KR102301469B1 - 갈락토-올리고당의 제조 - Google Patents

갈락토-올리고당의 제조 Download PDF

Info

Publication number
KR102301469B1
KR102301469B1 KR1020167008953A KR20167008953A KR102301469B1 KR 102301469 B1 KR102301469 B1 KR 102301469B1 KR 1020167008953 A KR1020167008953 A KR 1020167008953A KR 20167008953 A KR20167008953 A KR 20167008953A KR 102301469 B1 KR102301469 B1 KR 102301469B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
lactose
immobilized
galactosidase
gos
galacto
Prior art date
Application number
KR1020167008953A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20160082973A (ko
Inventor
프레데릭 벤자민스
린치우 카오
안토니우스 아우구스티누스 브록하이스
Original Assignee
프리슬랜드캄피나 네덜란드 비.브이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 프리슬랜드캄피나 네덜란드 비.브이. filed Critical 프리슬랜드캄피나 네덜란드 비.브이.
Publication of KR20160082973A publication Critical patent/KR20160082973A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102301469B1 publication Critical patent/KR102301469B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
    • C07H3/06—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/08—Reducing the nucleic acid content
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/087—Acrylic polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
    • C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C13—SUGAR INDUSTRY
    • C13K—SACCHARIDES OBTAINED FROM NATURAL SOURCES OR BY HYDROLYSIS OF NATURALLY OCCURRING DISACCHARIDES, OLIGOSACCHARIDES OR POLYSACCHARIDES
    • C13K5/00—Lactose

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Abstract

본 발명은 갈락토-올리고당(GOS)의 효소적 제조에 관한 것이다. (i) 락토오스 공급물을 고정화 β-갈락토시다제(EC 3.2.1.23) 와 접촉시킨 다음, (ii) GOS 합성을 수행하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 락토오스 공급물은 결정성 락토오스의 수성 슬러리인, 락토오스로부터 갈락토-올리고당(GOS)를 제조하는 방법이 제공된다.

Description

갈락토-올리고당의 제조 {Production of galacto-oligosaccharides}
본 발명은 갈락토-올리고당(GOS)의 제조방법에 관한 것이다.
올리고갈락토실락토오스, 올리고갈락토오스, 올리고락토오스 또는 트랜스갈락토올리고당 (TOS)으로도 또한 알려진 GOS는 중요한 식품 성분이다 [1]. GOS는 그의 비소화성 특성 때문에 프리바이오틱스의 그룹에 속한다.
프리바이오틱스(prebiotics)는 결장에서 유익한 박테리아의 성장 및/또는 활성을 자극하여 숙주에 유익하게 영향을 미치는 비소화성 식품 성분으로 정의된다. 유아용 조제유에 첨가될 때, 박테리아 숫자뿐 아니라 대장 미생물총의 대사작용에 대하여 모유의 비피더스생성 효과(befidongenic effect)를 복제할 수 있는 GOS의 능력은 다양한 식품 및 의약품 프로세스에서 이들의 생산 및 적용에 대한 관심이 현저하게 증가하였다. 예를 들면, GOS는 유아용 조제유 내지 위독한 질병용 식품 범위의 유아 및 성인용 식품 등의 상업적으로 시판중인 제품에서 발생한다.
그의 명칭이 제안하는 바와 같이, GOS 합성은 전형적으로 갈락토실 공여체로서 락토오스를 사용하고 갈락토실 수용체로서 락토오스 또는 중간체 GOS종을 사용하는, β-갈락토시다제(β-D-갈락토하이드롤라제; EC 3.2.1.23)에 의해 촉매되는 다수의 갈락토실 전달 프로세스를 포함한다.
기본적인 메카니즘은 반응도식 1에 도시된다. 요컨대, 효소 및 갈락토실 공여체 (락토오스, β-D-Galp-(1,4)-β-D-Glcp)는 초기에는 일시적 갈락토실-효소 복합체(En--Galp) 및 다음에 진정한 공유 갈락토실-효소 복합체 (En--Galp)를 형성하고, 이들은 복합체로부터 글루코오스 (분자 (β-D-Galp)를 방출한다. 그 후에, 또 다른 갈락토실 수용체 (락토오스, β-D-Galp-(1,4)-β-D-Glcp 또는 다른 GOS 종)은 활성 중심에서 복합체에 결합하고, 일반적으로 그의 비환원 말단 (갈락토오스의 갈락토실 부분)을 갖는 이러한 갈락토실-효소 복합체 (En-Galp)상에 친핵성 공격을 수행하며, 따라서 일반적으로 β-D-Galp-(1→n)-β-D-Galp-(1,4)-β-D-Glcp 생성물로서 표현되는 DP3 GOS 종을 형성하게 되며, 여기서 n은 글리코시드 결합의 위치를 나타내며, 이것은 효소의 공급원 및 적용된 반응조건에 따라 2, 3, 4, 또는 6일 수 있다.
Figure 112016032774611-pct00001
반응도식 1. β-1,4 글리코시드 결합에 의한 락토오스의 β-갈락토시다제-촉매화 신장에 의한 GOS 합성 메카니즘의 개략적 도시
반응이 진행함에 따라 (반응도식 1 참조), 더 많은 글리코실 부분이 기존의 GOS 종으로 이동하여, 상이한 중합도(DP)를 갖는 GOS 종의 형성을 유도한다. 따라서 GOS는 일반적으로 (Gal)m-Glc로 표현될 수 있다 (여기서 m은 통상적으로 효소의 공급원 및 적용된 반응조건에 따라 2 내지 9로 변화한다). ≥DP3 GOS 종과 별도로, 알로락토오스와 같은 새로운 DP2 종은 통상적으로 β-갈락토시다제의 트랜스갈락토실화 작용의 주요 생성물로서 고려된다. β-갈락토시다제의 트랜스갈락토실화에 의해 형성된 이들 새로운 DP2 종은 더 높은 DP GOS 종의 형성에 더욱 참여할 수 있으며, 따라서 하기 논의되는 바와 같이 GOS 생성물 스펙트럼을 복잡하게 한다.
효소 β-갈락토시다제가 식품 및 유제품 업계에서 다수의 적용용도를 가지고 있지만, 효소의 적당한 안정성은 산업적 규모로 생체 촉매의 일반적인 실시를 방해하는 제한요소 중의 하나이다. 촉매로서 이들의 완전한 잠재력을 탐색하기 위한 연구들은 효소 안정화를 위한 다양한 적절한 전략을 야기하였다. 예를 들면, 효소는 상이한 지지체 상에 물리적 흡수, 포착 및 공유결합 방법 등의 다양한 방법에 의해 고정화되었다. 고정화는 또한 β-갈락토시다제의 생성 억제을 감소시키는 유리한 효과를 갖는 것으로 나타났다. 추가로, 효소의 고정화는 GOS 합성 방법의 효소 재사용성 및 연속조작을 용이하게 한다.
β-갈락토시다제-촉매화 GOS 합성이 동력학적으로 제어된다는 것은 잘 알려져 있다 [2]. 이것은 시간내에 특정 지점에서 형성된 갈락토-올리고당의 실제량이 락토오스 및/또는 GOS의 원하는 합성 반응대 및 원하지 않는 가수분해반응의 상대속도에 따라 크게 달라진다는 것을 의미한다. 이것은 갈락토오스 농도 뿐만 아니라 형성되는 GOS 종에 따라 달라지며, 더욱더 합성 및 가수분해를 초래하는 생성물과 효소의 상호작용에 따라 달라진다.
따라서, 다양한 GOS종은 추가의 GOS 합성용 수용체로서 뿐만 아니라, 가수분해용 기질로서 사용될 수 있다. GOS 농도의 피크를 통과하고, 반응 혼합물 중의 주요 기질 락토오스 농도가 낮은 값으로 감소되는 경우에, 가수분해 반응은 일반적으로 반응의 마지막 단계에서 좌우할 것이다. 다른 한편, 생성 억제는 또한 더 많은 생성물이 축적할 때 발생할 수 있으며, 이는 GOS 합성 또는 GOS 가수분해의 억제를 초래한다.
다양한 인자들은 β-갈락토시다제를 사용하여 락토오스로부터 GOS 합성의 수율을 증가시키는 것으로 당업계에 알려져 있다. GOS의 생산, 특성 및 용도에 대한 검토는 Torres 등을 참조한다. 트랜스갈락토실화를 위한 반응조건은 반응 매체중에 높은 갈락토오스 농도, 높은 온도 및 낮은 수분활성이어야 한다. 기질의 온도, 농도 및 효소 기원은 올리고당의 효소 합성에 중요한 역할을 한다. 그러나 초기 락토오스 농도의 영향은 훨씬더 클 수 있다. 고농축 출발 락토오스 용액의 사용에 관하여, 최대 GOS 수율은, 농도범위가 30% 내지 40% (w/w)일 때까지, 주로 초기 락토오스 농도에 크게 영향을 받는 것으로 나타났다. 일반적으로 더 많은 더 큰 갈락토-올리고당(GOS)은 더 높은 초기 갈락토오스 농도로 생산할 수 있다. 락토오스 용해도는 실온에서 비교적 낮지만 온도 증가에 따라 명백히 증가하기 때문에, 높은 온도가 일반적으로 바람직하다.
더 높은 온도는 더 높은 올리고당 수율에 유익할 수 있다. 더 높은 온도에서 더 높은 수율은 높은 초기 락토오스 농도에서 및 계속해서 높은 온도에서 조작할 때 추가적인 이점이다. 다른 한편, GOS의 합성을 위한 고정화 베타-갈락토시다제의 잠재성, 예를 들면 효율적인 리사이클링, 용이한 취급 및 공정 제어에 의한 효소의 가격 기여를 낮추고, 연속 공정을 가능하게 한다는 것은 널리 인지되어 있다. 그러나 GOS의 생산을 위한 고정화 베타-갈락토시다제의 산업적 용도는 아직 보고되어 있지 않다. Urretia 등에 의한 연구의 실시예에서는, 반복되는 배치 조작 중에 높은 효소 투여량 (락토오스의 ~18% (w/w))를 사용하여 50% (w/w) 락토오스 용액 중에 60℃에서 반응을 수행할 때 재사용 가능한 것으로 나타났다.
따라서, GOS 합성은 일반적으로 높은 GOS 수율을 달성하고 가수분해 부반응을 줄이기 위하여 높은 초기 락토오스 농도에 의한 조건하에 고정화 효소를 사용하여 수행하는 것이 바람직하다 [3,4,5].
그러나 본 발명자들은 연구의 설정 중에 수행된 최적화 연구로부터 얻어진 결과들이, 예를 들면 식품 산업에서, 산업적 규모로 GOS 합성을 위한 양호한 지표를 제공하지 않으며, 여기서 비교적 낮은 효소 농도 (및/또는 더 작은 용적의 고정화 효소) 및 긴 (＞20 시간) 배양 기간이 높은 생산성 및 높은 공시 수율(space-time yield)을 달성하기 위하여 통상 경제적 이유 때문에 사용된다는 것을 밝혀냈다. 특히 본 발명자들은 반복되는 배치 조작중에 60 ℃에서 GOS 합성을 위한 락토오스 공급물로서 고농도 (55% w/w) 락토오스 용액의 사용이 제2 사이클의 조작 후에 고정화 효소의 초기 활성 LU의 약 90% 손실을 초래하였다는 것을 관찰하였다.
[비특허문헌]
1. Rivero-Urgell M and Santamaria-Orleans A (2001) Oligosaccharides: application in infant food. Early Human Development 65 Suppl. S43-S52
2. Torres D, Goncalves M, Teixeira J, Rodrigues L: Galacto-oligosaccharides: production, properties, applications, and significance as prebiotics. Compr Rev Food Sci, Food Safety 2010, 9:438-454.
3. Urrutiaa P, Mateob C, Guisan JMWilson, Illanes LA (2013)Immobilization of Bacillus circulans β-galactosidase and its application in the synthesis of galacto-oligosaccharides under repeated-batch operation. Biochemical Engineering Journal 77:41-48
4. Panesar PS, Panesar R, Singh RS, Kennedy JF and Kumar H (2006) Microbial production, immobilization and applications of β-D-galactosidase. Journal of Chemical Technology and Biotechnology J Chem Technol Biotechnol 81:530-543
5. Grosova Z., Rosenberg M., Rebros M. (2008) Perspectives and applications of immobilised β-galactosidase in food industry industry - a review. Czech J. Food Sci., 26: 1-14
6. Gaur R, Pant H, Jain R, Khare SK: Galacto-oligosaccharide synthesis by immobilized β-galactosidase. Food Chem. 2006, 97, 426-430.
7. Cao L:Immobilized Enzymes. In Comprehensive Biotechnology (Second Edition) 2011, 2:461-476.
따라서 본 발명자들은 높은 GOS 수율과 비용 효율적인 조작을 희생하지 않고 상당한 효소 활성을 유지하면서 고정화 효소의 반복되는 재사용을 가능하게 하는 산업적 규모로 GOS 합성을 위한 개선된 반응조건을 개발하는데 착수하였다.
놀랍게도, 락토오스 공급물로서 용해된 락토오스의 고농축 용액 대신에 결정성 락토오스의 슬러리를 사용하여 상술한 목적들이 달성될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 더욱 구체적으로, 초기 LU 효소 활성의 20% (하기 정의된 바와 같이 LU로서 측정)는 55% w/w의 락토오스 슬러리가 58℃에서 24 시간 동안 고정화 효소로 배양하였을 때 제3차 반응 사이클 후에 유지되었다. 최종 GOS 함량은 초기 6개의 배치 중에 60%(dm) 이상이었다. 임의의 이론으로 구속받고 싶지 않지만, 고온에서 완전한 용해에 의해 제조된 통상적인 고농축 락토오스 용액은 "메타 안정한" 용액으로 간주될 수 있으며 장기간 배양 중에 더 낮은 반응온도에서 재결정화를 수행할 것으로 추정된다. 이것은 효소 담체의 구멍에서 및 표면상에서 락토오스 결정 형성의 원인이 되며, 이것은 추측건대 접근성 감소 뿐만 아니라 고정화 효소의 비활성화 (변성)을 유도한다. 놀랍게도, 이것은 "미리-결정화된" 락토오스의 현탁액을 사용하여 회피할 수 있으며, 여기서 락토오스 결정은 기질 풀(substrate pool)로서 작용하며 또한 용해된 락토오스는 효소 담체의 구멍에 자유롭게 접근할 수 있다. 따라서, 효소 변성은 결정화된 락토오스를 더 높은 온도로 미리 가열함으로써 완전하게 락토오스를 용해할 필요 없이 "미리-결정화된" 락토오스의 사용에 의해 방해될 수 있다.
따라서 본 발명은, 락토오스로부터 갈락토-올리고당(GOS)를 제조하는 방법으로서, 락토오스 공급물을 바람직하게는 고체 담체 상에 고정화된 β-갈락토시다제와 접촉시킨 다음, GOS 합성을 수행하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 락토오스 공급물은 결정성 락토오스의 수성 슬러리인, 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "수성 슬러리"는 불용성 락토오스 결정들의 수상 혼합물 (현탁액), 즉 락토오스가 전혀 용해되지 않고 가용성 락토오스 농도가 소정의 반응온도에서 그의 용해도와 동일한 조성물을 언급한다. 상기 지적한 바와 같이, 락토오스 용해도는 온도에 강력하게 의존한다. 도 1은 중성 pH에서 물 중에 락토오스의 용해도-온도 관계를 도시한다.
전형적으로, 본 발명에서 사용하기 위한 수성 락토오스 슬러리는 17%-75% (w/w) 락토오스를 함유한다. 실제로, 슬러리 중에 높은 락토오스 함량은 반응기에서 농축된 생성물을 생기게 할 수 있으며, 이것은 75% (w/w)의 완성된 GOS 시럽을 얻기 위하여 더욱 농축하는데 더 적은 에너지를 필요로 한다. 따라서 경제적 이유 및 매우 양호한 GOS 수율을 위해, 락토오스 슬러리는 총 50-70 % (w/w)의 락토오스를 함유하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 수성 락토오스 슬러리는 적어도 53% (w/w), 바람직하게는 적어도 55% (w/w)의 락토오스를 함유한다. 효소 안정성을 희생시키지 않고 반응 혼합물의 총 건조물질 함량을 증가시킴으로써, 본 발명의 방법은 반응기 용적당 매우 높은 생산성 및 GOS 출력을 제공한다.
본 발명에서 사용하기 위한 슬러리는 수성 액체에 결정성 락토오스 (일수화물)을 첨가함으로써 용이하게 제조된다. 당업자는 락토오스 용해도 곡선에 기초하여 소정의 온도에서 슬러리를 얻기 위해 필요한 락토오스 농도를 계산할 수 있을 것이다. 예를 들면, 다음의 경험식을 이용하여 소정의 반응온도(T)에서 가용성 락토오스를 계산할 수 있다.
락토오스의 용해도 =
Figure 112016032774611-pct00002
따라서 58℃에서 락토오스 용해도는 35.6% (w/w)인 것으로 계산되었다. 따라서 퍼센트 불용성 락토오스 결정은 58℃에서 락토오스 용해도로 감산된 락토오스 농도일 것이다. 이렇게 하여, 반응 시스템에 존재하는 불용성 락토오스 결정의 퍼센트는 19.4% (55% 마이너스 35.6%) (w/w)인 것으로 계산된다.
전형적으로, 적절한 량의 락토오스는 실온에서 완충용액에 직접 첨가되며 원하는 반응온도로 가열된다. 또한 물에 락토오스를 첨가한 다음, 락토오스 슬러리의 pH를 예를 들면 가성(NaOH) 또는 완충용액을 첨가하여 효소 활성 범위내에 있는 약 pH 3.5 - 7.5의 작용 pH 범위로 조절할 수 있다.
당업자는 개개의 고정화 베타-갈락토시다제의 최적 pH는 그의 공급원 및 고정화 방법의 유형에 따라 달라지며 또한 이것은 효소 전환 중에 감소할 수도 있다. 따라서 pH는 예를 들면 가성 용액을 적가하거나 또는 pH 스타트 모드(stat mode)를 통해 효소 전환 중에 조절할 필요가 있을 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 고농축 락토오스 용액을 사용하는 통상적인 방법과 대조적으로, 본 발명의 방법은 락토오스를 완전하게 용해하기 위해 락토오스의 대규모 가열을 필요로 하지 않는다. 이것은 에너지 소비를 감소시키고 이에 따라 가열 단계와 관련된 조작 비용을 감소시킬 뿐만 아니라, 더욱 황색 외관으로 락토오스 용액의 바람직하지 않는 색상 변화를 피할 수 있다.
그러나, 실질적으로, 락토오스 결정 중에 존재할 수 있는 인산칼슘 또는 시트르산 칼슘 등의 불용성 광물 염 또는 불용성 단백질 집합물을 제거하기 위하여 락토오스를 완전하게 용해하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서 물론 락토오스 공급물을 고온(T1)으로 가열시켜 락토오스를 용해하고 상술한 바와 같이 불용성 입자를 제거한 다음 원하는 반응온도(T2)로 냉각시켜 용해된 락토오스를 결정화시킴으로써 락토오스 슬러리를 제조할 수 있다. 이하에 나타낸 바와 같이, > 58 %(w/w)의 완전히 가용화된 락토오스 용액을 가열한 다음, 약 60℃의 온도로 냉각시키면 락토오스의 자발적인 결정화를 초래하였다.
양호한 결정의 형성 및 결정 성장은 락토오스의 추출 및 정제에 중요하다. α-락토오스는 93.5℃ 이하의 온도에서 과포화 용액으로부터 결정화하여 다양한 결정 형상을 생성한다. 얻어진 통상적인 형상은 프리즘과 토마호크 형상(tomahawk shape)과 유사하며, 단단하고 난용성이다. 93.5℃ 이상에서, β-락토오스는 통상 불균일한 양면 다이어몬드로서 결정화된다. 물의 분자는 락토오스의 α-형태와 관련되어 있으며, 따라서 일수화물로서 언급된다. 그러나 120℃ 이상의 온도 및 진공하에, 이 물은 상실되며 또한 고흡습성 α-락토오스 및 무수물이 형성된다. 락토오스가 물에 용해되는 경우, 변선광(mutarotation)이 발생하며, 즉 α- 및 β-아노머(anomer)는 상호변환하여 20℃에서 62.7 % β-락토오스의 용액을 생성한다. α-락토오스는 훨씬 적은 용해성의 종이기 때문에, 용액의 농도는 α-락토오스 침전을초래하며 또한 추가의 변선광이 발생하여 동일한 평형 위치를 유지한다.
본 발명의 방법은 바람직게는 식품 등급 및 의약품 등급 락토오스, 또는 식품과 의약품 등급 락토오스 사이의 정제된 락토오스의 용도를 포함한다. 식품등급 락토오스는 유청 또는 투과액 (유청 단백질 농축물 생산의 부산물)을 과포화 용액으로 농축하여 락토오스를 결정화한 다음, 락토오스 결정을 제거하고 건조시킴으로써 제조된다. 결정화 뿐만 아니라 분쇄 및 분리 체질의 특별한 공정은 입도 분포가 상이한 락토오스의 형태를 생성한다. 오늘날, 당업계에서는 모든 적용용도를 위해 초미세부터 매우 거친 결정에 이르기까지 여러가지 유형의 락토오스를 제공한다. 락토오스 함량은, 건조 기준으로, 99% 이상이며, 황산 회분 함량은 0.3 % 이하이다. 10% 용액의 pH는 4.5 이상 또는 7.5 이상이다.
정제된 또는 의약품 등급의 락토오스를 얻기 위하여, 정제 공정이 필요하다. 이것은 락토오스 결정을 재용해하고 상기 용액을 새로운 활성 탄소로 처리하는 단계를 포함하며, 이것은 리보플라빈을 포함한 다수의 용질 및 다양한 단백질을 흡수한다. β-카제인으로부터 유도된 프로테아제 펩톤으로 알려진 폴리펩티드 그룹도 또한 흡수된다. 이들 펩톤은, 소의 유방에서 혈류로부터 밀크로 이동하는 프로테아제 효소인 플라스민의 작용에 의해 생성된다. 추가의 단백질은 액체 pH를 임시로 조절하여 활성탄에 흡수할 수 있다. 탄소는 응집 및 여과에 의해 제거하여 버린다. 결정화에 이어서, 원심분리 및 냉수 세척 및 건조에 의한 결정들의 후속 분리 후에, 고순도 백색 의약품 등급 락토오스가 얻어진다. 결정을 밀링하거나 체질하여 특정의 입도 분포를 갖는 생성물을 수득한다.
락토오스 슬러리를 고정화 베타-갈락토시다제 함유 제제로 접촉시킨 후에, 수득된 반응 혼합물을 GOS 합성에 유리한 조건하에 배양한다. 당업자는 선택된 반응 온도가 GOS 합성 및 효소 안정성에 둘다 유리해야 하는 것으로 이해할 것이다. 따라서 최적 온도는 고정화 효소를 경제적으로 최적의 방법으로 재사용을 할 수 있는 온도이며, 예를 들면 고정화 효소의 반감기가 개개의 선택된 고정화 베타-갈락토시다제에 도달할 때 고정화 효소를 처분한다. 전형적으로 GOS 합성은 약 20 내지 약 60℃의 반응 온도에서 수행한다, 일 실시형태에서, 반응은 40 내지 60℃, 바람직하게는 약 50℃에 유사한 45 내지 55℃에서 수행한다.
반응 혼합물은 원하는 량의 GOS가 얻어질 때까지 배양된다. 배양조건 및 고정화 효소의 사용량에 따라, 본 발명에 따른 GOS 합성은 일반적으로 0.5 내지 100 시간 진행시킨다. 그러나 GOS의 산업적 생산은 일반적으로 예를 들면 정제, 탈염, 변색 등, 수반된 조작의 다른 단위와 합리적인 통합을 필요로 한다. 따라서 산업적 규모로 GOS 합성은 실제적이고 경제적인 이유로 적어도 6 또는 10 시간, 바람직하게는 12 내지 36 시간의 반응시간 동안 수행하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 높은 GOS 수율 및 효소 안정성 증가 때문에, 본 발명의 방법은 약 18 내지 24 시간의 배양시간을 사용하여 적절하게 실시된다. 이것은, 반응기 중에 다량의 고정화 효소가 생산성 및 공시 수율을 감소할 것이기 때문에, 다량의 효소의 필요성을 제거함과 동시에 종업원의 근무일에 유연한 대응을 허용한다.
예를 들면, 고정화 베타-갈라토시다제의 투여량은 초기 락토오스 30 LU/그램 이하, 바람직하게는 25 LU/그람 이하의 량으로, 더욱 바람직하게는 약 10 내지 20 LU/그램의 량으로 사용할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 하나의 락토오스 단위 (LU)는 40℃, pH 6.0에서 반응의 초기 단계에서 분당 글루코오스 1 μmol을 유리하는 효소의 량으로 정의된다. 락토오스가 락타아제에 의해 가수분해되는 경우, 이것은 글루코오스 및 갈락토오스로 전환된다. 락타아제 활성은 유리된 글루코오스의 량을 측정하여 결정한다.
본 발명에서 개시된 바와 같이 락토오스 "슬러리" 반응을 사용하여 GOS 합성을 수행하기 위한 몇 가지 방법이 있다. 제 1 실시형태에서, 슬러리는 별도의 반응기에 넣고 불용성 락토오스 결정을 마이크로필터로 유지시킨다. 다음에 가용성 락토오스를 고정화 베타-갈락토시다제가 위치하는 충전층 반응기(PBR)로 펌핑한다. PBR의 출구는 반응기로 다시 돌아온다. 이렇게 하여 일정 시간 후에 락토오스를 완전히 용해하여 높은 GOS 농도를 얻을 수 있다.
제2 실시형태에서는, 락토오스 결정을 GOS 용액에 서서히 첨가한다. 락토오스을 용해하고 PBR에 펌핑하여 용해된 락토오스를 GOS로 전환한다.
제3 실시형태에서는 모든 불용성 락토오스 결정을 반응 혼합물을 교반하면서 일단 첨가하여 어떤 어려움이 발생하지 않도록 한다. 예를 들면, 락토오스 결정을 직접 기존의 반응 혼합물에 첨가하여, 용해되어 완전히 GOS로 전환된 초기에 존재하는 락토오스 결정을 보충한다. 반응이 진행함에 따라 락토오스 결정의 소실/용해의 시각적인 검출시, 더 많은 락토오스 결정을 첨가하여 높은 예를 들면 75% 이하의 GOS 용액이 얻어질 수 있을 때까지 반응을 계속한다.
이해되는 바와 같이, 본 발명의 방법은 미생물, 식물 및 동물 등의 다양한 공급원으로부터 베타-갈락토시다제를 사용하여 실시할 수 있다. 박테리아, 진균 및 효모 같은 미생물은 산업적 적용을 위한 베타-갈락토시다제의 바람직한 공급원으로 생각된다. 적절한 미생물 공급원의 개요는 Ranesar 2010을 참조한다. 바람직하게는, 베타-갈락토시다제는 에이. 오리재 (A. oryzae), 에이. 니게르(A. niger), 비. 시르쿨란스(B. circulans), 에스. 싱굴라리스(S. singularis), 티. 아쿠아트쿠스(T. aquatcus), 케이. 락티스(K. lactis), 케이. 마르시아누스(K. marxianus) 및 이. 콜라이(E. coli.)로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물로부터 분리된다. 효소의 일부는 결합의 특이적 쇄 및 배열의 올리고당을 합성하기 위해 높은 특이성을 갖는다. 예를 들면 비. 시르쿨란스(B. circulans)를 발생원으로 하는 β-갈락토시다제는 β-1,4 결합에 높은 특이성을 나타내며 또한 트랜스글리코실화에 의해 β-1,4 결합 갈락토실 올리고당 (GOS)을 주로 생성하며, 또한 아스페르길루스 오리재(Aspergillus oryzae)를 발생원으로 하는 β-갈락토시다제는 β-1,6 GOS를 주로 생성한다. 매우 양호한 결과는 비. 시르쿨란스(B. circulans) 베타-갈락토시다제로 얻었으며, 이것은 상업적 효소 제제 Biolacta®N5의 형태로 일본 아마노 다이와 카세이로부터 입수가능하다.
본 발명의 방법은 락토오스 슬러리를 고정화 베타-갈락토시다제로 배양하는 것을 특징으로 한다. 효소 고정화의 다양한 방법은 당업계에 알려져 있다. 이들 방법은 전형적으로 다공성 캐리어를 포함하며, 그 위에 베타-갈락토시다제가 공유결합을 통해, 물리적 흡수 (전하-전하 또는 반데르 발스 상호작용)을 통해, 겔 캡슐화를 통해 또는 그의 조합을 통해 고정화된다. Panesar 2010의 표 2는 베타-갈락토시다제의 상이한 공급원 및 고정화 방법의 개요를 제공한다. 그 외에, 담체- 불함유 고정화 효소 예컨대 CLEC (cross-linked enzyme crystals) 또는 CLEAs (cross-linked enzyme aggregates)이 또한 적용될 수 있다 [6,7].
본 발명은 특정 형태의 효소 고정화로 한정되는 것이 아니다. 그러나 효소의직접 공유결합을 촉진할 수 있는 담체가 조작의 용이성 및 반응 혼합물 중에 효소 분자의 누출 없음 측면에서 바람직하다.
이하에 도시된 바와 같이, 양호한 결과는 고체 담체에 공유결합에 의해 고정화된 베타갈락토시다제로 얻었다. 바람직하게는, 고체 담체는 활성화 아크릴계 중합체, 바람직하게는 기능화된 폴리메타크릴레이트 매트릭스이다. 예를 들어, 헥사 메틸렌 디아민-기능화 폴리메타크릴레이트 매트릭스 (Sepabeads) 또는 Eupergit C 250 L 같은 거대 아크릴에폭시활성화 수지가 사용될 수 있다.
반응을 원하는 수준으로 진행된 후, GOS 합성은 당업계에 공지된 방법에 의해 종료될 수 있다. 예를 들어, 고정화된 베타갈락토시다제는 여과에 의해 또는 반응기의 하부에 설치된 체에 의해 고정화 효소의 입자를 유지시켜 반응 혼합물의 나머지로부터 물리적으로 분리된다.
본 명세서에서 상술한 바와 같이, 본 발명의 방법은 GOS 합성의 몇 가지 연속적인 배치("사이클")를 수반하는 반복 배치 조작 시스템에서 유리하게 사용된다. 더욱이, 본 발명의 방법은 GOS 합성 반응 중에 락토오스 결정화의 해로운 효과가 락토오스 공급원으로서 락토오스 슬러리의 사용에 의해 회피되기 때문에 여러가지 배치 중에 고정화 효소의 재사용을 가능하게 한다. 이것은 효소의 반연속적 조작 및 복수 재사용을 가능하게 한다.
따라서 일 실시형태에서 방법은, 제1 사이클의 GOS 합성 이후에, (a) 고정화 베타-갈락토시다제를 세척하는 단계, (b) 임의로 고정화 베타-갈락토시다제를 추가로 사용할 때까지 저장하는 단계, 및 (c) 효소가 재사용될 수 있도록 단계 (a)의 세척된 고정화 베타-갈락토시다제를 락토오스 슬러리와 접촉시켜 하나 이상의 다음 사이클의 GOS 합성을 행하는 단계를 추가로 포함한다.
효소 세척 전에, 이것은 전형적으로 GOS-함유 반응 혼합물로부터 물리적으로 분리된다. 예를 들면, GOS 합성을 위해 사용되는 효소가 "티-백"(tea-bag) 유사 주머니에 사용되는 경우, 티-백은 단순히 반응 혼합물로부터 추출할 수 있다. 대안적으로, GOS는 고정화 효소가 세척 중에 반응기에 잔류하면서 반응기로부터 제거할 수 있다.
예를 들면, 효소는 GS 합성 반응에 사용되는 동일 완충액 및/또는 탈염수로여러번 세척한다. 고정화 효소는 살균처리하여, 예를 들면 pH 약 4.5의 초산 용액으로 세척하여 미생물수를 감소시킬 수 있다. 효소는 10℃ 이하의 온도에서, 바람직하게는 4℃ 부근에서 완충액에 저장할 수 있다. 적절한 완충액은 pH 5.5 내지 7.5 범위의 것을 포함한다. 예를 들면, 효소는 재사용 전에 4℃에서 0.1M K2HPO4/KH2PO4 완충액, pH 6.0 내지 7.0에서 저장한다. 하나의 실시형태에서, 본 발명의 방법은 재사용된 고정화 베타-갈락토시다제를 사용하여 적어도 5, 바람직하게는 적어도 8, 더욱 바람직하게는 적어도 10 사이클의 GOS 합성을 포함한다.
추가의 양상에서, 본 발명은 결정성 락토오스의 수성 슬러리를 포함하고 고체 담체 상에 고정화되는 베타-갈락토시다제를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 락토오스 농도, 효소 공급원 및 효소 농도는 본 명세서에서 앞서 기술되어 있다.
도 1: 락토오스 용해도 및 온도 곡선
도 2: 락토오스 공급물로서 락토오스 슬러리 (■) 또는 락토오스 용액 (◆)을 사용하여 고정화된 베타-갈락토시다제 EC-HA 촉매화 GOS 합성의 활성 지속성의 비교.
실험부문
본 명세서에서 하기 실시예는 고정화 베타-갈락토시다제를 사용하여 GOS의 제조에서 고농도 락토오스 용액 대신에 락토오스 슬러리를 이용하는 유리한 이점을 예시한다.
실시예 1 (비교 실시예): 락토오스 용액(55%)를 사용하여 바실루스 시르쿨란스(Bacillus circulans) 로부터 고정화 β-갈락토시다제에 의한 GOS의 합성
실험조건
35g의 락토오스를 25 그램 0,1M K2HPO4 / KH2PO4 완충액, pH 6.3에 첨가하고 95℃에서 완전히 용해한 다음, 58℃로 냉각하였다. 그 후, 특이적 활성의 131.16 LU/그램 고정화 효소와 결합하는 글루타르알데히드를 통해 상업적 담체(Sepabeads EC-HA)에 고정화된 2.7 그램 담체 결합 효소를 첨가하여 효소반응을 개시하였다. 효소 투여량은 10.2 LU/그램 락토오스이다.
반응시간 24 시간 후, GOS를 여과하고 고정화 효소를 탈염수로 세척하고 재사용 전에 4℃에서 0.1M K2HPO4/KH2PO4 완충액, pH 6.0 내지 7.0에서 저장하였다.
탄수화물 (갈락토오스, 글루코오스, 락토오스 및 GOS)를 Coulier et al. (J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 8488-8495) 및 Warmerdam et al. (Appl Biochem Biotechnol (2013) 170:340-358)에 의해 앞서 기술된 바와 같이 분석하였다.
제1 배치 및 제2 배치 후 잔류 효소 활성 및 GOS 수율은 표 1에 요약하였다. 특히 고정화 효소의 잔류 활성은 초기 LU의 단지 5.4%이었으며, 이는 고정화 효소가 빠르게 변성되었음을 제시한다.
완전히 용해된 락토오스 용액중에 고정화 베타-갈락토시다제를 이용한 GOS 합성의 요약
고정화 효소/배치번호 시간
[h] 		GOS 및 당 조성
[% on dm] 		각 배치 후 활성 지속성[%]
갈락토오스 글루코오스 락토오스 GOS
100
EC-HA-
배치 1		 24 2.86 23.71 16.02 57.41 26.1
EC-HA-
배치 2		 24 1.39 21.27 28.13 49.21 5.4
실시예 2: 본 발명의 락토오스 슬러리 (55% w/w) 반응 시스템에서 바실루스 시르쿨란스 로부터 고정화 β-갈락토시다제에 의한 GOS의 합성
실험조건
70 그램의 락토오스는 51 그램 0,1M K2HPO4 / KH2PO4 완충액, pH 6에 직접 첨가한 다음, 반응 혼합물을 반응온도 58℃로 가열하고 (적어도 1시간 유지시키고) 그 후, 특이적 활성의 141.8 LU/그램 고정화 효소와 결합하는 글루타르알데히드를 통해 상업적 담체(Sepabeads EC-HA)에 고정화된 12 그램 담체 결합 효소를 첨가하여 효소 반응을 개시시켰다. 효소 투여량은 15.2 LU/그램 락토오스이다.
24시간 반응시간 후, GOS를 여과하고 고정화 효소를 탈염수로 세척하고 재사용 전에 4℃에서 0.1M K2HPO4/KH2PO4 완충액, pH 6.0-7.0 용액에 저장하였다.
연속 모드에서 락토오스 슬러리 (55% w/w)중 바실루스 시르쿨란스로부터 고정화 β-갈락토시다제에 의한 GOS 합성의 요약
고정화 효소/배치 번호 반응 시간 [h] GOS 및 당 조성
[% on dm]		 LU
배치 후 잔류 활성[%]
갈락토오스 글루코오스 락토오스 GOS
100
배치 1 24 3.77 22.00 4.11 69.00 57.3
배치 2 24 5.31 24.46 3.44 65.38 30.1
배치 3 24 1.74 20.87 9.53 66.94 19.6
배치 4 24 1.28 18.88 12.03 67.03 11.7
배치 5 24 0.99 18.76 17.90 61.59 10.6
배치 6 24 0.74 18.16 25.77 54.59 7.3
배치 7 24 0.68 16.14 29.21 53.16 7.0
배치 8 24 0.65 16.54 32.63 48.93 3.8
실시예 3 (비교 실시예): 락토오스 슬러리 (65% w/w) 반응 시스템을 사용하여 바실루스 시르쿨란스 로부터 유리 β-갈락토시다제에 의한 GOS의 합성
실험 조건
85 그램의 락토오스를 65 그램 0,1M K2HPO4 / KH2PO4 완충액, pH 6에 직접 첨가한 다음, 반응 혼합물을 반응온도 58℃로 가열시키고 (적어도 1시간 동안 유지시키고) 2 ml 데미 워터에 용해된 바이오락타(Biolacta) N5 (Amano)의 85 mg 유리 베타-갈락토시다제를 첨가하여 반응을 개시하였다. 효소 투여량은 5 LU/그램 락토오스이다.
반응 혼합물을 오비탈 쉐이커(orbit shaker)로 워터 배치 중에 배양하였다. 24시간 반응 후에, 최종 반응 혼합물 중에 GOS 함량은 단지 40%이었으며 또한 반응 혼합물에 많은 불용성 락토오스가 아직도 존재하였다. 이것은 높은 락토오스 농도 슬러리 시스템에서 유리 효소는 고정화 효소보다 활성이 더 적다는 것을 제시한다.
실시예 4: 락토오스 슬러리 (65% w/w) 반응 시스템에서 바실루스 시르쿨란스 (담체-에폭시 Eupergit C 250 L) 로부터 β-갈락토시다제에 의한 GOS의 합성
Eupergit C 250 L 상의 바이오락타 N5의 8 그램 고정화 β-갈락토시다제를 20 mM 시트르산 칼륨과 함께 200 그램의 락토오스 슬러리에 첨가하고 60℃에서 배양하였다. 반응 혼합물을 자석 교반기로 교반하였다. 효소 투여량은 7 LU/그램 락토오스이다.
24 시간 후에, 반응 혼합물은 완전히 투명하고 GOS 함량은 57%인 것으로 밝혀졌다.
이러한 결과는 높은 슬러리 농도 및 고정화 효소의 조합이 산업적 공정에서 GOS 합성에 이상적이며: (i) 락토오스를 완전히 용해할 필요가 없고, 또한 (ii) 반응기로부터 생성물의 농도가 최종 생성물 (GOS 시럽, 75% (w/w))의 농도에 근접할 때 최종 생성물의 농도의 더 적은 에너지 소모가 있음을 제시한다.

Claims (15)

  1. 락토오스로부터 갈락토-올리고당(GOS)를 제조하는 방법으로서,
    (ⅰ) 실온에서 락토오스 결정을 수상에 용해시켜, 적어도 55 %(w/w)의 락토오스를 함유하는 결정화된 락토오스 수성 슬러리를 준비하는 단계;
    (ⅱ) 상기 결정화된 락토오스 수성 슬러리를 실온에서 20 내지 60 ℃ 사이의 원하는 반응온도로 가열하는 단계; 및
    (ⅲ) 상기 가열되고 결정화된 락토오스 수성 슬러리를 다공성 담체 상에 고정화된 바실러스 시르쿨란스(B. circulans) 유래 β-갈락토시다제(EC 3.2.1.23)와 접촉시키는 갈락토-올리고당을 합성하는 단계;를 포함하는 락토오스로부터 갈락토-올리고당(GOS)를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 결정화된 락토오스 수성 슬러리가 53 내지 75 %(w/w)의 식품 등급 또는 의약품 등급 락토오스를 함유하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 결정화된 락토오스 수성 슬러리가 적어도 55 %(w/w)의 락토오스를 함유하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결정화된 락토오스 수성 슬러리의 pH가 pH 3.5 내지 7.5인 방법.
  5. 삭제
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (ⅱ)의 가열하는 단계는 40 내지 60℃의 반응온도에서 수행되는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (ⅲ)의 갈락토-올리고당을 합성하는 단계는 적어도 6시간 수행되는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 고정화된 바실러스 시르쿨란스(B. circulans) 유래 β-갈락토시다제(EC 3.2.1.23)가 초기 락토오스 g 당 30 LU 이하로 사용되는 것인 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 β-갈락토시다제가 상기 다공성 담체 상에 공유결합을 통해 고정화되는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 다공성 담체는 활성화 아크릴 중합체 담체인, 방법.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 사이클의 갈락토-올리고당 합성 후에,
    (a) 상기 고정화된 바실러스 시르쿨란스(B. circulans) 유래 β-갈락토시다제(EC 3.2.1.23)를 물 또는 완충액으로 세척하는 단계,
    (b) 임의로, 상기 세척되고 고정화된 β-갈락토시다제를 추가로 사용할 때까지 저장하는 단계, 및
    (c) 상기 세척되고 고정화된 β-갈락토시다제를 가열되고 결정화된 락토오스 수성 슬러리와 접촉시켜 적어도 하나 이상의 다음 사이클의 갈락토-올리고당 합성을 수행하여 상기 고정화된 β-갈락토시다제를 재사용하는 단계;를 추가로 포함하고,
    상기 가열되고 결정화된 락토오스 수성 슬러리는 (ⅰ) 실온에서 락토오스 결정을 수상에 용해시켜, 적어도 55 %(w/w)의 락토오스를 함유하는 결정화된 락토오스 수성 슬러리를 준비하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 결정화된 락토오스 수성 슬러리를 실온에서 20 내지 60 ℃ 사이의 원하는 반응온도로 가열하는 단계;에 의해 제조되는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 재사용된 고정화된 β-갈락토시다제를 사용하여 적어도 5 사이클의 갈락토-올리고당 합성을 수행하는 방법.
  15. 삭제
KR1020167008953A 2013-09-05 2014-09-04 갈락토-올리고당의 제조 KR102301469B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP13183222.2 2013-09-05
EP13183222 2013-09-05
PCT/NL2014/050604 WO2015034356A1 (en) 2013-09-05 2014-09-04 Production of galacto-oligosaccharides.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160082973A KR20160082973A (ko) 2016-07-11
KR102301469B1 true KR102301469B1 (ko) 2021-09-13

Family

ID=49117728

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167008953A KR102301469B1 (ko) 2013-09-05 2014-09-04 갈락토-올리고당의 제조

Country Status (10)

Country Link
US (1) US10590448B2 (ko)
EP (1) EP3041945B1 (ko)
JP (2) JP6796489B2 (ko)
KR (1) KR102301469B1 (ko)
CN (1) CN105612258B (ko)
AU (1) AU2014315818B2 (ko)
DK (1) DK3041945T3 (ko)
ES (1) ES2641498T3 (ko)
PL (1) PL3041945T3 (ko)
WO (1) WO2015034356A1 (ko)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201518007D0 (en) * 2015-10-12 2015-11-25 Promovita Ingredients Ltd Manufacture of polymeric sugars
CN105441365B (zh) * 2015-12-31 2019-05-31 南通励成生物工程有限公司 一种产β-半乳糖苷酶的菌株
US20220000949A1 (en) * 2018-09-25 2022-01-06 National Cerebral And Cardiovascular Center Antitumor effect potentiator
EP3890499A4 (en) 2018-12-03 2022-11-23 DuPont Nutrition Biosciences ApS USING LACTASE TO PROVIDE HIGH GOS FIBER AND LOW LACTOSE
CN113226063A (zh) * 2019-01-02 2021-08-06 菲仕兰坎皮纳荷兰公司 用来自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶制备GOS制剂的方法、由此获得的GOS制剂及其用途
EP3960870A4 (en) * 2019-03-29 2023-06-07 Ajinomoto Co., Inc. PROCESS FOR PRODUCTION OF ALLOLACTOSE
CN111849940B (zh) * 2020-07-28 2022-03-25 量子高科(广东)生物有限公司 一种β-半乳糖苷酶的制备方法及其应用
EP4101301A1 (de) 2021-06-08 2022-12-14 DMK Deutsches Milchkontor GmbH Verfahren zur herstellung von galactooligosacchariden
EP4249600A1 (de) 2022-03-24 2023-09-27 DMK Deutsches Milchkontor GmbH Galactooligosaccharid-zubereitungen mit gelförmiger konsistenz
EP4385333A1 (de) 2022-12-15 2024-06-19 DMK Deutsches Milchkontor GmbH Kalorienarme lebensmittel
EP4385332A1 (de) 2022-12-15 2024-06-19 DMK Deutsches Milchkontor GmbH Kalorienarme süssspeisen
CN116926147A (zh) * 2023-07-19 2023-10-24 安徽天凯生物科技有限公司 一种制备乳糖和低聚半乳糖的方法和装置

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU569612B2 (en) 1984-04-16 1988-02-11 Fmc Corporation Process and apparatus to hydrolyse lactose to glucose and galactose
JPH03216185A (ja) * 1990-01-17 1991-09-24 Unitika Ltd ビフイドバクテリウム菌増殖促進剤の製造方法
JP2970932B2 (ja) * 1990-03-16 1999-11-02 サントリー株式会社 新規耐熱性β―ガラクトシル基転移酵素、その製造法及びその用途
RU2108044C1 (ru) * 1994-04-19 1998-04-10 Всероссийский научно-исследовательский институт маслоделия и сыроделия Способ производства сиропа гидролизованной лактозы
JP3856959B2 (ja) * 1998-08-10 2006-12-13 大和化成株式会社 小麦粉食品製造における新規な品質改善および保存方法
US7166451B1 (en) 2003-02-24 2007-01-23 The Ohio State University Immobilization of enzyme on a fibrous matrix

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biochemical Engineering Journal, Vol. 77, pp. 41-48 (2013.04.26.)
Food Chemistry, Vol. 115, pp. 92-99 (2009.)*
International Journal of Food Properties, Vol. 10, pp. 163-171 (2007.)

Also Published As

Publication number Publication date
CN105612258B (zh) 2020-10-16
ES2641498T3 (es) 2017-11-10
CN105612258A (zh) 2016-05-25
US20160194675A1 (en) 2016-07-07
AU2014315818B2 (en) 2017-10-12
KR20160082973A (ko) 2016-07-11
PL3041945T3 (pl) 2017-12-29
EP3041945A1 (en) 2016-07-13
JP2016529912A (ja) 2016-09-29
AU2014315818A1 (en) 2016-03-17
JP6796489B2 (ja) 2020-12-09
NZ717489A (en) 2021-10-29
JP2019213532A (ja) 2019-12-19
DK3041945T3 (en) 2017-10-09
US10590448B2 (en) 2020-03-17
EP3041945B1 (en) 2017-08-23
WO2015034356A1 (en) 2015-03-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102301469B1 (ko) 갈락토-올리고당의 제조
EP3714060B1 (en) Process for the purification of a sialic acid from a fermentation broth
WO2018228246A1 (zh) 一种酶法制备谷胱甘肽的方法
AU2008267279B2 (en) Novel prebiotics
CN106086126B (zh) 一种酶催化合成谷胱甘肽的方法
WO2014086373A1 (en) Crystallisation of human milk oligosaccharides (hmo)
EP0873995B1 (en) Crystalline 1-kestose and process for preparing the same
CN109266707B (zh) 一种制备聚唾液酸的方法
WO2023103543A1 (zh) 一种核酸酶p1的制备方法
JPH082903B2 (ja) 醗酵法で製造されたリボフラビンの精製法
NZ717489B2 (en) Production of galacto-oligosaccharides.
JP3365644B2 (ja) α−Ｄ−グリコシルカスガマイシン、その製造法およびそれを含有する抗菌剤
JPH04341193A (ja) ペプチド又はその塩の取得方法
JPH08119986A (ja) シアル酸またはその類縁体の精製方法
JPH04237497A (ja) 難消化性デキストリンの製造法
JPH06102672B2 (ja) シアル酸の製造法
JPS58190388A (ja) ビフイドバクテリウム菌の増殖促進物質の製造法
JP3871371B2 (ja) ３’ガラクトオリゴ糖含有糖組成物の製造方法
JP3630378B2 (ja) ガラクトシルグリセロール類の製造方法
CN115286666A (zh) 一种寡糖的分离纯化方法及应用
CN114507263A (zh) 一种β-烟酰胺单核苷酸的脱盐方法
CN116615203A (zh) 改进的益生元制剂
JPH01228491A (ja) 高級ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法
JPH03175990A (ja) オリゴ糖組成物及びその製造法
PL205572B1 (pl) Sposób enzymatyczny wytwarzania mieszanin fruktooligosacharydów przeznaczonych do celów spożywczych i farmaceutycznych

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant