CN104107193A - 用于增强免疫力的石金钱龟提取物、其制剂及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于增强免疫力的石金钱龟提取物，它是将石金钱龟的龟肉和龟甲分别用水和乙醇进行提取，龟肉提取液和龟甲提取液分别浓缩、干燥后，按0.5-3∶1的比例混合制成的。本发明还公开了该提取物的制备方法和含有该提取物的制剂，以及该制剂的制备方法。所制得的石金钱龟提取物具有显著的增强免疫力的作用，由该提取物制得的胶囊剂含药量大，性质稳定，在正常室温条件下可贮存两年，不吸潮，不变质，口感好，服药顺应性佳，患者在服药时和服药后不会感觉到难受的腥味。

Description

用于增强免疫力的石金钱龟提取物、其制剂及制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于增强免疫力的石金钱龟提取物，本发明还涉及该提取物的制备方法和由该提取物制成的制剂。

背景技术

免疫是指机体接触“抗原性异物”或“异己成分”的一种特异性生理反应，它是机体在进化过程中获得的“识别自身、排斥异己”的一种重要生理功能。免疫系统对维持机体正常生理功能具有重要意义。免疫功能低下，会对机体健康产生极为不利的影响，使多种传染病、非传染病的发病率和死亡率提高，其中引人关注的有恶性癌症、糖尿病等。造成机体免疫下降的原因有多种，诸如营养失衡、精神或心理因素、年龄增大、慢性疾病、药物、应激、内分泌失调和遗传因素等。

免疫调节药物或功能食品主要用于机体免疫功能障碍的疾病，如可增强由于肿瘤、衰老、慢性病毒感染(肝炎、艾滋病等)造成的免疫功能低下，或抑制器官移植后排斥反应及自身免疫性疾病时某些不正常的免疫反应。

石金钱龟，学名黄喉拟水龟(Mauremys mutica Cantor)，两广俗称石龟，分类上隶属龟鳖目、龟科、拟水龟属。国内主要分布于江浙、安徽、两广、海南、福建及台湾，国外分布于越南。石金钱龟是一种食药兼用的龟类，具有观赏价值及较高的营养价值和多种医疗保健功能，民间有可治疗癌症之说，其增强免疫力和抗肿瘤功效备受人们关注，中国古代书籍如“神农本草”、“山海经”和“本草纲目”都有关于龟类作为药材的记载。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种石金钱龟提取物。

本发明的第二个目的是提供一种该提取物的制备方法。

本发明的第三个目的是提供一种由该提取物制成的制剂。

本发明的第四个目的是提供一种该制剂的制备方法。

一种用于增强免疫力的石金钱龟提取物，它是将石金钱龟的龟肉和龟甲分别用水和乙醇进行提取，龟肉提取液和龟甲提取液分别浓缩、干燥后，按0.5-3∶1的比例混合制成的。

本发明的石金钱龟提取物对小鼠的免疫损伤起到恢复作用，可增加免疫低下小鼠的脾脏指数、胸腺指数、以及单核-巨噬细胞的吞噬指数，说明本发明提取物对免疫低下小鼠的胸腺、脾脏有保护作用，能促进免疫低下小鼠巨噬细胞吞噬功能的恢复。

该提取物的制备方法包括以下步骤：

1)龟肉的提取：取龟肉，加水煎煮提取1-3次，每次1-3小时，提取液合并后减压浓缩，冷冻干燥，得凝胶状的龟肉提取物；

2)龟甲的提取：取龟甲，用质量浓度为30-80％的乙醇溶液回流提取1-3次，每次1-3小时，提取液合并后减压浓缩，冷冻干燥，得凝胶状的龟甲提取物；

3)将龟肉提取物与龟甲提取物按0.5-3∶1的比例均匀混合，即得。

优选的制备方法是：

1)龟肉的提取：取龟肉，加水煎煮提取3次，第一次和第二次2小时，第三次1.5小时，提取液合并后减压浓缩，冷冻干燥，得凝胶状的龟肉提取物；

2)龟甲的提取：取龟甲，先用质量浓度为50％的乙醇溶液回流提取2.5小时，再用质量浓度为80％的乙醇溶液回流提取2小时，提取液合并后减压浓缩，冷冻干燥，得凝胶状的龟甲提取物；

3)将龟肉提取物与龟甲提取物按2∶1的比例均匀混合，即得。

本发明进一步提供了一种用于增强免疫力的胶囊剂，该胶囊剂含有所述的石金钱龟提取物，所述胶囊剂的内容物由下述重量百分比的成分组成：

优选的，所述胶囊剂的内容物由下述重量百分比的成分组成：

一种制备所述胶囊剂的方法，包括以下步骤：

1)取β-环糊精，加水，加热至70-80℃，制成β-环糊精饱和溶液；

2)将石金钱龟提取物溶于β-环糊精饱和溶液中，在70-80℃下搅拌0.5-1小时，然后将温度降至0-5℃，使石金钱龟提取物和β-环糊精从溶液中析出；

3)将析出的沉淀过滤，干燥，粉碎成细粉，与淀粉、微粉硅胶混匀后制粒；

4)将羟丙基甲基纤维素制成质量浓度为0.5-1.5％的溶液，将颗粒用羟丙基甲基纤维素溶液包衣，干燥后与香精混匀，最后用胶囊填充。

本发明中所涉及的回流提取、减压浓缩、冷冻干燥、制粒、包衣等方法均为本领域的常规操作方法。

由于石金钱龟提取物具有强烈的刺鼻腥味，难以直接服用，即使是制成胶囊剂，药物在胃内崩散后仍会迅速散发出强烈腥味，导致患者难以接受，服药顺应性极差。另外，由于石金钱龟提取物含有大量的蛋白、氨基酸、多肽等物质，导致稳定性很差，极易吸潮、变质。因此，本发明在制备胶囊时，通过加入特殊的辅料和采用特殊的工艺，较好地解决了以上问题。首先，将石金钱龟提取物与β-环糊精饱和溶液进行搅拌，使石金钱龟提取物中的腥味物质和小分子脂溶性成分被包合于β-环糊精的筒状结构中，从而达到掩味和提高稳定性的作用；其次，由于微粉硅胶具有极其蓬松的结构，分子之间具有巨大的空隙，其比表面积在70-400m/g之间，具有极强的吸附能力，在本发明中可用于防止吸潮并吸附挥发性的腥味成分；再次，本发明还采用了薄膜包衣技术，将颗粒薄膜包衣后进一步提高了其稳定性并掩盖了不良气味；最后，本发明还加入了香精矫味。

本发明的有益效果是：所制得的石金钱龟提取物具有显著的增强免疫力的效果，而且效果高于其它的龟类提取物。由该提取物制得的胶囊剂含药量大，性质稳定，在正常室温条件下可贮存两年，不吸潮，不变质，口感好，服药顺应性佳，患者在服药时和服药后不会感觉到难受的腥味。

附图说明

图1是石金钱龟提取物对正常小鼠体重的影响(n＝10)。

图2是石金钱龟提取物对免疫低下小鼠体重的影响(n＝10，与模型组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1石金钱龟提取物的制备和主要成分检测

1、石金钱龟提取物制备：取多年生石金钱龟于40℃水中15min，促使龟排尿；取出龟，放入100℃水中热烫，至使龟完全死亡，外甲皮松；趁热剥除外层黑甲及四肢和头部外皮，沿上下甲板线撬开龟甲，尽量不破坏其内脏；沿甲边缘剔开皮肉，去除内脏，肉与甲分装，做好标记，内脏及外层黑甲与四肢外皮去除不要；将肉切成小块，洗去血污，于冰箱中冷藏，贴标签；将龟甲掰成小块，洗净，常温封存。

1.1龟肉的提取：

将龟肉置于蒸煮锅内，加入适量蒸馏水，熬制2h，在熬制过程中，控制水温不爆沸但一直均匀沸腾，水量淹没龟肉，至汤汁呈白色(微黄)浓稠；将汤汁趁热抽滤；抽滤后的残渣继续加蒸馏水煮制，熬2h至汤汁浓稠，再次抽滤；抽滤后的残渣第三次熬制1.5h至汤汁较浓，再次抽滤。将三次的抽滤液混合，采用旋转蒸发仪减压蒸馏浓缩，蒸馏温度50-55℃，至基本无冷凝液滴下，将浓缩物倒入塑料杯中，保鲜膜封口置于4℃冷藏，得龟肉总提取物，并盛于塑料烧杯中冻存，冷冻干燥，提取物冻成块状凝胶。

1.2龟甲的提取：

将龟甲尽量掰碎，洗净置于1000ml圆底烧瓶，加入500ml50％的乙醇，接冷凝管回流煮制2.5h；第一次煮出液趁热抽滤，得第一次浓缩液；龟甲中加入80％乙醇，继续提取2h；将两次提取液合并，采用旋转蒸发仪减压蒸馏浓缩，得龟甲提取物，并盛于塑料烧杯中冻存，冷冻干燥，冻成凝胶状。

1.3石金钱龟提取物制备

石金钱龟提取物按龟肉提取物：龟甲提取物＝2：1比例混合均匀制得。

2、石金钱龟提取物主要成分分析

2.1龟肉、龟甲提取物干燥样品的水分含量测定

利用红外高温照射，使龟肉或者龟甲提取物中的水分蒸发，从而计算样品中的水分含量。结果见表1。

表1龟甲、龟肉提取物干燥样品的水分含量(n＝3)

样品	含水量(％)
		龟甲提取物	2.970±0.063
龟肉提取物	4.210±0.084

2.2龟肉、龟甲提取物干燥样品的胆固醇含量测定

当固醇类化合物与酸作用时，可脱水并发生聚合反应，产生颜色物质，因此可先对食品样品进行提取和皂化，用磷硫铁试剂作为显色剂，测定食品中胆固醇的含量。在样品的冰乙酸提取液中加磷硫铁试剂，胆固醇与试剂反应产生紫红色化合物，颜色的深浅与胆固醇的量成正比，可用分光光度计在波长560nm处测定。结果见表2。

表2龟甲、龟肉提取物干燥样品的胆固醇含量(n＝3)

样品	胆固醇含量mg/100g
		龟甲提取物	143.63±5.79
龟肉提取物	212.14±8.95

2.3龟肉、龟甲提取物干燥样品的蛋白质含量测定

按考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量，考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大吸收波长在488nm；当它与蛋白质结合后变为蓝色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。结果见表3。

表3龟甲、龟肉提取物干燥样品的蛋白质含量(n＝3)

样品	蛋白质含量(mg/100g)
		龟甲提取物	228.92±12.35
龟肉提取物	278.43±16.12

2.4龟肉、龟甲提取物干燥样品的氨基酸含量测定

氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮反应，生成蓝紫色化合物(脯氨酸除外)，最大吸收波长在570nm处，在一定的浓度范围内，有色物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，可在570nm处用分光光度法测定。结果见表4。

表4龟甲、龟肉提取物干燥样品的氨基酸含量(n＝3)

样品	氨基酸含量(mg/100g)
		龟甲提取物	133.45±10.96
龟肉提取物	124.93±11.33

实施例2石金钱龟提取物的药效学试验

一、试验方法

1、石金钱龟提取物对正常小鼠体重及免疫器官指数的影响试验方法

昆明小鼠，雌雄各半，18-22g，购于湖北省疾病预防控制中心实验动物中心(实验动物合格证号：SCXK2008-0005)。饲养条件：雌雄分开喂养，温度24±2℃，湿度50-70％，每天添加饲料2次，换水1次，每2d更换1次垫料，动物自由进食、饮水。将30只昆明小鼠随机分为正常对照组(给予等体积生理水)、石金钱龟提取物低剂量组(250mg/kg)、高剂量组(500mg/kg)，每组10只。各组小鼠均采取连续灌胃10天，按以上计量灌胃给药(0.2ml/10g)，每天1次。小鼠体重每天称量1次。末次给药前12h禁食不禁水，于末次给药1h后，脱颈椎处死小鼠，取胸腺和脾脏精密称取湿重，按照如下公式计算脏器系数。

2、石金钱龟提取物对免疫低下小鼠体重及免疫器官指数的影响试验方法

昆明小鼠，雌雄各半，18-22g，购于湖北省疾病预防控制中心实验动物中心(实验动物合格证号：SCXK2008-0005)。饲养条件：雌雄分开喂养，温度24±2℃，湿度50-70％，每天添加饲料2次，换水1次，每2d更换1次垫料，动物自由进食、饮水。将40只昆明小鼠随机分为正常对照组(给予等体积生理水)、模型组(给予等体积生理水并腹腔注射环磷酰胺)、石金钱龟提取物低剂量组(250mg/kg)、高剂量组(500mg/kg)，每组10只。小鼠分组后先灌胃给药3天，第4天开始除正常对照组外，其余各组均腹腔注射环磷酰胺80mg/kg，连续3天制造免疫功能低下小鼠模型，造模期间各组均采取上述给药方式给药，造模后再给药4天。小鼠体重每天称量1次。末次给药前12h禁食不禁水，于末次给药1h后，脱颈椎处死小鼠，取胸腺和脾脏精密称取湿重，按照如下公式计算脏器系数。

3、石金钱龟提取物对免疫低下小鼠单核-巨噬细胞系统碳粒廓清功能的影响试验方法

昆明小鼠，雌雄各半，18-22g，购于湖北省疾病预防控制中心实验动物中心(实验动物合格证号：SCXK2008-0005)。饲养条件：雌雄分开喂养，温度24±2℃，湿度50-70％，每天添加饲料2次，换水1次，每2d更换1次垫料，动物自由进食、饮水。将40只昆明小鼠随机分为正常对照组(给予等体积生理水)、模型组(给予等体积生理水并腹腔注射环磷酰胺)、石金钱龟提取物低剂量组(250mg/kg)、高剂量组(500mg/kg)，每组10只。小鼠分组后先灌胃给药3天，第4天开始除正常对照组外，其余各组均腹腔注射环磷酰胺80mg/kg，连续3天制造免疫功能低下小鼠模型，造模期间各组均采取上述给药方式给药，造模后再给药4天。小鼠体重每天称量1次。末次给药前12h禁食不禁水，于末次给药1h后，从尾静脉注入墨汁稀释液，立即计时。分别在注入墨汁后1min(t1)和6min(t2)，用经肝素处理的定量毛细管由小鼠眼眶后静脉丛取血25μL，并立即加入到0.1％Na₂CO₃溶液3mL中，用毛细管吹打均匀，混匀后于675nm处测定吸光度，以Na₂CO₃溶液作为空白对照。脱臼处死小鼠取肝和脾并称重，以碳粒廓清率K值和吞噬指数α值表示小鼠单核-巨噬细胞系统碳粒廓清功能。

碳粒廓清率K＝(lgA1-lgA2)/(t2-t1)

吞噬指数α＝K^1/3×体重/(肝重+脾重)

二、试验结果

1、石金钱龟提取物对正常小鼠体重及免疫器官指数的影响

石金钱龟提取物对正常小鼠体重及免疫器官指数没有显著性影响，结果见图1和表5。

表5石金钱龟提取物对正常小鼠免疫器官指数的影响(n＝10)。

分组	剂量	胸腺指数(mg/g)	脾脏指数(mg/g)
				空白组	生理盐水	0.368±0.081	0.521±0.091
石金钱龟低剂量组	250mg/kg	0.322±0.109	0.568±0.087
				石金钱龟高剂量组	500mg/kg	0.360±0.087	0.499±0.166

与空白组比较，*表示P<0.05

2、石金钱龟提取物对免疫低下小鼠体重及免疫器官指数的影响

试验结果表明，在没有使用环磷酰胺时的前3天小鼠体重有明显增重现象，从第4天开始对小鼠进行腹腔注射环磷酰胺，连续给药3天，从第四天开始，除空白组外，其余小鼠体重开始有明显下降。石金钱龟各给药组相比于模型组，小鼠体重有显著性增加，说明石金钱龟提取物对小鼠的免疫损伤起到恢复作用。高剂量组的小鼠体重一直高于低剂量，说明高剂量组的免疫效果比低剂量组的免疫效果要好。

与正常空白组比较，模型组小鼠胸腺指数、脾脏指数均大大下降，其差异有统计学意义(P<0.01)，说明造模成功；与模型组相比，石金钱龟提取物低剂量、高剂量组可极显著性增加免疫低下小鼠的脾脏指数(P<0.01),同时石金钱龟提取物低剂量、高剂量组均可极显著增加免疫低下小鼠的胸腺指数(P<0.01)。结果见图2和表6。

表6石金钱龟提取物对免疫低下小鼠免疫器官指数的影响(n＝10)。

分组	剂量	胸腺指数(mg/g)	脾脏指数(mg/g)
				空白组	生理盐水	0.387±0.081**	0.540±0.152**
模型组	生理盐水	0.084±0.044	0.464±0.083
				石金钱龟低剂量组	250mg/kg	0.152±0.083*	0.993±0.356**
石金钱龟高剂量组	500mg/kg	0.159±0.075**	1.242±0.365**

与模型组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01

3、石金钱龟提取物对免疫低下小鼠单核-巨噬细胞系统碳粒廓清功能的影响

试验结果表明，与正常空白组相比，模型对照组小鼠的吞噬指数、吞噬系数显著降低(P<0.01)，说明采用环憐酰胺成功建立免疫低下小鼠模型。与模型组相比，石金钱龟提取物高剂量组可极显著增加免疫低下小鼠的吞噬指数(P<0.01)；石金钱龟提取物低剂量组可显著增加免疫低下小鼠的吞噬指数(P<0.05)；与模型组相比，石金钱龟提取物高剂量组可极显著增加免疫低下小鼠的吞噬系数(P<0.01)；石金钱龟提取物低剂量组可显著增加免疫功能抑制小鼠的吞噬系数(P<0.05)。提示石金钱龟提取物对环磷酰胺致免疫低下小鼠的胸腺、脾脏有一定的保护作用，促进免疫低下小鼠巨噬细胞吞噬功能的恢复。结果表7。

表7石金钱龟提取物对免疫低下小鼠单核-巨噬细胞系统碳粒廓清功能的影响(n＝10)。

分组	剂量	吞噬指数K	吞噬系数α
				空白组	生理盐水	0.043±0.020**	6.379±1.19**
模型组	生理盐水	0.029±0.029	5.630±1.13
				石金钱龟低剂量组	250mg/kg	0.067±0.05*	6.604±1.81*
石金钱龟高剂量组	500mg/kg	0.072±0.059**	6.523±1.65**

与模型组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01

实施例3不同龟甲和龟肉比例的提取物对免疫低下小鼠免疫器官指数的影响分别按龟肉提取物∶龟甲提取物＝1∶2、1∶1、2∶1、3∶1的比例制备提取物，按实施例2中的试验方法2考察提取物对免疫低下小鼠免疫器官指数的影响，结果见表8。

表8不同龟甲和龟肉比例的提取物对免疫低下小鼠免疫器官指数的影响(n＝10)。

分组	剂量	胸腺指数(mg/g)	脾脏指数(mg/g)
				空白组	生理盐水	0.393±0.096**	0.552±0.143**
模型组	生理盐水	0.094±0.054	0.428±0.099
				龟肉：龟甲＝1：2提取物组	500mg/kg	0.147±0.075**	0.764±0.201**
龟肉：龟甲＝1：1提取物组	500mg/kg	0.150±0.062**	0.931±0.284**
				龟肉：龟甲＝2：1提取物组	500mg/kg	0.179±0.095**	1.127±0.431**
龟肉：龟甲＝3：1提取物组	500mg/kg	0.164±0.069**	0.890±0.337**

与模型组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01

与模型组相比，石金钱龟不同比例提取物均可显著提高免疫低下小鼠的脾脏指数和胸腺指数(P<0.01)；龟肉提取物∶龟甲提取物＝2∶1时对免疫损伤小鼠免疫器官指数升高的效果最好。

实施例4

一种用于增强免疫力的胶囊剂，所述胶囊剂的内容物由下述重量百分比的成分组成：

制备方法是：

1)取β-环糊精，加水，加热至70℃，制成β-环糊精饱和溶液；

2)将石金钱龟提取物溶于β-环糊精饱和溶液中，在70℃下搅拌1小时，然后将温度降至0℃，使石金钱龟提取物和β-环糊精从溶液中析出；

3)将析出的沉淀过滤，干燥，粉碎成细粉，与淀粉、微粉硅胶混匀后制粒；

4)将羟丙基甲基纤维素制成质量浓度为0.5％的溶液，将颗粒用羟丙基甲基纤维素溶液包衣，干燥后与香精混匀，用胶囊填充。

实施例5

一种用于增强免疫力的胶囊剂，所述胶囊剂的内容物由下述重量百分比的成分组成：

制备方法是：

1)取β-环糊精，加水，加热至80℃，制成β-环糊精饱和溶液；

2)将石金钱龟提取物溶于β-环糊精饱和溶液中，在80℃下搅拌0.5小时，然后将温度降至5℃，使石金钱龟提取物和β-环糊精从溶液中析出；

3)将析出的沉淀过滤，干燥，粉碎成细粉，与淀粉、微粉硅胶混匀后制粒；

4)将羟丙基甲基纤维素制成质量浓度为1.5％的溶液，将颗粒用羟丙基甲基纤维素溶液包衣，干燥后与香精混匀，最后用胶囊填充。

实施例6

一种用于增强免疫力的胶囊剂，所述胶囊剂的内容物由下述重量百分比的成分组成：

Claims (6)

1.一种用于增强免疫力的石金钱龟提取物，其特征在于：它是将石金钱龟的龟肉和龟甲分别用水和乙醇进行提取，龟肉提取液和龟甲提取液分别浓缩、干燥后，按0.5-3∶1的比例混合制成的。

2.一种用于增强免疫力的石金钱龟提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)龟肉的提取：取龟肉，加水煎煮提取1-3次，每次1-3小时，提取液合并后减压浓缩，冷冻干燥，得凝胶状的龟肉提取物；

2)龟甲的提取：取龟甲，用质量浓度为30-80％的乙醇溶液回流提取1-3次，每次1-3小时，提取液合并后减压浓缩，冷冻干燥，得凝胶状的龟甲提取物；

3)将龟肉提取物与龟甲提取物按0.5-3∶1的比例均匀混合，即得。

3.根据权利要求2所述用于增强免疫力的石金钱龟提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)龟肉的提取：取龟肉，加水煎煮提取3次，第一次和第二次2小时，第三次1.5小时，提取液合并后减压浓缩，冷冻干燥，得凝胶状的龟肉提取物；

2)龟甲的提取：取龟甲，先用质量浓度为50％的乙醇溶液回流提取2.5小时，再用质量浓度为80％的乙醇溶液回流提取2小时，提取液合并后减压浓缩，冷冻干燥，得凝胶状的龟甲提取物；

3)将龟肉提取物与龟甲提取物按2∶1的比例均匀混合，即得。

4.一种用于增强免疫力的胶囊剂，其特征在于含有权利要求1所述的石金钱龟提取物，所述胶囊剂的内容物由下述重量百分比的成分组成：

5.根据权利要求4所述用于增强免疫力的胶囊剂，其特征在于所述胶囊剂的内容物由下述重量百分比的成分组成：

6.一种制备权利要求4所述胶囊剂的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)取β-环糊精，加水，加热至70-80℃，制成β-环糊精饱和溶液；

2)将石金钱龟提取物溶于β-环糊精饱和溶液中，在70-80℃下搅拌0.5-1小时，然后将温度降至0-5℃，使石金钱龟提取物和β-环糊精从溶液中析出；

3)将析出的沉淀过滤，干燥，粉碎成细粉，与淀粉、微粉硅胶混匀后制粒；

4)将羟丙基甲基纤维素制成质量浓度为0.5-1.5％的溶液，将颗粒用羟丙基甲基纤维素溶液包衣，干燥后与香精混匀，最后用胶囊填充。