CN114981287A - 阿里他汀相关化合物、经缀合阿里他汀化合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明总体上涉及阿里他汀家族的新型化合物、用于将有效载荷偶合至另一个分子诸如靶结合分子的新型接头、新型接头‑毒素分子以及允许受控的位点特异性缀合的新型抗体分子。

Description

阿里他汀相关化合物、经缀合阿里他汀化合物及其使用方法
相关申请的交叉引用
本发明要求2020年1月6日提交的美国临时申请第62/957,780号的权益，该美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开总体上涉及阿里他汀(auristatin)家族的新化合物。本公开总体上还涉及用于将有效载荷与另一分子(诸如靶结合分子)偶合的新型接头。本公开总体上还涉及新型接头-毒素分子。本公开涉及与新型接头-毒素分子缀合的靶结合分子，其中所述毒素是阿里他汀家族的新型化合物。
对序列表的引用
依据美国联邦法规(C.F.R.)第37章第1.821条以计算机可读形式(ASCII格式)通过EFS-Web以电子方式同时提交的文件名为CYTX_070_PCT_ST25.txt序列表通过引用并入本文。该序列表的ASCII副本创建于2021年1月6日，并且大小为48千字节。
背景技术
几种称为尾海兔素的短肽化合物已从天然来源中被分离出来，或者/并且被发现通过结合微管蛋白和阻断微管蛋白的聚合而具有抗有丝分裂生物活性。还制备了这些化合物的类似物(称为阿里他汀)，并且一些被发现具有相似的活性。
此类分子通过化学接头与靶标结合部分(例如靶标特异性单克隆抗体)缀合而用于治疗，从而以靶标特异性方式递送毒性有效载荷。此类分子的功效和安全性可以取决于毒素的性质和连接接头的稳定性，因为稳定性低的接头会使药物原位释放，从而潜在地增加药物的毒性和耐受性。
药物与抗体或可活化抗体的缀合通常依赖于将药物与重链或轻链上的氨基或巯基侧链连接的化学反应。然而，对这些天然氨基酸残基的依赖可能会导致缀合后药物和抗体(DAR)之间的化学计量发生变化，或者导致需要减少抗体来破坏现有的半胱氨酸二硫键以允许缀合。
因此，在该领域存在对具有合适的功效和足够稳定的接头的药物的持续需求。在该领域还存在对允许受控的位点特异性缀合的新型抗体变体的持续需求。
发明内容
本文提供了式(I)、(II)和(III)的化合物；
Figure BDA0003732481060000021
其中R1是氢或C1-6烷基，并且其中R选自以下组成的组：氢、C1-6烷基、接头或基团X1-Y1-*，其中*是与氮的附接点，
Figure BDA0003732481060000031
其中R3是附接至式(II)的剂，其中所述附接点是氮、硫、氧或碳原子，并且其中R2是附接至式(II)的部分，其中所述附接点选自由以下组成的组：氯基团、碘基团、溴基团和巯基基团，
Figure BDA0003732481060000032
其中R2是附接至式(III)的部分，其中附接点选自以下组成的组：氯基团、碘基团、溴基团和巯基基团。
本文提供了抗体和可活化抗体，其中Kabat位置328是半胱氨酸。在一些实施方案中，式(I)、(II)和(III)的化合物与多肽缀合。在一些实施方案中，式(I)、(II)或(III)的化合物与抗体的位于Kabat位置328处的半胱氨酸的侧链巯基基团缀合。
在本公开的式(I)化合物的一些实施方案中，Y1为氧基羰基基团，且X1为C1-6烷基基团、9-芴基甲基基团、苄基基团或叔丁基基团。在式(I)化合物的一些实施方案中，R1是甲基基团，且R是氢。在式(I)化合物的一些实施方案中，X1-Y1是9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)基团。
在本公开的式(II)化合物的一些实施方案中，R2是靶结合部分，其中R2处的附接点是巯基基团。在式(II)化合物的一些实施方案中，该靶结合部分是与靶特异性地结合的分离的抗体或其抗原结合片段(AB)。在式(II)化合物的一些实施方案中，该靶结合抗体是在经活化状态下与靶特异性地结合的可活化抗体，并且所述可活化抗体包含：与靶特异性地结合的抗体或其抗原结合片段(AB)；与AB偶合的掩蔽部分(MM)，其中当可活化抗体处于未经切割的状态时，所述MM抑制AB与靶的结合；以及与AB偶合的可切割部分(CM)，其中所述CM是起到蛋白酶底物作用的多肽。在式(II)的一些实施方案中，MM的与AB结合的解离常数大于AB与其靶的解离常数，当可活化抗体处于被切割状态，MM不干扰或竞争AB与其靶的结合，MM为长度不超过40个氨基酸的多肽，MM多肽序列与靶序列不同，并且/或者MM多肽序列与AB的任何天然结合伴侣的同一性不超过50％。在式(II)的一些实施方案中，靶选自由CD44、CD147、CD166、ITGa3、ITGb1、PSMA和SLC34A2组成的组。在式(II)的一些实施方案中，所述剂选自阿里他汀E、单甲基阿里他汀F(MMAF)、单甲基阿里他汀E(MMAE)、单甲基阿里他汀D(MMAD)、类美登素(maytansinoid)DM4、类美登素DM1、卡奇霉素(calicheamicin)、多卡米星(duocarmycin)、吡咯并苯二氮
Figure BDA0003732481060000041
和吡咯并苯二氮
Figure BDA0003732481060000042
二聚体。
在式(I)的一些实施方案中，R是接头。在一些实施方案中，该接头是可切割接头。在一些实施方案中，该接头与靶结合部分连接。在一些实施方案中，该靶结合部分是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，靶选自由CD44、CD147、CD166、ITGa3、ITGb1、PSMA和SLC34A2组成的组。在一些实施方案中，所述抗体或可活化抗体包含位于Kabat位置328处的半胱氨酸残基。
在一些实施方案中，式(I)、(II)或(III)化合物连接至多肽的巯基基团。在一些实施方案中，该巯基基团是半胱氨酸残基的巯基基团侧链。在一些实施方案中，该半胱氨酸残基是抗体的Kabat位置328处的半胱氨酸残基。
在本公开的一些实施方案中，提供了一种将化合物与多肽缀合的方法，所述方法包括将式(I)化合物与该多肽缀合，其中R1是氢或C1-6烷基，其中R选自由以下组成的组：氢、C1-6烷基、接头或基团X1-Y1-*，其中*是与氮的附接点；并且其中Y1为氧基羰基基团，且X1为C1-6烷基基团、9-芴基甲基基团、苄基基团或叔丁基基团，其中至少一当量的式(I)化合物或其衍生物与该多肽缀合。
在本公开的一些实施方案中，提供了一种将化合物与多肽缀合的方法，所述方法包括将式(II)化合物与该多肽缀合，其中R2是附接至式(II)的部分，其中附接点选自由以下组成的组：氯基团、碘基团、溴基团和巯基基团。
在本公开的一些实施方案中，将化合物与多肽缀合的方法包括用还原剂还原该多肽，其中至少一个二硫基团被还原成游离巯基基团；在不氧化该游离巯基基团的情况下用氧化剂再氧化该多肽，以及将式(I)或(III)化合物与该游离巯基基团缀合。
附图说明
图1是本公开的阿里他汀物质的合成路径的示意概述图。
图2A和图2B示出描绘本公开的接头在活化的组织蛋白酶B中的示例性体外稳定性的曲线图。
图3A和图3B示出描绘本公开的接头在活化的溶酶体中的示例性体外稳定性的曲线图。
图4示出接头-毒素活化和接头-毒素与抗体缀合的示例性方法的工艺流程图。
具体实施方式
本公开总体上涉及阿里他汀(auristatin)家族的新化合物。本公开总体上还涉及用于将有效载荷与另一分子(诸如靶结合分子)偶合的新型接头。本公开总体上还涉及新型接头-毒素分子。此类实施方案的实例描述于以下实施例中。
在一些实施方案中，可以与本公开的化合物缀合的靶结合部分包括抗PSMA抗体，其实例描述于以下序列中：
表1.VL CDR氨基酸序列
Figure BDA0003732481060000061
表2.VH CDR氨基酸序列
Figure BDA0003732481060000062
表3.VL FR氨基酸序列
Figure BDA0003732481060000071
表4.VH FR氨基酸序列
Figure BDA0003732481060000072
表5.VL结构域氨基酸序列
可变区(双下划线)、恒定区(虚线下划线)
Figure BDA0003732481060000081
表6.VH结构域氨基酸序列
可变区(双下划线)、恒定区(虚线下划线)
Figure BDA0003732481060000082
表7.VL核酸序列
Figure BDA0003732481060000091
表8.VH核酸序列
Figure BDA0003732481060000101
在一些实施方案中，可以与本公开的化合物缀合的靶结合部分包括抗SLC34A2抗体，其实例描述于以下序列中：
表9.VL CDR氨基酸序列
Figure BDA0003732481060000111
表10.VH CDR氨基酸序列
Figure BDA0003732481060000112
表11.VL FR氨基酸序列
Figure BDA0003732481060000113
表12.VH FR氨基酸序列
Figure BDA0003732481060000121
表13.VL结构域氨基酸序列
可变区(双下划线)、恒定区(虚线下划线)
Figure BDA0003732481060000122
表14.VH结构域氨基酸序列
可变区(双下划线)、恒定区(虚线下划线)
Figure BDA0003732481060000131
表15.VL核酸序列
Figure BDA0003732481060000141
表16.VH核酸序列
Figure BDA0003732481060000151
实施例1：阿里他汀物质的示例性制备
此实施例提供制备MMATH化合物(分子14)的示例性方法，该MMATH化合物是具有噻吩甲基和羟甲基取代基的单甲基阿里他汀分子。该分子的合成制备的示意概述图描述于图1中。
方案1：
Figure BDA0003732481060000161
参考方案1中概述的反应，向搅拌(0℃)的Ala(2-TH)-OH(分子1；50.04g,0.29mol)在MeOH(500.00mL)中的悬浮液中经2小时添加SOCl2(100.07mL,1.38mol)。将混合物在23℃下搅拌。17小时后，在减压下蒸发掉挥发性物质。将残余物进一步干燥144小时。获得Ala(2-Th)-OMe_HCl(分子2)。HPLC rt＝0.59min(标准方法)，ESI[M+H]+186.2。
方案2：
Figure BDA0003732481060000162
参考方案2中概述的反应，向搅拌(23℃)的Ala(2-Th)-OMe_HCl(分子2：64.43g，0.29mol)、Boc-Dap-OH_DCHA(分子3：163.64g，0.35mol)、WSC_HCl(67.25g,0.35mol)和HOBt_H2O(42.77g,0.28mol)在DCM(1.00L)中的悬浮液中添加Et3N(49.00mL,0.35mol)。18小时后，反应混合物通过硅胶垫(约500g)过滤，滤饼用DCM(1L)洗涤。在减压下浓缩滤液直到剩余约500mL。过滤不溶解的物质并用DCM(100mL)洗涤滤饼。向滤液中添加1.0M HCl水溶液(500mL)，然后将混合物搅拌30分钟。过滤不溶物后，分离滤液。向分离的有机层中再次添加1.0M HCl水溶液(500mL)，然后将混合物搅拌30分钟。分离后，将有机层用饱和NaHCO3水溶液(500mL)、盐水(500mL)洗涤并经MgSO4干燥。过滤有机层后，在减压下浓缩该滤液。将残余物进一步干燥3小时。向粗物质中添加AcOEt(200mL)，然后将混合物加热至80℃(内部温度)。通过硅藻土(Cellite)过滤混合物，然后在减压下浓缩滤液。向残余物中添加AcOEt(150mL)，然后将混合物加热至80℃(内部温度)，直到材料溶解。将混合物静置在环境温度下。24小时后，过滤混合物并用50mL 10:1的己烷/AcOEt混合物洗涤固体两次。将固体进一步干燥14小时。获得Boc-Dap-Ala(2-Th)-OMe(分子4；92.30g,0.20mol)。HPLC rt＝1.52min(标准方法)，ESI[M+H]+455.2。
方案3：
Figure BDA0003732481060000171
参考方案3；在冰浴冷却下，在维持内部温度低于5℃的情况下向搅拌的LAH(8.25g,0.22mol)在THF(500.00mL)中的溶液中经2小时添加在THF(100mL)中的Boc-Dap-Ala(2-Th)-OMe(分子4；39.10g,0.09mol)。将反应混合物在相同温度(内部温度；5℃)下搅拌。5分钟后，在冰浴冷却下，依次向混合物中缓慢地添加H2O(8.5mL)、15％NaOH水溶液(8.5mL)和H2O(25.5mL)。将混合物在环境温度下搅拌16小时。通过硅藻土垫过滤混合物，然后用100mL AcOEt洗涤滤饼三次。在减压下浓缩该滤液。将残余物进一步干燥4小时。向粗物质中添加甲苯(110mL)，然后将混合物加热至60℃，直到所有物质溶解。将混合物静置在环境温度下。24小时后，过滤混合物，然后将固体用50mL甲苯洗涤两次并进一步干燥15小时。获得Boc-Dap-Ala(2-Th)-CH2OH(分子5；28.43g,0.07mol)。HPLC rt＝1.38min(标准方法)，ESI[M+H]+427.3。
方案4：
Figure BDA0003732481060000181
参考方案4中概述的反应，向搅拌(23℃)的Boc-Dap-Ala(2-Th)-CH2OH(分子5；19.42g,0.05mol)在MeOH(100.00mL)中的溶液中添加HCl/二噁烷(91.00mL,0.36mol)。2小时后，在减压下蒸发掉挥发性物质。向残余物中添加AcOEt(250mL)，然后将混合物真空浓缩。将该过程重复两次。将残余物进一步干燥20小时。向粗物质中添加ACN/H2O的20:1混合物(38mL)。将混合物加热至70℃(内部温度)，直到所有材料溶解，然后将混合物静置在环境温度下。24小时后，过滤混合物，然后将固体用15mL ACN洗涤两次。将固体进一步干燥8小时。获得H-Dap-Ala(2-Th)-CH2OH_HCl(12.84g,0.04mol)。HPLC rt＝0.60min(标准方法)，ESI[M+H]+327.2向搅拌(0℃)的Ala(2-TH)-OH(50.04g,0.29mol)在MeOH(500.00mL)中的悬浮液中经2小时添加SOCl2(100.07mL,1.38mol)。将混合物在23℃下搅拌。17小时后，在减压下蒸发掉挥发性物质。将残余物进一步干燥144小时。获得Ala(2-Th)-OMe_HCl(分子6)。HPLC rt＝0.59min(标准方法)，ESI[M+H]+327.2。
方案5：
Figure BDA0003732481060000191
参考方案5中概述的反应，实现一致的混合后，向搅拌(20℃)的(2S)-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酸(分子7；100.00g,294.65mmol)、(3R,4S,5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-(甲基氨基)庚酸叔丁酯(分子8；63.69g,245.54mmol)和2-氯-1-甲基吡啶-1-鎓碘化物(106.64g,417.42mmol)在乙酸乙酯(2.50L)中的溶液中添加N,N-二异丙基乙胺(154.38mL,883.95mmol)。16小时后，过滤粗反应混合物并用EtOAc洗涤。将溶液依次用1L1M HCl、1L水、0.5L碳酸氢钠、0.5L盐水萃取。将合并的有机部分用硫酸镁干燥，过滤并在减压下浓缩。获得呈粉色固体的(3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}-N,3-二甲基丁酰胺基]-3-甲氧基-5-甲基庚酸叔丁酯(分子9；149.00g，0.26mol)。HPLC rt＝1.55min(标准方法)，ESI[M+H]+581.4。
方案6：
Figure BDA0003732481060000192
参考方案6中概述的反应，向搅拌(20℃)的(3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}-N,3-二甲基丁酰胺基]-3-甲氧基-5-甲基庚酸叔丁酯(分子9；143.00g，246.23mmol)在乙酸乙酯(200.00mL)中的溶液中添加二乙胺(200.00mL，1,930.63mmol)。1小时后，将粗混合物真空浓缩。将残余物溶解于200mL乙酸乙酯中，然后再次浓缩。将此操作重复两次。向残余物中添加50mL甲苯，然后浓缩。将所得残余物溶解于1000mL己烷中。向混合物中添加500mL 1M盐酸和500mL水。将混合物搅拌5分钟。将两相混合物放入分液漏斗中并分离出水层。将有机层用500mL 0.1M盐酸萃取两次。将合并的水层用500mL己烷洗涤两次。向水层中添加碳酸钾以调节pH值超过10。将水溶液放入分液漏斗中，并用500mL乙酸乙酯萃取3次。将合并的有机层用500mL盐水洗涤，经硫酸镁干燥并真空浓缩。获得呈粉红色油状物的(3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰胺基]-3-甲氧基-5-甲基庚酸叔丁酯(分子10；66.80g，0.19mol)。HPLC rt＝0.82min(标准方法)，ESI[M+H]+359.4。
方案7：
Figure BDA0003732481060000201
参考方案7中概述的反应，实现一致的混合后，向搅拌(20℃)的(2S)-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基](甲基)氨基}-3-甲基丁酸(分子7；55.00g,155.63mmol)、(3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰胺基]-3-甲氧基-5-甲基庚酸叔丁酯(分子10；55.79g,0.16mol)和2-氯-1-甲基吡啶-1-鎓碘化物(67.59g,264.56mmol)在乙酸乙酯(1.50L)中的溶液中添加N,N-二异丙基乙胺(97.85mL,560.25mmol)。16小时后，将黄色沉淀通过硅藻土过滤移除并用100mL EtOAc洗涤。将滤液放入分液漏斗中，并且依次用200mL 1M盐酸(两次)、200mL水、200mL饱和碳酸氢钠溶液(两次)和盐水洗涤。将有机层经硫酸镁干燥并真空浓缩。将残余物在高真空下干燥24小时，以得到呈黄色泡沫的Fmoc-MeVal-Val-Dil-OtBu(分子11；103.53g,0.15mol)。HPLC rt＝1.86min(标准方法)，ESI[M+H]+694.5。
方案8：
Figure BDA0003732481060000211
参考方案8中概述的反应，向搅拌(20℃)的盐酸溶液(57.64mL,230.58mmol)中添加(3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基](甲基)氨基}-3-甲基丁酰胺基]-N,3-二甲基丁酰胺基]-3-甲氧基-5-甲基庚酸叔丁酯(分子11；20.00g,28.82mmol)。16小时后，将粗混合物真空浓缩。将残余物悬浮在50mL甲苯中并真空浓缩。将此操作重复3次。将获得的残余物在高真空下干燥24小时，以得到呈米色泡沫的Fmoc-MeVal-Val-Dil-OH(分子12；18.00g,0.03mol)。HPLC rt＝1.58min(标准方法)，ESI[M+H]+638.6。
方案9：
Figure BDA0003732481060000212
参考方案9中概述的反应，向Dap-(2-Th)Ala-CH2OH_HCl(分子5；3.94g,10.86mmol)中添加Fmoc-MeVal-Val-Dil-OH(分子12；6.30g,9.88mmol)、EDC_HCl(2.84g,14.82mmol)、HOBt(1.51g,9.88mmol)和DIPEA(4.30mL,24.69mmol)。将反应混合物在23℃下搅拌。搅拌18小时后，向混合物中添加CH2Cl2(100mL)。将混合物用0.1M HCl水溶液(100mL)、饱和NaHCO3水溶液(100mL)洗涤，然后用盐水(100mL)洗涤。将有机层用MgSO4干燥，并通过过滤移除固体。将有机层真空浓缩，以得到Fmoc-MMATH(“单甲基阿里他汀噻吩甲基羟甲基)(分子13；7.63g,0.01mol)。HPLC rt＝1.63min(标准方法)，ESI[M+H]+946.8。
方案10：
Figure BDA0003732481060000221
参考方案10中概述的反应，向Fmoc-MMATH(分子13；7.13g,7.54mmol)中添加EtOAc(100.00mL)、十二烷基硫醇(3.61mL,15.07mmol)和DBU(0.23mL,1.51mmol)。将反应混合物在23℃下搅拌。搅拌18小时后，将粗混合物放入分液漏斗中，并用50mL 1.0M盐酸萃取两次。将合并的水层用100mL乙酸乙酯洗涤两次。将水溶液移至圆底烧瓶中。向混合物中添加碳酸钾以将混合物的pH值调节至超过10。将水溶液放入分液漏斗中，并用100mL乙酸乙酯萃取两次。将合并的有机层用盐水洗涤，经硫酸镁干燥，且真空浓缩。将残余物在高真空下干燥16小时，以得到呈无色泡沫的MMATH(分子14；4.51g,0.01mol)。HPLC rt＝0.95min(标准方法)，ESI[M+H]+724.7。
实施例2：阿里他汀接头-毒素物质的示例性制备
此实施例提供用适合于偶合至靶分子的接头制备MMATH(分子14)化合物的示例性方法，该化合物是噻吩甲基羟甲基阿里他汀分子。
方案11：
Figure BDA0003732481060000231
参考方案11中概述的反应，向搅拌的23℃的Boc2O(137.0g,，628mmol)在THF(600mL)中的溶液中添加在水(600mL)中的H2N-Cit-OH(分子15；100.0g,571mmol)和NaCO3H(71.9g,856mmol)。16小时后，形成沉淀，并在20小时后通过LCMS分析反应完成。在减压下移除挥发性有机物并用2M HCl将反应调节至pH 4，并用EtOAC萃取(4×750mL)。将合并的有机层用盐水洗涤，并用MgSO4干燥。将溶液过滤并在减压下浓缩，以得到呈白色固体的77％的分子16。
方案12：
Figure BDA0003732481060000232
参考方案12中概述的反应，向搅拌的50℃的Boc-Cit(分子16，120.0g,436mmol)在EtOH(600mL)中的溶液中添加Paba(64.4g,523mmol)和EEDQ(129.3g,523mmol)。将溶液搅拌24小时并将有机溶剂浓缩至300mL。通过添加1.0L EtOAc并然后添加2.0L己烷并搅拌1小时来研磨经浓缩的粗溶液。通过过滤收集白色固体，并在减压下干燥以获得分子16，收率77％。
方案13：
Figure BDA0003732481060000241
参考方案13中概述的反应，向搅拌的23℃的Boc-Cit-Paba(分子16；10.0g,26.3mmol)在MeCN(300mL)中的溶液中添加Im(1.79g，26.3mmol)，然后添加PNP-COCl(7.95g,39.4mmol)。16小时后，将反应物在减压下浓缩以得到黄色油状物。向油状物中添加300mL EtOAc并将溶液研磨15分钟。通过过滤收集白色沉淀并将上清液浓缩至50％体积，并将第二批次研磨15分钟并通过过滤收集。将合并的材料在减压下干燥以得到呈白色粉末的分子17，收率69％。
方案14：
Figure BDA0003732481060000251
参考方案14中概述的反应，向搅拌的23℃的Boc-Cit-Paba-PNP(分子17；1.45g,2.65mmol)在DMF(21mL)中的溶液中添加MMATH(分子14；1.2g,1.66mmol)和HOAt(83.7mg,0.55mmol)，并然后添加NMM(0.73mL,6.63mmol)。72小时后，将反应物用EtOAc(200mL)稀释并用1.0M HCl洗涤(2×100mL)，然后用饱和NaHCO3(1×100mL)和盐水(1×100mL)洗涤。将有机层用MgSO4干燥、过滤并在减压下浓缩。将黄色泡沫在硅胶上使用含0％至10％MeOH的EtOAc通过快速柱层析法进行纯化，以得到呈白色泡沫的Boc-Cit-Paba-MMATH(分子18)，收率80％。
方案15：
Figure BDA0003732481060000261
参考方案15中概述的反应，将Boc-Cit-Paba-MMATH(分子18,1.2g,1.06mmol)利用5分钟的超声处理溶解在MeCN(6mL)中。向搅拌的23℃的Boc-Cit-Paba-MMATH(分子18；1.2g,1.06mmol)在MeCN(6mL)中的溶液中添加H3PO4(6mL)。16小时后，将溶液用水(15mL)稀释并用10M NaOH水溶液调节至pH 8。将水层用DCM萃取(2×100mL)。将合并的有机层用MgSO4干燥，过滤并在减压下浓缩，以得到呈黄色粉末的Cit-Paba-MMATH(分子19)，收率98％。
方案16：
Figure BDA0003732481060000262
参考方案16中概述的反应，向搅拌的0℃的β-高Val(分子20；1000mg,7.62mmol)在MeCN(40mL)中的悬浮液中添加4M NaOH(3.81mL,15.25mmol)，然后缓慢添加(1mL/min)的在MeCN(10mL)中的稀ClAcCl(0.60mL,7.55mmol)。20分钟后，将反应物用1M HCl(100mL)和EtOAc(100mL)稀释。移除水层，并将有机层用1M HCl洗涤(3×100mL)，然后用盐水洗涤(1×100ml)。将有机层用MgSO4干燥、过滤并在减压下浓缩。利用Phenomex Gemini-NX柱使用含5％至98％MeCN的0.05％TFA水溶液作为洗脱剂通过RP-HPLC来纯化粗反应物。获得呈无色油状物的分子21(1.14g)。
方案17：
Figure BDA0003732481060000271
参考方案17中概述的反应，向搅拌的0℃的DMTMMT(55mg,0.14mmol)在DMF(0.5mL)中的溶液中添加DIPEA(100μL,0.57mmol)，然后添加H2N-Cit-Paba-MMATH(分子19；105mg,0.1mmol)。搅拌反应5分钟后，添加ClAc-β-高Val(分子21；30mg,0.14mmol)。1小时后，将粗溶液用Phenomenex Gemini 10μ,C18
Figure BDA0003732481060000272
柱使用含5％至98％MeCN的0.05％TFA水溶液作为洗脱剂通过制备性RP-HPLC进行纯化。获得呈白色粉末的MMATH-L-Cl(分子22)(114mg,91％)。
在本公开的其他实施方案中，MMATH接头-毒素组合包括分子22的溴代和碘代衍生物，其中氯代基团被溴代基团(分子23)或碘代基团(分子24)替代，其中“有效载荷”代表毒素。在本公开的一些实施方案中，毒素是通过N端氮连接的MMATH(分子22)。
Figure BDA0003732481060000281
在本公开的一些实施方案中，分子23、24或25的有效载荷可以由诸如毒素的剂表示。
在本公开的一些实施方案中，化合物由分子26表示，其中有效载荷表示诸如毒素的剂，并且R表示经由游离巯基基团的靶结合部分(诸如抗体或其抗原结合部分)，或任何其他分子。
Figure BDA0003732481060000291
实施例3：阿里他汀物质的体外细胞毒性
在此示例性研究中，体外细胞毒性用于评估如本文中作为式(I)示出的MMATH(阿里他汀的噻吩甲基羟甲基衍生物)(即，本公开的阿里他汀物质)的相对毒性。
在此测定中，将测试细胞铺板并使其生长至适当的细胞密度(例如，对于SW780细胞为1500个细胞/孔(每孔50μL))。一式三份地用浓度范围为10μM至10-4nM的药物(MMATH或MMAE(单甲基阿里他汀E))处理该细胞，持续5天。在第6天终点时，将细胞与20μL PrestoBlue一起在37℃下温育2小时，并在Biotek synergy H4平板读取器上读取信号。减去培养基背景后，计算存活百分比并作图以确定EC50，如表1的示例性结果所示。
表1：阿里他汀物质的体外细胞毒性
Figure BDA0003732481060000292
在示例性研究中，测量了MMAE和MMATH与微管蛋白的结合，显示KD为69.9nM(MMAE)和204.4nM(MMATH)。示例性结果表明，新型MMATH阿里他汀物质具有与MMAE相当的毒性。这些示例性结果还表明，该可比的体外功效是用对微管蛋白具有较低亲和力的分子实现的，微管蛋白是它的假定功效分子靶标。
实施例4：接头物质的稳定性
在此示例性研究中，体外研究用于评估本公开的接头(分子26)与缬氨酸-瓜氨酸(vc)接头相比的稳定性。
在这项研究中，通过LCMS测量了多种组织蛋白酶对两种不同的半胱氨酸缀合的药物接头的切割的相对动力学速率。该酶(组织蛋白酶B、D、H、K、L和S)是在引入底物之前被活化。一种底物是通过缬氨酸-瓜氨酸-PAB-羧基接头(CAS号：646502-53-6)与半胱氨酸连接的阿里他汀MMAE，另一种底物是通过分子26的接头与半胱氨酸连接的本公开的MMATH阿里他汀(分子14)。
将两种不同的巯基连接的半胱氨酸连接的阿里他汀(MMATH-L-Cys和Cys-vc-MMAE)与预活化的酶一起在37℃下温育48小时。将时点样品(Timepoint)直接等分到2M，用pH 9Tris缓冲液来停止酶活性，并且然后立即冷冻至-80℃。随着时间的推移为每一时点样品监测游离药物和半胱氨酸连接的药物二者的MS XIC的AUC。在使用Dionex LC前端的Thermo LTQ Velos OrbiTrap质谱仪上运行所有样本。随时间测量原始半胱氨酸连接的药物、游离药物和经切割的“接头”残余部分的量。
参考图2A和图2B，示例性结果表明，用分子26的接头连接到MMATH的半胱氨酸显示出比连接到vcMMAE的相应半胱氨酸更高的稳定性。在利用组织蛋白酶H、D、L、K和S获得的结果中，结果显示对于所有组织蛋白酶而言该两种接头之间具有相似的相对稳定性。组织蛋白酶D和L以与组织蛋白酶B相当的切割速率切割，而组织蛋白酶H的切割比组织蛋白酶B相对更慢。组织蛋白酶K和S的切割比组织蛋白酶B相对更快。
在另一项示例性研究中，在活化的溶酶体衍生的裂解物中测试了两种半胱氨酸连接的阿里他汀物质的稳定性。在这项研究中，溶酶体是通过三个连续的冻/融循环以及随后的30分钟超声处理来裂解的。将半胱氨酸连接的阿里他汀在37℃下与预活化的溶酶体一起温育24小时。在这项研究中，将半胱氨酸-MMATH-L底物与5倍浓度的溶酶体一起温育。在整个温育过程中取出时点样品，并随时间的推移监测游离药物和cys-DL的MS XIC的AUC。在使用Dionex LC前端的Thermo LTQ Velos OrbiTrap质谱仪上运行所有样本。随时间测量原始半胱氨酸连接的药物、游离药物和经切割的“接头”残余部分的量。
参考图3A和图3B，示例性结果表明，用分子26的接头连接到MMATH的半胱氨酸在活化的溶酶体中显示出与连接到vcMMAE的相应半胱氨酸相当的稳定性，即使前者已经用5倍浓度的溶酶体进行处理，因此表明切割速率比vcMMAE接头慢约5倍。
在进一步的示例性研究中，在四种不同的羧酸酯酶(人或小鼠CES-1和CES-1C)存在下确定底物的稳定性。在这项研究中，该酶是在底物引入之前活化的，然后将其在37℃下与底物一起温育48小时。将时点样品(Timepoint)直接等分到2M，用pH 9Tris缓冲液来停止酶活性，并且然后立即冷冻至-80℃。随着时间的推移为每一时点样品监测游离药物和半胱氨酸连接的药物二者的MS XIC的AUC。在使用Dionex LC前端的Thermo LTQ VelosOrbiTrap质谱仪上运行所有样本。随时间测量原始半胱氨酸连接的药物、游离药物和经切割的“接头”残余部分的量。
在这项使用CES-1或CES-1C小鼠或人羧酸酯酶的研究中，没有观察到人或小鼠CES-1对任一底物的切割。然而，半胱氨酸-vcMMAE在48小时内被人和小鼠CES-1C完全切割。对于本公开的MMATH-接头，小鼠或人CES-1C的切割在12小时左右开始，并且以比对vcMMAE观察到的速率显著更慢的速率进行。
这些示例性结果表明分子26的接头在活化酶和溶酶体二者中都具有比缬氨酸-瓜氨酸接头更高的稳定性。这些示例性结果表明分子26的接头-MMATH在活化酶和溶酶体二者中都具有比vcMMAE更高的稳定性。
实施例5：新型抗体缀合位点
在此示例性研究中，亮氨酸残基位于人IgG1重链恒定区的FG环中。作为参考，所讨论的亮氨酸是在序列KVSNKALPAPI(即，位置328Kabat编号)的背景下发现的。在本公开中，该位置处的亮氨酸被位点特异性地修饰为半胱氨酸，即KVSNKACPAPI。
在这项研究中，特异性地结合靶HER2的单克隆抗体曲妥珠单抗在该位置处从亮氨酸修饰为半胱氨酸，以确定药物缀合和其他作用的适用性。天然曲妥珠单抗与本公开的经修改型式之间的比较在下面给出。
曲妥珠单抗 曲妥珠单抗(L328C)
药物-抗体比(DAR) 2 1.7
％未缀合 36％ 1％
％聚集 5％ 8％
ADC的体内功效 8/8
FcγR1结合(pM) 239 701(减少2.93倍)
C1q下降 减少1.02倍 减少3.4倍
这些示例性结果表明，与原始抗体相比，本公开的L328C变体与Fcγ受体的结合显著降低，同时导致约2的特异性DAR，但仍导致高度有效的缀合，即小于1％经缀合抗体。
如本文所述的这种突变的其他实例(抗PSMA和抗SLC34A2抗体)
这些示例性结果展示了使用具有这种位点特异性修饰的抗体或可活化抗体提供用于以特定化学计量缀合的有效、受控的位点的优点。
实施例6：示例性缀合方法
在此实施例中，描述了用于将本公开的阿里他汀MMATH与抗体分子缀合的示例性缀合方法。
参考图4的示例性工艺流程图，在本公开的示例性方法中，在7.2的pH值下以14g/L的浓度提供在Kabat位置328处具有半胱氨酸残基的抗体。过滤抗体溶液，然后将其用还原剂三(2-羧乙基)膦(TCEP)以9:1的TCEP:抗体摩尔比在20℃下还原80-120分钟。通过切向流过滤(TFF)以8个渗滤体积过滤反应物，该反应物以12g/L被回收。用(L)-脱氢抗坏血酸(DHA)以10:1DHA:抗体摩尔比在20℃下将抗体再氧化90分钟。
用碘化钠活化具有式(III)的MMATH接头-毒素化合物，其中R2是氯。在20℃下将活化的接头-毒素以9:1的接头-毒素:抗体摩尔比添加到再氧化的抗体中并保持12-16小时，以使接头-毒素与抗体缀合。通过TFF以10个渗滤体积过滤反应混合物，该反应混合物以17g/L被回收。经缀合抗体的分析显示在Kabat 328半胱氨酸位置处存在位点特异性缀合，DAR为2。
这些示例性结果表明，本公开的阿里他汀衍生物可以位点特异性方式与抗体缀合以提供DAR为2的抗体-药物缀合物。
这些示例性结果还表明，通过将接头-毒素与Kabat位置328处的位点特异性半胱氨酸缀合，可以使用碘活化的接头-毒素与半胱氨酸巯基基团的偶合来进行缀合。以这种方式，经缀合的产物比巯基-马来酰亚胺缀合物更不易受去缀合反应的影响，后者可以更容易地通过巯基交换来逆转，导致接头-毒素的非期望释放。使用具有位点特异性半胱氨酸(诸如位于Kabat位置328处的那些)的抗体进行接头-毒素缀合，也提供了DAR为2的经缀合抗体产物。使用此类具有位点特异性半胱氨酸残基(诸如位于Kabat位置328处的那些)的抗体还允许在不破坏抗体的天然链内或链间二硫键的情况下使接头-毒素与抗体缀合。
其他实施方案
虽然本发明已结合其具体实施方式进行描述，但是前述描述旨在举例说明而不限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其他方面、优点和修改在所附权利要求书的范围内。
序列表
<110> 西托姆克斯治疗公司(CytomX Therapeutics, Inc.)
<120> 阿里他汀相关化合物、经缀合阿里他汀化合物及其使用方法
<130> CYTX-070-PCT
<150> US 62/957,780
<151> 2020-01-06
<160> 72
<170> PatentIn version 3.5
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Gly
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
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Asp Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Ser Gly Gln Ser
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Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
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Leu Gln Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
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Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
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Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
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Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
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Gly Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
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Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Val Ile Ala Ala Arg Thr Phe Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
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Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
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Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
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Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
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Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
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Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Tyr
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Glu Ile Gln Leu Tyr Leu Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu
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Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
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<400> 33
gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60
atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg catagtgatg gatacaacta tttggattgg 120
tacctgcaga agtcagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 180
tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaactccg 300
tggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaacgga ctgtcgctgc accatctgtc 360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 657
<210> 34
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 34
gacatccaga tgacccagtc tccttcttcc gtgtctgcat ctgtaggagg cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc aactggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaaactcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa cctgcagcct 240
gaagattttg caagttacta ttgtcaacag gctaacagtt tccccctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa acggactgtc gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 35
<211> 1359
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 35
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatgaca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atttggtatg atggaagtaa taaatactat 180
gcagactcct tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctcag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagggttata 300
gcagctcgta ccttctacta ctacggtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 360
gtctcctcag catccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 420
acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 480
acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 540
cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 600
acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 660
gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 720
ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 780
cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 840
ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 900
cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 960
aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagcct gcccagcccc catcgagaaa 1020
accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1080
cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1140
agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1200
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag 1260
agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1320
cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaa 1359
<210> 36
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 36
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggaat cacctttagt aattattgga tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gactggagtg ggtggccaac ataaagaaag atggaagtga gaaattctat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatca acagcctgag agccgaggac acggctatgt attactgtgc gagagaaata 300
cagctatacc tgcagcactg gggccagggc accctggtca ccgtctcctc agcatccacc 360
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420
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ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagc ctgcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1080
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320
ctctccctgt ctccgggtaa a 1341
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 37
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Phe Leu Asn
1 5 10
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 38
Val Thr Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 39
Gln Gln Ser Tyr Asn Thr Pro Ile Thr
1 5
<210> 40
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 40
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Phe Leu Asn
1 5 10
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 41
Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 42
Gln Gln Ser Tyr Ser Val Pro Ile Thr
1 5
<210> 43
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 43
Ser Tyr Val Met His
1 5
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 44
Gly Val Ser Ser Ser Gly Asp Ser Thr Phe Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 45
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 45
Gly Gly Ile Thr Gly Ala Pro Leu Val Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 46
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 46
Ser His Ile Met Tyr
1 5
<210> 47
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 47
Gly Ile Ser Ser Asn Gly Leu Ser Ser Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 48
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 48
Gly Gly Arg Asp Arg Val Pro Ala Val Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 49
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 49
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 50
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 50
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 51
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 51
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 52
Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
1 5 10
<210> 53
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 53
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ile Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 54
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 54
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 55
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 55
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 56
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 56
Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
1 5 10
<210> 57
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 57
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
<210> 58
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 58
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 59
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 59
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Gly Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 60
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 60
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 61
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 61
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Trp Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
<210> 62
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 62
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 63
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 63
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Leu Leu Tyr Val His
1 5 10 15
Met Gly Ser Leu Lys Pro Glu Asp Met Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 64
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 65
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 65
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Val Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Thr Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 66
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 66
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ile Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ile Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Val Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 67
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 67
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val
35 40 45
Ser Gly Val Ser Ser Ser Gly Asp Ser Thr Phe Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Gly Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ile Thr Gly Ala Pro Leu Val Phe Asp Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Cys Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 68
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 68
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Trp Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Ile Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Ser Asn Gly Leu Ser Ser Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Leu Leu Tyr
65 70 75 80
Val His Met Gly Ser Leu Lys Pro Glu Asp Met Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Arg Asp Arg Val Pro Ala Val Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Cys Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 69
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 69
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc aggtttttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaaggtcct gatctatgtt acatccagtt tacaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag agttacaata cccctatcac cttcggccaa 300
gggacacgac tggagattaa acggactgtc gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 70
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 70
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctataggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattggc acctttttaa attggtatca acaaaaacca 120
gggaaagccc ctaaggtcct gatctatgtt gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcattg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagtg ttccgatcac cttcggccaa 300
gggacacgac tggagattaa acggactgtc gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 71
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 71
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agttatgtta tgcactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gactggaata tgtttcaggt gttagtagta gtggggatag cacattttat 180
gtagactctg tgaagggcag attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctttat 240
cttcaaatgg gcagcctgag agctgaggac atggctgtgt attactgtgc gagagggggt 300
ataactggag ctccactggt ttttgatatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctct 360
tcagcatcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gcctgcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1080
gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353
<210> 72
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 72
gaggtgcaac tggtggagtc tgggggaggc tgggtccagc cgggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agtcatatta tgtactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gactggaata tgtttcgggt attagcagta atggacttag ctcatattat 180
gttgactctg tgaagggcag attcaccatc tccagagaca attccaagaa tttactgtat 240
gttcatatgg gcagcctgaa acctgaggac atggctatgt attactgtgc gagagggggc 300
cgggatagag tgccagctgt ctttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360
tccgcttcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gcctgcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1080
gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353

Claims (58)

1.一种式(I)的化合物：
Figure FDA0003732481050000011
其中R1是氢或C1-6烷基基团；
其中R选自由以下组成的组：氢、C1-6烷基、接头或基团X1-Y1-*，其中*是与氮的附接点；并且
其中Y1是氧基羰基基团，且X1是C1-6烷基基团、9-芴基甲基基团、苄基基团或叔丁基基团。
2.如权利要求1所述的化合物，其中R1是甲基基团，且R是氢。
3.如权利要求1所述的化合物，其中X1-Y1是9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)基团。
4.一种式(II)的化合物：
Figure FDA0003732481050000021
其中R3是附接到式(II)的剂，其中附接点是氮、硫、氧或碳原子；并且
其中R2是附接至式(II)的部分，其中附接点选自由以下组成的组：氯基团、碘基团、溴基团和巯基基团。
5.如权利要求4的化合物，其中R2是靶结合部分，其中R2处的所述附接点是巯基基团。
6.如权利要求5所述的化合物，其中所述巯基基团是半胱氨酸残基的侧链巯基基团。
7.一种式(III)的化合物：
Figure FDA0003732481050000022
其中R2是附接至式(III)的部分，其中附接点选自以下组成的组：氯基团、碘基团、溴基团和巯基基团。
8.如权利要求7的化合物，其中R2是靶结合部分，其中R2处的所述附接点是巯基基团。
9.如权利要求8所述的化合物，其中所述巯基基团是半胱氨酸侧链巯基基团。
10.如权利要求4至9中任一项所述的化合物，其中所述靶结合部分是与所述靶特异性地结合的分离的抗体或其抗原结合片段(AB)。
11.如权利要求4至9中任一项所述的化合物，其中所述靶结合部分是在经活化的状态下与所述靶特异性地结合的可活化抗体，所述可活化抗体包含：
与所述靶特异性地结合的抗体或其抗原结合片段(AB)；
与所述AB偶合的掩蔽部分(MM)，其中当所述可活化抗体处于未经切割的状态时，所述MM抑制所述AB与所述靶的结合；以及
与所述AB偶合的可切割部分(CM)，其中所述CM是起到蛋白酶的底物作用的多肽。
12.如权利要求11所述的化合物，其中所述MM的与所述AB结合的解离常数大于所述AB与其靶的解离常数。
13.如权利要求11或权利要求12所述的化合物，其中当所述可活化抗体处于被切割状态时，所述MM不干扰或竞争所述AB与其靶的结合。
14.如权利要求11至13中任一项所述的化合物，其中所述MM是长度不多于40个氨基酸的多肽。
15.如权利要求11至14中任一项所述的化合物，其中所述MM多肽序列与所述靶序列不同。
16.如权利要求11至15中任一项所述的化合物，其中所述MM多肽序列与所述AB的任何天然结合伴侣的同一性不超过50％。
17.如权利要求10至16中任一项所述的化合物，其中所述靶选自由以下组成的组：CD44、CD147、CD166、ITGa3、ITGb1、PSMA和SLC34A2。
18.如权利要求4至6中任一项所述的化合物，其中所述剂选自由以下组成的组：阿里他汀E、单甲基阿里他汀F(MMAF)、单甲基阿里他汀E(MMAE)、单甲基阿里他汀D(MMAD)、类美登素DM4、类美登素DM1、卡奇霉素、多卡米星、吡咯并苯二氮
Figure FDA0003732481050000041
和吡咯并苯二氮
Figure FDA0003732481050000042
二聚体。
19.如权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中R是接头。
20.如权利要求19所述的化合物，其中所述接头是可切割接头。
21.如权利要求19或权利要求20所述的化合物，其中所述接头连接至靶结合部分。
22.如权利要求21所述的化合物，其中所述靶结合部分是与所述靶特异性地结合的分离的抗体或其抗原结合片段(AB)。
23.如权利要求21所述的化合物，其中所述靶结合部分是在经活化的状态下与所述靶特异性地结合的可活化抗体，所述可活化抗体包含：
与所述靶特异性地结合的抗体或其抗原结合片段(AB)；
与所述AB偶合的掩蔽部分(MM)，其中当所述可活化抗体处于未经切割的状态时，所述MM抑制所述AB与所述靶的结合；以及
与所述AB偶合的可切割部分(CM)，其中所述CM是起到蛋白酶的底物作用的多肽。
24.如权利要求21至23中任一项所述的化合物，其中所述靶选自由以下组成的组：CD44、CD147、CD166、ITGa3、ITGb1、PSMA和SLC34A2。
25.如权利要求10至23中任一项所述的化合物，其中所述抗体或可活化抗体包含Kabat位置328处的半胱氨酸残基。
26.一种IgG1抗体，其中位置Kabat位置328是半胱氨酸。
27.一种可活化抗体，其包含：
与所述靶特异性地结合的抗体或其抗原结合片段(AB)；
与所述AB偶合的掩蔽部分(MM)，其中当所述可活化抗体处于未经切割的状态时，所述MM抑制所述AB与所述靶的结合；以及
与所述AB偶合的可切割部分(CM)，其中所述CM是起到蛋白酶的底物作用的多肽,
其中所述AB的位置Kabat位置328是半胱氨酸。
28.如权利要求26所述的抗体或如权利要求27所述的可活化抗体，其中所述抗体或所述AB与选自由以下组成的组的靶特异性地结合：CD44、CD147、CD166、ITGa3、ITGb1、PSMA和SLC34A2。
29.一种药物组合物，其包含：
权利要求1至28中任一项所述的化合物、抗体或可活化抗体；和合适的载体。
30.一种将化合物与多肽缀合的方法，所述方法包括：
将式(I)的化合物与多肽缀合：
Figure FDA0003732481050000061
其中R1是氢或C1-6烷基基团；
其中R选自由以下组成的组：氢、C1-6烷基、接头或基团X1-Y1-*，其中*是与氮的附接点；并且
其中Y1是氧基羰基基团，且X1是C1-6烷基基团、9-芴基甲基基团、苄基基团或叔丁基基团；
其中至少一当量的所述式(I)化合物或其衍生物与所述多肽缀合。
31.如权利要求30所述的方法，其中R1是甲基，且R是氢。
32.如权利要求30所述的化合物，其中X1-Y1是9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)基团。
33.如权利要求30所述的方法，其中R是接头。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述接头是可切割接头。
35.一种将化合物与多肽缀合的方法，所述方法包括：
将式(III)化合物与多肽缀合：
Figure FDA0003732481050000071
其中R2是附接至式(III)的部分，其中附接点选自以下组成的组：氯基团、碘基团、溴基团和巯基基团。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述R2是卤素基团。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述R2是碘基团。
38.如权利要求36所述的方法，其中所述R2是溴基团。
39.如权利要求36所述的方法，其中所述R2是氯基团。
40.如权利要求30至39中任一项所述的方法，其中至少一种式(I)或(III)的化合物通过所述多肽上的巯基基团与所述多肽缀合。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述巯基基团是所述多肽的半胱氨酸残基的侧链巯基基团。
42.如权利要求30至41中任一项所述的方法，其中所述多肽包含靶结合部分。
43.如权利要求30至42中任一项所述的方法，其中所述多肽包含与靶特异性地结合的抗体或其抗原结合片段(AB)。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述半胱氨酸残基在所述AB的Kabat位置328处。
45.如权利要求30至44中任一项所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)用还原剂还原所述多肽，其中至少一个二硫基团被还原成游离巯基基团；
(ii)在不氧化所述游离巯基基团的情况下用氧化剂再氧化所述多肽；和
(iii)将所述式(I)或(III)的化合物与所述游离巯基基团缀合。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述还原剂是TCEP。
47.一种具有下式的经缀合多肽：
[T]-[L]-[C]；
其中[T]是靶结合部分，且[L]是接头部分；并且
其中[C]是包含式(I)化合物的化合物：
Figure FDA0003732481050000081
其中R1是氢或C1-6烷基基团；并且
其中R是与[L]的附接点。
48.如权利要求47所述的经缀合多肽，其中R1是甲基基团。
49.一种具有下式的经缀合多肽：
[T]–[LC]；
其中[T]是靶结合部分，且[LC]是接头-毒素；并且
其中[LC]是包含式(III)化合物的化合物：
Figure FDA0003732481050000091
其中R2是与[T]的附接点。
50.如权利要求47或权利要求48所述的经缀合多肽，其中所述接头[L]是可切割接头。
51.如权利要求47至50中任一项所述的经缀合多肽，其中所述接头[L]或所述接头-毒素[LC]是通过所述靶结合部分上的巯基基团偶合至所述靶结合部分[T]。
52.如权利要求51所述的经缀合多肽，其中所述巯基基团是所述靶结合部分上的半胱氨酸残基的侧链巯基基团。
53.如权利要求47至52中任一项所述的经缀合多肽，其中所述靶结合部分[T]包含与靶特异性地结合的抗体或其抗原结合片段(AB)。
54.如权利要求53所述的经缀合多肽，其中所述半胱氨酸残基是所述AB的Kabat位置328处的半胱氨酸残基。
55.一种治疗患有疾病或病症的受试者的方法，其包括：
向有需要的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含权利要求1至25中任一项所述的化合物、权利要求29所述的药物组合物或权利要求47至54中任一项所述的经缀合多肽。
56.权利要求1至25中任一项所述的化合物、权利要求29所述的药物组合物，或权利要求47至54中任一项所述的经缀合多肽用于治疗疾病或病症的用途。
57.如权利要求1至25中任一项所述的化合物、如权利要求29所述的药物组合物或如权利要求47至54中任一项所述的经缀合多肽，其用于制备用于治疗疾病或病症的药物。
58.如权利要求55至57中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症为癌症。
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