CN117030773A - 一种二叔丁基氯甲基磷酸酯的核磁定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种二叔丁基氯甲基磷酸酯的核磁定量检测方法，通过核磁方法检测二叔丁基氯甲基磷酸酯；配置含有1,3,5‑三甲氧基苯内标储备液，将其加入到样品溶液中，加热溶解后，用于核磁检测。本发明的有意效果是：利用核磁定量法即可完成低浓度二叔丁基氯甲基磷酸酯的检测，该检测方法操作简单，检测速度快、分析时间短、检测结果准确性高，克服了现有技术不能用色谱和质谱等方法检测药物中二叔丁基氯甲基磷酸酯含量的难题；本检测方法的准确性经专属性、定量限与检出限、精密度等试验验证，准确可靠。
Description
技术领域
本发明属于检测技术领域，尤其是涉及一种二叔丁基氯甲基磷酸酯的核磁定量检测方法。
背景技术
二叔丁基氯甲基磷酸酯属于基因毒性杂质中的一种。基因毒性杂质是指能直接或者间接损害DNA，导致基因突变或具有致癌倾向的位置。二叔丁基氯甲基磷酸酯是BRL-186616合成过程中使用到的原料之一，很容易残留在BRL-186616产物中，不利于BRL-186616药物安全性。
近年来，EMEA、FDA、ICH等相继发布了针对基因毒性杂质的指导原则。基因毒性杂质限度要求很低，其分析检测的难度较大。高效液相色谱法是药物分子中最常用的分离分析手段，但是由于二叔丁基氯甲基磷酸酯紫外吸收弱，沸点高的特点，HPLC方法不能满足基因毒性杂质限度低的要求。LC-MS/MS法是常用的基因毒性杂质检测方法，但二叔丁基氯甲基磷酸酯无明显质谱信号，无法达到检测要求。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种二叔丁基氯甲基磷酸酯的核磁定量检测方法。
本发明采用的技术方案是：一种二叔丁基氯甲基磷酸酯的核磁定量检测方法，以1,3,5-三甲氧基苯为内标，通过核磁方法检测二叔丁基氯甲基磷酸酯。
优选地，具体检测步骤为：
步骤一：配置内标储备液，取1,3,5-三甲氧基苯，加DMSO溶解制备得到内标储备液；
步骤二：配制二叔丁基氯甲基磷酸酯对照品溶液，取二叔丁基氯甲基磷酸酯，加入DMSO溶解，用DMSO和内标储备液适量稀释得到对照品溶液；
步骤三：配制样品溶液，取供试品，加入内标储备溶液和DMSO，加热溶解，制备得到样品溶液；
步骤四：将步骤二和三制备得到的溶液在核磁中进样检测；
步骤五：定内标峰面积为100，对二叔丁基氯甲基磷酸酯峰进行标峰，按外标法以峰面积计算二叔丁基氯甲基磷酸酯的含量。
优选地，步骤一中内标储备液浓度为0.5mg/ml；步骤二中对照品溶液浓度为28μg/ml。
优选地，步骤四中核磁检测条件为检测序列zg，扫描次数8次，延迟时间15秒。
优选地，步骤三中，取供试品约17.5mg，精密加入内标储备溶液100μl，DMSO 400μl加热溶解。
二叔丁基氯甲基磷酸酯的核磁定量检测方法在评价BRL-186616安全性方法中的应用。
本发明具有的优点和积极效果是：利用核磁定量法即可完成低浓度二叔丁基氯甲基磷酸酯的检测，该检测方法操作简单，检测速度快、分析时间短、检测结果准确性高，克服了现有技术不能用色谱和质谱等方法检测药物中二叔丁基氯甲基磷酸酯含量的难题；本检测方法的准确性经专属性、定量限与检出限、精密度等试验验证，准确可靠。
附图说明
图1为本发明实施例专属性稀释剂图；
图2为本发明实施例专属性对照品鉴别溶液图；
图3为本发明实施例专属性供试品鉴别溶液图；
图4为本发明实施例专属性内标溶液图；
图5为本发明实施例专属性对照品溶液图；
图6为本发明实施例专属性供试品加标溶液图；
图7为本发明实施例5中二叔丁基氯甲基磷酸酯线性图；
图8 本发明实施例定量限溶液检测结果；
图9 本发明实施例检出限溶液检测结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例做出说明。
本发明涉及一种二叔丁基氯甲基磷酸酯的核磁定量检测方法，以1，3，5-三甲氧基苯为内标，通过核磁方法实现对二叔丁基氯甲基磷酸酯的定性和定量。
具体检测方法如下：
步骤一：内标储备液的配制：取1,3,5-三甲氧基苯适量，精密称定，加DMSO溶解稀释至浓度为0.5mg/ml；
具体可取1,3,5-三甲氧基苯约10mg，精密加入DMSO 1.0ml溶解，精密移取50μl，精密加入DMSO 950μl，摇匀。
步骤二：二叔丁基氯甲基磷酸酯对照品溶液的配制：取二叔丁基氯甲基磷酸酯对照品适量，精密称定，精密加入DMSO溶解，加DMSO及内标储备液适量稀释成含二叔丁基甲基磷酸酯浓度为28μg/ml、1，3，5-三甲氧基苯20μg/ml的对照品溶液；
具体可取二叔丁基氯甲基磷酸酯对照品约14mg，精密称定，精密加入DMSO 1.0ml溶解，精密移取10μl，精密加入DMSO 990μl混匀，精密移取100μl，精密加入内标储备溶液100μl、DMSO 300μl混匀。
步骤三：样品溶液的配制：取供试品约17.5mg，精密加入内标储备溶液100μl，DMSO400μl加热溶解。
步骤四：将步骤二和三制备得到的溶液在核磁中进样检测；
检测条件为：检测序列zg，扫描次数8次，延迟时间15秒。
步骤五：二叔丁基氯甲基磷酸酯含量的计算：定内标峰面积为100，对二叔丁基氯甲基磷酸酯峰进行标峰，按外标法以峰面积计算二叔丁基氯甲基磷酸酯的含量。
将1，3，5-三甲氧基苯作为定量用的内标，核磁定量检测后，通过内标来确定CMDBP的峰面积，本方法能够实现低浓度二叔丁基氯甲基磷酸酯的检测，能够有效控制二叔丁基氯甲基磷酸酯在BRL-186609中间体中的残留量，进而控制BRL-186616成品中二叔丁基氯甲基磷酸酯的残留量来进一步保证药物的安全性。
下面以一组实施例为例，结合附图对本发明方案做出说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。
本组实施例中仪器为核磁共振波谱仪，型号BRUKER AVIII 400MHz。核磁定量分析方法的测试条件：NS=8，D1=15。定TMS峰为0ppm，选择1,3,5-三甲氧基苯6.09ppm附近的峰为定量峰，峰面积定为100，对CMDBP 1.44ppm处甲基峰进行积分。
1,3,5-三甲氧基苯：批号：10220667，来源：阿法埃莎（中国）化学有限公司，纯度99%；
二叔丁基氯甲基磷酸酯（CMDBP，下文简称CMDBP）对照品：CAS：229625-50-7，含量95%，化学式C9H20ClO4P，来源：厦门市博瑞来医药科技有限公司；
BRL-186609，批号：BE101-099-5、BE101-098-5 、BE101-097-5，其中BE101-099-5用于方法学验证，来源：厦门市博瑞来医药科技有限公司；
BRL-186616，批号：BE079-025-11、BE034-261-1，来源：厦门市博瑞来医药科技有限公司。
实施例1：样品中二叔丁基氯甲基磷酸酯含量的检测
本发明提供的核磁定量法测定BRL-186609中二叔丁基氯甲基磷酸酯含量测定方法，包括如下步骤：
（1）稀释剂：DMSO；
（2）内标储备溶液：取1,3,5-三甲氧基苯约10mg，精密加入DMSO 1.0ml溶解，精密移取150μl，精密加入DMSO 850μl，摇匀；
（3）对照品储备溶液：取CMDBP约14mg，精密加入DMSO 1.0ml溶解，精密移取10μl，精密加入DMSO 990μl混匀，配制成浓度为140μg/ml的对照品储备溶液；
（4）对照品鉴别溶液：精密移取对照品储备溶液100μl，精密加入DMSO 400μl混匀；
（5）供试品鉴别溶液：取供试品适量，精密加入DMSO 0.5ml加热溶解；
（6）对照品溶液：精密移取对照品储备溶液100μl，内标储备溶液100μl，精密加入DMSO 300μl混匀；
（7）供试品溶液：取供试品约17.5mg，精密加入内标储备溶液100μl，DMSO 400μl加热溶解；
（8）供试品加标溶液：取供试品约17.5mg，精密加入内标储备溶液100μl，对照品储备溶液100μl，DMSO 300μl加热溶解；
（9）样品检测：将步骤（1）、（4）~（8）得到的溶液在核磁定量中进样检测；
（10）二叔丁基氯甲基磷酸酯含量的计算：按外标法以峰面积计算二叔丁基氯甲基磷酸酯的含量。
得到的稀释剂图、对照品鉴别溶液图、供试品鉴别溶液图、内标溶液图、对照品溶液图、供试品加标溶液图；分别如图1~图6所示，结果表明，稀释剂和内标在二叔丁基氯甲基磷酸酯出峰位置处无干扰，满足要求。按外标法以峰面积计算样品中二叔丁基氯甲基磷酸酯含量。样品中二叔丁基氯甲基磷酸酯含量计算公式如下：
二叔丁基氯甲基磷酸酯含量=A样*V样/F*m样
式中：A样：供试品溶液中二叔丁基氯甲基磷酸酯峰面积；
V样：供试品溶液配制体积；
F响应：二叔丁基氯甲基磷酸酯响应因子；
按下面公式计算二叔丁基氯甲基磷酸酯响应因子：
式中：
A：对照品溶液中二叔丁基氯甲基磷酸酯峰面积；
C：对照品溶液中二叔丁基氯甲基磷酸酯浓度（mg/ml）。
3批样品中二叔丁基氯甲基磷酸酯含量见表1。
表1 样品检测结果
实施例2：专属性实验
考察空白溶液、内标溶液和样品溶液中其它成分对色谱峰是否干扰。
空白溶液：DMSO；
内标储备溶液：取1,3,5-三甲氧基苯约10mg，精密加入DMSO 1.0ml溶解，精密移取150μl，精密加入DMSO 850μl，摇匀。
对照品储备溶液：取CMDBP约14mg，精密加入DMSO 1.0ml溶解，精密移取10μl，精密加入DMSO 990μl混匀，配制成浓度为140μg/ml的对照品储备溶液。
对照品溶液：精密移取对照品储备溶液100μl，内标储备溶液100μl，精密加入DMSO300μl混匀。
样品溶液：取供试品约17.5mg，精密加入内标储备溶液100μl，DMSO 400μl加热溶解。
取空白溶液、对照品溶液、样品溶液测试氢谱。
从图1-图6可以看出，空白溶液及样品溶液不干扰待测成分。
实施例3：系统精密度实验
取浓度为28μg/ml对照品溶液连续进样6次，记录色谱图，计算二叔丁基氯甲基磷酸酯峰面积RSD。将连续6次进样的二叔丁基氯甲基磷酸酯峰面积RSD列于表2，从表2中可知，二叔丁基氯甲基磷酸酯峰面积RSD为0.8，小于2%。因此，本方法系统精密度良好。
表2 精密度检测结果
实施例4：定量限与检出限
定量限溶液配制：取CMDBP对照品适量，用内标溶液稀释至浓度为2.77μg/ml，连续进样6次，考察CMDBP甲基峰信噪比及6次进样峰面积的RSD。
可接受标准：CMDBP甲基峰信噪比应不小于10，且连续6针进样峰面积RSD应不大于5%。
结果如图8所示，定量限溶液甲基峰信噪比均大于10，峰面积RSD为4.3%，符合要求。具体结果见表3。
表3 定量限结果
结论：定量限溶液浓度为2.77μg/ml，相当于限度水平的9.9%。
检出限溶液配制：取CMDBP对照品适量，用内标溶液稀释至浓度为1.39μg/ml，连续进样3次，考察CMDBP甲基峰信噪比。
可接受标准：连续进样3次，检出限CMDBP甲基峰信噪比大于3。
结果如图9所示，检出限溶液信噪比均大于3，符合要求，具体结果见表4。
表4 检出限结果
结论：检出限溶液浓度为1.39μg/ml，相当于限度水平的4.9%。
实施例5：线性与范围
配制浓度分别为2.77μg/ml、13.86μg/ml、27.71μg/ml、41.57μg/ml、55.42μg/ml和28μg/ml的二叔丁基氯甲基磷酸酯对照品溶液，将不同浓度的溶液由低到高依次进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得到的二叔丁基氯甲基磷酸酯线性图如图7所示，线性浓度和峰面积结果列于表5中，得到的二叔丁基氯甲基磷酸酯线性方程为y =1292226.3360x+7525.1655，相关系数r=0.9996>0.999。由此可知，二叔丁基氯甲基磷酸酯在0.89mg/ml~2.67mg/ml浓度范围内线性关系良好。
表5 二叔丁基氯甲基磷酸酯线性浓度和峰面积结果
实施例6：准确度实验
分别制备低、中、高3个不同浓度的样品加标溶液，每种浓度分别制备3份溶液考察方法的准确度。
内标储备溶液：取1,3,5-三甲氧基苯约10mg，精密加入DMSO 1.0ml溶解，精密移取150μl，精密加入DMSO 850μl，摇匀。
对照品储备溶液：取CMDBP约14mg，精密加入DMSO 1.0ml溶解，精密移取10μl，精密加入DMSO 990μl混匀，配制成浓度为140μg/ml的对照品储备溶液。
按下表比例配制不同水平回收率溶液。每个水平溶液平行配制三份，将上述溶液进样分析。
表6 准确度溶液配制
可接受标准：各水平溶液平均回收率应在90%~108%范围内。
结果：各水平加标溶液回收率在93.4%~100.9%之间，见表5。
表7 准确度结果
结论：本方法准确性良好。
实施例7：重复性实验
由于供试品中CMDBP含量低于定量限，用100%水平供试品加标溶液回收率数据考察方法重复性。
可接受标准：6份供试品加标溶液中回收率均值应在90%~108%范围内，回收率RSD应不大于3%。
结果：6份溶液回收率在92.3%到97.7%之间，回收率RSD为2.2%，符合要求，见表8。
表8重复性结果
结论：本方法重复性良好。
实施例8：中间精密度实验
为考察随机变动因素对精密度的影响，另一名分析员在不同的日期重新配制供试品及供试品加标溶液，考察其回收率。
可接受标准：中间精密度6份供试品加标溶液，回收率均值应在90%~108%范围内，回收率RSD应不大于3%。中间精密度与重复性共12份供试品加标溶液，回收率RSD应不大于6%。
结果：6份中间精密度溶液回收率在92.9%到99.3%，RSD为2.9%，与重复性共12个回收率结果RSD为2.6%，符合要求，见表9。
表9 中间精密度结果
结论：本方法中间精密度良好。
实施例9：耐用性实验
考察波谱检测条件发生微小（NS±1，D1±2）变化的情况下，测定结果不受影响的承受程度。
配制对照品溶液和样品溶液，在不同耐用性条件下，分别进样分析，按外标法以峰面积计算二叔丁基氯甲基磷酸酯的含量。调整扫描时间NS±1、延迟时间D1±2情况下得到的耐用性试验结果见表10，由表10的数据可知，在改变本发明检测方法的扫描时间NS±1、延迟时间D1±2条件下，二叔丁基氯甲基磷酸酯含量RSD值均小于2%。说明本发明的检测方法耐用性良好。
表10 耐用性实验结果
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Claims (6)
1.一种二叔丁基氯甲基磷酸酯的核磁定量检测方法，其特征在于：以1,3,5-三甲氧基苯为内标，通过核磁方法检测二叔丁基氯甲基磷酸酯。
2.根据权利要求1所述的二叔丁基氯甲基磷酸酯的核磁定量检测方法，其特征在于：具体检测步骤为：
步骤一：配置内标储备液，取1,3,5-三甲氧基苯，加DMSO溶解制备得到内标储备液；
步骤二：配制二叔丁基氯甲基磷酸酯对照品溶液，取二叔丁基氯甲基磷酸酯，加入DMSO溶解，用DMSO和内标储备液稀释得到对照品溶液；
步骤三：配制样品溶液，取供试品，加入内标储备溶液和DMSO，加热溶解，制备得到样品溶液；
步骤四：将步骤二和三制备得到的溶液在核磁中进样检测；
步骤五：定内标峰面积为100，对二叔丁基氯甲基磷酸酯峰进行标峰，按外标法以峰面积计算二叔丁基氯甲基磷酸酯的含量。
3.根据权利要求2所述的二叔丁基氯甲基磷酸酯的核磁定量检测方法，其特征在于：步骤一中内标储备液浓度为0.5mg/ml；步骤二中对照品溶液浓度为28μg/ml。
4.根据权利要求2所述的二叔丁基氯甲基磷酸酯的核磁定量检测方法，其特征在于：步骤四中核磁检测条件为检测序列zg，扫描次数8次，延迟时间15秒。
5.根据权利要求2所述的二叔丁基氯甲基磷酸酯的核磁定量检测方法，其特征在于：步骤三中，取供试品约17.5mg，精密加入内标储备溶液100μl，DMSO 400μl加热溶解。
6.权利要求1-5中任一所述的二叔丁基氯甲基磷酸酯的核磁定量检测方法在评价BRL-186616安全性方法中的应用。
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