CN116804660A - 一种检测本芴醇粗品中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测本芴醇粗品中2,7‑二氯芴‑4‑环氧乙烷的方法，采用高效液相色谱法对本芴醇粗品中的2,7‑二氯芴‑4‑环氧乙烷进行检测，其中，高效液相色谱法采用的流动相包括磷酸溶液、甲醇和四氢呋喃；且流动相中，磷酸溶液、甲醇和四氢呋喃的体积比为11～13：84～86：3。该检测方法适用范围广、要求低、操作简单，有效解决了现有常规测试方法中操作繁琐的问题，减少了分析检测时间，使得检测更便捷、更快速。而且，该检测方法还具有优异的可靠性和准确性、线性范围良好和灵敏度较高。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体而言，涉及一种检测本芴醇粗品中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的方法。
背景技术
本芴醇是我国首创的甲氟喹类抗疟新药，主要用于恶性疟疾的治疗，尤其适用于抗氯喹恶性疟疾的治疗。它可与蒿甲醚配合，以协同增加抗疟作用。根据本芴醇合成路线，本芴醇的起始原料为芴，大概经过5步反应，共产生4个中间体，其中本芴醇可能引入的主要杂质为中间体II(2,7-二氯芴-4-氯乙酮)、III(2,7-二氯芴-4-环氧乙烷)、IV(2,7-二氯芴-α-(二正丁胺甲基)-4-甲醇)。《中华人民共和国药典》二部2020版收藏了本芴醇物质的检测方法，但是不能更好的定性杂质主要成分及含量。专利CN1034120823A公开了一种测定本芴醇中间体IV的反相高效液相色谱法，其采用的流动相为0.2mol/L的无水乙酸胺-乙酸溶液和乙腈的混合溶液，其测定的物质为中间体IV 2,7-二氯芴-α-(二正丁胺甲基)-4-甲醇，并未提及如何测定中间体III 2,7-二氯芴-4-环氧乙烷，且该测定方法的分析检测时间较长。
由于2,7-二氯芴-4-环氧乙烷是本芴醇合成过程中关键的中间体，而且是一种基因毒性杂质。因此，本发明有必要提供一种高效便捷地定量检测本芴醇粗品中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的方法。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种检测本芴醇粗品中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的方法，以解决现有技术中无法高效便捷地定量检测本芴醇粗品中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种检测本芴醇粗品中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的方法，采用高效液相色谱法对本芴醇粗品中的2,7-二氯芴-4-环氧乙烷进行检测，其中，高效液相色谱法采用的流动相包括磷酸溶液、甲醇和四氢呋喃；且流动相中，磷酸溶液、甲醇和四氢呋喃的体积比为11～13：84～86：3。
进一步地，检测本芴醇粗品中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的方法，还包括：待测样品溶液的配制：用第一部分稀释剂溶解本芴醇粗品，再向体系中加入第一部分甲醇进行振荡，取静置后的上层溶液作为待测样品溶液；标准品溶液的配制：用第二部分稀释剂溶解2,7-二氯芴-4-环氧乙烷标准品，得到2,7-二氯芴-4-环氧乙烷溶液；再将2,7-二氯芴-4-环氧乙烷溶液和第二部分甲醇混合作为标准品溶液；使标准品溶液进入高效液相色谱仪，并采用流动相进行洗脱，建立2,7-二氯芴-4-环氧乙烷标准品色谱图；使待测样品溶液进入高效液相色谱仪，并采用流动相进行洗脱，建立待测样品色谱图，结合2,7-二氯芴-4-环氧乙烷标准品色谱图及待测样品色谱图以定性、定量分析本芴醇粗品中的2,7-二氯芴-4-环氧乙烷。
进一步地，在检测过程中，流动相的洗脱方式为等度洗脱。
进一步地，流动相的流速为0.9～1.1mL/min。
进一步地，磷酸溶液中磷酸的体积分数为0.03～0.07％。
进一步地，流动相的pH值为2.2～2.5。
进一步地，稀释剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯或丙酮中的一种或多种，优选为二氯甲烷。
进一步地，在待测样品溶液的配制过程中，以每毫克本芴醇粗品计，第一部分稀释剂的用量为8～12μL；
进一步地，在待测样品溶液的配制过程中，以每毫克本芴醇粗品计，第一部分甲醇的用量为20～22μL。
进一步地，在标准品溶液的配制过程中，以每毫克2,7-二氯芴-4-环氧乙烷标准品计，第二部分稀释剂的用量为400～600mL。
进一步地，在标准品溶液的配制过程中，以每毫克2,7-二氯芴-4-环氧乙烷标准品计，第二部分甲醇的用量为900～1100mL。
进一步地，待测样品溶液的配制过程还包括以下步骤：将上层溶液进行离心，取离心后的上层清液作为待测样品溶液。
进一步地，振荡的时间为3～7min；振荡的转速为2000～3000rpm。
进一步地，静置的时间为0.5～2.0min。
进一步地，离心的时间为5～10min；离心的转速为8000～10000rpm。
进一步地，检测过程中，待测样品溶液和标准品溶液的进样体积各自独立地为15～20μL。
进一步地，高效液相色谱仪的色谱柱为苯基柱。
进一步地，高效液相色谱仪的柱温为30～40℃。
进一步地，色谱柱的长度为150mm，内径为4.6mm，色谱柱的填料颗粒直径为3μm。
进一步地，高效液相色谱仪的检测器选自紫外检测器或二极管阵列检测器。
进一步地，检测器的检测波长为272nm。
进一步地，本芴醇粗品包括99.5～99.8wt％的本芴醇、0.0002～0.0008wt％的2,7-二氯芴-4-环氧乙烷及余量杂质。
本发明提供了一种检测本芴醇粗品中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的方法，采用高效液相色谱法对本芴醇粗品中的2,7-二氯芴-4-环氧乙烷进行检测，其中，高效液相色谱法采用的流动相包括磷酸溶液、甲醇和四氢呋喃；且流动相中，磷酸溶液、甲醇和四氢呋喃的体积比为11～13：84～86：3。本发明根据本芴醇与2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的化学结构，特定选用了具有上述体积比的磷酸溶液、甲醇和四氢呋喃作为流动相，各组分协同配合使本芴醇粗品中的大部分组分，尤其是2,7-二氯芴-4-环氧乙烷组分具有合适的保留因子，从而促使待分析样品中的这些组分可在更短时间内实现较佳分离效果，形成具有良好峰形的色谱图，以便于精准的定量分析。另外，本发明对本芴醇粗品进行了样品前处理，先采用稀释剂对本芴醇粗品进行稀释溶解，再向体系中添加甲醇进行振荡以使部分本芴醇析出。本发明的样品前处理可以大大减少溶液中本芴醇以及杂质含量，降低对2,7-二氯芴-4-环氧乙烷组分测定干扰，以便于高效液相色谱定量检测分析，解决了现有常规测试方法中繁琐操作的问题，减少了分析检测时间，使得检测更便捷、更快速。本发明通过方法学考察，验证了本发明的检测方法具有优异的可靠性和准确性、线性范围良好且灵敏度较高。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了本发明实施例1的标准品溶液的高效液相色谱图；
图2示出了本发明实施例1的待测样品溶液的高效液相色谱图；
图3示出了本发明对比例1的待测样品溶液的高效液相色谱图；
图4示出了本发明对比例2的标准品溶液的高效液相色谱图；
图5示出了本发明对比例2的待测样品溶液的高效液相色谱图；
图6示出了本发明对比例3的标准品溶液的高效液相色谱图；
图7示出了本发明对比例3的待测样品溶液的高效液相色谱图；
图8示出了本发明对比例4的标准品溶液的高效液相色谱图；
图9示出了本发明对比例4的待测样品溶液的高效液相色谱图；
图10示出了本发明对比例5的待测样品溶液的高效液相色谱图；
图11示出了本发明一种实施方式中专属性试验中空白溶液的高效液相色谱图；
图12示出了本发明一种实施方式中专属性试验中灵敏度溶液的高效液相色谱图；
图13示出了本发明一种实施方式中专属性试验中检测限溶液的高效液相色谱图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
正如本申请背景技术部分所描述的现有技术中无法高效便捷地定量检测本芴醇粗品中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的问题，本发明的目的是提供一种检测本芴醇中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的方法。为了实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：采用高效液相色谱法对本芴醇粗品中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷进行检测，其中本发明选用的高效液相色谱的流动相包括磷酸溶液、甲醇和四氢呋喃；且流动相中，磷酸溶液、甲醇和四氢呋喃的体积比11～13：84～86：3。
本发明在高效液相色谱检测过程中所用的流动相包括磷酸溶液、甲醇和四氢呋喃，且将磷酸溶液、甲醇和四氢呋喃的体积比限定为11～13：84～86：3，例如可以为11：86：3；11.5：85.5：3；12：85：3；12.5：84.5：3；13：84：3；。基于此，这样的流动相中各组分协同配合能够使本芴醇粗品中的大部分组分，尤其是2,7-二氯芴-4-环氧乙烷组分具有合适的保留因子，从而促使待分析样品中的这些组分可在更短时间内实现较佳分离效果，形成具有良好峰形的色谱图，以便于精准的定量分析。该检测方法适用范围广、要求低、操作简单(流动相配制简单)，有效解决了现有常规测试方法中操作繁琐的问题，减少了分析检测时间，使得检测更便捷、更快速。而且，该检测方法还具有优异的可靠性和准确性、线性范围良好且灵敏度较高。
本发明根据本芴醇与2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的化学结构，特定选用了包含磷酸溶液、甲醇和四氢呋喃的流动相，三者之间存在相互协同作用。其中，磷酸溶液可以为本芴醇提供酸性条件，以使其完全电离，减弱在色谱条件上的保留能力；同时，流动相中磷酸溶液同甲醇按上述比例混合，能够增强色谱柱中π-π键键合作用力条件，使2,7-二氯芴-4-环氧乙烷有较好的保留，并协同添加上述特定比例的四氢呋喃进行流动相调和，可使2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的峰形不受本芴醇中其他杂质(例如2,7-二氯芴-4-氯乙酮、2,7-二氯芴-α-(二正丁胺甲基)-4-甲醇)的干扰。同时，磷酸水溶液配制简便、成本低廉且容易获得，配制后的溶液pH较为稳定；甲醇的极性在调整2,7-二氯芴-4-环氧乙烷保留和分离能力时相较于现有技术中乙腈更优。本发明通过选用特定组分、特定比例的流动相，实现了2,7-二氯芴-4-环氧乙烷与本芴醇及其杂质得到良好的分离，进而提高其检测准确度。
在一种优选的实施方式中，采用高效液相色谱法检测本芴醇粗品中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的方法包括：待测样品溶液的配制：用第一部分稀释剂溶解本芴醇粗品，再向体系中加入第一部分甲醇进行振荡，取静置后的上层溶液作为待测样品溶液；标准品溶液的配制：用第二部分稀释剂溶解2,7-二氯芴-4-环氧乙烷标准品，得到2,7-二氯芴-4-环氧乙烷溶液；再将2,7-二氯芴-4-环氧乙烷溶液和第二部分甲醇混合作为标准品溶液；使标准品溶液进入高效液相色谱仪，并采用流动相进行洗脱，建立2,7-二氯芴-4-环氧乙烷标准品色谱图；使待测样品溶液进入高效液相色谱仪，并采用流动相进行洗脱，结合2,7-二氯芴-4-环氧乙烷标准品色谱图及待测样品色谱图以定性、定量分析本芴醇粗品中的2,7-二氯芴-4-环氧乙烷。
发明人发现，在本芴醇粗品中，本芴醇和2,7-二氯芴-4-环氧乙烷溶解性极为相似，这在后续洗脱过程中，会导致二者分离效果较差，从而难以更准确的定量分析本芴醇粗品中的2,7-二氯芴-4-环氧乙烷。尤其是，本芴醇粗品中本芴醇与2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的含量相差较高，本芴醇的含量远超于2,7-二氯芴-4-环氧乙烷，这使得在对2,7-二氯芴-4-环氧乙烷痕量分析时，本芴醇和2,7-二氯芴-4-环氧乙烷几乎难以完全分离，无法对本芴醇粗品中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷组分进行定量。
基于此，本发明先采用稀释剂对本芴醇粗品进行稀释溶解，再向体系中添加甲醇进行振荡以使部分本芴醇析出。若对样品不进行这样的前处理，直接对本芴醇粗品进行2,7-二氯芴-4-环氧乙烷定量分析，难以准确测定。而本申请将本芴醇粗品进行稀释溶解后，向体系中添加甲醇，本芴醇粗品难溶于甲醇，但本芴醇与痕量2,7-二氯芴-4-环氧乙烷在甲醇中析出能力不同，稀释溶液中溶解的本芴醇含量较高，本芴醇会容易析出，本芴醇粗品中大量的本芴醇会从稀释溶液中析出，而痕量的2,7-二氯芴-4-环氧乙烷不会从甲醇中析出。经过上述处理方式可以大大减少溶液中本芴醇以及杂质含量，降低对2,7-二氯芴-4-环氧乙烷组分测定干扰，以便于高效液相色谱定量检测分析。本发明的样品前处理解决了现有常规测试方法中繁琐操作的问题，减少分析检测时间，使得检测更便捷、更快速。而且，该检测方法还具有优异的可靠性、准确性、线性范围良好、灵敏度较高。
为了使高效液相色谱分析过程更加方便与快捷，检测过程中，流动相的洗脱方式为等度洗脱。
为了进一步提高本芴醇粗品中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的分离效果，优选地磷酸溶液为磷酸水溶液，磷酸的体积分数为0.03～0.07％；优选地，流动相的pH值为2.2～2.5。在一些可实施的方式中，可通过磷酸溶液的用量调整其pH值，这是本领域技术人员基于本申请上述技术方案可以实施的，在此不多赘述。
为了使待分析样品中的各组分均可有效分离，使各组分物质均具有良好的峰型，分析结果更为准确，优选地流动相的流速为0.9～1.1mL/min；优选地磷酸溶液中磷酸的体积分数为0.03～0.07％
在一种优选的实施方式中，稀释剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯或丙酮中的一种或多种。采用上述稀释剂能够更好地溶解待测样品，且不干扰液相色谱的测定。优选地，稀释剂选自二氯甲烷。
在一种优选的实施方式中，在待测样品溶液的配制过程中，以每毫克本芴醇粗品计，稀释剂的用量为8～12μL。将稀释剂的用量控制在上述范围内，可以使待测样品溶液具有合适的浓度，在液相色谱柱进样过程中，具有合适的峰宽面积，定量分析更精确。
在一种优选的实施方式中，在待测样品溶液的配制过程中，以每毫克本芴醇粗品计，甲醇的用量为20～22μL。将甲醇用量控制在上述范围内，是基于以下考虑：当甲醇用量过低时，不能够使本芴醇及其杂质充分析出，会对2,7-二氯芴-4-环氧乙烷组分分离测定造成干扰；当甲醇用量过高时会影响2,7-二氯芴-4-环氧乙烷组分检测的灵敏度。
为了提高液相色谱定量分析的精确度，在标准品溶液的配制过程中，以每毫克2,7-二氯芴-4-环氧乙烷标准品计，稀释剂的用量为400mL～600mL。
为了提高液相色谱定量分析的精确度，控制变量，以每毫克2,7-二氯芴-4-环氧乙烷标准品计，甲醇的用量为900～1100mL。进一步说明的是，标准品溶液中甲醇的加入量和待测样品溶液的配制过程中甲醇的加入量一致。
为了使色谱分析过程的精密度更佳，灵敏度更高，含量测定更加准确。在一种优选的实施方式中，待测样品溶液的配制过程还包括：将上层溶液进行离心，取离心后的上层清液作为待测样品溶液。
在一些优选的实施方式中，在待测样品溶液的配制过程中，振荡的时间为3～7min；振荡的转速为2000～3000rpm；优选地，静置的时间为0.5～2.0min；优选地，离心的时间为5～10min min；离心的转速为8000～10000rpm。本发明在待测样品溶液的配制过程中，对待测样品进行了前处理，并调节上述前处理操作的条件参数，可以提高本芴醇粗品的稀释溶液中本芴醇的析出量和析出速率，得到合适质量浓度的2,7-二氯芴-4-环氧乙烷和本芴醇的待测样品溶液。
为了使各组分具有合适的峰形，分析结果更为精确，检测过程中，待测样品溶液和标准品溶液的进样体积各自独立地为15～20μL。
在一些可选的实施方式中，高效液相色谱仪的色谱柱为苯基柱；优选地，色谱柱的长度为150mm，内径为4.6mm，色谱柱的填料颗粒直径为3μm。高效液相色谱仪的检测器选自紫外检测器或二极管阵列检测器；高效液相色谱仪的检测器的检测波长为272nm。本发明将高效液相色谱仪的仪器参数设定在上述参数条件下时，可以使本芴醇粗品中各组分具有良好的峰型，使各组分得到更好的分离，测定的2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的含量更加精确。
在一种优选的实施方式中，高效液相色谱仪的柱温为30～40℃，本发明将柱温控制在上述范围内，可以使2,7-二氯芴-4-环氧乙烷组分具有良好的色谱峰形从而具有较好的灵敏度。
为了使分析结果更为精确，本芴醇粗品包括99.5～99.8wt％的本芴醇及0.0002～0.0008wt％的2,7-二氯芴-4-环氧乙烷及余量杂质。其中，余量杂质含有2,7-二氯芴-4-氯乙酮、2,7-二氯芴-α-(二正丁胺甲基)-4-甲醇。
以下结合具体实施例对本等申请作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。
实施例1
色谱条件：
色谱柱：Phenomenex Luna 3μm Phenyl-Hexyl，色谱柱的长度为150mm，内径为4.6mm，色谱柱的填料颗粒直径为3μm；
检测器：紫外检测器；
检测波长：272nm；
柱温：35℃；
进样量：15μL；
流动相：磷酸水溶液：甲醇：四氢呋喃＝12：85：3；流动相中的流速为1.0mL/min；洗脱方式：等度洗脱。
磷酸水溶液的配制：精密量取0.5ml磷酸加入至1000ml超纯水中溶解混合制得磷酸水溶液(磷酸溶液中磷酸的体积分数为0.05％)。
待测样品溶液的配制：取本芴醇粗品(CAS号：82186-77-4)100mg，精密称定，置于离心管中，加入二氯甲烷1ml稀释溶解(以每毫克本芴醇粗品计，二氯甲烷的用量为10μL)；再向体系中精密加入甲醇2ml(以每毫克本芴醇粗品计，甲醇的用量为20μL)进行涡旋振荡(振荡时间为5min，振荡转速为2500rpm)，静置1min后使部分本芴醇析出，取静置后的上层溶液进行离心(离心时间为5min，离心转速为10000rpm)，取离心后的上层清液作为待测样品溶液。
标准品溶液的配制：取2,7-二氯芴-4-环氧乙烷标准品20mg，精密称定，加入二氯甲烷稀释溶解得到质量浓度为2μg/mL的2,7-二氯芴-4-环氧乙烷溶液(以每毫克2,7-二氯芴-4-环氧乙烷标准品计，二氯甲烷的用量为500mL)，再取1mL的2,7-二氯芴-4-环氧乙烷溶液加入2ml甲醇混合作为标准品溶液(以每毫克2,7-二氯芴-4-环氧乙烷标准品计，甲醇的用量为1000mL)。
使上述标准品溶液进入高效液相色谱仪，并采用上述流动相进行洗脱，记录色谱图(如图1)。由图1可以发现，2,7-二氯芴-4-环氧乙烷在4.925min左右出峰；
使上述待测样品溶液进入高效液相色谱仪，并采用上述流动相进行洗脱，记录色谱图(如图2)。
实施例2
与实施例1不同之处仅在于，流动相中磷酸溶液、甲醇和四氢呋喃的体积比为11：86：3。
实施例3
与实施例1不同之处仅在于，流动相中磷酸溶液、甲醇和四氢呋喃的体积比为13：84：3。
实施例4
与实施例1不同之处仅在于，在待测样品溶液的配制过程中，以每毫克本芴醇粗品计，甲醇的用量为10μL。
实施例5
与实施例1不同之处仅在于，待测样品溶液与标准品溶液的进样体积为10μL。
实施例6
与实施例1不同之处仅在于，高效液相色谱仪的柱温为37℃。
实施例7
与实施例1不同之处仅在于，高效液相色谱仪的柱温为33℃。
对比例1
与实施例1不同之处仅在于，流动相选自：按照体积比计算，无水乙酸胺(0.2M)-乙酸溶液∶乙腈＝20∶80。将实施例1中的待测样品溶液进入高效液相色谱仪，并采用上述流动相进行洗脱，记录色谱图(如图3所示)。从图3可以发现，采用上述流动相定量检测本芴醇粗品中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷不可行，在上述色谱条件下，本芴醇粗品中本芴醇、2,7-二氯芴-4-环氧乙烷及其他杂质峰形相连，均不能够得到有效分离，无法定量分析本芴醇粗品中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷。
对比例2
与实施例1不同之处仅在于，流动相中磷酸溶液、甲醇和四氢呋喃的体积比为5：92：3。将实施例1中的标准品溶液进入高效液相色谱仪，并采用上述流动相进行洗脱，记录色谱图(如图4所示)，从图4可以发现，在上述的色谱条件下，2,7-二氯芴-4-环氧乙烷在3.403min左右出峰；将实施例1的待测样品溶液采用上述流动相进行洗脱，记录色谱图(如图5所示)，从图5可以发现，在保留时间为3.403min左右时，没有明显分离的尖锐峰形出现，在该保留时间的阶段下，只发现一个较高的溶剂和本芴醇混合物峰和一些相互堆叠的小杂峰，说明2,7-二氯芴-4-环氧乙烷在该色谱条件下，2,7-二氯芴-4-环氧乙烷出峰面积被本芴醇和溶剂的出峰面积所包裹，2,7-二氯芴-4-环氧乙烷不能够与本芴醇得到有效分离，在该色谱条件下不能够测定本芴醇粗品中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的含量。
对比例3
与实施例1不同之处仅在于，流动相中磷酸溶液、甲醇和四氢呋喃的体积比为20：77：3。将实施例1中的标准品溶液进入高效液相色谱仪，并采用上述流动相进行洗脱，记录色谱图(如图6所示)，从图6可以发现，在上述的色谱条件下，2,7-二氯芴-4-环氧乙烷在9.621min左右出峰；将实施例1的待测样品溶液采用上述流动相进行洗脱，记录色谱图(如图7所示)，从图7可以发现，在保留时间为9.621min左右时，有两个相连的峰，一个在8.781min左右，另一个在9.526min，因此在该色谱条件下，并不能明确2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的出峰位置，2,7-二氯芴-4-环氧乙烷与本芴醇粗品中其他杂质的分离度欠佳，在该色谱条件下不能够准确测定本芴醇粗品中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的含量。
对比例4
与实施例1不同之处仅在于，流动相中磷酸溶液、甲醇和四氢呋喃的体积比为13：86：1。将实施例1中的标准品溶液进入高效液相色谱仪，并采用上述流动相进行洗脱，记录色谱图(如图8所示)，从图8可以发现，在上述的色谱条件下，2,7-二氯芴-4-环氧乙烷在6.028min左右出峰；将实施例1的待测样品溶液采用上述流动相进行洗脱，记录色谱图(如图9所示)，从图9可以发现，在保留时间为6.033min左右时有个出峰位置，在保留时间为5.247min左右也有个小峰，推测保留时间为6.033min为2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的出峰位置，但是峰形很小，推测在该色谱条件下灵敏度较低或者2,7-二氯芴-4-环氧乙烷分离欠佳，可能有部分2,7-二氯芴-4-环氧乙烷在5.247min左右出峰。因此，在该色谱条件下测定本芴醇粗品中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的含量准确度存疑，且分析检测时间变长。
对比例5
与实施例1不同之处仅在于，待测样品溶液的配制过程，待测样品不进行样品前处理。其具体过程为：待测样品溶液的配制：取本芴醇粗品(CAS号：82186-77-4)100mg溶解于1mL二氯甲烷中，作为待测样品溶液。将上述待测样品溶液进入高效液相色谱仪中，色谱条件和实施例1相同，采用实施例1的流动相进行洗脱，记录色谱图(如图10所示)。从图10可以发现，色谱图只存在一个拖尾严重的峰形，可以得出本芴醇粗品中本芴醇、2,7-二氯芴-4-环氧乙烷和其他杂质均不能得到分离，在该情况下，不能够测定本芴醇粗品中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的含量。这是由于当对本芴醇粗品只进行稀释剂溶解而不加入甲醇析出剂的话，本芴醇粗品中本芴醇含量过高，2,7-二氯芴-4-环氧乙烷痕量，2,7-二氯芴-4-环氧乙烷和本芴醇和及其他杂质的出峰位置存在干扰，难以测定2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的含量。
根据上述实施例的高效液相色谱仪的色谱图定量分析本芴醇粗品中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的含量，其计算公式为：
式中：W：2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的含量(ppm)；
P：2,7-二氯芴-4-环氧乙烷标准品纯度；
MD：2,7-二氯芴-4-环氧乙烷标准品称量，mg；
MG：本芴醇粗品的称量，mg；
AG：待测样品溶液中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的峰面积；
AD：2,7-二氯芴-4-环氧乙烷标准品溶液中峰面积。
上述实施例的试验结果及数据处理见表1，表中的峰面积、保留时间均指2,7-二氯芴-4-环氧乙烷，W为色谱分析测定的本芴醇粗品中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的含量。
表1
| 保留时间/min | 峰面积 | W/ppm | 信噪比 | |
| 实施例1 | 4.925 | 7.74 | 2.9 | 182.4 |
| 实施例2 | 4.903 | 8.04 | 2.7 | 175.3 |
| 实施例3 | 4.980 | 7.53 | 2.7 | 178.9 |
| 实施例4 | 4.923 | 7.69 | 2.7 | 180.3 |
| 实施例5 | 4.921 | 7.49 | 2.9 | 177.2 |
| 实施例6 | 4.860 | 7.67 | 2.9 | 174.3 |
| 实施例7 | 5.057 | 7.43 | 2.7 | 177.1 |
本发明的方法学考察：
(1)专属性试验：
灵敏度溶液的配制：配制每1mL二氯甲烷中含有0.2μg的2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的2,7-二氯芴-4-环氧乙烷溶液；取2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的质量浓度为0.2μg/mL的2,7-二氯芴-4-环氧乙烷溶液1mL，加入甲醇2ml混合作为灵敏度溶液；
检测限溶液的配制：配制每1mL二氯甲烷中含有0.1μg的2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的2,7-二氯芴-4-环氧乙烷溶液；取2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的质量浓度为0.1μg/mL的2,7-二氯芴-4-环氧乙烷溶液1mL，加入甲醇2ml混合作为检测限溶液；
空白溶液的配制：精密量取二氯甲烷1ml，置离心管中，加入甲醇2ml，振摇。
精密量取空白溶液、灵敏度溶液、检测限溶液注入高效液相色谱仪(色谱条件与实施例1相同)，记录空白溶液色谱图(如图11所示)、灵敏度溶液色谱图(如图12所示)、检测限溶液色谱图(如图13所示)。
结论：在272nm波长处，根据空白溶液的色谱图和实施例1中待测样品溶液的色谱图，可以发现本芴醇粗品中其他杂质对2,7-二氯芴-4-环氧乙烷出峰处，无干扰；灵敏度溶液色谱图中，2,7-二氯芴-4-环氧乙烷信噪比大于10，检测限溶液色谱图中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷信噪比为大于3。
(2)线性范围试验
配制精密称取2,7-二氯芴-4-环氧乙烷标准品适量，加入二氯甲烷溶解稀释后，配制一系列质量浓度的2,7-二氯芴-4-环氧乙烷溶液，分别取上述一系列质量浓度的2,7-二氯芴-4-环氧乙烷溶液1mL，加入2mL甲醇混合，制成一系列线性样品溶液。
精密量取各线性样品溶液15μL，注入高效液相色谱仪(色谱条件与实施例1相同)，记录峰面积，绘制线性曲线方程。结果如见表2：
表2
结论：2,7-二氯芴-4-环氧乙烷线性回归方程和R2均满足要求，线性回归显著。
(3)回收率试验
未加标待测样品溶液的配制：配制过程与实施例1相同
配制三种不同质量浓度的2,7-二氯芴-4-环氧乙烷加标溶液，分别是10％加标溶液、100％加标溶液、150％加标溶液，其配制过程如下：
10％加标溶液的配制：配制每1mL二氯甲烷中含有0.2μg的2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的2,7-二氯芴-4-环氧乙烷溶液；取本芴醇粗品100mg，精密称定，置离心管中，加入2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的质量浓度为0.2μg/mL的2,7-二氯芴-4-环氧乙烷溶液1mL稀释溶解，再精密加入甲醇2ml，进行涡旋振荡(振荡时间为5min，振荡转速为2500rpm)，静置1min后使部分本芴醇析出，取静置后的上层溶液进行离心(离心时间为5min，离心转速为10000rpm)，取离心后的上层清液作为10％加标溶液，平行制备三份。
100％加标溶液的配制：配制每1mL二氯甲烷中含有2μg的2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的2,7-二氯芴-4-环氧乙烷溶液；取本芴醇粗品100mg，精密称定，置离心管中，加入2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的质量浓度为2μg/mL的2,7-二氯芴-4-环氧乙烷溶液1mL稀释溶解，再精密加入甲醇2ml，进行涡旋振荡(振荡时间为5min，振荡转速为2500rpm)，静置1min后使部分本芴醇析出，取静置后的上层溶液进行离心(离心时间为5min，离心转速为10000rpm)，取离心后的上层清液作为10％加标溶液，平行制备三份。
150％加标溶液的配制：配制每1mL二氯甲烷中含有3μg的2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的2,7-二氯芴-4-环氧乙烷溶液；取本芴醇粗品100mg，精密称定，置离心管中，加入2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的质量浓度为3μg/mL的2,7-二氯芴-4-环氧乙烷溶液1mL稀释溶解，再精密加入甲醇2ml，进行涡旋振荡(振荡时间为5min，振荡转速为2500rpm)，静置1min后使部分本芴醇析出，取静置后的上层溶液进行离心(离心时间为5min，离心转速为10000rpm)，取离心后的上层清液作为10％加标溶液，平行制备三份。
取上述溶液各15uL，注入液相色谱仪，测定加标样品的回收率(计算公式＝(检测量-样品本底量)/加入量×100)，其中：检测量：色谱分析测定2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的含量，样品本底量为本芴醇粗品中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷含量，加入量：加标溶液配制过程中加入的2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的含量，测试结果见表3：
表3
结论：2,7-二氯芴-4-环氧乙烷平均回收率在为97.5％，回收率RSD不大于2.0％，满足痕量杂质的测定要求，表明本方法准确度良好。
(4)精密度试验
标准品储备溶液：取2,7-二氯芴-4-环氧乙烷标准品适量，精密称定，加入二氯甲烷溶解并稀释制成每1ml含有2μg的溶液。
标准品溶液：移取标准品储备溶液1ml，置离心管中，加入甲醇2ml，振摇。
100％加标溶液：取本芴醇粗品100mg，精密称定，置离心管中，加入标准品储备溶液1ml，振摇使溶解。再精密量取稀释剂2ml，涡旋振荡5分钟(2500rpm)后，静置1分钟，使样品析出。移取上层溶液至离心管中，离心5分钟(10000rpm)，取上层清液，平行配制6份。
结论：取标准品溶液连续进样6次，2,7-二氯芴-4-环氧乙烷峰面积的RSD为3.4％；取6份100％加标溶液进样检测，2,7-二氯芴-4-环氧乙烷含量的RSD为2.9％。
(5)定量限和检测限试验
标准品储备溶液：取2,7-二氯芴-4-环氧乙烷标准品适量，精密称定，加入二氯甲烷溶解并稀释制成每1ml含有2μg的溶液。
定量限溶液：移取标准品储备溶液1ml，置10ml量瓶中，加入二氯甲烷稀释至刻度。移取溶液1ml，置离心管中，加入甲醇2ml，振摇。
检测限溶液：移取标准品储备溶液1ml，置20ml量瓶中，加入二氯甲烷稀释至刻度。移取溶液1ml，置离心管中，加入甲醇2ml，振摇。
取定量限溶液进样6次，取检测限溶液进样3次，色谱分析结果见表4和表5：
表4
表5
结论：定量限溶液连续进样6次，2,7-二氯芴-4-环氧乙烷峰面积的RSD为1.5％，且信噪比均大于10；检测限溶液连续进样3次，2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的信噪比均大于3，可以得出该检测方法灵敏度良好。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种检测本芴醇粗品中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的方法，其特征在于，采用高效液相色谱法对所述本芴醇粗品中的所述2,7-二氯芴-4-环氧乙烷进行检测，其中，所述高效液相色谱法采用的流动相包括磷酸溶液、甲醇和四氢呋喃；且所述流动相中，所述磷酸溶液、所述甲醇和所述四氢呋喃的体积比为11～13：84～86：3。
2.根据权利要求1所述的检测本芴醇粗品中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的方法，其特征在于，所述方法包括：
待测样品溶液的配制：用第一部分稀释剂溶解所述本芴醇粗品，再向体系中加入第一部分甲醇进行振荡，取静置后的上层溶液作为待测样品溶液；
标准品溶液的配制：用第二部分稀释剂溶解2,7-二氯芴-4-环氧乙烷标准品，得到2,7-二氯芴-4-环氧乙烷溶液；再将所述2,7-二氯芴-4-环氧乙烷溶液和第二部分甲醇混合作为标准品溶液；
使所述标准品溶液进入高效液相色谱仪，并采用所述流动相进行洗脱，建立2,7-二氯芴-4-环氧乙烷标准品色谱图；
使所述待测样品溶液进入所述高效液相色谱仪，并采用所述流动相进行洗脱，建立待测样品色谱图，结合所述2,7-二氯芴-4-环氧乙烷标准品色谱图及所述待测样品色谱图以定性、定量分析所述本芴醇粗品中的所述2,7-二氯芴-4-环氧乙烷。
3.根据权利要求2所述的检测本芴醇粗品中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的方法，其特征在于，检测过程中，所述流动相的洗脱方式为等度洗脱；
优选地，所述流动相的流速为0.9～1.1mL/min；
优选地，所述磷酸溶液中磷酸的体积分数为0.03～0.07％；
优选地，所述流动相的pH值为2.2～2.5。
4.根据权利要求2所述的检测本芴醇粗品中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的方法，其特征在于，所述稀释剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯或丙酮中的一种或多种，优选为二氯甲烷。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的检测本芴醇粗品中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的方法，其特征在于，在所述待测样品溶液的配制过程中，以每毫克所述本芴醇粗品计，所述第一部分稀释剂的用量为8～12μL；优选地，以每毫克所述本芴醇粗品计，所述第一部分甲醇的用量为20～22μL；
优选地，在所述标准品溶液的配制过程中，以每毫克所述2,7-二氯芴-4-环氧乙烷标准品计，所述第二部分稀释剂的用量为400mL～600mL；优选地，以每毫克所述2,7-二氯芴-4-环氧乙烷标准品计，所述第二部分甲醇的用量为900mL～1100mL。
6.根据权利要求2所述的检测本芴醇粗品中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的方法，其特征在于，所述待测样品溶液的配制过程还包括以下步骤：将所述上层溶液进行离心，取离心后的上层清液作为所述待测样品溶液；
优选地，所述振荡的时间为3～7min；所述振荡的转速为2000～3000rpm；
优选地，所述静置的时间为0.5～2.0min；
优选地，所述离心的时间为5～10min；所述离心的转速为8000～10000rpm。
7.根据权利要求2所述的检测本芴醇粗品中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的方法，其特征在于，检测过程中，所述待测样品溶液和所述标准品溶液的进样体积各自独立地为15～20μL。
8.根据权利要求2至7中任一项所述的检测本芴醇粗品中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的方法，其特征在于，所述高效液相色谱仪的色谱柱为苯基柱；
优选地，所述高效液相色谱仪的柱温为30～40℃；
优选地，所述色谱柱的长度为150mm，内径为4.6mm，所述色谱柱的填料颗粒直径为3μm。
9.根据权利要求2至8中任一项所述的检测本芴醇粗品中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的方法，其特征在于，所述高效液相色谱仪的检测器选自紫外检测器或二极管阵列检测器；
优选地，所述检测器的检测波长为272nm。
10.根据权利要求2至9中任一项所述的检测本芴醇粗品中2,7-二氯芴-4-环氧乙烷的方法，其特征在于，所述本芴醇粗品包括99.5～99.8wt％的本芴醇、0.0002～0.0008wt％的2,7-二氯芴-4-环氧乙烷及余量杂质。
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