CN114324714A - (1s)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种(1S)‑4,5‑二甲氧基‑1‑[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐的检测方法。本发明将(1S)‑4,5‑二甲氧基‑1‑[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品与流动相混合，得到供试品溶液；将杂质与流动相混合，得到对照品溶液；将(1S)‑4,5‑二甲氧基‑1‑[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品、对照品贮备液与流动相混合，得到混合溶液；然后将上述三类溶液分别注入高效色谱仪中进行HPLC检测(即高效液相色谱检测)，根据HPLC检测结果，获得(1S)‑4,5‑二甲氧基‑1‑[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品中的杂质含量。本发明提供的检测方法灵敏度高、精密度高、重现性好。
Description
技术领域
本发明涉及化学分析技术领域，特别涉及(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐的检测方法。
背景技术
(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐是合成药物-盐酸伊伐布雷定其盐酸盐的关键物料。盐酸伊伐布雷定(Ivabradine hydrochloride)，化学名为3-[3-[[[(7S)-3,4-二甲氧基二环[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-基]甲基]-甲基氨基]丙基]-7,8-二甲氧基-1,3,4,5-四氢-2H-3-苯并氮杂卓-2-酮盐酸盐。盐酸伊伐布雷定其盐酸盐，具有非常有价值的药理学和治疗特性，尤其是减缓心率的特性，可用于治疗或预防心肌缺血的多种临床表现，例如心绞痛、心肌梗塞和相关的节律紊乱，以及涉及节律紊乱的多种疾病，尤其是室上性心律失常，并可用于收缩性心力衰竭和舒张性心力衰竭。盐酸伊伐布雷定的化学结构式为：
盐酸伊伐布雷定合成主要是以7,8-二甲氧基-1,3-二氢-2H-3-苯并氮杂卓-2-酮为起始物料，通过3-氯-1-溴丙烷发生亲核反应生成3-(3-氯丙基)-7,8-二甲氧基-1,3-二氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮，然后再与(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷在碱性条件下发生缩合生成中间体3-[3-[[[(7S)-3,4-二甲氧基双环[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-基]甲基]甲基氨基]丙基]-1,3-二氢-2H-苯并氮杂-2-酮，最后氢化制备得到盐酸伊伐布雷定。
作为合成盐酸伊伐布雷定的中间关键原料，(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐的生产制备及质量管控具有重要意义。
现有技术中所报道的(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐的合成路线是：通过反应物4,5-二甲氧基-1-氰基苯并环丁烷进行还原，酰胺化，再还原，最后利用樟脑磺酸进行拆分得到，而(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐杂质的产生是在酰化时，多了一个酰基，使得在还原后，比产物多了一个甲基。
(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐的化学结构式如下：
(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐杂质来源于(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐合成工艺，为了从源头上监控杂质传递、去除情况，确保临床用药的安全有效，有必要对盐酸伊伐布雷定关键物料(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐中的杂质(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐进行有效的质量控制。而杂质(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐与主成分(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐的结构相似，使得其分析检测十分困难。
现有技术中只针对(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐合成路线进行介绍，如专利申请CN103524360A、CN104557573A；目前没有针对于(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐有关物质的分析检测方法，且该物料及杂质极性大，普通的液相方法洗脱基本不保留，无法能够有效分离，虽然通过离子对试剂能够延缓洗脱时间，但通过对比发现方法耐用性差，无法满足日常检测需求，因此，为不断提高药品的安全性和有效性，迫切需要建立一种操作简便、灵敏度高、重现性好的盐酸伊伐布雷定关键物料有关物质的定量检测方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐的检测方法。本发明提供的检测方法能够有效对(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐中的杂质(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐进行定量检测，且其灵敏度高、精密度高、重现性好。
本发明提供了一种(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐的检测方法，包括以下步骤：
a)将(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品与流动相混合，得到供试品溶液；
b)将杂质与流动相混合，得到对照品溶液；
c)将(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品、对照品贮备液与流动相混合，得到混合溶液；
所述对照品贮备液为杂质与流动相的混合液；
d)将所述供试品溶液、对照品溶液和混合溶液，分别注入高效色谱仪中进行HPLC检测，分别得到上述3种溶液的HPLC色谱图，再根据外标法，获得(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品中的杂质含量；
所述杂质为(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐；
所述HPLC检测的色谱条件为：采用Waters X
HSS T3色谱柱，柱温为30～40℃，流动相的流速为0.9～1.1mL/min；以磷酸二氢钾与乙腈的混合液为流动相；
所述步骤a)、步骤b)和步骤c)没有顺序限制。
优选的，所述流动相的配制过程为：
将磷酸二氢钾溶液与乙腈混合，得到流动相；
所述磷酸二氢钾溶液为磷酸二氢钾的水溶液；所述磷酸二氢钾溶液的浓度为0.03mol/L；
所述磷酸二氢钾溶液与乙腈的体积比为(88～92)∶(12～8)。
优选的，先将所述磷酸二氢钾溶液的pH值调节至5.4～5.6后，再与乙腈混合。
优选的，所述步骤a)中，(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品与流动相的用量比为(0.05～2.5)g∶1L。
优选的，所述步骤b)中，杂质与流动相的用量比为(0.00025～0.025)g∶1L。
优选的，所述步骤c)中，杂质与流动相的用量比为(0.0025～0.25)g∶1L。
优选的，所述步骤a)中，(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品与流动相的用量比为0.5g∶1L；
所述步骤b)中，杂质与流动相的用量比为0.0025g∶1L；
所述步骤c)中，杂质与流动相的用量比为0.025g∶1L。
优选的，所述色谱柱的尺寸为：长250mm，内径4.6mm，填充料粒径为3.5μm。
优选的，所述HPLC检测的检测波长为230nm；
所述柱温为35℃；
所述流动相的流速为1mL/min。
优选的，所述磷酸二氢钾溶液与乙腈的体积比为90∶10。
本发明将(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品与流动相混合，得到供试品溶液；将杂质与流动相混合，得到对照品溶液；将(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品、对照品贮备液与流动相混合，得到混合溶液；然后将上述三类溶液分别注入高效色谱仪中进行HPLC检测(即高效液相色谱检测)，根据HPLC检测结果，结合外标法获得(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品中的杂质含量。本发明提供的检测方法能够有效检测出(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品中的杂质(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐的含量，且上述检测方法灵敏度高、精密度高、重现性好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1实施例1中(1S)-4，5-二甲氧基-1[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐供试品的高效液相色谱图；
图2为实施例1中(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐对照品的高效液相色谱图；
图3为实施例1中混合溶液的高效液相色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐的检测方法，包括以下步骤：
a)将(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品与流动相混合，得到供试品溶液；
b)将杂质与流动相混合，得到对照品溶液；
c)将(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品、对照品贮备液与流动相混合，得到混合溶液；
所述对照品贮备液为杂质与流动相的混合液；
d)将所述供试品溶液、对照品溶液和混合溶液，分别注入高效色谱仪中进行HPLC检测，分别得到上述3种溶液的HPLC色谱图，再根据外标法，获得(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品中的杂质含量；
所述杂质为(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐；
所述HPLC检测的色谱条件为：采用Waters X
HSS T3色谱柱，柱温为30～40℃，流动相的流速为0.9～1.1mL/min；以磷酸二氢钾与乙腈的混合液为流动相；
所述步骤a)、步骤b)和步骤c)没有顺序限制。
本发明将(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品与流动相混合，得到供试品溶液；将杂质与流动相混合，得到对照品溶液；将(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品、对照品贮备液与流动相混合，得到混合溶液；然后将上述三类溶液分别注入高效色谱仪中进行HPLC检测(即高效液相色谱检测)，根据HPLC检测结果，获得(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品中的杂质含量。本发明提供的检测方法能够有效检测出(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品中的杂质(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐的含量，且上述检测方法灵敏度高、精密度高、重现性好。
关于步骤a)：将(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品与流动相混合，得到供试品溶液。
本发明中，所述流动相即为后续HPLC检测中的流动相。本发明中，所述(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品与流动相的用量比优选为(0.05～2.5)g∶1L，更优选为0.5g∶1L。将上述两种物质混合均匀，得到供试品溶液。
关于步骤b)：将杂质与流动相混合，得到对照品溶液。
本发明中，所述杂质为(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐，其正是待测样(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品中要检测的杂质。所述流动相即为后续HPLC检测中的流动相。
本发明中，所述杂质与流动相的用量比优选为(0.00025～0.025)g∶1L，更优选为0.0025g∶1L。将上述两种物质混合均匀，得到对照品溶液。
关于步骤c)：将(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品、对照品贮备液与流动相混合，得到混合溶液。
本发明中，所述对对照贮备液也为杂质与流动相的混合液。其中，杂质与流动相的用量比优选为(0.0025～0.25)g∶1L，更优选为0.025g∶1L。
本发明中，所述(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品与流动相的用量比优选为(0.05～2.5)g∶1L，更优选为0.5g∶1L。所述对照品贮备液中的杂质与所述流动相的用量比优选为(0.00025～0.025)g∶1L，更优选为0.0025g∶1L。将上述三类物质混合均匀，得到混合溶液。
本发明对步骤a)、步骤b)和步骤c)没有顺序限制。
关于步骤d)：将所述供试品溶液、对照品溶液和混合溶液，分别注入高效色谱仪中进行HPLC检测，分别得到上述3种溶液的HPLC色谱图，再根据外标法，获得(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品中的杂质含量。
本发明中，优选先将对照品溶液注入高效色谱仪中，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的逢高为满量程的20％～25％，再量取供试品溶液、对照品溶液和混合溶液，分别注入高效色谱仪中进行HPLC检测。其中，先注入对照品溶液的量优选为20μL，调节完后，再注入供试品溶液、对照品溶液和混合溶液时，进样量均优选为20μL。
本发明中，所述HPLC检测的色谱条件为：采用Waters X
HSS T3色谱柱，柱温为30～40℃，流动相的流速为0.9～1.1mL/min；以磷酸二氢钾与乙腈的混合液为流动相。
其中：
所述Waters X
HSS T3色谱柱尺寸优选为：长250mm，内径4.6mm，填充料粒径为3.5μm。
所述柱温为30～40℃，优选为35℃。在本发明的一些实施例中，所述柱温为30℃、35℃或40℃。
所述HPLC检测的检测波长优选为230nm。
所述HPLC检测的检测器优选为：UV检测器。
所述流动相的速度为0.9～1.1mL/min，优选为1mL/min。在本发明的一些实施例中，流动相的速度为0.9mL/min、1mL/min或1.1mL/min。
所述流动相为磷酸二氢钾与乙腈的混合液。其配制过程优选为：将磷酸二氢钾溶液与乙腈混合，得到流动相。更优选的，先将所述磷酸二氢钾溶液的pH值调节至5.4～5.6，再与乙腈混合。若pH过低或过高，则主成分峰移动，pH过低往主成分峰移动(杂质峰变尖，峰型变好，但是分离度不合格)，pH过高远离主成分峰移动(杂质峰变矮，峰型变差，分离度变高，但明显拖尾，导致定量不准)，在上述pH下才能有效准确定量测试杂质。所述pH值更优选为5.5。其中，调节pH所用的碱性物质优选为氢氧化钠。
其中，所述磷酸二氢钾溶液为磷酸二氢钾的水溶液。所述磷酸二氢钾溶液的浓度优选为0.03mol/L。所述磷酸二氢钾溶液与乙腈的体积比为(88～92)∶(12～8)，更优选为90∶10；在本发明的一些实施例中，所述体积比为88∶12、90∶10或92∶8。
本发明中，所述HPLC检测的的进样量优选为20μL。
通过上述HPLC检测，分别获得供试品溶液、对照品溶液和混合溶液的HPLC图谱，再通过杂质对照品外标法，得到测试样品中杂质的含量。本发明中，通过外标法获得测试样中杂质含量，具体通过下述公式1计算获得。
式1中：
W对为对照品的称样量，单位为mg；
a为对照品的纯度；
A对为对照品溶液的峰面积；
A样为供试品溶液的峰面积；
D样为供试品的稀释倍数；
W样为供试品的称样量，单位为mg；
D对为对照品的稀释倍数。
上述称样量是指固体样品称取到容量瓶中的称取量，例如先称取杂质对照品固体到容量瓶(质量为W对)，然后用流动相稀释到刻度，形成对照品初溶解液；接着将对照品初溶解液放入另一个容量瓶中，再用流动相稀释到刻度，得到对照品溶液。其中，第一步的称取量即为对照品的称样量；进入上述步骤d)的HPLC测试的对照品溶液即为上述第二次稀释的液体。
上述稀释倍数是指固体样品放入容量瓶用溶液溶解稀释的倍数，如1g固体样品放入10mL量瓶，稀释至刻度10mL，则记为稀释倍数为10。再如实施例1中，称取对照品2.91mg放入100mL容量瓶中加入流动相至刻度(此时稀释100倍，对照品体积相比于溶液体积足够小，可以忽略不计)，从该容量瓶中量取2mL溶液放入到20mL容量瓶，再加入流动相稀释至刻度(此时又稀释了10倍，总稀释倍数为100×10＝1000)，则最终稀释倍数为1000。
与现有技术相比，本发明提供的上述测试方法具有以下有益效果：
(1)本发明提供了盐酸伊伐布雷定关键物料特定杂质的控制方法，具体为(1S)-4，5-二甲氧基-1[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐和杂质(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐进行分离检测的方法，本发明采用不同于现有技术的色谱条件，从HPLC图谱中以看出它们之间有一定距离，能有效地对盐酸伊伐布雷定关键物料中杂质(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐进行分离检测。
(2)采用杂质对照品的检测方法，其分离度、专属性、定量限与检测限、线性、精密度、重复性、准确度、溶液稳定性、耐用性等方面均经详细验证，且各项验证结果均符合相关法规和指导原则的要求，实际检测效果良好。
(3)本发明实用性强，检测过程中，(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐的检测限可达0.0524μg/ml，即可以检出高于0.01％的(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐，实用性强。检测过程简单、快捷。
(4)本发明所述的高效液相色谱法，其测定条件中所包含的范围内均为有效值，即：在各参数范围内取任意值后，也能准确的检测出(1S)-4，5-二甲氧基-1[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐中的(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐，且能对(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐进行有效分离。在实际检测过程中，便于检测人员对参数的调整和避免人为误差对检测结果产生的影响，适宜推广使用。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。以下实施例所用材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
以下实施例均选取相同批号(115A8-11-190701SP批)的(1S)-4，5-二甲氧基-1[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品进行检测。
实施例1
S1、制备(1S)-4，5-二甲氧基-1[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐供试品溶液：
称取11.8mg(1S)-4，5-二甲氧基-1[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品加入20mL流动相，混合均匀后，稀释成每1ml约含(1S)-4，5-二甲氧基-1[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷0.5mg的溶液，作为供试品溶液，待用。
上述过程中，供试品称样量W样为11.8mg，供试品的稀释倍数D样为20。
S2、制备对照品贮备液：
称取(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐对照品适量，精密称定，加入流动相溶解并定量稀释制成每1ml中约含25μg(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷的溶液，作为(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷对照品贮备液。
S3、制备对照品溶液：
量取(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐对照品2.91mg，放入100mL容量瓶中加入流动相至刻度(此时稀释100倍)，再从该容量瓶中量取2mL溶液放入到20mL容量瓶，再加入流动相稀释至刻度(此时又稀释了10倍，总稀释倍数为100×10＝1000)，最终制成每1ml中约含2.5μg(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷的溶液，作为(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷对照品溶液。
上述过程中，对照品称样量W对为2.91mg，对照品的稀释倍数D对为1000，对照品含量a为99.56％(即纯度)。
S4、制备混合溶液：
称取(1S)-4，5-二甲氧基-1[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐11.8mg，加入20mL容量瓶中，精密量取步骤S2的(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐对照品贮备液2mL加至容量瓶中并用流动相稀释至20mL刻度，混合，摇匀，作为混合溶液，待用。
S5、取对照溶液20μL注入高效液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的20％～25％，再精密量取供试品溶液、对照品溶液、混合溶液各20μL，分别注入相色谱仪，记录色谱图。图1、图2和图3分别为本实施例中的(1S)-4，5-二甲氧基-1[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐供试品、(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐对照品及混合溶液高效液相色谱图。
从上述步骤S5，获得对照品溶液的峰面积A对，供试品溶液的峰面积A样。
其中高效液相色谱法的测定条件包括：
色谱柱：Waters X
HSS T3(型号：长250mm，内径4.6mm，填充料粒径3.5μm)；
检测器：UV检测器；
检测波长：230nm；
柱温：35℃；
流速：1ml/min；
流动相：用氢氧化钠将磷酸二氢钾溶液的pH调节至5.5，然后，将磷酸二氢钾溶液与乙腈按体积比＝90∶10混合，得到流动相。
根据上述HPLC检测结果，再通过杂质对照品外标法，得到测试样品中杂质的含量。公式如下：
式1中：
W对为对照品的称样量，单位为mg；
a为对照品的纯度；
A对为对照品溶液的峰面积；
A样为供试品溶液的峰面积；
D样为供试品的稀释倍数；
W样为供试品的称样量，mg；
D对为对照品的稀释倍数。
检测结果显示，(1S)-4，5-二甲氧基-1[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品中的杂质(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐含量为0.072％。从图谱中可以看出，(1S)-4，5-二甲氧基-1[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐和(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐的分离度大于1.5。
实施例2本发明方法的可靠性
按照实施例1的过程进行，不同的是，HPLC检测中使用的检测器不同，其它检测条件和实施例1一致。本实施例中，高效液相色谱法的测定条件包括：
色谱柱：Waters X
HSS T3(型号：长250mm，内径4.6mm，填充料粒径3.5μm)；
检测器：DAD检测器；
检测波长：230nm；
柱温：35℃；
流速：1ml/min；
流动相：同实施例1。
检测结果显示，(1S)-4，5-二甲氧基-1[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐峰纯度为0.999681，(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐的峰纯度为0.999932。峰纯度的测定是基于不同化合物对光的吸收不同从而判断出一个峰中是否包含着其他化合物，如果是单一化合物，则峰纯度达到0.999以上；而通过上述检测结果可知，所测出的主成分及杂质峰纯度均达到0.999以上，证明这些峰是单一的，不含有其它化合物，从而证明本发明提供的检测方法可靠性较高。
实施例3本发明方法的定量限及检测限
采用实施例1中的对照品溶液进行检测限与定量限检测，信噪比为10：1为定量限，信噪比为3:1为检测限，其它检测条件与实施例1一致，高效液相色谱法的测定条件包括：
色谱柱：Waters X
HSS T3(型号：长250mm，内径4.6mm，填充料粒径3.5μm)；
检测器：UV检测器；
检测波长：230nm；
柱温：35℃；
流速：1ml/min；
流动相：同实施例1。
检测结果显示，(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐检测限为0.0524μg/ml，定量限为0.1571μg/ml。上述检测结果证明，本发明提供的检测方法具有较好的灵敏度。
实施例4本发明方法的线性
选取杂质(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐对照品贮备液进行线性关系检测，配制对照品溶液定量限浓度、以及200％、150％、100％、80％、50％限度浓度，本实施例与实施例1检测条件一致。在本实施例中，高效液相色谱法的测定条件包括：
色谱柱：Waters X
HSS T3(型号：长250mm，内径4.6mm，填充料粒径3.5μm)；
检测器：UV检测器；
检测波长：230nm；
柱温：35℃；
流速：1ml/min；
流动相：同实施例1。
检测结果显示，杂质(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐，线性回归方程y＝21035x-531.87，线性相关系数为0.99931。上述检测结果证明，本发明提供的检测方法符合验证方案要求(回归系数应不小于0.999)。
实施例5本发明方法的精密度
配制杂质(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐对照品溶液定量限浓度以及100％浓度，连续进样6次，本实施例与实施例1检测条件一致。在本实施例中，高效液相色谱法的测定条件包括：
色谱柱：Waters X
HSS T3(型号：长250mm，内径4.6mm，填充料粒径3.5μm)；
检测器：UV检测器；
检测波长：230nm；
柱温：35℃；
流速：1ml/min；
流动相：同实施例1。
检测结果显示，杂质(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐其定量限浓度及100％浓度精密度RSD值分别为2.9％、0.7％。上述检测结果证明，本发明提供的检测方法具有较高的精密度。
实施例6本发明方法的耐用性
按照实施例1配制杂质对照品溶液及供试品溶液，放置0h、4h、8h、12h、16h、24h小时，考察稳定性，，为检测时杂质对照品和供试品溶液的放置时间提供依据。本实施例与实施例1检测条件一致。在本实施例中，高效液相色谱法的测定条件包括：
色谱柱：Waters X
HSS T3(型号：长250mm，内径4.6mm，填充料粒径3.5μm)；
检测器：UV检测器；
检测波长：230nm；
柱温：35℃；
流速：1ml/min；
流动相：同实施例1。
检测结果显示，对照品溶液中杂质(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐对照品的峰面积RSD为0.6％，供试品溶液中杂质(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐的峰面积RSD为1.8％。上述检测结果证明，对照品溶液及供试品溶液稳定性较好，在24h内稳定。
实施例7本发明方法的重复性
选取批号和实施例1相同批的(1S)-4，5-二甲氧基-1[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品6份，进行重复性考察，本实施例与实施例1检测条件一致。在本实施例中，高效液相色谱法的测定条件包括：
色谱柱：Waters X
HSS T3(型号：长250mm，内径4.6mm，填充料粒径3.5μm)；
检测器：UV检测器；
检测波长：230nm；
柱温：35℃；
流速：1ml/min；
流动相：同实施例1。
检测结果显示，(1S)-4，5-二甲氧基-1[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品中(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐含量RSD为3.1％。上述检测结果证明，本发明提供的检测方法具有较好的精密度。
实施例8本发明方法的加样回收率
选取批号和实施例1相同批的(1S)-4，5-二甲氧基-1[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品6份，按照实施例1配制成混合溶液6份，本实施例与实施例1检测条件一致。在本实施例中，高效液相色谱法的测定条件包括：
色谱柱：Waters X
HSS T3(型号：长250mm，内径4.6mm，填充料粒径3.5μm)；
检测器：UV检测器；
检测波长：230nm；
柱温：35℃；
流速：1ml/min；
流动相：同实施例1。
检测结果显示，(1S)-4，5-二甲氧基-1[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品中(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐回收率100.8％，RSD为0.4％。上述检测结果证明，本发明提供的检测方法具有较好的准确度。
实施例9
按照实施例1的测试过程进行，不同的是，色谱条件中的流速参数改变，其它检测条件和实施例1一致。具体如下：
色谱柱：Waters X
HSS T3(型号：长250mm，内径4.6mm，填充料粒径3.5μm)；
检测器：UV检测器；
检测波长：230nm；
柱温：35℃；
流速：0.9ml/min；
流动相：同实施例1。
检测结果显示，杂质(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐含量为0.069％。
实施例10
按照实施例1的测试过程进行，不同的是，色谱条件中的流速参数改变，其它检测条件和实施例1一致。具体如下：
色谱柱：Waters X
HSS T3(型号：长250mm，内径4.6mm，填充料粒径3.5μm)；
检测器：UV检测器；
检测波长：230nm；
柱温：35℃；
流速：1.1ml/min；
流动相：同实施例1。
检测结果显示，(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐含量为0.072％。
实施例11
按照实施例1的测试过程进行，不同的是，色谱条件中的柱温参数改变，其它检测条件和实施例1一致。具体如下：
色谱柱：Waters X
HSS T3(型号：长250mm，内径4.6mm，填充料粒径3.5μm)；
检测器：UV检测器；
检测波长：230nm；
柱温：30℃；
流速：1.0ml/min；
流动相：同实施例1。
经检测可知，(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐含量为0.070％。
实施例12
按照实施例1的测试过程进行，不同的是，色谱条件中的柱温参数改变，其它检测条件和实施例1一致。具体如下：
色谱柱：Waters X
HSS T3(型号：长250mm，内径4.6mm，填充料粒径3.5μm)；
检测器：UV检测器；
检测波长：230nm；
柱温：40℃；
流速：1.0ml/min；
流动相：同实施例1。
经检测可知，(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐含量为0.073％。
实施例13
按照实施例1的测试过程进行，不同的是，色谱条件中的流动相比例改变，其它检测条件和实施例1一致。具体如下：
色谱柱：Waters X
HSS T3(型号：长250mm，内径4.6mm，填充料粒径3.5μm)；
检测器：UV检测器；
检测波长：230nm；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
流动相：磷酸二氢钾溶液与乙腈按体积比＝92∶8。
检测结果显示，杂质(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐含量为0.067％。
实施例14
按照实施例1的测试过程进行，不同的是，色谱条件中的流动相比例改变，其它检测条件和实施例1一致。具体如下：
色谱柱：Waters X
HSS T3(型号：长250mm，内径4.6mm，填充料粒径3.5μm)；
检测器：UV检测器；
检测波长：230nm；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
流动相：磷酸二氢钾溶液与乙腈按体积比＝88∶12。
检测结果显示，杂质(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐含量为0.070％。
实施例15
按照实施例1的测试过程进行，不同的是，色谱条件中的流动相pH改变，其它检测条件和实施例1一致。具体如下：
色谱柱：Waters X
HSS T3(型号：长250mm，内径4.6mm，填充料粒径3.5μm)；
检测器：UV检测器；
检测波长：230nm；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
流动相：用氢氧化钠将pH调节至5.4。
检测结果显示，(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐含量为0.068％。
实施例16
按照实施例1的测试过程进行，不同的是，色谱条件中的流动相pH改变，其它检测条件和实施例1一致。具体如下：
色谱柱：Waters X
HSS T3(型号：长250mm，内径4.6mm，填充料粒径3.5μm)；
检测器：UV检测器；
检测波长：230nm；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
流动相：用氢氧化钠将pH调节至5.6。
检测结果显示，(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐含量为0.068％。
由实施例1～8的检测结果可知，本发明提供的检测方法能够有效定量检测出盐酸伊伐布雷定关键物料中的杂质(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐，且本发明检测方法具有良好的可靠性、灵敏度、线性、精密度、耐用性、重复性、准确度。
由实施例1及实施例9～16的检测结果可知，在本发明色谱条件的各参数范围内，对流动相比例、流速、柱温、pH等进行调整后，均能对关键物料(1S)-4，5-二甲氧基-1[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐中的(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐进行有效分离，且其检测结果均有效、准确。
对比例1
按照实施例1的测试过程进行，不同的是，色谱条件中的流动相pH改变，其它检测条件和实施例1一致。具体如下：
色谱柱：Waters X
HSS T3(型号：长250mm，内径4.6mm，填充料粒径3.5μm)；
检测器：UV检测器；
检测波长：230nm；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
流动相：用氢氧化钠将pH调节至4.0。
检测结果显示，杂质(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐无法有效分离，无法准确获得其含量。
对比例2
按照实施例1的测试过程进行，不同的是，色谱条件中的流动相比例改变，其它检测条件和实施例1一致。具体如下：
色谱柱：Waters X
HSS T3(型号：长250mm，内径4.6mm，填充料粒径3.5μm)；
检测器：UV检测器；
检测波长：230nm；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
流动相：磷酸二氢钾溶液与乙腈按体积比＝80∶20。
检测结果显示，杂质(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐无法有效分离，无法准确获得其含量。
由对比例1-2的检测结果证明，本发明的检测方法中，pH值及流动相比例尤为关键，在本发明规定的参数范围内才能有效分离杂质并准确定量检测出(1S)-4，5-二甲氧基-1[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品中的杂质(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐，而打破上述条件，则杂质无法有效分离，无法准确测定含量。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)将(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品与流动相混合，得到供试品溶液；
b)将杂质与流动相混合，得到对照品溶液；
c)将(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品、对照品贮备液与流动相混合，得到混合溶液；
所述对照品贮备液为杂质与流动相的混合液；
d)将所述供试品溶液、对照品溶液和混合溶液，分别注入高效色谱仪中进行HPLC检测，分别得到上述3种溶液的HPLC色谱图，再根据外标法，获得(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品中的杂质含量；
所述杂质为(1R)-4,5-二甲氧基-1-(N、N-二甲基氨基甲基)-苯并环丁烷盐酸盐；
所述HPLC检测的色谱条件为：采用Waters X
HSS T3色谱柱，柱温为30～40℃，流动相的流速为0.9～1.1mL/min；以磷酸二氢钾与乙腈的混合液为流动相；
所述步骤a)、步骤b)和步骤c)没有顺序限制。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相的配制过程为：
将磷酸二氢钾溶液与乙腈混合，得到流动相；
所述磷酸二氢钾溶液为磷酸二氢钾的水溶液；所述磷酸二氢钾溶液的浓度为0.03mol/L；
所述磷酸二氢钾溶液与乙腈的体积比为(88～92)∶(12～8)。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，先将所述磷酸二氢钾溶液的pH值调节至5.4～5.6后，再与乙腈混合。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤a)中，(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品与流动相的用量比为(0.05～2.5)g∶1L。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤b)中，杂质与流动相的用量比为(0.00025～0.025)g∶1L。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤c)中，杂质与流动相的用量比为(0.0025～0.25)g∶1L。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤a)中，(1S)-4,5-二甲氧基-1-[(甲基氨基)甲基]苯并环丁烷盐酸盐样品与流动相的用量比为0.5g∶1L；
所述步骤b)中，杂质与流动相的用量比为0.0025g∶1L；
所述步骤c)中，杂质与流动相的用量比为0.025g∶1L。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱的尺寸为：长250mm，内径4.6mm，填充料粒径为3.5μm。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述HPLC检测的检测波长为230nm；
所述柱温为35℃；
所述流动相的流速为1mL/min。
10.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述磷酸二氢钾溶液与乙腈的体积比为90∶10。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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