JP2023510724A - アウリスタチン関連化合物、コンジュゲートアウリスタチン化合物、およびその使用方法 - Google Patents

アウリスタチン関連化合物、コンジュゲートアウリスタチン化合物、およびその使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は一般に、アウリスタチンファミリーの新規化合物、ペイロードを別の分子、例えば標的結合分子にカップリングさせるための新規リンカー、新規リンカー－毒素分子、および制御された、部位特異的なコンジュゲーションを可能にする新規抗体分子に関する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本発明は、２０２０年１月６日に出願された米国仮出願第６２／９５７，７８０号（その内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる）の恩典を主張する。
発明の分野
本開示は一般に、アウリスタチンファミリーの新規化合物に関する。本開示はまた、一般に、ペイロードを別の分子、例えば標的結合分子にカップリングさせるための新規リンカーに関する。本開示はまた一般に、新規リンカー－毒素分子に関する。本開示は新規リンカー－毒素分子にコンジュゲートされた標的結合分子に関し、毒素はアウリスタチンファミリーの新規化合物である。
配列表への参照
３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１に従って、コンピュータ可読形態（ＡＳＣＩＩフォーマット）で、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してファイル名ＣＹＴＸ＿０７０＿ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔとしてこれと同時に電子的に提出された配列表が参照により本明細書に組み込まれる。配列表のＡＳＣＩＩコピーは２０２１年１月６日に作成され、サイズは４８キロバイトである。
ドラスタチンとして知られているいくつかの短いペプチド化合物が、天然源から単離され、または、および、チューブリンに結合し、その重合をブロックすることにより抗有糸分裂生物活性を有することが見出された。アウリスタチンとして知られているこれらの化合物の類似体もまた調製されており、いくつかが、同様の活性を有することが見出されている。
そのような分子は、それらを化学リンカーを介して標的結合部分、例えば、標的－特異的モノクローナル抗体にコンジュゲートさせ、これにより、毒性ペイロードを標的－特異的様式で送達させることにより治療的に使用される。そのような分子の有効性および安全性は、毒素の性質および連結リンカーの安定性に依存する可能性があり、というのも、低い安定性を有するリンカーは薬物をインサイチューで放出し、よって、潜在的に、薬物の毒性および認容性を増加させるからである。
薬物の抗体または活性化可能抗体へのコンジュゲーションは典型的には、薬物を重もしくは軽鎖上のアミノもしくはチオール側鎖に結合させる化学反応に依存する。しかしながら、これらの天然アミノ酸残基への依存は、コンジュゲーション後の薬物と抗体の間の化学量論（ＤＡＲ）の変動という結果になり得、または、既存のシステインジスルフィド結合を破壊させ、コンジュゲーションを可能にするために抗体を還元させることが必要とされる。
したがって、本分野では好適な有効性を有する薬物および十分安定なリンカーが継続的に必要とされる。本分野では、制御された、部位特異的なコンジュゲーションを可能にする新規抗体バリアントもまた、継続的に必要とされる。
式（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）の化合物が本明細書で提供される；
Figure 2023510724000002
 式中、Ｒ１は水素またはＣ１－６アルキル基であり、Ｒは、下記からなる群より選択される：水素、Ｃ１－６アルキル、リンカー、またはＸ１－Ｙ１－＊基（式中、＊は窒素への結合点である）、
Figure 2023510724000003
 式中、Ｒ３は式（ＩＩ）に結合される作用物質であり、結合点は窒素、硫黄、酸素、または炭素原子であり、Ｒ２は式（ＩＩ）に結合される部分であり、結合点は、下記からなる群より選択される：塩素基、ヨウ素基、臭素基、およびチオール基、
Figure 2023510724000004
 式中、Ｒ２は式（ＩＩＩ）に結合される部分であり、結合点は、下記からなる群より選択される：塩素基、ヨウ素基、臭素基、およびチオール基。
Ｋａｂａｔ位３２８がシステインである抗体および活性化可能抗体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）の化合物はポリペプチドにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）の化合物は抗体に、Ｋａｂａｔ位３２８のシステインの側鎖チオール基にコンジュゲートされる。
本開示の式（Ｉ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｙ１はオキシカルボニル基であり、Ｘ１はＣ１－６アルキル基、９－フルオレニルメチル基、ベンジル基、またはｔｅｒｔ－ブチル基である。式（Ｉ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ１はメチル基であり、Ｒは水素である。式（Ｉ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｘ１－Ｙ１は９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基である。
本開示の式（ＩＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ２は標的結合部分であり、Ｒ２の結合点はチオール基である。式（ＩＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、標的結合部分は、標的に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合性フラグメント（ＡＢ）である。式（ＩＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、標的結合部分は活性化可能抗体であり、それは、活性化状態では、標的に特異的に結合し、活性化可能抗体は、標的に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメント（ＡＢ）、ＡＢに結合されたマスキング部分（ＭＭ）（ＭＭは、活性化可能抗体が未切断状態にある場合ＡＢの標的への結合を阻止する）、ＡＢに結合された切断可能な部分（ＣＭ）（ＣＭはプロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドである）を含む。式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、ＭＭはＡＢのその標的への解離定数より大きいＡＢへの結合のための解離定数を有し、ＭＭは、活性化可能抗体が切断状態にある場合、その標的への結合について、ＡＢを妨害せず、またはこれと競合せず、ＭＭは４０アミノ酸以下の長さのポリペプチドであり、ＭＭポリペプチド配列は標的配列とは異なり、および／または、ＭＭポリペプチド配列は、ＡＢの任意の天然結合パートナーと５０％以下同一である。式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、標的は、ＣＤ４４、ＣＤ１４７、ＣＤ１６６、ＩＴＧａ３、ＩＴＧｂ１、ＰＳＭＡ、およびＳＬＣ３４Ａ２からなる群より選択される。式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、作用物質は、アウリスタチンＥ、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、マイタンシノイドＤＭ４、マイタンシノイドＤＭ１、カリチアマイシン、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、およびピロロベンゾジアゼピン二量体からなる群より選択される。
式（Ｉ）のいくつかの実施形態では、Ｒはリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは切断可能なリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは標的結合部分に結合される。いくつかの実施形態では、標的結合部分は抗体またはその抗原結合性フラグメントである。いくつかの実施形態では、標的は、ＣＤ４４、ＣＤ１４７、ＣＤ１６６、ＩＴＧａ３、ＩＴＧｂ１、ＰＳＭＡ、およびＳＬＣ３４Ａ２からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、抗体または活性化可能抗体はＫａｂａｔ位３２８でシステイン残基を含む。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）の化合物はポリペプチドに、チオール基に結合される。いくつかの実施形態では、チオール基はシステイン残基のチオール基側鎖である。いくつかの実施形態では、システイン残基は、抗体のＫａｂａｔ位３２８のシステイン残基である。
本開示のいくつかの実施形態では、化合物をポリペプチドにコンジュゲートさせる方法は、式（Ｉ）の化合物をポリペプチドにコンジュゲートさせることを含み、Ｒ１は水素またはＣ１－６アルキル基であり、Ｒは、下記からなる群より選択される：水素、Ｃ１－６アルキル、リンカー、またはＸ１－Ｙ１－＊基（式中、＊は窒素への結合点である）；ならびに、Ｙ１はオキシカルボニル基であり、Ｘ１はＣ１－６アルキル基、９－フルオレニルメチル基、ベンジル基、またはｔｅｒｔ－ブチル基であり、式（Ｉ）の化合物またはその誘導体の少なくとも１つの等価物がポリペプチドにコンジュゲートされる。
本開示のいくつかの実施形態では、化合物をポリペプチドにコンジュゲートさせる方法は、式（ＩＩ）の化合物をポリペプチドにコンジュゲートさせることを含み、Ｒ２は式（ＩＩ）に結合される部分であり、結合点は、下記からなる群より選択される：塩素基、ヨウ素基、臭素基、およびチオール基。
本開示のいくつかの実施形態では、化合物をポリペプチドにコンジュゲートさせる方法は、ポリペプチドを還元剤で還元することであって、少なくとも１つのジスルフィド基が遊離チオール基に還元されること、ポリペプチドを酸化剤で、遊離チオール基を酸化させずに再酸化すること、ならびに、式（Ｉ）または（ＩＩＩ）の化合物を遊離チオール基にコンジュゲートさせることを含む。
本開示のアウリスタチン種への合成経路の概略図である。 活性化カテプシンＢに対する本開示のリンカーの例示的なインビトロ安定性を描いたグラフを示す。 活性化リソソームに対する本開示のリンカーの例示的なインビトロ安定性を描いたグラフを示す。 リンカー－毒素活性化およびリンカー－毒素の抗体へのコンジュゲーションの例示的な方法のプロセスフロー図を示す。
本開示は一般に、アウリスタチンファミリーの新規化合物に関する。本開示はまた一般に、ペイロードを別の分子、例えば標的結合分子にカップリングさせるための新規リンカーに関する。本開示はまた一般に、新規リンカー－毒素分子に関する。そのような実施形態の例が下記実施例において記載される。
いくつかの実施形態では、本開示の化合物をコンジュゲートさせることができる標的結合部分としては抗ＰＳＭＡ抗体が挙げられ、その例が下記配列において記載される：
Figure 2023510724000005
Figure 2023510724000006
Figure 2023510724000007
Figure 2023510724000008
Figure 2023510724000009
Figure 2023510724000010
Figure 2023510724000011
Figure 2023510724000012
Figure 2023510724000013
いくつかの実施形態では、本開示の化合物をコンジュゲートさせることができる標的結合部分としては抗ＳＬＣ３４Ａ２抗体が挙げられ、その例が下記配列において記載される：
Figure 2023510724000014
Figure 2023510724000015
Figure 2023510724000016
Figure 2023510724000017
Figure 2023510724000018
Figure 2023510724000019
Figure 2023510724000020
Figure 2023510724000021
Figure 2023510724000022
実施例１：アウリスタチン種の例示的な調製
この実施例はＭＭＡＴＨ（分子１４）の化合物、チオフェニルメチルおよびヒドロキシメチル置換基を有するモノメチルアウリスタチン分子の調製の例示的な方法を提供する。この分子の合成的調製の概略図が図１に示される。
スキーム１：
Figure 2023510724000023
スキーム１で概要が示される反応について説明すると、Ａｌａ（２－ＴＨ）－ＯＨ（分子１；５０．０４ｇ、０．２９ｍｏｌ）を含むＭｅＯＨ（５００．００ｍＬ）の撹拌（０℃）懸濁液に、ＳＯＣｌ２（１００．０７ｍＬ、１．３８ｍｏｌ）を２時間にわたって添加した。混合物を２３℃で撹拌した。１７時間後、揮発性物質を減圧下で蒸発させた。残渣をさらに１４４時間乾燥させた。Ａｌａ（２－Ｔｈ）－ＯＭｅ＿ＨＣｌを得た（分子２）。ＨＰＬＣ ｒｔ＝０．５９分（標準方法）、ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋１８６．２。
スキーム２：
Figure 2023510724000024
スキーム２で概要が示される反応について説明すると、Ａｌａ（２－Ｔｈ）－ＯＭｅ＿ＨＣｌ（分子２：６４．４３ｇ、０．２９ｍｏｌ）、Ｂｏｃ－Ｄａｐ－ＯＨ＿ＤＣＨＡ（分子３：１６３．６４ｇ、０．３５ｍｏｌ）、ＷＳＣ＿ＨＣｌ（６７．２５ｇ、０．３５ｍｏｌ）およびＨＯＢｔ＿Ｈ２Ｏ（４２．７７ｇ、０．２８ｍｏｌ）を含むＤＣＭ（１．００Ｌ）の撹拌（２３℃）懸濁液に、Ｅｔ３Ｎ（４９．００ｍＬ、０．３５ｍｏｌ）を添加した。１８時間後、反応混合物をシリカゲルパッド（およそ５００ｇ）に通して濾過し、濾過ケーキをＤＣＭ（１Ｌ）で洗浄した。濾液を減圧下で残りが約５００ｍＬとなるまで濃縮した。不溶解材料を濾過し、濾過ケーキをＤＣＭ（１００ｍＬ）で洗浄した。濾液に１．０Ｍ ＨＣｌ ａｑ．（５００ｍＬ）を添加し、次いで、混合物を３０分間撹拌した。不溶解材料を濾過した後、濾液を分離した。分離した有機層に１．０Ｍ ＨＣｌ ａｑ．（５００ｍＬ）を再び添加し、次いで、混合物を３０分間撹拌した。分離後、有機層をｓａｔ．ＮａＨＣＯ３ ａｑ．（５００ｍＬ）、ブライン（５００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。有機層を濾過した後、濾液を減圧下で濃縮した。残渣をさらに３時間乾燥させた。粗材料にＡｃＯＥｔ（２００ｍＬ）を添加し、次いで、混合物を８０℃（内部温度）まで加熱した。混合物をセライト（Ｃｅｌｌｉｔｅ）に通して濾過し、その後、濾液を減圧下で濃縮した。残渣にＡｃＯＥｔ（１５０ｍＬ）を添加し、次いで、混合物を８０℃（内部温度）まで、材料が溶解するまで加熱した。混合物を周囲温度で放置した。２４時間後、混合物を濾過し、固体を５０ｍＬのヘキサン／ＡｃＯＥｔの１０：１混合物で２回洗浄した。固体をさらに１４時間乾燥させた。Ｂｏｃ－Ｄａｐ－Ａｌａ（２－Ｔｈ）－ＯＭｅ（分子４；９２．３０ｇ、０．２０ｍｏｌ）を得た。ＨＰＬＣ ｒｔ＝１．５２分（標準方法）、ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋４５５．２。
スキーム３：
Figure 2023510724000025
スキーム３について説明すると；氷浴冷却下で、ＬＡＨ（８．２５ｇ、０．２２ｍｏｌ）を含むＴＨＦ（５００．００ｍＬ）の撹拌溶液に、Ｂｏｃ－Ｄａｐ－Ａｌａ（２－Ｔｈ）－ＯＭｅ（分子４；３９．１０ｇ、０．０９ｍｏｌ）を含むＴＨＦ（１００ｍＬ）を、内部温度を５℃未満に維持しながら２時間にわたって添加した。反応混合物を同じ温度（内部温度；５℃）で撹拌した。５分後、氷浴冷却下で、混合物に、Ｈ２Ｏ（８．５ｍＬ）を徐々に、１５％ＮａＯＨ ａｑ（８．５ｍＬ）およびＨ２Ｏ（２５．５ｍＬ）をこの順で添加した。混合物を周囲温度で１６時間撹拌した。混合物をセライトパッドに通して濾過し、次いで、濾過ケーキを１００ｍＬのＡｃＯＥｔで３回洗浄した。濾液を減圧下で濃縮した。残渣をさらに４時間乾燥させた。粗材料にトルエン（１１０ｍＬ）を添加し、次いで、混合物を６０℃まで、全ての材料が溶解するまで加熱した。混合物を周囲温度で放置した。２４時間後、混合物を濾過し、次いで、固体を５０ｍＬのトルエンで２回洗浄し、さらに１５時間乾燥させた。Ｂｏｃ－Ｄａｐ－Ａｌａ（２－Ｔｈ）－ＣＨ２ＯＨ（分子５；２８．４３ｇ、０．０７ｍｏｌ）を得た。ＨＰＬＣ ｒｔ＝１．３８分（標準方法）、ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋４２７．３。
スキーム４：
Figure 2023510724000026
スキーム４で概要が示される反応について説明すると、Ｂｏｃ－Ｄａｐ－Ａｌａ（２－Ｔｈ）－ＣＨ２ＯＨ（分子５；１９．４２ｇ、０．０５ｍｏｌ）を含むＭｅＯＨ（１００．００ｍＬ）の撹拌（２３℃）溶液に、ＨＣｌ／ジオキサン（９１．００ｍＬ、０．３６ｍｏｌ）を添加した。２時間後、揮発性物質を減圧下で蒸発させた。残渣にＡｃＯＥｔ（２５０ｍＬ）を添加し、次いで、混合物を真空で濃縮させた。このプロセスを２回繰り返した。残渣をさらに２０時間乾燥させた。粗材料に、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（３８ｍＬ）の２０：１混合物を添加した。混合物を７０℃（内部温度）まで、全ての材料が溶解するまで加熱し、次いで、混合物を周囲温度で放置した。２４時間後、混合物を濾過し、次いで、固体を１５ｍＬのＡＣＮで２回洗浄した。固体をさらに８時間乾燥させた。Ｈ－Ｄａｐ－Ａｌａ（２－Ｔｈ）－ＣＨ２ＯＨ＿ＨＣｌ（１２．８４ｇ、０．０４ｍｏｌ）を得た。ＨＰＬＣ ｒｔ＝０．６０分（標準方法）、ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋３２７．２。Ａｌａ（２－ＴＨ）－ＯＨ（５０．０４ｇ、０．２９ｍｏｌ）を含むＭｅＯＨ（５００．００ｍＬ）の撹拌（０℃）懸濁液に、ＳＯＣｌ２（１００．０７ｍＬ、１．３８ｍｏｌ）を２時間にわたって添加した。混合物を２３℃で撹拌した。１７時間後、揮発性物質を減圧下で蒸発させた。残渣をさらに１４４時間乾燥させた。Ａｌａ（２－Ｔｈ）－ＯＭｅ＿ＨＣｌを得た（分子６）。ＨＰＬＣ ｒｔ＝０．５９分（標準方法）、ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋３２７．２。
スキーム５：
Figure 2023510724000027
スキーム５で概要が示される反応について説明すると、（２Ｓ）－２－｛［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝－３－メチルブタン酸（分子７；１００．００ｇ、２９４．６５ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ－ブチル（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）－３－メトキシ－５－メチル－４－（メチルアミノ）ヘプタノエート（分子８；６３．６９ｇ、２４５．５４ｍｍｏｌ）、および２－クロロ－１－メチルピリジン－１－イウムヨージド（１０６．６４ｇ、４１７．４２ｍｍｏｌ）を含む酢酸エチル（２．５０Ｌ）の撹拌（２０℃）溶液に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１５４．３８ｍＬ、８８３．９５ｍｍｏｌ）を添加し、すぐに、一貫した混合を達成した。１６時間後、粗反応混合物を濾過し、ＥｔＯＡｃで洗浄した。溶液を１Ｌの１Ｍ ＨＣｌ、続いて、１Ｌの水、続いて、０．５Ｌ重炭酸ナトリウム、続いて、０．５Ｌブラインで抽出した。有機画分を合わせ、硫酸マグネシウムを用いて乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。ｔｅｒｔ－ブチル（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）－４－［（２Ｓ）－２－｛［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝－Ｎ，３－ジメチルブタンアミド］－３－メトキシ－５－メチルヘプタノエート（分子９；１４９．００ｇ、０．２６ｍｏｌ）をピンク固体として得た。ＨＰＬＣ ｒｔ＝１．５５分（標準方法）、ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋５８１．４。
スキーム６：
Figure 2023510724000028
スキーム６で概要が示される反応について説明すると、ｔｅｒｔ－ブチル（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）－４－［（２Ｓ）－２－｛［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝－Ｎ，３－ジメチルブタンアミド］－３－メトキシ－５－メチルヘプタノエート（分子９；１４３．００ｇ、２４６．２３ｍｍｏｌ）を含む酢酸エチル（２００．００ｍＬ）の撹拌（２０℃）溶液にジエチルアミン（２００．００ｍＬ、１，９３０．６３ｍｍｏｌ）を添加した。１時間後、粗混合物を真空で濃縮させた。残渣を２００ｍＬの酢酸エチルに溶解し、次いで、再び濃縮した。この操作を２回繰り返した。残渣に、５０ｍＬのトルエンを添加し、次いで、濃縮した。残渣を１０００ｍＬのヘキサンに溶解した。混合物に５００ｍＬの１Ｍ塩酸および５００ｍＬの水を添加した。混合物を５分間撹拌した。二相混合物を分液漏斗に入れ、水層を分離した。有機層を５００ｍＬの０．１Ｍ塩酸により２回抽出した。水層を合わせ、５００ｍＬのヘキサンで２回洗浄した。水層に炭酸カリウムを添加し、ｐＨを１０超に調整した。水溶液を分液漏斗に入れ、５００ｍＬの酢酸エチルにより３回抽出した。有機層を合わせ、５００ｍＬブラインで洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、真空で濃縮した。ｔｅｒｔ－ブチル（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）－４－［（２Ｓ）－２－アミノ－Ｎ，３－ジメチルブタンアミド］－３－メトキシ－５－メチルヘプタノエート（分子１０；６６．８０ｇ、０．１９ｍｏｌ）をピンク油として得た。ＨＰＬＣ ｒｔ＝０．８２分（標準方法）、ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋３５９．４。
スキーム７：
Figure 2023510724000029
スキーム７で概要が示される反応について説明すると、（２Ｓ）－２－｛［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］（メチル）アミノ｝－３－メチルブタン酸（分子７；５５．００ｇ、１５５．６３ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ－ブチル（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）－４－［（２Ｓ）－２－アミノ－Ｎ，３－ジメチルブタンアミド］－３－メトキシ－５－メチルヘプタノエート（分子１０；５５．７９ｇ、０．１６ｍｏｌ）、および２－クロロ－１－メチルピリジン－１－イウムヨージド（６７．５９ｇ、２６４．５６ｍｍｏｌ）を含む酢酸エチル（１．５０Ｌ）の撹拌（２０℃）溶液に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（９７．８５ｍＬ、５６０．２５ｍｍｏｌ）を添加し、すぐに一貫した混合を達成した。１６時間後、黄色沈殿物をセライト濾過により除去し、１００ｍＬのＥｔＯＡｃで洗浄した。濾液を分液漏斗に入れ、２００ｍＬの１Ｍ塩酸で２回、２００ｍＬの水、２００ｍＬの飽和重炭酸ナトリウム溶液で２回、およびブラインで洗浄した。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、真空で濃縮した。残渣をｈｉ－ｖａｃ下で２４時間乾燥させ、Ｆｍｏｃ－ＭｅＶａｌ－Ｖａｌ－Ｄｉｌ－ＯｔＢｕ（分子１１；１０３．５３ｇ、０．１５ｍｏｌ）を黄色フォームとして得た。ＨＰＬＣ ｒｔ＝１．８６分（標準方法）、ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋６９４．５。
スキーム８：
Figure 2023510724000030
スキーム８で概要が示される反応について説明すると、塩酸（５７．６４ｍＬ、２３０．５８ｍｍｏｌ）の撹拌（２０℃）溶液に、ｔｅｒｔ－ブチル（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）－４－［（２Ｓ）－２－［（２Ｓ）－２－｛［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］（メチル）アミノ｝－３－メチルブタンアミド］－Ｎ，３－ジメチルブタンアミド］－３－メトキシ－５－メチルヘプタノエート（分子１１；２０．００ｇ、２８．８２ｍｍｏｌ）を添加した。１６時間後、粗混合物を真空で濃縮させた。残渣を５０ｍＬのトルエンに懸濁させ、真空で濃縮した。この操作を３回繰り返した。得られた残渣をｈｉ－ｖａｃ下で２４時間乾燥させ、Ｆｍｏｃ－ＭｅＶａｌ－Ｖａｌ－Ｄｉｌ－ＯＨ（分子１２；１８．００ｇ、０．０３ｍｏｌ）をベージュフォームとして得た。ＨＰＬＣ ｒｔ＝１．５８分（標準方法）、ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋６３８．６。
スキーム９：
Figure 2023510724000031
スキーム９で概要が示される反応について説明すると、Ｄａｐ－（２－Ｔｈ）Ａｌａ－ＣＨ２ＯＨ＿ＨＣｌ（分子５；３．９４ｇ、１０．８６ｍｍｏｌ）に、Ｆｍｏｃ－ＭｅＶａｌ－Ｖａｌ－Ｄｉｌ－ＯＨ（分子１２；６．３０ｇ、９．８８ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ＿ＨＣｌ（２．８４ｇ、１４．８２ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１．５１ｇ、９．８８ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（４．３０ｍＬ、２４．６９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２３℃で撹拌した。１８時間撹拌した後、混合物にＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）を添加した。混合物を０．１Ｍ ＨＣｌ ａｑ（１００ｍＬ）、ｓａｔ．ＮａＨＣＯ３ ａｑ．（１００ｍＬ）、次いでブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、固体を濾過により除去した。有機層を真空で濃縮し、Ｆｍｏｃ－ＭＭＡＴＨ（モノメチルアウリスタチンチオフェニルメチルヒドロキシメチル）（分子１３；７．６３ｇ、０．０１ｍｏｌ）を得た。ＨＰＬＣ ｒｔ＝１．６３分（標準方法）、ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋９４６．８。
スキーム１０：
Figure 2023510724000032
スキーム１０で概要が示される反応について説明すると、Ｆｍｏｃ－ＭＭＡＴＨ（分子１３；７．１３ｇ、７．５４ｍｍｏｌ）に、ＥｔＯＡｃ（１００．００ｍＬ）、ドデシルメルカプタン（３．６１ｍＬ、１５．０７ｍｍｏｌ）およびＤＢＵ（０．２３ｍＬ、１．５１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２３℃で撹拌した。１８時間撹拌した後、粗混合物を分液漏斗に入れ、５０ｍＬの１．０Ｍ塩酸で２回抽出した。水層を合わせ、１００ｍＬの酢酸エチルで２回洗浄した。水溶液を丸底フラスコに移した。混合物に炭酸カリウムを添加し、混合物のｐＨを１０超に調整した。水溶液を分液漏斗に入れ、１００ｍＬの酢酸エチルで２回抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、真空で濃縮した。残渣をｈｉ－ｖａｃ下で１６時間乾燥させ、ＭＭＡＴＨ（分子１４；４．５１ｇ、０．０１ｍｏｌ）を無色フォームとして得た。ＨＰＬＣ ｒｔ＝０．９５分（標準方法）、ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋７２４．７。
実施例２：アウリスタチンリンカー－毒素種の例示的な調製
この実施例は、ターゲティング分子にカップリングさせるのに好適なリンカーを有する、ＭＭＡＴＨ（分子１４）、チオフェニルメチルヒドロキシメチルアウリスタチン分子の化合物の調製の例示的な方法を提供する。
スキーム１１：
Figure 2023510724000033
スキーム１１で概要が示される反応について説明すると、Ｂｏｃ２Ｏ（１３７．０ｇ、６２８ｍｍｏｌ）を含むＴＨＦ（６００ｍＬ）の撹拌２３℃溶液に、Ｈ２Ｎ－Ｃｉｔ－ＯＨ（分子１５；１００．０ｇ、５７１ｍｍｏｌ）およびＮａＣＯ３Ｈ（７１．９ｇ、８５６ｍｍｏｌ）を含む水（６００ｍＬ）を添加した。１６時間後、沈殿物が形成し、２０時間後、反応はＬＣＭＳ分析により完了した。揮発性有機物を減圧下で除去し、反応物をｐＨ４に２Ｍ ＨＣｌで調整し、ＥｔＯＡＣ（４×７５０ｍＬ）で抽出した。有機物を合わせ、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。溶液を濾過し、減圧下で濃縮し、７７％の分子１６を白色固体として得た。
スキーム１２：
Figure 2023510724000034
スキーム１２で概要が示される反応について説明すると、Ｂｏｃ－Ｃｉｔ（分子１６、１２０．０ｇ、４３６ｍｍｏｌ）を含むＥｔＯＨ（６００ｍＬ）の撹拌５０℃溶液にＰａｂａ（６４．４ｇ、５２３ｍｍｏｌ）およびＥＥＤＱ（１２９．３ｇ、５２３ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を２４時間撹拌し、有機溶媒を３００ｍＬまで濃縮した。濃縮粗溶液を１．０ＬのＥｔＯＡｃに添加し、続いて、２．０Ｌのヘキサンに添加してトリチュレートし、１時間撹拌する。白色固体を濾過により収集し、減圧下で乾燥させ、分子１６を７７％収率で得た。
スキーム１３：
Figure 2023510724000035
スキーム１３で概要が示される反応について説明すると、Ｂｏｃ－Ｃｉｔ－Ｐａｂａ（分子１６；１０．０ｇ、２６．３ｍｍｏｌ）を含むＭｅＣＮ（３００ｍＬ）の撹拌２３℃溶液にＩｍ（１．７９ｇ、２６．３ｍｍｏｌ）、次いで、ＰＮＰ－ＣＯＣｌ（７．９５ｇ、３９．４ｍｍｏｌ）を添加した。１６時間後、反応物を減圧下で濃縮して、黄色油を得た。油に３００ｍＬのＥｔＯＡｃを添加し、溶液を１５分間トリチュレートした。白色沈殿物を濾過により収集し、上清を濃縮して５０％体積とし、第２のバッチを１５分間トリチュレートし、濾過により収集した。材料を合わせ、減圧下で乾燥させ、分子１７を白色粉末として６９％収率で得た。
スキーム１４：
Figure 2023510724000036
スキーム１４で概要が示される反応について説明すると、Ｂｏｃ－Ｃｉｔ－Ｐａｂａ－ＰＮＰ（分子１７；１．４５ｇ、２．６５ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（２１ｍＬ）の撹拌２３℃溶液に、ＭＭＡＴＨ（分子１４；１．２ｇ、１．６６ｍｍｏｌ）およびＨＯＡｔ（８３．７ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）、次いで、ＮＭＭ（０．７３ｍＬ、６．６３ｍｍｏｌ）を添加した。７２時間後、反応物をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で希釈し、１．０Ｍ ＨＣｌ（２×１００ｍＬ）、続いて、Ｓａｔ．ＮａＨＣＯ３（１×１００ｍＬ）およびブライン（１×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。黄色フォームをフラッシュカラムクロマトグラフィーによりシリカゲル上で０％～１０％ＭｅＯＨを含むＥｔＯＡｃを使用して精製し、Ｂｏｃ－Ｃｉｔ－Ｐａｂａ－ＭＭＡＴＨ（分子１８）を白色フォームとして８０％収率で得た。
スキーム１５：
Figure 2023510724000037
スキーム１５で概要が示される反応について説明すると、Ｂｏｃ－Ｃｉｔ－Ｐａｂａ－ＭＭＡＴＨ（分子１８、１．２ｇ、１．０６ｍｍｏｌ）をＭｅＣＮ（６ｍＬ）に、５分の超音波処理を使用して溶解する。Ｂｏｃ－Ｃｉｔ－Ｐａｂａ－ＭＭＡＴＨ（分子１８；１．２ｇ、１．０６ｍｍｏｌ）を含むＭｅＣＮ（６ｍＬ）の撹拌２３℃溶液に、Ｈ３ＰＯ４（６ｍＬ）を添加する。１６時間後、溶液を水（１５ｍＬ）で希釈し、１０Ｍ ａｑＮａＯＨでｐＨ８に調整した。水層をＤＣＭ（２×１００ｍＬ）で抽出した。有機物を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、Ｃｉｔ－Ｐａｂａ－ＭＭＡＴＨ（分子１９）を黄色フォームとして９８％収率で得た。
スキーム１６：
Figure 2023510724000038
スキーム１６で概要が示される反応について説明すると、β－ｈｏｍｏＶａｌ（分子２０；１０００ｍｇ、７．６２ｍｍｏｌ）を含むＭｅＣＮ（４０ｍＬ）の撹拌０℃懸濁液に４Ｍ ＮａＯＨ（３．８１ｍＬ、１５．２５ｍｍｏｌ）を添加し、続いて、希ＣｌＡｃＣｌ（０．６０ｍＬ、７．５５ｍｍｏｌ）を含むＭｅＣＮ（１０ｍＬ）を徐々に添加した（１ｍＬ／分）。２０分後、反応物を１Ｍ ＨＣｌ（１００ｍＬ）およびＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈した。水層を除去し、有機層を１Ｍ ＨＣｌ（３×１００ｍＬ）、続いて、ブライン（１×１００ｍｌ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗反応物をＲＰ－ＨＰＬＣにより、Ｐｈｅｎｏｍｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸカラムを用いて、５％～９８％ＭｅＣＮを含む０．０５％ＴＦＡ水溶液を溶離剤として使用して精製した。分子２１を無色油として得た（１．１４ｇ）。
スキーム１７：
Figure 2023510724000039
スキーム１７で概要が示される反応について説明すると、ＤＭＴＭＭＴ（５５ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（０．５ｍＬ）の撹拌０℃溶液に、ＤＩＰＥＡ（１００μＬ、０．５７ｍｍｏｌ）、続いて、Ｈ２Ｎ－Ｃｉｔ－Ｐａｂａ－ＭＭＡＴＨ（分子１９；１０５ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を５分間撹拌した後、ＣｌＡｃ－β－ｈｏｍｏＶａｌ（分子２１；３０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を添加した。１時間後、粗溶液を、分取ＲＰ－ＨＰＬＣによりＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ １０μ、Ｃ１８ １１０Åカラムを用いて、５％～９８％ＭｅＣＮを含む０．０５％ＴＦＡ水溶液を溶離剤として使用して精製した。ＭＭＡＴＨ－Ｌ－Ｃｌ（分子２２）を白色粉末として得た（１１４ｍｇ、９１％）。
本開示の他の実施形態では、ＭＭＡＴＨリンカー－毒素の組み合わせは、分子２２のブロモ－およびヨード－誘導体を含み、ここで、クロロ基はブロモ基（分子２３）またはヨード基（分子２４）と置き換えられ、「ペイロード」は毒素を表す。本開示のいくつかの実施形態では、毒素はＮ末端窒素を介して連結されたＭＭＡＴＨ（分子２２）である。
Figure 2023510724000040
Figure 2023510724000041
Figure 2023510724000042
本開示のいくつかの実施形態では、分子２３、２４、または２５のペイロードは、作用物質、例えば、毒素により表すことができる。
本開示のいくつかの実施形態では、化合物は分子２６により表され、ペイロードは作用物質、例えば、毒素を表し、Ｒは標的結合部分、例えば、抗体またはその抗原結合、または遊離チオール基を介する任意の他の分子を表す。
Figure 2023510724000043
実施例３：アウリスタチン種のインビトロ細胞毒性
この例示的な研究では、インビトロ細胞毒性を、本明細書では式（Ｉ）として示されるＭＭＡＴＨ（アウリスタチンのチオフェニルメチルヒドロキシメチル誘導体）、本開示のアウリスタチン種の相対的な毒性を評価するために使用した。
このアッセイでは、試験細胞を播種し、適切な細胞密度（例えば、ＳＷ７８０細胞について１５００細胞／ウェル（５０μＬ毎ウェル））まで増殖させた。細胞を薬物（ＭＭＡＴＨまたはＭＭＡＥ（モノメチルアウリスタチンＥ））を用いて、１０μＭ～１０－４ｎＭの範囲の濃度にて、三通りで５日間処理した。第６日エンドポイントに、細胞を２０μＬのＰｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅと共に３７℃で２時間インキュベートし、シグナルをＢｉｏｔｅｋ ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ４プレートリーダーで読み取った。培地バックグラウンドを減算した後、生存パーセントを計算し、プロットし、ＥＣ５０を決定した。表１に例示的な結果が示される。
Figure 2023510724000044
例示的な研究では、ＭＭＡＥおよびＭＭＡＴＨのチューブリンへの結合を測定し、６９．９ｎＭ（ＭＭＡＥ）および２０４．４ｎＭ（ＭＭＡＴＨ）のＫＤを示した。例示的な結果により、新規ＭＭＡＴＨアウリスタチン種はＭＭＡＥと同等な毒性を有することが示される。これらの例示的な結果により、この同等なインビトロ有効性は、チューブリン、有効性についてのその推定分子標的へのより低い親和性を有する分子を用いて達成されたことも示される。
実施例４：リンカー種の安定性
この例示的な研究では、インビトロ研究を使用して、バリン－シトルリン（ｖｃ）リンカーと比較して、本開示のリンカー（分子２６）の安定性を評価した。
この研究では、２つの異なるシステイン－コンジュゲート薬物リンカーについての様々なカテプシンによる切断の相対動力学速度をＬＣＭＳにより測定した。酵素（カテプシンＢ、Ｄ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、およびＳ）を活性化させ、その後、基質に導入した。１つの基質は、バリン－シトルリン－ＰＡＢ－カルボキシリンカーを介してシステインに結合されたアウリスタチンＭＭＡＥとし（ＣＡＳ Ｎｏ．：６４６５０２－５３－６）、もう一方は、分子２６のリンカーを介してシステインに結合された本開示のＭＭＡＴＨアウリスタチン（分子１４）とした。
２つの異なるチオール－結合システイン－結合アウリスタチン（ＭＭＡＴＨ－Ｌ－ＣｙｓおよびＣｙｓ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）を３７℃で予め活性化された酵素と共に４８時間の期間にわたりインキュベートした。時点を直接２Ｍ、ｐＨ９ Ｔｒｉｓバッファーにアリコートし、酵素活性を停止させ、次いで、直ちに－８０℃で凍結させた。各々について、遊離薬物およびシステイン－結合薬物の両方のＭＳ ＸＩＣのＡＵＣを時間と共にモニタした。全ての試料をＴｈｅｒｍｏ ＬＴＱ Ｖｅｌｏｓ ＯｒｂｉＴｒａｐ質量分析計上でＤｉｏｎｅｘ ＬＣフロントエンドを用いて実施した。元々のシステイン－結合薬物、遊離薬物、および切断された「リンカー」スタブの量を時間と共に測定した。
図２Ａおよび２Ｂについて説明すると、例示的な結果により、分子２６のリンカーを有するシステイン－結合ＭＭＡＴＨは、対応するシステイン－結合ｖｃＭＭＡＥより高い安定性を示したことが示される。カテプシンＨ、Ｄ、Ｌ、Ｋ、およびＳを用いた結果では、結果により、全てのカテプシンに対して２つのリンカー間で同様な相対的安定性が示された。カテプシンＤおよびＬは、カテプシンＢと同等な速度で切断したが、カテプシンＨはカテプシンＢよりも相対的に遅く切断した。カテプシンＫおよびＳはカテプシンＢよりも相対的に速く切断した。
別の例示的な研究では、２つのシステイン－結合アウリスタチン種の安定性を活性化リソソーム由来ライセートにおいて試験した。この研究では、リソソームを３つの連続凍結／解凍サイクル、続いて、３０分の超音波処理により溶解させた。システイン－結合アウリスタチンを３７℃で、予め活性化されたリソソームと共に２４時間の期間にわたりインキュベートした。この研究では、システイン－ＭＭＡＴＨ－Ｌ基質を５×リソソーム濃度を用いてインキュベートした。時点をインキュベーションを通してとり、遊離薬物およびｃｙｓ－ＤＬの両方についてのＭＳ ＸＩＣのＡＵＣを時間と共にモニタした。全ての試料をＴｈｅｒｍｏ ＬＴＱ Ｖｅｌｏｓ ＯｒｂｉＴｒａｐ質量分析計上でＤｉｏｎｅｘ ＬＣフロントエンドを用いて実施した。元々のシステイン－結合薬物、遊離薬物、および切断された「リンカー」スタブの量を時間と共に測定した。
図３Ａおよび３Ｂについて説明すると、例示的な結果により、分子２６のリンカーを有するシステイン－結合ＭＭＡＴＨは活性化リソソームにおいて、対応するシステイン－結合ｖｃＭＭＡＥと同等な安定性を示し、前者は５×リソソーム濃度で処理され、よって、ｖｃＭＭＡＥリンカーよりも約５×遅い切断速度が示されたことが示される。
さらに例示的な研究では、基質の安定性を４つの異なるカルボキシルエステラーゼ（ヒトまたはマウスＣＥＳ－１およびＣＥＳ－１Ｃ）の存在下で決定した。この研究では、酵素を基質導入前に活性化し、次いで、基質と共に３７℃で４８時間の期間にわたりインキュベートした。時点を直接２Ｍ、ｐＨ９ Ｔｒｉｓバッファーにアリコートし、酵素活性を停止させ、次いで、直ちに－８０℃で凍結させた。各々について、遊離薬物およびシステイン－結合薬物の両方のＭＳ ＸＩＣのＡＵＣを時間と共にモニタした。全ての試料をＴｈｅｒｍｏ ＬＴＱ Ｖｅｌｏｓ ＯｒｂｉＴｒａｐ質量分析計上でＤｉｏｎｅｘ ＬＣフロントエンドを用いて実施した。元々のシステイン－結合薬物、遊離薬物、および切断された「リンカー」スタブの量を時間と共に測定した。
ＣＥＳ－１またはＣＥＳ－１Ｃマウスまたはヒトカルボキシルエステラーゼを使用するこの研究では、ヒトまたはマウスＣＥＳ－１によるどちらの基質の切断も観察されなかった。しかしながら、システイン－ｖｃＭＭＡＥは４８時間で、ヒトおよびマウスＣＥＳ－１Ｃの両方により完全に切断された。本開示のＭＭＡＴＨ－リンカーについては、マウスまたはヒトＣＥＳ－１Ｃによる切断は、およそ１２時間で、ｖｃＭＭＡＥで観察されるものよりも実質的に遅い速度で始まる。
これらの例示的な結果により、分子２６のリンカーは活性化酵素およびリソソームの両方においてバリン－シトルリンリンカーより高い安定性を有することが示される。これらの例示的な結果により、分子２６のリンカー－ＭＭＡＴＨは活性化酵素およびリソソームの両方においてｖｃＭＭＡＥより高い安定性を有することが示される。
実施例５：新規抗体コンジュゲーション部位
この例示的な研究では、ロイシン残基はヒトＩｇＧ１重鎖定常領域のＦＧ－ループ内に位置した。参考のため、問題になっているロイシンは配列ＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩ（すなわち、Ｋａｂａｔ番号付け３２８位）との関連で見出されている。本開示では、この位置のロイシンはシステインに部位特異的に改変され、すなわち、ＫＶＳＮＫＡＣＰＡＰＩであった。
この研究では、標的ＨＥＲ２に特異的に結合するモノクローナル抗体トラスツズマブをこの位置で、ロイシンからシステインに改変し、薬物コンジュゲーションの適合性および他の効果を決定した。天然トラスツズマブと本開示の改変型の間の比較を以下で示す。
Figure 2023510724000045
これらの例示的な結果により、元々の抗体と比べて、本開示のＬ３２８ＣバリアントのＦｃγ受容体への結合の著しい減少が示され、一方、およそ２の特定的なＤＡＲが得られ、さらに、高効率的なコンジュゲーション、すなわち、１％未満コンジュゲート抗体が得られた。
この突然変異の他の例が本明細書で記載される（抗ＰＳＭＡおよび抗ＳＬＣ３４Ａ２抗体）。
これらの例示的な結果により、この部位特異的な改変を有する抗体または活性化可能抗体を使用する利点が示され、特定の化学量論でのコンジュゲーションのための効率的な、制御された部位が提供される。
実施例６：コンジュゲーションの例示的な方法
この実施例では、本開示のアウリスタチンＭＭＡＴＨを抗体分子にコンジュゲートさせるための例示的なコンジュゲーション方法が記載される。
図４の例示的なプロセスフロー図について説明すると、本開示の例示的な方法では、Ｋａｂａｔ位３２８でシステイン残基を有する抗体が７．２のｐＨで１４ｇ／Ｌの濃度で提供される。抗体溶液を濾過し、次いで、還元剤トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いて９：１ ＴＣＥＰ：抗体モル比で、８０－１２０分間２０℃で還元させる。反応物を接線流濾過（ＴＦＦ）により、８ダイアボリュームで濾過し、１２ｇ／Ｌで回収した。抗体を（Ｌ）－デヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡ）を用いて１０：１ＤＨＡ：抗体モル比で、９０分間２０℃で再酸化させた。
Ｒ２が塩素である、式（ＩＩＩ）を有するＭＭＡＴＨリンカー－毒素化合物をヨウ化ナトリウムで活性化した。活性化リンカー－毒素を再酸化抗体に９：１リンカー－毒素：抗体モル比で１２－１６時間２０℃で添加し、リンカー－毒素を抗体にコンジュゲートさせた。反応混合物をＴＦＦにより１０ダイアボリュームで濾過し、１７ｇ／Ｌで回収した。コンジュゲート抗体の分析により、２のＤＡＲを有するＫａｂａｔ３２８システイン位で部位特異的なコンジュゲーションが示された。
これらの例示的な結果により、本開示のアウリスタチン誘導体は抗体に部位特異的にコンジュゲートさせることができ、２のＤＡＲを有する抗体－薬物コンジュゲートが提供されることが示された。
これらの例示的な結果により、リンカー－毒素をＫａｂａｔ位３２８で部位特異的なシステインにコンジュゲートさせることにより、コンジュゲーションはリンカー－毒素のシステインチオール基へのヨウ素－活性化カップリングを使用して進行することができることもまた示された。このようにして、コンジュゲート生成物はチオール－マレイミドコンジュゲートよりも脱コンジュゲーション反応を受けにくく、後者はチオール交換により、より容易に逆転される可能性があり、リンカー－毒素の望ましくない放出という結果になる。リンカー－毒素コンジュゲーションのために部位特異的なシステイン、例えば、Ｋａｂａｔ位３２８のものを有する抗体の使用はまた、２のＤＡＲを有するコンジュゲート抗体生成物を提供する。部位特異的なシステイン残基、例えば、Ｋａｂａｔ位３２８のものを有するそのような抗体の使用によっても、抗体の天然鎖内または鎖間ジスルフィド結合の破壊なしで、抗体へのリンカー－毒素コンジュゲーションが可能になる。
他の実施形態
本発明についてその詳細な説明と共に記載してきたが、前記記載は、本発明を説明することを意図しており、その範囲を制限することを意図しておらず、本発明は添付の特許請求の範囲により規定される。他の態様、利点、および改変は下記の範囲内にある。

Claims (58)

  1. 式（Ｉ）の化合物：
    Figure 2023510724000046
     式中、Ｒ１は水素またはＣ１－６アルキル基であり；
    Ｒは、下記からなる群より選択され：水素、Ｃ１－６アルキル、リンカー、またはＸ１－Ｙ１－＊基（式中、＊は窒素への結合点である）；ならびに
    Ｙ１はオキシカルボニル基であり、Ｘ１はＣ１－６アルキル基、９－フルオレニルメチル基、ベンジル基、またはｔｅｒｔ－ブチル基である。
  2. Ｒ１はメチル基であり、Ｒは水素である、請求項１に記載の化合物。
  3. Ｘ１－Ｙ１は９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基である、請求項１に記載の化合物。
  4. 式（ＩＩ）の化合物：
    Figure 2023510724000047
     式中、Ｒ３は式（ＩＩ）に結合される作用物質であり、結合点は窒素、硫黄、酸素、または炭素原子であり；ならびに
    Ｒ２は式（ＩＩ）に結合される部分であり、結合点は、下記からなる群より選択される：塩素基、ヨウ素基、臭素基、およびチオール基。
  5. Ｒ２は標的結合部分であり、Ｒ２の結合点はチオール基である、請求項４に記載の化合物。
  6. 前記チオール基はシステイン残基の側鎖チオール基である、請求項５に記載の化合物。
  7. 式（ＩＩＩ）の化合物：
    Figure 2023510724000048
     式中、Ｒ２は式（ＩＩＩ）に結合される部分であり、結合点は、下記からなる群より選択される：塩素基、ヨウ素基、臭素基、およびチオール基。
  8. Ｒ２は標的結合部分であり、Ｒ２の結合点はチオール基である、請求項７に記載の化合物。
  9. 前記チオール基がシステイン側鎖チオール基である、請求項８に記載の化合物。
  10. 前記標的結合部分は、前記標的に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合性フラグメント（ＡＢ）である、請求項４～９のいずれか一項に記載の化合物。
  11. 前記標的結合部分は、活性化状態では、前記標的に特異的に結合する活性化可能抗体であり、前記活性化可能抗体は下記を含む、請求項４～９のいずれか一項に記載の化合物：
    前記標的に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメント（ＡＢ）；
    前記ＡＢに結合されたマスキング部分（ＭＭ）であって、前記ＭＭは、前記活性化可能抗体が未切断状態にある場合、前記ＡＢの前記標的への結合を阻止する、部分；ならびに
    前記ＡＢに結合された切断可能な部分（ＣＭ）であって、前記ＣＭはプロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドである、部分。
  12. 前記ＭＭは前記ＡＢのその標的への解離定数より大きい前記ＡＢへの結合のための解離定数を有する、請求項１１に記載の化合物。
  13. 前記ＭＭは、前記活性化可能抗体が切断状態にある場合、その標的への結合について、前記ＡＢを妨害しない、またはこれと競合しない、請求項１１または請求項１２に記載の化合物。
  14. 前記ＭＭは４０アミノ酸以下の長さのポリペプチドである、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の化合物。
  15. 前記ＭＭポリペプチド配列は前記標的配列とは異なる、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の化合物。
  16. 前記ＭＭポリペプチド配列は、前記ＡＢの任意の天然結合パートナーと５０％以下同一である、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の化合物。
  17. 前記標的は、ＣＤ４４、ＣＤ１４７、ＣＤ１６６、ＩＴＧａ３、ＩＴＧｂ１、ＰＳＭＡ、およびＳＬＣ３４Ａ２からなる群より選択される、請求項１０～１６のいずれか一項に記載の化合物。
  18. 前記作用物質は、アウリスタチンＥ、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、マイタンシノイドＤＭ４、マイタンシノイドＤＭ１、カリチアマイシン、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、およびピロロベンゾジアゼピン二量体からなる群より選択される、請求項４～６のいずれか一項に記載の化合物。
  19. Ｒはリンカーである、請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物。
  20. 前記リンカーは切断可能なリンカーである、請求項１９に記載の化合物。
  21. 前記リンカーは標的結合部分に結合される、請求項１９または請求項２０に記載の化合物。
  22. 前記標的結合部分は、前記標的に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合性フラグメント（ＡＢ）である、請求項２１に記載の化合物。
  23. 前記標的結合部分は、活性化状態では、前記標的に特異的に結合する活性化可能抗体であり、前記活性化可能抗体は、下記を含む、請求項２１に記載の化合物：
    前記標的に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメント（ＡＢ）；
    前記ＡＢに結合されたマスキング部分（ＭＭ）であって、前記ＭＭは、前記活性化可能抗体が未切断状態にある場合、前記ＡＢの前記標的への結合を阻止する、部分；ならびに
    前記ＡＢに結合された切断可能な部分（ＣＭ）であって、前記ＣＭはプロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドである、部分。
  24. 前記標的は、ＣＤ４４、ＣＤ１４７、ＣＤ１６６、ＩＴＧａ３、ＩＴＧｂ１、ＰＳＭＡ、およびＳＬＣ３４Ａ２からなる群より選択される、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の化合物。
  25. 前記抗体または活性化可能抗体はＫａｂａｔ位３２８でシステイン残基を含む、請求項１０～２３のいずれか一項に記載の化合物。
  26. Ｋａｂａｔ位３２８がシステインである、ＩｇＧ１抗体。
  27. 下記を含む活性化可能抗体であって：
    前記標的に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメント（ＡＢ）；
    前記ＡＢに結合されたマスキング部分（ＭＭ）であって、前記ＭＭは、前記活性化可能抗体が未切断状態にある場合、前記ＡＢの前記標的への結合を阻止する、部分；ならびに
    前記ＡＢに結合された切断可能な部分（ＣＭ）であって、前記ＣＭはプロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドである、部分、
    前記ＡＢのＫａｂａｔ位３２８がシステインである、活性化可能抗体。
  28. 前記抗体または前記ＡＢは、ＣＤ４４、ＣＤ１４７、ＣＤ１６６、ＩＴＧａ３、ＩＴＧｂ１、ＰＳＭＡ、およびＳＬＣ３４Ａ２からなる群より選択される標的に特異的に結合する、請求項２６に記載の抗体または請求項２７に記載の活性化可能抗体。
  29. 請求項１～２８のいずれか一項に記載の化合物、抗体、または活性化可能抗体；および
    好適な担体
    を含む、医薬組成物。
  30. 式（Ｉ）の化合物をポリペプチドにコンジュゲートさせることを含む、化合物をポリペプチドにコンジュゲートさせる方法であって：
    Figure 2023510724000049
     式中、Ｒ１は水素またはＣ１－６アルキル基であり；
    Ｒは、下記からなる群より選択され：水素、Ｃ１－６アルキル、リンカー、またはＸ１－Ｙ１－＊基（式中、＊は窒素への結合点である）；ならびに
    Ｙ１はオキシカルボニル基であり、Ｘ１はＣ１－６アルキル基、９－フルオレニルメチル基、ベンジル基、またはｔｅｒｔ－ブチル基であり；
    式（Ｉ）の化合物またはその誘導体の少なくとも１つの等価物が前記ポリペプチドにコンジュゲートされる、方法。
  31. Ｒ１はメチル基であり、Ｒは水素である、請求項３０に記載の方法。
  32. Ｘ１－Ｙ１は９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基である、請求項３０に記載の方法。
  33. Ｒはリンカーである、請求項３０に記載の方法。
  34. 前記リンカーは切断可能なリンカーである、請求項３３に記載の方法。
  35. 化合物をポリペプチドにコンジュゲートさせる方法であって、
    前記方法は、式（ＩＩＩ）の化合物をポリペプチドにコンジュゲートさせることを含み
    Figure 2023510724000050
     式中、Ｒ２は式（ＩＩＩ）に結合される部分であり、結合点は、下記からなる群より選択される、方法：塩素基、ヨウ素基、臭素基、およびチオール基。
  36. 前記Ｒ２はハロゲン基である、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記Ｒ２はヨウ素基である、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記Ｒ２は臭素基である、請求項３６に記載の方法。
  39. 前記Ｒ２は塩素基である、請求項３６に記載の方法。
  40. 式（Ｉ）または（ＩＩＩ）の少なくとも１つの化合物が前記ポリペプチドに、前記ポリペプチド上のチオール基を介してコンジュゲートされる、請求項３０～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記チオール基は前記ポリペプチドのシステイン残基の側鎖チオール基である、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記ポリペプチドは標的結合部分を含む、請求項３０～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記ポリペプチドは標的に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメント（ＡＢ）を含む、請求項３０～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記システイン残基は前記ＡＢのＫａｂａｔ位３２８にある、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記方法は、
    （ｉ）前記ポリペプチドを還元剤で還元することであって、少なくとも１つのジスルフィド基が遊離チオール基に還元される工程；
    （ｉｉ）前記ポリペプチドを酸化剤で、前記遊離チオール基を酸化させずに再酸化する工程；ならびに
    （ｉｉｉ）式（Ｉ）または（ＩＩＩ）の化合物を前記遊離チオール基にコンジュゲートさせる工程
    を含む、請求項３０～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記還元剤はＴＣＥＰである、請求項４５に記載の方法。
  47. 下記式を有するコンジュゲートポリペプチドであって：
    ［Ｔ］－［Ｌ］－［Ｃ］；
    ［Ｔ］は標的結合部分であり、［Ｌ］はリンカー部分であり；ならびに
    ［Ｃ］は式（Ｉ）の化合物を含む化合物であり：
    Figure 2023510724000051
     式中、Ｒ１は水素またはＣ１－６アルキル基であり；ならびに
    Ｒは［Ｌ］への結合点である、コンジュゲートポリペプチド。
  48. Ｒ１はメチル基である、請求項４７に記載のコンジュゲートポリペプチド。
  49. 下記式を有するコンジュゲートポリペプチドであって：
    ［Ｔ］－［ＬＣ］；
    ［Ｔ］は標的結合部分であり、［ＬＣ］はリンカー－毒素であり；ならびに
    ［ＬＣ］は式（ＩＩＩ）の化合物を含む化合物であり：
    Figure 2023510724000052
     式中、Ｒ２は［Ｔ］への結合点である、コンジュゲートポリペプチド。
  50. 前記リンカー［Ｌ］は切断可能なリンカーである、請求項４７または請求項４８に記載のコンジュゲートポリペプチド。
  51. 前記リンカー［Ｌ］または前記リンカー－毒素［ＬＣ］は前記標的結合部分［Ｔ］に前記標的結合部分上のチオール基を介して結合される、請求項４７～５０のいずれか一項に記載のコンジュゲートポリペプチド。
  52. 前記チオール基は、前記標的結合部分上のシステイン残基の側鎖チオール基である、請求項５１に記載のコンジュゲートポリペプチド。
  53. 前記標的結合部分［Ｔ］は標的に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメント（ＡＢ）を含む、請求項４７～５２のいずれか一項に記載のコンジュゲートポリペプチド。
  54. 前記システイン残基が前記ＡＢのＫａｂａｔ位３２８のシステイン残基である、請求項５３に記載のコンジュゲートポリペプチド。
  55. その必要のある被験体に、有効量の、請求項１～２５のいずれか一項に記載の化合物、請求項２９に記載の医薬組成物、または請求項４７～５４のいずれか一項に記載のコンジュゲートポリペプチドを含む組成物を投与することを含む、疾患または障害を有する被験体を治療する方法。
  56. 疾患または障害を治療するための、請求項１～２５のいずれか一項に記載の化合物、請求項２９に記載の医薬組成物、または請求項４７～５４のいずれか一項に記載のコンジュゲートポリペプチドの使用。
  57. 疾患または障害を治療するための薬剤の調製において使用するための、請求項１～２５のいずれか一項に記載の化合物、請求項２９に記載の医薬組成物、または請求項４７～５４のいずれか一項に記載のコンジュゲートポリペプチド。
  58. 前記疾患または障害は癌である、請求項５５～５７のいずれか一項に記載の方法。
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