CN115521840A - 一种茯苓醪酒制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于茯苓酒加工领域,提供了一种茯苓醪酒制备工艺,包括将茯苓粉碎为粉末,加入乙醇提取,分别收集提取完成后的茯苓粗粉与茯苓醇提液,回收乙醇;将黍米倒入缸中,加入清水,浸渍;往缸中加入底浆,倒入沸水,进行搅动;10min后再次搅动,加水继续浸渍24h;浸渍后的米捞出,与茯苓粉加入到沸水中煮糜;加入麦曲糖化一定时间;将黄酒酵母加入糜中,搅拌均匀后装坛发酵;发酵完毕,经压榨澄清后加入一定量羟丙基‑β‑环糊精并勾兑入回收乙醇的茯苓醇提液,加温灭菌得到茯苓醪酒,借此,本发明所制备的茯苓酒含有三萜类化合物的成分比例高,提高了茯苓酒的药效作用,能够更好地满足人们健脾和胃、提高免疫力的需求。
Description
技术领域
本发明涉及茯苓酒加工领域,尤其涉及一种茯苓醪酒制备工艺。
背景技术
现代茯苓酒的制备工艺分为两种,一种是用蒸馏白酒浸渍制成的药酒,此方法虽然制作简单,但以高度蒸馏酒做酒基却存在诸多安全性问题,且不利于不善饮酒人群的使用;另一种方法总体继承了传统茯苓酒酿制法的工艺路线,仅仅对米的种类及发酵工艺进行了一定优化,使其色泽与口感得到了较好的提升。然而茯苓中主要的有效成分为多糖及三萜类化合物,就三萜类化合物不易溶于水的理化性质而言,单纯的酿制法并不能使其溶解于酒中,这就造成了茯苓中有效成分在一定程度上的浪费,限制了茯苓酒健脾作用药效的发挥。
综上可知,现有技术在实际使用上显然存在不便与缺陷,所以有必要加以改进。
发明内容
针对上述的缺陷,本发明的目的在于提供一种茯苓醪酒制备工艺,其所制备的茯苓酒含有三萜类化合物的成分比例高,提高了茯苓酒的药效作用,能够更好地满足人们健脾和胃、提高免疫力的需求。
为了实现上述目的,本发明提供一种茯苓醪酒制备工艺,包括S1、将茯苓粉碎为粉末,加入60%~80%乙醇提取40min~80min,分别收集提取完成后的茯苓粗粉与茯苓醇提液,茯苓醇提液经旋转蒸发回收乙醇;S2、将黍米倒入缸中,加入清水,浸渍24h;S3、浸渍完成后,往缸中加入适量底浆,倒入沸水,进行搅动,使此时温度约为55°~70℃;8~12min后,再次搅动,使烫米水降温至35~50℃,加水继续浸渍24h;S4、浸渍后的米用水洗后捞出,与所述步骤S1处理的茯苓粉一同加入到沸水中进行煮糜;S5、待煮好的糜温度降至约50℃~70℃,加入8%~10%麦曲糖化时间为20~60min;S6、将活化好的黄酒酵母加入到糖化好的糜中,搅拌均匀后装坛发酵;S7、发酵完毕,经压榨澄清后得到茯苓酒,茯苓酒中加入一定量羟丙基-β-环糊精,与S1中回收乙醇的茯苓醇提液进行勾兑,振荡搅拌一定时间;S8、勾兑完成的茯苓酒经澄清,再经过加温灭菌,得到茯苓醪酒。
根据本发明的茯苓醪酒制备工艺,所述所述步骤S1中的茯苓醇提液采用高效液相色谱检测去氢土莫酸与茯苓酸含量;其中,色谱检测仪所选择的色谱柱条件为WondaSilC18(250mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈(A)-0.05%磷酸水(B),梯度洗脱(0~9min,65%A,9~16min,65%A→68%A,16~24min,68%A→70%A,24~35min,70%A→73%A);流速:1.0mL·min-1;柱温:30℃;进样量:10μL;检测波长:220nm。
根据本发明的茯苓醪酒制备工艺,对所述步骤S1中所获得的茯苓醇提液取样并进行综合评分测定,其中,综合评分=50%茯苓酸得率+50%去氢土莫酸得率。
根据本发明的茯苓醪酒制备工艺,所述步骤S1中按照综合评分获取最佳原料配比,获取加入为70%乙醇,提取时间为60min,并获取8倍不同溶剂量的供试品溶液时获取的综合评分最高。
根据本发明的茯苓醪酒制备工艺,所述步骤S5中,糖化结果采用3,5二硝基水杨酸比色法通过紫外分光光度计测定。
根据本发明的茯苓醪酒制备工艺,所述步骤S7中,通过相对增溶率计算三萜类的溶解效果;相对增溶率(Relative SolubilizationRate,RS)计算方法为RS=(Stot-Sw)/Sw;其中,Sw为溶质(增溶质,难溶性药物)的原始溶解度(单位为μg·mL-1);Stot为增溶后的溶解度(单位为μg·mL-1)。
根据本发明的茯苓醪酒制备工艺,在所述步骤S3中,加入沸水后的溶液温度为55°,并在8min后继续搅拌,搅拌后的温度为35°。
根据本发明的茯苓醪酒制备工艺,在所述步骤S3中,加入沸水后的溶液温度为70°,并在12min后继续搅拌,搅拌后的温度为50°。
根据本发明的茯苓醪酒制备工艺,在所述步骤S3中,加入沸水后的溶液温度为60°,并在10min后继续搅拌,搅拌后的温度为40°。
本发明提供了一种茯苓醪酒制备工艺包括茯苓醪酒制备工艺,包括S1、将茯苓粉碎为粉末,加入60%~80%乙醇提取40min~80min,分别收集提取完成后的茯苓粗粉与茯苓醇提液,茯苓醇提液经旋转蒸发回收乙醇;S2、将黍米倒入缸中,加入清水,浸渍24h;S3、浸渍完成后,往缸中加入适量底浆,倒入沸水,进行搅动,使此时温度为55°~70℃;8~12min后,再次搅动,使烫米水降温至35~50℃,加水继续浸渍24h;S4、浸渍后的米用水洗后捞出,与所述步骤S1处理的茯苓粉一同加入到沸水中进行煮糜;S5、待煮好的糜温度降至约50℃~70℃,加入8%~10%麦曲糖化时间为20~60min;S6、将活化好的黄酒酵母加入到糖化好的糜中,搅拌均匀后装坛发酵;S7、发酵完毕,经压榨澄清后得到茯苓酒,茯苓酒中加入一定量羟丙基-β-环糊精,与S1中回收乙醇的茯苓醇提液进行勾兑,振荡搅拌一定时间;S8、勾兑完成的茯苓酒经澄清,再经过加温灭菌,得到茯苓醪酒。本发明所制备的茯苓酒含有三萜类化合物的成分比例高,提高了茯苓酒的药效作用,能够更好地满足人们健脾和胃、提高免疫力的需求。
附图说明
图1去氢土莫酸标准曲线图;图2茯苓酸标准曲线图;图3提取时间对茯苓醪酒有效成分含量的影响;图4溶剂量对醇提液成分含量的影响;图5浓度对茯苓醪酒有效成分含量的影响;图6还原糖标准曲线图;图7糖化温度对于还原糖含量的影响;图8加曲量对还原糖含量的影响;图9糖化时间对还原糖含量的影响;图10茯苓酸标准曲线图;图11超声时间对茯苓醪酒有效成分含量的影响;图12振荡时间对茯苓醪酒有效成分含量的影响图13增溶物质添加量对茯苓醪酒有效成分含量的影响;图14给药过程中各给药组大鼠体质量变化;图15茯苓醪酒对脾阳虚模型大鼠脾脏组织病理学的影响。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明,应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
本发明提供了一种茯苓醪酒制备工艺,该茯苓醪酒制备工艺包括茯苓醪酒制备工艺,包括:S1、将茯苓粉碎为粉末,加入60%~80%乙醇提取40min~80min,分别收集提取完成后的茯苓粗粉与茯苓醇提液,茯苓醇提液经旋转蒸发回收乙醇;S2、将黍米倒入缸中,加入清水,浸渍24h;S3、浸渍完成后,往缸中加入适量底浆,倒入沸水,进行搅动,使此时温度约为55°~70℃;8~12min后,再次搅动,使烫米水降温至35~50℃,加水继续浸渍24h;在本实例中,55°~70℃;8~12min后,再次搅动,使烫米水降温至35~50℃,加水继续浸渍24h。S4、浸渍后的米用水洗后捞出,与所述步骤S1处理的茯苓粉一同加入到沸水中进行煮糜;S5、待煮好的糜温度降至约50℃~70℃,加入8%~10%麦曲糖化时间为20~60min;6、将活化好的黄酒酵母加入到糖化好的糜中,搅拌均匀后装坛发酵;S7、发酵完毕,经压榨澄清后得到茯苓酒,茯苓酒中加入一定量羟丙基-β-环糊精,与S1中回收乙醇的茯苓醇提液进行勾兑,振荡搅拌一定时间;S8、勾兑完成的茯苓酒经澄清,再经过加温灭菌得到茯苓醪酒。
在实例二中,与实例一之间的区别为,加入沸水后的溶液温度为55°,并在8min后继续搅拌,搅拌后的温度为35°。
在实例三中,与实例一之间的区别为,在所述步骤S3中,加入沸水后的溶液温度为70°,并在12min后继续搅拌,搅拌后的温度为50°。
具体制备过程为:
3.1色谱条件
色谱柱:WondaSil C18(250mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈(A)-0.05%磷酸水(B),梯度洗脱(0~9min,65%A,9~16min,65%A→68%A,16~24min,68%A→70%A,24~35min,70%A→73%A);流速:1.0mL·min-1;柱温:30℃;进样量:10μL;检测波长:220nm;
3.2供试品溶液的制备
将20g茯苓粗粉置于圆底烧瓶中,加入一定量乙醇溶液,加热回流一定时间,抽滤得茯苓醇提液,将其定容至250mL。精密称取25mL醇提液水浴蒸干,用甲醇溶解定容至10mL。
3.3对照品溶液的制备
将精密称取的茯苓酸、去氢土莫酸标准品置于量瓶中,用甲醇进行稀释,得到浓度为0.22、0.21mg·mL-1的去氢土莫酸、茯苓酸的混合对照品溶液。
3.4方法学考察
3.4.1标准曲线的制备
精密吸取“3.3”项下规定制备的对照品溶液0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1.0mL,以甲醇为溶剂定容至1.0mL,制备得到系列浓度梯度的供试品溶液。测定其峰面积,以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标制备标准曲线。
表1标准曲线实验结果
3.4.2精密度实验
在1d之内,取同一对照品溶液并连续重复进样6次,测得去氢土莫酸、茯苓酸的峰面积,计算相对标准偏差。
表2精密度实验结果
3.4.3稳定性实验
吸取同一份混合供试品溶液,分别于0、2、4、6、8、12h进样,测得茯苓酸、去氢土莫酸的峰面积,计算其相对标准偏差。
表3稳定性实验结果
3.4.4重复性实验
依据“3.2”项下规定的方法,将6份相同的样品制备成供试品溶液,测定去氢土莫酸、茯苓酸的峰面积,计算得率及相对标准偏差。
表4重复性实验结果
3.4.5加样回收实验
精密量取浓度已知的100mL样品溶液(去氢土莫酸21.61μg·mL-1、茯苓酸39.22μg·mL-1)定容至200mL作为供试品溶液。再精密称取去氢土莫酸、茯苓酸标准品加入70%的乙醇溶液,得到43、78.4μg·mL-1的对照品溶液。精密吸取六份20mL供试品溶液分别按与已知成分含量1∶1的比例精密加入5mL对照品溶液。依据“3.2”项下规定的方法,制备成供试品溶液,测峰面积,计算加样回收率。
表5去氢土莫酸加样回收率试验结果
表6茯苓酸加样回收率试验结果
3.4.6醇提工艺单因素实验
以茯苓酸、去氢土莫酸含量为指标。对二者综合得率进行评分。综合评分=50%茯苓酸得率+50%去氢土莫酸得率。
3.4.6.1醇提时间考察
考察醇提时间对茯苓醇提液中去氢土莫酸、茯苓酸含量的影响:按照“3.2”项下,70%乙醇,10倍溶剂量,获得20、40、60、80、100min不同提取时间的供试品溶液,计算茯苓酸、去氢土莫酸含量。对去氢土莫酸和茯苓酸得率进行综合评分,以综合评分作为指标进行考察,结果见表7、图3。
表7乙醇提时间考察结果表
由图3知,提取时间小于60min时,去氢土莫酸等三萜类成分的含量随提取时间的延长而增大,综合评分上升。但在60min后,去氢土莫酸等物质大部分已被提取,综合评分随时间变化不明显。
3.4.6.2溶剂量考察
考察溶剂量对茯苓醇提液中去氢土莫酸、茯苓酸含量的影响:按照“3.2”项下,采用70%乙醇,醇提60min,获得4、6、8、10、12倍不同溶剂量的供试品溶液,计算其含量。对去氢土莫酸和茯苓酸得率进行综合评分,以综合评分作为指标进行考察,结果见表8、图4。
表8溶剂量考察结果表
由图4知,溶剂量越多,可溶解的物质越多,综合评分上升,在溶剂量为8倍时,综合评分达到最高。但总体而言,溶剂量对于综合评分的影响不大,
3.4.6.3乙醇浓度考察
考察乙醇浓度对茯苓醇提液中去氢土莫酸、茯苓酸含量的影响:按照“3.2”项下,采用10倍溶剂量,醇提60min,获得40%、50%、60%、70%、80%不同乙醇浓度的供试品溶液。计算其含量,对去氢土莫酸和茯苓酸得率进行综合评分,以综合评分作为指标进行考察,结果见表9、图5。
表9乙醇浓度考察结果表
由图5知,随乙醇浓度升高,去氢土莫酸、茯苓酸溶解的量增大,综合评分不断上升。乙醇浓度为70%时,综合评分达到最高。再提高浓度,综合评分差异不大。
3.4.7正交实验
根据单因素实验结果,设计L9(34)正交实验,对乙醇浓度(A)、溶剂量(B)、醇提时间(C)三个因素进行工艺优化,获得最佳工艺。以去氢土莫酸、茯苓酸含量为指标,按方法测定去氢土莫酸、茯苓酸含量。并用SPASS22.0软件对实验结果进行分析。
表10茯苓醇提工艺正交实验因素水平表
表11茯苓醪酒醇提工艺正交实验结果表
表12茯苓醪酒醇提工艺正交实验方差分析结果表
由正交结果知,各因素对综合评分的影响为B(溶剂量)>A(乙醇浓度)>C(提取时间)。
由方差分析结果知,只有溶剂量和乙醇浓度对综合评分的影响才具有统计学意义。而乙醇浓度因素中,70%和80%评分相同,从节省能源和降低成本方面和单因素考察结果来看,可采取70%乙醇浓度。因此,最终确定提取工艺为A2B2C3。
3.4.8验证实验
为验证茯苓粉醇提最佳工艺,取3份200g茯苓粗粉各放于圆底烧瓶中,在乙醇浓度70%、提取时间80min、乙醇溶剂量8倍的条件下,采用回流加热的方法制备醇提液并测定其峰面积,计算其综合评分,结果见表13。
表13茯苓醇提最佳工艺验证实验结果
4.茯苓醪酒糖化工艺研究
4.1对照品溶液的制备
将葡萄糖样品放置在热风干燥箱98℃干燥至恒重,准确称量1.000g,以蒸馏水为溶剂将其定容至1000mL,得对照品溶液。
4.2供试品溶液的制备
将浸泡24h后的1Kg黍米用沸水烫制,再浸泡24h。将其与茯苓残渣共同煮糜,摊晾后加入麦曲糖化,得到糖化液。将糖化液离心(4000r·min-1,20min),取上清液定容至250mL,再精密吸取1mL上清液用蒸馏水定容至100mL,即可得到供试品溶液。
4.3方法学实验
4.3.1标准曲线的制备
取“4.1”项下规定的0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL对照品溶液于15mL具塞试管中,加入蒸馏水稀释至2mL,加入2mL的3,5-二硝基水杨酸试剂,混合均匀。沸水水浴5min后取出冷却至室温,用蒸馏水定容至15mL,摇匀混合后测定吸光度(540nm)。以吸光度为纵坐标,还原糖浓度为横坐标绘制标准曲线。
4.3.2精密度实验
取“4.1”项下的对照品溶液0.8mL,按照“4.3.1”的条件连续测定6次,得到吸光度,计算相对标准偏差。
表14精密度实验结果
4.3.3稳定性实验
取“4.2”项下的供试品溶液,在0、10、20、30、40、50min时测定吸光度,计算相对标准偏差。
表15稳定性实验结果
4.3.4重复性实验
取“4.2”项下制备的供试品溶液6份,测定吸光度,计算还原糖含量和相对标准偏差。
表16重复性实验结果
4.3.5加样回收实验
精密吸取1mL按照“4.2”项下条件制备的已知浓度的供试品溶液6份。精密称量葡萄糖样品3.59mg,以蒸馏水为溶剂定容至10mL,得到已知质量浓度的葡萄糖对照品溶液。将供试品溶液按照与已知成分含量1:1的比例精密加入一定量的对照品溶液。按照“4.3.1”项下规定的方法测定吸光度,计算平均回收率。
表17加样回收实验结果
4.3.6单因素实验
4.3.6.1糖化温度考察
考察糖化温度对茯苓糖化液中还原糖含量的影响:按照“4.2”项下,加曲量8%,糖化时间50min,获得50、55、60、65、70℃不同温度条件的供试品溶液,取2mL供试品溶液依据“4.3.1”项测定吸光度,计算还原糖含量。结果见表18、图7。
表18糖化温度考察结果表
由图7知,糖化前期,还原糖含量随温度的上升而上升。温度较低时,糖化酶活性低,水解出的还原糖含量较少。当温度上升到60℃时,酶活性最好,还原糖的含量则最高。随后再升高温度,酶活性降低,还原糖含量则会下降。
4.3.6.2加曲量考察
考察加曲量对茯苓糖化液中还原糖含量的影响:按照“4.2”项下,糖化温度60℃,糖化时间50min,获得2、4、6、8、10%不同加曲量的供试品溶液,取2mL供试品溶液依据“4.3.1”项测定吸光度,计算还原糖含量。结果见表19、图8.
表19加曲量考察结果表
由图8知,麦曲量增多,酶的含量相继增多,有助于水解,使得还原糖含量上升。但当加曲量到8%时,再增加加曲量,此时大部分淀粉已被水解,还原糖含量增长幅度趋于缓和。
考察糖化时间对茯苓糖化液中还原糖含量的影响:按照“4.2”项下,糖化温度60℃,加曲量8%,获得20、30、40、50、60min不同糖化时间的供试品溶液,取2mL供试品溶液据“4.3.1”项测定吸光度,计算还原糖含量。结果见表20、图10.
表20糖化时间考察结果表
由图9知,还原糖含量随糖化时间的延长而上升,当时间为40min时,含量最高。这是因为糖化时间延长,淀粉被不断水解转化为糖,使得还原糖含量不断上升。糖化时间超过40min,还原糖含量则降低。猜测可能与麦曲中的少量杂菌(例如乳酸杆菌)将糖转化为有机酸有关。
按照单因素实验结果,设计L9(34)正交实验,对糖化温度(A)、加曲量(B)、糖化时间(C)三个因素进行工艺优化,获得最佳工艺。以还原糖含量为指标,按方法测定还原糖含量。并用SPASS22.0软件对实验结果进行分析。
表21茯苓醪酒糖化工艺正交实验因素水平表
表22茯苓醪酒糖化工艺正交实验结果表
表23糖化工艺正交实验方差分析结果表
由正交实验结果知,各因素对工艺综合评分的影响为A>B>C,即糖化温度>加曲量>糖化时间。由方差分析结果知,糖化时间、加曲量对于综合评分的影响不具有统计学意义。因此,结合单因素考察结果,确定最佳工艺为A2B3C2。
为验证茯苓醪酒最佳糖化工艺,取3份1Kg的黍米,各浸泡烫至后与茯苓粉共同煮糜,在60℃时,加入10%的麦曲糖化40min,将糖化液离心并测定其吸光度。计算其还原糖含量等,结果见表24。
表24茯苓醪酒糖化工艺验证实验结果表
4.茯苓醪酒勾兑工艺研究
4.1色谱条件
色谱柱:WondaSil C18(250mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈(A)-0.05%磷酸水(B),梯度洗脱(0~9min,65%A,9~16min,65%A→68%A,16~24min,68%A→70%A,24~35min,70%A→73%A);流速:1.0mL·min-1;柱温:30℃;进样量:10μL;检测波长:210nm;
取一定量增溶剂于80ml黄酒中,搅拌溶解后,加入20ml已回收乙醇的茯苓醇提液,分别超声振荡一定时间,滤过,得黄酒溶液。取90ml黄酒溶液于烧杯中,准确量取270ml石油醚,分三次萃取黄酒后合并萃取液,真空回收石油醚至20ml后转移至蒸发皿内,水域蒸干,加甲醇溶解,定容至1ml,即得。
精密称取一定量的茯苓酸对照品置于量瓶中,加甲醇稀释制成茯苓酸质量浓度分别为0.21mg/mL的对照品溶液。
精密吸取“4.3”项下规定制备的对照品溶液0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1.0mL,以甲醇为溶剂定容至1.0mL,制备得到系列浓度梯度的供试品溶液。测定其峰面积,以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标制备标准曲线。结果见图10。得回归方程为Y=6007.2X-12257,R2=0.9992。茯苓酸浓度在5.25~210μg/mL时与峰面积呈现良好的线性关系。
在1d之内,取同一对照品溶液并连续重复进样6次,测得茯苓酸的峰面积,计算相对标准偏差。
表25精密度实验结果
吸取同一份混合供试品溶液,分别于0、2、4、6、8、12h进样,测得茯苓酸的峰面积,计算其相对标准偏差。
表26稳定性实验结果
依据“4.2”项下规定的方法,将6份相同的样品制备成供试品溶液,测定茯苓酸的峰面积,计算绝对增溶度及相对标准偏差。
表27重复性实验结果
为克服三萜类成分溶解度问题,采用增加溶解度有代表性的物质对茯苓发酵酒进行勾兑,以茯苓酸的相对增容率为指标,优选提高三萜类成分溶解度较好的方法。
相对增溶率(Relative SolubilizationRate,RS)计算方法为RS=(Stot-Sw)/Sw。其中Sw为溶质(增溶质,难溶性药物)的原始溶解度(单位为μg·mL-1);Stot为增溶后的溶解度(单位为μg·mL-1)。
采用增加溶解度有代表性的羟丙基-β-环糊精(常用于制包合物)、聚维酮(常用于制固体分散体)、吐温-20(表面活性剂)、聚乙二醇300(表面活性剂)、泊洛沙姆188(表面活性剂)五种增溶剂,按“4.2”项下,在增溶剂加入量为4%,超声时间为60min,振荡时间为60min条件下制备供试品溶液。计算茯苓酸相对增溶率,以茯苓酸相对增溶率为指标进行考察。结果见表28。
表28增溶剂筛选试验结果
选取增溶效果最好的羟丙基-β-环糊精考察增溶方式,按“4.2”项下条件,在增溶剂加入量为4%,增溶方式分别为仅超声120min,仅振荡120min,超声60min加振荡60min三种不同勾兑方式下制备供试品溶液。计算茯苓酸相对增溶率,以茯苓酸相对增溶率为指标进行考察。结果见表29。
表29勾兑方式考察结果表
4.4.6.3超声时间考察
考察超声时间对勾兑的影响:按照“4.2”项下,在增溶剂加入量为4%,超声时间为20、40、60、80、100min,振荡时间为60min条件下制备供试品溶液。计算茯苓酸相对增溶率,以茯苓酸相对增溶率为指标进行考察。结果见表30、图11。
表30超声时间考察结果表
考察振荡时间对勾兑的影响:按照“4.2”项下,在在增溶剂加入量为4%,超声时间80min,振荡时间为20、30、40、50、60min条件下制备供试品溶液。计算茯苓酸相对增溶率,以茯苓酸相对增溶率为指标进行考察。结果见表31、图6。
表31振荡时间考察结果表
考察增溶物质添加量对勾兑的影响:按照“4.2”项下,在增溶剂加入量分别为1%、2%、3%、4%、5%,超声时间80min,振荡时间为60min条件下制备供试品溶液。计算茯苓酸相对增溶率,以茯苓酸相对增溶率为指标进行考察。结果见表32、图13。
表32增溶物质添加量考察结果表
根据单因素实验结果,设计L9(34)正交实验,对超声时间(A)、振荡时间(B)、增溶剂添加量(C)三个因素进行工艺优化,获得最佳工艺。以茯苓酸相对增溶率为指标,进行试验。并用SPASS22.0软件对实验结果进行分析。
表33茯苓醇提工艺正交实验因素水平表
表35茯苓醪酒勾兑工艺正交实验方差分析结果表
直观分析显示,各因素对综合评分的影响大小为C>A>B,即增溶剂添加量>超声时间>振荡时间;方差分析结果显示,超声时间与增溶剂添加量对工艺的影响均具有统计学意义。结合单因素考察结果,最终确定增溶工艺为A3B1C3。
为验证茯苓醪酒最佳增溶工艺,取最佳工艺验证的茯苓醇提液与茯苓发酵酒,按正交工艺所选的最佳工艺方法进行勾兑,根据优化工艺进行验证实验,结果见表,由表可知,茯苓醪酒勾兑工艺稳定、合理、可行。
表36茯苓醪酒勾兑工艺验证实验结果
茯苓醪酒健脾作用药效研究
1.材料与方法
1.1药物
黍米(批号:20211001,十月稻田);茯苓(批号:220101,青岛天成中药饮片有限公司);大黄(批号220302,青岛天成中药饮片有限公司);
1.2动物
8周龄SPF级SD大鼠50只,雄性,体质量180~220g,合格证编号:NO.370726221100426415,由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供;于山东中医药大学动物实验中心常规饲养,许可证:SYAK(鲁)20170022。
1.3试剂
水合氯醛(批号20190524,国药集团化学试剂有限公司);D-木糖(D-xylose)试剂盒(批号20220427,南京建成生物工程研究所);大鼠胃泌素(GAS)ELISA试剂盒(批号202204,江苏晶美生物科技有限公司);大鼠IL-6,MCP-1,IFN-γ酶联免疫ELISA试剂盒(批号202204,均购自上海酶联生物科技有限公司);碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒(批号20117008H),丙氨酸转氨酶(ALT)检测试剂盒(批号20526011H)均购自山东博科生物产业有限公司;多聚甲醛固定液(批号202201,武汉塞维尔生物科技有限公司)。
1.4仪器
酶标仪(Specctra Max M5,美国Molecular Devices公司);电子天平(YP6001N,上海舜宇恒平科学仪器有限公司);医用低温保存箱(DW-86L626,青岛海尔生物医疗股份有限公司);全自动生化分析仪(BK-280,山东博科生物产业有限公司);高速冷冻离心机(CR21N,德国Eppendorf公司);动物体温计(FT3400,南京卡尔文生物科技有限公司);电热恒温水浴锅(DK-S16,中仪国科(北京)科技有限公司;紫外-可见分光光度计(UV-2700,日本岛津实验器材有限公司);全景切片扫描仪(PANNORAMIC DESK,匈牙利3DHISTECH公司)。
1.5方法
1.5.1大黄水煎液的制备
称取适量大黄饮片于圆底烧瓶中,加8倍量水浸泡30min,100℃加热煮沸30min,过滤,药液另器保存,药渣继续加4倍量水煎煮20min,过滤,合并两次大黄煎煮液,浓缩至1g·mL-1。
1.5.2分组、造模及给药
50只适应性饲养1w的雄性SD大鼠按体质量随机分为2组,正常对照组6只,剩余44只为脾阳虚造模组。造模方法:采用饮食不节、苦寒泻下、疲倦过度三因素相结合的方法建立大鼠脾阳虚模型。造模过程中,大鼠单日禁食,双日给粮,自由饮水。同时造模大鼠每日上午按10ml·kg-1灌胃大黄水煎液,下午于置55×40×33cm3的塑料箱中负重游泳至力竭(即大鼠四肢明显失调,鼻尖没入水下5s,连续3次),每日造模持续15d。造模完成后,将脾阳虚模型复制成功的大鼠根据体质量将分为5组:模型组、茯苓浸渍酒组、茯苓醪酒低中高剂量组。
给药:根据2022版《中国居民膳食指南》中建议的成年人每日酒精摄入量,成人以60kg计,设定成人每日饮用茯苓醪酒100ml为宜。动物分组后,设茯苓醪酒低、中、高剂量组分别为5ml·kg-1体质量、10ml·kg-1体质量和20ml·kg-1体质量(分别相当于人体推荐摄入量的3、6、12倍),由于大鼠最大灌胃量宜为10ml·kg-1体质量,为达到最佳灌胃效果,将茯苓醪酒经旋转蒸发仪浓缩2.5倍后,再用酒基调制成原浓度(最终酒精度均为14%vol);茯苓浸渍酒组浓缩相同倍数后用酒基调制回原浓度(最终酒精度为42%vol),并按浓缩后的8ml·kg-1体质量灌胃;正常对照组与模型组均按8ml·kg-1灌胃生理盐水。给药过程中除正常对照组外,其余大鼠上午继续按10ml·kg-1灌胃大黄水煎液,隔日1次,连续21d,正常对照组给予等体积蒸馏水。
1.5.3形态学观察
观察模型建立前后大鼠体质量与肛温变化以及药物干预过程中各组大鼠体质量变化(每3d对大鼠进行称重),观察并记录每只大鼠的精神状态、运动状况、毛发光泽、大便形状等体征。
1.5.4样品采集
给药第21天后各组大鼠禁食不禁水12h。次日早上对每组大鼠进行称重,并按10mL·kg-1灌胃5%D-xylose溶液。灌胃1h后,用水合氯醛麻醉大鼠,腹主动脉取血,室温静置后,3000r·min-1 4℃离心15min,分离血清存于-80℃冰箱备用。
1.5.5脏器指数测定
采血完成后脱颈处死大鼠,摘取脾脏、胸腺,称重后测定其质量(mg)与体质量(g)的比值,计算脏器指数。
1.5.6血清和肝功能生化指标测定
取出血清,参照试剂盒说明书上操作步骤,分别进行D-xylose、GAS、IFN-γ、IL-6、MCP-1水平测定。全自动生化分析仪检测大鼠血清中ALP、ALT水平。
1.5.7脾脏组织病理学观察
取大鼠相同部位的脾脏组织于4%多聚甲醛中固定48h,石蜡包埋,切片并进行HE染色,观察大鼠脾脏组织损伤。
1.5.8统计学方法
2.1一般形态学考察
正常对照组大鼠反应灵敏,毛发顺滑,饮食正常,精神状态良好。造模大鼠体质量及肛温明显下降(P<0.05),并出现双眼无神,消瘦懒动,毛发稀疏,弓背眯眼,尾巴细瘦,大便溏泄等症状,表明脾阳虚大鼠模型建立成功。药物干预后,各组大鼠精神状态有所好转,随着给药天数的增加,各组大鼠毛发干枯、扎堆蜷缩、大便溏稀等症状减轻,灵敏度及活动度趋向正常。药物干预过程中各组大鼠体质量变化见图14。
注:#P<0.05(与正常对照组比较)
注:#P<0.05(与正常对照组比较)
2.2对各组大鼠脾脏指数和胸腺指数的影响
与正常对照组相比,模型组大鼠脾脏、胸腺质量均明显下降(P<0.01),脾脏指数、胸腺指数虽有所下降但没有统计学差异。与模型组相比,茯苓浸渍酒组脾脏指数下降,其余各给药组也可使脾脏重量与脾脏指数、胸腺重量与胸腺指数升高,差异无统计学意义。具体结果见表3表3各组大鼠脾脏指数和胸腺指数(n=6)
注:#P<0.05,##P<0.01(与正常对照组比较);*P<0.05,**P<0.01(与模型组比较);△P<0.05,△△P<0.01(与茯苓浸渍酒组比较)(下同)。
2.3对大鼠消化吸收功能指标的影响
与正常对照组相比,模型组大鼠血清D-xylose含量明显降低(P<0.01),血清GAS含量显著升高(P<0.01)。与模型组相比,茯苓醪酒中剂量组与茯苓醪酒高剂量组能显著升高血清D-xylose含量(P<0.01)。茯苓醪酒低剂量组与茯苓醪酒中剂量组可显著降低血清GAS含量(P<0.05或P<0.01),其余各组也能降低血清GAS含量,但无统计学差异。与茯苓浸渍酒组比,茯苓醪酒高剂量组血清D-xylose含量增加显著(P<0.01)。具体结果见表4。
2.4对大鼠免疫炎症相关指标的影响
与正常对照组相比,模型组大鼠血清IL-6、MCP-1水平显著升高(P<0.05)、IFN-γ水平显著降低(P<0.01)。与模型组比较,茯苓醪酒中剂量组可显著降低IL-6水平(P<0.01),茯苓浸渍酒组与茯苓醪酒中剂量组可显著降低MCP-1水平(P<0.05或P<0.01),茯苓醪酒中剂量组与茯苓醪酒高剂量组可显著升高IFN-γ水平(P<0.05或P<0.01)。与茯苓浸渍酒组比,茯苓醪酒中剂量组与茯苓醪酒高剂量组血清IFN-γ含量增加显著(P<0.05或P<0.01)。
2.5对大鼠肝功能生化指标的影响
与正常对照组相比,模型组大鼠血清ALP、ALT水平有所升高,但没有统计学差异,茯苓浸渍酒组大鼠血清ALP、ALT水平明显增加(P<0.01)。与茯苓浸渍酒组比较,茯苓醪酒低剂量组和茯苓醪酒中剂量组大鼠血清ALP含量显著降低(P<0.01),茯苓醪酒中剂量组与茯苓醪酒高剂量组血清ALT含量显著降低(P<0.05或P<0.01)。
2.6对大鼠脾脏组织病理学的影响
正常对照组大鼠脾脏切片白髓结构清晰,数量丰富,红髓与白髓分界清楚。与正常对照组相比,模型组大鼠脾脏组织可见大量的白髓萎缩,体积减小,白髓内淋巴细胞数量减少,排列疏松,红髓与白髓分界模糊。各给药组大鼠脾脏组织白髓结构较清晰,淋巴细胞增多且排列紧密,红髓与白髓分界较清晰。
参见图15,A:正常对照组;B:模型组;C:茯苓浸渍酒组;D:茯苓醪酒低剂量组;E:茯苓醪酒中剂量组;E茯苓醪酒高剂量组。
综上所述,本发明提供了一种茯苓醪酒制备工艺包括茯苓醪酒制备工艺,包括S1、将茯苓粉碎为粉末,加入60%~80%乙醇提取40min~80min,分别收集提取完成后的茯苓粗粉与茯苓醇提液,茯苓醇提液经旋转蒸发回收乙醇;S2、将黍米倒入缸中,加入清水,浸渍24h;S3、浸渍完成后,往缸中加入适量底浆,倒入沸水,进行搅动,使此时温度为55°~70℃;8~12min后,再次搅动,使烫米水降温至35~50℃,加水继续浸渍24h;S4、浸渍后的米用水洗后捞出,与所述步骤S1处理的茯苓粉一同加入到沸水中进行煮糜;S5、待煮好的糜温度降至约50℃~70℃,加入8%~10%麦曲糖化时间为20~60min;S6、将活化好的黄酒酵母加入到糖化好的糜中,搅拌均匀后装坛发酵;S7、发酵完毕,经压榨澄清后得到茯苓醪酒,茯苓醪酒中加入一定量羟丙基-β-环糊精,与S1中回收乙醇的茯苓醇提液进行勾兑,振荡搅拌一定时间;S8、勾兑完成的茯苓酒经澄清,再经过加温灭菌。本发明所制备的茯苓酒含有三萜类化合物的成分比例高,提高了茯苓酒的药效作用,能够更好地满足人们健脾和胃、提高免疫力的需求。
当然,本发明还可有其它多种实施例,在不背离本发明精神及其实质的情况下,熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形,但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
Claims (6)
1.一种茯苓醪酒制备工艺,其特征在于,包括:
S1、将茯苓粉碎为粉末,加入60%~80%乙醇提取40min~80min,分别收集提取完成后的茯苓粗粉与茯苓醇提液,茯苓醇提液经旋转蒸发回收乙醇;
S2、将黍米倒入缸中,加入清水,浸渍24h;
S3、浸渍完成后,往缸中加入适量底浆,倒入沸水,进行搅动,使此时温度为55°~70℃;8~12min后,再次搅动,使烫米水降温至35~50℃,加水继续浸渍24h;
S4、浸渍后的米用水洗后捞出,与所述步骤S1处理的茯苓粉一同加入到沸水中进行煮糜;
S5、待煮好的糜温度降至约50℃~70℃,加入8%~10%麦曲糖化时间为20~60min;
S6、将活化好的黄酒酵母加入到糖化好的糜中,搅拌均匀后装坛发酵;
S7、发酵完毕,经压榨澄清后得到茯苓醪酒,茯苓醪酒中加入一定量羟丙基-β-环糊精,与S1中回收乙醇的茯苓醇提液进行勾兑,振荡搅拌一定时间;
S8、勾兑完成的茯苓酒经澄清,再经过加温灭菌。
2.根据权利要求1所述的茯苓醪酒制备工艺,其特征在于,所述步骤S1中的茯苓醇提液采用高效液相色谱检测去氢土莫酸与茯苓酸含量;其中,色谱检测仪所选择的色谱柱条件为WondaSil C18(250mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈(A)-0.05%磷酸水(B),梯度洗脱(0~9min,65%A,9~16min,65%A→68%A,16~24min,68%A→70%A,24~35min,70%A→73%A);流速:1.0mL·min-1;柱温:30℃;进样量:10μL;检测波长:220nm。
3.根据权利要求1所述的茯苓醪酒制备工艺,其特征在于,对所述步骤S1中所获得的茯苓醇提液取样并进行综合评分测定,其中,综合评分=50%茯苓酸得率+50%去氢土莫酸得率。
4.根据权利要求3所述的茯苓醪酒制备工艺,其特征在于,所述步骤S1中按照综合评分获取最佳原料配比,获取加入为70%乙醇,提取时间为60min,并获取8倍不同溶剂量的供试品溶液时获取的综合评分最高。
5.根据权利要求1所述的茯苓醪酒制备工艺,其特征在于,所述步骤S5中,糖化结果采用3,5二硝基水杨酸比色法通过紫外分光光度计检测。
6.根据权利要求1所述的茯苓醪酒制备工艺,其特征在于,所述步骤S7中,通过相对增溶率计算三萜类的溶解效果;
相对增溶率(Relative SolubilizationRate,RS)计算方法为RS=(Stot-Sw)/Sw;其中,Sw为溶质(增溶质,难溶性药物)的原始溶解度(单位为μg·mL-1);Stot为增溶后的溶解度(单位为μg·mL-1)。
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CN (1) | CN115521840B (zh) |
Citations (7)
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---|---|---|---|---|
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2022
- 2022-09-30 CN CN202211217881.3A patent/CN115521840B/zh active Active
Patent Citations (7)
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Title |
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邵玉明等: "《新编特效药酒大全》", 甘肃科学技术出版社, pages: 1283 - 221 * |
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CN115521840B (zh) | 2024-05-03 |
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