方案的寡糖的分离纯化方法，所述b)中，利用金属离子对发酵液或者反应液进行处理，去除所述多价阴离子；
所述金属离子的添加浓度为5-1000mM；优选为100-500mM，进一步优选为100-400mM。
[1.4]根据本发明第一方面任一实施方案的寡糖的分离纯化方法，所述b)中，利用金属离子对发酵液或者反应液进行处理，去除所述多价阴离子；
所述金属离子的添加浓度为5-1000mM；优选为100-500mM，进一步优选为100-400mM。
[1.5]根据本发明第一方面任一实施方案的寡糖的分离纯化方法，所述金属离子包括钙离子、镍离子、钴离子、锌离子、铜离子、铅离子、锰离子、镁离子、铝离子、铁离子、钡离子、银离子中的任意一种或者一种以上；
所述金属离子以含有该金属离子的盐的溶液的方式加入；
所述盐的溶液的浓度为该金属盐溶液对应的饱和溶液的浓度。
[1.6]根据本发明第一方面任一实施方案的寡糖的分离纯化方法，
使b)处理过后的发酵液或者反应液pH在6～12，优选为7～10，进一步优选为8～9。
[1.7]根据本发明第一方面任一实施方案的寡糖的分离纯化方法，
所述c)中，对发酵液或者反应液进行超滤；
优选进行从所述发酵液或者反应液中去除分子量≥20kDa的可溶性蛋白的超滤，更优选进行从所述发酵液或者反应液中去除分子量≥10kDa的可溶性蛋白的超滤，最优选进行从所述发酵液或者反应液中去除分子量≥4kDa的可溶性蛋白的超滤。
[1.8]根据本发明第一方面任一实施方案的寡糖的分离纯化方法，
c)中，所述从发酵液或者反应液中去除阳离子通过阳离子交换色谱法进行；
优选地，所述阳离子交换色谱法的固定相为阳离子交换树脂，进一步优选为强酸性阳离子交换树脂；
c)中，所述从发酵液或者反应液中去除阴离子通过阴离子交换色谱法进行；
优选地，所述阴离子交换色谱法的固定相为阴离子交换树脂，进一步优选为弱碱性阴离子交换树脂。
[1.9]根据本发明第一方面任一实施方案的寡糖的分离纯化方法，
还包括一个或多个选自以下的处理步骤：
Ⅰ)对，经过b)处理后的发酵液或者反应液，进行固液分离处理；
所述固液分离处理的方式包括过滤、微滤或离心；
Ⅱ)对，经过c)处理后的发酵液或者反应液进行过滤处理，所述过滤方式优选纳滤；
采用纳滤膜进行纳滤浓缩同时可以去除残留的pH调节剂离子以及酶解后的单糖产物，纳滤膜的截留分子量应该介于目的寡糖分子量和杂质分子量之间；
优选纳滤膜截留分子量小于500道尔顿。更优的，纳滤膜的截留分子量选用100～300道尔顿。
[1.10]根据本发明第一方面任一实施方案的寡糖的分离纯化方法，
还包括一个或多个选自以下的处理步骤：
Ⅲ)对，经过Ⅱ)处理后的发酵液或者反应液进行脱色处理；优选利用活性炭进行脱色处理；
Ⅳ)对，经过Ⅲ)处理后的发酵液或者反应液进行结晶，或醇沉，或冻干，或喷雾干燥处理。
[1.11]根据本发明第一方面任一实施方案的寡糖的分离纯化方法，
其中所述寡糖包括中性母乳低聚糖和酸性人乳低聚糖(唾液酸化的人乳低聚糖)；
包括乳糖基-N-四糖(LNT)、乳糖基-N-新四糖(LNnT)、乳糖-N-二岩藻糖六糖Ⅰ(LNDFHⅠ)、乳糖-N-二岩藻糖六糖Ⅱ(LNDFHⅡ)、乳糖-N-六糖(LNH)、乳糖-N-新六糖(LNnH)、3'-唾液酸乳糖(3’-SL)、6'-唾液酸乳糖(6’-SL)、6'-唾液酸乳糖胺(6’-SLN)、3'-唾液酸乳糖胺(3’-SLN)、3'-唾液酸-3-岩藻糖基乳糖(3’S3FL)、二唾液酸乳糖(DSL)、二唾液酸乳-N-四糖(DSLNT)、唾液酸乳糖-N-四糖a(LST a)、唾液酸乳糖-N-四糖b(LST b)、唾液酸乳糖-N-四糖c(LST c)、岩藻糖基二唾液酸乳糖-N-六糖Ⅰ(FDS-LNH-Ⅰ)、岩藻糖基二唾液酸乳糖-N-六糖Ⅱ(FDS-LNH-Ⅱ)等，但不局限于这些低聚糖。
[2]根据第二方面，本发明提供了一种含有寡糖的制剂，其中所述寡糖通过以上任一所述的方法进行纯化所得；且，所述寡糖以≥90％(质量)的纯度存在于所述含有寡糖的制剂中。
[3]根据第三方面，本发明提供了以上任一所述的制剂用于制造营养组合物、优选婴儿配方物的用途。
有益效果
1、本发明提供的方法工艺简单易控制，整个过程条件温和，且使用设备简单，利于工业化生产目的寡糖；
2、本发明提供的方法能够有效去除发酵过程产生或者酶法反应残留的产物类似物，增大这些物质与目的寡糖的物理化学性质差异，降低目的寡糖分离纯化的难度，有效的避免了尺寸依赖型凝胶过滤层析、色谱分离等复杂而昂贵的分离工艺的使用。且本发明所使用的水解酶或者裂解酶不会对母乳低聚糖产生酶解效果，故而不影响产物的收率。
3、本发明提供的方法能够有效去除水溶性磷酸根离子，且生成的磷酸沉淀物颗粒较大，后续过滤速度快、用时短，经实验证实，通过本发明提供的方法，溶液中最终磷酸根的含量低于10mmol/L。且本发明产生的磷酸盐沉淀不会对母乳低聚糖产生吸附效果，故而不影响产物的收率。且本发明通过反应生成磷酸盐沉淀，该沉淀可以用于建材或者农业领域，利于废物的回收利用。
4、本发明通过酶解法、化学沉淀法、离子交换树脂以及纳滤膜结合使用，使得最终产品中的杂质离子的含量很低，极大地减少了离子交换树脂的使用，减少了分离工艺废水的产生量。
5、在本发明最终获得产品的纯度能达到90％以上。
附图说明
图1：6'-唾液酸乳糖的结构图；
图2：6'-唾液酸乳糖的酶法合成线路图
图3：目的寡糖的分离纯化方法示意图；
图4：6'-唾液酸乳糖反应结束时的HPLC图；
图5：向6'-唾液酸乳糖反应液中加入N乙酰神经氨酸醛缩酶3h后的HPLC图；
图6：向6'-唾液酸乳糖反应液中加入β-半乳糖苷酶反应3h后的HPLC图；
图7：纯化得到6'-唾液酸乳糖的HPLC图；
图8：纯化得到6'-唾液酸乳糖的LC-MS图；
图9：LNT的多酶催化合成路线图；
图10：纯化得到LNT的HPLC图。
具体实施方式
通过参考结合附图和示例的以下描述可以更容易地理解本公开，所有附图和示例构成本公开的一部分。应当理解的是，本公开不限于本文描述和/或示出的特定产品、方法、条件或参数。进一步地，本文使用的术语仅用于通过示例的方式描述特定实施例的目的并且不旨在限制，除非另有说明。
还应当理解的是，为了清楚起见，本公开的某些特征可以在单独实施例的上下文中被描述在本文中，但是也可以在单个实施例中彼此组合地被提供。即，除非明显不兼容或特别地不包括，否则每个单独的实施例被认为可与任何其它实施例可组合，并且该组合被认为代表另一个不同的实施例。相反地，为了简明起见，在单个实施例的上下文中描述的本公开的各种特征也可以单独地或以任何子组合来提供。最后，虽然特定实施例可以被描述为一系列步骤的部分或更通用的结构的部分，但是每个步骤或子结构本身也可以被认为是独立的实施例。
除非另有说明，否则应当理解的是，同一表述中的每个单独元素和该表述中的单独元素的每个组合将被解释为不同的实施例。例如，表示为“A、B或C”的实施例的列表应被解释为包括实施例“A”、“B”、“C”、“A或B”、“A或C”、“B或C”或“A、B或C”。
本文所使用的冠词“一”、“一个”和“该”的单数形式还包括相应的复数个提及物，并且对特定数值的提及至少包括该特定值，除非上下文另有明确说明。因此，例如，对“物质”的提及是对这种物质及其等同物中的至少一种的提及。
本文所用的术语“包括、包含、含有、具有”，当位于对方法中步骤的记载之前时，意指该方法涵盖明确记载的内容之外的一个或多个步骤，并且这些额外的一个或多个步骤可以在所记载的步骤之前、之间、和/或之后进行。例如，包括步骤a、b和c的方法涵盖步骤a、b、x和c的方法，a、b、c和x的方法以及步骤x、a、b和c的方法。
此外，当位于对方法中步骤的记载之前时，术语“包括”并不(尽管可以)要求所列步骤的相继执行，除非上下文另外清晰指明。例如，包括步骤a、b和c的方法涵盖如下示意的顺序：以步骤a、c和b的顺序，步骤a、b和c的顺序，步骤b、a和c的顺序，步骤b、c和a的顺序，步骤c、b和a的顺序以及步骤c、a和b的顺序执行步骤的方法。
通常，术语“约”的使用表示可以根据通过所公开的主题所获得的期望特性而变化的近似值，并且将基于功能以依赖于上下文的方式来解释。因此，本领域普通技术人员将能够在个案的基础上解释一定程度的差异。在一些情况下，表达特定值时使用的重要数字的数量可以是用于确定由术语“约”允许的差异的代表性技术。在其它情况下，可以使用一系列值中的渐变来确定由术语“约”允许的差异的范围。进一步地，本公开中的所有范围都是包含性的和可组合的，并且对范围中所述的值的提及包括该范围内的每个值。除非另外指明，本文所用的表示成分的量、性质比如分子量、反应条件等等的所有数字应被理解为，在所有实例中都由术语“约”修饰。因此，除非相反地指出，本文的数值参数是可以根据试图通过本发明获得的期望性质而变化的近似值。最起码，并且不将等同物声明的应用局限于权利要求的范围，应当至少考虑所报告的有效数字的数目并通过应用普通的舍入技术来理解各个数值参数。虽然描述本发明的广泛范围的数值范围和参数是近似值，在具体实施例中的数值是尽可能准确报告的。然而，任何数值本质上包含由数值测试测量中出现的误差而必然产生的标准差。
包括诸如“第一”和“第二”的序数的术语可用于解释各种组件或者流体，但这些组件、流体不受这些术语的限制。因此，在没有背离本公开的教导的情况下，这些术语仅用于将该组件/流体与另一组件/流体区分开来。
当通过使用结合性术语“……和/或……”等来描述项目时，描述应被理解为包括相关联的所列项目中的任何一个以及其中的一个或多个的所有组合。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文所使用的术语和/或包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
如在此所述的“寡糖”，是指通过糖基转移酶、糖苷酶、糖核苷酸再生系统中的一种或者几种酶共同参与合成。基于此，所述寡糖的生物合成方式包括基因工程菌发酵和生物酶法合成。
本发明提供的寡糖的分离纯化工艺，可以应用于纯化通过基因工程菌发酵产生的寡糖。在容许细胞产生所需的寡糖的条件下培养能够产生所需的寡糖的细胞。用于产生所需的寡糖的合适细胞包括细菌，例如大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或酵母，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。
可以对细胞进行基因改造以产生所需的寡糖，比如母乳低聚糖(在基因上未经修饰的前体细胞不能够产生所需的寡糖。例如，大肠杆菌是用于代谢工程的优选宿主，已被用于HMOs(包括中性HMOs以及唾液酸化的HMOs)的发酵。然而，其他宿主菌株——例如酵母(如酿酒酵母)、谷氨酸棒状杆菌、芽孢杆菌(Bacillus)属种——同样也可以进行精心改造，以产生寡糖。
其中所述寡糖包括母乳低聚糖。HMOs可以分为中性母乳低聚糖(中性HMOs)和酸性母乳低聚糖，即唾液酸化的母乳低聚糖(唾液酸化的HMOs)。所述HMOs包括乳糖基-N-四糖(LNT)、乳糖基-N-新四糖(LNnT)、乳糖-N-二岩藻糖六糖Ⅰ(LNDFHⅠ)、乳糖-N-二岩藻糖六糖Ⅱ(LNDFHⅡ)、乳糖-N-六糖(LNH)、乳糖-N-新六糖(LNnH)、3'-唾液酸乳糖(3’-SL)、6'-唾液酸乳糖(6’-SL)、6'-唾液酸乳糖胺(6’-SLN)、3'-唾液酸乳糖胺(3’-SLN)、3'-唾液酸-3-岩藻糖基乳糖(3’S3FL)、二唾液酸乳糖(DSL)、二唾液酸乳-N-四糖(DSLNT)、唾液酸乳糖-N-四糖a(LST a)、唾液酸乳糖-N-四糖b(LST b)、唾液酸乳糖-N-四糖c(LST c)、岩藻糖基二唾液酸乳糖-N-六糖Ⅰ(FDS-LNH-Ⅰ)、岩藻糖基二唾液酸乳糖-N-六糖Ⅱ(FDS-LNH-Ⅱ)等，但不局限于这些低聚糖。
其中，对于所需的唾液酸化的HMOs的产生，细菌或酵母宿主菌株通常需要从葡萄糖或者甘油开始，通过在细胞内异源表达唾液酸合成相关的酶合成唾液酸。同时，还需要以乳糖为原料，在异源表达的特定的糖基转移酶作用下进行链的延伸，最后在异源表达糖基转移酶的作用下，合成唾液酸化HMO。在这过程中，需要对宿主细胞进行改造以提高产物的外泌。同时，一些中间产物，例如，生成或添加的唾液酸、底物乳糖在糖链延伸过程中产生的中间体等均会外泌到培养液中，成为了纯化中需要从目的产物中进行移除的产物类似物。
关于(唾液酸化/中性的)低聚糖的术语“所需的”，是指应由或者期待细胞产生的低聚糖。所需的低聚糖是通过本文公开的工艺待纯化的低聚糖。如本文所用，关于唾液酸化的低聚糖的术语“所需的”还用于区分待产生的唾液酸化的低聚糖与细胞可能无意产生的其他唾液酸化的低聚糖。
本发明提供的寡糖的分离纯化工艺，可以应用于纯化通过生物酶法合成的寡糖。所需的寡糖通过一种或多种体外酶促反应获得，并且可在生物催化反应结束时通过对反应混合物(或者不含细胞的发酵液、澄清化的裂解物)，进行本文所述的纯化工艺而从所述反应混合物中纯化。应理解，从体外生物催化的反应混合物中纯化寡糖不需要从反应混合物中去除生物质。
不含细胞的发酵液、澄清化的裂解物或反应混合物含有所需的寡糖以及大量杂质和不需要的成分，包括除所需的寡糖之外的其他低聚糖、一价盐、二价盐、氨基酸、多肽、蛋白质、核酸、反应残留的单糖、以及反应残留的底物乳糖和在反应过程中可能生成的中间体等产物类似物。
其中所述寡糖包括母乳低聚糖。HMOs可以分为中性母乳低聚糖(中性HMOs)和酸性母乳低聚糖，即唾液酸化的母乳低聚糖(唾液酸化的HMOs)。所述HMOs包括乳糖基-N-四糖(LNT)、乳糖基-N-新四糖(LNnT)、乳糖-N-二岩藻糖六糖Ⅰ(LNDFHⅠ)、乳糖-N-二岩藻糖六糖Ⅱ(LNDFHⅡ)、乳糖-N-六糖(LNH)、乳糖-N-新六糖(LNnH)、3'-唾液酸乳糖(3’-SL)、6'-唾液酸乳糖(6’-SL)、6'-唾液酸乳糖胺(6’-SLN)、3'-唾液酸乳糖胺(3’-SLN)、3'-唾液酸-3-岩藻糖基乳糖(3’S3FL)、二唾液酸乳糖(DSL)、二唾液酸乳-N-四糖(DSLNT)、唾液酸乳糖-N-四糖a(LST a)、唾液酸乳糖-N-四糖b(LST b)、唾液酸乳糖-N-四糖c(LST c)、岩藻糖基二唾液酸乳糖-N-六糖Ⅰ(FDS-LNH-Ⅰ)、岩藻糖基二唾液酸乳糖-N-六糖Ⅱ(FDS-LNH-Ⅱ)等，但不局限于这些低聚糖。且前述所列举的HMOs都可以通过生物酶法合成。
基于此，根据第一方面，寡糖的分离纯化方法，所述方法对发酵液或者反应液进行分离纯化处理，包括以下步骤：
a)去除产物类似物；
b)去除多价阴离子；
c)去除可溶性蛋白、阳离子、阴离子。
如在此所述的“寡糖的产物类似物”主要包括分子量低于待纯化的低聚糖或者唾液酸化的低聚糖的分子量的化合物，所述化合物包括发酵或者酶法反应所需要的糖类底物以及在各类糖基转移酶作用下生成的各级寡糖中间产物；例如在LST-a的酶法合成中，可能会出现乳糖、N-乙酰神经氨酸(唾液酸)、N乙酰氨基葡萄糖、半乳糖四种底物的残留，以及LNTⅡ(乳糖-N-三糖)和LNT(乳糖-N-四糖)两个中间产物的残留。
如在此所述的“多价阴离子”主要包括磷酸根离子和硫酸根离子，在发酵法生成寡糖体系中，所述多价阴离子，有尤其是磷酸根离子和硫酸根离子都是来源于发酵培养基；在酶法反应体系中，所述多价阴离子主要是指磷酸根离子。且出于成本考虑酶法合成寡糖的体系中，大多需要加入糖核苷酸再生系统，而细胞工厂发酵生产母乳低聚糖的发酵培养基中会加入磷酸盐。基于此，上述两类合成体系中，还会产生大量的磷酸根，这些磷酸根的存在对寡糖的分离提出了巨大的挑战。基于此，反应液中的磷酸根离子/多价阴离子的浓度/含量一般不低于150mM。
如在此所述的“可溶性蛋白”，主要指在发酵法或者酶法反应结束，经过离心后在溶液中仍存的可溶性蛋白；其中发酵法中可溶性蛋白主要是指在发酵过程中分泌于胞外的可溶性蛋白以及在纯化中为了去除产物类似物而加入的水解酶或者裂解酶。酶法反应体系中可溶性蛋白主要是指在酶促反应体系中加入了酶液作为催化剂以及为了去除产物类似物而加入的水解酶或者裂解酶。
如在此所述的“阳离子”，包括在发酵培养基中加入的阳离子或者酶法反应体系中原料以钠盐的形式存在，以及在过程中加入的pH调节剂和纯化过程沉淀反应残留的微量的金属离子，典型的阳离子包括钠离子、镁离子、钾离子等。
如在此所述的“阴离子”，包括在发酵培养基中加入的一价阴离子或者酶法反应体系中原料以氯离子盐的形式存在，以及在过程中加入的pH调节剂和纯化过程沉淀反应残留的微量的阴离子。典型的阴离子包括氯离子、磷酸根离子、硫酸根离子等。
在本发明第一方面的一个实施方案中，去除产物类似物的操作包括，利用酶液对发酵液或者反应液进行处理。上述酶解发酵过程产生或者酶法反应残留的产物类似物的步骤a)中，所述酶液包括或者只具有水解酶。优选采用水解酶进行中间副产物的水解，所述水解酶进一步优选为能够水解底物或者中间副产物的糖苷水解酶(简称糖苷酶)。
如在此所述的，“糖苷水解酶”是指能够水解发酵过程产生或者酶法反应残留的产物类似物的糖苷酶；所述的糖苷水解酶包括半乳糖苷酶、岩藻糖苷酶、唾液酸酶、N-乙酰氨基葡萄糖苷酶或者N-乙酰氨基己糖苷酶等。优选地，所述糖苷水解酶包括β-半乳糖苷酶、α-岩藻糖苷酶、α-唾液酸酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶或者β-N-乙酰氨基己糖苷酶。进一步优选地，所述糖苷水解酶包括包括β-1,3半乳糖苷酶、α-1,2/1,3/1,4岩藻糖苷酶、α-2,3/2,6唾液酸酶、β-1,3/1,6N-乙酰氨基葡萄糖苷酶或者β-N-乙酰氨基己糖苷酶。最为优选的，所述糖苷水解酶是指能够水解发酵过程产生或者酶法反应残留的产物类似物的非还原端专一性的外切糖苷酶，包括β-1,3半乳糖苷酶、α-1,2/1,3/1,4岩藻糖苷酶、α-2,3/2,6唾液酸酶、β-1,3/1,6N-乙酰氨基葡萄糖苷酶或者β-N-乙酰氨基己糖苷酶。
进一步地，在一些实施例中，上述酶解发酵过程产生或者酶法反应残留的产物类似物的步骤a)中，利用酶液对发酵液或者反应液进行处理，所述酶液包括或者只具有水解酶和裂解酶。优选采用水解酶进行中间副产物的水解，进一步优选采用裂解酶进行底物的降解。
如在此所述的，术语“裂解酶”是指能够裂解发酵过程产生或者酶法反应残留的产物类似物的裂解酶。其中基因工程菌发酵液或者酶法反应液经过糖苷水解酶处理后，残留的底物和产物类似物均已单糖的结构存在，包括葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖、唾液酸、岩藻糖等。其中除唾液酸以外的单糖均能通过纳滤膜与产物分开，而唾液酸因为性质、分子结构与分子量均与唾液酸化HMOs性质接近，导致其无法很好地通过纳滤方法将其与产物分开。因此，本发明采用裂解酶将唾液酸进一步进行处理，以期获得更高的产物纯度。所述裂解酶进一步优选为N乙酰神经氨酸醛缩酶和/或唾液酸裂解酶。
进一步地，在一些实施例中，所述水解酶的添加量(终浓度)为500～5000ALU/L，优选为1000～3000ALU/L，更加优选为1500～2500ALU/L；所述水解酶的终浓度为1～50U/mL或500～5000ALU/L(后续实施例中可以采用购买的β半乳糖苷酶)；
所述裂解酶的添加量(终浓度)为1～50U/mL，优选为1～30U/mL，更优选为5～10U/mL。
在本发明第一方面的，一个实施方案中，所述b)中，去除所述多价阴离子的操作包括：利用金属离子对发酵液或者反应液进行处理，去除所述多价阴离子；所加入的金属离子会与多价阴离子结合形成溶解度极低的盐沉淀，因此，在一些实施例中，需要通过离心的方法去除沉淀。在另外的和/或替代的实施方案中，将沉淀通过过滤从发酵液或者反应液中分离。用于从发酵液中分离沉淀的合适的过滤方法包括微滤和超滤。
微滤本身是一种物理过滤工艺，其中使含有颗粒的流体通过具有特定孔径大小的膜以从流体中分离出颗粒。如本文所用，术语“微滤”是指其中将沉淀或者可溶性蛋白从发酵液中分离出的物理过滤工艺。
超滤是各种膜过滤，并且没有根本不同。在超滤中，诸如压力或浓度梯度之类的力导致通过半透膜的分离。高分子量的细胞、悬浮固体、沉淀或者可溶性蛋白和溶质保留在所谓的渗余物中，而水和低分子量的溶质如所需的唾液酸化的低聚糖则通过膜进入渗透液(滤液)中。
进一步地，在另外的实施例中，所述金属离子的添加浓度为5-1000mM；优选为100-500mM，进一步优选为100-400mM。通常，金属离子选自钙离子、镍离子、钴离子、锌离子、铜离子、铅离子、锰离子、镁离子、铝离子、铁离子、钡离子、银离子中的一种或者多种；并且，通常所述金属离子以含有该金属离子的盐的溶液的方式加入。进一步地，在另外的实施例中，所述金属离子以含有该金属离子的盐的溶液的方式加入；所述盐的溶液的浓度为该金属盐溶液对应的饱和溶液的浓度。进一步优选的，在一些实施例中，步骤b)处理过后的发酵液或者反应液pH在6～12，优选为7～10，进一步优选为8～9。
在一些优选实施例中，在去除所述多价阴离子的操作过程中，需保持液体环境的最佳pH在6-12，优选为7-10，更加优选为8-9；基于尽量减少难以去除的杂质离子引用的考虑，优选通过加入含有氢氧化钠或者氢氧化钾的碱液来调节pH值。且，所述碱液的浓度过高实际上会导致产物降解，过低则调节速度太慢。因此，所述碱液的浓度一般为3-6mol/L。
进一步地，在一些优选实施例中，在去除所述多价阴离子的操作过程中，需保持液体环境具有一定的温度，此处所述的温度会影响沉淀的溶解度以及产物的稳定性。温度较高，产物的稳定性不好，容易发生降解，且磷酸盐沉淀的溶解度较高。温度较低，能耗增加。因此，综合考量，所述温度应该在0-45℃，优选为5-30℃，最佳温度为10-20℃。
在本发明第一方面的一个实施方案中，寡糖的分离纯化方法，去除所述可溶性蛋白的操作包括超滤。在一些优选实施例中，所述c)中，对发酵液或者反应液进行超滤，可以实现从所述发酵液或者反应液中去除分子量≥20kDa的可溶性蛋白。在一些优选实施例中，所述c)中，对发酵液或者反应液进行超滤，从所述发酵液或者反应液中去除分子量≥10kDa的可溶性蛋白；在一些优选实施例中，所述c)中，对发酵液或者反应液进行超滤，从所述发酵液或者反应液中去除分子量≥4kDa的可溶性蛋白。
在本发明第一方面的一个实施方案中，寡糖的分离纯化方法，包括去除阳离子的操作，以从不含细胞的发酵液、澄清化的裂解物或反应混合物中去除带正电荷的化合物。
因此，在一些实施例中，步骤c)中，所述从发酵液或者反应液中去除阳离子通过阳离子交换色谱法进行，所述阳离子交换色谱法的固定相为阳离子交换树脂，进一步优选为强酸性阳离子交换树脂，进行阳离子交换树脂处理以从不含细胞的发酵液、澄清化的裂解物或反应混合物中去除带正电荷的化合物。
在一些优选实施例中，所述阳离子交换树脂为强酸性阳离子交换树脂；可用的强酸性阳离子交换树脂包括H型或者Na型，优选H型树脂。示意性的，用于去除带正电荷的化合物的合适的阳离子交换树脂包括强酸性阳离子交换树脂，以及D113等弱酸性阳离子交换树脂；所述强酸性阳离子交换树脂尤指强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，比如：0017强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂、732强酸性阳离子交换树脂、
Figure BDA0003826727130000131
IR-120(或者AmberliteIR-120，CAS号9002-23-7)阳离子交换树脂、001×7强酸性苯乙烯系阳离子交换、732阳树脂、lewatit-100(如：德国朗盛离子交换树脂Lewatit MonoPlus S100)、Diaion SK-1(如：日本三菱阳离子交换树脂DIAION SK-1)。
在一些优选实施例中，去除所述阳离子的操作过程中同时采用碱液调节溶液的pH在5～9，优选PH在6～7。
在本发明第一方面的一个实施方案中，寡糖的分离纯化方法，包括去除阴离子的操作，以从不含细胞的发酵液、澄清化的裂解物或反应混合物中去除带负电荷的化合物。
因此，在一些实施例中，步骤c)中，所述从发酵液或者反应液中去除阴离子通过阴离子交换色谱法进行；所述阴离子交换色谱法的固定相为阴离子交换树脂，进一步优选为弱碱性阴离子交换树脂。
在一些优选实施例中，可用的弱碱性阴离子交换树脂可以选用OH型或者Cl型，优选OH型树脂。示意性的，合适的阴离子交换树脂包括D201、201*7、Amberlite IRA-400(CAS号：9002-24-8)、lewatit-M 500(比如：德国拜耳朗盛树脂
Figure BDA0003826727130000132
MonoPlus M500)、Diaion SA-10A(比如：三菱化学阴离子交换树脂凝胶型)等强碱性阴离子树脂，以及D301大孔弱碱性苯乙烯系I型阴离子交换树脂、D113、Amberlite-200(CAS号：12626-25-4)、lewatit-MP 500(比如：德国拜耳朗盛树脂
Figure BDA0003826727130000133
MonoPlus MP 500)、Diaion PA308(比如：三菱化学阴离子交换树脂多孔型)等弱碱性阴离子交换树脂。
在一些优选实施例中，在去除所述阴离子的操作过程中同时采用酸液调节溶液的PH在5～9，优选PH在6～8。
在本发明第一方面的一个实施方案中，对发酵液或者反应液进行产物类似物、多价阴离子去除操作后，分离纯化寡糖的方法还包括：步骤Ⅰ)对，经过b)处理后的发酵液或者反应液，进行固液分离处理；所述固液分离处理的方式包括过滤、微滤或离心。
在本发明第一方面的一个实施方案中，对发酵液或者反应液进行产物类似物、多价阴离子、可溶性蛋白、阳离子、阴离子等去除操作后，通常分离纯化寡糖的方法还包括：
步骤Ⅱ)，对经过c)处理后的发酵液或者反应液进行过滤处理，所述过滤方式优选纳滤；
对酶解底物或者副产物、去除沉淀物后超滤，并脱盐后的溶液进行纳滤处理。通过该步骤可以将溶液中还含有的一些离子、水解酶或者裂解酶处理后形成的小分子物质等进一步的降低和去除，进一步的降低最终产品中的杂质含量。
在一些实施例中，所述过滤处理方式优选纳滤；采用纳滤膜将溶液6进行纳滤浓缩同时可以去除残留的PH调节剂离子以及酶解后的单糖产物。纳滤膜的截留分子量应该介于目的寡糖分子量和杂质分子量之间；
纳滤膜的截留分子量应该介于目的寡糖分子量和杂质分子量之间。优选纳滤膜截留分子量小于500道尔顿。更优的，纳滤膜的截留分子量选用100～300道尔顿。
在本发明第一方面的一个实施方案中，寡糖的分离纯化方法，还包括一个或多个选自以下的处理步骤：
脱色处理；以及结晶，或醇沉，或冻干，或喷雾干燥处理。
在一些实施例中，包括步骤Ⅲ)，对经过Ⅱ)处理后的发酵液或者反应液进行脱色处理；优选利用活性炭进行脱色处理。进一步地，在一些实施例中，包括步骤Ⅳ)，经过Ⅲ)处理后的发酵液或者反应液进行结晶，或醇沉，或冻干，或喷雾干燥处理。
在本发明第一方面的一个实施方案中，本发明提供的寡糖的分离纯化方法包括以下步骤：
(1)定量发酵过程产生或者酶法反应残留的各产物类似物的量，向发酵液或者酶法反应液中加入适量的酶液来去除发酵过程产生或者酶法反应残留的产物类似物，获得含有目的寡糖的液体1；
(2)准确测定溶液中磷酸根离子的含量，通过1:1的摩尔比例，向溶液中加入金属离子来去除发酵液或者酶法反应液中的磷酸根离子。维持溶液的pH值为8-9，等待沉淀物析出，获得含有母乳低聚糖和沉淀物的溶液2；
(3)待沉淀物不再析出后，通过过滤、微滤或离心的方法将沉淀物从溶液中去除，获得含有母乳低聚糖的溶液3；
(4)采用超滤去除溶液3中的可溶性蛋白，获得含有母乳低聚糖的溶液4；
(5)去除溶液4中的阳离子，获得含有寡糖的溶液5；
(6)去除溶液5中的阴离子，获得含有寡糖的溶液6；
(7)将溶液6进行纳滤，获得含有高纯度目的寡糖的溶液7。
(8)将溶液7进行活性炭脱色处理，获得含有高纯度寡糖的浓溶液8；
(9)将溶液8进行处理，获得高纯度寡糖的晶体或者粉末。
在本发明第一方面的一个实施方案中，所述纯化工艺提供在制剂中的所需的寡糖，其中所述所需的寡糖的纯度为≥80％、≥85％、之90％、≥95％。所述工艺提供唾液酸化的低聚糖的制剂，其中寡糖的纯度适于食品和饲料应用。
基于上述，根据本发明第一方面任一实施方案的寡糖的分离纯化方法，其中所述寡糖包括中性母乳低聚糖和酸性母乳低聚糖(唾液酸化的母乳低聚糖)；包括乳糖基-N-四糖(LNT)、乳糖基-N-新四糖(LNnT)、乳糖-N-二岩藻糖六糖Ⅰ(LNDFHⅠ)、乳糖-N-二岩藻糖六糖Ⅱ(LNDFHⅡ)、乳糖-N-六糖(LNH)、乳糖-N-新六糖(LNnH)、3'-唾液酸乳糖(3’-SL)、6'-唾液酸乳糖(6’-SL)、6'-唾液酸乳糖胺(6’-SLN)、3'-唾液酸乳糖胺(3’-SLN)、3'-唾液酸-3-岩藻糖基乳糖(3’S3FL)、二唾液酸乳糖(DSL)、二唾液酸乳-N-四糖(DSLNT)、唾液酸乳糖-N-四糖a(LST a)、唾液酸乳糖-N-四糖b(LST b)、唾液酸乳糖-N-四糖c(LST c)、岩藻糖基二唾液酸乳糖-N-六糖Ⅰ(FDS-LNH-Ⅰ)、岩藻糖基二唾液酸乳糖-N-六糖Ⅱ(FDS-LNH-Ⅱ)等，但不局限于这些低聚糖。
根据本发明第二方面的一个实施方案，提供一种含有寡糖的制剂，其中所述寡糖通过以上任一所述的方法进行纯化所得。
在本发明第二方面的一个实施方案中，所述寡糖以≥80质量％的纯度存在于制剂中。在一些实施例中，所述寡糖以≥85质量％的纯度存在于制剂中。进一步地，在一些优选实施例中，所述寡糖以≥90质量％的纯度存在于制剂中。进一步地，在一些优选实施例中，所述寡糖以≥95质量％的纯度存在于制剂中。
所述工艺提供唾液酸化的低聚糖的制剂，其中寡糖的纯度适于食品和饲料应用。
根据本发明第三方面的一个实施方案，提供了以上任一所述的制剂用于制造营养组合物、优选婴儿配方物的用途。示例性婴儿配方物的组分包括如下：
表1婴儿配方物的组分信息
组分 每100g/组分g
能量 1800～2100KJ
蛋白质 10～20g
脂肪 10～30g
碳水化合物 50～70g
其中乳糖 42～58g
低聚半乳糖 1～3g
HMO 3.5～5.1g/L
其中2‘FL’ 1.8～2.4g/L
3FL 0.5～0.6g/L
LNT 0.85～1.15g/L
LNnT 0～0.2g/L
3’SL 0.05～0.28g/L
6’SL 0.12～0.4g/L
盐 0.4～0.6g
以下结合更加具体的实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。本发明的实质特点和显著效果可以从下述的实施例中得以体现，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，因此，它们并不对本发明作任何限制，本领域的技术人员根据本发明的内容做出一些非本质的改进和调整，均属于本发明的保护范围。
实施例1
采用酶法反应体系反应生成含有6'-唾液酸乳糖(6’SL)的酶法反应液；
参见图2为6’SL酶法合成的路线图。反应体系组成与条件：
100ml反应体系，内含：
80mM唾液酸，100mM乳糖，80mM ATP，Tris-HCl(pH 8.5，100mM)，60mM MgCl2，
NmCSS(CMP-唾液酸合成酶，Yu H,et al.,Bioorganic&MedicinalChemistry,2004,12,6427–6435)、Pd26ST(α-2,6-唾液酸转移酶，Sun M,et al.,BiotechnolLett.2008,30,671–676)、PPA(焦磷酸酶，Li L,et al.,Org.Lett.,2013,15,5528-5530)的浓度均为2μM；
37℃140rpm反应48hr。
该反应的转化率可以达到92％，最终6’SL的生成量为73.6mM，乳糖残留9.03g/L，唾液酸残留1.98g/L。其中，在多酶催化合成中，由于加入了PPA，导致每生成1分子的产物就会产生2分子的磷酸盐。该反应残留的底物和产物类似物为乳糖和唾液酸。
实施例2
从实施例1的酶法反应液中纯化6'-唾液酸乳糖，步骤如图3所示：
本实验室首先采用酶法反应体系反应生成6'-唾液酸乳糖，如图4所示反应完成。待反应完成后，直接向反应体系中加入10U/mL(终浓度)的N乙酰神经氨酸醛缩酶(本实验室表达)。N乙酰神经氨酸醛缩酶是一种裂解酶，能够有效的将反应结束后溶液中残留的N乙酰神经氨酸(唾液酸)降解为丙酮酸钠和N乙酰氨基葡萄糖，该步骤对应图5该反应在37℃反应3h后，调节溶液的pH值为5.0，调解反应温度至55℃后，加入2500ALU/L(终浓度)的β-半乳糖苷酶反应3h，该步骤对应图6β-半乳糖苷酶是一种糖苷酶，能够有效的将反应结束后溶液中残留的乳糖分解成为半乳糖和葡萄糖。本实验采用的β-半乳糖苷酶购自中诺生物科技发展江苏有限公司，为白色粉末状。其温度范围：5℃～65℃，最佳温度为55℃～60℃。pH有效范围为3.0～8.0，最佳pH为4.0～5.5。反应结束后将反应体系降温至20℃，之后准确测定溶液中磷酸根离子的含量为160mM,向溶液中加入等摩尔的氯化镁。之后调节pH至8.5，等待沉淀析出。待沉淀物不再析出后，再次调节溶液的pH值为8.5。再次待沉淀物不再析出以后，10000rpm离心去除沉淀，获得含有超过50g/L的6'-唾液酸乳糖溶液。测定该溶液中磷酸根的终浓度为9mM。
通过图5和图6的结果可以发现，N乙酰神经氨酸醛缩酶可以有效的将溶液中残留的唾液酸底物降解，而对6'-唾液酸乳糖分子上连接的唾液酸基团无降解作用。同样的，β-半乳糖苷酶仅能选择性地对乳糖产生水解作用，而对6'-唾液酸乳糖中非还原端的Gal(β1-4)Glu无水解作用。
通过超滤膜(截留分子量为5000道尔顿)，截留酶法反应体系中的蛋白质。
透过液依次通过强酸性阳离子交换树脂和弱碱性阴离子交换树脂。其中强酸性阳离子交换树脂的填料选用001*7。预处理方法为：酸-碱-酸的顺序进行处理，上样速度为每小时一倍床层体积流过。上样溶液为床层体积的五倍。其中弱碱性阴离子交换树脂的填料选用D301。预处理方法为：碱-酸-碱的顺序进行处理，上样速度为每小时一倍床层体积流过。上样溶液为床层体积的五倍。
将依次经过强酸性阳离子交换树脂和弱碱性阴离子交换树脂的流穿液进行纳滤，纳滤膜采用陶氏公司的NF270-4040。该步骤主要用于目的产物的浓缩，同时还能去除微量的反应体系中水解或者降解后的小分子产物、PH调节剂离子。纳滤最终将溶液浓缩至6'-唾液酸乳糖的浓度达到100g/L以上。
之后通过活性炭对纳滤截留液进行脱色处理。
采用冻干机冻干后获得6'-唾液酸乳糖的粉末。
本实施例2也适用于实施例1之外的其他多酶催化合成的唾液酸化寡糖。
实施例3
通过HPLC测定实施例2所得6'-唾液酸乳糖的纯度，如图7所示。
采用HPLC测定样品的纯度，色谱柱：XAmide，100A(4.6×250mm，5μm)(ACCHROM)。B-乙腈，C-100mM甲酸铵水溶液(pH3.2)。洗脱程序：0-20分钟，80％B-20％C到65％B-35％C。流速1mL/min。
将冻干后的6'-唾液酸乳糖产品配置成5g/L的浓度进行HPLC分析。经过外标法计算，冻干机冻干后获得6'-唾液酸乳糖的粉末的纯度可以达到96.3％。
实施例4
测定实施例2所得6'-唾液酸乳糖的灰分。
称取1g冻干后试样至于坩埚中，以小火加热使试样充分炭化至无烟，然后置于马弗炉中，在550±25℃灼烧4h。冷却至200℃左右，取出，放入干燥器中冷却30min至恒重，计算灰分含量(重量百分比g/100g，以下简称％)。
经过测定和计算，冻干后获得6'-唾液酸乳糖的粉末的灰分含量为5.2％。
实施例5
LC-MS鉴定6'-唾液酸乳糖的结构，如图8所示。
将冻干后的6'-唾液酸乳糖产品配置成0.5g/L的浓度进行LC-MS分析。
LC方法：色谱柱：Amide(2.1×150mm，2.5μm)(Waters)。B-乙腈，C-100mM甲酸铵水溶液(pH3.2)。洗脱程序：0-40分钟，80％B-20％C到65％B-35％C。流速0.3mL/min。
质谱方法：离子源电压：3.5KV，源温：150℃，碰撞电压37V，扫描范围200～1000m/z
实施例6
如图9所示，采用酶法反应体系反应生成含有LNT(中性HMOs)的酶法反应液。
反应体系组成与条件：100ml反应体系，50mM半乳糖，50mM乳糖，50mM的N-乙酰氨基葡萄糖，50mM UTP，50mM ATP，Tris-HCl(pH 8.0，100mM)，20mM MgCl2，0.5mg/mL NahK(LiY,et al,Molecules,2011,16,6396-6407)、0.5mg/mL GlmU(Chen Y,et al,Chem.Commun.,2011,47,10815-10817)、0.5mg/mL LgtA(Li Y,et al,Bioorganic&Medicinal Chemistry,2016,24,1696-1705)和0.5mg/mL PPA(Li L,et al.,Org.Lett.,2013,15,5528-5530)、0.5mg/mL GalK(Chen X,et al,J.Am.Chem.Soc.2001,123,2081-2082)、0.5mg/mL BLUSP(Muthana MM,et al,Chem.Commun.,2012,48,2728-2730)、0.5mg/mL WbgO(Liu X,et al,Bioorganic&Medicinal Chemistry,2009,17,4910-4915)，37℃140rpm反应48hr。该反应的转化率可以达到79％，最终LNT的生成量为27.95g/L，乳糖残留1.08g/L，半乳糖残留1.34g/L，N-乙酰氨基葡萄糖残留4.29g/L，中间产物LNTⅡ残留4.72g/L。
在该酶催化合成中，由于加入了PPA，导致每生成1分子的产物就会产生4分子量的磷酸根。该反应残留的底物和产物类似物为乳糖、N乙酰氨基葡萄糖、半乳糖和LNTⅡ。
实施例7
从实施例6的酶法反应液中纯化LNT。
待反应完成后，向溶液中加入5U/mL(终浓度)的β-N-乙酰氨基己糖苷酶(本实验室表达)，于37℃反应5h后，调节溶液的pH值为5.0，调解反应温度至55℃后，加入2500ALU/L(终浓度)的β-半乳糖苷酶反应3h。之后降温至20℃，之后准确测定溶液中磷酸根离子的含量为179mM,向溶液中加入等摩尔的氯化镁饱和溶液。之后调节pH至8.5，等待沉淀析出。待沉淀物不再析出后，再次调节溶液的pH值为8.5。再次待沉淀物不再析出以后，10000rpm离心去除沉淀，获得含有超过27.95g/L的LNT溶液。测定该溶液中磷酸根的终浓度为6.3mM。
通过超滤膜(截留分子量为5000道尔顿)，截留酶法反应体系中的蛋白质。
透过液依次通过强酸性阳离子交换树脂和弱碱性阴离子交换树脂。其中强酸性阳离子交换树脂的填料选用001*7。预处理方法为：酸-碱-酸的顺序进行处理，上样速度为每小时一倍床层体积流过。上样溶液为床层体积的五倍。其中弱碱性阴离子交换树脂的填料选用D301。预处理方法为：碱-酸-碱的顺序进行处理，上样速度为每小时一倍床层体积流过。上样溶液为床层体积的五倍。
将依次经过强酸性阳离子交换树脂和弱碱性阴离子交换树脂的流穿液进行纳滤，纳滤膜采用陶氏公司的NF270-4040。该步骤主要用于用于目的产物的浓缩，同时还能去除微量的反应体系中水解或者降解后的小分子产物、PH调节剂离子。纳滤最终将溶液浓缩至LNT的浓度达到100g/L以上。
之后通过活性炭对纳滤截留液进行脱色处理。
采用冻干获得LNT的粉末。
本实施例7也适用于实施例6之外的其他多酶催化合成的中性寡糖。
实施例8
通过HPLC测定实施例7所得LNT的纯度为95.1％，灰分为3.8％。
采用HPLC测定样品的纯度，色谱柱：Sugar-Pak Column，10μm,6.5mm×300mm，1/pk(Waters)。流动相为纯水，柱温80℃。流速0.5mL/min。进样体积：10ul。检测器为RID检测器。采用外标法定量。
结果如图10所示。
实施例9
本实施例提供一种含有寡糖的制剂，其中所述寡糖通过以上实施例1、实施例2所述的方法进行制备、纯化所得。
所述寡糖以≥95质量％的纯度存在于制剂中。
同时本实施例提供了将所述的制剂用于婴儿配方物的用途。婴儿配方物的组分包括如下：
表2婴儿配方物的组分信息
Figure BDA0003826727130000191
Figure BDA0003826727130000201
对比例1
本对比例，同样从实施例1的酶法反应液中纯化6'-唾液酸乳糖，区别之处在于：
仅仅向酶法反应液中加入β-半乳糖苷酶，而不再加入N乙酰神经氨酸醛缩酶；
其余同实施例2。
通过HPLC测定本对比例纯化所得6'-唾液酸乳糖的纯度为91.9％，灰分为5.21％。
对比例2
本对比例，同样从实施例1的酶法反应液中纯化6'-唾液酸乳糖，区别之处在于：
向酶法反应液中加入酶液处理后；不利用氯化镁对酶法反应液进行处理，然后直接进行可溶性蛋白、阳离子、阴离子的去除处理；且处理过程中仍然采用上样溶液为床层体积的五倍的上样量。其余同实施例2。
通过HPLC测定本对比例纯化所得6'-唾液酸乳糖的纯度为78.13％，灰分为24.61％。
对比例3
本对比例，同样从实施例1的酶法反应液中纯化6'-唾液酸乳糖，区别之处在于：
向酶法反应液中加入酶液处理后，准确测定溶液中磷酸根离子的含量为160mM，之后利用树脂进行磷酸根离子的去除，而不是向溶液中加入氯化镁来进行磷酸根离子的去除。
其余同实施例2。
事实上，为了使树脂流穿液中磷酸根离子的浓度降至和实施例2中树脂流穿液中磷酸根离子相同的浓度，需要反复19次采用D301(上样溶液为床层体积的五倍，同实施例2)树脂进行磷酸根离子的去除。之后纳滤获得含有超过100g/L的6'-唾液酸乳糖溶液。对比实施例2和对比例3，采用传统树脂去除磷酸根，替代本发明中的金属盐沉淀，对比例3中，该步骤产生的废水量是实施例的19倍。以处理1t酶法反应液来说明，采用实施例2的(即本发明)技术方案，多价阴离子的去除过程中产生的废水量为2.8t，而对比例3多价阴离子的去除过程中，产生的废水量为53.2t。
通过HPLC测定本对比例纯化所得6'-唾液酸乳糖的纯度为96.4％。

Claims (13)

1.一种寡糖的分离纯化方法，其特征在于，
对发酵液或者反应液进行分离纯化处理，
所述处理包括以下步骤：
a)去除产物类似物；
所述产物类似物包括：分子量低于待纯化的寡糖的分子量的化合物；
b)去除多价阴离子；
所述多价阴离子主要包括磷酸根离子；
c)去除可溶性蛋白；
去除阳离子；
去除阴离子。
2.根据权利要求1所述寡糖的分离纯化方法，其特征在于，
所述a)中，利用水解酶对发酵液或者反应液进行处理，去除所述产物类似物；或者，
所述a)中，利用裂解酶对发酵液或者反应液进行处理，去除所述产物类似物；或者
所述a)中，利用水解酶、裂解酶对发酵液或者反应液进行处理，去除所述产物类似物。
3.根据权利要求2所述寡糖的分离纯化方法，其特征在于，
所述水解酶为糖苷水解酶，所述水解酶的终浓度为1～50U/mL或500～5000ALU/L；
所述裂解酶为N乙酰神经氨酸醛缩酶或者唾液酸裂解酶，所述裂解酶的终浓度为1～50U/mL。
4.根据权利要求1～3任一所述寡糖的分离纯化方法，其特征在于，
所述b)中，利用金属离子对发酵液或者反应液进行处理，去除所述多价阴离子；
所述金属离子的添加浓度为5-1000mM；优选为100-500mM，进一步优选为100-400mM。
5.根据权利要求4所述的寡糖的分离纯化方法，其特征在于，
所述金属离子包括钙离子、镍离子、钴离子、锌离子、铜离子、铅离子、锰离子、镁离子、铝离子、铁离子、钡离子、银离子中的任意一种或者一种以上；
所述金属离子以含有该金属离子的盐的溶液的方式加入；
所述盐的溶液的浓度为该金属盐溶液对应的饱和溶液的浓度。
6.根据权利要求4所述的寡糖的分离纯化方法，其特征在于，
使b)处理过后的发酵液或者反应液pH在6～12，优选为7～10，进一步优选为8～9。
7.根据权利要求5所述的寡糖的分离纯化方法，其特征在于，
所述c)中，对发酵液或者反应液进行超滤；
优选进行从所述发酵液或者反应液中去除分子量≥20kDa的可溶性蛋白的超滤，更优选进行从所述发酵液或者反应液中去除分子量≥10kDa的可溶性蛋白的超滤，最优选进行从所述发酵液或者反应液中去除分子量≥4kDa的可溶性蛋白的超滤。
8.根据权利要求5所述的寡糖的分离纯化方法，其特征在于，
c)中，所述从发酵液或者反应液中去除阳离子通过阳离子交换色谱法进行；
优选地，所述阳离子交换色谱法的固定相为阳离子交换树脂，进一步优选为强酸性阳离子交换树脂；
c)中，所述从发酵液或者反应液中去除阴离子通过阴离子交换色谱法进行；
优选地，所述阴离子交换色谱法的固定相为阴离子交换树脂，进一步优选为弱碱性阴离子交换树脂。
9.根据权利要求8所述的寡糖的分离纯化方法，其特征在于，
还包括一个或多个选自以下的处理步骤：
Ⅰ)对，经过b)处理后的发酵液或者反应液，进行固液分离处理；
所述固液分离处理的方式包括过滤、微滤或离心；
Ⅱ)对，经过c)处理后的发酵液或者反应液进行过滤处理，所述过滤方式优选纳滤；
采用纳滤膜进行纳滤浓缩同时可以去除残留的pH调节剂离子以及酶解后的单糖产物，纳滤膜的截留分子量应该介于目的寡糖分子量和杂质分子量之间；
优选纳滤膜截留分子量小于500道尔顿。更优的，纳滤膜的截留分子量选用100～300道尔顿。
10.根据权利要求9所述的寡糖的分离纯化方法，其特征在于，
还包括一个或多个选自以下的处理步骤：
Ⅲ)对经过Ⅱ)处理后的发酵液或者反应液进行脱色处理；优选利用活性炭进行脱色处理；
Ⅳ)对经过Ⅲ)处理后的发酵液或者反应液进行结晶，或醇沉，或冻干，或喷雾干燥处理。
11.根据权利要求1～10任一所述的寡糖的分离纯化方法，其特征在于，其中所述寡糖包括中性母乳低聚糖和酸性母乳低聚糖；或者，
所述寡糖包括乳糖基-N-四糖(LNT)、乳糖基-N-新四糖(LNnT)、乳糖-N-二岩藻糖六糖Ⅰ(LNDFHⅠ)、乳糖-N-二岩藻糖六糖Ⅱ(LNDFHⅡ)、乳糖-N-六糖(LNH)、乳糖-N-新六糖(LNnH)、3'-唾液酸乳糖(3’-SL)、6'-唾液酸乳糖(6’-SL)、6'-唾液酸乳糖胺(6’-SLN)、3'-唾液酸乳糖胺(3’-SLN)、3'-唾液酸-3-岩藻糖基乳糖(3’S3FL)、二唾液酸乳糖(DSL)、二唾液酸乳-N-四糖(DSLNT)、唾液酸乳糖-N-四糖a(LSTa)、唾液酸乳糖-N-四糖b(LSTb)、唾液酸乳糖-N-四糖c(LSTc)、岩藻糖基二唾液酸乳糖-N-六糖Ⅰ(FDS-LNH-Ⅰ)、岩藻糖基二唾液酸乳糖-N-六糖Ⅱ(FDS-LNH-Ⅱ)中的一种或者几种。
12.含有寡糖的制剂，其中所述寡糖已通过权利要求1～11中任一项所述的方法进行纯化；且，所述寡糖以≥90％(质量)的纯度存在于制剂中。
13.根据权利要求12中所述的制剂用于制造营养组合物、优选婴儿配方物的用途。
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